NO303544B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid med Ún eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskaper til granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) - Google Patents
FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid med Ún eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskaper til granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) Download PDFInfo
- Publication number
- NO303544B1 NO303544B1 NO871679A NO871679A NO303544B1 NO 303544 B1 NO303544 B1 NO 303544B1 NO 871679 A NO871679 A NO 871679A NO 871679 A NO871679 A NO 871679A NO 303544 B1 NO303544 B1 NO 303544B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- csf
- hpg
- cells
- ser
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 46
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 title claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 108
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 abstract 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 abstract 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 13
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 7
- 102000055056 N-Myc Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 7
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 6
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 6
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 5
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 3
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-M deoxycholate Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-M 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 210000001237 metamyelocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 3
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical group SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 2
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 210000004765 promyelocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 101000904962 Arabidopsis thaliana Histone H2B.6 Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 229920013669 Clearsite Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000824878 Gallus gallus Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 206010024305 Leukaemia monocytic Diseases 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- 241000282346 Meles meles Species 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000931108 Mus musculus DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033826 Promyelocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 108010004215 chloroacetate esterase Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150034144 ci gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M methylmercury(1+);hydroxide Chemical compound [OH-].[Hg+]C KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000006894 monocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004206 promonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical group OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/243—Colony Stimulating Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Bakgrunn
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte
for fremstilling av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger, fragmenter og polypeptidanaloger derav.
Det humane bloddannende (hematopoietiske) system er-statter forskjellige hvite blodlegemer (deriblant neutrofiler, makrofager og basofiler/mast-celler), røde blodlegemer (erythrocytter) og klump-dannende celler (megakaryocyter/blodplater). Det bloddannende system hos det gjennomsnittlige menneske av hankjønn er blitt anslått å produsere i størrelsesorden 4,5 x 10^ granulocytter og eryhtrocytter hvert år, noe som er ekvivalent med en årlig erstatning av den samlede kropps-vekt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154-158 (1985).
Det antas at små mengder av bestemte vekstfaktorer for bloddannelse er ansvarlig for differensieringen av et lite antall forløper-"stamceller" til de forskjellige blodcelle-linjene, for den voldsomme formeringen av disse linjene, og for den endelige differensiering av ferdig utviklede blod-celler fra disse linjene. Ettersom vekstfaktorene for bloddannelse er tilstede i svært små mengder, har påvisningen og identifikasjonen av disse faktorene vært basert på en lang rekke prøver som hittil bare skjelner mellom de forskjellige faktorer på grunnlag av stimulerende virkninger på dyrkede celler under kunstige betingelser. Som et resultat av dette, har et stort antall navn blitt laget for å betegne et mye mindre antall faktorer. Som et eksempel på den resulterende forvirring, er uttrykkene IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF
og PSF alle kortord som nå antas å gjelde for en enkelt murin vekstfaktor for bloddannelse. Metcalf, Science, 229, 16-22,
(1985). Se også Burgess et al., J. Biol. Chem., 252, 1988
<5>(1977), Das et al., Blood, 58, 600 (1980), Ihle et al.,
J. Immunol., 129, 2431 (1982), Nicola et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf et al., Int. J. Cancer, 30, 773,
(1982) og Burgess et al., Int. J. Cancer, 26, 647 (1980),
som vedrører forskjellige murine vekstregulerende glycoproteiner.
Anvendelsen av rekombinante genetiske teknikker har bragt en viss orden i dette kaoset. F.eks. har man oppnådd aminosyre- og DNA-sekvensene for human erythropoietin som stimulerer produksjonen av erythrocytter. (Se Lin, PCT publisert søknad nr. 85/02610, publisert 20. juni 1985). Rekombinante metoder er også blitt anvendt for isolering av cDNA
for en human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor.
Se Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 4360-4364
(1985) og Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985). Se også Yokota et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 81, 1070 (1984), Fung et al., Nature, 307, 233 (1984) og Gough et al., Nature, 309, 763 (1984) vedrørende kloning av murine gener, samt Kawasaki et al., Science, 230, 291 (1985) vedrørende human-M-CSF.
En human vekstfaktor for bloddannelse kalt human koloni-stimulerende faktor med flere forskjellige virkninger (hpCSF) eller pluripoiétin, er blitt påvist å være tilstede i dyrknings-mediet til en human carcinomcellelinje fra urinblære betegnet 5637 og deponert under restriktive betingelser ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som A.T.C.C de-poneringsnr. HTB-9. Den hpCSF som renses fra denne cellelinje, er blitt rapportert å stimulere formering og differensiering av forløperceller med flere forskjellige virkninger som fører til produksjonen av alle de viktigste blodcelletypene, i prøver hvor det brukes human benmarg-forløperceller. Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985). Ved rensing av hpCSF ble det brukt: (NH4)2S04~utfelling, anionbytterkromatografi ( DEAE-cellulose, DE52), gelfiltrering (AcA54-kolonne) og C18 væskekromatografi i omvendt fase med høy yteevne. Et protein identifisert som hpCSF som elueres i den andre av to aktivitetstopper i fraksjoner fra C18 HPLC
i omvendt fase, ble angitt å ha en molekylvekt (MW) på 18.000 bestemt ved hjelp av natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacrylamid-gelelektroforese (PAGE) under anvendelse av sølvfarging.
hpCSF ble tidligere angitt å ha et isoelektrisk punkt på 5,5
[Welte et al., J. Cell. Biochem., Supp 9A, 116 (1985)] og en høy differenseriengsaktivitet for den myelomonocyttiske leukemicellelinje WEHI-3B D<+>fra mus [Welte et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gale et al.,
utg., New Series, 2Q, (1985)]. Foreløpige undersøkelser indikerer at faktoren identifisert som hpCSF i overveiende grad har granulocytt-kolonistimulerende aktivitet i løpet av de første 7 dagene i en human CFU-GM-prøve.
En annen faktor, betegnet human CSF-(3, er også blitt isolert fra human urinblære carcinomcellelinje 5637 og er
125
blitt beskrevet som en konkurrent til munn 1-merket granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF) når det gjelder binding til WEHI-3B D<+->celler i et doseresponsforhold som er identisk med forholdet til umerket murin G-CSF [Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985)].Dette doseresponsforhold var tidligere blitt rapportert å være enestående for umerket murin G-CSF og ikke å finnes hos slike faktorer som M-CSF, GM-CSF eller multi-CSF [Nicola et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 81 f 3765-3769 (1984)]. CSF-(3 og G-CSF er også enestående blant CSF-er ved at de deler en høy grad av evne til å indusere differensiering av WEHI-3B D<+->celler. Nicola et al., Immuno-logy Today, _5, 76-80 (1984) . Ved høye konsentrasjoner stimulerer G-CSF blandede granulocytt/makrofag-kolonidannende celler [Nicola et al., (1984) supra], noe som er i overensstemmelse med foreløpige resultater som indikerer frem-komsten av granulocyttiske, monocyttiske, blande granulocy-tiske/monocyttiske og eosinofile kolonier (CFU-GEMM) etter 14 dagers inkubasjon av humane benmargkulturer med hpCSF. CSF-P er også blitt angitt å stimulere dannelse av neutrofile granulocyttiske kolonier i prøver hvor det ble anvendt benmargceller fra mus, en egenskap som har vært et kriterium for identifikasjon av en faktor som en G-CSF. På grunnlag av disse likheter, er human CSF-(3 blitt identifisert med G-CSF (granulocyttisk kolonistimulerende faktor). Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985).
På grunnlag av de felles egenskaper synes det som om human SCF-(3 ifølge Nicola et al., supra, og hpCSF ifølge Welte et al., supra, er den samme faktor som passende kunne refereres til som en human granulocytt-kolonistimulerende faktor (hpG-CSF). Karakterisering og rekombinant produksjon av hpG-CSF ville være særlig ønskelig på bakgrunn av den rapporterte egenskap hos murin G-CSF til å undertrykke en in vitro WEHI-3B 3<+>leukemisk cellepopulasjon fullstendig ved "helt normale konsentrasjoner", og den rapporterte egenskap-hos rå, injiserte preparater av murin G-CSF til å undertrykke etablerte transplanterte myeloid-leukemier i mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985). Se også Dachs Scientific American, 284 ( 1) , 40-47 (1986).
I den utstrekning hpG-CSF kan vise seg å være terapeutisk betydningsfull og således trengs å være tilgjenge-
lig i mengder i kommersiell skala, er det usannsynlig at isolering fra cellekulturer kan utgjøre en adekvat material-kilde. Det er f.eks. verd å legge merke til at det fore-ligger restriksjoner mot kommersiell bruk av celler fra human tumorbank, slik som den humane urinblære-carcinomcellelinje 5637 (A.T.C.C. HTB9) som er blitt angitt som kilder for naturlige hpCSF-isolater i Welte et al. (1985 supra).
Oppsummering av oppfinnelsen
For anvendelse i forbindelse med oppfinnelsen tilveiebringes DNA-sekvenser som koder for hele eller en del av hpG-CSF. Slike sekvenser kan omfatte: innlemmelse av kodoner som er "foretrukket" for ekspresjon ved hjelp av utvalgte ikke-pattedyrverter, tilveiebringelsen av steder for spalting ved hjelp av restriksjonsendonukleaseenzymer, og tilveie-bringelse av initielle, terminale eller mellomliggende DNA-sekvenser som letter konstruksjon av lett uttrykte vektorer. Det tilveiebringes også DNA-sekvenser
som koder for mikrobiell ekspresjon av polypeptidanaloger eller derivater av hpG-CSF som skiller seg fra naturlig forekommende former når det gjelder identiteten og lokaliseringen av én eller flere aminosyrerester (dvs. "deletion"-analoger som inneholder mindre enn alle restene som er angitt for hpG-CSF; substitusjonsanaloger, slik som [Ser<17>]hpG-CSF, hvor én eller flere av de angitte rester er erstattet med andre rester; og addisjonsanaloger hvor én eller flere aminosyrerester er tilført en terminal eller medial del av polypeptidet)
og som deler noen av eller alle egenskaper til naturlig forekommende former.
Nye DNA-sekvenser som kan anvendes, omfatter sekvenser som kan brukes til å sikre ekspresjon i prokaryote eller eukaryote vertceller av polypeptidprodukter som har minst en del av den primære strukturkonf ormas jon og én eller_. flere av biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocytt-kolonistimulerende faktor med flere forskjellige virkninger. DNA-sekvenser som kan anvendes, viser seg spesielt å omfatte: (a) DNA-sekvensen som er angitt i tabell VII og tabell VIII, eller de komplementære kjeder til denne; (b) en DNA-sekvens som hybridiserer (under slike hybridi-seringsbetingelser som her er vist, eller strengere betingelser) til DNA-sekvensene i tabell VII eller fragmenter derav; og (c) en DNA-sekvens som, hvis det ikke hadde vært for den genetiske kodes degenerasjon, ville ha hybridisert til DNA-sekvensen i tabell VII. Spesielt omfattet i del (b) er genom-DNA-sekvenser som koder for alleliske variantformer av hpG-CSF og/eller koder for andre pattedyrarter av granulocytt-kolonistimulerende faktor med flere forskjellige virkninger. Spesielt omfattet av del (c) er fremstilte DNA-sekvenser som koder for hpG-CSF, fragmenter av hpG-CSF og analoger av hpG-CSF, DNA-sekvenser som kan omfatte kodoner som letter translasjon av budbringer-RNA i mikrobielle verter. Slike fremstilte sekvenser kan lett konstrueres ifølge metodene
til Alton et al., PCT publisert søknad nr. WO 83/04053.
Fremstilt ved foreliggende oppfinnelse er den klassen av polypeptider som kodes for av deler av DNA-komple-mentet til den øverste kjeden i human cDNA- eller genomiske DNA-sekvenser ifølge tabellene VII og VIII, dvs. "komple-mentært inverterte proteiner" som beskrevet av Tramontano et al., Nucleic Acids Res., 12, 5049-5059 (1984).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking under egnede næringsbetingelser av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med en renset og isolert DNA-sekvens som koder for ekspresjon av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocyttkolonistimu-lerende faktor (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger, og en del av eller hele hpG-CSF-aminosyresekvensen angitt i tabellene VII og VIII, eller en polypeptidanalog derav med samme biologiske virkning, og isolering av ønskede polypeptidprodukter fra ekspresjonen av_. DNA-sekvenser. Avhengig av den verten som anvendes, kan polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen være glycosylerte med pattedyr- eller andre eukaryote carbohydrater, eller kan være ikke-glycosylerte. Polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en initiell methionin-aminosyrerest ( i stilling -1).
Polypeptidene kan anvendes i farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av polypeptidprodukter fremstilt ifølge oppfinnelsen sammen med egnede fortynningsmidler, hjelpestoffer og/eller bærere som kan anvendes i hpG-CSF-terapi.
Polypeptidproduktet kan "merkes" ved tilknytning til et påvisbart markørstoff (f.eks. merkes radioaktivt med<125>I), hvorved det fåes reagenser som kan brukes ved påvisning og kvantifisering av human hpG-CSF i faste vev- og væskeprøver, slik som blod og urin. DNA-produkter som anvendes kan også merkes med påvisbare markører, (slik som radioaktive markører og ikke-isotopiske markører, slik som biotin), og anvendes i fremgangsmåter for DNA-hybridisering for å lokalisere stillingen til det humane hpG-CSF-gen og/eller stillingen til en nær beslektet genfamilie i et kromosomkart. De kan også brukes til å identifisere feil i det humane hp-CSF-gen på DNA-nivået og brukes som genmarkører for å identifisere nabogener og feil i disse.
Polypeptidproduktet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan, alene eller sammen med andre faktorer for bloddannelse eller legemidler, være anvendbar ved behandlingen av feil i bloddannelsen, slik som aplastisk anemi. De kan også være anvendbar ved behandlingen av mangler i bloddannelsen som oppstår av kjemoterapi eller av stråleterapi. F.eks. kan vel-lykketheten ved benmargstransplantasjon økes ved anvendelse av hpG-CSF. Sårhelende behandling av brannskade og behandling av bakteriebetennelse kan også dra nytte av anvendelse av hpG-CSF. I tillegg kan hpG-CSF også være nyttig ved behandlingen av leukemier basert på en rapportert evne til å differensiere leukemiceller. Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985) og Sachs, supra.
En rekke aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil være åpenbare for fagfolk innen teknikken ut fra den nærmere beskrivelse nedenunder som gir illustrasjoner på utøvelsen av oppfinnelsen ved dens for tiden foretrukne utførelsesformer. Kort beskrivelse av tegningene
Figuren er et partielt restriksjonsendonukleasekart over hpG-CSF-genet ledsaget av piler som viser den sekven-seringsstrategi som er brukt for å komme frem til genomsekvensen.
Nærmere beskrivelse
I forbindelse med oppfinnelsen er DNA-sekvenser som koder for en del av eller hele polypeptidsekvensen til hpG-CSF, blitt isolert ogkarakterisert.
De følgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen og er spesielt rettet mot fremgangsmåter utført før identifikasjon av hpG-CSF-cDNA og -genomkloner, mot fre-gangsmåter som fører til slik identifikasjon, og mot sekvenseringen, utviklingen av ekspresjonssystemer basert på cDNA, genomgener og fremstilte gener, og verifikasjon av ekspresjon av hpG-CSF og analoge produkter i slike systemer.
Nærmere bestemt er eksempel 1 rettet mot aminosyre-sekvensering av hpG-CSF. Eksempel 2 er rettet mot fremstillingen av et cDNA-bibliotek for screening av kolonohybridi-sering. Eksempel 3 vedrører konstruksjon av hybridiseringsprober. Eksempel 4 vedrører hybridiseringsscreening, identifikasjon av positive kloner, DNA-sekvensering av en positiv cDNA-klon og frembringelsen av informasjon vedrørende primær polypeptidstrukturkonformasjon (aminosyresekvens). Eksempel 5 er rettet mot identifikasjonen og sekvenseringen av en genomklon som koder for hpG-CSF. Eksempel 6 er rettet mot konstruksjonen av et fremstilt gen som koder for hpG-CSF, hvor det anvendes kodoner som begunstiges av E. coli.
Eksempel 7 er rettet mot fremgangsmåter for konstruksjon av en E. coil transformasjonsvektor som omfatter hpG-CSF-kodende DNA, bruken av vektoren i proKaryot ekspresjon av hpG-CSF, og analyse av egenskaper til fremstilte rekombinante produkter. Eksempel 8 er rettet mot fremgangsmåter for frem-bringelse av analoger av hpG-CSF hvor cysteinrester er erstajt-tet med en annen egnet aminosyrerest ved hjelp av mutagenese utført på DNA som koder for hpG-CSF. Eksempel 9 er rettet mot fremgangsmåter for konstruksjon av en vektor som omfatter hpG-CSF-analog-kodende DNA avledet fra en positiv cDNA-klon, bruken av vektoren for transfeksjon av COS-l-celler, og de transfiserte celler i vekst i kultur. Eksempel 10 vedrører fysiske og biologiske egenskaper hos rekombinante polypeptidprodukter fremstilt ifølge oppfinnelsen.
Eksempel 1
A.Sekvensering av materiale tilveiebragt ved hjelp av metoder ifølge litteraturen
En prøve (3-4 ug, 85 - 90% ren etter SDS, sølvfarge-PAGE) av hpG-CSF ble erholdt fra Sloan Kettering Institute, New York, New York, isolert og renset i henhold til Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1630 (1985).
Den N-terminale aminosyresekvens til denne prøve av hpG-CSF ble bestemt i et forsøk nr. 1 ved mikrosekvens-analyse under anvendelse av et AB407A gassfase-sekvensapparat (Applied Biosystems, Foster City, California) for å tilveie-bringe sekvensinformasjonen som er angitt i tabell I nedenunder. I tabellene I - IV er det anvendt en bokstavkoder, "X" betegner en rest som ikke ble entydig bestemt, og rester i paranteser ble bare alternativt eller forsøksvis utpekt.
En stor grad av bakgrunnsforstyrrelse var tilstede i hver runde av forsøket som det er gjengitt resultater for i tabell I, noe som indikerer at prøven hadde mange forurensende bestanddeler, sannsynligvis i form av kjemiske rester fra rensing. Sekvensen ble beholdt bare for bruk som referanse.
