KR20060002743A - 조혈성장인자에 의한 신경학적 질환의 치료방법 - Google Patents

조혈성장인자에 의한 신경학적 질환의 치료방법 Download PDF

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마르틴 마우레
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Abstract

본 발명은 포유동물의 신경학적 질환을 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF), 과립구-대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)와 같은 조혈 성장인자를 투여함에 의한 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뉴런 세포의 표면에서 발견되는 GCSF 또는 GMCSF 수용체에 조합하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하고; 이것은 신경 보호성, 신경증식성 및/또는 STAT 유전자 촉진 활성을 제공한다.

Description

조혈성장인자에 의한 신경학적 질환의 치료방법{METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL CONDITIONS WITH HEMATOPOEITIC GROWTH FACTORS}
본 발명은 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF), 과립구-대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)와 같은 조혈 성장인자 및/또는 예를 들면, 적혈구 조혈인자(EPO) 이외의 MCSF와 같은 다른 조혈인자를 투여함에 의해 포유동물의 신경학적 질환을 치료 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뉴런 세포의 표면에서 발견되는 GCSF 또는 GMCSF 수용체에 조합하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하고; 이것은 신경 보호성, 신경증식성 및/또는 STAT 유전자 촉진 활성을 제공한다.
성장인자는 신경 세포의 생장, 증식, 성숙, 및 발육의 생육을 조절하는데 필수적으로 포함되는 단백질이다. 예를 들면, 다수의 성장인자의 발현은 각종 뇌상해에 대한 반응으로 증가한다. 많은 인자들은 내인성 신경보호 및 신경영양 효과를 나타낸다(참조 Arvidsson A st al., Neuroscience 2001; 106:27-41; Larsson E, et al., J Cereb Blood Flow Metab 1999;19:1220-8; Mattson MP, et al., J Neurotrauma 1994; 11:3-33; Semkova I, et al., Brain Res Brain Res Rev 1999; 30;176-88). 이들 효과는 또한 뇌외상 및 뇌졸증 후 인 비트로 및 인 비보 외인성 투여 후에도 보고되었다(참조 Semkova I., et al., Brain Res. Rev 1999;30:176- 88; Fisher M, et al., J. Cerb. Blood Folw Metab. 1995; 15-953-9; Schabitz WR et al., Stroke 2001; 32: 1226-33; Schabits WR, et al., Stroke 2000; 31:2212-7). 고친화성 막 수용체에 조합한 후, 성장 인자의 효과는 세포내 신호-도입 사상의 캐스캐이드에 의해 조정되고(Kernie SG, et al., Arch Neurol 2000; 57:654-7), 이것은 세포가 성장하고 분화되도록 하고; 또는 세포 생존에 대한 영양 지지를 제공한다.
과립구-콜로니 자극인자(GCSF), 20 kDa 단백질, 종양괴사인자-α(TNF-α)와 함께 및 인터로이킨은 성장인자의 시토킨 류의 멤버이다. GCSF는 호중구 과립구의 산물에 포함된다.
GCSF는 그의 기능을 조혈단백질의 상부-과(super-family)에 속하고, 또한 클래스 Ⅰ 시토킨 수용체로 불리우는 막 수용체(GCSF 수용체)의 활성을 통해 발휘한다(de Koning and Touw, Curr. Opin. Hematol., 1996, 3, 180-4).
림포킨, 조혈 성장인자, 및 성장 호르몬-관련 분자에 대한 많은 수용체는 통상의 조합 영역을 공유하는 것이 발견되었다. 이들 수용체는 조혈 수용체로 불리우며 대응 단백질은 조혈단백질로 불리운다. 더우기, 조혈 단백질은 두개의 중요 구조군으로 다시 나누어진다: 크고/긴 및 작고/짧은 조혈단백질. 큰 조혈소의 수용체 복합체의 일부인 개개의 수용체 사슬은 그들의 세포외 부분에 통상의 구조적 요소를 함유한다: 면역글로빈-형 영역, 조혈소-수용체 영역, 및 3 피브로넥틴 Ⅲ-형 영역(렙틴 수용체에 2). 이 하부군은 "수용체의 gp130 과"를 나타내고(Mosley, et al., J. Biol Chem. 1996, 271, 32635-43), 렙틴 수용체(LPTR), 괴립구 콜로니 자 극 인자 수용체(GCSFR), 인터로킨-6/-11/LIF/OSM/CNTF 통상 베타 사슬(OSMR), 인터로킨-12 수용체 베타-1 사슬(IL12RB1), 온코스타틴-M 수용체 베타-2 사슬(OSMR), 인터로킨-12 수용체 베타-1 사슬(IL12RB1), 인터로킨-12 수용체 베타-2 사슬(IL12RB2)를 포함한다. 이들 수용체 사슬들은 동계 시토킨에 조합한 후, 동종이형화(GCSFR, GP130, LPTR) 또는 이종이형화(LIFR 또는 OSMR을 갖는 GP130, IL12RB2를 갖는 IL12RB1)된다. 이에 더하여, 전위치 교감작용 패턴은 이 수용체 과의 특성이며, 이것은:
N-x(4)-S-x(28,35)-[LVIM]-x-W-x(0,3)-p-x(5,9)-[YF]x(1,2)-[VILM]-x-W(SEQ ID No. 1)이다.
GCSF는 특정 GCSF 수용체(GCSFR)에 조합을 통해 중성호성 과립구 직계에 수용된 세포의 증식, 생장 및 성숙을 자극한다(Hartung T., et al., Curr. Opin. Henatol. 1998;5:221-5 참조). 신호를 조절하는 GCSFE은 신호 변환기 및 전사 활성기(STAT) 단백질의 과를 활성화하고 이것은 핵에 전이되고 전사를 조절한다(Darnell JF Jr., Science 1997; 277:1630-5). GCSF는 통상적으로 인간의 여러 종류를 호중구 감소증의 치료에 사용된다. 이것은 임상적 사용이 허용된 소수의 성장인자중 하나이다. 특히, 이것은 화학적영양(CT)-유도 혈구감소증의 감소에 사용된다(Viens et al., J. of Clin. Oncology, Vol. 20, No.1, 2002:24-36). GCSF는 또한 임시 보조제로서 감염성 질병에 치료제로서 사용되어져 왔다(Hubel et al., J of Infectious Diseases, Vol. 185:1490-501, 2002). GCSF는 보도에 의하면, 어느 정도 결정화되어지며(EP 344 796), GCSF의 전체적 구조는 추측되어 왔지만 겨우 개 락적인 수준이다(Bazan, Immunology Today 11:350-354(1990); Parry et al. J. Molecular Recognition 8: 107-11(1988)).
최근 bFGF와 같은 다수의 성장인자와 전구유착 차단제 유사 항-GP IIb/IIa 및 Abcizimab과 같은 약제학적으로 기대되는 물질이 임상 연구에서 신경보호 효능에 대해 시험되어졌다. 불행히도, 이들 보급된 것들 중 어느것도 신경보호 효능을 제공하지 않는다. 특히, NMDA 길항제, 자유라디칼 포획제 및 글루타민산염 길항제는 실패하거나 또는 심각한 부작용을 나타내었다. 성장이 실패된 항-ICAM 또는 글루타민산염-조절 NO-합성제의 억제제와 같은 리스트이다(De Keyser, et al. (1999), Trends Beurosci, 22, 535-40).
대뇌 국소빈혈에 대한 대부분의 연구 및 인 비보 약물학적 물질의 시험은 약물의 조절 효과 또는 연구 하의 패러다임(즉, 뇌졸증 유발 후 24시간의 경색 크기)에 대하여 관심을 갖는다. 그러나, 특정 물질의 참효능의 더욱 확실한 파라미터는 기능적 회복에 대한 장기간 효과이고, 이것은 또한 인산 뇌졸증 연구에 반영되고, 여기서 임상적 규모(예를 들면, 스칸디나비안 뇌졸증 규모, NIH 규모, Barthel 인덱스)는 일상적인 활성을 실행하는 능력을 반영한다. 병소 병변후 처음 며칠 후의 회복은 부종의 소산 또는 국소빈혈 반음영의 재관류 때문일 수 있다. 급성 상(phase) 후 기능적 회복의 대부분은 손상된 영역에 의해 이미 실시된 기능에 대해 취해지는 뇌의 외피 영역 주변의 뇌 유연성 때문인 듯 하다(.Chen R, Cohen LG, Hallett M. Neuroscience 2002;111(4):761-73). 인식을 설명하기 위해 제안된 2개의 주요 메카니즘은 이미 존재하지만 기능적으로 불활성 연결이고 병렬적 발아와 같은 새로운 연결의 성장을 폭로한다(Chen R, Cohen LG, Hallett M. 2002 Neuroscience 2002; 111(4):761-73). 단기간 정성적 변화는 흥분 시냅스의 억제를 제거함에 의해 조절되고, 이것은 감소된 GABAergic 억제 때문인 듯 하다(Kaas JH. Annu Rev Neurosci. 1991;14:137-67; Jones EG. Vereb Cordex) 1993 9월~10월;3(5):361-72). 장기간에 걸쳐 일어나는 유연성은 장기간 강화(LTP)와 같은 잠재적 시냅스의 폭로 이외에 메카니즘을 포함하고, 이것은 NMDA 수용체 활성과 증가된 세포내 칼슘 농도를 요구한다(Hess and Donoghue, J Neurophysiol. 1994 71(6):2543-7). 장기간 변화는 또한 축색돌기 재생과 시냅스 모양, 수, 크기 및 형태의 변화를 갖는 발아를 포함한다(Kaas JH. Annu Rev Neurosci. 1991; 14:137-67., 3).
뇌졸증은 세번째 사망 원인으로, 서양에서 장애의 주요 원인이다. 병인은 국소빈혈(원인의 대부분) 또는 출혈이다. 국소빈혈 뇌졸증의 원인은 종종 색전, 또는 혈전성이다. 지금까지, 대부분의 뇌졸증 환자들에 대한 효과적인 치료는 없었다. 지금까지 임상적으로 허용된 약물은 조직 플라미노겐 활성제(TPA) 및 아스피린이다. 글루코스와 산소의 부족으로 인한 직접 경색 코어에서 대량의 세포 치사 후, 경색 영역은 글루타민산염 독성자극, 세포자멸 메카니즘, 및 자유 라디칼의 발생과 같은 2차 메카니즘으로 인해 수일동안 확장된다.
근위축성측삭경화증(ALS; 루게릭 병; 샤르코 병)은 매년 인구 100.000명당 0.4 내지 1.76의 발생하는 신경퇴행성 질병이다(Adams et al., Principles of Neurology, 6th ed., New York, pp 1090-1095). 이것은 전신에 퍼진 조생, 골격근의 점진적인 위축 및 약화, 강직성 경련 및 추체골관 징후, 눌어증, 연하곤란 및 호흡곤란을 갖는 운동 뉴런 발병의 가장 일반적인 형태이다. 병인은 우선적으로 척수의 전촉각 및 하부뇌간의 운동핵의 신경 세포의 손실로 이루어지지만, 피질의 제 1 명령 운동 뉴런을 포함할 수 있다. 이 파괴적인 질병의 병인은 여전히 대부분 알려지지 않았고, 비록 혈통적 경우에서 과산화물-분자변이효소(SOD1) 돌연변이의 역할이 상당히 잘 성취되었지만, 이것은 산화 스트레스 가설을 포함한다. 지금까지 SOD1 단백질중의 90 이상의 돌연변이가 기재되었고, 이것은 ALS를 일으킬 수 있다(Cleveland and Rothstein(2001), Nat Rev neurosci, 2, 806-19). 또한, 이 질병에서 신경필라멘트의 역할이 나타났다. 독성자극, 과량의 글루타민산염 자극에 의한 메카니즘이 또한 중요한 인자일 수 있고, 인간 환자의 Riluzole의 유리한 역할로 예시될 수 있다. 대부분의 SOD1 돌연변이에서 나타나는, 캡시케이드와 세포자멸사의 활성은 ALS의 통상적인 최종 경로로 보인다(Ishigaki, et al.(2002), J Neurochem, 82, 576-84., Li, et al (2000), Science, 288, 335-9). 그러므로, ALS는 글루타민산염 관련, 산화 스트레스 및 프로그램화된 세포 치사와 같은 다른 신경 질병과 뇌졸증에 작용되는 동일한 전신 병인 패턴에 속하는 것으로 보인다.
파킨슨씨병은 가장 흔한 운동장해이고, 북미에서 약 백만명의 환자가 있으며; 65세 이상 인구의 약 1%가 걸렸다. 이 질병의 핵심 증세는 강직, 떨림 및 무동증이다(Adams et al., Principles of Neurology, 6th ed., New York, pp 1090-1095). 파킨슨씨병의 병인은 알려지지 않았다. 그럼에도 불구하고, 인간 뇌 부검 연구 및 동물 모델로부터의 생물학적 자료들의 상당한 부분은 흑질에서 산화 스트레스의 진행 과정을 지적하고, 이것은 도파민성 신경퇴행을 개시할 수 있다. 신경 독 6-히드록시도파민과 MPTP(N-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드록시피리딘)에 의해 유도되는 산화 스트레스는 신경 퇴행의 과정을 조사하기 위한 동물 모델에서 사용되어져왔다. 비록 징후치료가 존재하지만(예를 들면, L-DOPA 플러스 디카르복실라제 억제제; 브로모크립틴, 도파민 작용제로서의 퍼글라이드; 및 트리헥실페니딜(아르탄)과 같은 항콜린제), 예를 들면, 신경퇴행치료와 같은 원인치료에 대한 분명한 요구가 있고, 이것은 질병의 진행을 실제로 정지시킨다. 이 동물 모델들은 라디칼 스캐빈저, 이온 킬레이트화물, 도파민 작용제, 질산염 산화물 합성 억제제 및 특정 칼슘 채널 길항제의 효능 시험에 사용되어져 왔다. 세포자멸 메카니즘은 환자 뿐만 아니라 동물 모델에서 분명히 작동한다(Mochizuki, et al.(2001), Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 98, 10918-23, Xu et. al.(2002), Nat. Med., 8-600-6, Viswanathm et al,(2001), J. Neurosci., 21, 9519-28, Hartmann, et al. (2002), Neurology, 58, 308-10). 산화 스트레스 및 세포자멸을 포함하는 병리학은 다른 신경퇴행질병과 뇌졸증 중에서 파킨슨씨병에 놓인다.
대뇌빈혈은 뇌혈류(CBF)의 약화를 일으키는 여러 원인으로 발생하고 산소와 글루코스의 결핍에 기인한다. 한편, 외상성 뇌손상(TBI)은 1차 기계적 영향을 포함하고 보통 혈관과 뇌조직이 나뉘고 찢어지는 뇌 두개골 파열과 뇌 실제조직의 급작스런 분열의 원인이 된다. 즉, 이것은 2차 손상을 가져오는 분자와 세포 반응의 활성에 의해 특징되는 일련의 사상을 유발한다. 이와 같은 2차 손상의 발전은 많은 생화학적 경로가 포함되는 활성과정이다(Leker and Shohami (2002), Brain Res, Rev., 39, 55-73). 경계부 허혈 영역과 2차 외상후 손상에 노출되는 영역에서 2차 세포 사멸을 일으키는 해로운 경로 사이의 많은 유사성이 확인되었다(예를 들면, 과량의 글루타민산염 방출에 의한 독성자극, 반응성 산소종, 염증, 세포자멸(Leker and Shohami (2002), Brain Res. Rev., 39, 55-73)). 이에 더하여 초기 빈혈 에피소드는 1차 기계적 손상에 대한 빈혈의 성분을 더하여 외상성 뇌손상 후 발생되는 것으로 보고된다.
심장혈관질환은 서양 선진국에서 주요 사망원인이다. 미국에서, 해마다 약 1백만명이 사망하고 이들 중 거의 50%는 급사이며 병원외에서 사망한다(Zheng, et al.(2001), Circulation, 104, 2158-63). 심폐기능소생(CPR)이 매년 100,000 거주인의 40-90에 시도되고, 자동순환소생(ROSC)은 이들 환자의 25~50%에서 이루어진다. 그러나, 성공적인 ROSC 후 병원퇴원률은 겨우 2~10%이다(Bottiger, et al.(1999), heart, 82, 674-9). 그러므로, 매년 미국에서 심장환자의 대부분은 성공적으로 치료되지 못한다. 낮은 생존률의 가장 큰 원인은, 즉, 정지후 병원에서의 사망률은 뇌손상을 없애기 어렵기 때문이다. 심장순환 정지에 따른 뇌손상은 감압 스트레스에 대한 그리고 특정 재관류 장애에 대한 짧은 내성에 관련된다(Safar(1986), Circulation, 74, Ⅳ138-53, Hossmann (1993), Resuscitation, 26, 225-35). 초기에, 심장순환정지후 많은 수의 환자가 혈류역학적 일 수 있지만, 그러나 그들 중 많은 수가 중추신경계 손상으로 사망한다. 심장발작 이후의 뇌손상의 개인적, 사회적, 및 경제적 중요성은 엄청나다. 심장 정지 및 소생("전체 신체 허혈 및 제관류)에서 가장 중요한 이슈중 하나는 대뇌 소생 및 후-정지 대뇌 손상이다(Safra(1986), Circulation, 74, Ⅳ138-53, Safar, et al.(2002), Cirt Care Med, 30, p.140-4). 현재, 뉴런에 대한 1차 손상을 감소시키는 것은 불가능하고 이것은 후-정지 치료측정에 의한 심장 정지동안의 혈중 산소감소에 의해 일어난다. 주요 병리학 이슈는 혈중산소감소 및 이후의 괴사, 자유 라디칼 형성에 의한 재관류 손상 및 세포 칼슘 유입, 여기 아미노산의 방출, 뇌 미세혈관 재관류 손상 및 프로그램화된 뉴런치사 또는 세포괴사를 포함한다(Safar(1986), Circulation, 74, Ⅳ138-53, Safar et al.(2002), Crit Care Med, 30, 140-4).
임상적 시험이 성공없이 심장정지 후 신경학 결론을 개선하기 위해 시도되었다. 바비트루산염(신경보호를 강화하기 위한)의 치료적 사용 또는 (허혈 재관류 손상을 감소시키기 위한)칼슘 채널 차단체의 사용이 시험되어졌다(Group(1086), Am.J. Energ. Med., 4,72-86, Group(1986), N. Engl.J. Med., 314, 397-403, Group(1991), Control Clin. Trials, 12, 525-45, Group(1991), N. Engl. J. Med., 324, 1225-31). 지금까지, (큰, 임의의 그리고 조절된 이상 시험의 결과가 기다려지는 저체온증과 체온저하의 가능성을 제외하고)임상 세팅에서 심장순환 정지가 따르는 신경학 결론을 개선시키기 위해 이용할 수 있는 특정 후-정지 치료 선택은 없다(Safar et al(2002), Crit. Care Med., 30, 140-4)). 그러므로, 심장 정지 후 신경학 결론을 개선하기 위한 혁신적인 치료가 결정적이다.
다발성 경화증은 중추신경계의 원형 감염성 자동면역 장해이고, 청년의 신경장애의 가장 일반적인 원인으로 400명 중 하나의 평생 위험을 갖는다. 세계적으로, 이 질병을 앓는 환자는 약 2~5백만명이다(Compston and Coles(2002), Lancet, 359, 1221-31). 모든 복잡한 시도후, 장해는 아직 확인되지 않은 환경인자 및 민감성 유 전자간의 상호작용으로부터이다. 이들 인자들은 함께 일련의 사상을 일으키고, 면역 시스템의 연결, 신경돌기 및 신경교의 급성 감염손상, 기능 회복 및 구조적 회복, 후-감염성 글리오시스 및 신경퇴행을 포함한다. 이들 공정의 이후의 포함은 회복 증상의 발현, 지속적 장애 증상을 떠나는 발현 및 2차 진행으로 특징되는 임상 코스를 겪는다. 치료의 목적은 빈도를 줄이고, 재발의 지속 결과를 제한하고 증상을 완화하고 질병이 진행의 발생을 막고 조직 회복을 촉진하는 것이다.
우울증은 슬픔, 활동에 관한 관심의 손실 및 감소된 에너지에 의해 특징되는 일반적인 정신질환이다. 우울증은 그것의 심각성 정도, 증상 및 질병의 지속에 의해 정상 무드 변화로부터 나누어진다. 자살은 일반적이고 가장 피할 수 없는 우울증 결과중 하나이다. 우울증 증상의 발현이 과장된 의기양양과 흥분이 번갈아 온다면, 이들은 이극 장애로 알려진다. 우울증 장애와 정신분열증은 전체 자살의 60%의 원인이다. 우울증의 원인은 변한다. 상반된 상황조건과 같은 심리적 인자는 우울증 증상발현을 개시 및 지속시킬 수 있다. 유전적 및 생리적 인자들 또한 일부 역할을 할 수 있다.
대략 1억2천백만명이 현재 우울증을 앓고 있다. 우울증은 YLD(Years Lived with Diability)로 측정된 장애의 주된 원인이고 질병의 국제적 예산(DALY=Disability adjusted Life Years)에 4번째로 기여한다. 잠재 수명의 합은 2000년에 미성숙 정신 및 생산햇수에 의해 손실된다. 남성의 약 5.8% 및 여성의 약 9.5%가 어느 해에 우울증 증상발현을 경험할 것이다. 2020년까지, 우울증은 양성에서, 모든 연령에서 산출된 DALY의 랭킹에서 2위를 차지할 것이다. 개발된 영역 에서, 우울증은 질병의 예산의 가장 높은 랭킹이 될 것이다.
오늘날, 우울증을 겪는 사람 대부분의 첫번재 치료는 항우울증 약제, 정신요법 또는 이들 모두의 조합으로 이루어진다. 항-우울증제는 주요 우울증 증상발현의 심각성의 전체 범위에 효과적이다. 현재, 효과적인 항우울증 치료법은 세로토닌 신경전달물질의 변경 또는 미세 튜닝과 밀접한 관계가 있다. 뇌에서 세라토닌의 수준을 증가시키는 약물은 가장 잘 알려진 항우울증제이다(Fluoxetine, Prozac® 또는 Flictin®). 환자에게 항우울증 효과를 제공하는 치료는 리튬과 같은 약물학적 항우울증제, 전기-충격요법 및 물리적 운동이다. 다른 개입은 취약한 개인, 가족 및 그룹에 대한 지지 네트워크 시스템을 세팅하는 것이다. 우울증 예방에 관한 증거는 덜 확정적이고, 오직 몇몇 분리된 연구만이 우울증 예방을 위하여 제안된 개입이 효과적임을 보여준다. 기존의 약물이 질병의 증상을 완화하는데 도움이 된다는 생각이 중요하지만, 이 질병에 대한 기본적 병인 메카니즘을 우선적으로 초점을 맞추지 못한다. 그러므로, 새로운 치료법 특히 우울증에 새롭게 발견된 심각한 면에 촛점을 맞춘 치료법이 요구된다.
정신불열증은 가장 일반적인 정신 질환증 하나이다. 100명당 약 1명(인구의 1%)가 정신분열증을 앓고 있다. 이 질병은 전세계적으로 모든 인종과 문화에서 발견된다. 정신분열증은 남여 동일한 수로 감염되고, 평균적으로 남자가 여자보다 빨리 정신분열이 전개되는 것을 나타난다. 일반적으로, 남성은 20대 초반에 정신분열증의 증상이 나타나고, 여성은 20대 후반에 처음 신호가 나타난다. 정신분열증은 사회적 비용이 엄청나고, 미국에서 대략 년간 32억5천만달러이다. 정신분열증은 다 음 증상의 몇몇으로 특징된다: 망상, 환각, 무질서한 사고 및 언어, 부정적 증상(사회로부터의 도피, 감정 및 표현의 부재, 감소된 에너지, 작극 및 활동), 긴장증. 정신분열증에 대한 주요 치료법은 클로로프로마진, 할로페리돌, 올란자핀, 클로자핀, 티로리다진 등과 같은 뉴로플렙틱스를 기초로 한다. 그러나, 뉴로플렙틱스 치료법은 종종 정신분령증의 모든 증상을 완화시키지 않는다. 더우기, 항정신병 치료법은 만발성 운동장해와 같은 심각한 부작용을 갖는다. 정신분열증의 병인은, 비록 유전적 영향이 있는것 같지만, 명백하지는 않다. 최근, 정신분열증이 신경퇴행 질병의 적어도 몇몇 관점을 갖는다는 것이 분명해졌다. 특히, MR 연구는 정신분열증 환자에게서 신속한 피질 그레이 물질 손실을 나타내었다(Thompson, et al.(2001). Proc Natl Acad Sci USA 98, 11650-5; Cannon, et al, (2002), Proc Natl acad Sci USA, 99, 3228-33). 그러므로, GCSF 또는 GMCSF와 같은 신경보호 약제 또는 다른 조형 인자에 의한 정신분열증의 치료가 정당화된다.
인간에게서 인식용량을 증가시키고, 지능을 강화하는 방법이 요구된다. 현대적 의미의 지능은 단순히 논리 또는 의미적 능력으로 제한되지 않는다. 예를들면, Howard Gardner에 의한 다중지능이론은 진화와 인류학적 관점으로부터 지능을 평가하고, IQ 테스트에 의해 측정되는 지능과 관련된 언어적/논리적 능력 뿐만 아니라 운동, 근육, 예능 및 감정 용량을 포함하는 더 넓은 관점을 생산한다. 지능의 더 넓은 의미는 창조성의 영역으로도 확장된다. 이에 더하여, ARML(age-related memory loss) 또는 MCI(mild cognitive impairment)로 인간에게 알려진 비-병리적 상태가 있고 이것은 통상 40대에 나타나며 알츠하이머병의 초기 신호와 다르다.
성인기를 통해 신경 세포의 생리적 손실있고, 대략 하루당 100,000 뉴런정도이다. 성인기를 통해, 뇌의 중량과 부피가 점진적으로 감소된다. 이 감소는 10년당 약 2%정도이다. 앞에서 간단히 설명한 것과 반대로, 감소는 50대 후에 가속되지 않지만, 성인기 초반으로부터 동일한 페이스로 계속된다. 이것의 축적 효과는 더 나이가 들때까지 인식되지 않는다.
뇌가 크기면에서 감소되는 동안, 이것은 균질하지 않다. 특정 구조는 더 쉽게 축소된다. 예를 들면, 해마와 전두엽, 두 구조는 기억에 포함되는데 종종 더 작아진다. 이것은 부분적으로 뉴런의 손실 때문이고 부분적으로 몇몇 뉴런의 위축 때문이다. 대부분의 다른 뇌 구조물은 크기의 손실을 겪지 않는다. 정신적 프로세싱의 느림은 손실, 축소 또는 연결 손실과 같은, 뉴런의 열화에 의해 일어난다. 온전한 기능적 뉴런의 고갈은 단순하거나 또는 자동적일 수 있는 정신적 수고를 관리하기 위해 뉴런의 추가적인 네트워크를 보충하는 것이 요구된다. 그러므로, 공정이 느려진다. 전두엽 외피로 불리는 전두엽의 일부는 사고와 행동을 모니터하고 조절하는데 포함된다. 이 뇌 영역에서 일어나는 수축은 많은 성인의 언어 발견의 어려움을 설명한다. 이것은 또한 자동차 열쇠를 놓은 곳을 잊어버리는 것이나 일반적인 건망증을 설명한다. 전두엽과 해마의 수축은 기억력 장애에 관련된다고 생각된다. 그러므로, 개인의 지각능력의 강화 또는 개선에 대한 요구가 여전히 남아있다.
상기 관점에서, 유연성과 기능적 회복의 강화와 관련된 신경성 질병, 또는 신경계의 세포-치사와 같은 신경학 및/또는 정신적 질환을 치료하는 것이 요구된다. 특히, 관련된 신경 세포에 신경보호물질을 제공하여 신경학 질병을 치료하는 것이 요구된다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 포유동물의 신경계 또는 정신적 질환을 치료하기 위하여 GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체와 같은 조혈인자 및 이들의 조합물, 또는 GCSF 또는 GMCSF 또는 유도체를 스크리닝하는 세포를 투여하여 상기 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포유동물의 신경학적 질환을 치료하기 위하여 GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체와 같은 조혈인자 및 이들의 조합물을 갖는 신경 줄기세포 조성물을 컨디셔닝하고; 신경 줄기세포를 상기 질환을 치료하기 위해 포유동물에 투여하는 것인 포유동물의 신경 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 뉴런 세포를 접촉시켜 뉴런 세포의 STAR를 활성화하는 뉴런세포의 과립구 콜로니 자극인자 수용체(GCSFR)에 조합하는 화합물을 동정하고; 상기 화합물과 접촉하지 않은 뉴런 세포에서 STAT 활성에 대한 STAT 활성의 증가를 측정하고, 예를 들면, GCSF 조절된 STAT 활성에 대한 활성을 측정하는 방법을 제공하는 것이다. 더우기, 신경 질환을 치료하기 위해 상기 화합물을 사용하는 방법 뿐 아니라 이 방법으로 얻은 화합물은 본 발명의 추가의 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뉴런 세포의 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(GMCSFR)에 조합하고 및/또는 뉴런 세포를 상기 화합물과 접촉시켜 뉴런 세포에서 STAT 유전자 발현을 활성화하는 화합물을 동정하고; 상기 화합물과 접촉하지 않은 뉴런 세포에서의 STAT 유전자 할성과 비교하여 STAT 활성의 증가를 측정하는 방법을 제공하는 것이다. 추가로, 상기 화합물을 사용하여 신경 질환을 치료하는 방법 뿐만 아니라 이 방법으로 얻은 화합물은 본 발명의 추가 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화합물을 GCSF 수용체를 갖는 신경 세포와 접촉시키고, 신경 세포에 대한 화합물의 신경보호 효과를 측정하고, 그리고 GCSF의 효과에 대한 화합물의 효과를 비교함에 의한 개선된 신경보호 활성을 갖는 GCSF 수용체 작동물질을 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 상기 화합물을 사용하여 신경 질환을 치료하는 방법 뿐만 아니라 이 방법으로 얻은 화합물은 본 발명의 추가 목적이다.