I forsøk nr. 2 ble en andre prøve (5-6 ug,,~95% ren) erholdt fra Sloan Kettering som for forsøk nr. 1 og det ble utført en sekvenseringsprosedyre som for forsøk nr. 1. Denne prøven var fra det samme parti av materiale som ble anvendt til å frembringe figur 4 hos Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985). Resultatene er gjengitt i tabell II.
Selv om flere rester ble identifisert, ga ikke forsøk nr. 2 en tilstrekkelig lang, entydig sekvens hvorfra et rimelig antall prober kunne konstrueres for å lete etter hpG-CSF-DNA. Det ble beregnet at minst 1536 prober ville ha vært påkrevet for å forsøke isolering av cDNA basert på sekvensen ifølge tabell II. Igjen ble det antatt at forurens-ning av prøven var problemet.
Følgelig ble det erholdt en tredje prøve (3-5 ug, 40% ren) fra Sloan Kettering som ovenfor. Dette preparatet ble elektroblottet etter separasjon ved hjelp av SDS-PAGE i et forsøk på ytterligere rensing. Sekvensanalyse av denne
prøven ga ingen data.
(B) Sekvensering av materialer tilveiebragt ved hjelp av reviderte metoder
For å oppnå en tilstrekkelig mengde rent materiale til å utføre passende avgrenset aminosyresekvensanalyse, ble det erholdt celler fra en urinblære-carcinomcellelinje 5637 (sub-klon 1A6) fremstilt ved Sloan-Kettering fra dr. E. Platzer. Celler ble først dyrket i Iscove's medium (GIBCO, Grand Island, New York) i kolber inntil sammenflyting. Etter sammenflyting ble kulturene trypsinert og plassert i rulleflasker
(1 - 1/2 kolber/flaske) som hver inneholdt 25 ml forkondi-sjonert Iscove's medium under 5% C02. Cellene ble dyrket over natten ved 37°C ved 0,3 rpm.
Cytodex-l-kuler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ble vasket og sterilisert ved å bruke følgende fremgangsmåter. 8 g kuler ble innført i en flaske og 400 ml PBS ble tilsatt. Kulene ble oppslemmet ved forsiktig rotering i 3 timer. Etter å ha latt kulene få synke ned, ble PBS trukket av, kulene ble skylt i PBS og frisk PBS ble tilsatt. Kulene ble auto-klavert i 15 minutter. Før bruk ble kulene vasket i Iscove's medium + 10% kalveforsterserum (FCS) før det ble tilsatt friskt medium + 10% FCS for å oppnå behandlede kuler.
Etter fjerning av alt bortsett fra 30 ml av mediet
fra hver rulleflaske, ble det tilsatt 30 ml friskt medium + 10% FCS og 40 ml behandlede kuler til flaskene. Flaskene ble gasset med 5% CC^og alle boblene ble fjernet ved avsuging. Flaskene ble plassert i rullerader ved 3 rpm i en halv time før hastigheten ble redusert til 0,3 rpm. Etter 3 timer ble en ytterligere kolbe trypsinert og tilsatt hver rulleflaske som inneholdt kuler.
Ved 40 - 50% sammenflyting ble rulleflaskekulturene vasket med 50 ml PBS og rotert i 10 minutter før fjerning
av PBS. Cellene ble dyrket i 48 timer i medium A (Iscove's medium som inneholdt 0,2% FCS, 10 hydrokortison, 2 mm glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml strepto-mycin) . Deretter ble kultursupernatanten innhøstet ved sentrifugering ved 3000 rpm i 15 minutter og lagret ved -70°C. Kulturene ble på nytt tilført medium A inneholdende 10% FCS
og ble dyrket i 4 8 timer. Etter at mediet var kassert, ble cellene vasket med PBS som ovenfor og dyrket i 48 timer i medium A. Supernatanten ble på nytt innhøstet og behandlet som tidligere beskrevet.
Omtrent 30 liter medium kondisjonert ved hjelp av 1A6-celler ble oppkonsentrert til ca. 2 liter på en Millipore<®>-. Pellicon-enhet utstyrt med 2 kassetter med avkuttinger med molekylvekt 10.000, ved en filtreringshastighet på ca. 200 ml/minutt og en tilbakeholdelseshastighet på ca. 1000 ml/ minutt. Konsentratet ble diafiltrert med ca. 10 liter 50 mM Tris (pH 7,8) under anvendelse av det samme apparat og de samme strømningshastigheter. Det diafUtrerte konsentrat ble påfylt ved 4 0 ml/minutt på en 1 liters DE-cellulose-kolonne ekvilibrert i 50 mM Tris (pH 7,8). Etter påfylling ble kolonnen vasket ved den samme hastighet med en 1 liter 50 mM Tris (pH 7,8) og deretter med 2 liter 50 mM Tris (pH 7,8)
med 50 mM NaCl. Kolonnen ble så i rekkefølge eluert med 6
én liters oppløsninger av 50 mM Tris (pH 7,5) som inneholdt følgende konsentrasjoner av NaCl: 75mM, 100 mM, 125 mM,
200 mM og 300 mM.Fraksjonene (50 ml) ble samlet opp og aktive fraksjoner ble slått sammen og oppkonsentrert til 65 ml på
en Amicon ultrafiltreringscelleenhet med omrøring utstyrt med en YM5-membran. Dette konsentratet ble fylt på en 2 liter AcA54 gelfiltreringskolonne ekvilibrert i PBS. Kolonnen ble kjørt ved 80 ml/time og 10 ml fraksjoner ble samlet opp. Aktive fraksjoner ble slått sammen og påfylt direkte på en
CA væskekromatografikolonne med høy yteevne (HPLC).
Prøver som varierte i volum fra 125 ml til 850 ml, og som inneholdt 1 - 8 mg protein hvorav ca. 10% var hpG-CSF, ble fylt på kolonnen ved en strømningshastighet som varierte fra 1 ml til 4 ml pr. minutt. Etter påfylling og en innledende vasking med 0,1 M ammoniumacetat (pH 6,0 - 7,0) i 80% 2-propanol ved en strømningshastighet på 1 ml/minutt, ble 1 ml store fraksjoner samlet opp og undersøkt med hensyn på proteiner ved 220 nm, 260 nm og 280 nm.
Som et resultat av rensing ble fraksjoner som inneholdt hpG-CSF klart separert (som fraksjoner 72 og 72 av 90) fra andre protein-holdige fraksjoner. hpG-CSF ble isolert
(150 - 300 ug) ved en renhet på ca. 85 - 5% og et utbytte på ca. 50%. Fra dette rensede materiale ble 9 ug brukt i forsøk nr. 4, en aminosyresekvensanalyse hvor proteinprøven ble til-ført en TFA-aktivert glassfiberplate uten polybren. Sekvensanalyse ble utført med en AB 470A-sekvenser ifølge fremgangsmåtene til Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1-981) og Lai,Anal. Chim. Acta, 163, 243-248 (1984). Resultatene fra forsøk nr. 4 fremgår av tabell III.
Etter 31 sykluser i forsøk nr. 4 (svarende til rest 31 i tabell III) ble det ikke oppnådd noen ytterligere signifikant sekvensinformasjon. For å oppnå en lengre utve-tydig sekvens ble 14 ug hpG-CSF renset fra kondisjonert medium redusert med 10 yl p-mercaptoethanol i 1 time ved 45°C i et forsøk nr. 5, deretter grundig tørket under vakuum. Proteinresten ble så på nytt oppløst i 5% maursyre før den ble tilført en polybrenisert glassfiberplate. Sekvensanalyse ble utført som for forsøk nr. 4 ovenfor. Resultatene fra forsøk nr. 5 er gjengitt i tabell IV.
Aminosyresekvensen som er gjengitt i tabell IV var tilstrekkelig lang (44 rester) og entydig til å konstruere prober for å oppnå hpG-CSF-cDNA som beskrevet nedenunder.
Eksempel 2
Blant standardfremgangsmåter for isolering av cDNA-sekvenser av interesse er fremstillingen av plasmidbårne cDNA-"bibliotek" avledet fra revers-transkripsjon av mRNA som det finnes rikelig av av donorceller valgt på grunnlag av ekspresjon av et målgen. Når vesentlige deler av aminosyresekvensen til et polypeptid er kjent, kan det anvendes merkede, énkjedede DNA-probesekvenser som duplikerer en sekvens som antas å være tilstede i "mål"-cDNA, i DNA/DNA-hybridiserings-fremgangsmåter utført på klonede kopier av den cDNA som er blitt denaturert til énkjedet form. Weissman et al., U.S. patentskrift nr. 4 394 443; Wallace et al., Nucleic Acids Res., 3543-3557 (1979), Reyes et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 19, 3270-3274 (1982) og Jaye et al., Nucleic Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). Se også U.S. Patentskrift nr. 4 358 535 som vedrører DNA/DNA-hybridiseringsfremgangs-måter for å utføre diagnoser, og Davis et al., "A Manual
for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980), sider 55 - 58 og 174 - 176 som vedrører koloni- og plakk-hybridiseringsteknikker.
Total RNA ble ekstrahert fra omtrent 1 g celler fra
en urinblære-carcinomcellelinje 5537 (1A6) ved å bruke en guanidinthiocyanatfremgangsmåte for kvantitativ isolering av intakt RNA. [Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299
(1979)].
Den sterile vandige RNA-oppløsning inneholdt total RNA fra I 6-cellene. For å oppnå bare budbringer-DNA fra den totale RNA-oppløsning, ble oppløsningen sendt gjennom en kolonne som inneholdt oligodeoxythymidylat [oligo(dT)] (Colla-borative Research, Inc., Waltham, Massachusetts. Poly-adeny-lerte (poly-A<T>) haler som er karakteristiske for budbringer-RNA fester seg til kolonnen mens ribosom-RNA elueres. Som et resultat av denne fremgangsmåte, ble det isolert omtrent 90 ug poly-adenylart budbringer-RNA (poly-A<+->mRNA). Den iso-lerte poly-A<+->budbringer-RNA var forbehandlet med methyl-kvikksølvhydroxyd (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts) ved en sluttkonsentrasjon på 4 mM i "5 minutter ved værelsetemperatur før bruk i en cDNA-reaksjon. Methylkvikksølvhydroxyd-behandlingen denaturerte reaksjonsprodukter av budbringer-RNA, både med seg selv og med forurensende molekyler som inhiberer translasjon. Payvar et al., J. Biol. Chem., 258, 7636-7642
(1979).
Ifølge Okayama-fremgangsmåten [Okayama et al., Molecular&Cellular. Biology, 2, 161-170 (1982)], ble en cDNA-bank fremstilt ved å bruke mRNA erholdt fra IA6-celler. cDNA-ene ble deretter transformert ved inkubasjon i en vertmikro-organisme E. coli K-12 stamme HB101 for forsterkning.
Eksempel 3
Hybridiseringsprober utformet på grunnlag av den hpG-CSF-aminoterminale sekvens ifølge tabell IV besto av et sett av 24 oligonukleotider som hver var 23 baser lange og inneholdt 3 inosinrester. Probeoligonukleotidene ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Caruthers et al., Genetic Engi-
32
neer ing, 4_, 1-18 (1982) og merket med 7- P ATP ved kinase-behandling med polynukleotidkinase. Probeoligonukleotidene som svarte til budbringer-RNA for restene 23-30 i sekvensen ifølge tabell IV, er illustrert i tabell V.
Opprettelsen av nøytralitet hos I var basert på det publiserte arbeide av Takahashi et al., Proe. Nati. Acad.
Sei. ( USA), 82, 1931-1935 (1985) og Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985). Inosin kan imidlertid ha en destabiliserende virkning dersom det er baseparet med et G eller T. Ifølge Takahashi et al. kan inosiner vise seg å ha en nøytral virkning ettersom de gjennomsnittlig kommer ut som en gruppe nær nøytralitet (f.eks. tre som på gunstig måte har dannet par med C og to som ikke-på gunstig måte danner par med T).
For å teste virkningen av. at I har dannet basepar med G, ble det utformet kontrollforsøk ved å bruke en.N-myc-gen-sekvens og klon. Sekvensene tatt ut fra N-myc-genet hadde det samme totale G- og C-innhold i de to første stillingene i hvert kodon, slik det var foreskrevet ved hjelp av hpG-CSF-probene. Således hadde N-myc-testprobene den samme lengde, inneholdt I-er i de samme relative stillinger og hadde potensielt den samme gjennomsnittlige Tm (62 - 66°C, hvor de 3 eller 4 inosinrestene inkludert ikke telte med) som hpG-CSF-probene.
Det ble konstruert to sett med N-myc-testprober ifølge fremgangsmåten til Caruthers et al., supra. Sett I omfattet som vist i tabell VI: 1, en 23 mer med perfekt tilpasning;
2, hvor tre C-er i tredje stilling var erstattet med I-er slik at det verst mulige tilfelle for tilsetning av I-er var frembragt; og 3, hvor fire C-er i tredje stilling var erstattet med I-er. Det andre settet av testprober ble utformet for å utgjøre en mer tilfeldig fordeling av inosin-basepar som ville kunne gi en samlet nøytral baseparingseffekt. Sett II omfattet som vist i tabell VI: 4, inneholdende to I-er
som ville danne basepar med C-er, og en med en G; og 5, iden-
tisk med 4, med tillegg av et I:G-basepar mer.
Fem replikafiltere som inneholdt N-myc-DNA-sekvenser
og kylling-veksthormon-DNA-sekvenser (som en negativ kontroll), ble oppvarmet i en vakuumovn i 2 timer ved 80°C før hybridisering. Alle filtrene ble hybridisert som beskrevet i eksempel 4 for hpG-CSF-probene, bortsett fra at hybridiserings-tiden bare var 6 timer. Filtrene ble vasket tre ganger ved værelsetemperatur, deretter én gang ved 45°C, 10 minutter hver. Filtrene ble undersøkt med en Geiger-teller.
Filteret som representerte N-myc-probe 3 ga et svært svakt signal i forhold til de øvrige fire filtrene med prober og ble ikke vasket noe mer. Etter vasking i 10 minutter ved 50°C ga Geiger-telleren følgende prosentvise signal, idet Probe 1 var satt til 100%: Probe 2: 20%, Probe 3 (45°C):2%, Probe 4: 92% og Probe 5: 75%. Etter vasking ved 55°C var prosenttallene: Probe 2: 16%, Probe 4: 100% og Probe 5: 80%. En sluttvask ved 60°C ga følgende prosenttall: Probe 2: 1,6%, Probe 4: 90% og Probe 5: 70%.
I nærvær av tre I-er, som i Probe 2 og 4, ble det således iakttatt opp til en 60 gangers forskjell i signal når den teoretiske Tm (I-er ikke inkludert i beregningen) nåes [basert på et verste tilfelle I-baseparing (Probe 2) og et forholdsvis nøytralt I-basparingstilfelle (Probe 4)].
Den standardiseringsinformasjon som ble vunnet ved hjelp av N-Myc-testhybridiseringene ble benyttet ved vasking og undersøkelse av hpG-CSF-hybridiseringen som angitt nedenunder, for å måle den sikkerhetsgrad som resultatene fra mindre nøye vasking kan aksepteres ved.
Eksempel 4
Ifølge fremgangsmåten til Hanahan et al., J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983), ble bakterier som inneholdt rekombi-nanter med cDNA- innskudd fremstilt ifølge eksempel 2 spredd ut på 24 nitrocellulosefiltere (Millipore<®>, Bedford, Massachusetts) lagt på agarplater. Platene ble deretter inkubert slik at det ble etablert omtrent 150.000 kolonier som ble replika-utplatet på 24 andre nitrocellulosefiltere. Replikaene ble inkubert inntil utydelige kolonier kom til syne. Bakteriene på filtrene ble lysert på ark av Whatman 3 mm papir såvidt mettet med natriumhydroxyd (0,5M) i 10 minutter, deretter blottet med Tris (IM) i 2 minutter etterfulgt av blotting med Tris (0,5M) som inneholdt NaCl (1,5M) i 10 minutter. Da filtrene var nesten tørre, ble de varmet opp i 2 timer ved 8 0°C
i en vakuumovn før nukleinsyrehybridisering. [Wahl et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 76, 3683-3687 (1979)] og Mania-tiset al., Cell, 81, 163-182 (1976).
Filtrene ble forhybridisert i 2 timer ved 65°C i 750
ml 10X Denhardfs, 0,2% SDS og 6X SSC. Filtrene ble skylt i 6X SSC, deretter ble fire plassert i en pose og hybridisert i 14 timer i 6X SSC og 10X Denhardfs. Det var omtrent 15 ml oppløsning pr. pose som inneholdt 50 x 10 cpm -P-merket probe (oligonukleotider).
Etter hybridisering ble filtrene vasket tre ganger i
6X SSC (1 liter/vask) ved værelsetemperatur i 10 minutter hver. Filtrene ble så vasket to ganger ved 45°C i 15 minutter hver, en gang ved 50°C i 15 minutter og en gang ved 55°C i 15 minutter under anvendelse av 1-litervolumer i 6X SSC. Filtrene ble autoradiografert i 2 timer ved -70°C under anvendelse av et forsterkergitter og Kodak<®>XAR-2-film. På den autoradio-graf ble det påvist 40 - 50 positive signaler, deriblant 5 svært sterke signaler.
Områdene som inneholdt de fem sterkeste signalene og ytterligere fem positive områder ble avskrapet fra master-platene og på nytt platet ut for en andre screening under anvendelse av den samme probeblanding under de samme betingelser. Vaskefremgangsmåten adskilte seg ved at høytemperatur-vaskingene besto av to ved 55°C i 15 minutter hver og deretter en ved 60°C i 15 minutter. Basert på N-myc-probeunder-søkelsen ifølge eksempel 3 ble sluttemperaturene ved vasking i den andre screening økt fordi aggregatsmeltepunktet for de 24 23-merer var 60 - 6 8°C, det samme som for N-myc-probene. Like etter den andre vasking ved 55°C ble filtrene etterlatt fuktige og det ble utført en autoradiografering. Sammenligning av denne autoradiografering med den andre autoradiografering utført for et lignende tidsrom etter en sluttvasking ved 60°C, viste at bare to av de ti klonene som ble testet, ikke led av et vesentlig tap i signal når man økte fra 55 til 60°C. Disse to klonene ble senere vist å ha nesten identiske lengder og restriksjonsendonukleasemønstere. En klon betegnet Ppo2 ble valgt, ut for sekvensering.