본 발명의 다른 목적은 화합물을 GMCSF 수용체를 갖는 신경 세포와 접촉시키고, 신경 세포에 대한 화합물의 신경보호 효과를 측정하고, 그리고 GMCSF의 효과에 대한 화합물의 효과를 비교함에 의한 개선된 신경보호 활성을 갖는 GMCSF 수용체 작동물질을 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 상기 화합물을 사용하여 신경 질환을 치료하는 방법 뿐만 아니라 이 방법으로 얻은 화합물은 본 발명의 추가 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화합물을 GCSF 수용체를 갖는 신경 세포와 접촉시키고, GCSF와 접촉된 2차 신경 세포에 신경 세포에서 STAT 유전자 발현 수준을 비교함에 의한, 개선된 GCSF 수용체 작용제를 갖는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 상기 화합물을 사용하여 신경 질환을 치료하는 방법 뿐만 아니라 이 방법으로 얻은 화합물은 본 발명의 추가 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화합물을 GMCSF 수용체를 갖는 신경 세포와 접촉시키고, GCSF와 접촉된 2차 신경 세포에 신경 세포에서 STAT 유전자 발현 수준을 비교함에 의한, 개선된 GMCSF 수용체 작용제를 갖는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 상기 화합물을 사용하여 신경 질환을 치료하는 방법 뿐만 아니라 이 방법으로 얻은 화합물은 본 발명의 추가 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포에 존재하는 GCSF 또는 GMCSF 수용체를 작동시킴에 의한 GCSF 또는 GMCSF 발현 및/또는 내인성 신경 세포에서의 방출을 자극하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 세포는 GCSF 또는 GMCSF의 발현 및/또는 방출을 증가시키는 물질과 접촉된다. 이와 같은 방법은 예를 들면, 신경세포 배양물과 같은 신경 세포에서 GCSF 및/또는 GMCSF의 방출 또는 증가된 발현을 검출하는 조사에 적용될 수 있다(예를 들면, PCR 및/또는 ELISA 조사).
본 발명의 다른 목적은 GMSCF 수용체, GCSF 수용체, 또는 두 수용체를 신경 질환을 치료하기 위해 작동시킴에 의한 포유동물에서 신경 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포를 포유동물에 이식하기 전에, GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체 및/또는 이들의 조합물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입함으로써, 포유동물에 이식된 세포의 생장을 강화하고, 그것에 의해 세포가 폴리뉴클레오티드의 도입전에 세포 생장과 비교하여 세포 생장을 강화시키는데 충분한 양으로 조혈인자를 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포를 조혈인자를 제공하기 전의 배양과 비교하여 신경세포배양의 생존능력을 강화하기 위해 GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체 및/또는 이들의 조합물을 제공함에 의한 신경세포배양의 생존능력을 강화하는 방법을 제공하는 것이다. 이와같은 방법에서, 조혈인자는 배양의 세포와 접촉하는데 사용될 수 있고 또는 조혈 인자를 암호화하고 발현하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 제종될 수 있다.
도 1은 인 비보 및 인 비트로에서 GCSF에 의한 효율적인 신경보호를 설명한다. A, TTC-염색법으로 측정한, 병소의 뇌국소빈혈 후 GCSF의 신경보호 정도(필라멘트 모델: 중뇌 동맥 폐색,MCAO). y-축의 값은 전체 반구의 경색 백분률을 나타낸다(자료는 평균±SD; T-테스트; p<0.05). B, H2O2에 의한 산화 스트레스의 증가하에서 NGF-처리 PC12세포에서 세포 생존 분석(OμM, 400μM, 750μM) GCSF 처리는 새포 생존률을 극적으로 증가시켰다. 비교에서, 공지의 신경보호 물질, 에리트로포이에틴(EPO)으로 세포를 처리 후의 세포 생존률을 나타내었다: Y-축:상대적(Rev.) 세포 생장(루시퍼라제 활성의 광유니트).
도 2a는 마우스 GCSFR에 대한 RT-PCR 특이를 나타낸다. GCSF-R RNA는 예상크기 567bp의 뇌조직에서 검출되었다. 동정은 PCR 산물을 서열화하여 변화시켰다.
도 3은 GCSF-R의 면역블롯을 나타낸다. GCSF-R 항혈청을 사용하여 약 130 kDa에서의 밴드가 래트 피질의 조직에서 검출되었다(래인 1). 저분자량의 주가의 밴드는 산물의 분해를 반영하는 것이다. 각각의 펩티드에 의한 항혈청의 예비흡착 후, 아무런 검출된 밴드가 없다(래인 2).
도 4는 마우스의 다양한 뇌 영역에서 GCSF-수용체의 분포를 나타낸 면역조직화학(immunohistochemistry)이다. a-d: 해마에서 GCSF-R의 위치측정. 항체가 CA3와 CA2 영역사이에 날카로운 경계를 갖는 CA3 영역(a,b)에서 뉴런을 오염시켰다는 것을 확인하라(c, 화살표). GCSF-R은 뉴런의 공정 뿐만 아니라 체세포에도 분포한다(b, 화살표). 치상돌기 회의 신문(hilus)과 기저세포증에 수용체가 존재한다는 것을 확인하라(d, 화살표). GCSF-수용체는 피질 영역에서도 검출된다: 예를 들면, 이상(piriform)피질(e), 및 코주위의 피질(f). 소뇌에서 푸르키네에 세포를 포식화하였다(g, 화살표). 또한, 후각 구의 큰 승모세포의 몇몇은 GCSF-R 양성이다(h, 화살표). 척수의 전관에 의해 강한 염색이 나타났고(i.j), 큰 확대에 의해 GCSF-R 양성(k,l)과 같은 큰 운동뉴런을 동정하였다. 뉴런진행은 강하게 표식화되었다. 중뇌에서, 흑질 중의 뉴런은 GCSF-R 양성을 나타내었다(m). 특히, 조밀부의 모든 뉴런을 표식화한다(m과 n의 화살표). 또한, 망상부에서 여러 뉴런은 GCSF-R을 발현한다(o). 뉴런으로부터 분리되어, 백색 물질 트랙의 핍지신경교는 예를 들면, 전교련에서 오염된다(p, 화살표). 놀랍기는, GCSF 리간드의 오염(항체 sc13102, Santa Cruz)는 그의 수용체(항체 sc694, Santa Cruz)의 발현과 공동배치된다(도 4 q-u). 이것은 해로운 자극에 대한 뉴런의 보호 측정으로서 오토크란 메카니즘을 설명한다. 해마에서 동일한 서브필드 특이성이 GCSF 리간드에 대해 관찰된다(q:GCSFR, r:GCSF, 화살표는 서브필드 CA2-3 사이의 경계를 지적하고, ca3과 ca2라벨은 서브 필드를 나타낸다). 이 특이성은 국소빈혈 손상에 대한 이들 영역의 민감성의 알려진 차이와 관련되고, GCSF 시스템의 신경보호 작용을 설명한다. 또한, 치상돌기 회에서, 신문과 서브과립 영역에서 발현된 동일한 흥미있는 패턴이 관찰되었다(도4c, GCSF 수용체; 도 4t, GCSF; 화살표는 서브과립 영역의 하나의 뉴런을 지적한다. 라벨:s: 서브과립 영역, h: 치상돌기 회의 신문), 이것은 신경조직발생에 대한 GCSF 시스템의 중요성을 나타내고, 신경 수용체와 신경구의 발현과 거의 동등하다(도 13 참조). 흥미롭기는, GCSF는 또한 척수의 큰 운동뉴런에서 발현되고(도 4u) 그의 수용체도 역시 발현된다(도 4i-l).
도 5는 피질(a,b)과 해마 배양된 뉴런(c,d)에서의 GCSFG에 대한 오염을 나타낸다. 수용체는 뉴런의 체세포와 뉴런의 돌기에 모두 존재한다. 측면에 있는 뉴런 모두가 라벨화되지 않는다. 각각의 펩티드를 갖는 항체의 예비배양, 또는 1차 항체의 제거는 특정 오염을 가져오지 않았다(도시하지 않음).
도 6과 7은 STAT3에 대한 항체로 얻은 면역조직화학 결과를 나타낸다. 도 6: STAT3 면역조직학. 많은 뉴런핵은 플라시보 처리된 동물의 피질 경색주위 영역(a: 화살표; 좌측:경색; 우측: 체세포; 기본 확대×200)과 비교하여, GCSF 처리된 래트의 피질 반음영에서 양으로 오염된다(b, 화살표). 도 7: 비감염된 반대측 면(CL)의 피질 뉴런과 경색 주변의 동측성(IL)을 GCSF 처리한 동물과 대조군으로 정량화하였다. STAT3의 핵 위치이동된 뉴런의 수를 세어 확인한 바에 따르면 GCSF-처리된 군에서 경색 주변의 뉴런중 STAT3의 상당한 활성이 있었다(*p<0.05, t-테스트).
도 8은 대뇌 국소빈혈의 포토트롬보성 벵갈로스 모델에서 GCSF 처리의 효과 를 나타낸다. A, 로타로드 실행; B, 빔 밸런스를 포함한, 신경학적 점수; C,D: 반대측(D) 뿐만 아니라 ipsi-(C)에서 측정된 점착 트랩 제거 시험. 범예: 허혈: 허혈 래트, 비처리의 군; 허혈 + GCSF: GCSF로 처리된 허혈 래트 군; GCSF 처리된, 모조-수술 동물; 모조:모조-수술 동물, 비처리. L:좌측 앞발에서 테이프 제거 시험; R: 우측 앞발에서 테이프 제거. 테이프-제거 시험(C,D)에서 두쪽 모두에서 효과가 있었고, 아마도 테이프가 동측성 측면상에 있을때 현저한 운동 결핍, 및 테이프가 반대측면에 있을 때 현저한 센서 결핍에 의한 것일 것이다.
도 9는 뱅갈-로스 모델에서 허혈 반대측면에서 포토트롬보시스의 유도 48시간 후 GCSF-수용체의 상승조절을 나타낸다. A, 래트 뇌의 관상 부위의 허혈, 조직 샘플 3과 4를 모조-수술 래트의 동일한 조직과 비교하여 GCSF 수용체 mRNA의 정량화를 위해 사용하였다. B, 피질 반음영 샘플(A의 샘플 3과 4)에서 GCSF 수용체 mRNA의 정량화. 동측성 면에서 유도된 허혈 후 6시간에서 초기 조절은 초기 경색 후 48시간에서 반대측에서의 조절을 가져온다. 이 반대 조절은 GMCSF 수용체에서도 발견된다(하기 참조).
도 10은 클러스터 W 알고리즘을 이용한 다양한 종의 GCSF의 배열을 나타낸다(SEQ ID NOS: 28-33)(MEGALIGNTM, Lasergene, Wisconsin).
도 11은 마우스와 인간의 GCSF 수용체의 배열, 및 클러스터 W 알고리즘을 이용한 래트의 단편을 나타낸다(SEQ ID NOS:34-36)(MEGALIGNTM, Lasergene, Wisconsin).
도 12는 RT-PCR (역전사 PCR)에 의한 성인 뉴런 줄기 세포상의 GCSF 수용체 의 존재를 설명한다. 나타낸 것은 아게로스 겔이다. 래인 1: 크기 마커; 래인 2: 신경 줄기세포의 PCR 산물(nsc), 가시적인 것은 래트 GCSFR- 특이 밴드(279bp); 래인 3:음성 대조.
도 13은 GCSF-수용체와 뉴런 줄기 세포상의 GCSF의 존재를 나타낸다. A, 모든 세포의 가시화를 위한 신경구의 DAPI 오염; B, GCSF 수용체에 대하 검출된 항체로 오염된 동일한 신경구; C,D, DAPI(C)로 오염된 신경구 및 GCSF(D)에 대한 항체.
도 14는 마이스에 복강내 주입 후 비오틴화된 GCSF의 신속 섭취를 나타낸다. A, 7.5μg GCSF/마우스의 주입 후 1,2,4,6,20, 28시간에 살해된 마우스 혈청의 웨스턴 블롯. B, 주입 즉시 혈청 GCSF의 ELISA. 2시간에서 혈청 피크 수준을 갖는 복막에서 GCSF의 신속한 섭취가 있고, 이 투여 경로의 적용가능성을 나타낸다.
도 15는 동측면과 허혈의 반대 면에서 광혈전증(벵갈 로스 모델)의 도입 후 후조절된 mRNA로서 GMCSF-수용체의 동정을 나타낸다. A는 허혈 측면을 나타낸다; B는 RMDD-겔의 부위를 나타낸고, 여기서 GMCSF-수용체의 전사는 조절되면서 동정되었다. 래인은 마우스 뇌의 RNA 샘플의 RT-PCR 산물을 나타낸다. 샘플은 뇌졸증 후 다른 시점에서 피질 반음영에서 취하였다(각각 A의 3과 4).
도 16은 LightCycler-System을 적용 후, 정량적 RT-PCR에 의해 48시에서 뱅갈-로스 모델에서의 GNCSF-수용체의 조절의 변형을 나타낸다. 샘플을 광혈전증의 유도 후 6시, 48시 및 21일 후에 취하였고 유도 수준은 모조-수술 동물과 비교하였다. 동축성 반구에서, GMCSF 수용체의 상향조절은 피질 허혈 후 초기에 최대이고 21일까지 꾸준히 감소된다. 대응하는 반대측 피질-샘플에서, 상향조절은 경색 후 2 일에 븐명했고, 21일에 여전히 상당히 상향조절되었다. 이 반대측에서의 조절 패턴은 GCSF 수용체를 떠오르게 한다(상기 참조).
도 17은 인간, 마우스 및 상향조절된 전사에 의해 동정된 래트의 서열의 GMSCF 수용체의 배열이다(SEQ ID NOS: 22, 23 및 24)(ClustalW 알고리즘, MEGALIGNTM, Lasergene, Wisconsin).
도 18은 인간, 마우스, 래트의 GMSCF의 배열을 나타낸다(SEQ ID NOS: 25, 26 및 27)(ClustalW 알고리즘, MEGALIGNTM, Lasergene, Wisconsin).
도 19는 마우스의 다른 뇌 영역(파라핀 부위, 2㎛)에서 GMCSF-수용체 알파(a-d) 및 GMCSF(e-g)의 분포를 나타내는 면역조직화학이다. a: 소뇌에서 푸르키네에 세포를 라벨화하였다(화살표). b-d: 해마에서 GMCSF-R 알파의 국지화. 치상돌기 회에서 수용체의 존재를 확인을 주목하라. 항체는 우선적으로 CA3와 CA3 영역(c, 화살표)의 예민한 경계를 갖는 CA3 영역(c)의 뉴런을 오염시킨다. GMCSF-R 알파는 뉴런의 돌기(CA2) 뿐만 아니라, 체세포에 걸쳐 분포된다(CA3). GMCSF-수용체는 또한 엔트로하이날(entrohinal) 피질에도 분포된다(d). GMCSF는 GMCSF-수용체 알파와 비교하여 유사하게 분포된다. 푸르키네 세포와 마찬가지로 GMCSF 항체는 CA3와 CA3 영역(f, 화살표)의 예민한 경계를 갖는 CA3 영역(e)의 뉴런과 엔트로하이날 피질(g)의 뉴런을 오염시킨다. 도 19h-m: GMCSF 수용체와 그것의 뉴런에서의 리간드의 놀라운 공동국소가 나타난다. h; 해마 서브필드 CA3의 뉴런에서 GMCSF 수용체(항체 sc690, Santa Cruz)의 국소, 화살표는 CA2 영역에 인접한 예민한 발현 경계를 지적 한다. i, GMCSF 리간드(항체 sc13101)는 동일한 서브필드-특이 발현을 나타내고, 화살표는 CA3 영역의 하나의 뉴런을 지적한다. 화살표는 서브과립 영역의 뉴런을 지적한다. j, 치상돌기 회의 신문과 서브과립 영역의 GMCSF 수용체의 발현. 화살표는 서브과립 영역의 뉴런을 지적한다. k, 그 영역에서 GMCSF 리간드의 발현. 여기서, 리간드는 그의 수용체와 비교하여 약간 다른 발현을 나타낸다. CA3 영역(화살표)의 발현은 분명하지만, 치상돌기 회 영역에서는 덜 분명하다. l,m: 척수의 큰 운동뉴런에서 GMCSF 수용체(l)와 리간드(m)의 발현. 이 놀라운 발현은 운동뉴런 질병, 특히 근위축성측삭경화증에 대한 GMCSF 시스템의 치료적 적용가능성을 명백히 나타낸다.
도 20은 피질 뉴런 배양의 GMCSFR 알파에 대한 오염을 나타낸다. 수용체는 체세포와 뉴런의 돌기 모두에 존재한다. (핵 에피토프 NeuN, 및 시납토피신에 대한 항체(이것은 도시하지 않음)에 대해 검출된 항체로 이중 표지화에 의해 확증). 각각의 펩티드를 갖는 항체의 예비배양, 또는 1차 항체의 제거는 특이 오염을 가져오지 않았다(도시하지 않음).
도 21은 성인 신경 줄기세포(nsc)와 PC12 세포상의 GMCSF-수용체 알파의 존재를 설명한다. 아가로스겔을 나타낸다. 래인 1: 크기 마커(M); 래인 2: 신경줄기세포(nsc)에 대한 PCR; 래인 3: PC12 세포(PC12)에 대한 PCR; 래인 4: 음성 대조(neg). 래트 GM-CSFR 알파-특이 밴드(176bp)가 래인 2와 래인 3에 보여졌다.
도 22는 면역세포화학에 의한 성인 신경줄기세포(nsc)에 대한 GMCSF-수용체 알파의 존재를 나타낸다. 하나의 신경구를 DAPI(A, 모든 세포 핵 오염), 그리고 GMCSF 수용체(B)에 대한 특이 항체로 오염하였다(10배 확대).
도 23은 인비트로 GMCSF에 의한 효과적인 신경보호를 설명한다. H2O2(0 μM, 400μM, 750μM)의한 산화 스트레스의 증가하에 NGF-처리된 PC12 세포에서 세포 생존을 조사한다. GMCSF 처리는 세포 생존에 극적인 증가를 가져온다. 대조적으로, 세포를 공지의 신경보호 물질, 에리트로포이에틴(EPO; 0.5U/㎖)으로 처리한 후 세포 생존을 제공한다. Y-축: 상대적 세포 생존(루시퍼라제 활성의 광단위).
도 24는 C-CSF 비투여(대조군)와 비교한, 허혈의 개시 후 120분이 적용되었을 때 래트 MCAO 모델에서 경색 부피상의 정맥상으로 적용된 G-CSF의 효과를 나타낸다.
도 25는 G-CSF 수용체와 G-CSF에 대한 해마와 피질에서의 TTC-오염을 나타낸다. 데이타는 GCSF 수용체(a,d,g)가 그것의 리간드(b,e,h)와 해마(a-c 치상돌기 회)와 피질(g-i)에서 공동-국소됨을 나타낸다.
도 26은 피질(g-i) 뿐 아니라 해마의 치상돌기 회(a-g)와 신문(d-f)의 뉴런상의 G-CSF 및 GM-CSF 수용체 모두의 발현을 나타낸다. GCSF 수용체(a,d,g)와 GMCSF 수용체(b,e,h)는 해마와 피질(c, f, i) 모두에서 동일한 뉴런에서 발현된다.
도 27은 G-CSF가 뉴런에서 stat3의 활성에 의해 항-세포자멸적으로 작용한다는 것을 나타낸다.
도 28은 (I과 II)는 ipsi- 및 반대편에서 국소허혈 후 2시간 및 6시간에서 GCSF의 매우 강한 상향조절을 나타내고(A), 그에 반하여 수용체는 6시간 후 적당히 조절된다(B). GCSF의 유도된 발현은 MCAO 모델에 특이적이지 않고 덜한 정도라도 전체 허혈(C)에서 나타난다.
도 29는 경색 반음영-CSF 및 그것의 수용체를 나타낸다(벵갈 로스).
도 30은 치상돌기 회(a-f)와 해마의 신문의 뉴런상의 GCSF 수용체(a,d,g) 및 이중에코틴(b,e,h)의 발현을 나타낸다.
도 31은 GCSF 처리 후 4일에, 뉴런 마커 NSE와 베타-투불린 4d의 강하고 농도-의존 상향조절을 나타낸다. PLP와 GFAP는 GCSF- 농도의 의존성이 알맞게 조절된다. 에러 막대는 3-배 연속 희석된 cDNA 샘플로부터 산출된 표준 편차를 나타내고, 측정의 신뢰성을 반영한다.
도 32는 뇌에서 GMCSF와 그것의 수용체의 공동-국소를 나타낸다. GMCSF 수용체(a,d,g) 및 GMCSF(b, e,h)은 치상돌기 회(a-c), 신문(d-f), 및 피질(g-i)의 뉴런상에 공동국소된다.
도 33은 대뇌 허혈에 의해 상향조절된 GMCSF와 그것의 수용체를 나타낸다.
도 34는 해마의 치상돌기 회(a-c)와 신문(d-i)의 뉴런상의 GMCSF 수용체(a,d,g) 및 이중코르틴(b,e,h)의 발현을 나타낸다.
도 35는 신경 줄기세포의 미분 포턴셜과 미분된 세포의 특정 마커 발현을 나타내고 신경 줄기세포를 GMCSF 10ng/ml로 처리하면 베타 Ⅲ-튜블린(n=3; p<0.05, 이중-테일 t-테스트)의 상당히 유도된 발현, 돌연변이 뉴런(B)에 대한 마커, NSE의 덜 확장을 가져왔다.
도 36은 G-CSF가 혈액-뇌-장벽(BBB)을 통과함을 나타낸다.
도 37은 GM-CSF가 혈액-뇌-장벽(BBB)을 통과함을 나타낸다.
도 38은 근위축성측삭경화증(ALS)의 치료에 대한 G-CSF의 효능을 나타낸다.
도 39는 파킨슨씨병(PD)의 설취류 모델에서의 GCSF의 효능을 나타낸다.
도 40은 GMCSF가 뉴런에서 stat3 경로의 활성에 의해 항-세포자멸적으로 작용함을 나타내고, 파트 I은 GMCSF가 PARP 분열을 억제한다는 것을 나타내고, 이것은 세포자멸의 신호로서 특이적으로 발생된다. 세포 치사는 NO-공여자 NOR-3의 사용에 의해 1차 뉴런에서 유도된다. 파트 Ⅱ는 비록 단백질 자체는 뉴런에서 발현되지만, GMCSF가 STAT1("pSTAT1") 또는 STAT5("pSTAT5")의 증가된 인산화를 가져오지 않는다는 것을 나타낸다. 파트 Ⅲ. A는 GMCSF가 STAT3의 시간-의존 활성을 가져온다는 것을 나타내고, 이것은 GMCSF 자극후 5분에서 최대이다. B. 3개의 개별적인 실험의 정량화. C, 인산화에 의한 STAT3의 활성은 JAK2 억제제 AG490에 의해 억제될 수 있다. 파트Ⅳ는 GMCSF가 stat3 표적 유전자 Bcl2, 및 BclXI의 발현을 상당히 유도한다는 것은 나타낸다. 이들 유전자들은 항세포자멸로 알려져 있다.
도 41은 GMCSF-처리된 동물에서, 초기(파트 I) 및 3시간의 후 시간창(파트Ⅱ)에서 경색 부피의 상당한 감소가 있었음을 설명한다.
발명의 상세한 설명
GCSF
과립구-콜로니 자극 인자(GCSF)는 잘 알려진 성장 인자이다. 여기에 기재된 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 GCSF는 전장 암호화 서열, 단백질 서열, 및 여러 기능적 변이체, 돌연변이체, 및 알려지고 이용가능한 의태이다. 이하의 논의에서 이들은 GCSF 유도체로 언급된다.
암호화 DNA와 단백질 모두의 구조는 포유동물 다능성 과립구 콜로니-지극 인자(WO 87/01132;US 특허 4,810,643호)를 재조합적으로 생산하기 위한 방법과 함께 알려져 있다. 예를 들면, G-CSF에 대응하는 몇몇 아미노산 서열이 도 10 및 서열 리스트, 즉 SEQ ID NOS: 28, 29, 30, 31, 32 및 33에 나타나 있다.
하나의 구현예에서, 여기에 기재된 전장 인간 GCSF 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하기는 적어도 80%, 더욱 바람직하기는 적어도 90%가 동일한 단백질이 본 발명에 사용될 수 있다: 예를 들면, SEQ ID NO:28. 다른 구현예에서, 사용할 수 있는 GCSF는 야생형 전장 인간 GCSF 암호화 서열과 적어도 70%, 바람직하기는 적어도 90%, 95%, 및 97%가 동일한 폴리누클레오티드에 의해 암호화되는 것으로, 예를 들면, 폴리튜클레오티드 암호화 SEQ ID NO:28 이고, 이 폴리뉴클레오티드는 야생형 전장 인간 GCSF의 암호화 폴리누클레오티드 서열에 대한 엄격한 조건하에서 혼성화될 것이다. "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성 조건"은 폴리뉴클레오티드가 그것의 표적 서열로 혼성화되는 조건을 포함하고 다른 서열보다 더 큰 정도로 검출가능한 것을 의미한다(예를 들면 기준보다 적어도 2배). 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서, 염농도가 약 1.5M Na 이온 미만이고, 통상적으로 약 0.01 내지 1.0M Na 이온 농도이며 온도가 짧은 소식자(예를 들면, 10~50 뉴클레오티드)에 대하여 적어도 약 30℃이고, 긴 소식자(예를 들면, 50 초과의 뉴클레오티드)에 대하여 적어도 60℃인 조건이며, 예를 들면, 매우 엄격한 조건은 37℃에서, 50% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS 중의 혼성화 및 60~65℃에서 0.1X SSC에서 세척을 포함한다(Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probe, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elaevier, New York(1993); 및 Current Prtocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995) 참조). 아미노산과 폴리뉴클레오티드 동정, 상동 및/또는 유사성은 Clustal W 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다(MEGALIGNTM, Lasergene, Wisconsin).
여러 GCSF 기능성 변종, 돌연변이, 및 의태의 예는 기능적 단편 및 (예를 들면, 구조적으로 및 생물학적으로 야생 단백질과 유사하고 적어도 하나의 생물학적으로 동등한 도메인을 갖는)변종, GCSF의 화학적 유도체(예를 들면, 추가의 화학적 부분, 폴리에틸렌글리콜 및 그것의 폴리에틸렌글리콜 유도체, 및/또는 LenogastrimTM과 같은 글리코실화 형태) 및 GCSF의 펩티도미메틱(예를 들면, 구조 및/또는 기능으로 펩티드를 모방하는 저분자량 화합물(예를 들면, Abell, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, London: JAI Press(1997); Gante, Peptidomimetica-massgeschneiderta Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106:1780-1802(1994); 및 Olson et al.,J.Med.Chem. 36:3039-3049 (1993) 참조)를 포함한다.
GCSF 유도체의 추가의 예는 알부민과 GCSF의 융합단백질(AlbugraninTM), 또는 미국 특허 제 6261250호에 기재된 바와 같은 다른 융합 변형물이다; PER-GCSF 컨쥬게이트 및 다른 PEGylated 형태; WO00/44785 및 Viens et al., J. of Clin. Oncology, VI., Nr. 1, 2002에 기재된 것들; 미국 특허 제 5,599,690호에 기재된 GCSF의 노르로인신 동족체; WO 99/61445, WO 99/61446, 및 Tian et al., Science, Vol.281, 1998에 기재된 것과 같은 GCSF 의태물; GCSF 돌연변이, 여기서 단일 또는 복수의 아미노산이 미국 특허 제 5,214,132 및 5,218,092호에 기재된 바와 같이 변형, 결실 또는 삽입된다; 미국특허 제 6,261,550 및 미국특허 제 4,810,643호에 기재된 GCSF 유도체; 및 예를 들면 레리디스틴(Leridistin)과 같은 다른 서열 단편과 조합된 GCSF의 완전 서열 또는 일부를 함유하는 키메르성 분자 --- 예를 들면, Streeter, et al.(2001) Exp. Hematol., 29,41-50, Monahan, et al(2001) Exp.Hematol., 29, 416-24., Hood, et al(2001) Biochemistry, 40, 13598-606, Farese et al.(2001) Stem Cells, 19, 514-21, Farese, et al.(2001) Stem Cells, 19, 522-33, MacVittie, et al.(2000) Blood, 95, 837-45 참조. 이외에, GCSF 유도체는 미국 특허 제 6,004,548에 기재된 바와 같은, (세린과 같은)다른 아미노산으로 치환된 (174 아미노산 종(SEQ ID NO:37)의, 또는 175 아미노산을 갖는 것의) 위치 17, 36, 42, 64 및 74에 시스테인을 갖는 것을 포함하고, 첫번째(N-터미날)위치에 알라닌을 갖는 GCSF; EP 0 335 423에 기재된 바와 같은 GCSF 활성을 갖는 펩티드에 적어도 하나의 아미노기의 변형; EP 0 272 703에 기재된 바와 같은 단백질의 N-터미날 영역에 치환 또는 결실된 아미노산을 갖는 GCSf 유도체; 적어도 하나의 천연적으로 발생하는 GCSF의 생물학적 특성을 갖고 5mg/ml에서 적어도 35%의 용액 안정도를 갖는 천연적으로 발생하는 GCSF의 유도체로, 여기서 상기 유도체는 EP 0 459 630호에 기재된 바와 같이 적어도 Ser17 잔기로 대체된 천연서열의 Cys17과 Ser27 잔기로 대체된 천연서열의 Asp27을 갖는다; EP 0459 630에 기재된 바와 같이 단백질의 아미노산 서열의 변화 없이, N-터미날이 재조합 숙주세포에서 단백질의 발현을 강화하기 위해 변형된 GCSF를 암호화하는 변형된 DNA 서열; EP 0 243 153에 기재된 바와 같이 이스트를 사용한 재조합 생산에서 수득률의 증가를 위한 적어도 하나의 이스트 KEX2 프로테아제 공정 부위를 불활성시킴에 의해 변형된 GCSF; 미국특허 제 4,904,584에 기재된 바와 같은 리신 변형된 단백질; WO/9012874(미국 5,166,322)에 기재된 바와 같은 시스테인 변형된 단백질의 변이체;AU-A-10948/92에 기재된 바와같은 원시핵 발현 후 분자의 주름형성에 첨가하기 위한 GCSF 분자의 어느 쪽의 말단에 아미노산의 첨가;AU-A-76380/91에 기재된 바와 같이, GCSF의 50-56 위치에서 서열 Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile(SEQ ID NO:11)을 174 아미노산(SEQ ID NO:37)로, 그리고 GCSF의 위치 53~59를 177 아미노산(SEQ ID NO;39)로 치환, 및/또는 돌연변이 GCSF의 위치 43, 79, 156 및 170에서 4개의 히스테인 잔기중 적어도 하나가 174 아미노산(SEQ ID NO:37)로 치환 또는 돌연변이 GCSF의 위치 46, 82, 159 또는 173에서 177 아미노산(SEQ ID NO:39)로 치환; 및 GB 2 213 821에 기재된 바와 같이 선택된 영역의 카세트 돌연변이가 용이하도록 제한 위치가 병합되고 원하는 발현 시스템으로 유전자의 병합이 용이하도록 제한 부위의 측면배치된 합성 GCSF-암호화 핵산 서열을 포함한다. G-CSF 동족체의 추가의 예는 SEQ ID NOS:64 및 65 및 미국특허 제 6,632,426에 기재된 다른 것을 포함한다. 상기의 함량은 참조에 의해 여기에 병합된다.
GCSF의 여러가지 기능적 유도체, 변이체, 돌연변이 및/또는 유사체는 바람직하기는 야생형 포유동물 GCSF 활성의 생물학적 활성의 적어도 20%, 바람직하기는 50%, 더욱바람직하기는 적어도 75% 및/또는 가장 바람직하기는 적어도 90%를 유지하고-생물학적 활성의 양은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95% 및 그들 사이의 모든 값과 그 아래 범위를 포함한다. 추가로, GCSF의 기능적 유도체, 변이체, 돌연변이 및/또는 유사체는 야생형 포유동물 GCSF 활성과 비교하여 100% 이상-적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 125%, 적어도 150%, 및 적어도 200%의 생물학적 활성의 양을 가질 수 있다.
GCSF의 생물학적 활성을 측정하기 위해, 몇몇 알려진 분석이 단독으로 또는 조합하여 적용되었다. GCSF 기능을 측정하는 하나의 예를 실시예 1에서 설명하였다. GCSF 기능을 결정하기 위한 다른 방법은 알려져 있고 생쥐 골수세포를 적용하는 코로니형성 분석; G-CSF에 의해 유도된 골수 세포의 증식의 자극; 성장을 위해 G0CSF에 의존하고 GCSF(예를 들면 AML-193; 32D; BaF3; GNFS-60; HL-60, M1; NFS-60; OCl/AML1a; 및 WEHI-3B)에 반응하는 세포계를 갖는 특정 생물학적 정량을 포함한다. 이들 및 다른 분석들은 Braman et al. Am.J.Hematology 39:194-201(1992); Clogston CL et al Anal Biochem 202:375-83(1992); Hattori K et al Blood 75:1228-33(1990); Kuwabara T et al Journal of Pharmacobiodyn 15:121-9(1992); Motojima H et al. Journal of Immunological Methods 118:187-92(1989); Sallerfor B and Olofsson European Journal of haematology 49:199-207(1992); Tanaka H and Kaneko Journal of Pharmacobiodyn. 15:359-66(1992); Tie F st al. Journal of Immunological Methods 149:115-20(1992); Watanabe M et al Anal. Biochem.195:38-44(1991)에 기재되어 있다.
한 구현예에서, GCSF는 변형되거나 또는 제제화(formulate)되거나, 또는 혈액-뇌 장벽을 넘는 능력이 증가된 또는 뇌조직을 향해 분배계수가 이동된 GCSF 의태물로 존재한다. 이와 같은 변형의 예는 PTD 또는 TAT 서열의 첨가이다(Cao et al(2002) J.Neurosci.22:5423-5431; Mi et al.(2000) Nol.Ther. 2:339-347; Morris et al.(2001) Nat Biotechnol 19:1173-1176; Park et al.(2002) J Gen Virol 83:1173-1181). 이들 서열은 돌연변이 형태로도 사용될 수 있고 단백질의 아미노- 또는 카르복시-터미날에서 추가의 아미노산이 첨가될 수 있다. 또한, 어느 GCSF 제제의 정맥 적용에 대한 브래디키닌, 또는 동족체 물질의 첨가는 그것의 뇌 또는 척수로의 전달을 지지한다(Emerich et al.(2001) Clin Pharmacokinet 40:105-123; Siegal et al(2002) Clin Pharmacokinet 41:171-186).
GM-CSF
과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GMCSF)는 잘 알려진 성장인자이다(예를 들면 도 18, SEQ ID NOS:25, 26 및 27 참조). 여기에 기재된 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 GMCSF는 전장 암호화 서열, 단백질 서열, 및 각종 기능적 변이체, 키메릭 단백질, 돌연변이, 및 알려지고 이용가능한 의태로서, 예를 들면 PEG화 형태 또는 알부민-커플화 형태이다. 암호화 DNA와 단백질의 모두의 구조는 포유동물 다능성 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자를 재조합적으로 생성하기 위한 방법과 함께 잘 알려져 있다(미국특허 5,641,663). 또한, GMCSF 수용체는 잘 알려져 있고, 예를 들면, 미국특허 5,629,283에 기재되어 있다.
한 구현예에서, 적어도 70%, 바람직하기는 적어도 80%, 더욱 바람직하기는 적어도 90%가 전장-인간 GMCSF 아미노산 서열과 동일한 단백질이 본 발명에 적용된다. 또 다른 구현예에서, 사용될 수 있는 GMCSF는 적어도 70%, 바람직하기는 80%, 더욱 바람직하기는 적어도 90%, 95%, 97% 및 98%가 야생형 전장 인간 GMCSF 암호화 서열과 동일한 폴리뉴클레오티트, 예를들면, SEQ ID NO:25를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것이고, 이 폴리뉴클레오티드는 야생형 전장 인간 GMCSF의 암호화 폴리뉴클레오티드에 대한 엄격한 조건하에서 혼성화될 것이다. 용어 "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 폴리누클레오티드가 다른 서열보다 검출가능하게 더 큰 정도로 그것의 표적화서열로 혼성화되는 조건에 대한 언급을 포함한다(예를 들면, 적어도 기준의 2배 초과). 엄격한 조건은 pH 7.0 ~8.3에서 염농도가 약 1.5M Na이온 미만이고, 통상적으로 약 0.01~1.0M Na 이온이며, 온도는 짧은 프로브의 경우(예를 들면, 10~50 뉴클레오티드) 적어도 약 30℃이고, 긴 프로브의 경우(예를 들면 50 뉴클레오티드 초과) 적어도 약 60℃이고, 예를 들면 매우 엄격한 조건은 37℃에서 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS에서의 혼성화, 및 60~65℃에서 0.1X SSC에서 세척을 포함한다(Tijssen, laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Viology- Hybridization with Nicleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of Principles of hybridization and the stratwgy of nucleic acid probe assays", Elsevier New York(1993); and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Green Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995)). 아미노산과 폴리뉴클레오티드 동정, 상동성 및/또는 유사성은 Clustal W 알고리즘(MEGALIGNTM, Lasergene, Wisconsin)을 이용하여 결정할 수 있다.
GMCSF의 여러가지 기능적 유도체, 변이체, 돌연변이 및/또는 의태물은 바람직하기는 야생형 포유동물 GMCSF 활성의 생물학적 활성의 적어도 20%, 바람직하기는 50%, 더욱 바람직하기는 적어도 75% 및/또는 가장 바람직하기는 적어도 90%를 보유하고-생물학적 활성의 양은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95% 및 모든 값과 그 사이의 범위를 포함한다. 더우기, GMCSF의 기능적 유도체, 변이체, 돌연변이 및/또는 의태물은 야생형 포유동물 GNCSF 활성과 비교하여 100% 이상의 생물학적 활성을 가질 수 있고-생물학적 활성의 양은 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 125%, 적어도 150% 및 적어도 200%를 포함한다.
본 발명을 실시하기 위해, 뉴런을 보호하기 위한 그들의 잠재력을 보유하고 백혈구에 대한 작용이 감소되고, 그것에 의해 부작용 잠재력이 감소된 본 발명의 GMCSF의 유도체, 더욱 바람직하기는 GMCSF-의태물이 바람직하다. GMCSF의 유도체, 바람직하기는 GMCSF-의태물은 실시예 17에 기재된 바와 같이, 인비트로 신경보호 분석으로 시험될 수 있다. 이 분석에서 양성 신경보호 작용을 설명하는 물질은 그들의 면역-조절 활성에 대해 추가로 시험될 수 있다.
GMCSF의 생물학적 활성을 측정하기 위해, 몇몇 알려진 분석이 단독으로 또는 연합하여 사용될 수 있다. 이들 GMCSF 작용은 그것의 알려진 면역조절작용 및 신경 보호에서의 그것의 역할과 관련된 하나 이상의 작용을 포함한다. GMCSF 작용을 측정하기 위한 다른 방법은 예를 들면, 대식세포, 호중구, 에오신호성, 및 거핵구를 함유하는 콜로니의 발생에 의해 콜로니 형성분석, GM-CSF의 존재에서 그들의 성장에 의존하거나 이 인자에 반응하는 세포계를 사용한 특정 생물학적정량에 포함된다(예를 들면, 세포계: AML-193; B6STUt-A; BAC1.2F5; BCL1; Da; FDCP1; GF-D8; GM/SO; IC-2; MO7E; NFS-60; PT-18; TA;;-103; TF-1; UT-7). 이들 및 다른 분석은 Cebon J et al Blood 72:1340-7(1988); Katzen NA et al European Cytokine Network 3: 365-72(1992); Lewis CE et al Journal of Immunological Methods 127:51-9(1990); Mortensen BT et al Experimental Heamtology 21:1366-70(1993); Oez S et al Experimental Mehtods 158:191-6(1993); Sallerfors B and Olofsson European Jpurnal of Haematology 49:199-207(1992); Zenke G et al Journal of Immunoassay 12:185-206(1991).
또한 바람직한 것은 GMCSF의 변형 또는 제제화이거나, 또는 혈액-뇌 장벽을 넘는 능력이 증가되거나 또는 그것의 분배계수가 뇌조직으로 이동된 의태물질이다. 이와 같은 변형의 예는 단백질 형질도입 도메인(PTD) 또는 TAT 서열의 첨가이다(Cao G. et al(2002) J.Neurosci. 22:5423-5431; Mi Z et al(2000) Mol. Ther. 2:339-347; Morris et al(2001) Nat Biotechnol 19;1173-1176; Park et al(2002) J Gen Virol 83:1173-1181). 이들 서열은 돌연변이 형태에도 사용될 수 있고, 단백질의 아미노- 또는 카르복시말단에서 추가의 아미노산으로 첨가될 수 있다. 또한, 어느 GMCSF의 정맥 적용에 대한 브래드키닌 또는 동족체 물질의 첨가는 그것의 뇌, 또는 척수로의 전달을 지지한다(Emerich et al(2001) Clin Pharmacokinet 40:105-123; Siegal et al(2002) Clin Pharmacokinet 41:171-186). 다른 안정한 형태 및 유도체에 대한 예는 사르크래모스틴(Leukine®, Prokine®), Leucotropin® 또는 몰그래모스팀(Leucomax®)이다.
GMCSFR mRNA는 분리된 마이크로글리아, 성상세포, 핍지신경교종 및 뉴런에서 측정된다(Sawada et al.(1993), Neurosci Lett, 160, 131-4); Baldwin et al 1993), Blood, 82, 3279-82). GMCSF는 성상세포의 증식을 자극한다는 것이 나타났다(Guillemin, et al.(1996), Glia, 16, 71-80). GMCSF는 또한 마이크로글리아로부터 인터로킨 6의 방출을 자극한다(Suzumura, et al.(1996), Brain Rev, 713, 192-8). 최근 문헌은 인터로킨 1이 신경 세포계 NT2에서 GMCSF의 생산을 증가시켰다는 것을 나타낸다(Dame, et al. (2002), Eur Cytokine Netw, 13, 128-33). 뇌에서의 GMCSF의 존재는 태아에서 GMCSF 수용체 발현을 위한 대칭적 연구에서의 인간 태아로부터의 재료를 나타낸다(Dame, et al.(1999), Pediatr Res, 46, 358-66). Dame et al은 그들의 발견으로부터 GMCSF가 태아에서 신경 발생에 역할을 하고, 성인 뇌에서 면역감시 역할을 한다고 결론지었다. 중요하기는, 그들은 어떠한 질병 관련, 특히 신경보호에 대한 관여를 언급하지 않는다. GMCSF는 인비트로(SN6.10.2.2 세포계 및 배양된 마우스 격막 뉴런) 콜린 아세틸트란스퍼라제 활성을 증가시키고 인비보에서 핌브리아-뇌궁 절단 후 병변된 래트의 콜린작동성 격막 뉴런의 생존을 증가시킨다(Kamegai et al.(1990), Brain Res, 532, 323-5)(Konishi, et al.(1993), Brain Res, 609, 29-35). 중요하기는, 이 발견은 뉴런의 특정 서브타입에 대해서만 관련되고, 다른 신경 또는 신경세포형에는 일반화되지 않는다. 이들은 이들 자료로부터 GMCSF의 일반적인 신경보호 특성을 끌어내지 않았고 어떠한 치료적 적용가능성을 끌어내지도 않았다. GMCSF는 개선된 글리코실화 종말 생성물의 첨가 후 성상세포에서 상향조절된다(AGEs)(Li, et al.(1998), Mol Med, 4, 46-60). GMCSF는 인 비트로에서 마이크로글리아 증식을 촉진시키는 것을 나타낸다(Lee, et al.(1994), Glia, 12, 309-18). 최근 GMCSF 수준이 알쯔하이머병 환자의 수액(csf)에서 증가된다는 것이 발견되었다(Tarkowski, et al(2001), Acta Beurol Scand, 103, 166-74). GMCSF는 뇌졸증 환자의 CSF에서 연구되었다(Tarkowski, et al.(1999), Stroke, 30, 321-7). 후자의 연구에서, 전세포자멸 단백질, FAS 리간드의 수준은 21-26일 및 3개월 이후에 뇌졸증 환자의 수액에서 GMCSF 수준과 명학하게 관련된다. 그러나, 뇌졸증 환자에게서 이 발견의 치료적 유용성을 이끌어 내는 결론이 없고 GMCSF의 어떠한 가능성 있는 치료적 역할의 언급도 없다. 뇌졸증 자체 후 GMCSF의 방출은 여러 이유가 있는데, 어떠한 기능적 예상을 허용하지 않는다. GMCSF는 혈액-뇌 장벽을 넘는다(McLay, et al.(1997), Brain, 120, 2083-91). 이 연구는 신경학적 질병에 대한 GMCSF의 치료적 가능성을 나타내기 위한 목적으로 실행된 것은 아니고, 신경퇴행성 질병 또는 뇌졸증에서의 GMCSF의 가능한 유용성의 문맥상의 언급이 없다.
요약하면, 문헌에서 상기 참조는 신경계에서 GMCSF 수용체와 리간드의 존재에 대한 증거를 제공하지만, GMCSF의 일반적인 신경보호적 특성은 나타내지 않는다. 이들 연구는 신경퇴행와 뇌졸증과 같은 허혈성 장애의 치료에 대한 GMCSF의 사용을 의미하지 않는다.
다른 조혈성 성장인자
본 발명의 다른 구현예에서 치료적 작용, 바람직하기는 신경보호적 작용을 지지하는 GCSF 및/또는 GMCSF 제제의 조합이 사용될 수 있다. 이들 조합에 의해 발휘되는 효과는 축적 또는 부가/시너지적일 수 있다. 한 구현예에서, 여러가지 GCSF 및/또는 GMCSF 유도체는 서로 조합하여 사용된다. 한편, GCSF 및/또는 GMCSF는 에리트로포이에틴, 그것의 유도체와 같은 하나 이상의 조혈성 성장인자와 조합하여 사용될 수 있고, 이것은 최근 간접적으로 강한 신경보호 특성을 갖는다는 것이 발견되었다(예를 들면, Brines et al (2000) Pro Natl Acad Sci USA 97:10526-10531; Cerami et al(2002) Nephrol Dial Transplant 17:8-12; Siren AL, Ehrenreich H(2001) Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 251:179-184)다. 이외에, GMCSF 및/또는 GCSF는 예를 들면 (M-CSF와 같은)여러 콜로니 자극인자, SCF(줄기세포 인자) SCPF(줄기세포 증식인자), 여러 인터로킨(IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL11, IL12), LIF, TGF-β, MIP-1-α, TNF-α, 및 여러가지 다른 저분자량 인자와 조합되어 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 에리트로포이에틴을 제외한 여러 조혈 성장인자는 GMCSF 및/또는 GCSF의 부재하에 단독으로 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 예를 들면, 뇌졸증의 상황에서, GCSF 및/또는 GMCSF는 혈전성 활성을 갖는 물질, 예를 들면, 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA), 스트렙토키나제, 우로키나제, 및/또는 앤코드를 포함한다. GCSF 및/또는 GMCSF는 아세틸살리실산(아스피린) 또는 헤파린; 멜라토닌; 및/또는 세포자멸 신호를 방해하는 물질(예를 들면, 캐스패이즈의 억제 제)과 조합될 수 있다. 또한, 특히 제한되는 것은 아니지만, GCSF 및/또는 GMCSF와 Riluzole(Rilutek®)근위축성 측위 경화증(ALS) 조합물의 치료에, 비타민 E와 같은 비타민, Q10 또는 항산화물질이 가능하다. 파킨슨씨병의 치료를 위해, GCSF /또는 GMCSF와, 트리헥실페니딜, 셀레길린, L-DOPA, 페르골리드 및 다른 것이 파킨슨씨병 치료에 사용되는 공지의 약물과의 조합으로 사용될 수 있다. 조혈성장인자, 예를 들면, G-CSF 및/또는 GM-CSF와 조합될 수 있는 다른 물질은 bFGF, 항-GPIIb/IIa, 항-ICAM, 질산 억제제, 혈전 용해제, 로타마스 억제제, 칼시노이린 억제제, 및 시클로스포린을 포함한다. 이 외에, 신경퇴행성 질병을 치료할 때, 신경전달 수준에 영향을 미치는 하나 이상의 약제가 또한 포함될 수 있다. 더우기, 인지적 조건을 치료할 때, 하나 이상의 콜린성제, 카테콜아민 재흡수 억제제 등이 투여될 수 있다.
존재하는 항우울증제와의 조합은 개인의 우울증을 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다. 항우울증제의 비-제한적인 예는 SSRI's(선택적 세로토닌 재흡수 억제제): Paxil(파록세틴); Prozac(플로오세틴); Zoloft(세르탈린); Celexa(시칼로프람); Lexapro(에사이탈로프람 옥살레이트); Luvox(플루복사민), MOAI's(모노아민 옥시다제 억제제); Nardil(페넬진); Parnate(트라닐시프로민); TCA's(삼환성 항억제제); Adapin(독세핀); Anafranil(클로미프라민); Elavil(아미트리프틸린); Endep(아미트리프틸린); Ludiomil(마프로틸린);Norpramin(데시프라민); Pamelor(노르트리프틸린); Pertofrane(데시프라민); Sinequan(독세핀); Surmontil(트리미프라민); Tofranil(이미프라민); Vivactil(프로프리프틸린); 또는 다른 약제 형태 :Effexor(벤라팍신); Cymbalta(둘록세틴); Desyrel(트라조돈); Buspar(부스피론); Edronax, Vestra(리복세틴);Remeron(미르타자핀);erzone(네파조돈); Wellbutrin(부프로피온)을 포함한다.
신경학적 질환
본 발명에 따라 치료되어야 할 신경학적 질환은 일반적으로 3개로 분류될 수 있다: 허혈 또는 감압 메카니즘을 갖는 질병; 신경퇴행성 질병(Adam et al, Principles of Neurology, 1997, 6th Ed., New York, pp1048 ff 참조); 및 신경세포 치사와 관련된 신경학적 및 정신병적 질병. 또한, 본 발명에 따라 처리될 수 있는 다른 신경학적 질환은 인식적 능력의 강화 및 신경교아세포, 성상세포, 수막종 및 신경섬유초종과 같은 뇌종양의 치료를 포함한다.
허혈 또는 감압 메카니즘을 갖는 질병은 또한 일반 질병 및 대뇌허혈로 재분류될 수 있다. 허혈 및 감압 메카니즘을 포함하는 이와 같은 일반적 질병의 예는 심근경색, 심장부전, 심장마비, 출혈성 심장마비, 심근염, 심낭염, 심근낭염, 관상심장질환(관상 동맥 협착증), 협심증, 선천성 심장질환, 쇼크, 사지허혈, 신장 동맥의 협착증, 당뇨병성 망막증, 말라리아 연관 혈전증, 인공심장 밸브, 빈혈, 비기능항진증 증후근, 폐기종, 폐섬유종, 및 폐부종을 포함한다. 대뇌 허혈 질병의 예는 (출혈성 뇌졸증과 같은)뇌졸증, 대뇌 세관이상(소혈관 질병), 분만내 대뇌허혈, 심장마비 또는 소생 중/후의 대뇌 허혈, 수술중의 문제로 인한 대뇌허혈, 경동맥 수술동안의 대뇌 허혈, 대뇌 혈액-공급 동맥의 협착으로 인한 만성 대뇌 허혈, 시누스 혈전증 또는 대뇌 혈관의 혈전증, 대뇌혈관 기형, 및 당뇨병성 망막증을 포 함한다.
신경퇴행성 질병의 예는 근위축성측삭경화증, 파킨슨씨병, 헌팅톤씨병, 윌슨씨병, 다중계 위축증, 알츠하이머병, 피크씨병, 로이-바디병, 할러포르덴-스파츠병, 기형성근이긴장증, 유전성 감각 및 운동 신경병(HMSN), 게르스트만-스트라우슬러-샹커병, 크로이츠필드-야콥병, 마차도-요셉병, 프레드리히 기능장애, 비-프레드리히 기능장애, 질드라투렛 증후근, 가족성 경련, 올리브교소뇌피질 퇴행, 파라신성형성 대뇌증후군, 유전성 경련성 양측마비, 유전성 시신경장애(Leber), 망막색소변성증, 스타가르트병, 및 키른-세이어 증후근을 포함한다.
신경세포 치사와 관련된 신경학적 및 정신병적 질병의 예는 폐혈병성 뇌졸증, 뇌간출혈, 지망막하 출혈, 다중경색 치매, 감염성 질병(맥관염, 다발성 경화증, 및 길리안-바레-증후근), 신경종양,(척수종양, 및 뇌종양), 말초신경장애, 다중신경장애, 간질, 정신분열증, 우울증, 대사성 뇌질환, 및 (바이러스성, 세균성, 진균성) 중추신경계 감염을 포함한다.
"치료"는 질병 또는 질환의 진행의 느림, 방해, 정지 또는 멈춤을 의미하고 질병증상 또는 신호의 완전한 제거를 반드시 요구하는 것은 아니다. "예방"은 신경병적 질병의 예방을 포함하는 의도로, 여기서 "예방"은 질병 또는 질환의 신호 또는 증상의 개시 또는 심해지는 시간의 억제정도로 이해되고, 질병 또는 질환의 완전한 방지로 제한되는 것은 아니다.
척수의 대운동 뉴런상의 GCSF 수용체, 및 GMCSF 수용체의 강력한 발현이 발견되고(도 4 i~l 참조), 그리고 GCSF가 국소대뇌허혈에 효과적이며(도 1 참조), 여 기서 동일한 기본적 병원성 메카니즘은 ALS 및 글루타민산염 포함, 산화성 스트레스와 같은 다른 신경퇴행성 질병에서와 동일하게 작동되고, 목록화된 세포치사 GCSF는 ALS와 같은 만성 질환에서 장기간 치료에 특히 알맞고, 이것은 임상적으로 제공되었을 때 인간에게 잘-내성화된다(Ozer et al(2000), J.Clin. Oncol., 18, 3558-85). 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, GCSF 및 GMCSF과 같은 조혈성 성장인자 단독, 서로와의 조합물, 및/또는 다른 하나 이상의 추가의 인자와의 조합물이 ALS를 치료하는데 사용된다.
산화성 스트레스와 세포자멸의 관여와 같은, 파킨슨씨병과 관련된 신경병리학은 다른 신경퇴행성 장해 및 뇌졸증 중에서 파킨슨씨병을 식별한다. GCSF는 세포계 PC12(도 1b)에서 H2O2-포함 세포치사에서 강력하게 신경보호적이다. PC12세포는 도파민성 세포의 특성, 예를 들면, 기능적 도파민 운반자의 존재를 나타내고(Maruyama et al.(2001), Arch Toxicol, 75, 209-13), 예를 들면 MPTP 대사체 MPP+에 의한 독성과 같은, 중요한 면에 대한 인비트로 모델로서 사용된다(Bai et al.(2002), Neurosci Lett, 321, 81-4). H2O2는 PC12 세포에서의 파킨슨씨병의 몇몇 관점을 명백히 모델하는 PC12 세포에 대한 비독성 자극제이다. 예를 들면, H2O2는 MPTP-포함 세포사상의 중간체중 하나이다(Fabre et al 1999 J Physiol Biochem 55(4):325-31). 도파민성 뉴런의 MPTP- 및 H2O2-조절 세포치사에 포함된 세포사상의 케스케이드와 신호화 메카니즘간에 현저한 중복이 존재한다(Chun, HS et al., J Neurochem 2001 Feb; 76(4):1010-21; Lai. et al., Biochem Pharmacol 1993 Feb24;45(4):927-33). H2O2는 산화성 스트레스와 세포자멸을 야기하는 반응성 산소종(ROS)을 생산함으로써 작용한다. 산소 라디칼에 의한 손상은 파킨슨씨병의 주요한 병리생리학적 사상의 하나이고(Bonnet and Houeto(1999), Biomed Pharmacother, 53, 117-21., Beal(2001), Nat Rev Neurosci, 2 325-34), 항산화요법은 환자에게 효과적이다(Beal(2002), Free Radic Res, 36, 455-60)., Shults et al.(2002), Arch Neurol, 59, 1541-50). 그러므로, PC12 세포에서 H2O2 관여 세포치사에 대한 GCSF의 효능, 산화성 스트레스 및 세포자멸의 중요한 병리생리학적 메카니즘에 대한 모델은 파킨슨씨병(PD)에 대한 효능을 예측한다: 놀랍기는, 파킨슨씨병, 흑질(SN), 특히 흑질 para compacta(SNC)에 의해 감염된 영역에서 GCSF 수용체의 발현이 설명되었다(도 4m~o 참조). 세포 모델에서의 효능, 수용체의 인비보 국지화, 및 대뇌 허혈을 갖는 병리생리학적 메카니즘의 중복(산소 라디칼/세포자멸)은 예를 들면, GCSF 및/또는 다른 성장인자, 예를 들면, GMCSF가 파킨슨씨병을 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 위력적인 증거를 제공한다. 세포 모델의 효능, 수용체의 인비보 국지화 및 대뇌허혈(산소 라디칼/세포자멸)을 갖는 병리생리학적 메카니즘의 중복은 GCSF 및/또는 다른 성장인자, 예를 들면 GMCSF가 파킨슨씨병의 치료에 사용될 수 있다는 압도적인 증거를 제공한다. 설치류 모델에서의 효능 시험은 실시예 5에 예시된 바와 같이 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예에서, GCSF 및 GMCSF 조혈성장인자의 단독, 서로간의 조합, 및/또는 하나 이상의 추가의 인자와의 조합물이 파킨슨씨병의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 여기에 함유된 논의에 의해, GCSF와 GMCSF가 신경조직발생을 강화할 수 있는 능력을 갖고, 허혈 병변 후 반응성 극복을 개선한다는 것을 발견하였다. 신경조직발생은 신경 네크워크의 가소성을 증가시킬 수 있는 메카니즘이고ㅡ 뉴런의 점진적-손실을 대체하는 하나의 메카니즘이다. 그러므로, 본 발명의 한 구현예는 여기서 논의된 투여에 의해 개개인에게 여기에 기재된 바에 따른 하나 이상이 조성물의 투여에 의해 어느 정도의 인식의 손실을 겪고, 나타내고 및/또는 믿어지는 개인에 대한 인식 능력의 강화, 개선 또는 증가를 제공한다. 선택적인 구현예에서, 인식적인 강화는 비-병리적 질환의 개개인, 예를 들면, 인식적인 장애를 나타내지 않는 개인들에게 유익하다. 인식능력 및 그러므로 강화를 측정하는 것은 당업자들에게 알려져 있다. 인식적 능력의 증가 또는 강화가 측정될 때, 이들은 동일한 임계적, 파라미터를 사용하여, 동일한 시험을 사용하여, 본 발명의 조성물의 투입 전과 투입 후를 비교할 수 있다(그리고 몇몇 예에서 투여 중에도 측정될 수 있다).
이외에, 인식 강화에서 본 발명에 따른 조성물의 사용은 정신적 용량에서 비-병리적 감소로 제한되지 않고 정신 용량의 정상적인, 생물학적 수용체를 증대시키는데, 예를 들면 기억력 강화, 미세 운동 용량의 강화, 및/또는 논리적 용량의 강화에 적용될 수 있다.