Sekvensering av den rekombinante hpG-SCF-cDNA-klon, Ppo2, oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor ble ut-ført ved hjelp av dideoxymetoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 74, 5463-5467 (1977). Den énkjedede DNA-fag M-13 ble brukt som en kloningsvektor for å skaffe tilveie énkjedede DNA-templater fra de dobbeltkjedede cDNA-kloner. Metoden til Sanger et al. avslørte den sekvens som er gjengitt i tabell VII ledsaget av dens aminosyretranslasjon og en komplementær kjede i det polypeptidkodende område.
Følgende kjennetegn ved sekvensen ifølge tabell VII
er verd å merke seg. Ved 5 *-enden i sekvensen er det vist baser svarende til de i poly G cDNA-linkeren. Det oppstår så ca. 5 baser (betegnet som "N") med en sekvens som ikke lett kunne bestemmes éntydig ved hjelp av metoden til Sanger et al. på grunn av de mange G-er som går forut. Sekvensen legger deretter for dagen en serie på 12 kodoner som koder for en del av en antatt ledersekvens for polypeptidet. Basert på samsvarhet med N-aminosekvensen i naturlige isolater av hpCSF beskrevet i eksempel 1, er den første threoninrest: i den antatt "ferdige" form av hpG-CSF angitt ved +1. Ferdig hpG-CSF viser seg deretter å omfatte 174 rester som angitt. Etter "stopp"-kodonet (OP-kodonet, TGA) kommer det omtrent 856 baser av en ikke-translatert 3'-sekvens og flere A-er av poly A "halen". Unike HgiAi- og Apal-restriksjonsendonukleaser-gjenkjenningssteder, samt to Stul-steder (omtalt nedenunder når det gjelder konstruksjon av prokaryote og eukaryote ekspresjonssystemer) er også betegnet i tabell VII. På grunn av mangel på asparaginrester i polypeptidet, er det ingen klare steder for N-glycosylering. De understrekede 6 baser nær enden av den 3'-ikke-translaterte sekvens utgjør et potensielt polyadenyleringssted. ;Det er verd å merke seg at hver av to ytterligere cDNA-kloner identifisert ved hjelp av hybridiseringsfrem-gangsmåtene beskrevet ovenfor, fra et samlet antall på 450.000 kloner, unnlot å ta opp DNA som koder for hele ledersekvensen fra transkripsjonsinitieringsstedet og fremover. Faktisk terminerte alle tre hpG-SCF-klonene i 5<1->området nøyaktig på samme tid, noe som indikerer at sekundærstrukturen til den transkriberte mRNA på ugunstig måte hindrer cDNA-dannelse utenfor dette sted. Som en sak av praktisk betydning, kunne derfor slik cDNA-ekspresjonsscreening som beskrevet iOkayama et al., Mol, and Cell. Biol., 3^, 280-289 (1983), og som faktisk anvendes for å isolere GM-CSF i Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985), kunne ikke lett ha vært anvendt til isolering av hpCSF-DNA ettersom slike isoleringssystemer vanligvis beror på tilstedeværelsen av en cDNA-transkript ;i full lengde i de analyserte kloner. ;Sekvensen ovenfor er ikke lett mottagelig for sikring av direkte ekspresjon av hpG-CSF i en mikrobevert. For å sikre slik ekspresjon, bør det hpG-CSF-kodende område være forsynt med et første ATG-kodon og sekvensen bør være innskutt i en transformasjonsvektor på et sted som er under kontroll av en egnet promoter/regulator-DNA-sekvens. ;Eksempel 5 ;I dette eksemplet ble cDNA som koder for hpG-CSF som isolert i eksemplet ovenfor, brukt til å undersøke en genomklon. Et genombibliotek med fag lambda human fosterlever, (fremstilt ifølge fremgangsmåten til Lawn et al., Cell, 15, 1157-1174 (1978) og erholdt fra T. Maniatis) undersøkt ved å bruke en "nick"-translatert probe bestående av to hpG-CSF-cDNA-fragmenter isolert ved oppløsning med HgiAI og Stul ( HgiAI til Stul, 649 b.p., Stul til Stul, 639 b.p.). Tilsammen ble omtrent 500.000 fager platet ut på 12 (15 cm) petriskåler og plakk tatt ut og hybridisert til probe ved å bruke fremgangsmåten til Benton/Davidson [Benton et al., Science, 196, 180 (1977)]. Det ble tilsammen iakttatt 12 positive kloner. Tre kloner (1-3) som ga de sterkeste signaler etter autoradiografi i en sekundær screening, ble dyrket i 1 liter kulturer og kartlagt ved hjelp av restrik-sjonsenzymoppløsning og Southern-blotting under anvendelse av et radioaktivt merket 24-mer oligonukleotid (kinase behandlet med7-<32>P- ATP)5'-CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3<1>. Resultatene fra kartleggingen viste at isolatene 1 og 3 var identiske, og at to inneholdt 2000 ytterligere baser 5' til hpG-CSF-genet. Klon 2 ble derfor brukt til ytterligere karakterisering. DNA fra klon 2 ble oppløst med Ri for å frigi en 8500 bp hpG-CSF som inneholder fragment som deretter ble subklonet inn i pBR322, og ytterligere kartlagt ved hjelp av restriksjonsnedonuklaseoppløsninger, Southern-blotting,M13-subkloning og sekvensering. Sekvensen som ble oppnådd, er som angitt i tabell VIII. ; ;
Et restriksjonsendonukleasekart (omtrent 3,4 Kb) av genom-DNA som inneholdt hpG-CSF-genet, er spesifisert i fig. ;1. Restriksjonsnedonukleasene som er vist i figur 1 er: ;Ncol, N; Pstl, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X og Kpn, K. Pilene under kartet viser sekvenseringsstrategien som ble brukt for å oppnå genomsekvensen. De innrammede områder er~ de som ble funnet i cDNA-klonen, idet rammen med stiplet åpen ende representerer en sekvens som ikke var tilstede i cDNA-klonen, men identifisert ved å undersøke mRNA-flekker. Identifikasjonen av de antatte kodende sekvenser for exon 1 ble utført ved hjelp av Northern blotteanalyse. En 24-mer 5 > 3» oligonukleotidprobe, -CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT , som spente over sammenknytningspunktene for exoner 1 og 2 som var forutsagt, ble hybridisert til hpG-CSF-mRNA i et Northern blotteformat. Den resulterende flekk oppviste en mRNA med den samme størrelse (ca. 1650 bp) som den som fåes med en exon 2 oligonukleotidprobe. Disse data sammen med evnen til å styre ekspresjon av hpG-CSF fra pSVGM-Ppol-vektoren (eksempel 9) under anvendelse av Met-initieringkodonet vist i tabell VIII, definerer de kodende sekvenser som finnes i exon 1. Exonene 1-5 defineres ved hjelp av de kodende sekvenser erholdt i cDNA-klonen i hpG-CSF-genet (tabell VII). ;Eksempel 6 ;Dette eksemplet vedrører fremstilling av et produsert gen som koder for hpG-CSF og omfatter E. coli preferansekodoner. ;I korte trekk var den anvendte fremgangsmåte som angitt i beskrivelsen i PCT patentsøknad nr. WO83/04053. Genene ble utformet for først å samle komponentoligonukleotider i multiple duplekser som deretter ble samlet i tre adskilte avsnitt. Disse avsnittene ble utformet for hurtig forsterkning og, etter fjerning fra forsterkningssystemet, kunne de samles i rekkefølge eller gjennom en flertrinns fragment-ligering i en egnet ekspresjonsvektor. ;Konstruksjonen av avsnittene I, II og III er illustrert i tabellene IX - XIV. Ved konstruksjonen av avsnitt I ble, som vist i tabellene IX og X, oligonukleotidene 1-14 samlet i 7 duplekser (1 og 8), 2 og 9, 3 og 10, 4 og 11, 5 og 12, 6 og 13, og 7 og 14). Disse dupleksene ble deretter ligert slik at de utgjorde avsnitt I som vist i tabell X. Det kan også legges merke til i tabell X at avsnitt I omfatter en oppstrøms Xbal klebrig ende og en nedstrøms BamHI klebrig ende som kan benyttes til ligering for å forsterke og ut- — trykke vektorer, og for ligering til avsnitt II. ; Som vist i tabellene XI og XII, ble oligonukleotidene 15 - 30 ved konstruksjonen av avsnitt II samlet i 8 duplekser (15 og 23, 16 og 24, 17 og 25, 18 og 26, 19 og 27, 20 og 28, 21 og 29 og 22 og 30). Disse 8 dupleksene ble deretter ligert, hvorved man fikk avsnitt II, som vist i tabell XII. Som videre vist i tabell XII, har avsnitt II en oppstrøms BamHI klebrig ende og en nedstrøms EcoRI klebrig ende som kan brukes for ligering til en forsterkningsvektor og for ligering til avsnitt I. Nær sin nedstrøms ende omfatter avsnitt II også et nedstrøms Sstl-sted som kan brukes i den eventuelle ligering av avsnittene II og III. Til slutt ble avsnitt III konstruert som vist i tabellene XIII og XIV. Til denne konstruksjon ble oligonukleotidene 31 - 42 samlet i 6 duplekser (31 og 37, 32 og 38, 33 og 39, 34 og 40, 35 og 41 og 36 og 42). De 6 dupleksene ble deretter ligert, hvorved man fikk avsnitt III som vist i tabell XIV. Som også vist i tabell XIV omfatter avsnitt Ill-en oppstrøms BamHI klebrig ende og on nedstrøms EcoRI klebrig ende som kan brukes for ligering i en forsterkningsvektor, og i det minste i tilfellet med EcoRI-enden, i en ekspresjonsvektor. I tillegg har avsnitt III et oppstrøms Sstl-sted som kan brukes ved den eventuelle ligering av avsnittene II og III. ;
Fragmentet fra Xbal til BamHI dannet av avsnitt I ble ligert inn i en M13mpll fagvektor som var åpnet med Xbal ogBamHI. Vektoren ble deretter på nytt åpnet ved oppløsning medBamHI og EcoRI etterfulgt av ligering med BamHI-EcoRI-fragmentet dannet av avsnitt II. På dette trinn var avsnittene I og II blitt knyttet sammen i korrekt orientering. Deretter ble en annen M13mpll-vektor åpnet ved hjelp av BamHI- EcoRI-oppløsning og deretter ligert med BamHI- EcoRI-fragmentet dannet av avsnitt III. ;Vektoren som inneholdt avsnittene I og II, ble opp-løst med Xbal og Sstl. På samme måte ble vektoren som inneholder avsnitt III, oppløst med Sstl og EcoRI. Begge de minste av de to fragmentene som fåes fra hver oppløsning, ble ligert inn i et plasmid pCFM1156 som på forhånd var blitt åpnet med Xbal og EcoRI. Produktet fra denne reaksjon var et ekspre-sjonsplasmid som inneholder en sammenhengende DNA-sekvens som vist i tabell XV, og som koder for hele hpG-CSF-polypeptidet med et aminoterminalt methioninkodoii (ATG) for E. coli translasjonsinitiering. ;
Selv om hvilken som helst egnet vektor kan anvendes til å uttrykke denne DNA, kan ekspresjonsplasmidet pCFM1156 lett konstrueres fra et plasmid pCFM836, hvis konstruksjon er beskrevet i den publiserte europeiske patentsøknad nr. 136 490. pCFM836 ble først kuttet med Ndel og deretter gjort butt i endene med Poll slik at begge de foreliggende-Ndel-steder ble ødelagt. Deretter ble vektoren oppløst med Clal og SacII for å fjerne en tilstedeværende polylinker før ligering til en substituttpolylinker, slik som vist i tabell XVI. Denne substituttpolylinker kan konstrueres ifølge fremgangsmåten til Alton et al., supra. Kontroll av ekspresjon i ekspresjonsplasmidet pCFM1156 skjer ved hjelp av en lambda-PL<->promoter som selv kan være under kontroll av et C1857~ repressorgen (slik som det som er tilveiebragt i E. coli stamme Kl2AHtrp). ;
Eksempel 7 ;Dette eksempel vedrører ekspresjon i E. coli av et hpG-CSF-polypeptid ved hjelp av en DNA-sekvens som koder for [Met ]-hpCSF. Den anvendte sekvens var delvis syntetisk og delvis cDNA-avledet. I den syntetiske sekvens ble det brukt E. coli preferansekodoner. ;Plasmid Ppo2 som inneholder hpG-CSF-genet vist i tabell VII, ble oppløst med HgiAI og Stul slik at man fikk et fragment med omtrent 6 45 basepar inkludert genet for ferdig hpCSF (som vist i tabell VII) med syv av ledersekvens-kodonene i 5<1->enden og 100 basepar av 3<1->ikke-kodende område. HgiAI-oppløsning etterlot en klebrig 5<1->ende med 4 baser som er identisk med det som fåes med Pstl, og Stul etterlot en stump ende. Dette muliggjorde hurtig innskudd av fragmentet i M13 mp8 (Rf) kuttet med Pstl og med restriksjonsenzymet HincII som gir stumpe ender. Etter forsterkning i M13, ble hpG-CSF-DNA tatt ut ved oppløsning med Apal og BamHI som kutter henholdsvis ved Apal-stedet og strekker seg over kodonene for restene +3 til +5 i hpCSF, og ved et BamHI-sted "nedstrøms" fra HincII-stedet i M13 mp8 restriksjons-linkeren. For å muliggjøre ekspresjon i E. coli av hpG-CSF-polypeptidet, ble det fremstilt et syntetisk fragment som angitt i tabell XVII nedenunder. ;
Som det kan bestemmes ut fra analyse av tabell XVII, omfatter linkeren en Apal klebrig ende, kodoner som angir de første tre restene i aminoenden av hpG-CSF ("gjeninnsetter" ;12 3 ;de Thr -, Pro -, Leu -spesifiserende kodoner fjernet etter ;Apal-oppløsning av M13-DNA beskrevet ovenfor og som anvender kodoner som fortrinnsvis uttrykkes i E. coli), et translasjons-initierings-ATG, en sekvens med 24 basepar som gir et ribosom-bindende sted og en Xbal klebrig ende. \ ;Ekspresjonsvektoren som ble anvendt for ekspresjon i E. coli, var den som er beskrevet som pCFM536 i europeisk patentsøknad nr. 176 490, publisert 10. april 1975. (Se også A.T.C.C. 39974, E. coli JM103 som inneholder pCFM536). I korte trekk ble plasmid pCFM536 opløst med Xbal og BamHI. hpG-CSF-fragmentet ( Apal/ BamHI) og linkeren ( Xbal/ Apal) beskrevet ovenfor ble deretter ligert inn slik at det ble dannet et plasmid betegnet p536Ppo2. ;Plasmid p536Ppo2 ble transformert inn i en fag-resi-stent variant av E. coli AM7-stammen som tidligere var blitt transformert med plasmid pMWl (A.T.C.C. nr. 39933) ' som inne-857 ;holder et CI -gen. Transformasjon ble bekreftet på grunnlag av markørgenet for antibiotisk (amp)-resistens som .'bæres på ;-t ;pCFM536 forløperplasmidet. Kulturer av celler i LB dyrknings-væske (ampicillin 50 ug/ml) ble holdt ved 28°C og etter vekst av celler i kultur til A600 = 0,5, ble hpCSF-ekspresjon indu-sert ved å øke dyrkningstemperaturen til 42°C i 3 timer. Den endelige O.D. i kulturen var A600 =1,2. ;Ekspresjonsnivået for hpG-CSF i de transformerte celler ble bestemt på en SDS-polyacrylamidgel farget med "coomassie blue"-fargestoff til 3 - 5% av det totale cellulære protein. ;Cellene ble innhøstet ved sentrifugering ved 3500 g ;i 10 minutter i en JS-4.2-sentrifuge. Celler ved 25% (vekt/ volum) i vann ble brudt ned ved å passere tre ganger gjennom en "French Pressure Cell" ved 10.000 p.s.i. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 15 minutter ;i en JA-20-sentrifuge. Pelleten ble på nytt oppslemmet i vann og oppløseliggjort ved ca. 5 mg/ml totalt protein i 1% laurin-syre, 50 mM Tris, pH 8,7. Det oppløseliggjorte pelletmateriale ble sentrifugert ved 15.000 g i 10 minutter og det ble tilsatt 20 mM CuSO^til supernatanten. Etter 1 time ble denne prøven fylt på en C4 HPLC-kolonne for rensing i henhold til fremgangsmåtene ifølge eksempel 1 (B) , idet det. ble gjort regu-leringer for volum og konsentrasjon. ;En andre rensingsfremgangsmåte ble utviklet for å gi større mengder hpG-CSF formulert i en buffer uten organiske forbindelser. Dette materiale er egnet for in vivo under-søkelser. 150 g cellemasse ble på nytt oppslemmet i ca. 600 ;ml 1 mM DTT og sendt fire ganger gjennom en Manton Gualin homogenisator ved ca. 7000 PSI. Suspensjonen av nedbrudte - celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter og pelleten ble på nytt oppslemmet i 400 ml 1% deoxycholat (DOC), 5 mM EDTA, 5mM DTT og 50 mM Tris, pH 9. Denne suspensjon ble blandet ved værelsetemperatur i 30 minutter og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble på nytt oppslemmet i ca. 400 ml vann og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløseliggjort i 100 ml 2% "Sarkosyl" og 50 mM ;ved pH 8. CuS04ble tilsatt til 20 um og blandingen ble omrørt i 16 timer ved værelsetemperatur og deretter sentrifugert ved 20.000 g i 30 minutter. Til supernatanten ble det tilsatt 300 ml aceton. Denne blanding ble plassert på is i 30 minutter og deretter sentrifugert ved 5000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 250 ml 6 M guanidin og 40 mM natriumacetat ved pH 4, og sendt over en 1200 ml G-25-kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. hpG-CSF-toppen (ca. 400 ml) ble slått sammen og tilført en 15 ml CM-cellu-losekolonne ekvilibrert med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. Etter påfylling ble kolonnen vasket med 60 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 25 mM natriumklorid, og deretter ble kolonnen eluert med 200 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 37 mM natriumklorid. 150 ml av dette elueringsmiddel ble oppkonsentrert til 10 ml og tilført en 300 ml G-75-kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat og 100 mM natriumklorid ved pH 5,4. Toppfraksjonene som utgjorde 35 ml, ble slått sammen og filtersterilisert. Sluttkonsentra-sjonen av hpG-CSF var 1,5 mg/ml, var mer enn 95% ren bestemt ved analyse på en gel og inneholdt mindre enn 0,5 mg pyrogen pr. 0,5 mg hpG-CSF. Pyrogennivået ble bestemt ved å bruke et prøvesett for "Limulus Amebocyte Lysate" (LAL) (M.A. Bio-products, Walkersville, Maryland) . ;Eksempel 8 ;Dette eksempel vedrører bruken av rekombinante metoder for å generere analoger av hpG-CSF hvor tilstedeværende cysteinrester i posisjonene 17, 36, 42, 64 og 74 individuelt ble erstattet med en passende aminosyrerest. ;Stedrettede mutagenesefremgangsmåter ifølge Souza et al., publisert PCT patentsøknad nr. WO85/00817, publisert 28. februar 1985, ble utført på (Met-1 ]-kodende DNA fra plasmid p536Ppo2, beskrevet nedenunder, ved å bruke syntetiske oligonukleotider som varierte i størrelse fra 20 til 23 baser, slik som vist i tabell XVIII nedenunder. Oligonukleotid nr. ;1 ga dannelse av et gen som koder for [Ser 17]hpG-CSF, oligonukleotid nr. 2 ga dannelse av [Ser 3 6]hpG-CSF, osv. ;