우울증은 슬픔, 활동에 대한 관심의 손실, 및 감소된 에너지에 의해 특징된다. 다른 증상은 확신 및 자신감의 손실, 부적절한 죄의식, 죽음 및 자살에 대한 사고, 집중력 감소, 및 수면과 식욕의 불균형을 포함한다. 다양한 신체적 증상도 존재한다. 비록 낙심된 감정이 일반적이지만, 특히 삶에 실패를 경험한 후, 우울 장애는 오직 증상이 임계치에 도달하고 적어도 2주 지난 후에만 진단된다. 우울증은 온순에서 매우 심한 정도로 심한정도가 변할 수 있다.
우울증은 비록 사고가 중년에 가장 높긴하지만, 수명의 어느 단계에서도 개인에게 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 청년기와 젊은 시절동안 우울증에 대한 인식이 증가한다(Lewinsohn, et al.(1993), J.Abnorm Psychol, 102, 110-20). 우울증은 주기적으로 반복되는 질병으로, 각 기간은 수개월에서 수년동안 지속되고, 그 사이에 정상적인 기간이 있다. 그러나, 케이스의 약 20%는 특히, 이용가능한 적절한 치료가 없을 때, 차도가 없는 임상 코스를 갖는다(Thornicroft and Sartorius(1993), Psychol Med, 23, 1023-32). 첫번째 에피소드로부터 회복된 사람들에 대한 재발률은 2년내에 약 35%이고 12년에 약 60%이다. 재발률은 45세가 넘는 사람들에게서 더 높다. 우울증 장애의 특별히 비극적인 극복은 자살이다. 우울증 환자의 약 15~20%는 자살로 그들의 삶을 마감한다. 자살은 가장 일반적이고, 우울증의 벗어날 수 있는 해결책이다. 요약하면, 우울증은 일반적인 정신 장애로, 매우 높은 수준의 질병 부담을 가져오고, 앞으로 20년동안 증가하는 경향이 나타날 것으로 예상된다.
우울증은 환자를 끊임없이 해롭게 할 수 있고(단극성) 또는 이극성 성격(조울증 또는 이극우울증)을 갖는다. 이중극 우울증은 지나친 에너지의 "높음"에서부터 철저한 절망 및 무기력의 "낮음"으로의, 극단적인 감정의 흔들림에 의해 표시된다. 조울증은 종종 리튬으로 치료되는데, 이것은 감정의 흔들림을 평형되게 한다.
우울증은 계절성 정서장애(SAD)일 수 있다. 이 형태의 우울증은 겨울이 다가 옴과 일치하여, 9월에 시작하여 봄에 낮이 길어지고 햇볕이 많아질 때까지 지속된다.
우울증은 생후 약 2주부터 최대 2살까지 일어날 수 있는 출생후 우울증일 수 있다.
우울증의 중대성을 분류하기 위한 시도가 있었다, 예를 들면 다음의 8 기본 크기, 즉 비관론, 약한 집중력, 수면 문제, 무쾌감, 피로, 외로움, 낮은 자존감, 및 어린이와 청년의 우울증의 프로필을 정의하기 위한 신체적 고통.
우울증은 (이것과 관련된 신체적병이 없는)특발성질환으로 발생할 수 있고, 또는 신체적 질병의 신경쇠약 증후근, 특히 다수의 신경퇴행성 질병일 수 있다. 우울증 질병(DDs)은 다발성경화증, 뇌졸증, 치매, 편두통, 파킨슨씨병, 및 간질과 같은 신경학적 질병의 빈번한 정신의학적 공동병적 상태이다. 이러한 신경질환에서 DD의 임상적 표시는 특발성 심리질환의 임상적 표시와 동일하다. 신경퇴행성 질병은 종종 질병의 초기 설명으로서 "고전적인" 정신병적 증상을 나타낸다. 신경퇴행성 질병의 내용중 우울증의 증후학은 우울증 단독과는 다르다. 증후근으로서 우울증을 갖는 몇몇 신경퇴행성 질병을 아래에 나타내었다:
1. 다발성 경화증
2. 종양성 뇌손상:우울증은 종양성 뇌손상(TBI) 환자에게 영향을 미친다:TBI 환자의 30 내지 38%는 우울증으로도 분류될 수 있다(Seel and Kreuzer 03)
3. 뇌졸증:뇌졸증 환자의 약 30%는 임상적으로 우울증이다(William 86)
4. 치매와 알츠하이머병
5. 편두통
6. 파킨슨씨병: 우울증 증상은 PD환자의 약 절반에서 일어나고 PD 환자에 대한 기능적 장애의 중요한 원인이다. PD의 우울증이 단순히 사회심리적 스트레스와 불능에 대한 반응이라기 보다는 신경해부적인 퇴화에 대한 이차적인 것임을 제안하는 축적된 증거가 있다. 우울증의 발생률은 중심 세로토닌성 기능의 변화와 특정 피질과 하부피질 경로의 신경퇴행과 관련있다. 그러므로, PD에서 공동병적 우울증의 이해는 울병의 신경해부적 기준의 이해에 더해질 수 있다.
7. 간질: 간질은 사회적, 직업적, 및 심리학적 기능에 복합적 작용을 갖는 만성 질환이다. 몇몇 정신병적 질환이 일반 인구와 비교하여 간질환자에서 증가된 발병률을 갖는다는 것이 나타난다. 우울증은 가장 일반적인 정신병적 공동병으로 보이지만, 불안과 다른 진단은 집중적으로 조사되지 않았다. 그러나 간질에서, 우울증적 장애는 특발성 우울증의 임상적 특성과 다른 임상적 특성을 갖는 것으로 나타나고 정신장애의 진단 및 통계적 매뉴얼(Diagnostic and Statistical Manual of Psychiatric Disorders-Fourth Edition)에 포함된 기준과는 맞지 않는다. 우울증 또는 신경병적 우울증은 발작 빈도 및 심각성, 고용 또는 정력적인 상태를 포함하긴 하지만, 수명의 건강-관련 품질의 가장 강력한 예언자이다(Gilliam et al.(2003), Epilepsy Behav, 4 Suppl 4, 26-30). 임상적으로 간질을 갖는 우울증 환자는 유사한 타입의 발작을 경험한 비-우울증 환자보다 전체 발작 회복에 더 큰 문제를 가질 뿐 아니라, 발작으로부터의 감지된 중대성과 걱정의 수준이 더 높다는 것이 보고되었다. 발작활성의 보도에 대한 우울증 증상의 지각된 영향은 간질환자 는 우울증에 대하여 검열되어야 한다는 것을 제안한다. 이들 자료는 간질 환자중의 우울증을 검출 및 치료의 중요성을 강조한다(Gilliam, Hecimovic, and Sheline(2003), Epilepsy Behave, 4 Suppl 4, 26-30).
8. 헌팅톤씨병: 헌팅톤씨병(HD)는 인간의 운동 조절, 인식력, 감정의 안정의 퇴화로서 분명한 신경퇴행성 과정이다. 감정적 불안정성은 성격의 변화, 불안 및 흥분과 같은 증상의 변화를 통해 반영된다. 인식의 감퇴는 헌팅톤씨병(HD)의 운동 증상에 선행한다. 우울증은 HD에서 일반적이고 인식의 장애에도 연결된다. DNA 돌연변이 길이를 사용하여 산출된, 우울증 감정 및 질병 개시에 대한 평가 시간은 모두 작업 메모리 실행의 중요한 예언자였다. 발견된 것은 인식의 감퇴(즉, 우울한 감정)에 잠재적으로 치료할 수 있는 기여를 확인하는 HD에 대한 개개인의 예비징후에 의한 기존의 연구와 일치하고 기여한다(Nehl, et al.92001), J Neuropsychiatry Clin Neurosci, 13, 342-6). 우울증은 상기 이외의 다른 신체적 질병과도 관련하여 발생될 수 있다.
최근 우울증이 뇌구조의 신경퇴행성 사상과 및 해마 구조의 정확한 성인 신경조직발생에 연결된다는 것을 의미하는 우울증 병인에 관한 새로운 눈부신 발전이 있었다. 그러므로, 여기에 기재된 바와 같은 항-세포자멸 작용 및 (내인성 성인 신경 줄기세포를 포함한) 전-재발생 작용에 의한 조혈성 성장인자, 예를 들면, G-CSF 및/또는 GM-CSF 치료가 우울증 치료에 사용될 수 있다.
다음은 우울증의 신경퇴행성 개념과 관련된 연구를 기재한다(Reviewed by Kempermann and Kronenberg(2003), Biol Psychiatry, 54, 499-503).
우울증 환자의 형태상 변형의 연구는 회색 물질 변화를 포함한 해마에서 구조적 변화를 드러내었다(Sheline(2000), Biol Psychiatry, 48, 791-800). 초기 개시 재발 우울증, 신경학적 장애와 연관된 후기 생애 우울증, 및 이중극 질병의 연구는 신경해부적 순환내의 구조적 뇌 변화를 드러낸다. 이 순환은 지절-피질-선조-담창구-시상로를 말하며, 광범위하게 상호연결된 구조물을 포함한다. 감정적 병의 3차원적 MRI(magnetic resonance imaging) 연구에서, 이 관을 포함하는 많은 구조는 용적 손실 또는 구조적 이상을 갖는다는 것이 발견되었다. 우울증에서 부피 손실을 설명하기 위해 제안되는 메카니즘은 신경 손상에 의한 신경독성, 감소된 신경조직발생, 및 유연성의 손실을 포함한다. 이 면은 GCSF 또는 GMCSF의 활성에 의해 치료될 수 있다. 바람직한 가정 중 하나는 성인 해마 신경조직발생에서의 혼란이다(Kempermann and Kronenberg(2003), Biol Psychiatry, 54, 499-503, Jacobs, et al(2000), Mol Psychiatry, 5, 262-9, Jacobs(2002), Brain Behav Immun, 16, 602-9). 그러므로, 우울증 및 다른 감정 장애는 '줄기세포 장애'이다. 최근의 연구는 어떻게 성인 해마 신경조직발생이 조절되는가에 대한 새로운 관점을 내놓았다. 성인 신경조직발생을 강력하게 억제하는 인자중 하나는 아마도 증가된 글루코코르티코이드 방출에 의한 스트레스이다(Jacobs, Praag and Gage(2000), Mol Psychiatry, 5, 262-9).
성인 해마 신경조직 발생은 1965년에 Altman과 Das에 의해 처음 기재되었고, 여러번 재발견 되었다. 해마에 대한 광범위한 관심은 성인 카나리아의 뇌에서 신경조직발생과 관련된 활성에 대한 보고에 의해 1980년대 초에 처음 시작되었다. 좀 더 번거로운 tritiated 티미딘과 방사선 주사기술 대신에, 공초점 레이저 주사현미경과 조합된 브롬모디옥시우리딘(BrdU)으로 뇌의 세포가 증식되는 표식은 성인 신경조직발생에 대한 좀더 적극적인 정량적 접근을 허용한다. 새로운 세포의 부분집합이 생존하고, 과립 세포층으로 이동하고, 뉴런으로 미분화된다. 이들은 과립 세포층의 모든 다른 과립 세포들 처럼, 이끼가 낀 섬유관을 따라 CA3 영역에 신경돌기 돌출을 확립하고, 주변의 오래된 세포와 가시적으로 구별할 수 없게 된다.
만성 항우울증 처리가 성인 신경조직발생의 감소를 완하시킨다는 발견은 상기의 가정을 강화한다(Benninghoff, et al.(2002), J Neural Transm, 109, 947-62, Dremencov, et al.(2003), Prog Neuropsychopahrmacol Biol Psychiatry, 27, 729-39, D'Sa and Suman(2002), Bipolar Disord, 4, 183-94, Duman, et al(2001), J Pharmacol Exp Ther, 299, 401-7, Duman, et al.(1999), Biol Paychiatry, 46, 1181-91).
그러므로, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 조혈성 성장인자, 예를 들면, G-CSF 및 GM-CSF는 단독, 서로와 조합하여, 여기에 기재된 다른 추가의 인자들과 조합하여 우울증을 치료하는데 사용될 수 있고 및/또는 예를 들면, 우울증이 예상되거나 또는 우울증 증상이 발전될 것으로 예상되는 환자에게 투여함에 의해 예방적 우울증 치료법을 제공할 수 있다.
한 구현예에서, 우울증은 더 긴 플라즈마 반감기를 갖는, 예를 들면, 상기와 같은, PEGylated 형태(PRG필그라스팀), 알부민-커플형(알부그라닌)과 함께 GCSF 및/또는 GMCSF의 제제로 치료될 수 있다. 치료는 특발성 우울증에 제한되지 않고, 징후상 우울증, 및 공동-병적상태로서의 우울증에도 사용된다. 다른 구현예에서, 치료는 주단위로 피하주입될 수 있고, 이것은 뇌의 GCSF 또는 GMCSF 수용체의 경구적으로 이용가능한 작용제과 조합될 수 있다. 치료 투여량은 상기와 같을 수 있고, 하나의 바람직한 구현예에서, 매일 체중 kg 당 GCSF 또는 GMCSF 0.1~1000㎍일 수 있다. 허혈 중심과 종양부위 근처의 유사 신경화학 환경은, 유사하게 변형된 유전자 전이와 함께, 유해한 메카니즘을 갖는 경계에서 유사한 신경보호 전략은 대뇌 허혈 및 외상성 뇌손상에 효과적이어야 함을 제안한다. 두 타입의 손상에 대한 이들 치료법의 목적은 이들 경로간의 균형이 실질적으로 위험시 조직의 운명을 결정하는 균형으로서 독성 경로의 활성을 최소화하고 외인성 신경보호 메카니즘의 활성을 강화하는 것이다. 참으로, 실험 모델에서 효과적이라고 발견되는 대부분의 신경보호제는 실험적 종양성 뇌손상(TBI)의 모델에도 역시 효과적이다.
신경보호적 전략에 대한 통상의 반응 뿐만 아니라, 통상의 병리적 및 보호적 과정에 비추어 대뇌허혈과 종양성 뇌 손상에서의 활성은 GCSF 치료법이 종양성 뇌손상에 효율적임을 나타낸다. 종양성 뇌손상의 질환에서의 GCSF를 시험한 연구가 있었다(Heard, et al.(1998), Crit. Care Med., 26, 748-54). 그러나, 이 연구는 GMSF(필그라스팀)의 신경보호 효과에 대한 것이 목적이 아니라 단순히 감염 계수(연구의 일차 종점:절대 호중구 수의 증가, 필그라스팀의 안정성, 및 병원내 감염의 빈도(폐렴, 균혈증, 및 요도관 감염))를 줄이는 것이다. 이 연구에서 사망률의 개선은 없었다. 임상적 안정성과 관련하여, 이 연구는 GCSF 투여가 TBI에 대해 안정하고, 본 발명에 따른 신경보호에 대한 GMSF 치료의 안전한 실시가능성을 확인한 다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예에서, 조혈성장인자, 예를 들면, GCSF 및 GMCSF는 단독으로, 서로와 조합하여, 및/또는 하나 이상의 추가의 인자들과 조합하여, 예를 들면 대뇌허혈 및 종양성 뇌손상을 갖는 환자의 신경세포를 보호하는 예방법을 제공함으로서, 대뇌허혈 및 종양성 뇌손상을 치료하는데 사용될 수 있다.
심장마비와 소생으로 인한 대뇌 허혈에서 작동하는 병리생리학적 메카니즘은 혈관의 폐색으로 인한 대뇌 허혈하에 발생하는 것과 공통점이 있으므로(실시예 1), GCSF 치료법은 신경보호를 위한 심장 문제의 질환 하에서도 효과적일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 조혈성장인자, 예를 들면, GCSF 및 GMCSF는 단독으로, 서로와 조합하여, 및/또는 하나 이상의 추가의 인자들과 조합하여, 심장문제/질병의 결과로서의 허혈을 치료하는데 사용할 수 있고 및/또는 예방적 신경보호 치료를 제공할 수 있다. 치료법은 응급소생이 시작되면 곧 시작될 수 있다. 선택적으로, 심장문제(심근경색 전, 고 혈중 콜레스테롤 수준, 고혈압, 당뇨병, 흡연)로 알려진 위험군에 속한 환자에게서, 조혈성 성장인자, 예를 들면, GCSF로의 예방적 연속 치료가, 인자들의 느린 방출형태를 사용하여 실시될 수 있다.
또한, 이들 상기 고려는 이후의 대뇌허혈의 수술을 겪는 큰 환자 군에 적용된다. 특히, 심장수술(Hogue et al.(1999), Circulation, 1000, 642-7), 및 뇌로 공급되는 큰 혈관의 수술(예를 들면 심장 동맥내막절제술)은 그들과 관련하여 신경학적 합병증의 매우 큰 위험이 있다. 1982년 University of Toronto의 신경수술교습실에서 실시된 358 심장동맥내막절제술의 객관적인, 소극적 검토는 수술후 뇌졸증률이 3.9%이고 사망률이 1.5%임을 설명한다. 대부분(82%)의 신경학 합병증은 즉 각적인 수술-후 기간(24시간) 후 발생된다. 연기된 뇌졸증의 높은 발생은 대부분의 수술후 뇌졸증이 혈액동태보다는 색전증이라는 것을 제안한다. 5~6%의 조합된 사망률과 사망자수가 심장 동맥내막절제술에서 예상된다(Group(1986), Stroke, 17, 848-52). 이들 및 다른 자료들은 이들 과정에서 예방적 신경보호 치료에 대한 명백한 필요를 설명한다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 조혈성 성장인자, 예를 들면, GCSF 및 GMCSF는 단독으로, 서로와 조합하여, 및/또는 하나 이상의 추가의 인자들과 조합하여, 수술적으로 유도된 대뇌 허혈의 결과로서의 허혈을 치료하는데 사용될 수 있고 및/또는 예방적 신경보호 치료법을 제공한다. 한 구현예에서, 치료는 대규모의 수술과정 전에 환자의 위험상태에서 시작된다.
본 발명의 한 구현예에서, 조혈성 성장인자, 예를 들면, GCSF 및 GMCSF는 단독으로, 서로와 조합하여, 및/또는 하나 이상의 추가의 인자들과 조합하여, 다발성 경화증(MS)의 치료에 사용될 수 있고 및/또는 다발성 경화증 환자의 예방적 신경보호 치료를 제공할 수 있다. 이 방법은 핍지신경교 상의 GCSF 수용체의 존재를 기준으로 하고, MS의 일차 표적 세포상의 GCSF의 집적 효능을 지지한다. 이에 더하여, GCSF 수용체는 신경세포와 그들의 공정에 존재하고, 이것은 질병의 이후 단계에서 타협되고, 지속적 불능과 상관될 수 있다.(Cid, et al.(2002), J Neurol Sci, 193, 103-9). 참으로, 최근 다발성 경화증에 대한 치료적 개념에 있어서 면역조절로부터 신경보호로의 패러다임의 이동이 발생하고 있고, 신경퇴행성 메카니즘이 다발성 경화증의 불능 관점에 가장 중요하다는 것을 나타낸다(Bo et al(2003), mult Acler, 9, 323-31, Bjartmar, et al.(2003), J Neurol Sci, 206, 165-71, Wujek, et al.(2002), J. Neuropathol Exp Neurol, 61, 23-32, Bjartmar, et al.(2001), Neurology, 57, 1248-52, Peterson, et al.(2001), Ann Neurol, 50, 389-400, Bjartmar and Trapp(2001), Curr Opin Neurol, 14, 271-8, Ajartmar, et al(2000), Ann Neurol, 48, 893-901, Bjartmar, et al(1999), J Neurocytol, 28, 383-95, Trapp, et al.(1999), Curr Opin Neurol, 12, 295-302, Trapp, et al(1998), N Engl J Med, 338, 278-85, Neuhaus, et al.(2003), Trends Pharmacol Sci, 24, 131-8, Pryce, et al.(2003), Brain, 126, 2191-202, Waubant(2003), Expert Opin Emerg Drugs, 8, 145-61, Graumann, et al.(2003), Brain Pathol, 13, 554-73, Golde, et al.(2003), Eur J Neurosci, 18, 2527-37). 백질에 관하여 정상으로 보이는 뇌의 영역에서도 신경퇴행의 신호가 나타난다. 그러므로, 신경돌기 병리 및 신경퇴행은 다발성 경화증에서 중요한 치료적 표적이다. 본 발명에 나타낸 바와 같이, 뉴런에서 항-세포자멸 활성을 갖는 GCSF 및 GMCSF, 및 그들의 전-재생 잠재력은 여기서 기재된 조성물이 다중성 경화증의 치료에 새로운 치료법으로서 사용될 수 있다는 것을 지지한다.
더우기, 다발성 경화증에서 대뇌 허혈의 중요 메카니즘과 중복되는 병리생리학적 메카니즘, 예를 들면 질산의 관여(Smith, et al.(2002), Ann Neurol, 49, 470-6), 및 글루탐산염 흥분독성의 관여(Pitt et al.(2000) Nat Med, 6,67-70). 이 정보를 참작하여, GCSF 및 GMCSF와 같은 조혈성 성장인자는 다발성 경화증 및 감염성 뇌 장애에 대한 새로운 치료적 선택이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 정신분열증의 신경보호적 치료에 관한 것이다. 정신분열증에서 최근에 점진적인 회백질 손실에 대한 놀라운 증거가 있었다. 이 증거는 우선적으로는 신규한 MRI 기술에 의해 제공되었다. 비록 정신분열증에서 신경퇴행적 과정이 분자수준으로 이해되는 것은 아니지만, 정신분열증의 GCSF 및/또는 GMCSF로의 신경보호적 치료는 이 질병에 대한 새로운 접근이다. 일차 뉴런의 보호에서, GCSF와 같은 조혈성 성장인자의 효능을 시험하는 것은 다음과 같이 준비될 수 있다. 단계 E18의 배아(태생 18일)로부터 10~12의 래트 피질을 준비한다. 조직을 HBSS(Hanks balanced salt solution, Bio Withakker) 중에서 트립신[10mg/ml]/EDTA/Dnase[5mg/ml](Roche diagnostics, Mannheim, Germany)을 이용하여 해리할 수 있다. 소화는 4부분의 매질(neurobasalmedium+1ml 50×B-2지지체(Invitrogen) + 0.5mM L-글루타민산염)을 이용하여 정지될 수 있고 실온에서 5분동안 800g에서 원신분리될 수 있다. 펠렛을 매질 5ml에 용해시키고 세포의 수를 세어 확인한다(Neubauer slide). 세포들을 폴리-L-라이신으로 코팅될 수 있는 덮개 슬립에 24-웰-플레이트의 웰당 250000 세포의 밀도로 플레이트될 수 있다. 그리고 나서, 이들 뉴런을 보호 자극제(GCSF)와 해로운 자극제(글루타민산염, 100㎕)의 조합물로 처리될 수 있다. GCSF는 글루탐산염으로 처리되기 30분 전에 적용된다. 대조군은 GCSF가 없거나(살린만) 또는 글루탐산염 없이 처리된다. 24시간 후, 신경세포 치사는 제조자 지침에 따라, LDH 분석(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 사용하여 결정될 수 있다. 선택적으로, 세포치사를 유도하기위해 알려진 다른 독성 자극제, 예를 들면, NMDA 및 글리신, 3-니트로프로피온산(3-NPA), H2O2, 스타우로스 포린, 혈중산소감소/글루코스 결핍, 칼륨 회수, MPP+, 인터로킨-1-베타, TNF알파, FAS 리간드 또는 다른 공지의 세포 및 뉴런에 유해하다고 알려진 것이 사용될 수 있다. 다른 분석, 예를 들면, 세포-치사 ELISA(Roche Diagnostics), 아넥신/프로피디움 아이오다이드 염색과 레이저-조사 혈구조사분석(Kamentsky (2001), Methods Cell Biol, 63, 51-87), 컴퓨사이트(cambridge, Messachusetts), DAPI 또는 HOECHST33342 염색 후 세포자멸 특성을 갖는 세포핵의 카운팅(응축, 단편화), 분열-특이 항체로 면역염색 후 활성화된 캐스패이스 3에 대해 양성인 세포의 카운팅(예를 들면, ApoOne Assay, Promega; Western blots, Elisas) 또는 세포 생존 또는 세포자멸 특성을 측정하기에 알맞는 다른 분석법이, 세포 치사 또는 관련 세포 생존을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 다른 세포, 예를 들면, 미분된 PC12 세포, HN33 세포, SHSY5 세포, 일차 해마 뉴런, 일차 운동 뉴런, 일차 지각 신경절 세포, 일차 중뇌 배양, 신경성 줄기세포, 미분화된 ES 세포, 또는 본 분야에 알려진 다른 뉴런-형 세포, 또는 하나 이상의 신경 표현형이 사용될 수 있다. 여기에 예시된 시간 및 농도는 변할 수 있고, 예를 들면, GCSF는 자극제와 함께 적용될 수 있거나, 또는 자극제 전 또는 후에 적용될 수 있다. GCSF의 변화된 농도, 예를 들면 0.1~100㎍/ml가 사용될 수 있다. 원칙적으로, 이 분석은 뇌 슬라이스 조직에 사용되도록 변형될 수 있다. 뇌 종양의 모델(조절된 피질 충돌)에서, GCSF와 같은 조혈성 성장인자의 효능을 시험하기 위해, 다음이 실시된다. 실험적 프로토콜은 지역 윤리 위원회에 의해 승인 될 수 있다. 체중 280~320g의 20마리 수컷 위스터 래트(Charles river, Germany)를 다음 군으로 임의로 배정하였다: A (대조군 ,n=10, 종양성 뇌손상(TBI), TBI 30분 후 90분 동안 0.9% 살린 2ml로 처리): B (GCSF 군, n=10, 90분동안 허혈, 살린 0.9% 2ml중에 용해된, 재조합 G-CSF, Neupogen®, Amgen, Europe B.V., Netherlands로 체중 kg 당 60 ㎍으로 90분 동안 처리, TBI 초기 30분); C (모조-효과된 GCSF-처리 대조군, n=10, 모조 작용, 살린 0.9% 2ml중에 용해된, 재조합 G-CSF, Neupogen®, Amgen, Europe B.V., Netherlands로 체중 kg 당 60 ㎍으로 90분 동안 처리, TBI 초기 30분).
동물은 체중 kg 당 케타민하이드로클로라이드(WDT, Garbsen, Germany) 100mg의 복강내 주입에 의해 마취될 수 있다. 마취는, 필요하다면, 50 mg/kg 체중으로 유지될 수 있다. 평균 동맥 혈압, 혈액 가스, 헤마토크릿, 백혈구 수, 및 혈중 글루코스 수준을 연속적으로 모니터하기 위해, PE-50 폴리에틸렌 튜브를 우측 대퇴부동맥에 삽입할 수 있다. 우측 대퇴부 정맥은 주입처리를 위해 PE-50 튜브로 삽입될 수 있다. 실험 중, 직장 온도를 모니터하고 가열패드를 자동온도조절장치로 조절하여 37℃를 유지할 수 있다(Fohr Medical Instruments, Germany).
TBI의 경우, 피부를 프로브 주변에서 절단하여 두개골을 노출시키고 세척한다. TBI는 미세투석과 양립가능하도록 변형된 간접충돌 중량-적하 장비를 사용하여 제공될 수 있다(중량 150g을 직경이 2.0mm인 테프론 포인트를 갖는 PVC 실린더 상에 40cm에서 떨어뜨림). 모의 작동한 대조군은 종양없이, TBI를 수용한 래트와 동일하게 제조될 수 있다.
모든 동물에 있어서, 극복은 사망률 뿐만 아니라 신경학적 심각성 점수(NSS)로 측정될 수 있고, 이것은 실험군에 대해 알지못하는 관찰자가 종양뇌손상 후 1주 일 동안 매일 실시할 수 있다. 신경학적 기능은 0에서 16까지의 점수로 등급되어질 수 있다(정상 점수:0, 최대 장애 점수:16). NSS는 운동, 감각, 및 반사시험의 복합이고 평균대 균형시험을 포함한다. 손상의 심각성 점수에서, 시험을 실시하는 것이 불가능한 경우, 또는 시험된 반사의 부복의 경우 1점을 줄 수 있고; 그러므로, 점수가 높을수록 손상이 더욱 심각하다.
TBI 일주일 후, 래트는 체중 kg 당 케타민 150mg으로 마취되고 참수될 수 있다. 뇌를 제거하고, 24시간 동안 0.1몰/l 인산염 완충액 중의 4% 파라포름알데히드로 고정시킬 수 있다. 파라핀을 삽입한 후, 1㎛ 두께로 절단하고 H&E 염색, Nissl 염색 및 면역조직화학에 사용될 수 있다.
면역 조직화학연구는 미엘로퍼옥시다제(DAKO, USA), G-CSFG(Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)에 대한 항혈청으로 실시될 수 있다. 항혈청은 각각, 분리된 인간 단백질(항-미엘로퍼옥시다데)로 또는 마우스 기원 G-CSF의 카르복시 말단을 매핑하는 합성 펩티드로 면역화된 래빗에서 발생된다. 항원 회복을 위해, G-CSFR 면역 조직화학연구에 제공되는 절개된 부위는 20분 동안 99℃에서 10mM 시트르산염 완충액 중에서 가열될 수 있다. 그리고나서, 절개된 부위는 정상 돼지 혈청(인산염-완충 살린 중 10%)에서 30분 동안, 그리고나서 4℃에서 일차 항혈청에서 밤새도록 배양할 수 있다. 일차 항체는 아비딘 비오틴 복합체 방법에 의해 가시화될 수 있다(Vectastain, Vector laboratories, U.S.A.). 절개된 부위는 0.02% 과산화수소를 갖는 0.02% 디아미노벤지딘(DAB)에서 전개될 수 있다. 반응 생성물은 0.02% 염화코발트 및 니켈 암모늄 설페이트의 첨가에 의해 증대된다. TBI 후 신경 생존은 G-CSF 처리된 동물과 대조군의 해마에서 현미경으로(40배 확대) 뉴런을 정량화하여 측정될 수 있다. 호중구 과립구(NG)의 침입은 4-점 저울에서 반정량적으로 측정될 수 있다(0=MPO 음성, 1= 낮은 NPO 발현, 2=중간 MPO 발현, 3=강한 MPO 발현).
통계적 분석
값은 평균±SD로 나타내었다. 모든 자료를 모은 후, 임의추출 코드를 해결할 수 있다. ANOVA 및 순차적 포스트 hoc Fisher 보호된 덜 중요한 미분 시험이 생리적 계수와 같은 연속 변수의 차이의 통계적 중요성을 결정하는데 사용될 수 있다. 신경손상과 면역조직화학 자료의 비교를 위해 t-테스트를 사용할 수 있다. Mann-Whitney U-시험이 사망률과 MPO 면역조직화학과 같은 미계수적 자료에 대해 시험될 수 있다. p값<0.05은 통계적으로 중요하다고 간주된다.
GMCSF 및 GCSF와 같은 조혈인자의 효과, 그리고 신경세포에 대한 인식 수용체의 고통 효과를 기준으로, 본 발명의 또 다른 구현예는 암세포에 대한 GMCSF 및/또는 GCSF 수용체의 반대작용에 의해 뇌종양 또는 다른 신경학적 암을 치료하는 것이다.
신경줄기세포
최근, 신경학적 질병을 다루기 위한 새로운 신경 세포(신경조직발생)의 형성의 중요성이 인식되고 있다. 다른 많은 조직과 달리, 성숙 뇌는 재생 용량이 제한되고, 그것의 세포상 분화의 이례적인 정도는 남은 건강한 조직이 손상된 뇌의 기능을 떠맡을 수 있는 정도로 제한된다. 그러나, 대뇌 뉴런은 성인 외에 존속되는 전구체로부터 유래되고, 성인 뇌의 내인성 신경 전구체의 자극은 치료적 가능성을 가질 수 있다.
신경조직발생은 성인 뇌의 제한된 영역에서 일어나고, 측면 공동의 문 서브공동영역(SVZ)과 치상돌기 회(DG)의 서브과립 영역(SGZ)을 포함한다. 신경조직발생은 성인 동물에서 특히 신경학적 패러다임 이후에 발생한다(예를 들면, 대뇌허혈(Jin, et al(2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 4710-5, Jiang, et al.(2001), Stroke, 32, 1201-7, Kee, et al(2001), Exp. Brain. Res., 136, 313-20, Perfilieva, et al.(2001), J. Cereb. Blood Folw Metab., 21, 211-7)). 신경조직발생은 인간에서 설명되어왔고(Eriksson, et al.(1998), Nat Med, 4, 1313-7), 그리고 참으로 기능적 뉴런을 가져왔다(van Praag, et al.(2002), Nature, 415, 1030-4). 특히, 치상돌기 회의 서브과립 영역, 및 신문은 성인기 동안 새로운 뉴런을 발생할 수 있는 잠재력을 갖는다(Gage, et al. (1998), J Neurobiol, 36, 249-66). GCSF 수용체가 이 영역에서 발현된다는 것은 주목할만 하다(도 4 a,d). GCSF 처리 후, 기능적 결과의 개선을 나타내는 놀라운 자료, 그리고 GCSF가 다른 시스템(조혈작용)에서 줄기세포인자라는 사실과 함께, GCSF가 그의 작용의 일부, 특히 적어도 치상돌기 회에서 성인 줄기세포상의 작용의 촉진을 통해 관찰된(도 8) 장기간 효과를 발휘할 것이 기대된다.
이것은 래트의 축상돌기 회를 둘러싸는 해마 영역으로부터 분리된, 성인 신경 줄기세포상의 GCSF 수용체의 존제를 설명함에 의해 본 출원에서 확신된다(도 12 및 13). 신경조직발생의 중요성은 신경퇴행성 질병의 모든 면 및 뉴런이 사멸하는 모든 질병에서 GCSF 처리의 적용가능성 및 유용성에 대한 다른 이유를 제공한다. 신경학적 질병의 치료를 위한 뇌의 내인성 줄기세포에서의 작용과 반대로, GCSF는 줄기세포의 인비트로 촉진, 예를 들면, 미분화 및 증식에 적용될 수 있다. 인간에게서 줄기세포 치료법은 수 많은 질병, 특히 파킨슨씨병과 뇌졸증에 대해 탐험되고 있다. 배양에서 줄기세포를 신경세포의 특정 형태로 미분화하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 파킨슨씨병을 치료하기 위한 도파민성 세포이다. 미분화된, 또는 새로운 환경으로 변화된 세포는 여러 경로를 통해 기관으로 투여된다. 예를 들면, 파킨슨씨병에서, 줄기세포는 흑질의 도파민성 뉴런의 손실을 치환하기 위해 뇌로 직접적으로 주입된다("대체요법")(Arenas(2002), Brain Res. Bull, 57, 795-808, Barker(2002), Mov. Disord., 17, 233-41).
그러므로, 본 발명의 한 구현예에서, 조혈성 성장인자와 그것의 유도체를 사용하여 포유동물에 착상하기 전에 신경 줄기세포 또는 필수조건 신경 줄기세포의 성장과 미분화를 자극하는 것이다. 본 발명의 추가의 구현예는, 기재된 바와 같은 신경학적 질병의 치료를 위한 방법에서, 바람직하기는 신경 줄기세포가 개개인에게 투여될 때 신경보호 효과를 제공하는 방법에서 이들 신경 줄기세포를 이용하는 것이다.
한 구현예에서, 줄기세포는 동맥내 또는 정맥내 투여될 수 있다. 예를 들면, 대뇌 허혈 또는 종양성 뇌 손상에서, 골수 지질세포가 뇌의 표적 영역으로의 길을 찾아 주입된다(Mahmood, et al.(2001), Neurosurgery, 49, 1196-203; discussion 1203-4, Lu, et al(2001), J Neurotrauma, 18, 813-9, Lu, et al.(2002), Cell Transplant, 11, 275-81, Li et al.(2002), Neurology, 59, 514-23). 그러므로, 줄기세포는 GCSF, 또는 GMCSF, 또는 다른 조혈성 성장인자에 의해 인 비트로 치료될 수 있고, 그리고나서 여기 논의된 어떠한 질병을 갖는 환자에게 다양한 경로를 통해 주입된다.
본 발명의 한 구현예에서, 이식된 줄기세포는 유전적으로 숨겨진 인자를 발현하고, 그리고 이웃 세포의 생존을 강화하거나, 또는 성인 내인성 줄기세포의 증식 및/또는 미분화의 증가를 가져온다. 예를 들면, 줄기세포는 GCSF, GMCSF, 및/또는 하나 이상의 추가의 조혈성 인자를 안정하게 발현하도록 설계될 수 있고; 그리고나서 GCSF, GMCSF, 및/또는 하나 이상의 추가의 조혈성 인자를 국지적 환경에 일정하게 분비하도록 중추신경계로 전달될 수 있다.
줄기세포는 GCSF, GMCSF, 및/또는 다른 조혈 인자 수용체 작용제로 치료될수 있다. 사용될 수 있는 줄기세포는 불멸화된 줄기세포(예를 들면, 불멸화된 종양 유전자), 신경구, 및 배아줄기세포(ES)-유도 신경세포(Gottlieb(2002), Annu Rev Neurosci, 25, 381-407)를 포함하지만, 또한 골수 기공세포, 또는 제대세포를 포함할 수 있다(Lu, et al(2002), Cell Transplant, 11, 275-81, Li et al(2002), Neurology, 59, 514-23). 여러가지 형태의 줄기세포의 이식은 파킨슨씨병(Isacson(2002), Brain Res Bull, 57, 839-46) 및 뇌졸증(Kondziolka, et al(2002), J Clin Neurosci, 9, 225-30)을 포함하여, 다양한 신경학적 질병에 치료적 가능성이다.
줄기세포, 예를 들면, 인간 줄기세포는 이식 전에 그들을 조절하기 위해 처 리될 수 있다. 이들 조절인자의 한 예는 성장인자이다. 컨디셔닝의 한 예는 원하는 세포의 방향, 예를 들면 뉴런으로 그들을 미분화하는 것이다(Svendsen, et al.(1999), Brain Pathol, 9, 499-513). 줄기세포 상의 GCSF 수용체의 존재는 이들 세포의 컨디셔닝에 이들 수용체의 작용제의 중요성을 나타낸다. 성인 신경 줄기세포는 다양한 농도의 GCSF 또는 다른 GCSF 수용체 작용제로 처리될 수 있고, 예를 들면, 신경 줄기세포(네스틴)의 마커와 비교하여 신경 마커(Map2, NSE(뉴런-특이 에놀라제), 신경필라멘트, NeuN)의 비율을 정량화함에 의한, 정량적 PCR 접근법으로 증가된 미분화 잠재력을 분석한다. 처리 후 증가된 비율은 신경 계대를 향한 줄기세포의 증가된 미분화를 알린다.
본 발명의 다른 구현예에서, GCSF 및 GMCSF 수용체 작용제 뿐만 아니라, GCSF, GMCSF, 그것의 유도체는 신경세포, 예를 들면 신경 줄기세포의 배양을 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 이 방법에서, GCSF 및 GMCSF 수용체 작용제 뿐만 아니라, GCSF, GMCSF, 그것의 유도체는 세포에 첨가되기 전에 매질에 첨가되어 미리 섞일 수 있거나 또는 세포가 배양되는 매질에 첨가될 수 있다. 본 방법의 또 다른 구현예에서, 신경 세포는 GCSF, GMCSF 및 그것의 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 트란스펙트되고, 이것은 트란스펙트될 때 세포에 관련 인자를 발현한다.
투입/제제화/투여량
G-CSF, GM-CSF, 및 다른 인자, 유도체, 유전자 및 그들의 조합물이, 액체용액 또는 현택액, 정제, 필제, 분말제, 좌약제, 폴리머성 마이크로캡슐제 또는 마이크로소포제, 리포좀, 및 주사 또는 주입가능한 용액을 포함하는 여러 투여 형태 로 투여될수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 형태는 투여 및 치료적 적용방식에 따른다.
조성물은 액체, 슬러리, 또는 사용 전에 무균성 주입가능 매질에 용해될 수 있는 무균성 고체일 수 있다. 비경구적 투여는 바람직하기는 정맥내 투여이다. 이 주입은 바늘 또는 양립가능한 수단을 통할 수 있다. 이것은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 선택적으로, 예를 들면, G-CSF를 함유하는 조성물은 점막 경로를 통해, 적당한 투여량으로, 그리고 액체 형태로 투여될 수 있다. 경구 투여의 경우, 예를 들면, G-CSF를 함유하는 조성물은 액체 또는 고체 형태로 적당한 담체와 함께 투여될 수 있다.
예를 들면, 치료되어질 동물은 기니피그, 개, 고양이, 래트, 마우스, 말, 소, 양, 원숭이 또는 침판지일 수 있다. 한 구현예에서, 포유동물은 사람일 수 있다. 한편, 한 구현예에서, 치료 및 예방에 사용되는 GCSF 및 GMCSF와 같은 조혈인자는 인간 인자 또는 인간 소스로부터 유도될 수 있다.
인자들이 단일로 또는 조합하여 사용될 때 신경학적 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조혈 인자의 치료적으로 유효한 양은 신경보호 효과를 가져오는 양으로 사용되어야 한다. 이와 같은 양은 인자당 약 100ng ~ 약 10mg/kg 체중의 범위이거나 또는 조합물로서 연령, 인종, 성별 및 개인 환자를 기준으로 다른 인자를 기준으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 현재 방법에 사용하기 위한 GCSF의 양은 약 5 ~ 60㎍/kg 체중이고, GMCSF의 경우 약 5 ~ 약 750㎍/kg 체중이다. 인자들이 조합하여 사용될 때, 이들은 투여전에 미리 혼합되거나, 동시에 투여되거나, 또는 시리 즈로 하나씩 투여될 수 있다.
여기에 기재된 신경학적 질병을 치료하는 하나의 구현예에서, G-CSF 및 GM-CSF의 투여량이 클수록 특히 효과적이며, 예를 들면, 적어도 1mg, 적어도 2mg, 또는 적어도 3mg이 사용될 수 있고, 바람직하기는 약 1 ~ 3 mg이 사용된다. 이들 더 높은 투여량은 현재 이용가능한 포장 단위를 사용하여 환자가 편리하게 얻도록 할 수 없다. 그러므로, 본 발명은 여기에 기재된 바에 따른 신경보호 목적을 위해, 특히 비경구적, 또는 피하적으로 투여될 수 있는, 20~250 ㎍/kg 체중 범위의 투여량을 위한 포장을 제공한다. 고투여량 조성물의 전달에 유용한 포장 단위의 예는 1.0ml 또는 2.0ml의 용기 부피에서 G-CSF 및/또는 GN-CSF 0.75~25mg을 함유하는 1회용 바이알 및 미리채워진 주사기를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 포장 단위는 그 안에 함유된 조성물의 전달을 위해, 라벨상에 또는 분리된 인쇄종이로 지시사항을 포함할 수 있다.
또한, 바람직한 것은 환자의 체중에 따라, 각 개인에 대해 정확하고 신속한 투여를 허용하는, kg/bdy체중 규모로 보정된 G-CSF 및/또는 GM-CSF 투여용 미리채워진 주사기이다. 이들 포장 단위는 예를 들면, 환자가 손상 후 매우 신속하게 처치되어야 하는 뇌졸증의 경우, 응급 설비로서 매우 유용하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예는 예를 들면 뇌졸증 또는 다른 신경종양사상을 겪는 환자에게 손상이 발생한 후 짧은 시간에 여기에 기재된 하나 이상의 조성물을 투여함으로써 신경보호를 제공하는 것이다. 선택적인 구현예에서, 여기 기재된 조성물, 예를 들면, 미리채워진 주사기는 손상 후 오직 짧은 시간으로만 특별히 제한되지 않고 손상 후 어느때라도 투여/사용될 수 있다.
본 구현예의 내용에 사용된 바와 같이, "손상 후 짧은 시간"은 손상의 발생 또는 손상을 일으키는 사상 후 약 10분, 15분, 20분, 25분, 30분 또는 최대 약 1시간내를 의미한다. 조성물은 의학 전문가 또는 몇몇 경우에는 인자들의 적당한 투여량을 함유한 포장 단위에 대한 권한을 갖는 비-의학 전문가에 의해 투여될 수 있다. 엠블런스 기술자, 간호사, 의사 등과 같은 의학 전문가의 경우, 투여는 환자가 뇌졸증과 같은 신경종양으로 고통받는 장소, 앰블런스 또는 병원(또는 다른 의학 장소)으로 옮겨지는 다른 차량에서, 또는 응급실과 같은 병원에서 실시될 수 있다. 이론적인 제한 없이, 손상 후 짧은 시간 내에, G-CSF 및/또는 GM-CSF 와 같은 하나 이상의 조혈인자 함유 조성물의 투여는 더 큰 신경보호 효과를 달성할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 또한 이식된, 바람직하기는 피하적으로 이식된 미니-펌프일 수 있는, 특히 느린 방출 및 일정한 장기간 적용에 알맞는 장비를 제공한다(예를 들면, Edith Mathiowitz;(Ed.), Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, John wiley & Sons vol2, pp 896-920, 1999). 이와 같은 펌프는 인슐린 치료법에 유용하다고 알려져 있다. 이와 같은 펌프의 예는 Animas, Dana Diabecare, Deltec Cozm, Disetronic Switzerland, Medtronic, and Nipro Amigo에 의해 제조/판매되는 것을 포함하고, 미국특허 제 5474552; 6558345; 6122536; 5492534에 기재된 것을 포함하고 이것의 관련 내용은 본 명세서에 병합되어 있다.
본 발명은 또한 G-CSF 또는 GM-CSF의 내인성 혈청-수준을 측정하는 장비를 제공하고, 이것은 (예를 들면, Renard E., Curr Opin Pharmacol. 2002 Dec; 2(6):708-16에 기재한 바와 같이)연령과 체중을 고려하여 산출되고 약제의 적당한 양을 주입한다. 이것은 만성 기준으로, 예를 들면, 상기의 미니-펌프를 사용하여, 또는 급성 기준으로 실시될 수 있다. 이와 같은 장비의 예는 인슐린 치료용 Medtronic minimet사(Medtronic MiniMed, 18000 Devonshire Street, Northridge, CA91325-1219)에서 생산된다. GCSF 또는 GMCSF 혈청 수준을 측정하는 방법은 미국특허 제 6,630,358; 6,537,749; 및 6,475,809에 기재되어 있고, 이것의 관련 내용은 여기에 참조로서 병합된다.
펌프를 사용한 및/또는 GCSF 및/또는 GMCSF의 혈청수준의 검출과 관련된 약제 전달의 상기 구현예는 특히, 예를 들면, 파킨슨씨병, 근위축성측삭경화증(ALS), 치매 등의 만성 신경퇴행성 질병의 치료에 특히 유용하다.
투여 경로는 통상의 경로, 예를 들면, 경구, 피하, 피부, 직장, 질, 근육내, 정맥내, 동맥내, 뇌에 직접 및 비경구 경로를 포함할 수 있다. 이외에, 몇몇 경우, 폐 투여법이 유용하고, 예를 들면 폐 스프레이 및 다른 호흡기 형태가 있다.
폐 스프레이에 더하여, 비내(IN) 전달(예를 들면 비내 스프레이)이 신경학적/정신적 질환에 대한 본 발명의 조성물을 전달하는 바람직한 적용 방법이다. 비내 전달은 단백질 및 펩티드의 적용 방법과 같이 제공되기에 알맞고 사용하기에 편리하고, 특히 장기간 치료에 편리하다. 뇌에 펩티드 또는 단백질을 적용하기 위한 비내(코 스프레이)의 사용의 예는 :(Lyritis and Trovas(2002), Bone, 30, 71S-74S, Dhillo and Bloom(2001), Curr Opin pharmacol, 1, 651-5, Thorne and Frey(2001), Clin Pharmacokinet, 40, 907-46, Tirucherai, et al.(2001), Expert Opin Biol Ther, 1, 49-66, Jin, et al.(2003), Ann Neurol, 53, 405-9, Lemere, et al.(2002), Neurobiol Aging, 23, 991-1000, Lawrence(2002), Lancet, 359, 1674, Liu, et al.92001), Neurosci Lett, 308, 91-4)에서 발견할 수 있다. 비내 적용의 경우, GCSF/GMCSF 및 여기에 기재된 다른 조성물은 용매, 용제 및 코의 혈관을 확장하고, 관류를 증가시키는 등의 약제와 같은, 코의 상피 또는 혈관으로 전달의 가능성을 증가시키는 물질과 조합될 수 있다.
투여 방법을 기준으로, 그리고 포함된 관련 약물동태학을 고려하여, 투여량은 추가로 변할 수 있고, 예를 들면 뇌에 직접 주입의 경우 투여량은 낮아지고, 양은 GCSF, GMCSF 또는 그들의 유도체의 국지적 이용가능성을 기준으로(예를 들면, 총 투여량 5㎍) 절대적 투여량을 명시할 수 있다. 바람직하기는, GCSF, GMCSF 및 다른 조혈 인자들과 그것들의 유도체는 정맥내, 피하적으로, 또는 직접 대뇌 주사에 의해 주입되고, 이것은 삼투 펌프로 실시된다.
다른 구현예에서, GCSF, GMCSF 및 다른 조혈인자 및 그들의 유도체는 이들 인자들은 암호화하는 하나 이상의 핵산을 투여함에 의해 제공될 수 있다. 코딩서열 핵산은 바람직하기는 바이러스 벡터와 같은 재조합 벡터의 형태로 투여된다. 벡터 구조물 뿐만 아니라 알맞는 벡터의 선택 및 발현 조절 서열이 알려져 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터는 아데노바이러스(Acsadi et al., Hum. Gene Ther. 7(2):129-140(1996); Quantin et al., PNAS USA 89(7):2581-2584(1992); 및 Ragot et al., Nature 361(6413):647-650(1993)), 아데노-연관 바이러스 벡터(Rabinowitz et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9(5): 470-475(1998)), 레트로바이러스 벡터(Federico, Surr. Opin. Biotechnol. 10(5):448-453(1999)), 헤르페스 단순 바이러스 벡터(Latchman, Gene 264(1):1-9(2001)), 렌티바이러스 벡터, Sindbis 바이러스 벡터, 또는 세밀리키 포레스트 바이러스 벡터를 포함한다. 알맞는 벡터들은 또한 바이러스 에피토프와 같은 신경 세포에 연결되는 단백질을 함유하는 리포좀과, GCSD 또는 GMCSF를 암호화하는 핵산 또는 댄백질, 또는 올리고뉴클레오티드를 함유한다(Kaneda et al.(2002), Mol Ther, 6, 219-26. Kaneda(1999), Mol Member Biol, 16, 119-22). 바람직하기는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하고 발현하는 분리되고 정제된 핵산은 신경세포에서 발현되기에 알맞는 프로모터에 실시가능하게 연결된다. 이들 및 다른 알맞는 벡터들은 Kay et al., Nature Medicine 7:33-40(2001); Somia et al., Nature Reviews 1:91-99(2000); 및 van Deutekom et al., Neuromuscular Disorders 8:135-148(1998)에서 검토되고 있다.
분리되고 정제된 핵산에 실시가능한 연결에 알맞는 프로모터는 본 분야에 알려져 있다. 바람직하기는, 폴리펩티드를 암호화하는 분리되고 정제된 핵산은 근육 크레아틴 키나아제(MCK)(Jaynes et al., Mol. Cell Biol. 6: 2855-2864(1986)), 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 테트라시클린/독시시클린-조절가능 프로모터(Gossen et al., PNAD USA 89:5547-5551(1992))로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 실시가능하게 연결된다.
일반적으로, 본 발명의 벡터의 효과적인 이동을 학실히 하기 위해, 주어진 투여 경로의 관점에서 접촉되어질 대략적인 세포 수를 기준으로, 접촉되어질 세포 당 벡터의 약 1 ~ 약 5,000 카피가 적용되고, 각 세포에 약 3 내지 약 300 pfu가 들어가는 것이 바람직하다. 실제적인 투여량과 스케쥴은 조성물이 다른 조성물, 예를 들면, 약제학적 조성물과 조합하여 투여되는 가에 의존하거나, 또는 약물동태학, 약물 기질, 및 대사작용의 개개의 차이에 의존하여 변할 수 있다. 유사하기는, 양은 세포의 특정 형태 또는 벡터가 전이되는 수단에 따라 인비트로에서 변할 수 있다.
상기 단백질 또는 그들의 유도체, 물질 또는 핵산은 본 분야에서 이용가능한 표준 공정에 따라 의약 목적을 위해 제제화될 수 있고, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 담체(또는 부형제)가 첨가될 수 있다. 담체 또는 부형제는 활성성분을 위한 전달수단 또는 매질로서 작용할 수 있는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적당한 형태 및 투여방법은 선택된 생성물, 질병 또는 치료될 질환, 질병과 질환의 단계, 및 다른 관련 상황의 특별한 특성에 따라 선택될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(1990)). 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제의 비율 및 특성은 선택된 투여경로, 및 표준 약제학적 실시로 선택된 물질의 용해도 및 화학적 특성에 의해 결정된다. 약제학적 제제는 경구, 비경구, 또는 국소적 사용을 위해 변형될 수 있고 정제, 캡슐제, 좌약제, 용제, 현탁제 등의 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 성장인자, 그것의 유도체, 그것의 서열을 암호화하는 핵산은, 안정성, 결정화의 편리성, 증가된 용해도 등을 목적으로, 산부가염 또는 염기부가염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염으로 투여될 수 있다.
몇몇 신경학적 질병, 특히 허혈성 질병에서, 치료의 개시를 연기하지 않는 효과적인 치료가 특히 중요하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은, GCSF, GMCSF 또는 그것의 유도체 또는 STAT 단백질을 활성화하는 물질 또는 GCSF 또는 GMCSF 수용체의 작용제가 혈관의 폐색, 또는 신경학적 증상의 개시, 또는 허혈사상의 개시의 검출 후 24시간내, 바람직하기는 10, 가장 바람직하기는 3~6 시간 내에 투여된다. GCSF 및 GMCSF는 장기간 기능적 개선에 유리한 효과를 갖기 때문에, 허혈 상해 후 상당한 시간에 치료를 시작하는 것도 가능하다(예를 들면, 상해 후 1일 내지 7일). 치료는, 본 발명자들의 장기간 피질 경색 모델에서 보여진 기능적 개선과 유사한 환자의 지능적 회복을 개선하는 수단으로서, 허혈 사상 후 수일동안 및 수주일 동안 지속될 수 있다(도 8 참조). 치료는 GCSF, GMCSF 또는 관련 인자들의 수준을 통해 정상상태에 도달하기 위해, 하루 여러번의 투약으로 이루어질 수 있다. 치료는 일정 혈청수준을 보장하기 위해 기재된 물질의 연속적인 느린 주입(예를 들면 perfusor 유니트에 의해)을 포함할 수 있다.
파킨슨씨병, 또는 근위축성측삭경화증과 같은 만성 신경퇴행성 과정의 경우, 치료는 GCSF 또는 관련 인자들의 매일 투여, 또는 바람직하기는 느린-방출 제제의 사용, 또는 GCSF 또는 관련 인자등의 더욱 안정한 유도체로 이루어지는 것이 더욱 알맞다.
신경세포 상의 GCSF 또는 GMCSF 수용체에 조합하는 신경보호 물질의 선별
본 발명의 실시를 위해, GCSF, GMCSF(예를 들면, GCSF- 또는 GMCSF-의태) 및/또는 뉴런을 보호하기 위한 잠재력을 유지하고 백혈구에 대한 감소된 작용을 갖고, 그것에 의해 효과에 불리한 잠재력은 감소된 다른 조혈인자들이 바람직하다. 그러므로, 본 발명의 한 구현예는 신경 세포 상의 GCSF 또는 GM-CSF 수용체에 조합하고 본 출원서에 기재된 바와 같이 GM-CSF 또는 GCSF에서 관찰되는 신경보호 효과를 촉진하는 화합물을 선별하는 것이다.
GCSF의 유도체, 예를 들면, GCSF-의태는 실시예 10에 예시된 바와 같은 인 비트로 신경보호 분석에서 시험될 수 있다. 이 신경보호 분석은, 예를 들면, (ⅰ)인터로킨-1, 산소 박탈, A4 펩티드, FAS 리간드 같은 다른 손상 자극, 또는 (ⅱ) 예를 들면, SH-SY5Y 세포, 또는 PC12 세포 같은 신경성 세포인 다른 세포, 또는 (ⅲ)DNA-단편, 핵 압축, 공동-트란스펙트된 베타-갈락토시다제의 활성, 캐스패이즈(caspase)의 불소유전성 물질의 검출 등과 같은 세포-생육력 또는 세포-치사에 대한 다른 판독정보에 대한 적합에 의해 시험의 기본 원리의 변화없이 변할 수 있다. 고작업량 선별기술은 통상적으로 대규모의 세포의 신속한 처리를 정의 하는데 사용된다. 이 분석에서 긍정적인 신경보호 효과를 설명하는 물질은, 예를 들면 Tian et al., Science 281, 257-259에 기재된 바와 같이, 그들의 과립구감소증 활성에 대해 더욱 시험될 수 있다. GCSF 유도체의 선택은 바람직하기는 GCSF의 알려진 형태에 의해 이끌어 내어진 이들 효과를 갖는 시험 물질에 의해 이끌어진 이들 두개의 특정 효과의 비교를 기준으로 한다. 마찬가지로, GMCSF의 유도체, 예를 들면 GMCSF-의태는 GCSF에 대해 기재된 바와 같은 인 비트로 신경보호 분석에 시험될 수 있다.
추가의 신경보호물질은 신경성 또는 뉴런-형 세포의 STAT-3 및 STAT-5(예를 들면, PC12, SH-SY5Y, hNT, NT2, hn33)를 포함하는, STAT-단백질과 같은 활성화된 전이의 존재를, 이들이 시험 물질에 노출된 후 측정함에 의해 얻을 수 있다. 그러 므로, 본 발명의 또 다른 구현예에서, GCSF 또는 GMCSF 수용체에 대한 작용제로 작용하는 특정 물질 또는 화합물의 능력은 여기 기재된 바와 같이 뉴런-형 세포 중의 STAT 단백질, 예를 들면, STAT3 및/또는 STAT5의 활성화에 의해, 및 LightCyclerTM 또는 TaqmanTM 분석에 의한 정량적 PCR과 같은 통상의 유전자 발현 분석을 사용하여 분석된다.
활성화된 STAT 단백질은 인산화되고(pSTAT) 시판중인 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학적 연구의 pSATA-특이 항체(Santa Cruz Biotechnology) 또는 ELISA에 의해 검출될 수 있다.
선택적으로, STAT 활성은 루시퍼라제와 같은 리포터 유전자에 연결된 STAT-반응성 프로모터 요소(예를 들면, 다중화 STAT-3 또는 STAT-5 조합 요소와 같은 다중화 STAT-조합 요소), SEAP(secreated alkaline phosphatase), 클로라페니콜 트란스퍼라제(CAT), 녹색형광단백질(GFP), 또는 다른 통상의 유전자 발현 리포터를 포함할 수 있다.세포를 리포터 구조물로 트란스펙트한 후, 세포는 시험물질과 접촉되고 리포터 발현의 양이 동정될 수 있다. STAT 활성을 측정하는 이 방법은 고-산출 포멧으로 변형될 수 있다.
통상의 리포터 분석은, 예를 들면 시판중인 분석 시스템을 이용하여 실시될 수 있다(Mercury Pathway Profiling System from Clontech; Path Detect-System from Stratagene). 실시될 수 있는 프로토콜의 예는 다음과 같다.