De mot Cys til Ser stedrettede mutageneserestriksjoner ble utført ved å bruke M13 mplO med et Xbal- BamHI hpG-CSF-fragment isolert fra p536Ppo2 som et templat. DNA fra hver M13 mplO-klon inneholdende en Cys-Ser-substitusjon ble behandlet med Xbal og BamHI. Det resulterende fragment ble klonet inn i ekspresjonsvektor pCFM746 og ekspresjonspro-dukter ble isolert som i eksempel 7. ;Plasmidet pCFM746 kan konstrueres ved å spalte et plasmid pCFM73 6 (konstruksjonen av dette fra deponerte og ålment tilgjengelige materialer er beskrevet i Morris, publisertPCT patentsøknad nr. WO85/00829, publisert 28. februar 1985) med Clal og BamHI for å fjerne en tilstedeværende polylinker, og ved å bytte ut følgende polylinker. ;
Ved en rensefremgangsmåte for Cys-Ser-analoger fremstilt ifølge oppfinnelsen ble ca. 10 - 15 g cellemasse på nytt oppslemmet i 40 ml 1 mM DTT og sendt 3 ganger gjennom en "French Pressure Cell" ved 10.000 psi. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 1000 g i 30 minutter. Pelleten ble på nytt oppslemmet i 1% DOC, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 9 og fikk blandes i 30 minutter ved værelsetemperatur. Blandingen ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter, på nytt oppslemmet i 40 ml 1^0 og resentrifu-gert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 10 ml 2% "Sarkosyl", 50 mM DDT, 50 mM Tris, pH 8. Etter blanding i 1 time ble blandingen klaret ved sentrifugering ved 20.000 g i 30 minutter og deretter tilført en 300 ml G-75-kolonne ekvilibrert og betjent med 1% "Sarkosyl, 50 mM Tris, pH 8. Fraksjoner som inneholdt analogen, ble slått sammen og fikk oxyderes i luft ved henstand med eksponering mot luft i minst 1 dag. Sluttkonsentrasjonene varierte fra 0,5 til 5 mg/ml. ;Eksempel 9 ;I dette eksempel ble et ekspresjonssystem for pattedyrceller utformet for å sikre at et aktivt polypeptidpro-dukt av hpG-CSF-DNA kunne bli uttrykt i og utskilt fra pattedyrceller (COS-1, A.T.C.C. CRL-1650). Dette systemet ble utformet for å sørge for sekresjon av en polypeptidanalog til hpG-CSF via ekspresjon og sekresjonsbearbeiding av en delvis syntetisk, delvis cDNA-avledet konstruksjon som koder for [Ala^J-hpG-CSF som kommer etter et lederpolypeptid med den rekkefølge av rester som er tilskrevet human GM-CSF i Wong et al., Sience, 228, 810-815 (1985) og Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 4360-4364 (1985). ;Den ekspresjonsvektor som ble anvendt til foreløpige undersøkelser av ekspresjon av fremstilte polypeptidprodukter, var en 11 ferge "-vektor som omfatter både pBR322-og SV40-DNA som var blitt utformet for å gi autonom replika-sjon i både E. coli-celler og pattedyrceller, med pattedyrcelleekspresjon av innskutt eksogen DNA under kontroll av en virus-promoter/regulator-DNA-sekvens. Denne vektor, betegnet pSVDM-19, plassert i E. coli 101, ble deponert 3. august 1985, ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, og fikk tilvékstnum-meret A.T.C.C. 53241. ;De bestemte manipulasjoner som er involvert i konstruksjonen av ekspresjonsvektoren, var som følger. En leder-kodende DNA-sekvens ble syntetisert som angitt i tabell XX nedenunder. ;
Som angitt i tabell XX, omfatter sekvensen Hindlll ogApal klebende ender og kodoner for de 17 aminosyrerestene ;som tilskrives "lederen" til human GM-CSF. Det følger kodoner som angir en alaninrest, en prolinrest og en leucinrest. Pro-lin- og leucinrestene duplikerer aminosyrene som er tilstede i stillingen +2 og +3 i hpG-CSF, mens alaninresten er et duplikat av den første aminoenderesten (+1) i GM-CSF, og ikke i hpG-CSF. Erstatning av threonin med alanin ble bestemt for lettere å gi korrekt vertcelle-"processing off" av GM-CSF-lederen ved hjelp av cellulære mekanismer som vanligvis er involvert i sekretorisk behandling av GM-CSF. ;Plasmid pSVDM-19 ble oppløst med Kpnl og oppløsnings-stedet ble gjort stumpt i endene med Klenow-enzym. Deretter ble DNA kuttet med Hindlll. Det resulterende store fragment ble kombinert og ligert med Hindlll/ PvuII-fragment vist i tabell VII (isolert fra plasmid Ppo2 som det neststørste fragment som resulterte fra Hindlll-oppløsning og delvis oppløs-ning med PvuII), hvorved det ble dannet plasmid pSV-Ppol. ;Det fremstilte GM-CSF-ledersekvensfragment ifølge tabell ;VIII ble så ligert inn i pSV-Ppol (etter dets spalting med Hindlll og Apal), hvorved man fikk plasmid pSVGM-Ppol. ;Kalsiumfosfatutfellinger (1-5 ug) av plasmid pSVGM-Ppol-DNA ble transformert i doble 6 0 ml plater med COS-1-celler, i det vesentlige som beskrevet i Wigler et al., Cell, 14, 725-731 (1978). Som en kontroll, ble også plasmid pSVDM-19 transformert i COS-l-celler. Vevkultursupernatanter ble inn-høstet 5 dager etter transfeksjon og analysert med hensyn på hpG-CSF-aktivitet. Utbytter av [Ala<1>]hpG-CSF fra kultursupernatanten var i størrelsesorden 1 til 2,5 ug/ml. ;Etter vellykket ekspresjon av det [Ala<1>]hpG-CSF-produkt-kodende plasmid pSVGM-Ppol i COS-l-celler, ble en annen vektor konstruert som omfattet den humane GM-CSF-ledersekvens, men hadde et kodon for en threoninrest (som naturlig opptrer i stilling 1 i hpG-CSF) som erstatning for kodonet for alanin i denne stillingen. I korte trekk ble et oligonukleotid syntetisert( 5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG) for stedrettet mutagenese (SDM). hpG-CSF-fragmentet fra Hindlll til BamHI i pSVGM-Ppol ble ligert inn i Ml3mpl0 for SDM. Det nysyntetiserte hpG-CSF-gen som inneholdt et Thr-kodon i stilling 1, ble isolert ved spalting med Hindlll og EcoRI. Fragmentet ble deretter klonet inn i pSVDM-19 fremstilt ved spalting med de samme to restriksjonsendonukleasene. Den resulterende vektor pSVGM-Ppo(Thr) ble transformert inn i COS-celler og utbyttene av hpG-CSF målt i kultursupernatantene varierte fra 1 til ug/ml. ;Til slutt ble den genomsekvens som det er beskrevet isolering av i eksempel 5, anvendt til å danne en ekspresjonsvektor for pattedyrcelleekspresjon av hpG-CSF. Nærmere bestemt ble pSVDM-19 oppløst med Kpnl og Hindlll og det store fragmentet brukt i en fireveis ligering med en syntetisk linker med Hindlll og Ncol klebrige ender, som vist i tabell XXI. Et NcoI- BamHI-fragment som inneholdt exon 1 isolert fra pBR322 (8500 hpG-CSF), en genomsubklon og et BamHIII- Kpnl-fragment som inneholdt exoner 2-5 isolert fra plasmidet pBR322 (8500 hpG-CSF-genomsubklon). Den resulterende patte-dyrekspresjonsvektor, pSV/ghG-CSF ga 1 til 2,5 ug/ml hpG-CSF fra transformerte COS-celler. ;
Eksempel 10 ;Dette eksempel, vedrører fysiske og biologiske egenskaper hos rekombinante polypeptidprodukter fremstilt ifølge oppfinnelsen. ;1. Molekylvekt ;Rekombinante hpG-CSF-produkter fra E. coli-ekspresjon som i eksempel 7 hadde en tilsynelatende molekylvekt på 18,8 kD når de ble bestemt i reduserende SDS-PAGE (som ville bli forutsagt ut fra den utledede aminosyreanalyse i tabell 7, mens naturlige isolater renset som beskrevet i eksempel 1 hadde en tilsynelatende molekylvekt på 19,6 kD. Tilstedeværelsen av N-glycaner forbundet med de naturlige isolater kunne effektivt utelukkes på grunnlag av mangelen på asparaginrester i primærsekvensen til hpG-CSF i tabell VII, og det ble derfor stilt opp en fremgangsmåte for å bestemme om 0-_. glycaner var ansvarlige for molekylvektforskjeller mellom naturlige isolater og de ikke-glycosylerte rekombinante produkter. Omtrent 5 ug av materialet fra det naturlige isolat ble behandlet med neuraminidase (Calbiochem., LaJolla, California) , en 0,5 ug prøve ble fjernet og det gjenværende materiale ble inkubert med 4 mU O- Glycanase (endo-x-n-acetyl-galactoseaminidase, Genzyme, Boston, Massachusetts) ved 37°C. Aliquoter ble fjernet etter en halv, 2 og 4 timer med inku-bering. Disse prøvene ble underkastet SDS-PAGE side om side med det rekombinante materiale avledet fra E. coli. Etter neuraminidasebehandling skiftet den tilsynelatende molekylvekt til isolatet fra 19,6 kD til 19,2 kD, noe som tyder på fjerning av en sailinsyrerest. Etter 2 timers behandling med O-glycanase skiftet molekylvekten til 18,8 kD, identisk med den tilsynelatende molekylvekt for det materiale som er avledet fra E. coli. Carbohydratstrukturens følsomhet overfor neuraminidase og O-glycanase antyder følgende struktur for carbohydratbestanddelen: N-acetylneuraminsyre-ot (2-6) (galac-tose-p-(1-3)-N-acetylgalactosamin-R, hvor R er serin eller threonin. ;2. Opptak av 3 H- thymidin ;Formeringsinduksjon av humane benmargceller ble under-søkt på grunnlag av økt innlemmelse av<3>H-thymidin. Human benmarg fra friske donorer ble utsatt for en densitetskutt med Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia) og celler med ;lav densitet ble oppslemmet i Iscove's medium (GIBCO) som inneholdt 10% bovint fosterserum og glutamin "pen-strep". Deretter ble 2 x 10 4 humane benmargceller inkubert med enten kontrollmedium eller det rekombinante E. coli materiale fra eksempel 7 i 96 flatbunnede brønnplater ved 37°C i 5% C02i luft i 2 dager. Prøvene ble undersøkt in duplo og konsentra- ;sjonen varierte over et område på 10.000 ganger. Kulturer ble deretter pulset i 4 timer med 0,5 u Ci/brønn med<3>H-thymidin (New England Nuclear, Boston, Massachusetts). Opp-taket av<3>H-thymidin ble målt som beskrevet i Ventua et al., Blood, 61, 781 (1983) . I denne prøven kan humane hpG-CSF-isolater indusere<3>H-thymidin-innlemmelse i humane benmargceller ved nivåer på omtrent 4-10 ganger høyere enn kon-trollsupernatanter. Det E. coli avledede hpG-CSF-materiale ifølge eksempel 6 hadde lignende egenskaper. ;En andre undersøkelse av human benmargcelleformering ble utført ved å bruke dyrkningsmedium fra transfiserte COS-l-celler slik disse er fremstilt i eksempel 9 og ga lignende resultater, noe som indikerte at kodede polypeptidprodukter faktisk ble utskilt i dyrkningsmedium som aktive stoffer. ;3. WEHI- 3B D+ differensieringsinduksjon ;Kapasiteten til rekombinante E. coli avledede materialer når det gjelder å indusere differensiering av den murine myelomocyttiske leukemi-cellelinje WEHI-3B D<+>ble undersøkt i halvfast agarmedium som beskrevet i Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980). Det rekombinante hpG-CSF-produkt og mediekontroller ble inkubert med ca. 60 WEHI-3B D<+>celler/ brønn ved 37°C i 5% CO2i luft i 7 dager. Prøvene ble inkubert i 24 flatbunnede brønnplater og konsentrasjonen varierte over et område på 2000 ganger. Koloniene ble klassifisert som ikke-differensierte, delvis differensierte eller fullstendig differensierte, og kolonicelletellinger ble utført mikroskopisk. E. coli rekombinantmateriale ble funnet å indusere differensiering. ;4. CFU- GM-, BFU- E- og CFU- GEMM- analyser ;Naturlige isolater av human G-CSF (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger og det rekombinante humane G-CSF (rhpG-CSF) med flere forskjellige virkninger ble funnet å forårsake at humane benmargceller formerer seg og differen-sieres. Disse aktivitetene ble målt i CFU-GM [Broxmeyer et al., Exp. Hema tol., 5_, 87, (1971] BFU-E- og CFU-GEMM-analyser [Lu et al., Blood, 61, 250 (1983)] under anvendelse av lavdensitets, ikke-vedhengende benmargceller fra friske humane frivillige. En sammenligning av de biologiske virkninger av CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM under anvendelse av enten 500 enheter hpG-CSF eller rhgG-CSF er vist i tabell XXII nedenunder. ;Alle kolonianalysene ble utført med lavdensitets ikke-vedhengende benmargceller. Humane benmargceller ble utsatt for en densitetskutt med Ficoll-Hypaque (densitet, 1,077 g/ cm 3, Pharmacia). Lavdensitetscellene ble deretter på nytt oppslemmet i Iscove's modifiserte Dulbecco's medium som inneholdt kalvefosterserum og plassert for binding på Falcon vevkultur-plater (Nr. 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) il-l/2 time ved 37°C. ;
Mediumkontroll besto av Iscove's modifiserte Dulbecco's medium pluss 10% FCS, 0,2 mM hemin og 1 enhet rekombinant erythropoietin. ;For CUF-GM-analysen ble målceller platet ut ved ;1 x 10 i 1 ml 0,3% agardyrkningsmedium som omfattet supplert McCoy's 5A medium og 10% varmeinaktivert kalvefosterserum.Kulturer ble bedømt med hensyn på kolonier (mer enn 40 celler pr. aggregat) og morfologi bestemt på dag 7 av dyrkingen. Antallet kolonier er vist som middelverdien - SEM bestemt fra plater in kvadrupel. ;For BFU-E- og CFU-GEMM-analysene ble celler (1 x IO<5>) tilsatt til en 1 ml blanding av Iscove<*>s modifiserte Dul-becco's medium (GIBCO), 0,8% ethylcellulose, 30% kalvefosterserum, 0,05 nM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM hemin og 1 enhet rekombinant erythropoietin. Plater ble inkubert i en fuktet atmosfære av 5% C02og 5% 02. Lav oxygenspenning ble oppnådd ved å bruke et oxygenreduksjonsapparat fra Reming Bioinstru-ments (Syracuse, N.Y.). Kolonier ble bedømt etter 14 dagers inkubasjon. Antallet kolonier er vist som gjennomsnitts-verdien - SEM, som bestemt ut fra plater in duplo.
Kolonier dannet i CFU-GM-analysen ble alle funnet å være kloracetatesterasepositive og ikke-spesifikk esterase (ot-nafthylacetatesterase)-negative, i overensstemmelse med at koloniene er granulocytter av type. Både naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF ble funnet å ha en spesifikk aktivitet på omtrent 1 x 10 g E/mg rent protein når de ble analysert ved hjelp av seriefortynning i en CFU-GEMM-prøve. BFU-E- og CFU-GEMM-dataene i tabell XXII er representative for tre separate for-søk og svarende til de data som er rapportert tidligere for naturlig hpG-CSF. Det er viktig å legge merke til at rhpG-CSF er svært rent og fritt for andre potensielle pattedyr-vekstfaktorer i kraft av fremstillingen i E. coli. Således er rhpG-CSF i stand til å understøtte blandet kolonidannelse (CFU-FEMM) og BFU-E når det tilsettes i nærvær av rekombinant erythropoietin.
5. Prøver på cellebindinq
Det ble tidligere rapportert at WEHI-3B(D<+>)-celler og humane leukemiceller fra nydiagnostiserte leukemier vil
125 binde I-merket murin G-CSF og at denne binding kan gjøres fullstendig ved tilsetning av umerket G-CSF eller humanCSF-(3. Evnen til naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF når det gjelder å konkurrere for binding av<1>25I-hpG-CSF til humane og murine leukemiceller, ble testet. Sterkt renset naturlig hpG-CSF (mer enn 95% rent, 1 ug) ble jodert [Tejedor et al., Anal.Biochem., 127, 143 (1982) ] og ble separert fra reaktanter ved hjelp av gelfiltrering og ionebytterkromatografi. Den
125
spesifikke aktivitet til den naturlige I-hpG-CSF var omtrent uCi/ug protein. Murin WEHI-3B(D<+>) og to humane myeloid-leukemicellepreparater fra perifert blod (ANLL, en klassifisert som M4, den andre som M5B) ble testet med henyn på evne til å binde<125>I-hpG-CSF.