세포를 다중웰 플레이트, 예를 들면 96 웰 플레이트에서 웰당 20,000세포로 배양하였다. 접종 후 2일에 배양 매질을 무-혈청 배지(40㎕/웰)로 교환하고 세포는 STAT-조합 요소 및 리포터 단백질(STAT-3_firefly-루시퍼라제 플라스미드; 50ng/웰) 및 트란스펙션 대조 플라즈미드(레닐라-루시퍼라제 발현 플라즈미드;10~20ng/웰)을 각 세포형에 따라 최적화 조건하에서 암호화하는, 리포터 플라스미드로 트란스펙션한다(예를 들면: PC-12세포는 LIPOFECTAMINE2000TM, Invitrogen을 사용한 리포펙션에 의해 트란스펙션될 수 있다). 트란스펙션 48~72시간 후에, 분석이 진행될 수 있다. 세포는 여러 범위의 농도를 포함하는 여러 농도의 시험물질로 자극된다. 자극의 5분 내에 시작하는 복수분석시간 지점을 선택하여야 한다. 루시퍼라제 분석을 사용할 때, 판독정보는 발광기, 플레이트 포멧(Berthold, Germany)에서 평가될 수 있고, 레닐라와 개똥벌레 루시퍼라제의 할성을 단계적으로 측정한다. 두 루시퍼라제-활성은 시판중인 검출키트(이중 루시퍼라제 리포터 분석키트, Promega; 루시퍼라제 리포터 분석키트, Clonetech)를 사용하여 실시된다. 개똥벌레 루시퍼라제의 값은 레닐라 루시퍼라제 값에 대하여 정상화되고 리포터 유전자의 상대적 감응이 산출될 수 있다.
선별법의 선택적인 예에서, 신경 세포의 GCSF 또는 GMCSF 수용체에서의 작용제 활성이 사용되고 측정될 수 있다. 예를 들면, 리간드 조합 후 동질다이머화는 형광고명전이에너지측정법(FRET, 또는 BRET(생물발광 공명에너지 전이)(Siegel RM et al Sci STKE(2000)(38): L1; Xu Y et al, Proc Natl Acad Sci USA(1999) 96(1):151-6), 또는 다이머화 사상에 대한 리포터 시스템, 예를 들면 이중 스위치 시스템(DE 10211063.8), 베타-갈 리포터 시스템(Rossi F et al Proc Natl Acad Sci USA(1997) 94(16):8405-10), 또는 분할-편재 시스템(WO 954/29195, US 5,585,245, 또는 Johnsson, N. and Varshavsky, Proc Natl Acad Aci USA(1994) 91(22):10340-4)을 사용하여 조사될 수 있다.
신경세포 상의 GCSF 및 GMSCF에 조합하는 신경보호 물질을 선별하는 추가의 선택적인 것에서, GCSF 및/또는 GMCSF의 뇌-내인성 수준의 유도가 본 발명에서 제공된다. 여기에 기재되고 이하의 실시예에서 설명되는 바와같이, GCSF와 GMCSF는 놀랍게도 뇌-내인성 리간드라고 발견되었다. 이들 리간드는 뇌의 여러 허혈 질환에서 유도되었다. 그러므로, 이들은 뇌-내인성 신경보호 시스템의 일부로서 작용한다. 동일한 의미에서 혈액-뇌-장벽을 넘는 외인성적으로 첨가된 GCSF 또는 GMCSF가 신경보호가 타당한 치료적 원리인 질환의 넓은 범위에 유익하다는 것과 동일한 의미로, GCSF/GMCSF의 뇌-내인성 수준이 증가하는 약물은 이들 질환에 유익할 수 있다.
이와 같은 물질을 동정하기 위한 선별 시스템은 배양물의 세포에 예를 들면, PC12 세포, SHSY5-세포, 및 다른 것과 같은 신경 세포, 일급 세포 또는 뉴런-형 불멸화 세포인 물질(예를 들면 대량의 저분자 라이브러리로부터)을 첨가하고, GCSF 및 GMCSF의 수준을 측정하는 기본 방법으로 설치될 수 있다.
GCSF/GMCSF의 수준을 측정하는 것은 단백질 자체를 분석함에 의해(웨스턴 블로팅, ELISA, RIA, 및 당업자들에게 알려진 다른 방법), 이들 단백질을 암호화하는 mRNA를 분석함에 의해(정량적 PCR, 노던 블로팅, RNAse 보호 분석, RNA 점-블로팅, 및 당업자들에게 알려진 다른 방법), GCSF/GMCSF에 대한 유전자의 조절 요소의 활성을 분석함에 의해 실시될 수 있다. 바람직하기는, 조절 프로모터들의 활성은 프로모터, 인헨서, 및/또는 리포터를 암호화하는 cDNA로 이루어진 인트론 요소(루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 녹색형광 단백질, 또는 쉽게 분석될 수 있는 다른 리포팅 유전자)로 이루어진 리포터 구조물에 의해 평가될 수 있다. 이들 리포터 구조물은 세포로 안정하게 또는 임시적으로 트란스펙트될 수 있다.
세포는 생리적 조건하에서 유지되거나, 또는 시험되어질 각각의 물질의 오염물 첨가의 효과를 관찰하기 위해, 유독한 자극(혈중산소감소/글루코스 결핍, NO 공여자, 글루탐산염 과량 등)에 추가적으로 노출될 수 있다.
동정된 물질은 물질을 동물에 제공하고 뇌의 GCSF/GMCSF의 함량을 측정함에 의해 (예를 들면, 정량 PCR에 의해)더욱 확인될 수 있다.
다른 구현예에서, GCSF 및 GMCSF에 대항 수용체의 발현 수중의 증가는 리간드에 대한 세포의 반응성을 증가시키는게 유용할 수 있다. 그러므로, 상기 설명된 선별분석은 수용체 발현에서의 증가를 선별하기 위해 변형될 수 있다.
본 발명에 일반적으로 기재된 바에 의해, 추가의 이해는 오직 설명의 목적으로 제공된 특정 실시예를 참조로 하여 얻어지며 다른 언급이 없는 한 이것으로 제한하려는 의도는 아니다.
본 발명에 근거하는 실험들은 GCSF는 생체외에서 신경보호성이고, GCSF는 일시적 국소 대뇌 허혈 후에 상당한 경색 감소효과를 발휘한다는 것을 입증한다. 그러나 또한 반대측면상의 경색 주변에 있는 뉴런은 GCSF 수용체에 대한 지시자인, 항GCSFR-항체에 특이적 조합을 나타냈다. 뉴런상의 GCSFR 존재는 신규의 웨스턴 블럿, RT-PCR, 및 뇌에서 상세한 면역조직화학에 의해 그리고 PCR 및 배양된 1차 뉴런에서 상세한 면역조직화학에 의해 검증되었다. 게다가 STAT3의 핵 전좌에 의해 판단될때 STAT3 활성화는 활동의 GCSFR/STAT 중재 메카니즘을 제안하는 대조구에 비교하여 GCSF 처리된 동물의 반음영(penumbra) 뉴런에서 상당히 증가되었다. 생체내 허혈 실험에서 (중뇌 동맥폐색, MCAO), 두 그룹과 비교시에, 레이저 Doppler flowmetry (Idf)에 의해 측정될 때 대뇌 혈액 흐름상에 영향이 없었다. MCAO 실험중에 두 그룹사이에 생리학적 파라미터 및 중량 경사(decline)에서 큰 차이는 없었다. 사망률은 MCAO 실험에서 대조구에 비하여 GCSF 처리된 동물들에서 상당히 증가하였다. 호중구성 혈액 계수(NGC)는 대조구와 비교할때 GCSF 처리된 동물에서 24시간 후에 상당히 증가되었다. 허혈 뇌반구로 호중구성 과립구(NGs)의 침입화의 측정시 미엘로퍼옥시다제(MPO)-염색화는 GCSF 처리된 동물들과 대조구 사이에 분명한 차이는 없었다.
실험에서 사용된 정맥주사된 GCSF의 용량(60㎍/㎏/체중)은 다른 실험 조건들에 사용된 용량에 상당했다. 초기 파일럿 프로젝트에서 사전에 안정성에 대해 시험되었고, 결과적으로 분명한 부작용은 관찰되지 않았다. 이 용량(60㎍/㎏/체중)은 인간 척수이형증(myelodysblastic) 및 다른 질환들의 치료에 승인된 용량보다 6배 더 높은 것이고 래트 모델에서 감지할 수 있는 부작용은 보이지 않았다.
GCSF로 달성된 50%의 경색 감소 효과는 전신 적용 후에 bFGF, 또는 IGF와 같은 다른 상장 인자들의 것에 필적한다 (Fisher M, et al., J. Cereb. Blood Flow Metab., 1995-9;Schabitz WR,et al., Stroke 2001; 32:1226-33). 세포자멸사, 반응성 산소종들 및 증가된 요구들(예를들면, 스프레딩 저하로부터)에도 불구하고 감소된 에너지 저장뿐만 아니라 세포들의 연이은 Ca2+ 과부하에 의한 글루코스 박탈 및 흥분성독성(excitotoxicity)은 허혈에 이은 뉴런성 세포 사멸의 주요 원인으로 보인다 (Lee JM, et al., Nature 1999;399(Suppl):A7-14). 실시예들에서 증명된 바와 같이, GCSF는 H2O2 유도된 세포 사멸에 대한 생체외 뉴런-유사 세포들 (NGF-분화된 PC12 세포들)을 보호한다. H2O2는 세포 사멸을 야기하는 반응성 산소종들(ROS)의 생산에 의해 산화 스트레스를 이끌어 낸다. 포유동물 세포에서 H2O2-중재 세포성 스트레스는 세포성 표현형, 용량, 시간-코스 및 관련된 신호 경로에 관하여 잘 특징화되어 있다. 다수의 연구에서 H2O2의 만연된 사용은 세포에서 H2O2의 효과로서 세포자멸에서 메카니즘을 지지한다 (FASEB J. 2002 Jan;16(1) 111-3; :J Cell Biochem 2001;82(3):437-44). 예를들면, 예비(pro)-세포자멸사 키나제 ASK1 및 FasLigand의 역활이 H2O2-중재 세포-사멸에서 설득력있게 증명되어 왔다 (Tobiume K, EMBO Rep 2001 Mar;2(3):222-8; Kwon, D., J Neuroimmunol. 2001 Feb 1;113(1):1-9;Facchinetti, F., J Neruosci Res. 2002 Jul 15;69(2):178-88.). 그러므로, GCSF는 대뇌 허혈에서 야기되는 세포자멸사 메카니즘에 간섭하는 것 같다. GCSF의 작용은 아마도 고-친화성 수용체 GCSFR에 조합함에 의해 중재된다. 이 수용체와 상호작용은 야누스(Janus) 패밀리 키나제(JAK) 및 STAT들을 활성화한다 (Darnell JE Jr., Science 1997; 227:1630-5). JAK는 리간드-유도된 수용체 이중체화 시에 활성화되는 비-수용체-유형 티로신 프로테인 키나제이다. JAK들의 GCSF 유도된 활성화는 STAT 이중체화를 유도하는 보존된 티로신 키나제 상의 STAT들을 인산화한다 (Quelle FW,et al., Mol. Cell Biol. 1994; 14:4335-41). 게다가, STAT들은 핵으로 전좌하고 연이어서 유전자 발현을 조절한다 (Shuai K, et al., Nature 1993;366:580-3;Shuai K., Oncogene 2000; 19:2638-44). STAT3은 GCSFR에 의해 활성화된 주요 STAT 단백질이다 (Shuai K., Oncongene 2000; 19:2638-44). STAT3은 bcl-2 활성화에 의해 세포자멸사 작용을 중재하고 c-myc 유전자를 상향(up)조절함에 의해 과립구의 증식 및 분화를 유도한다 (Fukada T. Immunity 1996;5:449-60; Shimozaki K, J. Biol. Chem. 1997;272:25184-9). 면역조직화학, RT-PCR 및 웨스턴-블럿을 사용하여 여기에 보여지는 바와 같이, GCSFR은 조혈 세포상뿐만 아니라 뉴런, 신경교세포, 뉴런-유사 세포 및 뉴런성 줄기세포 상에도 존재한다. 게다가, 반음영의 뉴런에서 GCSF 유도된 STAT3 상향조절은 BDNF 또는 bFGF에 대해 보여지는 바와 같이 bcl-2 상향조절과 같은 세포자멸사 효과를 중재할 수 있고 (Schabitz WR, et al., Storke 2001;32:1226-33), 생존하기 위해서 뉴런의 주성(tropic) 지지를 제공한다. 경색의 반음영에서 STAT3의 조밀 핵 라벨링은 대뇌 허혈 후에 활성화된 미세신경교에 대해 이미 보여진 세포질로부터 핵으로의 STAT3의 막-중재 전좌를 반영할 수 있다 (Planas AM, et al., Eur. J. Neurosci. 1996;8:2612-8). GCSF는 방출, 작용자의 작용의 증강, 및 호중구성 과립구 (NGC)의 세포자멸사성 세포 사멸을 지연시킴에 의해 생존시간의 연장을 자극하는, 모든 종류의 감염에 대한 신체의 제1 방어선으로 알려져 있다 (Hartung T., Curr Poin Hematol 1998;5:221-5). 호중구는 미세관을 폐색시킬 수 있고, 연이은 백혈구의 침입은 단백질가수분해성 효소, 산소 자유라디칼, 인터루킨 및 대뇌 허혈 후에 경색 크기 및 결과를 퇴화시키는 것으로 알려진 TNF-α의 방출을 자극한다 (Del Zoppo GJ, Stroke 1991;22:1276-83;Jean WC,et al., Neurosurgery 1998;43:1382-96;Matsuo Y, et al., Brain Res, 1994;656:344-52). 반대로, GCSF는 분명한 항-염증성 효과를 갖는다: GCSF는 말초 감염 모델에서 TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6 및 IL-8을 감소시키고, IL-1β 수용체-길항제를 증가시킨다 (Gorgen I, et al., J Immunol 1992;149:918-24;Heard SO,et al., Crit. Care Med. 1999;27:1019-21; Heard SO,et al., Crit. Care Med. 1998;26:748-54;Hebert JC, et al., Arch, Surg. 1990;125:1075-8; Lundblad R, et al., Crit. Care Med 1996;24:820-6.; Squadrito f, et al., Br J Pharmacol 1997;20:333-9.). GCSF는 생체외 및 건강한 지원자의 생체내에서 TNF-α의 방출을 감소시켰고, TNF, IL-6, IL-8 및 IL-1에 대한 길항제 수준을 증가시켰다 (Hartung T. Curr Opin Hrmatol 1998;5:221-5;Gorgen I, et al., J. Immunol. 1992; 149:918-24;Heard SO, et al., Crit Care Med 1999;27:1019-21). 게다가, 폐 및 회장에서 감소된 호중구 침입은 내장 허혈 및 재관류 모델에서 투여 15분 후에 관찰되었다 (Squadrito F et al., Br J Pharmacol 1997; 120:333-9.). 이들 발견과 일치하여, 비록 GCSF 처리 후에 총 호중구성 과립구(NGC)가 증가했을지라도, 허혈 반구로의 호중구 침입의 증가는 발견되지 않았다.
성장인자들 특히 bFGF 작용의 또 다른 가능한 메카니즘은 대뇌 혈류상의 효 과를 포함한다. bFGF 처리는 전신 강압을 촉진하지 않는 용량이어도 peri-허혈 영역에서 측부(collateral)을 확장해서, 반음영 지역으로의 혈류를 증가시킨다 (Tanaka R, et al., Stroke 1995;26:2154-8; discussion 2158-9). 그러나, 여기서 보여진 바와 같이, GCSF 처리는, LDF에 의해 측정될때 대조구와 비교해서 순환 혈압을 감소시키지 않거나 대뇌 혈류를 변화시키지 않는다.
광혈전증(photothrombotic) 벤갈 로즈(bengal rose) 모델에서, 허혈후 정맥내 GCSF 처리는 광혈전증의 뇌졸증 6주후 감각기관 운동 작용 결과를 분명히 증가시켰고, 이는 게다가 성장인자들이 생체내의 외상 뇌 손상 후에 회복 및 재생성을 유도한다는 가설을 뒷받침하는 것이다. 2개의 다른 화합물들, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 골원성(osteognic) 단백질-1 (OP-1)이 이전에 감각기관 운동 기능을 증진시키고, 대뇌 허혈 후에 뉴런성 발아를 유도하는 것으로 보고되었다 (Kawamata et al Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:8179-84; Kawamata et al Neuroreport 1998;9:1441-5; Ren et al Neuropharmacology 2000;39:860-5). 이들 연구 대부분에서 성장 인자들이 임상적으로 관련이 없는 대뇌 뇌실로 투여되었다. Ramirez 등 만이 (Ramirez, et al.(1999), Neuroreport, 10, 1201-4) bFGF의 정맥 투여가 손상-유도된 해마형성체(hippocampel) 발아를 뒷받침한다는 것을 보고했고, 다른 저자들은 기능적 결과 측정을 연구하지 않았다. 여기서 나타낸 결과들은 GCSF 투여의 임상적으로 관련 용량 프로토콜은 대뇌 허혈 후에 기능적 회복을 유도한다는 것을 나타낸다. 가소성(platicity) 증진의 수용량은 허혈성 뇌 손상에 분명히 제한되는 것이 아니라, 파킨슨병 및 근위축증측삭경화증(ALS)과 같은 신경퇴행 질 환, 트리뉴클레오티드 반복 질환, 인공호흡 또는 출산중(intrapartal) 문제에 기인한 대뇌 허혈, 아마도 또한 알츠하이머와 같은 치매 및 정신분열증의 신경퇴행 양상과 관련된다.
대뇌 허혈상의 실험을 위한 방법 개요
허혈은 래트에서 중대뇌 동맥의 봉합경색 모델 (90분)을 사용하여 유도하였다. 허혈 유도 30분 후에, 동물들 (n=그룹마다 12마리)에 GCSF 60㎍/㎏체중 또는 부형제를 정맥주사로 90분동안 투여했다. 경색 용적은 허혈 24시간 후에 TTC (2,3,5-트레페닐테트라졸리움 클로라이드)-염색에 기초하여 계산하였다. GCSFR의 발현은 면역조직화학에 의해 연구되고, RT-PCR 및 면역블롯팅으로 입증되었다. STAT3의 발현은 면역조직화학으로 연구되었다, 기능상의 회복에의 GCSF의 효력은 벤갈 로즈 광혈전증 모델에서 연구되었다.
통계 분석
이 연구에서 제시된 값들은 평균±SD이다. 모든 데이터를 얻은 후에, 무작위추출 코드는 파괴되었다. ANOVA 및 연이은 포스트 hoc Fisher 보호된 적어도 상당한 차이 시험 또는 Bonferroni 교정(correction)이 생체외 데이터에서, 그리고 일련의 실험에서 생리학적 파라미터들 또는 기능적인 결과의 통계적으로 상당한 차이를 결정하는데 사용되었다. t-시험이 사후 경색 용적, MPO 및 STAT3 면역조직화학의 비교를 위해 사용되었다. Chi-square 시험이 사망 데이터를 위해 수행되었다. p-값 < 0.05가 통계적으로 상당(분명)함으로 고려되었다.
결과
GCSF는 경색 용적을 131,96mm3±112,7mmm3 (대조구에서 278,9mm3±91,56mm3)(p<0.05)로 감소시켰다. 면역조직화학, 웨스턴-블롯팅, 및 RT-PCR은 뉴런 및 신경교 세포에서 GCSF 수용체의 존재를 드러냈다. GCSF는 대조구에 비하여 경색의 주변에서 상당히 STAT3을 활성화시켰다 (p<0.05). GCSF는 벤갈 로즈 광혈전증 모델에서 허혈 후에 기능적 회복을 증진시키는데 효과적이다.
그러므로, GCSF는 세포 배양 및 국소 대뇌 허혈 후에 상당한 신경보호 효과를 갖는다는 것이 증명되었다. 이 효과는 GCSFR과 STAT3의 활성화의 상호작용에 의해 중개되는 것으로 여겨진다.
실시예 1 - 국소 대뇌 허혈
국소 대뇌 허혈을 유도하기 위한 과정 (MCAO, 중대뇌 동맥 폐색)
실험 프로토콜은 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다. 24마리 수컷 위스터 래트 (Charles River, Germany) (280 내지 320g 체중)을 무작위로 다음과 같은 그룹으로 할당하였다: A (대조구, n=12, 90분간 허혈, 혈관 폐색 30분후 시작하여 90분동안 2㎖의 0.9% 염수로 처치); B (GCSF 그룹, n=12, 90분간 허혈, 혈관 폐색 30분후 시작하여 90분동안 2㎖의 0.9% 염수에 용해된 재조합 인간 GCSF (Neupogen
Figure 112005034721422-PCT00001
, Amgen, Europe B.V., Netherlands) 60㎍/㎏체중으로 처치). 대안으로, 다른 소스(다른 제조사 (e.g.LenogastrimTMby Roche or GranocyteTMby Chugai AlbugraninTMby HGS or NeulastaTMby Roche/Amgen))의 GCSF 또는 유도체 또는 제형이 여기서 사용될 수 있다.
그리고 나서 동물들을 케타민 히드로클로라이드 (WDT, Garbsen, Germany) 100mg/kg체중의 복강내 주사로 마취시켰다. PE-50 폴리에틸렌 튜브를 평균 동맥혈압, 혈액 가스, 헤마토크릿, 백혈구 계수 및 혈당 수준의 연속적인 모니터를 위하여 오른쪽 대퇴부 동맥에 삽입하였다. 오른쪽 대퇴부 정맥을 처치 주입을 위해 PE-50으로 캐뉼라화했다(cannulated). 실험 동안 직장 온도를 모니터했고, 정온적으로 조절된 열 패드 (Fohr Medical Intruments, Germany)에 의해 37℃로 유지하였다. 순간적 국소 대뇌 허혈을 Zea Longa et al (Stroke 1989;20:84-91)에 의해 상세히 기재된 바와 같이 봉합 경색 모델을 사용하여 유도하였다. 간략하게, 오른쪽 총(commonn)경동맥 및 오른쪽 외부 경동맥을 중선 목 절제를 통해 노출시켰다. 실리콘으로 코팅된 4-0 모노필라멘트 나일론 봉합사를 총경동맥에 동맥절제를 통하여 삽입하고, 내부 경동맥으로 순하게 전진시키고, 동맥 분기로부터 약 17mm에 위치시켰다. 이 기술을 사용하여, 봉합사의 팁은 근방의 전방 대뇌 동맥, MCA의 근원 및 후방의 통하는 동맥을 한쪽으로 폐색시킨다. MCA의 경계에서 큰 경색이 전형적으로 생성된다. 재관류가 혈관 폐색 90분 후에 폐색기 필라멘트의 회수로 수행되었다. 모조-수술된 동물들을 상기에서 기재된 바와 동일한 실험 과정을 겪게 해서 (단, 나일온 필라멘트는 총경동맥을 넘어 전진되지는 않았다), 경색은 일어나지 않았다. 외과수술 후에, 카테터를 제거하고 동물들을 마취로부터 회복되도록 하고, 무제한으로 음식과 물을 주었다.
지역적 대뇌 혈류의 측정
Laser-Doppler flowmetry(LDF)(Periflux 400 Master, Perimed AB, Sweden)를 MCA의 폐색 전에, 중에 및 후에 대뇌 혈류(CBF)를 모니터하기 위해 사용하였다. 동물을 정위 프레임에 둔 후에, 동물의 두개골을 노출시키고 직경 1.5mm의 구멍을 현미경 하에서 대천문으로 우측 4mm 측면 및 2mm 미부 상에 드릴했다. 경뇌막은 왼쪽 그대로 있게 했고 LDF 프로브 (직경 1.4mm)를 burr 구멍으로 위치시켰다. CBF 모니터를 위해 선택된 부위가 래트에서 MCA 폐색 모델의 허혈 반음영에 대응되었다.
경색 용적 계산
MCA 폐색 24시간 후에, 래트를 케타민 150mg/kg체중의 마취시키고 참수했다. 뇌를 해부하여 5개의 2mm 두께의 관상 슬라이스로 절단하고 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC) 2% 용액에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 10% 완충된 포르말린 용액에서 침수하여 고정하였다. TTC-염색된 섹션은 전하 커플링된 장치 카메라 (EDH-1000HR Computer Camera, Electrim Corporation, Princetown, NJ, USA)를 사용하여 사진 찍었다. 실험과정이 가려진 조사자는 컴퓨터 영상 분석기 (Bio Scan Oprimas, Edmonds, WA)로 경색 크기를 측정했다. 뇌 부종의 효과를 상쇄하기 위해, 교정된 경색 면적이 이전에 상세히 기재한 바와 같이 계산되었다: 교정된 경색 면적은 왼쪽 반구 면적을 뺀 것과 동일하다 (오른쪽 반구 면적 - 경색 면적) (Schacitz WR, et al., Stroke 2001;32:1226-33). 경색 용적은 반대쪽의 반구의 퍼센트로서 표현되었다.
허혈 실험
GCSF는 국소 대뇌 허혈 후에, 잠재적 신경보호 효과를 달성하였다. 복강내 GCSFF 처치된 동물에서 경색 면적은 131,96mm3±112,7mmm3 대 대조구에서 278,9mm3±91,56mm3(p<0.05)이거나 또는 9.96±8.31%(n=12) 대 총반구의 22.7±6.69%(p<0.05; 도 1)이었다.
GCSF 처치는 사망을 상당히 감소시켰다. 대조구에서 4마리 및 GCSF-처치된 그룹에서 1마리가 24-시간 재관류 기간동안 죽었다 (p<0.05). 모든 동물에 대한 직장 온도, pH, pCO2, pO2, 헤마토크릿(hct), 혈당, 심장속도, 평균 동맥압 및 체중에서 대조구와 GCSF-치리된 그룹 사이에 통계적 차이는 관찰되지 않았다 (표 1). 말초혈에서 백혈구 계수는 대조구에 비하여 GCSF 처치된 동물에서 허혈 후에 24시간 동안 상당히 증가되었다 (p<0.05, 표 1).
표 1
Figure 112005034721422-PCT00002
표 1은 GCSF 처리된 동물 및 대조구의 생리학적 파리미터를 나열한다. 값들은 평균 SD로서 주어져 있다 (p<0.05; ANOVA;F-시험).
LDF-모니터링은 두 처리 그룹 사이에 통계적 차이가 없음을 드러냈다 (데이터는 도시되지 않음).
실시예 2 - 국소 대뇌 허혈의 전후관계에서 면역조직화학
사용된 면역조직화학 방법
경색된 뇌에서 STAT3 활성와 (도 6) 및 GCSFR 분포의 형태학적 분석, 및 호중구성 과립구의 계수를 위하여, GCSF-처치된 동물 및 대조구의 2mm-두께 뇌 슬라이스를 0.1mol/l 인산염 완충액 중의 4% 파라포르말데히드에 침수하여 고정하였다 (n = 그룹당 5마리). 파리핀-임베딩(embedding) 후에, 1㎛-두께 섹션을 절단하고 H&E 염색, Nissl 염색 및 면역조직화학 분석을 위해 사용했다.
면역조직화학 연구를 미엘로퍼옥시다제 (DAKO, Carpinteria, CA, USA), 신경교 소섬유 산성 단백질 (GFAP)(DAKO, Carpinteria,CA, USA), GCSFR (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) 및 STAT3 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)에 대한 항혈청으로 수행하였다. 항원 회복을 위해, GCSFR 및 STAT3 면역조직화학을 위해 제공된 섹션을 10mM 시트레이트 완충액에서 99℃에서 20분간 가열하였다. 그리고 나서 섹션을 정상 돼지 혈청(포스페이트-완충된 염수중 10%)에서 30분간 인큐베이션 하고 그리고 나서 1차 항혈청에서 4℃에서 하룻밤 인큐베이션 하였다. 1차 항체를 각각 1:150(미엘로퍼옥시다제), 1:400(GFAP), 1:400(GCSFR) 및 1:100(STAT3)으로 희석했다. 면역반응성은 아비딘 비오틴 복합체 방법 (Vectastain, Vector Laboratories, USA)에 의해 가시화되었다. 섹션을 0.02% 과산화수소를 갖는 0.02% 디아미노벤지딘 (DAB)에 발달시켰다. 반응생성물을 0.02% 코발트 클로라이드 및 니켈 암모늄 설페이트의 첨가에 의해 증강시켰다. 대조구 슬라이드 서브세트에서, 각각의 펩티드로 GCSFR 항혈청의 예비흡수는 면역염색을 생성하지 않았다 (도시되지 않음). 1차 혈청을 생략했을 때, 면역염색은 또한 생성되지 않았다 (도시되지 않음).
호중구성 과립구(NG)의 침입은 경색된 반구 당 NG를 계수함에 의해 양적으로 측정되었다. STAT3 단백질 발현은 측부 대뇌피질의 경색 부근 및 대응하는 반대측에서 2 중복 fields 상하방향(rostro-caudal)으로 정량화되었다 (확대 x 400). 마지막으로, 핵 전좌를 갖는 뉴런을 계수하고 모든 뉴런으로부터 STAT3 양성 뉴런의 퍼센트로서 나타내었다.
국소 대뇌 허혈에서 면역조직화학 실험의 결과
미엘로퍼옥시다제(MPO) 염색은 두 그룹의 비-허혈 반구에서 호중구성 과립구 (NG)를 검출하지 않았다. MPO 염색에서 GCSF 처치된 동물과 대조구 사이에 허혈 반구에서 정량화된 MPO 양성 세포를 기초하여 상당한 차이는 없었다 (14±17.6 대 14.3±12.5, n.s.).
GFAP 면역반응성 (IR)은 비경색된 반구의 대뇌피질, 선조체(striatum) 및 백질을 통하여 분산된 성상세포 프로세스에 존재하였다. GFAP 염색의 패턴 및 강도에서는 어떠한 차이도 처치되지 않은 그리고 GCSF 처치된 래트 둘 다에서 대뇌피질의 peri-경색 영역에서 검출되지 않았다. 특히, 플라세보 그룹에서도 그리고 GCSFF 그룹에서도, GFAF IR은 대뇌피질 반음영에서 증가되지 않았다 (도시되지 않음). 경색 코어 내에, 분산된 GFAP 면역반응성 성상세포가 검출될 수 있었다 (도시되지 않음 ).