De murine og nylig erholdte humane myeloidleukemi-celler fra perifert blod ble vasket tre ganger med PBS/1%
BSA. WEHI-3B(D<+>)-celler (5 x IO<6>) eller nye leukemiceller
(3 x IO<6>) ble inkubert in duplo i PBS/1% BSA (100 ul) i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner (volum: 10 ul) med umerket hpG-CSF, rhpG-CSF eller GM-CSF, og i nærvær av<125>I-hpG-CSF (omtrent 100.000 cpm eller 1 ng) ved 0°C
i 90 minutter (totalt volum: 120 ul). Cellene ble deretter på nytt oppslemmet og lagt opp på 200 pl iskald FCS i et 350 ul sentrifugerør av plast og sentrifugert (1000 g, 1 minutt). Pelleten ble samlet opp ved å kutte av enden av røret og pellet og supernatant telt hver for seg i en -jr-teller (Packard).
Spesifikk binding (cpm) ble bestemt som total binding
i fravær av en konkurrent (gjennomsnitt av duplikater) minus binding (cpm) i nærvær av 100 gangers overskudd umerket hpG-CSF (ikke-spesifikk binding). Den ikke-spesifikke binding var maksimalt 2503 cpm for WEHI-3B(D<+>)-celler, 1072
cpm for ANLL (M4)-celler og 1125 cpm for ANLL (M5B)-celler. Forsøk 1 og 2 ble utført på forskjellige dager under an-
125 . vendelse av det samme preparat av I-hpG-CSF og gir inn-byrdes overensstemmelse i den prosentvise inhibering som fåes for 2000 enheter hpG-CSF. Erholdte data er gjengitt i tabell XXIII nedenunder.
125
Som vist i tabell XXIII, oppviste I-hpG-CSF binding til WEHI-3B(D<+>) leukemiceller. Bindingen ble inhibert på en doseavhengig måte ved hjelp av umerket naturlig hpG-CSF
eller rhpG-CSF, men ikke med GM-CSF. I tillegg ble binding av naturlig hpG-CSF til humane myelomonocyttiske leukemiceller (ANLL, M4) iakttatt. Bindingen til disse cellene ble sammenlignet med hensyn på respons med naturlig hpG-CSF i væskekul-turer ved differensiering til ferdige makrofager bedømt ved
125
hjelp av morfologi. Fraværet av binding av naturlig I-hpG-CSF til monocyttiske leukemiceller fra en annen pasient (ANLL,
M5B) antyder at visse leukemier differensielt kan uttrykke eller mangle reseptorer for hpG-CSF. Evnen til rhpG-CSF når det gjelder å konkurrere for binding av naturlig<125>I-hpG-CSF på samme måte som naturlighpG-CSF,antyder at reseptorene gjenkjenner begge formene like godt.
Disse undersøkelsene som viser bindingen av naturlig
125
I-merket hpG-CSF til leukemiceller, ble sammenlignet i kultur ved hjelp av naturlig hpG-CSF's evne til å indusere granulocyttisk og monocyttisk differensiering av benmargceller med lav densitet erholdt fra en pasient med en akutt promyelocyttisk leukemi (M3) og en andre pasient med en akutt myeloblastisk leukemi (M2). Celler fra hver pasient ble dyrket i 4 dager i medium alene eller i nærvær av 1 x IO<5>enheter rhpG-CSF. Celler fra M3-kontrollkulturene inkubert i medium alene var fortsatt promyelocyttisk av type; mens celler dyrket i nærvær av rhpG-CSF oppviste ferdige celler av myeloid-typen inkludert en metamyelocytt, "giant band"-form og segmenterte neutrofiler og monocytt. De faktiske forskjeller
for denne pasienten, på 100 celler evaluert for kontrollen, 100% promyelocytter, og for de behandlede rhpG-CSF-celler,
22% blåster pluss promyelocytter, 7% myelocytter, 35% metamyelocytter, 20% "band"-former pluss segmenterte neutrofiler, 14% monocytter og 2% makrofager. Det bør legges merke til det faktum at en av de polymorfonukleære granulocytter fortsatt inneholdt en fremtredende Auer-stav, hvilket tyder på
at i det minste denne cellen utgjorde en differensiert celle som tilhører den leukemiske klon. Celler fra den andre pasienten med en myeloblastisk leukemi (M2) ble også dyrket i
4 dager i nærvær eller fravær av rhpG-CSF. Visuell analyse av M2-celler dyrket i medium alene avslørte store "blast-lignende" celler, hvorav noen hadde nukleoler. Noen av M2-cellene differensierte, når de ble behandlet med rhpG-CSF, til ferdig segmenterte neutrofiler med rester av Auer-staver i sentrumsneutrof ilen, noe som tyder på at dif f erensiering_. har oppstått i en celle som tilhører den leukemiske klon. Den faktiske differensiering av 100 celler evaluert morfo-logisk avslørte at kontrollceller besto av 100% blastceller. rhpG-CSF-behandlede celler besto av 43% blastceller, 1% myelocytter, 15% metamyelocytter. 28% "Band"-former pluss segmenterte neutrofiler, 2% promonocytter og 11% monocytter. Leukemicellen ble også undersøkt med hensyn på differens-lering ved 4 andre konsentrasjoner av rhpG-CSF (5 x 10 3), 1 x IO<4>, 2,5 x IO<4>og 5 x IO<4>E/ml, data ikke vist). Selv ved den laveste konsentrasjon av rhpG-CSF som ble testet (5 x 10<3>E/ml), var det signifikant differensiering (celler differensierte utover myelocytter) av M3-(50%) og M2-(37%) leukemiceller .
6. Immunologisk analyse
For å fremstille polyklonale antistoffer for bruk
ved immunologisk analyse, var det antigen som ble anvendt, G-CSF med flere forskjellige virkninger renset fra den humane urinblære-carcinomcellelinje 5637 (1A6) fremstilt ifølge eksempel 1 (B). Dette materiale ble bedømt til å være 85% rent basert på sølvnitratfarging av polyacrylamidgeler. 6 uker gamle Balb/C-mus ble immunisert med subkutane injek-sjoner av antigen på flere steder. Antigenet ble på nytt oppslemmet i PBS og emulgert med like store volumdeler Freund's komplette hjelpestoff. Dosen var 5 - 7 ug antigen pr. mus pr. injeksjon. En forsterkningsimmunisering ble administrert 18 dager senere med den samme mengde antigen emulgert med et like stort volum Freund's ukomplette hjelpestoff. 4 dager senere ble det tatt ut museserum for å teste med hensyn på
det antistoff som er spesifikt for human G-CSF med flere forskjellige virkninger.
"Dynatech Immulon II Removawell"-stripper
i holdere (Dynateck Lab., Inc., Alexandria, Virginia) ble belagt med 5 ug/ml hpG-CSF i 50 mM carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,2. Brønner ble belagt med 0,25 ug i et volum på 50 ul. Antigenbelagte plater ble inkubert 2 timer ved værelsetemperatur og over natten ved 4°C. Oppløsningen ble dekantert og platene ble inkubert i 30 minutter med PBS som inneholdt 5-%-BSA for å blokkere den reaktive overflate. Denne oppløsning ble dekantert og de fortynnede preimmun- eller testsera ble tilsatt til brønnene og det ble inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur. Sera ble fortynnet med PBS, pH 7,0, som inneholdt 5% BSA. Serumoppløsningen ble dekantert og platene ble vasket tre ganger med "Wash Solution" (KPL, Gaithers-burg, Maryland). Omtrent 200.000 cpm jodert kanin-anti-mus-IgG (NEN, Boston, Massachusetts) i 50 ul PBS, pH 7,0, som inneholdt 1% BSA, ble tilsatt til hver brønn. Etter inku-bering i 1 - 1/2 time ved værelsetemperatur ble oppløsningen dekantert og platene ble vasket 5 ganger med "Wash Solution". Brønner ble fjernet fra holder og helt i en Beckman 5500 teller. Høy-titrede museserum oppviste mer enn 12 ganger høyere reaktivitet enn de tilsvarende preimmunsera ved en fortynning på 1:100.
De immunologiske egenskaper til hpG-CSF avledet fra
E. coli ble bestemt ved hjelp.av reaktivitet til høy-titretmuseserum som er spesifikt for pattedyrcelleavledet hpG-CSF. 0,25 ug 90% rent protein avledet fra E. coli ble belagt på "Immulon II Removawells" i et volum på 50 ul og museserum ble analysert som beskrevet ovenfor.
Høytitrede musesera oppviste 24 ganger høyere reaktivitet mot materiale avledet fra E. coli enn de tilsvarende preimmunsera ved en fortynning på 1:100.
7. Biologiske analyser av Serin analoger
[Ser<17>]hpG-CSF-, [Ser3<6>]hpG-CSF-, [Ser<42>]hpG-CSF-, [Ser<64>]hpG-CSF- og [Ser<74>]hpG-CSF-produkter fremstilt ifølge eksempel 9 ble analysert med hensyn på hpG-CSF-aktivitet i
<3>H-thymidin-opptaks-, CFU-GM- ogWEHI3BD+-prøver. Il.hver prøve hadde [ser 17]-analogen en aktivitet som var sammenlignbar med aktiviteten til rekombinante molekyler med den naturlig fore-
kommende struktur. De gjenværende analoger hadde i størrelses-orden 100 ganger mindre aktivitet i<3>H-thymidin-opptaksprøven, 250 ganger mindre aktivitet i CFU-GM-prøven og 500 ganger mindre aktivitet i WEHI-3B D<+->prøven. Disse data understøtter forslaget om at cysteiner i stillingen 36, 42, 64 og 74 kan være nødvendig for full biologisk aktivitet.
8. In vivo biologisk analyse
Osmotiske pumper av type "Alzet" (Alzet Corp., Palo Alto, CA; Model 2001) ble tilknyttet innsatte katetere i den høyre halsvene som var implantert subkutant i 7 syriske gull-hamstere av hankjønn. 4 av pumpene inneholdt en buffer [20 mM natriumacetat (pH 5,4) og 37 mM natriumklorid] og 1,5 mg/ml hpG-CSF avledet fra E. coli, mens 3 inneholdt buffer alene. Den pumpehastighet som var påkrevet for de osmotiske pumpene, var 1 ul/time i opp til 7 dager. På den tredje dag etter im-plantering av pumpene var det gjennomsnittlige granulocytt-tall for de 4 behandlede hamstere 6 ganger høyere enn for de 3 (buffer) kontrollene, og det økte granulocytt-tall ble gjenspeilet i en 4 ganger økning i totalt antall lymfocytter. Erythrocytt-tall var uforandret etter behandlingen. Disse resultatene indikerer at det rekombinante materiale gir en spesifikk økning i produksjon og/eller frigivelse.av granulocytter i et pattedyr.
I tillegg til de naturlig forekommende allelformer av hpG-CSF, omfatter foreliggende oppfinnelse også andre hpG-CSF-produkter, slik som polypeptidanaloger av hpG-fCSF og fragmenter av hpG-SCF. Ved å følge fremgangsmåten>ifølge den ovenfor angitte publiserte søknad fra Alton et ali, (WO/83/ 04053), kan man lett utforme og fremstille gener som koder for mikrobiell ekspresjon av polypeptider med primærkonfor-masjoner som adskiller seg fra konformasjonene som her er
l angitt når det gjelder identiteten av eller plasseringen av én eller flere rester (f.eks. substitusjoner, terminale og mellomliggende addisjoner og "deletions"). Alternativt kan modifikasjoner av cDNA og genomgener lett utføres ved hjelp av velkjente stedsrettede mutageneseteknikker, og anvendes til å frembringe analoger og derivater derav. Slike produkter
ville ha minst én av de biologiske egenskapene til hpG-CSF, men kan være forskjellig med hensyn til andre. Som eksempler
>mfatter tilsiktede produkter fremstilt ifølge oppfinnelsen de som er blitt forkortet ved f.eks. "deletions"; eller de som er ier stabile overfor hydrolyse (og derfor kan ha mer uttalte iller langvarige virkninger enn naturlig forekommende produk-:er); eller de som er blitt endret for å fjerne ett eller :lere potensielle steder for O-glycosylering (som kan resul-:ere i høyere aktiviteter for gjærproduserte produkter); eller som har én eller flere cysteinrester fjernet eller erstattet ned, f.eks. alanin- eller serinrester, og er potensielt Lettere å isolere i aktiv form fra mikrobesystemer; eller som iar én eller flere tyrisonrester erstattet med fenylalanin og kan binde mer eller mindre lett til hpG-CSF-reseptorer på målceller. Også omfattet er polypeptidfragmenter som duplikerer bare en del av den kontinuerlige aminosyresekvens eller sekundære konformasjoner i hpG-CSF, fragmenter som kan ha én aktivitet (f.eks. reseptorbinding) og ikke andre (f.eks. kolonivekststimulerende aktivitet). Det er verd å merke seg at aktiviteten ikke er nødvendig for at ett eller flere av produktene fremstilt ifølge oppfinnelsen skal ha terapeutisk utnyttbarhet [se Weiland et al., Blut. 44, 173-175 (1982)] eller utnyttbarhet i andre sammenhenger, slik som i prøver på hpG-CSF-antagonisme. Konkurrerende antagonister kan være svært nyttige i f.eks. tilfeller med overproduksjon av hpG-CSF.
Den DNA-sekvens som her er beskrevet og som koder for hpG-CSF-polypeptider, er verdifull med hensyn til den informasjon som tilveiebringes vedrørende aminosyresekvensen til pattedyr-proteinet som hittil har vært utilgjengelig til tross for analytisk bearbeiding av isolater av naturlig forekommende produkter. DNA-sekvensene er også påfallende verdifulle som produkter som kan brukes til å bevirke mikrobiell syntese av hpG-CSF i stor skala ved hjelp av en rekke forskjellige rekombinante teknikker. Sagt på en annen måte så er DNA-sekvenser som er tilveiebragt, anvendbare når det gjelder å frembringe nye og nyttige virale og ringformede plasmid-DNA-vektorer, nye og nyttige transformerte og transfiserte mikrobi elle prokaryote og eukaryote vertceller (inkludert bakterie-og gjærceller og pattedyrceller dyrket i kultur), og nye og nyttige metoder for vekst i kultur av slike mikrobevertceller som er i stand til å gi ekspresjon av hpG-CSF og dets beslektede produkter. DNA-sekvenser som anvendes er også påfallende egnede matrialer for bruk som merkede prober ved isolering av hpG-CSF og beslektede protein-kodende human genom-DNA, samt cDNA- og genom-DNA-sekvenser for andre pattedyrarter. DNA-sekvenser kan også være anvendbare ved forskjellige alter-native fremgangsmåter for proteinsyntese (f.eks. i insektcel-ler), eller ved genetisk terapi av mennesker og andre pattedyr. DNA-sekvenser som anvendes forventes å være anvendbare ved utvikling av transgenetiske pattedyrarter som kan tjene som eukaryote "verter" for fremstilling av hpG-CSF og hpG-CSF-produkter i større mengder. Det vises generelt til Palmiter et al., Science. 224( 4625). 809-814 (1983).
Anvendbare på hpG-CSF-fragmenter og polypeptidanaloger fremstilt ifølge oppfinnelsen er rapporter vedrørende den immunologiske aktivitet til syntetiske peptider som i vesentlig grad duplikerer aminosyresekvensen som finnes i naturlig forekommende proteiner, glycoproteiner og nukleoproteiner. Nærmere bestemt er forholdsvis lavmolekylære polypeptider blitt påvist å delta i immunreaksjoner som i varighet og utstrekning er lik
med immunreaksjonene til fysiologisk signifikante proteiner, slik som virusantigener, polypeptidhormoner og lignende. Inkludert blant immunreaksjonene til slike polypeptider er fremkallingen av dannelse av spesifikke antistoffer i immunologisk aktive dyr. Se f.eks. Lerner et al., Cell, 23, 309-
310 (1981); Ross et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei ( USA), 77'5197-5200 (1980); Lerner et al., Proe. Nati. Acad. Sei ( USA), 78, 3403-3407
(1981) ; Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 78, 4882-4886 (1981); Wong et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA) , 78, 7412-7416 (1981); Green et al., Cell, .28, 477-487 (1982);
Nigg et al., Proe. Nati. Acad, Sei. ( USA), 79, 5322-5326
(1982) ; Baron et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman et al., Nature, 295, 185-160 (1982) og Kerner et al., Scientific American, 248, nr. 2, 66-74 (1983). Se også Kaiser et al., Science, 223, 249-255 (1984) vedrørende biologiske og immunologiske virkninger av syntetiske peptider som omtrentlig deler sekundærstrukturer hos peptidhormoner, men ikke be-høver å dele deres primære strukturkonformasjon.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid,karakterisert vedat den omfatter dyrking under egnede næringsbetingelser av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med en renset og isolert DNA-sekvens som koder for ekspresjon av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocyttkolonistimu-lerende faktor (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger, og en del av eller hele hpG-CSF-aminosyresekvensen angitt i tabellene VII og VIII, eller en polypeptidanalog derav med samme biologiske virkning, og isolering av ønskede polypeptidprodukter fra ekspresjonen av DNA-sekvenser.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-sekvensen koder for en analog av hpG-CSF valgt fra gruppen bestående av: [Ser<17>]hpG-CSF, [Ala^hpG-CSF, [Ser<36>]hpG-CSF, [Ser<42>]hpG-CSF, [Ser<64>]hpG-CSF, [Ser<74>]hpG-CSF, [Mef ^hpG-CSF, [Met'<1>, Ser17]hpG-CSF, [Mef1, Ser<36>]hpG-CSF, [Met-<1>, Ser<42>]hpG-CSF, [Met-<1>, Ser<64>]hpG-CSF og [Mef1, Ser<74>]hpG-CSF.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-sekvensen koder for aminosyresekvensen 1-174 ifølge tabell VII, med en ytterligere metionylrest i stilling -1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO954199A NO954199D0 (no) | 1985-08-23 | 1995-10-20 | DNA-sekvens som koder for et polypeptidprodukt |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US76895985A | 1985-08-23 | 1985-08-23 | |
US06/835,548 US4810643A (en) | 1985-08-23 | 1986-03-03 | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
PCT/US1986/001708 WO1987001132A1 (en) | 1985-08-23 | 1986-08-22 | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO871679D0 NO871679D0 (no) | 1987-04-22 |
NO871679L NO871679L (no) | 1987-04-22 |
NO303544B1 true NO303544B1 (no) | 1998-07-27 |
Family
ID=27118107
Family Applications (6)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO871679A NO303544B1 (no) | 1985-08-23 | 1987-04-22 | FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid med Ún eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskaper til granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) |
NO19982132A NO314902B1 (no) | 1985-08-23 | 1998-05-11 | Biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor som koder for en analog av granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), samtprokaryot eller eukaryot vertscelle |
NO20032250A NO318755B1 (no) | 1985-08-23 | 2003-05-19 | Anvendelse av et hpG-CSF-polypeptid til fremstilling av et medikament for a stanse proliferasjon av leukemiceller |
NO2003008C NO2003008I1 (no) | 1985-08-23 | 2003-11-13 | Fremgangsmaate for fremstilling av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiskeegenskaper til grnulocyttkolonistimulerende faktor(hpg-csf) |
NO2003010C NO2003010I2 (no) | 1985-08-23 | 2003-12-09 | Pegfilgrastim |
NO20045548A NO20045548L (no) | 1985-08-23 | 2004-12-17 | Fremgangsmate for fremstilling av et hpG-CSF-polypeptidprodukt, samt anvendelse derav til fremstilling av et medikament for induksjon av proliferasjonen av humane benmargsceller |
Family Applications After (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19982132A NO314902B1 (no) | 1985-08-23 | 1998-05-11 | Biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor som koder for en analog av granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), samtprokaryot eller eukaryot vertscelle |
NO20032250A NO318755B1 (no) | 1985-08-23 | 2003-05-19 | Anvendelse av et hpG-CSF-polypeptid til fremstilling av et medikament for a stanse proliferasjon av leukemiceller |
NO2003008C NO2003008I1 (no) | 1985-08-23 | 2003-11-13 | Fremgangsmaate for fremstilling av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiskeegenskaper til grnulocyttkolonistimulerende faktor(hpg-csf) |
NO2003010C NO2003010I2 (no) | 1985-08-23 | 2003-12-09 | Pegfilgrastim |
NO20045548A NO20045548L (no) | 1985-08-23 | 2004-12-17 | Fremgangsmate for fremstilling av et hpG-CSF-polypeptidprodukt, samt anvendelse derav til fremstilling av et medikament for induksjon av proliferasjonen av humane benmargsceller |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US4810643A (no) |
EP (1) | EP0237545B2 (no) |
JP (11) | JP2527365B2 (no) |
KR (1) | KR880700071A (no) |
CN (1) | CN1020924C (no) |
AT (1) | ATE332375T1 (no) |
AU (1) | AU6334686A (no) |
CA (1) | CA1341537C (no) |
CY (1) | CY1642A (no) |
DE (1) | DE3650788T2 (no) |
DK (1) | DK174980B1 (no) |
ES (1) | ES2001883A6 (no) |
FI (3) | FI105191B (no) |
GR (1) | GR862185B (no) |
HK (1) | HK1029600A1 (no) |
IL (1) | IL79805A (no) |
MX (1) | MX9202992A (no) |
NL (1) | NL930127I1 (no) |
NO (6) | NO303544B1 (no) |
NZ (1) | NZ217334A (no) |
PT (1) | PT83242B (no) |
SA (1) | SA92130186B1 (no) |
SG (2) | SG48964A1 (no) |
WO (1) | WO1987001132A1 (no) |
Families Citing this family (338)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU594014B2 (en) * | 1984-03-21 | 1990-03-01 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant DNA molecules |
US5718893A (en) * | 1984-04-15 | 1998-02-17 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
WO1986004605A1 (en) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
US5532341A (en) * | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
US5078996A (en) * | 1985-08-16 | 1992-01-07 | Immunex Corporation | Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
US6004548A (en) | 1985-08-23 | 1999-12-21 | Amgen, Inc. | Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
NZ218336A (en) * | 1985-12-09 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Monoclonal antibodies to human pluripotent granulocyte colony stimulating factor (hpg-csf) |
DK203187A (da) * | 1986-04-22 | 1987-10-23 | Immunex Corp | Human g-csf proteinekspression |
GR871067B (en) * | 1986-07-18 | 1987-11-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Process for producing stable pharmaceutical preparation containing granulocyte colony stimulating factor |
US5186931A (en) * | 1986-08-06 | 1993-02-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Composition and method for supporting bone marrow transplantation |
JPH01500483A (ja) * | 1986-08-11 | 1989-02-23 | シタス コーポレイション | G‐csf及びそのミューテインの発現 |
JPH0618781B2 (ja) * | 1986-10-18 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 感染症治療剤 |
US6238889B1 (en) * | 1986-12-16 | 2001-05-29 | Dsm N.V. | Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3 |
US5194592A (en) * | 1986-12-23 | 1993-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
US5214132A (en) * | 1986-12-23 | 1993-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
US5681720A (en) * | 1986-12-23 | 1997-10-28 | Kyowa Hakko Co., Ltd. | DNA encoding human granulocyte colony stimulating factor plasmids and host cells comprising same, and methods of expressing the encoded polypeptide |
US5362853A (en) * | 1986-12-23 | 1994-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
JP2618618B2 (ja) * | 1988-03-04 | 1997-06-11 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗g−csf誘導体、nd28モノクローナル抗体 |
DK174044B1 (da) * | 1986-12-23 | 2002-05-06 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Polypeptid afledt fra human granulocytkolonistimulerende faktor, og fremgangsmåde til fremstilling deraf, DNA kodende for nævnte polypeptid, rekombinant plasmid indeholdende nævnte DNA, og mikroorganismer indeholdende nævnte rekombinante plasmid....... |
US6384194B1 (en) * | 1987-12-16 | 2002-05-07 | Dsm N.V. | Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof |
GB2213821B (en) * | 1987-12-23 | 1992-01-02 | British Bio Technology | Synthetic human granulocyte colony stimulating factor gene |
US5599690A (en) * | 1988-02-01 | 1997-02-04 | Amgen Inc. | Control of norleucine incorporation into recombinant proteins |
CA1329119C (en) * | 1988-03-29 | 1994-05-03 | Milton David Goldenberg | Cytotoxic therapy |
US20030232010A2 (en) * | 1988-03-29 | 2003-12-18 | Immunomedics, Inc. | Improved cytotoxic therapy |
EP0347041A3 (en) * | 1988-05-13 | 1990-11-22 | Amgen Inc. | Compositions and method for treating or preventing infections in animals |
US5070013A (en) * | 1988-05-31 | 1991-12-03 | Schering Corporation | Immunochemical assay for human granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
US5082774A (en) * | 1988-08-30 | 1992-01-21 | The General Hospital Corporation | Recombinant human nerve growth factor |
US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
US5104651A (en) * | 1988-12-16 | 1992-04-14 | Amgen Inc. | Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf |
US20020177688A1 (en) * | 1988-12-22 | 2002-11-28 | Kirin-Amgen, Inc., | Chemically-modified G-CSF |
CA2006596C (en) * | 1988-12-22 | 2000-09-05 | Rika Ishikawa | Chemically-modified g-csf |
US6166183A (en) * | 1992-11-30 | 2000-12-26 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically-modified G-CSF |
AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
US6254861B1 (en) * | 1989-05-23 | 2001-07-03 | Chandra Choudhury | Hematopoietic growth factor derived from T lymphocytes |
US5605822A (en) * | 1989-06-15 | 1997-02-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for growing human hematopoietic cells |
US5635386A (en) | 1989-06-15 | 1997-06-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture |
US5763266A (en) * | 1989-06-15 | 1998-06-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells |
DK0477290T3 (da) * | 1989-06-15 | 1997-07-21 | Univ Michigan | Fremgangsmåder, sammensætninger og indretninger til dyrkning af celler |
US5580722A (en) * | 1989-07-18 | 1996-12-03 | Oncogene Science, Inc. | Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease |
US6203976B1 (en) | 1989-07-18 | 2001-03-20 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation |
US5665543A (en) * | 1989-07-18 | 1997-09-09 | Oncogene Science, Inc. | Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators |
US5776502A (en) | 1989-07-18 | 1998-07-07 | Oncogene Science, Inc. | Methods of transcriptionally modulating gene expression |
EP0447523A4 (en) * | 1989-10-10 | 1991-11-27 | Amgen Inc. | Compositions and methods for treating or preventing infections in canine and feline animals |
CA2025181A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting fungi |
ZA907921B (en) | 1989-10-16 | 1991-08-28 | Amgen Inc | Stem cell factor |
US6852313B1 (en) | 1989-10-16 | 2005-02-08 | Amgen Inc. | Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor |
US7144731B2 (en) * | 1989-10-16 | 2006-12-05 | Amgen Inc. | SCF antibody compositions and methods of using the same |
GEP20002145B (en) * | 1989-10-16 | 2000-06-25 | Amgen Inc Us | Stem Cell Factor |
DE69033584T2 (de) * | 1989-10-16 | 2001-03-08 | Amgen Inc., Thousand Oaks | Stammzellenfaktor |
US20040181044A1 (en) * | 1989-10-16 | 2004-09-16 | Zsebo Krisztina M. | Method of stimulating growth of epithelial cells by administering stem cell factor |
US5132212A (en) * | 1989-11-17 | 1992-07-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Scl gene, and a hematopoietic growth and differentiation factor encoded thereby |
US5214133A (en) * | 1989-11-17 | 1993-05-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | SCL: a hematopoietic growth and differentiation factor |
JPH04218000A (ja) * | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
US5147799A (en) * | 1990-04-25 | 1992-09-15 | Isia Bursuker | Repopulation of macrophages and granulocytes using transforming growth factor-beta |
GB9107846D0 (en) * | 1990-04-30 | 1991-05-29 | Ici Plc | Polypeptides |
US5399345A (en) * | 1990-05-08 | 1995-03-21 | Boehringer Mannheim, Gmbh | Muteins of the granulocyte colony stimulating factor |
US5258367A (en) * | 1990-06-29 | 1993-11-02 | University Of Florida | Uteroferrin and rose proteins for stimulating hematopoietic cells |
IE912365A1 (en) * | 1990-07-23 | 1992-01-29 | Zeneca Ltd | Continuous release pharmaceutical compositions |
WO1992014480A1 (en) * | 1991-02-22 | 1992-09-03 | Amgen Inc. | Use of gm-csf and g-csf to promote accelerated wound healing |
GB2253852B (en) * | 1991-02-26 | 1995-03-22 | Ici Plc | Vector for expression of heterologous polypeptide comprising inducible selection system |
US6565841B1 (en) | 1991-03-15 | 2003-05-20 | Amgen, Inc. | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US6153183A (en) * | 1992-11-24 | 2000-11-28 | G. D. Searle & Company | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's or cytokines for multi-lineage hematopoietic cell production |
US6361976B1 (en) * | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF'S for multi-lineage hematopoietic cell production |
US5738849A (en) * | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
US6361977B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Methods of using multivariant IL-3 hematopoiesis fusion protein |
US6403076B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-06-11 | S. Christopher Bauer | Compositions for increasing hematopoiesis with interleukin-3 mutants |
US5772992A (en) * | 1992-11-24 | 1998-06-30 | G.D. Searle & Co. | Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors |
US6413509B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-07-02 | S. Christopher Bauer | Methods of ex-vivo expansion of hematopoietic cells using interleukin-3 mutant polypeptides with other hematopoietic growth factors |
US7091319B1 (en) | 1992-11-24 | 2006-08-15 | Bauer S Christopher | IL-3 variant hematopoiesis fusion protein |
US6057133A (en) * | 1992-11-24 | 2000-05-02 | G. D. Searle | Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production |
AU2007200247B2 (en) * | 1993-01-28 | 2011-03-10 | Amgen Inc. | G-CSF analog compositions |
US5581476A (en) * | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
EP0982405B1 (en) | 1993-09-15 | 2009-08-26 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Recombinant alphavirus vectors |
US5874075A (en) * | 1993-10-06 | 1999-02-23 | Amgen Inc. | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
US20050059149A1 (en) * | 1993-11-22 | 2005-03-17 | Bauer S. Christopher | Methods of ex-vivo expansion of hematopoeitic cells using multivariant IL-3 hematopoiesis chimera proteins |
CA2139385C (en) * | 1994-02-04 | 2001-12-25 | Gottfried Alber | Products containing g-csf and tnf binding protein |
US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
DK0690127T3 (da) * | 1994-03-31 | 1999-05-03 | Amgen Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til stimulering af megakaryocytvækst og -differentiering |
US5795569A (en) * | 1994-03-31 | 1998-08-18 | Amgen Inc. | Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation |
US5536495A (en) * | 1994-04-15 | 1996-07-16 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
US20030053982A1 (en) * | 1994-09-26 | 2003-03-20 | Kinstler Olaf B. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US6100070A (en) * | 1995-10-05 | 2000-08-08 | G. D. Searle & Co. | G-CSF receptor agonists |
US6066318A (en) | 1995-10-05 | 2000-05-23 | G.D. Searle & Co. | Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors |
DE69738521T2 (de) | 1996-04-05 | 2009-05-07 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville | Alphaviren-vektors mit einer reduzierten inhibierung der synthese von zellmakromolekülen |
CA2266656A1 (en) | 1996-09-17 | 1998-03-26 | Chiron Corporation | Compositions and methods for treating intracellular diseases |
US6162426A (en) * | 1997-05-05 | 2000-12-19 | La Gamma; Edmund F. | Use of G-CSF to enhance the immune system in neonates |
US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
BR9812267B1 (pt) * | 1997-07-14 | 2013-11-26 | Hormônio de crescimento recombinante. | |
US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
US7153943B2 (en) | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
US6753165B1 (en) * | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
US6017876A (en) * | 1997-08-15 | 2000-01-25 | Amgen Inc. | Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity |
US7507705B2 (en) * | 1997-10-02 | 2009-03-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the modulation of neovascularization and/or the growth of collateral arteries and/or other arteries from preexisting arteriolar connections |
US20020034819A1 (en) * | 1998-02-23 | 2002-03-21 | Alan K. Smith | Human lineage committed cell composition with enhanced proliferative potential, biological effector function, or both; methods for obtaining same; and their uses |
US6541033B1 (en) | 1998-06-30 | 2003-04-01 | Amgen Inc. | Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin |
CN1101403C (zh) * | 1998-07-13 | 2003-02-12 | 金磊 | 粒细胞集落刺激因子的制备 |
US6979442B1 (en) | 1998-08-17 | 2005-12-27 | Pfizer Inc. | Stabilized protein compositions |
US5999474A (en) | 1998-10-01 | 1999-12-07 | Monolithic System Tech Inc | Method and apparatus for complete hiding of the refresh of a semiconductor memory |
US6420339B1 (en) | 1998-10-14 | 2002-07-16 | Amgen Inc. | Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility |
US6245740B1 (en) | 1998-12-23 | 2001-06-12 | Amgen Inc. | Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins |
US6451346B1 (en) * | 1998-12-23 | 2002-09-17 | Amgen Inc | Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents |
US7935805B1 (en) | 1998-12-31 | 2011-05-03 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
JP2002533124A (ja) | 1998-12-31 | 2002-10-08 | カイロン コーポレイション | Hivポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成 |
US7208473B2 (en) * | 1999-01-06 | 2007-04-24 | Xencor, Inc. | Nucleic acids and protein variants of hG-CSF with granulopoietic activity |
CA2357811A1 (en) | 1999-01-06 | 2000-07-13 | Xencor, Inc. | Nucleic acids and proteins corresponding to mutants of g-csf with granulopoietic activity |
US8288126B2 (en) | 1999-01-14 | 2012-10-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