면역조직학적으로, GCSF를 위한 염색은 처치되지 않은 그리고 GCSF 처치된 동물 둘 다에서 분산된 대뇌피질 뉴런 및 신경돌기에서 검출할 수 있었다 (도시되지 않음). 신경교 세포는 또한 GCSF-R 항체로 염색되었다 (도시되지 않음). 경색 코어에서, GCSF-R 면역반응성 세포는 보여지지 않았다. GCSF-R IR의 패턴 및 강도에서 차이는 두 실험 그룹에서 증명되지 않았다.
STAT IR은 플라세보 및 GCSFF 처치된 래트 둘 다의 비경색된 반구 내에서 뉴런 및 신경교 세포의 분산된 핵들에서 보여졌다. 일부 세포질 염색은 몇몇의 분산된 뉴런에서 또한 존재했다. STAT3 단백질 발현은 비처리된 대조구에 비하여 경색의 반음영에 GCSF 처리후에 상당히 증가했다 (34.4±7.05 대 13.7±4.4; p<0.0003)(도 6, 7). 반대측 상에 차이는 일어나지 않았다 (16.2±6.9 대 13.3±6.9;n.s.).
실시예 3 - 국소 대뇌 허혈의 전후관계에서 웨스턴 블럿 및 PCR
웨스턴 블럿 (도 3)
면역블럿팅을 위해서, 뇌 조직 (2시간의 일시적인 허혈)을 4℃, 동질화 완충액 20부피(w/v)(320mM 수크로스, 0.1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 및 2㎍/㎖ 펩스타틴)에서 용해하였다. 동질화물을 4℃, 9,200G에서 15분간 원심분리했다. 동질화 부피의 1/10에 펠렛을 재현탁한 후에, 단백질 결정(Bio-Rad protein-assay, Munich, Germany)을 위한 분취량을 분리하고 시료를 일산화질소에서 급속히 동결시키고 -70℃에서 저장하였다. 레인당 15㎍ 단백질을 4M 우레아를 함유하는 8% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에 로딩하고 표준 조건하에서 전기영동하였다. 단백질들은 반-건조 블롯팅에 의해 Immobilon-PTM 막 (Millipore Corp., Eschnorn, Germany)으로 전기영동적으로 이동되었다. 상온에서 1시간 동안 TBST (20mM 트리스 염기, PH 7.6, 137mM NaCl 및 0.05% 트윈-20) 중의 3% 지질없는 건조 우유에서 블록킹한 후에, 막을 4℃에서 밤새 1차 GCSFR 항체 (1:500)으로 인큐베이션 하였다. TBST에서 세척 후에, 막을 상온에서 1시간 동안 적절한 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 2차 항체의 1:2,000 희석액으로 인큐베이션 하였다. 면역반응성 밴드는 증강된 화학발광으로 선형 범위로 가시화되었다 (Amersham Intl., Braunschweig, Germany).
대뇌피질 추출물로 면역블롯팅 실험에서 (도 3), GCSF-R 항혈청은 추론된분자량과 일치하는, 약 130kD의 단백질 밴드를 검출했다 (Fukunafa R, et al., J Biol Chem 1990;265:14008-153:). 또한, 더 저분자량의 몇몇 밴드가 보여졌는데, 아마도 파쇄 생성물을 반영하는 것이다. 각각의 펩티드로 GCSFR 항혈청의 예비흡수 후에, 밴드들은 사라졌다 (도 3).
뇌에서 GCSF 수용체를 위한 PCR (도 2A)
래트를 깊게 마취시키고 심장을 가로질러 관류시킨 후, 뇌를 재빨리 해부했다. RNA를 제조자의 지시에 따라서, RNA-세정 키트 (AGS, Heidelberg, Germany)로 뇌로부터 추출하였다. 총 10㎍의 RNA를 MMLV 역전사효소 및 랜덤 핵사머로 역전사하였다. PCR을 위하여, 뮤린 GCSFR의 2 및 7 엑손으로부터 다음과 같은 프라이머를 사용하였다: 센스, 5'-CCC CTC AAA CCT ATC CTG CCT C-3' (SEQ ID NO:5) 및 안티센 스, 5'-TCC AGG CAG AGA TCA GCG AAT G-3'(SEQ ID NO:6)(Ashihara E, et al., J Cell Physiol 1997:171:343-56). PCR을 다음의 프로토콜에 따라 수행하였다: 94℃에서 3분, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 및 72℃에서 1분 (40 사이클). 생성물을 2% 아가로스 겔 상에서 분석하였다.
마우스 GCSFR에 대해 특이적인 RT-PCR을 사용하여, GCSF-R mRNA을 뇌 조직에서 검출하였다 (도 2A). PCR 생성물은 567bp의 기대된 크기를 가졌다. 정체는 PCR 생성물을 서열화함에 의해 입증되었다 (도 2).
실시예 4 - ASL 모델에서 GCSF 효력
ALS 마우스 모델에서 생존 시험
이전 실험들은 ALS의 SOD1 마우스 모델이 인간에서 치료의 성공을 예측함을 증명했다 (Cleveland and Rothstein(2001), Nat Rev Neurosci, 2, 806-19). 그러한 분석에서 1차 종료점은 운동 신호의 개시 및 사망 둘다 이다. 예를들면, 운동 신호의 개시는 마우스가 20rpm의 속도에서 7분동안 로타로드(rotarod) 상에 남아있을 수 없는 첫째 날로서 정의될 수 있다 (Li, et al(2000), Science, 288, 335-9). 사망은 죽은 날로서 기록하거나, 결손이 너무 심하여 마우스가 사살되어야만 하는 날로서 기록하였다 (예를들면, 자체로 무감각 및 무능). 추가 파라미터들이 그립 강도 테스트에 의한 운동강도 측정, 척수에서 운동 뉴런의 계수, 신경 두께 (예를들면, 좌골신경, 횡경막 신경), 및 척수 운동 뉴런에서 세포자멸사 염색의 존재에 의해 결정된다. GCSF는 삼투압 펌프를 통하여 대뇌 뇌실로 예정된 용량으로 예를들면 60㎍/㎏체중/일로 주입될 수 있다. 대안으로서, GCSF는 정맥 또는 복강주사(i.p.) 로 60㎍/㎏체중/일 또는 더 높은 용량으로 주어진다. 대안으로서, 다른 공급원 (다른 제조사 (e.g. LENOGASTRIMTMfrom Roche, GRANOCYTETMFrom Chugai Pharma, Co. Ltd., ALBUGRANINTMfrom Human Genome Sciences, or NEULASTATMFrom Roche/Amgen))의 GCSF 또는 유도체 또는 제형이 사용된다. 처치는 SOD1 G93A 돌연변이체의 늦은 예비징후 단계 (late presymptomatic stage)에서 60일에 시작되었다. 비처리된 가족의 ALS 마우스에, 운동 결함은 12-14주령에서 보여지나, 마비는 20주령 전에는 관찰되지 않았다. 생존 예측치는 140-170주령이다. 효과적인 처치는 대조구에 비하여 15% 이상 생명을 연장시켜야만 한다 ( Cleveland and Rothstein (2001), Nat. Rev. Neurosci., 2, 806-19). 처치를 위한 대조구로서, 부형제와 zVADfmk (이 모델에서 효력을 보여준 유력한 caspase 저해제) 둘 다 처리된 동물이 사용될 것이다. 각각의 그룹은 각각 10마리 동물을 포함한다.
실시예 5 - 파킨슨 모델에서 GCSF 효력
GCSF의 효력 연구를 위해 적절한, 입수가능한 파킨슨병의 다양한 로덴트 모델이 있다 (Grunclatt, et al.(2000), J Neurol, 247 Suppl 2, Il95-102.). 하나의 잘-특징화된 모델은 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP)이다. MPTP-HCl의 4 용량(dose)(용량당 15mg/kg)을 2시간 간격으로 복강주사를 통해서 8-주령 수컷 마우스(n=20)에 투여할 수 있다. 20마리 마우스를 MPTP 처치 및 GCSF 1일용량을 투여하고 마지막 MPTP 처치 7일 후에 마우스를 사살하였다. 그때까지, 마우스는 운동 파라미터 (로타로드 행동, 자유 이동)에 대해서 분석했다. 10마리 마우스의 뇌 각각을, 티로신 가수분해효소 또는 도파민 트랜스포터에 양성인 흑색질(substantia nigra)에서 총 뉴런 수, 세포자멸사-양성 뉴런의 수 (TUNEL 염색, caspase-3 염색)를 분석하는 면역조직화학을 위해 처리하였다. MPTP 처리 후에 남아있는 도파민성 뉴런은 MPTP + GCSF를 받은 것들 및 모조 그룹과 비교된다.
각 그룹에서 남아있는 10마리는 염수로 심장을 가로질러 관류될 것이고, 사살되고 그리고 선조체를 해부하여 적출했다. 선조체는 얼음 상에서 동질화시키고 도파민 함량을 전기화학적 검출로 HPLC에 의해 측정하였다. 3 그룹의 비교는 흑색질에서 세포 손실에 기인한 도파민 고갈의 좋은 측정이다.
이 실험은 MPTP에 대한 상이한 용량 스킴을 사용하여 또한 수행될 수 있다 (즉, 한번에 40mg/kg체중; 30mg/kg체중 두번 등).
실시예 6 - GCSF는 광혈전증 대뇌 허혈 후에 감각-운동 기능을 향상시킨다 (도 8)
실험 그룹
실험 프로토콜은 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다. 수컷 위스터 래트 (Charles River, Germany) (280 내지 320g 체중)을 무작위로 다음과 같은 그룹으로 할당하였다: A(대조구, n=6), 허혈, 허혈 1시간후 시작하여 정맥주사 볼러스로 0.5㎖의 0.9% 염수로 처치; B (GCSF 그룹, n=6), 허혈, 허혈 1시간 후 시작하여 0.5㎖의 0.9% 염수에 용해된 5㎍ GCSF (Amgen)로 처치. 대안으로, 다른 소스(다른 제조사 (e.g.LenogastrimTMby Roche or GranocyteTMby Chugai AlbugraninTMby HGS or NeulastaTMby Roche/Amgen))의 GCSF 또는 유도체 또는 제형이 여기서 사용될 수 있다. 꼬리 정맥을 통하여 반복적인 정맥주사 볼러스 주입이 1 ~ 5일 이어졌다. C (모조 수술된 그룹, n=6), 모조 수술, 허혈없음, 허혈 1시간후 시작하여 정맥주사 볼러스로 0.5㎖의 0.9% 염수로 처치.
광혈전증에 의한 국소 대뇌 허혈
동물들을 케타민히드로클로라이드 (WDT, Garbsen, Germany) 100mg/kg체중의 근육내 주사로 마취시켰다. 마취는 필요에 따라서 50mg/kg체중으로 유지하였다. PE-50 폴리에틸렌 튜브를 평균 동맥혈압 및 혈액 가스의 연속적인 모니터를 위하여 오른쪽 대퇴부 동맥에 삽입하였다. 오른쪽 대퇴부 정맥을 처치 주입을 위해 PE-50으로 캐뉼라화했다. 실험 동안 직장 온도를 모니터했고, 정온적으로 조절된 열 패드 (Fohr Medical Intruments, Germany)에 의해 37℃로 유지하였다.
광혈전증 허혈을 Watson et al (Watson BD, Dietrich WD, Busto R, Wachtel MS, Ginsberg MD. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 1985;17:497-504.)의 방법에 따라서 오른쪽 래트 정수리 피질에 유도하였다. 동물을 케타민히드로클로라이드로 마취시키고 정위 프레임에 두고, 두개골을 노출시키기 위해 머리가죽을 절개했다. 조명을 위해, 1.5mm 구경의 섬유-광학 번들을 대천문으로 4mm 후방 및 중선으로부 4mm 측부의 두개골 상에 정위로 위치시켰다. 두개골을 냉, 백색 광선(150W)로 20분간 조명하였다. 조명의 처음 1분동안, 염료 로즈 벤갈 (0.133ml/kg체중, 10mg/ml 염수)을 정맥주사로 주입하였다. 모조-수술된 동물들에게도 로즈 벤갈 주입 및 조명을 제외하고는 상기에 기재된 바와 동일한 실험과정을 겪게 했다. 외과수술 후에, 카테터를 제거하고 동물들을 마취로부터 회복되도록 하고, 무제한으로 음식과 물을 주었다.
행동 시험
모든 동물에서 일련의 행동 시험을 허혈 전, 허혈 후 기준일, 2, 3, 4, 5 및 6주에, 실험 그룹을 알지못하는 관찰자들에 의해 수행되었다. 로타로드 시험을 위하여, 래트를 가속화되는 로타로드 실린더 위에 위치시키고 동물들이 로타로드 상에 남아있는 시간을 측정하였다 (Hamm et al, J Neurotrauma 1994 Apr; 11(2): 187-96, Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of imtravenous Administration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerenral Ischemia in Rats. Stroke. 2001;32:1005.). 속도는 5분 내에 4에서 40rpm까지 천천히 증가시켰다. 시도는 만일 동물이 가로대에서 떨어지거나 장치를 잡고 가로대에서 걷기를 시도하지 않고 2연속 회전 동안 주변을 돌면(spin)은 끝냈다. 임의의 시간 제한은 시험 과정뿐만 아니라 훈련과정에서 로타로드 실린더 상에 래트의 500초로 설정했다. 동물들은 허혈 전에 3일간 훈련되었다. 장치 상의 평균 지속시간(초)은 수술 1일전에 3 로타로드 측정으로 기록되었다. 운동 시험 데이터는 내부 기준 대조구 (수술전)에 비교하여 로타로드 상의 평균 지속(3 시도)의 퍼센트로서 나타내었다.
점착-제거 시험을 위하여, 체성감각 결손은 허혈 전 및 후, 둘다에서 측정되 었다 (Schallert T, Kozlowski DA, Humm JL, Cocke RR. Use-dependent structural events in necovery of function. Adv Nerurol. 1997;73:229-238.; Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of Bone Marrow Sromal Cells After Cerebral Ischemaia in Rats. Stroke. 2001;32:1005.). 모든 래트들을 시험 환경에 익숙하게 하였다. 초기 시험에서, 점착-뒷면의 종이 도트의 2개의 작은 조각(같은 크기의, 113.1mm2)을 각각의 앞다리 발목 상에 원심-방사 영역을 차지하는 양측 촉각 자극으로서 사용하였다. 그리고 나서 래트를 케이지로 돌려보냈다. 앞다리로부터 각각의 자극을 제거하기 위한 시간을 각각의 앞발에 대해 하루에 5회로 기록하였다. 개개의 시도는 적어도 5분 간격으로 분리시켰다. 외과수술 전에, 동물을 3일 동안 훈련시켰다. 일단 래트는 10초내에 도트를 제거할 수 있으면, 마취의 대상으로 하였다.
Neurological Severity Scores (NSS)을 Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M (Therapeutic Benefit of Intraveous Administration of Bone Narrow Stromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke. 2001;32:1005., and Schallert T, Kozlowski DA, Humm JL, Coke RR. Use-dependent structural events in recovery of function. Adv Neurol. 1997;73:229-238)에 따라서 변형했다. 신경학상 기능은 0 ~ 16 등급으로 나누었다 (정상 점수: 0; 최대 결손 점수 :16). NSS는 운동, 감각, 반사작용, 및 균형 시험의 조합이다 (Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intracenous Administration of Bone Marrow Srtomal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke. 2001;32:1005., Germano AF, dixon CE, d'Avella D, Hayes RL Tomasello F. Behavioral deficits follwing experimemtal subarachnoid hemirhage in the rat. J Neurotrauma. 1994;11:345-353.). 손상의 심각도 점수에서, 1점은 시험을 수행하기 불능 또는 시험된 반사작용의 부족에 대해 부여되고; 점수가 높을수록 손상 정도가 심하다.
결과
모든 동물에 대한 직장 온도, pH, pCO2, pO2, 헤마토크릿(hct), 혈당, 심장 속도, 평균 동맥압, 체중 및 사망에서 그룹간의 통계적 차이는 관찰되지 않았다 (도시되지 않음).
GCSF 처치된 동물에서 기능적 회복은 모든 그룹들과 비교하여 훨씬 더 좋은 오버 타임(over time)을 가졌다. GCSF 처치된 동물들은 대조구에 비교하여 실험동안 Beam-Balance를 포함하여 상당히 낮은 NSS 점수를 받았고 (p<0.001, 도 8b), 대조구에 비교하여 상당히 더 좋은 로타로드 수행의 결과를 가져왔다 (p<0.05, 도 8a). 점착 테이프 제거에 의해 측정된 감각운동 기능은 또한 대조구에 비교하여 GCSF 처리된 동물의 반대쪽 앞발 오버 타임이 더 좋았고 또한 동측의 앞발에서 6주였다 (도 8c, d 참조).
실시예 7 - GCSF 수용체는 대뇌 허혈의 광혈전증 모델에서 조절되지 않는다
RNA는 래트 피질 반음영 샘플, 손상측면의 동측 및 반대측으로부터 표준 프 로토콜에 따라 분리되었고 (Chomczynski and Sacchi(1987), Anal. Biochem., 162, 156-159), 이어서 Qiagen RNeasyTM 미니 키트 정제가 행해졌다 (조직 샘플의 위치화에 대해 도 9a 참조; 여기서 3 대 4). cDNA를 올리고 dT 프라이머, 표준 조건을 사용하는 전사체 II 역전사효소(Gibco)를 사용하여 1㎍ 총 RNA로부터 생합성하였다. 정량 PCR을 DNA 이중체의 SYBR-그린 염색으로 Lightcycler
Figure 112005034721422-PCT00003
시스템(Roche Diagnostics, Manngein, Germany)을 사용하여 수행하였다. 사이클 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 5분, 95℃에서 5초, 66℃에서 7초, 72℃에서 30초, 84℃에서 9초(55 사이클). 융해 곡선은 다음과 같은 파라미터로 행해졌다: 95℃, 50℃까지 쿨링; 0.2/초로 99℃까지 램핑. 다음의 프라이머 쌍이 사용되었다: "rat GCSFR-frag-32s "
Figure 112005034721422-PCT00004
및 "rat GCSFR-frag-265s "
Figure 112005034721422-PCT00005
. Lightcycler
Figure 112005034721422-PCT00006
PCR을 제조자의 추천에 따라서 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 수행하였다 (Roche Diagnostics). 생성물의 특이성은 융해점 분석 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 보장되었다. 샘플의 cDNA 함량은 스츨로필린의 발현 수준으로 정상화되었다 (프라이머:
Figure 112005034721422-PCT00007
;
Figure 112005034721422-PCT00008
Figure 112005034721422-PCT00009
). 상대적 조절 수준은 시클로필린으로 정상화한 후 유래되었고 모조-수술된 동물과 비교되었다. 도 9b는 반대측 상에 48시간 후 GCSFR의 상향조절을 보이고, 에러 바는 표준 편차를 나타내고, 이들은 3-배 연속적으로 희석된 cDNA-샘플로부터 계산되고 측정의 신뢰성을 반영한 다.
실시예 8 - GCSF 수용체는 1차 배양에서 뉴런성 세포상에 존재한다:
면역세포화학
뉴런의 제조
10-12 피질을 스테이지 E18(배아일 18)의 배아로부터 제조하였다. 조직을 HBSS(Hanks balanced salt solution, Bio Withankker) 중의 트립신[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml](Roche Diagnostics)을 사용하여 분해하였다. 소화를 4부 배지 (신경기본배지 + 1ml 50xB-27 보충물(Invitrogen) + 0.5mM L-글루타민 + 25μM 글루타메이트)를 사용하여 정지시키고 상온에서 5분간 800g으로 원심분리했다. 펠렛을 5ml 배지에 녹이고 세포 수를 계수에 의해 결정했다 (Neubauer slide). 세포를 폴리-L-라이신으로 코팅된 커버슬릿 상에 24-웰-플레이트의 웰당 250 000 세포의 밀도로 플레이트하였다.
면역세포화학
제조 14일 후, 뉴런을 PSB(Gibco)(37℃)로 세척하고 얼음상에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 고정했다. 그리고 나서, 세포를 PBS(4℃)로 세척하고 4℃에서 저장했다. 세포를 PBS중의 50mM 글라이신에서 10분간 인큐베이션하고 그리고 나서 PBS로 세척했다. 세포를 PBS중의 0.2% 트리톤X-100(Sigma)를 사용하여 얼음상에서 침투시켰고, 블로킹 용액(PBS중의 0.2% 트리톤X-100, 4% 정상 염소 혈청(NGS)(Jackson Immunoresearch Laboratories))으로 상온에서 인큐베이션했다. 1차 항체 (마우스 GCSFR의 C-말단에 대한 래빗-항-GCSF-Rezeptor-항체, M-20; sc-694; SantaCruz Biotechnology, Inc)을 1:800(0.1% 트리톤-X100/2% NGS)로 희석하여 사용했고, 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 그리고 나서 세포를 1% NGS/PBS로 세척하고, 실온에서 2차 항체 (항-래빗-FITC, 1:400; dianova)로 30분간 인큐베이션했다. 그리고 나서 세포를 1% NGS/PBS로 간략히 세척하고, 핵을 대조염색하기 위해 Hoechst 33342(Molecular Probes)(PBS중의 1:10000)으로 염색했다. 마지막으로, 커버슬릿을 1% NGS/PBS로 2번 간단히, PBS에서 2번, 그리고 10mM Tris/HCl(pH 7,6)에서 10분동안 한번 세척했다. 커버슬릿을 Aquamount (Polyscience)를 사용하여 임배드했다. 사진을 Olympus IX81 현미경 및 "Analysis" 소프트웨어 팩키지 (Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)로 디지털적으로 얻었다.
실시예 9 - GCSF 수용체는 뉴런성 줄기세포 상에 존재한다: PCR 및 면역세포화학 (도 12, 13); GCSF 수용체는 PC12 세포상에 존재한다: PCR (도 2B)
뉴런성 줄기세포의 생성
줄기세포를 알려진 자발적 신경세포발생에 의해 4-6주령 수컷 위스터 래트의 뇌 영역 즉, 해마상융기, 우각신경 벌브 및 뇌실하 영역(subventricular zone)으로부터 기재된 바와 같이 (Ray J et al(1993), Proc Natl Acad Sci U S A 90:3602-6.) 단리하였다. 프로토콜을 미국의 National Research Council에 의해 승인된 바와 같이, 동물의 사용에 대한 정책에 일치시켰고, 독일법의 요건에 충족한다. 간략히, 동물들을 1%(v/v) 이소플루란, 70% N2O, 29% 산소로 마취시키고 참수로 사살했다. 뇌를 제거하고 4.5g/L 글루코스 (DPBS/Glc)로 보충된 50ml 얼음-냉장 둘베코 인산염 완충된 염수(DPBS)에서 세척했다. 6마리 유래의 해마상융기, 우각신경 벌브 및 뇌실하 영역을 해부해 내고 10ml DPBS/Glc에서 세척하고 4에서 5분간 1600xg로 원심분리 했다. 상등액을 제거한 후, 조직을 가위와 수술용 메스로 동질화하였다, 조직 조각을 DPBS/Glc 배지로 5분간 800g에서 5분간 세척하고 3 펠렛을 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 중의 0.01%(w/v) 파파인, 0.1%(w/v) 디스파제 II (천연 프로테아제), 0.01%(w/v) DNaseI, 및 12.4mM 황산망간에 재현탁했다. 조직을 플라스틱 피펫 팁으로 가루로 만들고 상온에서 40분동안 인큐베이션 했고, 10분마다 용액을 잘 혼합했다. 현탁액을 4℃에서 5분간 800xg로 원심분리했고, 펠렛을 2mL 글루타민, 100 유니트/mL 페니실린 및 100 유니트/mL 스트렙토마이신이 보충된 10mL DMEM-Ham's F-12 배지로 3번 세척했다. 그리고 나서, 세포 펠렛을 B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2mM L-글루타민, 100유니트/mL 페니실린 및 100 유니트/mL 스트렙토마이신, 20ng/mL EGF, 20ng/mL FGF-2, 및 2㎍/mL 헤파린이 보충된 1mL 신경기본 배지에 재현탁했다. 세포를 25,000-100,000 세포/mL의 농도로 6-웰 디쉬에 멸균 조건하에 플레이트하였다. 디쉬를 5% CO2에 37℃에서 인큐베이션했다. 세포 배양 배지를 1주일에 한번 교환했고, 여기서 배지의 약2/3가 대체되었다 (Ray J et al(1993), Proc Natl Acad Sci U S A 90: 3602-6.).
RT-PCR 프로토콜
RNA를, 제조자의 추천(RNeasy kit, Qiagen)에 따라서 냉동된 스톡으로부터 해마상융기 줄기세포를 해동한 후 배양으로 3주간 증식시킨, 해마상융기 줄기세포( 도 12)로부터 표준 프로토콜에 따라 단리하였다. cDNA를 표준 조건을 사용하는, 올리고dT 프라이머, 수퍼스크립트 II 역전사효소 (Gibco)를 사용하여 생합성하였다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 다음의 사이클 조건으로 수행하였다: 94℃에서 3분, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분 (32 사이클), 프라이머 쌍 "rat GCSFR-frag-8s"
Figure 112005034721422-PCT00010
및 "rat GCSFR-frag-287as"
Figure 112005034721422-PCT00011
을 사용. 프라이머들은 TBLASTX 서치에 의한 래트 게놈 데이타베이스로부터 확인된 래트 GCSFR의 단편으로부터 유래되었다 (도 11 참조). 반응 조건: 2mM MgCl2, 200μM dNTP, 200mM의 각각의 프라이머, 1 유니트 Taq 폴리머라제 (Introgen)/25㎕. PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔 상에 분해(resolve)했다. 특이적 PCR 생성물은 279bp 길이며 다음과 같은 서열을 가졌다 (SEQ ID NO:4) (프라이머 서열은 밑줄쳐져 있다)
Figure 112005034721422-PCT00012
PC12 세포 상의 PCR을 위해(도 2B), 상기 프로토콜이 이어졌다.
신경구의 면역세포화학
뉴런성 줄기세포로 구성되는 신경구(neurosphere)를 글라스 슬라이드 상에 피펫팅하고, 커버슬릿을 세포 위에 덮고, 슬라이드를 적어도 30분간 -80℃에 두었 다. 커버슬릿을 제거하고 즉시 pH 7.4의 0.1M 인산염 완충액 중의 4% PFA(파라포름알데히드)에 두었다. 세포를 20분 동안 고정시켰다. 세포를 1% FCS 및 0.02% NaN3를 갖는 PBS (pH 7.4)에서 5분간 3번 세척하였다. 세포를 0.5% TX-100을 함유하는 PBS 중에서 10분동안 투과시켰다. 항원을 1% FCS 및 0.02% NaN3 함유하는 PBS(pH 7.4)에서 60분간 블록킹했다. 세포를 PBS 중의 0.001mg/ml 농도로 핵 염료 DAPI로 12분간 염색했다. 그리고 나서 세포를 1% FCS 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS(pH 7.4)로 5분간 2회 세척하였다. 제1 항체를 1% FCS 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS(pH 7.4)로 다음과 같은 농도로 각각 희석되게 2시간 동안 적용하였다: 항-G-GSF 1:1000, 항-G-CSF-R 1:1000, 항-GM-CSF-R 1:1000 (santa cruz). 세포를 1% FCS 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS(pH 7.4)로 5분간 3번 세척하였다. 그리고 나서 제2 항체 (염소 항-래빗 IgG-FITC, (DAKO))를 1% FCS 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS(pH 7.4)에 1:30의 농도로 60분간 적용하였다. 세포를 1% FCS 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS(pH 7.4)로 5분간 3번 세척하였다. 마지막으로 세포를 Aquamount 및 커버슬릿으로 정착시켰다.
실시예 10 - GMCSFR 알파는 대뇌 허혈의 광혈전증 모델에서 조절되지 않는다 (RMDD에 의해 발견)
실험 프로토콜은 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다. 수컷 위스터 래트 (Charles River, Germany) (280 내지 320g 체중)을 다음과 같은 처치 그룹으로 할당하였다: a) 다양한 시점에서 허혈 (6, 48 및 21일); b) 모조 수술, 대응 시점에 허혈 없음 (6, 48 및 21일), 각각의 시점 및 처치에 대해 n = 2.
광혈전증에 의한 국소 대뇌 허혈
동물들을 케타민히드로클로라이드 (WDT, Garbsen, Germany) 100mg/kg체중의 근육내 주사로 마취시켰다. 마취는 필요에 따라서 50mg/kg체중으로 유지하였다. PE-50 폴리에틸렌 튜브를 평균 동맥혈압 및 혈액 가스의 연속적인 모니터를 위하여 오른쪽 대퇴부 동맥에 삽입하였다. 오른쪽 대퇴부 정맥을 처치 주입을 위해 PE-50으로 캐뉼라화했다. 실험 동안 직장 온도를 모니터했고, 정온적으로 조절된 열 패드 (Fohr Medical Intruments, Germany)에 의해 37℃로 유지하였다.
광혈전증 허혈을 Watson BD, Dietrich WD, Busto R, Wachtel MS, Ginsberg MD (Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 1985;17:497-504.)의 방법에 따라서 오른쪽 래트 정수리 피질에 유도하였다. 동물을 케타민히드로클로라이드로 마취시키고 정위 프레임에 두고, 두개골을 노출시키기 위해 머리가죽을 절개했다. 조명을 위해, 1.5mm 구경의 섬유-광학 번들을 대천문으로 4mm 후방 및 중선으로부 4mm 측부의 두개골 상에 정위로 위치시켰다. 두개골을 냉, 백색 광선(150W)로 20분간 조명하였다. 조명의 처음 2분동안, 염료 로즈 벤갈 (0.133ml/kg체중, 10mg/ml 염수)를 정맥주사로 주입하였다. 모조-수술된 동물들에게도 로즈 벤갈 주입 및 조명을 제외하고는 상기에 기재된 바와 동일한 실험과정을 겪게 했다. 외과수술 후에, 카테터를 제거하고 동물들을 마취로부터 회복되도록 하고, 무제한으로 음식과 물을 주었다. 동물들을 다양한 시점에 (각각 허혈 및 모조 수술 후 6, 48, 및 21일) 사살하고, 동측 및 반대측 의 반음영 피질을 당업자에 알려져 있다.