ATE420665T1 (de) | 1999-01-19 | 2009-01-15 | Molecular Insight Pharm Inc | Konjugate des granulozyten-kolonie stimulierenden faktors zur gezielten bildgebung von infektionen und entzündungen |
EA004685B1 (ru) * | 1999-01-29 | 2004-06-24 | Эмджен Инк. | Конъюгаты гксф |
US6365583B1 (en) | 1999-02-02 | 2002-04-02 | Anormed, Inc. | Methods to enhance white blood cell count |
KR100356140B1 (ko) * | 1999-07-08 | 2002-10-19 | 한미약품공업 주식회사 | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 |
US8106098B2 (en) * | 1999-08-09 | 2012-01-31 | The General Hospital Corporation | Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer |
CA2391226A1 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-17 | Baxter International, Inc. | Reduced side-effect hemoglobin compositions |
US6555660B2 (en) * | 2000-01-10 | 2003-04-29 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
US6831158B2 (en) * | 2000-01-10 | 2004-12-14 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
JP2003519478A (ja) | 2000-01-10 | 2003-06-24 | マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド | G−csf結合体 |
US6646110B2 (en) * | 2000-01-10 | 2003-11-11 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF polypeptides and conjugates |
TR200401573T4 (tr) | 2000-02-29 | 2004-08-23 | Pfizer Products Inc. | Stabilize edilmiş granülosit koloni uyarıcı faktör |
MXPA02009665A (es) * | 2000-03-31 | 2005-09-08 | Celgene Corp | Inhibicion de actividad de ciclooxigenasa-2. |
EP1276756A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-06-09 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
US8435939B2 (en) | 2000-09-05 | 2013-05-07 | Biokine Therapeutics Ltd. | Polypeptide anti-HIV agent containing the same |
MXPA03002046A (es) * | 2000-09-08 | 2003-07-24 | Massachusetts Inst Technology | Composiciones analogos de factor estimulador de colonias de granulocitos y metodos para su elaboracion. |
US20020150979A1 (en) * | 2000-10-04 | 2002-10-17 | Naokazu Naitou | Process for producing a protein |
ATE374609T1 (de) * | 2000-11-30 | 2007-10-15 | Childrens Medical Center | Synthese von 4-aminothalidomid enantiomeren |
EP1229045A1 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-07 | Institut Curie | Universal carrier for targeting molecules to Gb3 receptor expressing cells |
ES2309167T3 (es) | 2001-02-19 | 2008-12-16 | Merck Patent Gmbh | Metodo para identificar epitotes de celulas t y metodo para preparar moleculas con inmunogenicidad reducida. |
FR2820979B1 (fr) | 2001-02-22 | 2004-03-12 | Didier Pourquier | Nouvelle application therapeutique du g-csf |
US6956023B1 (en) | 2001-04-19 | 2005-10-18 | University Of Florida | Materials and methods for providing nutrition to neonates |
CA2452119C (en) | 2001-07-05 | 2013-10-15 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
EP1411770A4 (en) | 2001-07-05 | 2006-05-10 | Chiron Corp | POLYNUCLEOTIDES CODING FOR ANTIGENIC C-TYPE HIV POLYPEPTIDES, POLYPEPTIDES AND THEIR USE |
CA2452582C (en) | 2001-07-11 | 2013-01-22 | Maxygen Holdings, Ltd. | G-csf conjugates |
US7169750B2 (en) * | 2001-07-31 | 2007-01-30 | Anormed, Inc. | Methods to mobilize progenitor/stem cells |
LT2371361T (lt) * | 2001-07-31 | 2019-09-10 | Genzyme Corporation | Pirmtakų/kamieninių ląstelių suaktyvinimo būdai |
US20030104996A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-06-05 | Tiansheng Li | L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations |
EP2298354B1 (en) | 2001-10-10 | 2014-03-19 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of interferon-beta |
SG159381A1 (en) | 2001-10-10 | 2010-03-30 | Novo Nordisk As | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
SI21102A (sl) | 2001-12-19 | 2003-06-30 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika |
ES2545090T3 (es) | 2001-12-21 | 2015-09-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina y GCSF |
KR20030062854A (ko) * | 2002-01-21 | 2003-07-28 | 주식회사 엘지생명과학 | 분비형 벡터를 이용한 효모에서의 재조합 단백질의 제조방법 |
AU2003210052A1 (en) * | 2002-03-20 | 2003-09-29 | Biopolymed Inc. | Preparation of g-csf stoichiometrically conjugated with biocompatible polymers at cystein residue |
US20030191056A1 (en) | 2002-04-04 | 2003-10-09 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
AU2003228751A1 (en) | 2002-05-01 | 2003-11-17 | Cell Genesys, Inc. | Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation |
CN1697655B (zh) | 2002-05-17 | 2013-09-18 | 细胞基因公司 | 使用免疫调节性化合物用于治疗和控制癌症和其它疾病的方法及组合物 |
US7393862B2 (en) * | 2002-05-17 | 2008-07-01 | Celgene Corporation | Method using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for treatment of certain leukemias |
US20100129363A1 (en) * | 2002-05-17 | 2010-05-27 | Zeldis Jerome B | Methods and compositions using pde4 inhibitors for the treatment and management of cancers |
US7323479B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-01-29 | Celgene Corporation | Methods for treatment and management of brain cancer using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-methylisoindoline |
NZ536908A (en) * | 2002-05-17 | 2008-09-26 | Celgene Corp | Treating or preventing cancer comprising administering an effective amount of cytokine inhibitory drug plus a second active ingredient |
US7968569B2 (en) * | 2002-05-17 | 2011-06-28 | Celgene Corporation | Methods for treatment of multiple myeloma using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione |
USRE48890E1 (en) | 2002-05-17 | 2022-01-11 | Celgene Corporation | Methods for treating multiple myeloma with 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione after stem cell transplantation |
US7081443B2 (en) * | 2002-05-21 | 2006-07-25 | Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) | Chimeric comp-ang1 molecule |
WO2004001056A1 (en) * | 2002-06-24 | 2003-12-31 | Dr. Reddy's Laboratories Ltd. | Process for preparing g-csf |
SI21273A (sl) * | 2002-07-31 | 2004-02-29 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Priprava inkluzijskih teles z visokim deležem pravilno zvitega prekurzorja heterolognega proteina |
WO2004020462A1 (ja) | 2002-08-27 | 2004-03-11 | Fujii, Nobutaka | Cxcr4拮抗薬およびその用途 |
DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
US7189740B2 (en) * | 2002-10-15 | 2007-03-13 | Celgene Corporation | Methods of using 3-(4-amino-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myelodysplastic syndromes |
US8404717B2 (en) * | 2002-10-15 | 2013-03-26 | Celgene Corporation | Methods of treating myelodysplastic syndromes using lenalidomide |
US8404716B2 (en) | 2002-10-15 | 2013-03-26 | Celgene Corporation | Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine |
EP1900369A1 (en) | 2002-10-15 | 2008-03-19 | Celgene Corporation | Methods of using and compositions comprising immunomodulatory compounds for the treatment and management of myelodysplastic syndromes |
US11116782B2 (en) | 2002-10-15 | 2021-09-14 | Celgene Corporation | Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine |
EP1551385A4 (en) * | 2002-10-15 | 2008-10-22 | Celgene Corp | SELECTIVE CYTOKINE INHIBITOR DRUGS FOR THE TREATMENT OF MYELODYSPLASTIC SYNDROMES |
MXPA05004780A (es) | 2002-11-06 | 2005-10-05 | Celgene Corp | Metodos y composiciones que usan farmacos inhibidores selectivos de citocina para el tratamiento y el manejo de canceres y otros padecimientos. |
BR0316695A (pt) * | 2002-11-26 | 2005-10-18 | Anthrogenesis Corp | Unidade citoterapêutica, kit para tratamento, método de tratamento de uma enfermidade, biblioteca de unidades citoterapêuticas e método de tratamento de um paciente |
US7695723B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-04-13 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
US7785601B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-08-31 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
KR20060002743A (ko) * | 2002-12-31 | 2006-01-09 | 악사론 바이오사이언스 아게 | 조혈성장인자에 의한 신경학적 질환의 치료방법 |
NZ566132A (en) * | 2003-02-13 | 2009-09-25 | Anthrogenesis Corp | Use of umbilical cord blood to treat inflammation, ParkinsonÆs disease or diabetes |
ZA200507284B (en) | 2003-03-12 | 2007-03-28 | Celgene Corp | 7-amino-isoindolyl compounds and their pharmaceutical uses |
EP1624883A4 (en) * | 2003-04-09 | 2008-11-26 | Univ Utah Res Found | COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO THE PRODUCTION OF ERYTHROPOIETIN |
EP1615945B1 (en) | 2003-04-09 | 2011-09-28 | BioGeneriX AG | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7501518B2 (en) * | 2003-04-22 | 2009-03-10 | Genzyme Corporation | Methods of making 2,6-diaryl piperidine derivatives |
CA2517077C (en) * | 2003-04-22 | 2013-03-12 | Anormed Inc. | Chemokine receptor binding heterocyclic compounds with enhanced efficacy |
EP1667706A4 (en) * | 2003-08-22 | 2009-06-24 | Queensland Inst Med Res | G-CSF DERIVATIVE FOR INDUCING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE |
UA83504C2 (en) | 2003-09-04 | 2008-07-25 | Селджин Корпорейшн | Polymorphic forms of 3-(4-amino-1-oxo-1,3 dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione |
US7220407B2 (en) * | 2003-10-27 | 2007-05-22 | Amgen Inc. | G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction |
EA200600921A1 (ru) * | 2003-11-06 | 2006-10-27 | Селджин Корпорейшн | Способы и композиции с применением талидомида для лечения и менеджмента рака и других заболеваний |
NZ548049A (en) * | 2003-12-02 | 2009-01-31 | Celgene Corp | Methods and compositions for the treatment and management of hemoglobinopathy and anemia |
EP1711159B1 (en) | 2003-12-30 | 2013-03-20 | Durect Corporation | Solid implants containing a block copolymer for controlled release of a gnrh compound |
NZ548256A (en) | 2004-02-02 | 2010-02-26 | Ambrx Inc | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
SE0400942D0 (sv) * | 2004-04-08 | 2004-04-08 | Henrik Arnberg | Composition and method |
BRPI0418742A (pt) * | 2004-04-14 | 2007-09-11 | Celgene Corp | métodos de tratamento, prevenção ou controle de uma sìndrome mielodisplásica, de redução ou evitação de um efeito adverso associado com a administração de um segundo ingrediente ativo em um paciente sofrendo de um sìndrome mielodisplásica, composição farmacêutica, forma de dosagem unitária única, e, kit |
JP2007532642A (ja) * | 2004-04-14 | 2007-11-15 | セルジーン・コーポレーション | 脊髄形成異常症候群の治療及び管理のための選択的サイトカイン阻害薬の使用法、及びそれを含む組成物 |
EP1586334A1 (en) * | 2004-04-15 | 2005-10-19 | TRASTEC scpa | G-CSF conjugates with peg |
US7597884B2 (en) * | 2004-08-09 | 2009-10-06 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
KR20070085227A (ko) * | 2004-08-09 | 2007-08-27 | 앨리오스 바이오파마 인크. | 합성 초글리코실화, 프로테아제 저항성 폴리펩티드 변이체,경구 제제 및 이를 이용한 방법 |
CN101094684A (zh) * | 2004-08-13 | 2007-12-26 | 阿诺麦德股份有限公司 | 用趋化因子的组合活化祖细胞/干细胞 |
AU2005282449B2 (en) * | 2004-09-07 | 2011-07-14 | Velico Medical, Inc. | Apparatus for prolonging survival of platelets |
CA2581769C (en) | 2004-09-28 | 2014-03-11 | Genexel-Sein, Inc. | Methods of using chimeric coiled-coil molecule |
AU2006304496B2 (en) * | 2004-10-15 | 2013-07-11 | Velico Medical, Inc. | Compositions and methods for prolonging survival of platelets |
GB0505353D0 (en) | 2005-03-16 | 2005-04-20 | Chem Technologies Ltd E | Treatment process for concrete |
WO2006050394A2 (en) | 2004-11-01 | 2006-05-11 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Combination approaches for generating immune responses |
WO2006055260A2 (en) | 2004-11-05 | 2006-05-26 | Northwestern University | Use of scf and g-csf in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders |
US7790174B2 (en) * | 2004-12-23 | 2010-09-07 | Merck Serono Sa | G-CSF polypeptides and uses thereof |
ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
MX2007008982A (es) | 2005-01-25 | 2007-12-06 | Cell Therapeutics Inc | Conjugados de proteinas biologicamente activas que tienen una vida media modificada in vivo. |
US20060270707A1 (en) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Zeldis Jerome B | Methods and compositions using 4-[(cyclopropanecarbonylamino)methyl]-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindole-1,3-dione for the treatment or prevention of cutaneous lupus |
AU2006254543A1 (en) | 2005-06-01 | 2006-12-07 | Maxygen Holdings Ltd. | PEGylated G-CSF polypeptides and methods of producing same |
EP1739179A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
DE102005033250A1 (de) | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Reinigung von G-CSF |
KR100735784B1 (ko) * | 2005-07-20 | 2007-07-06 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 인간 과립구콜로니자극인자 변이체 및 이의 화학적 접합물 |
KR20080033439A (ko) * | 2005-08-04 | 2008-04-16 | 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 | G-csf 부분 및 중합체의 컨주게이트 |
US8580814B2 (en) * | 2006-04-03 | 2013-11-12 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using (+)-1,4-dihydro-7-[(3S,4S)-3-methoxy-4-(methylamino)-1-pyrrolidinyl]-4- oxo-1-(2-thiazolyl)-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid for treatment of cancer |
US20080138295A1 (en) * | 2005-09-12 | 2008-06-12 | Celgene Coporation | Bechet's disease using cyclopropyl-N-carboxamide |
US20070155791A1 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-05 | Zeldis Jerome B | Methods for treating cutaneous lupus using aminoisoindoline compounds |
CA2643209A1 (en) * | 2006-02-24 | 2007-09-20 | Genzyme Corporation | Methods for increasing blood flow and/or promoting tissue regeneration |
DE102006009437A1 (de) | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | G-CSF-Flüssigformulierung |
WO2007102814A2 (en) * | 2006-03-07 | 2007-09-13 | Regenetech, Inc. | Recombinant mammalian molecules and method for production thereof |
GB0605684D0 (en) * | 2006-03-21 | 2006-05-03 | Sicor Biotech Uab | Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
WO2007137300A2 (en) | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods |
JP2009539994A (ja) | 2006-06-12 | 2009-11-19 | サネシス ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 癌の治療のための化合物及び組成物 |
CA2659861A1 (en) * | 2006-08-02 | 2008-02-07 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using (+)-1,4-dihydro-7-[(3s,4s)-3-methoxy-4-(methylamino)-1-pyrrolidinyl]-4-oxo-1(2-thiazolyl)-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid for treatment of certain hematologic disorders |
CL2007002218A1 (es) * | 2006-08-03 | 2008-03-14 | Celgene Corp Soc Organizada Ba | Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa. |
MX2009001445A (es) * | 2006-08-07 | 2009-02-18 | Genzyme Corp | Terapia de combinacion. |
CA2673719C (en) | 2006-12-21 | 2018-07-24 | Biokine Therapeutics Ltd. | T-140 peptide analogs having cxcr4 super-agonist activity for bone marrow recovery |
WO2008096370A2 (en) * | 2007-02-05 | 2008-08-14 | Natco Pharma Limited | An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf |
NZ580686A (en) * | 2007-05-02 | 2012-11-30 | Ambrx Inc | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
JP5457344B2 (ja) * | 2007-07-17 | 2014-04-02 | アセア バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | 複素環式化合物および抗がん剤としての使用 |
US7893045B2 (en) | 2007-08-07 | 2011-02-22 | Celgene Corporation | Methods for treating lymphomas in certain patient populations and screening patients for said therapy |
EP2185689A2 (en) | 2007-08-09 | 2010-05-19 | Genzyme Corporation | Method of treating autoimmune disease with mesenchymal stem cells |
EP2578235A3 (en) | 2007-08-27 | 2013-08-28 | BioGeneriX AG | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
KR20100044261A (ko) | 2007-08-27 | 2010-04-29 | 바이오제너릭스 에이지 | G-csf의 액상 조성물 |
WO2009046015A2 (en) * | 2007-09-30 | 2009-04-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Combination therapies for treating type 1 diabetes |
KR100921226B1 (ko) | 2007-10-04 | 2009-10-12 | 학교법인 선목학원 | 사람 혈액의 과립구집락자극인자(hG-CSF) 유전자를 내장하는 레트로바이러스 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 가금 |
US20090155838A1 (en) * | 2007-11-28 | 2009-06-18 | Smart Tube, Inc. | Devices, systems and methods for the collection, stimulation, stabilization, and analysis of a biological sample |
EP2649997B1 (en) | 2007-12-10 | 2019-01-23 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | (+)-1,4-dihydro-7-[(3s,4s)-3-methoxy-4-(methylamino)-1-pyrrolidinyl]-4-oxo-1-(2-thiazolyl)-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid for use in the treatment of myelodyspastic syndrome |
CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
JP2011519375A (ja) * | 2008-04-30 | 2011-07-07 | ニュートロン ロウ | 癌治療のためのコルチコトロピン放出因子の使用法 |
PT3782612T (pt) | 2008-05-15 | 2024-01-18 | Celgene Corp | Formulações orais de análogos da citidina e métodos de utilização dos mesmos |
EP3225248B1 (en) * | 2008-07-23 | 2023-06-07 | Ambrx, Inc. | Modified bovine g-csf polypeptides and their uses |
US9155780B2 (en) | 2009-02-11 | 2015-10-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Short beta-defensin-derived peptides |
EP2436387B1 (en) | 2009-05-25 | 2018-07-25 | Celgene Corporation | Pharmaceutical composition comprising crbn for use in treating a disease of the cerebral cortex |
US9427456B2 (en) | 2009-06-14 | 2016-08-30 | Biokine Therapeutics Ltd. | Peptide therapy for increasing platelet levels |
EA020621B1 (ru) | 2009-06-22 | 2014-12-30 | Амген Инк. | Рефолдинг белков с использованием химически контролируемого окислительно-восстановительного состояния |
RU2012102259A (ru) | 2009-06-24 | 2013-07-27 | Стефен ЭВАНС-ФРИК | Способы применения кортикотропин-рилизинг фактора для лечения рака |
EP3660032A1 (en) | 2009-06-25 | 2020-06-03 | Amgen, Inc | Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system |
WO2011056566A2 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for treatment of cancer |
US20110129858A1 (en) * | 2009-11-27 | 2011-06-02 | Changhua Christian Hospital | Prognosis Biomarker for Evaluating the Cure Level of Stroke Patient and a Method thereof |
MX349301B (es) | 2009-12-21 | 2017-07-21 | Ambrx Inc | Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos. |
DK2341061T3 (da) | 2009-12-31 | 2013-11-04 | Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret As | Ny fremgangsmåde til fremstilling af G-CSF (granulocytkoloni-stimulerende faktor) |
CN102822173A (zh) * | 2010-02-19 | 2012-12-12 | 美国艾森生物科学公司 | 杂环化合物和作为抗癌剂的用途 |
ES2639398T3 (es) * | 2010-03-04 | 2017-10-26 | Pfenex Inc. | Método para producir proteína de interferón recombinante soluble sin desnaturalización |
JP2013522236A (ja) | 2010-03-12 | 2013-06-13 | セルジーン コーポレイション | レナリドミドを使用する非ホジキンリンパ腫の治療方法、並びに予測因子としての遺伝子及びタンパク質バイオマーカー |
NZ603033A (en) | 2010-04-01 | 2014-06-27 | Pfenex Inc | Methods for g-csf production in a pseudomonas host cell |
WO2012019168A2 (en) * | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
TWI480288B (zh) | 2010-09-23 | 2015-04-11 | Lilly Co Eli | 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物 |
DK3241558T3 (da) | 2010-09-28 | 2021-04-26 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Højopløselige leptiner |
US20140031325A1 (en) | 2010-12-06 | 2014-01-30 | Celgene Corporation | Combination therapy with lenalidomide and a cdk inhibitor for treating multiple myeloma |
CN103338753A (zh) | 2011-01-31 | 2013-10-02 | 细胞基因公司 | 胞苷类似物的药物组合物及其使用方法 |
PE20140983A1 (es) | 2011-03-11 | 2014-08-25 | Celgene Corp | Formas solidas de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4h-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, y sus composiciones farmaceuticas y sus usos |
HUE027481T2 (en) | 2011-03-11 | 2016-09-28 | Celgene Corp | Methods of treating cancer with 3- (5-amino-2-methyl-4-oxo-4H-quinazolin-3-yl) -piperidine-2,6-dione |
KR20140024914A (ko) | 2011-04-29 | 2014-03-03 | 셀진 코포레이션 | 예측인자로 세레브론을 사용하는 암 및 염증성 질환의 치료를 위한 방법 |
US9320777B2 (en) | 2011-05-13 | 2016-04-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods and use of growth hormone supergene family protein analogs for treatment of radiation exposure |
US11707410B2 (en) | 2011-10-25 | 2023-07-25 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US10350139B2 (en) | 2011-10-25 | 2019-07-16 | Corning Incorporated | Pharmaceutical glass packaging assuring pharmaceutical sterility |
CN104168884A (zh) | 2011-11-01 | 2014-11-26 | 细胞基因公司 | 使用胞苷类似物的口服制剂治疗癌症的方法 |
US8889630B2 (en) | 2011-12-23 | 2014-11-18 | Carlos Lopez | Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
HUP1200171A1 (hu) | 2012-03-19 | 2013-09-30 | Richter Gedeon Nyrt | Módszerek polipeptidek elõállítására |
HUP1200172A2 (en) * | 2012-03-19 | 2013-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Methods for refolding g-csf from inclusion bodies |
ES2681050T3 (es) | 2012-04-11 | 2018-09-11 | Acerta Pharma B.V. | Inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton para la movilización hematopoyética |
WO2013160895A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-10-31 | Biokine Therapeutics Ltd. | Peptides and use thereof in the treatment of large cell lung cancer |
ES2872967T3 (es) | 2012-06-29 | 2021-11-03 | Celgene Corp | Métodos para determinar la eficacia de fármacos usando IKZF3 (AIOLOS) |
EP2870238A4 (en) | 2012-07-05 | 2016-03-09 | Ohio State Innovation Foundation | COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH VIRAL VACCINES |
EP3613765A1 (en) | 2012-08-03 | 2020-02-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibody against repulsive guidance molecule b (rgmb) |
PL2882442T3 (pl) | 2012-08-09 | 2021-12-13 | Celgene Corporation | Sposoby leczenia nowotworów z wykorzystaniem 3-(4-((4-(morfolinometylo)benzylo)oksy)-1-oksoizoindolin-2-ylo)piperydyno-2,6-dionu |
AU2013299631B2 (en) | 2012-08-09 | 2017-09-28 | Celgene Corporation | Salts and solid forms of (S)-3-(4-((4-morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and compositions comprising and methods of using the same |
US9587281B2 (en) | 2012-08-14 | 2017-03-07 | Celgene Corporation | Cereblon isoforms and their use as biomarkers for therapeutic treatment |
EA201590535A1 (ru) | 2012-09-10 | 2015-07-30 | Селджин Корпорейшн | Способы лечения локально прогрессирующего запущенного рака молочной железы |
US9968627B2 (en) | 2013-03-26 | 2018-05-15 | Celgene Corporation | Solid forms comprising 4-amino-1-β-D-ribofuranosyl-1,3,5-triazin-2(1H)-one and a coformer, compositions and methods of use thereof |
MX2015013912A (es) | 2013-04-02 | 2016-08-12 | Celgene Corp | Metodos y composiciones que utilizan 4-amino-2-(2,6-dioxo-piperidi n-3-il)-isoindolin-1,3-diona para tratamiento y manejo de canceres en el sistema nervioso central. |
US9717649B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-08-01 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9707155B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9849066B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-12-26 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9707153B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9707154B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9603775B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-03-28 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9713572B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-25 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9717648B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-08-01 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9700486B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-11 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9839579B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-12-12 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
US9700485B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-11 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
EP3293275B1 (en) | 2013-06-06 | 2021-08-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment prevention, and treatment of cancer using pd-l1 isoforms |
EP2815749A1 (en) | 2013-06-20 | 2014-12-24 | IP Gesellschaft für Management mbH | Solid form of 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidine-3-yl)isoindoline-1,3-dione having specified X-ray diffraction pattern |
EP3757130A1 (en) | 2013-09-26 | 2020-12-30 | Costim Pharmaceuticals Inc. | Methods for treating hematologic cancers |
WO2015057992A1 (en) | 2013-10-16 | 2015-04-23 | Izumi Raquel | Btk inhibitors for hematopoietic mobilization |
WO2015073727A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Aequus Biopharma, Inc. | Engineered glycoproteins and uses thereof |
EP3094736A4 (en) | 2014-01-14 | 2017-10-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of melanoma using pd-l1 isoforms |
WO2015195634A1 (en) | 2014-06-17 | 2015-12-23 | Celgne Corporation | Methods for treating epstein-barr virus (ebv) associated cancers using oral formulations of 5-azacytidine |
EP3160486B1 (en) | 2014-06-27 | 2020-11-18 | Celgene Corporation | Compositions and methods for inducing conformational changes in cereblon other e3 ubiquitin ligases |
US9499514B2 (en) | 2014-07-11 | 2016-11-22 | Celgene Corporation | Antiproliferative compounds and methods of use thereof |
RS64038B1 (sr) | 2014-08-22 | 2023-04-28 | Celgene Corp | Postupci za lečenje multiplog mijeloma imunomodulatornim jedinjenjima u kombinaciji sa antitelima |
MA40517A (fr) | 2015-03-16 | 2016-09-21 | Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret As | Procédé pour préparation du facteur stimulant les colonies de granulocytes (g-csf) |
JP6525171B2 (ja) | 2015-04-13 | 2019-06-05 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 環状化サイトカイン及びその製法 |
SI3313818T1 (sl) | 2015-06-26 | 2024-03-29 | Celgene Corporation | Postopki zdravljenja Kaposijevega sarkoma ali s KSHV povzročenega limfoma, z uporabo imunomodulatornih spojin in uporabe biomarkerjev |
WO2017009843A2 (en) | 2015-07-16 | 2017-01-19 | Biokine Therapeutics Ltd. | Compositions, articles of manufacture and methods for treating cancer |
CN108348593B (zh) | 2015-08-31 | 2022-08-16 | 泰克诺瓦克斯股份有限公司 | 基于人呼吸道合胞病毒(hrsv)病毒样颗粒(vlps)的疫苗 |
US11229683B2 (en) | 2015-09-18 | 2022-01-25 | Bolder Biotechnology, Inc. | Hematopoietic growth factor proteins and analogs thereof and angiotensin converting enzyme inhibitors for treatment of radiation exposure |
WO2017066561A2 (en) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | President And Fellows Of Harvard College | Regulatory t cell pd-1 modulation for regulating t cell effector immune responses |
EP3365360A1 (en) | 2015-10-19 | 2018-08-29 | Sandoz AG | Improved coding sequence for human g-csf |
WO2017067959A1 (en) | 2015-10-19 | 2017-04-27 | Sandoz Ag | Method for producing a recombinant protein with reduced impurities |
US10953003B2 (en) | 2015-12-14 | 2021-03-23 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancer |
CA3008279A1 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancer |
SI3393468T1 (sl) | 2015-12-22 | 2023-01-31 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Postopki za zdravljenje bolezni imunske pomanjkljivosti |
WO2017117118A1 (en) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Celgene Corporation | Compositions and methods for inducing conformational changes in cereblon and other e3 ubiquitin ligases |
EA037508B1 (ru) | 2016-01-08 | 2021-04-06 | Селджин Корпорейшн | Композиции 2-(4-хлорфенил)-n-((2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)метил)-2,2-дифторацетамида |
MX367669B (es) | 2016-01-08 | 2019-08-30 | Celgene Corp | Compuestos antiproliferativos y sus composiciones farmacéuticas y usos. |
TWI733734B (zh) | 2016-01-08 | 2021-07-21 | 美商西建公司 | 2-(4-氯苯基)-n-((2-(2,6-二氧六氫吡啶-3-基)-1-氧基異吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙醯胺之固體型式,及其醫藥組合物及用途 |
BR112018016924A2 (pt) | 2016-02-23 | 2019-01-02 | Biokine Therapeutics Ltd | método de seleção de regime de tratamento para indivíduo que tem leucemia mieloide aguda (lma), método de maximização de resposta ao tratamento de leucemia mieloide aguda (lma), método de tratamento de lma, antagonista de cxcr4 e agente quimioterápico no tratamento de lma |
KR20190080825A (ko) | 2016-03-21 | 2019-07-08 | 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. | T-세포 기능소실 상태-특이적 유전자 발현 조절인자 및 그 용도 |
IL262007B2 (en) | 2016-04-01 | 2023-04-01 | Signal Pharm Llc | Modified aminopurine compounds, their compositions and methods of treatment using them |
PT3436019T (pt) | 2016-04-01 | 2021-11-04 | Signal Pharm Llc | (1s,4s)-4-(2-(((3s,4r)-3-fluorotetra-hidro-2h-piran-4- il)amino)-8-((2,4,6-triclorofenil)amino)-9h-purin-9-il)-1- metilciclo-hexano-1-carboxamida e métodos de utilização dos mesmos |
US11337969B2 (en) | 2016-04-08 | 2022-05-24 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancer |
WO2017180770A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Synthetic Genomics, Inc. | Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof |
JP7084624B2 (ja) | 2016-06-21 | 2022-06-15 | エックス4 ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | Cxcr4阻害剤およびその使用 |
US11332470B2 (en) | 2016-06-21 | 2022-05-17 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | CXCR4 inhibitors and uses thereof |
EP3808748A1 (en) | 2016-06-21 | 2021-04-21 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Substituted piperidines as cxcr4-inhibitors |
WO2018013689A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-18 | Celgene Corporation | Solid dispersions and solid forms comprising 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidine-3-yl)isoindoline-1,3-dione, method of preparation and use thereof |
WO2018013693A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-18 | Celgene Corporation | Solid dispersions and cocrystals comprising 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione compositions and methods of use thereof |
CN110073002B (zh) | 2016-10-17 | 2024-06-11 | 杨森制药公司 | 重组病毒复制子体系及其用途 |
KR102655641B1 (ko) | 2016-12-05 | 2024-04-05 | 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 | 유전자 발현을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 |
WO2018165142A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Celgene Corporation | Solid forms of 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4h-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione, and their pharmaceutical compositions and uses |
KR20200041294A (ko) | 2017-06-21 | 2020-04-21 | 샤이 테라퓨틱스 엘엘씨 | 암, 염증성 질환, 신경발달질환 및 섬유증 질환의 치료를 위하여 Ras 수퍼패밀리와 상호작용하는 화합물 |
CA3068591A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Celgene Corporation | Compositions and methods of use of 2-(4-chlorophenyl)-n-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolin-5-yl) methyl)-2,2-difluoroacetamide |
SG11202002864PA (en) | 2017-10-04 | 2020-04-29 | Celgene Corp | Compositions and methods of use of cis-4-[2-{[(3s,4r)-3-fluorooxan-4-yl] amino}-8-(2,4,6-trichloroanilino)-9h-purin-9-yl]-1-methylcyclohexane-1-carboxamide |
US10590136B2 (en) | 2017-10-04 | 2020-03-17 | Celgene Corporation | Processes for the preparation of cis-4-[2-{[(3S,4R)-3-fluorooxan-4-yl]amino}-8-(2,4,6-trichloroanilino)-9H-purin-9-yl]-1-methylcyclohexane-1-carboxamide |
AU2018348138A1 (en) * | 2017-10-11 | 2020-04-23 | Ambrx, Inc. | Porcine G-CSF variants and their uses |
CN111918652A (zh) | 2017-11-06 | 2020-11-10 | 拉普特医疗公司 | 用于治疗eb病毒阳性的癌症的趋化因子受体调节剂 |
EA202091513A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-09-09 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение |
EA202091516A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-11-03 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv) |
EA202091517A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-11-03 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv) |
EP3740245A4 (en) | 2018-01-19 | 2022-01-05 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | INDUCTION AND ENHANCEMENT OF IMMUNE RESPONSES USING RECOMBINATION REPLICON SYSTEMS |
US10548889B1 (en) | 2018-08-31 | 2020-02-04 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Compositions of CXCR4 inhibitors and methods of preparation and use |
JP7407461B2 (ja) | 2018-12-19 | 2024-01-04 | シャイ・セラピューティクス・エルエルシー | がん、炎症性疾患、ras病、及び線維性疾患の処置のためのrasスーパーファミリーと相互作用する化合物 |
WO2020234742A1 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | Lupin Limited | Granulocyte colony stimulating factor purification |
WO2021257828A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Shy Therapeutics, Llc | Substituted thienopyrimidines that interact with the ras superfamily for the treatment of cancers, inflammatory diseases, rasopathies, and fibrotic disease |
WO2023201282A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Novel gspt1 compounds and methods of use of the novel compounds |
WO2024064646A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-28 | Celgene Corporation | Salts and solid forms of (s)- or racemic 3-(4-((4-(morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and methods of using the same |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
FI82266C (fi) * | 1982-10-19 | 1991-02-11 | Cetus Corp | Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. |
JPS6023777A (ja) * | 1983-07-15 | 1985-02-06 | 鶴海合成炉材株式会社 | 低融点金属用溶解保持手許炉 |
WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
US4710473A (en) * | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
JPS60206066A (ja) * | 1984-03-29 | 1985-10-17 | Toshiba Corp | 固体撮像装置 |
JPS60209638A (ja) * | 1984-04-03 | 1985-10-22 | Diesel Kiki Co Ltd | デイ−ゼル機関用電子式ガバナ |
JPS60217150A (ja) * | 1984-04-13 | 1985-10-30 | マツダ株式会社 | 塗装を施した繊維強化ウレタン成形品 |
JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
JPH0615477B2 (ja) * | 1985-02-08 | 1994-03-02 | 中外製薬株式会社 | 感染防禦剤 |
WO1986004605A1 (en) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
JPH01110629A (ja) * | 1985-04-05 | 1989-04-27 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 感染防禦剤 |
US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
JPS63500636A (ja) * | 1985-08-23 | 1988-03-10 | 麒麟麦酒株式会社 | 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするdna |
JPH0657152B2 (ja) * | 1985-09-17 | 1994-08-03 | 中外製薬株式会社 | Csf遺伝子類 |
DE3681551D1 (de) * | 1985-09-30 | 1991-10-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Menschlicher granulozyten-colony stimulierender faktor. |
US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
JP2976258B2 (ja) * | 1992-07-07 | 1999-11-10 | 株式会社名機製作所 | ホットプレスの断熱材取付け構造 |
-
1986
- 1986-03-03 US US06/835,548 patent/US4810643A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-22 IL IL79805A patent/IL79805A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-22 AT AT00101091T patent/ATE332375T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-22 AU AU63346/86A patent/AU6334686A/en not_active Abandoned
- 1986-08-22 WO PCT/US1986/001708 patent/WO1987001132A1/en active IP Right Grant
- 1986-08-22 DE DE3650788T patent/DE3650788T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-22 NZ NZ217334A patent/NZ217334A/en unknown
- 1986-08-22 KR KR870700352A patent/KR880700071A/ko not_active Application Discontinuation
- 1986-08-22 PT PT83242A patent/PT83242B/pt unknown
- 1986-08-22 SG SG1996004322A patent/SG48964A1/en unknown
- 1986-08-22 EP EP86905530A patent/EP0237545B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-22 GR GR862185A patent/GR862185B/el unknown
- 1986-08-23 ES ES8601318A patent/ES2001883A6/es not_active Expired
- 1986-08-23 CN CN86106234A patent/CN1020924C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-25 CA CA000516737A patent/CA1341537C/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-04-16 FI FI871700A patent/FI105191B/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-22 DK DK198702044A patent/DK174980B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-04-22 NO NO871679A patent/NO303544B1/no not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-05-02 JP JP1113512A patent/JP2527365B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-02 JP JP1113513A patent/JPH0231675A/ja active Granted
-
1991
- 1991-05-17 JP JP3141402A patent/JP2660178B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-27 JP JP3277149A patent/JP2660179B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-26 SG SG358/92A patent/SG35892G/en unknown
- 1992-06-18 MX MX9202992A patent/MX9202992A/es unknown
- 1992-10-21 SA SA92130186A patent/SA92130186B1/ar unknown
- 1992-11-06 CY CY1642A patent/CY1642A/xx unknown
-
1993
- 1993-07-01 NL NL930127C patent/NL930127I1/nl unknown
-
1995
- 1995-05-26 US US08/452,135 patent/US5582823A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 US US08/459,298 patent/US5580755A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-12 JP JP8055077A patent/JP2718426B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-11 US US08/678,692 patent/US5676941A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-15 US US08/679,897 patent/US5830705A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-02-18 JP JP9033849A patent/JP2952203B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-11 NO NO19982132A patent/NO314902B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
1999
- 1999-02-12 JP JP11034848A patent/JP3115561B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-04 FI FI20000014A patent/FI107540B/fi not_active IP Right Cessation
- 2000-03-08 JP JP2000064219A patent/JP2000279185A/ja active Pending
- 2000-12-12 HK HK00107970A patent/HK1029600A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-02-21 FI FI20010334A patent/FI110576B/fi not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-03-28 JP JP2002092947A patent/JP2002315578A/ja active Pending
-
2003
- 2003-05-19 NO NO20032250A patent/NO318755B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-11-13 NO NO2003008C patent/NO2003008I1/no unknown
- 2003-11-26 JP JP2003394905A patent/JP2004041242A/ja not_active Withdrawn
- 2003-12-09 NO NO2003010C patent/NO2003010I2/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-17 NO NO20045548A patent/NO20045548L/no unknown
-
2006
- 2006-01-11 JP JP2006004052A patent/JP2006101889A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO303544B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid med Ún eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskaper til granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) | |
US4999291A (en) | Production of human pluripotent granulocyte colony-stimulating factor | |
US6004548A (en) | Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor | |
EP1018552B1 (en) | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor | |
AU727724B2 (en) | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor | |
BG63065B2 (bg) | Аналози на плурипотентен гранулоцитен колония-стимулиращ фактор | |
AU1110101A (en) | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor | |
BG63285B2 (bg) | Получаване на човешки плурипотентен гранулоцитен колония-стимулиращ фактор | |
AU2004202013A1 (en) | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
SPCF | Filing of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: PEGFILGRASTIM; NAT. REG. NO/DATE: NO , EU/1/02/22 20030513; FIRST REG. NO/DATE: EP , EU/01/02/2 20020827 Spc suppl protection certif: 2003008 Filing date: 20031113 |
|
MK1K | Patent expired |