RNA 단리 및 RMDD
RNA를, 표준 프로토콜 (Chomczynski and Sacchi(Anal Biochem(1987), 162, 156-9), followed by Qiagen RNeast mini kit purification)에 따라서 손상 부위에 동측 및 반대측의, 래트 피질 반음영 샘플로부터 단리하였다. cDNA 합성은 RMDD (restrictionn mediated differential display) - EP 0 743 367 A2 및 US 5,876,932에 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라서 총 1㎍ RNA로부터 수행되었다. 제1 스트랜드 및 제2 스트랜드 합성, 및 MboI 소화에 이어서, 어댑터 결찰을 행했다. 프라이머 조합의 서브셋으로 2개의 PCR 반응을 행하였다. 연이어서, PCR 반응을 변성 겔상에 로딩하였고, 나일론 막 상에 블롯하였다 (GATC Biotech AG, Konstanz, Germany). 비오틴-라벨된 밴드를 통상의 스트렙타비딘-퍼옥시다제 반응으로 가시화했다. 피질 반음영으로부터 PCR 샘플을 다음의 순서로 겔상에 로딩하였다: 동측; 천연(비처리), 모조 6시간, 모조 48시간, 모조 21일, 및 광혈전증 6시간, 48시간 및 21시간; 반대측: 모조 6시간, 모조 48시간, 모조 21일, 및 광혈전증 6시간, 48시간 및 21일. 동측 및 반대측 영역에서 상이한 강도를 갖는 밴드를 나일론 막으로부터 절단해 내고, 동일한 PCR 생성물의 재증폭을 수행했다. 증폭된 생성물을 pCR-BluntII-TOPO 벡터 (Invitrogen Gmbh, Karlsruhe)에 클론하고 T7 및 M13rev 프라이머 (ABI3700)로 서열화했다. 얻어진 서열을 EMBL-데어터베이스와 비교했다. 48시간 후 동측 및 반대측 피질 반음영에서 조절되지 않은 서열을 확인했다 (도 14). 확인된 EST-서열을 EST-데이터베이스에서 BLASTN-조사로 확장하고, 마 우스 GM-CSFR 알파를 코딩하는 마우스 상동성 서열을 검색 프로그램 (BLAST, TBLASTN(Altschul, et al.(1997), Nucleic Acids Res, 25, 3389-402.))을 사용하여 EST- 및 게놈성 데이터베이스 (ensembl; www.ensembl.org)에서 확인하였다.
검색은 얻어진 래트 서열을 확증하기 위해 세퍼드의 PCR 클로닝 방법 ((1997)Nucleic Acids Res 25:3183-3185)으로 래트 cDNA 라이브러리에서 수행하였다. 이 방법은 비오틴-커플된 올리고뉴클레오티드 서열로 플라스미드 라이브러리로부터 유래된 cDNA 분자의 혼성화에 기초된다. 스트렙타비딘-커플된 자기 비드로 플라스미드 추출 후, 결과를 진단 PCR 및 단일 클론이 회수될때 까지, 얻어진 플라스미드의 재형질전환에 이어서 단계들의 2배 복제에 의해 보증했다. 다음의 프라이머 조합을 사용하였다:
Figure 112005034721422-PCT00013
(ORF를 단일 클론에 대해 결정하고 서열을 SEQ ID NO:40에 도시하고, 대응하는 아미노산 서열을 SEQ ID NO:41에 도시한다).
실시예 11 - GMCSF 수용체 알파는 대뇌 허혈의 광혈전증 모델에서 조절되지 않는다 (정량 PCR에 의해 입증)
RNA를, 표준 프로토콜 (Chomczynski and Sacchi(Anal Biochem(1987), 162, 156-9), followed by Qiagen RNeast mini kit purification)에 따라서 손상 부위에 동측 및 반대측의, 래트 피질 반음영 샘플로부터 단리하였다 (조직 샘플의 국소화에 대해 도 13a 참조; 여기서 3 대 4). cDNA를 표준 조건을 사용하는, 올리고dT 프라이머, 수퍼스크립트 II 역전사효소 (Gibco)를 사용하여 총 1㎍ RNA로부터 생합성하였다. 정량 PCR을 DNA 이중 스트랜드의 SYBR-그린 염색으로 Lightcycler system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행하였다. 사이클 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 5분, 95℃에서 5초, 62℃에서 7초, 72℃에서 30초; 80℃에서 9초 (50 사이클). 융해 곡선은 다음의 파라미터로 행해졌다: 95℃, 50℃로 냉각; 0.2℃/초로 99℃로 램핑. 다음의 프라이머 쌍이 사용되었다: "rat BR4-4s96"
Figure 112005034721422-PCT00014
, 및 "rat BR4-4as272"
Figure 112005034721422-PCT00015
. LightcyclerTM PCR을 제조자의 추천 (Roche diagnostics)에 따라서 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 수행하였다. 생성물의 특이성을 융해점 분석 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 보증했다. 샘플의 cDNA 함량을 시클로필린의 발현 수준으로 정상화했다 (프라이머:
Figure 112005034721422-PCT00016
Figure 112005034721422-PCT00017
Figure 112005034721422-PCT00018
). 상대적 조절 수준은 스츨로필린에 정상화 및 모조-수술된 동물에 비교 후에 유래되었다. 도 14a는 48시간 후 동축 및 반대측 상의 GMCSFR 알파의 비조절을 보여준다. 광혈전증의 유도 21일 후, 검출되는 분명한 조절은 없다 (도 14b). 에러 바는 표준편차를 나타내고, 3배 연속 희석된 cDNA-샘플로부터 계산했고, 측정의 신뢰성을 반영한다.
실시예 12 - GMCSF-수용체 알파는 1차 피질 배양에서 뉴런성 세포상에 존재한다: 뉴런의 제조
10-12 피질을 스테이지 E18(배아일 18)의 배아로부터 제조하였다. 조직을 HBSS(Hanks balanced salt solution, Bio Withankker) 중의 트립신[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml](Roche Diagnostics)을 사용하여 분해하였다. 소화를 4부 배지 (신경기본배지 + 1ml 50xB-27 보충물(Invitrogen) + 0.5mM L-글루타민 + 25μM 글루타메이트)를 사용하여 정지시키고 상온에서 5분간 800g으로 원심분리했다. 펠렛을 5ml 배지에 녹이고 세포 수를 계수에 의해 결정했다 (Neubauer slide). 세포를 폴리-L-라이신으로 코팅된 커버슬릿 상에 24-웰-플레이트의 웰 당 250 000 세포의 밀도로 플레이트하였다.
면역세포화학
제조 1주일 후, 뉴런을 PSB(Gibco)(37℃)로 세척하고 얼음상에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 고정했다. 그리고 나서, 세포를 PBS(4℃)로 세척하고 PBS중의 50mM 글라이신에서 10분간 인큐베이션하고 그리고 나서 PBS로 세척했다. 세포를 PBS중의 0.2% 트리톤X-100(Sigma)를 사용하여 얼음상에서 침투시켰고, 블로킹 용액(PBS중의 0.2% 트리톤X-100, 4% 정상 염소 혈청(NGS)(Jackson Immunoresearch Laboratories))으로 상온에서 인큐베이션했다. 1차 항체 (마우스 GCSFR의 C-말단에 대한 래빗-항-GCSF-Rezeptor-항체, M-20; sc-691; SantaCruz)를 1:300(0.1% 트리톤-X100/2% NGS)로 희석하여 사용했고, 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 그리고 나서 세포를 1% NGS/PBS로 세척하고, 실온에서 2차 항체 (항-래빗-FITC, 1:400; dianova)로 30분간 인큐베이션했다. 그리고 나서 세포를 1% NGS/PBS로 간략히 세척하고, 핵을 대조염색하기 위해 Hoechst 33342(Molecular Probes)(PBS 중의 1:10000)으로 염색했다. 마지막으로, 커버슬릿을 1% NGS/PBS로 2번 간단히, PBS에서 2번, 그리고 10mM Tris/HCl(pH 7,6)에서 10분동안 한번 세척했다. 커버 슬릿을 Aquamount (Polyscience)를 사용하여 임배드했다. 사진을 Olympus IX81 현미경 및 "Analysis" 소프트웨어 팩키지 (Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)으로 디지털적으로 얻었다.
실시예 13 -GMCSF 수용체는 뉴런성 줄기세포에 존재한다: 뉴런성 줄기 세포의 생성 (도 13)
줄기세포로 알려진 자발적 신경세포발생에 의해 4-6주령 수컷 위스터 래트의 뇌 영역 즉, 해마상융기, 우각신경 벌브 및 뇌실하 영역으로부터 기재된 바와 같이 (Ray J et al(1993), Proc Natl Acad Sci U S A 90:3602-6.) 단리하였다. 프로토콜을 미국의 National Research Council에 의해 승인된 바와 같이, 동물의 사용에 대한 정책에 일치시켰고, 독일법의 요건에 충족한다. 간략히, 동물들을 1%(v/v) 이소플루란, 70% N2O, 29% 산소로 마취시키고 참수로 사살했다. 뇌를 제거하고 4.5g/L 글루코스 (DPBS/Glc)로 보충된 50ml 얼음-냉장 둘베코 인산염 완충된 염수(DPBS)에서 세척했다. 6마리 유래의 해마상융기, 우각신경 벌브 및 뇌실하 영역을 해부해 내고 10ml DPBS/Glc에서 세척하고 4℃에서 5분간 1600xg로 원심분리 했다. 상등액을 제거한 후, 조직을 가위와 수술용 메스로 동질화하였다, 조직 조각을 DPBS/Glc 배지로 5분간 800g에서 5분간 세척하고 3 펠렛을 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 중의 0.01%(w/v) 파파인, 0.1%(w/v) 디스파제 II (천연 프로테아제), 0.01%(w/v) DNaseI, 및 12.4mM 황산망간에 재현탁했다. 조직을 플라스틱 피펫 팁으로 가루로 만들고 상온에서 40분동안 인큐베이션 했고, 10분마다 용액을 잘 혼합했다. 현탁액을 4℃에서 5분간 800xg로 원심분리했고, 펠렛을 2mL 글루타민, 100 유니트/mL 페니실린 및 100 유니트/mL 스트렙토마이신이 보충된 10mL DMEM-Ham's F-12 배지로 3번 세척했다. 그리고 나서, 세포 펠렛을 B27(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2mM L-글루타민, 100유니트/mL 페니실린 및 100 유니트/mL 스트렙토마이신, 20ng/mL EGF, 20ng/mL FGF-2, 및 2㎍/mL 헤파린이 보충된 1mL 신경기본 배지에 재현탁했다. 세포를 25,000-100,000 세포/mL의 농도로 6-웰 디쉬에 멸균 조건하에 플레이트하였다. 디쉬를 5% CO2에 37℃에서 인큐베이션했다. 세포 배양 배지를 1주일에 한번 교환했고, 여기서 배지의 약2/3가 대체되었다 (Ray J et al(1993), Proc Natl Acad Sci U S A 90: 3602-6.).
RT-PCR 프로토콜
RNA를, 제조자의 추천(RNeasy kit, Qiagen)에 따라서 냉동된 스톡으로부터 해마상융기 줄기세포를 해동한 후 배양으로 3주간 증식시킨, 해마상융기 줄기세포로부터 표준 프로토콜에 따라 단리하였다. cDNA를 표준 조건을 사용하는, 올리고dT 프라이머, 수퍼스크립트 II 역전사효소 (Gibco)를 사용하여 생합성하였다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 다음의 사이클 조건으로 수행하였다: 94℃에서 3분, 94℃에 서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분 (32 사이클), 프라이머 쌍 "rat BR4-4s96"
Figure 112005034721422-PCT00019
및 "rat BR4-4as272"
Figure 112005034721422-PCT00020
을 사용. 반응 조건: 2mM MgCl2, 200μM dNTP, 200mM의 각각의 프라이머, 1 유니트 Taq 폴리머라제 (Introgen)/25㎕. PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔 상에 분해(resolve)했다. 특이적 PCR 생성물은 176bp 길이며 다음과 같은 서열을 가졌다(프라이머 서열은 밑줄쳐져 있다) :
Figure 112005034721422-PCT00021
실시예 14 - 혈청 반감기 및 혈액 뇌 장벽을 통한 GCSF/GM-CSF의 통과를 결정하기 위한 분석
GCSF 및 GMCSF가 혈액-뇌 장벽의 통과여부를 알기 위함이다. GCSF/GM-CSF를 뇌 조직에서 케모킨의 검출을 위한 매우 민감한 아비딘-비오틴 상호작용의 사용을 만들기 위해 비오틴화했다. G-CSF (Neupogen, Amgen)를 비오틴-XX-SE(Molecular Probes B 1606)을 사용하여 비오틴화 했다. G-CSF를 250mM 솔비톨 및 0.004% 트윈-80을 갖고 비오틴-XX-SE 첨가된 pH 8의 20mM 탄산나트륨 완충액으로 희석시켰다. 상온에서 1시간 후, 트리스 완충액(pH 8)을 비반응된 라벨링 시약을 억제하기 위해 50mM 농도로 첨가했다. 셈플을 응집물을 제거하기 위해 TLA110 로터 (Beckman Instruments)에서 45000rpm으로 30분간 스핀하였다.
7.5㎍ 비오틴화된 G-CSF를 0 시간에 마우스에게 복강내로 주입하였다 (250mM 솔비톨 및 0.004% 트윈-80을 갖는 pH 8의 20mM 탄산나트륨 완충액 200㎕에서). 마우스를 지시된 시간에서 클로랄하이드레이트로 마취하고 혈액 샘플 (약 200㎕)을 우심방으로부터 취했다. EDTA를 5mM로 첨가하고 샘플을 혈청을 얻기 위해 1000g에서 10분간 원심분리 했다. 4x 샘플 완충액을 혈청에 첨가하고 단백질을 95℃에서 5분간 가열하여 변성시키고 미니겔에 20㎕ 적용하였다. 단백질을 니트로셀룰로스에 전달시키고 블록시키고 TBST 중의 스트렙타비딘-HRP (Amersham)으로 인큐베이션 했다. 세척 후, 신호를 Pierce Supersignal 화학발광 시약으로 검출했다.
Elisa 분석 혈청 샘플을 분석 완충액에서 1:20으로 희석하고, 제조자 지침(IBL, Hamburg, Germany)에 따라서 분석을 행했다.
이 분석은 혈액-뇌-장벽을 넘는 GCSF의 전이를 결정하기 위해 뇌척수액(csf) 또는 뇌 동질물에 따라서 적합될 수 있다.
실시예 15: GCSF, GMCSF의 신경보호 작용에 대해 분석 (도 1b)
GCSF/GMCSF의 신경보호 작용을 생체외에서 NGF-처리된 PC12 세포상에서 결정했다. PC12 세포를 폴리-l-라이신(0.01% 최종 농도)으로 코팅된 96 웰 플레이트에 40,000세포/웰의 밀도로 시딩했다. 세포를 1000mg 글루코스/l 및 10% HS (말 혈청) 5% FCS (태아 소 혈청), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 유지하였다. 그리고 나서 세포를 제조자의 추천에 따라서 Lipofectamine2000
Figure 112005034721422-PCT00022
트랜스펙션 시약 (Gibco BRL)(0.2㎍DNA/웰)을 사용하여 pSV20-RL (renilla 루시퍼라제 유전자를 코딩하는)로 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션 후 즉시, NGF(신경 성장 인자)를 PC12 세포의 분화를 유도하기 위해 40ng/ml의 농도로 첨가했다. 처리 24시간 후, PC12 세포는 연장된 프로세스를 갖는 뉴런-같은 형태로 발달한다. 그리고 나서, 세포를 변화하는 농도의 H2O2 (도 1b), 및 변화하는 농도(1-100ng/ml)의 GCSF로 처리했다. EPO를 생체외에서 알려진 신경보호능을 갖는 물질 (Cerami, et al.(2002), Nephrol Dial Transplant, 17, 8-12, Kawakami, et al.(2001), J Biol chem, 276, 39469-75., Sinor and Greenberg(2000), Neurosci Lett, 290, 213-5., Chongg, et al.(2002), J Cereb Blood Flow Metab, 22, 503-14.)에 대한 양성 대조구로서 0.O1U/ml 내지 1U/ml의 농도로 첨가했다. 24시간 후, 배지 상등액을 버리고, 세포를 수동 용해 완충액 (Promega)을 사용하여 용해했다. 그리고 나서 renilla 루시퍼라제 활성을 발광계측기 (Mithras)로 기록하고, 해독은 상대적인 빛 유니트로 표현되었다. 이 분석은 검출가능한 루시퍼라제 양으로서 세포 생존을 측정한다. 그러므로, 상대적 빛 유니트가 높을 수록, 더 많은 세포가 생존되어 있다. 이 분석에서, GCSF는 에리트로포이에틴 보다 더 유력한, PC12 세포의 용량-의존 신경보호를 보였다.
실시예 16-GCSF 수용체는 신경학적 질병에 중요한 다양한 뇌 영역에 발현된다(도 4); GMCSF는 다양한 중요 뇌 영역에 발현된다(도 19).
정상 마우스 뇌 내의 GCSF 수용체의 분포를 조직적으로 측정하기 위하여 C57/b16 마우스(2-3월령)를 Rompun®과 Ketanest®의 i.p. 주사를 사용하여 마취시 켰다. 그 다음 마우스에 20ml 행크스 균형 염 용액(HBSS), 그 다음에 PBS(pH7.4) 중의 4% 파라포름알데히드(PFA) 20ml를 심장을 통하여 관류시켰다. 뇌를 절개해 내어, 2% PFA 용액에 밤새 보존하였다. 파라핀-삽입 조직을 절개하고(2㎛), 미리 처리된 슬라이드(DAKO, Glostrup, 덴마크)에 배접시키고, 밤새 공기 중에서 건조시킨 다음 파라핀 제거되었다. 마이크로파 처리 후(구연산 완충액; 500W, 10분), 항-GCSFR 항체(1:400)가 적용되고, 조직은 수분 챔버 내 상온에서 1 시간 동안 배양되었다. 항체 표지는 일반적인 ABC 기술 및 색원체로서 DAB를 사용하여 제조자 추천사항(DAKO, Glostrup, 덴마크)에 따라 노출되었다. 적절한 정상 혈청(Dianova, Hamburg, 독일)이 사용되는 절편 뿐만 아니라 일차 항체가 완전히 생략되었던 유사 가공된 절편이 음성 대조군으로 포함되었다. GCSF-R의 배치가 CA3과 CA2 영역 사이의 선명한 경계를 가지고(도 4c, 화살표), CA3 영역 내 뉴런의 우세적인 염색으로(도 4a,b) 해마 내에서 관찰되었다(도 4a-d). GCSF-R이 체세포 및 뉴런의 돌기에 거쳐 분포된다(도 4b, 화살표). 수용체는 신문(hilus) 및 치상돌기 회의 기부 세포층 내에 존재한다(도 4d, 화살표). GCSF 수용체는 대뇌피질 영역: 예를 들면 이상엽 피질(도 4e), 및 후각 주위 피질(f)에서도 감지되었다. 소뇌에서는 푸르키니에 세포가 표지되었다(도 4g, 화살표). 또한, 후각구 내 큰 승모판 세포 중 일부는 GCSF-R 양성이다(도 4h, 화살표). 진한 염색은 연수 내 전방 컬럼에 의하여 나타났으며(도 4i, j), 더 많은 증식은 GCSF-R 양성으로서 큰 운동 뉴런을 나타낸다(도 4k, l). 신경 돌기는 매우 강하게 표지된다는 점을 주목하라. 중뇌에서, 흑색질 내 뉴런은 GCSF-R 양성을 나타낸다(도 4 m,n,o). 뉴런과 별도로, 예를 들면, 전방 횡 연합 신경 내에서 백색질 트랙내 희돌기 세포(oligodendrocyte)가 염색된다(도 4p, 화살표).
동일한 예가 GMCSFR의 배치에 적용된다(도 19). 여기서, 염색은 해마, 대뇌 피질, 소뇌, 및 외측내실 맥락얼기(choroid plexus)에서 나타났다. 중뇌 및 연수는 아직 조사되지 않았다.
실시예 17: GCSF, GMCSF의 신경 방어 작용 분석 (도 1b, 도 23)
GCSF/GMCSF의 신경 방어 작용이 NGF-처리된 PC12 세포에서 인 비트로로 측정되었다. PC12 세포는 40,000 세포/웰의 밀도로 폴리-l-라이신(0.01% 최종 농도)으로 코팅된 96웰 플레이트로 접종되었다. 세포는 1000mg 포도당/l 및 10% HS(말 혈청), 5% FCS(태아 송아지 혈청), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 보존되었다. 그 다음 세포는 리포펙타민2000(Lipofectamine2000®) 트란스펙션 시약(Gibco BRL)(0.2㎍ DNA/웰)을 사용하여 pSV40-RL(레닐라 루시퍼라아제 유전자를 코드함)로 감염되고, 제조자 추천사항을 따랐다. 트란스펙션 직후, NGF(신경 성장 인자, Nerve Growth Factor)가 PC12 세포의 분화를 유도하기 위하여 40ng/ml의 농도로 첨가되었다. 처리 24시간 후에, PC 12세포는 연장된 돌기를 갖는 뉴런같은 형태로 발전되었다. 그 다음 세포는 다양한 농도의 H2O2(도 1b, 도 23), 및 다양한 농도의 GCSF와 GMCSF(1-100ng/ml)로 처치되었다. EPO는 인 비트로에서 공지된 신경세포 보호능을 갖는 물질용 양성 대조군으로서 0.01U/ml 내지 1U/ml(도 1b) 또는 0.5U/ml(도 23)의 농도로 첨가되었다(Cerami et al. (2002), Nephrol Dial Transplant, 17, 8-12,. Kawakami et al. (2001), J Biol Chem, 276, 39469-75., Sinor and Greenberg (2000), Neurosci Lett, 290, 213-5., Chong et al.(2002), J Cereb Blood Flow Metab, 22, 503-14). 24시간 후, 중간 상징액이 폐기되고, 세포가 수동 용해 완충액(Promega)을 사용하여 용해되었다. 그 다음 레닐라 루시퍼라아제 활성을 발광측정기(Mithras, Berthold)에서 기록하고, 판독을 상대적 광 유니트로 나타내었다. 이 분석법은 감지가능한 루시퍼라아제 양으로 세포 생존을 측정한다. 따라서, 상대적 광 유니트가 높을 수록 더 많은 세포가 살아있는 것이다. 이 분석법에서, GMCSF와 GCSF는 에리트로포이어틴보다 더 강력한 PC12 세포의 투여량 의존적 신경세포보호를 나타내었다.
실시예 18: 혈전색전성 뇌 허혈(thrombembolic cerebral ischemia)
실험 프로토콜은 지방 윤리 위원회에 의하여 승인될 것이다. 280 내지 320g의 40마리 수컷 위스타 래트(Charles River, 독일)를 다음과 같은 군으로 랜덤하게 할당할 것이다: A) 혈전색전성 혈관 폐색 1시간 후, 1시간 동안 10mg rt-PA/kg 체중으로 조기 혈전 용해; B) 혈전색전성 혈관 폐색 3시간 후, 1시간 동안 10mg rt-PA/kg 체중으로 후기 혈전 용해; C) 혈전 용해 없음, 그러나 혈전 색전성 허혈 후 30분부터 90분 동안 0.9%의 식염수 2ml 중의 재조합 G-CSF(Neupogen®, Amgen, Europe B.V., 네덜란드)를 60㎍/kg 체중으로 처리함; D) 혈전 색전성 혈관 폐색 3시간 후 1시간 동안 10mg rt-PA/kg 체중으로 후기 혈전 용해와 조합시킨 혈전 색전성 허혈 30분 후부터 90분 동안 0.9%의 식염수 2ml 중의 재조합 G-CSF(Neupogen®, Amgen, 유럽 B.V., 네덜란드)를 60㎍/kg 체중으로 처리함.
동물들을 염산 케타민(WDT, Garbsen, 독일) 100mg/kg 체중으로 복막내 주사하여 마취시킬 것이다. 필요하다면, 마취제는 50mg/kg 체중으로 유지될 것이다. PE-50 폴리에틸렌 튜브는 평균 동맥 혈압, 혈관 가스, 적혈구 용적, 백혈구수, 및 혈당 수준을 지속적으로 관찰하기 위하여 오른쪽 대퇴부 동맥으로 삽입될 것이다. 오른쪽 대퇴부 정맥은 치료제 주입을 위하여 PE-50 튜브가 삽입될 것이다. 실험 동안, 직장 온도가 관찰되고, 자동온도조절 열 패드(Fohr Medical Instruments, 독일)에 의하여 37℃로 유지될 것이다.
혈전색전성 뇌졸중이 Busch et al(Brain Res 1997 Dec 5;778(1):16-24)에 의하여 개시된 수정된 방법에 따라 유도될 것이다. 간략하게는, 오른쪽 총경동맥(CCA), 내부 경동맥(ICA) 및 외부 경동맥(ECA)이 목의 중앙선 절개를 따라 노출될 것이다. 더 절개하여 날개구개 동맥(PPA)의 기원을 동정한다. ECA와 PPA는 6-0 실크 봉합사에 의하여 영구적으로 결찰될 것이다. CCA는 색전술 기간 동안만 일시적으로 결찰될 것이다. 카테터가 결찰부에 인접한 ECA로 삽입되고 12개의 적혈구 응혈(각각 직경 0.35mm, 길이 3mm)이 주입되어 오른쪽 중뇌동맥(MCA)의 색전을 일으킨다.
경색 진전은 확산-, 관류-, 및 T2-강조 이미지화를 이용함으로써 1, 2, 4, 및 24시간에 MR-이미지에 의하여 관찰될 것이다. 모든 동물에서, 허혈 후 24시간에 5점 스케일을 기준으로 신경학적 결과뿐만 아니라 사망율에 의하여 결과가 관찰될 것이다. 허혈 24시간 후, 래트는 케타민 150mg/kg 체중으로 마취되고, 참수될 것이 다. 뇌가 제거되고, 24시간 동안 0.1mol/l 인산 완충액 중 4% 파라포름알데히드로 고정될 것이다. 파라핀 주입 후, 1-㎛-두께 절편이 잘라져, TTC, H&E, 및 Nissl 염색과 면역 조직화학적 분석을 위하여 사용될 것이다.
통계적 분석
값은 평균±SD가 될 것이다. 모든 자료를 얻은 다음, 랜덤화 코드가 알려질 것이다. ANOVA 및 이어지는 사후검증 Fisher 보존된 최소 유의차 검정이 생리적 매개변수와 경색 용적과 같은 연속 변수에서 차이의 통계적인 유의성을 결정하는데 사용될 것이다. 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정은 사망율과 같은 비 매개변수적 자료를 위하여 실행될 것이다. 0.05 미만의 p 값이 통계적으로 유의하다고 여겨질 것이다.
실시예 19: G-CSF는 중뇌동맥 폐색(MCAO), 설치류 뇌졸중 모델에 연장된 시간대에서 주어질 때 효과적이다.
도 24는 허혈 개시 후 120분에 적용될 때 래트 MCAO 모델에 경색용적 상 G-CSF가 정맥내로 투여되는 효과를 나타낸다. 실험은 마취가 흡입 마취제(1% 할로탄, 30% O2, 및 70% N2O)에 의하여 유도된 것을 제외하고는 실시예 1에 개시된 바와 같이 행해졌다. 또한, 여기서 래트의 kg 체중 당 60㎍ G-CSF(Neupogen®, Amgen) 투여량이 사용되었다. TTC-염색에 의한 경색 용적과 비교할 때 유의적인 보호가 나타났다(도 25). 실시예 1의 경우처럼 다른 실험 장비에 효능을 보이는 관찰자의 다른 세트에 의하여 작업이 실시되었다. 또한, 이 실시예는 뇌졸중 및 신경계의 다른 허 혈성 장애를 위한 치료제로서 G-CSF의 유용성을 나타낸다.
실시예 20: 뇌 내의 GCSF 및 그 수용체의 공동배치
사용된 면역 조직화학적 방법
파라핀 주입된 조직 절편(2㎛)을 자이롤로 2×5min, 100% 에탄올로 2×2min 처리한 다음, 에탄올 농도를 96%에서 70%까지 낮춤으로써 탈파라핀화하였다. 최종적으로 상기 절편은 증류수로 세정되고 마이크로파처리되었다(15분 동안 600W에서 구연산 완충액). 그 다음, 이 절편을 증류수로 세정하고, 항원이 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4) 내에 3×5min 차단(block)되었다. 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 희석된 GCSF-수용체 항혈청(SC694; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA: 1:100)이 습기 챔버 내에서 1시간동안 상온에서 배양되었다. 그 다음 절편들을 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)로 3×2min 세정하였다. 그 다음 이차 항체(염소 항-토끼 Fab-FITC, dianova, 1:50)를 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 4℃에서 밤새 처리하였다. 1×TBS(pH7.4) 내 0.2% BSA로 절편을 3×2min 세정한 다음 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 1:100으로 희석된 GCSF 항혈청(SC13102; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 상온에서 1시간 동안 가하였다. 상기한 바와 같이 절편을 3번 세정하고, 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에서 1:200으로 희석된 비오틴화된 염소 항-토끼 IgG(Vector Laboratories, USA)으로 30분 동안 배양하였다. 상기 절편을 다시 세정한 후, TRITC-컨쥬게이트된 스트렙타비딘(디아노바; 1:200)을 상온에서 1.5시간 동안 가하였다. 그 다음, 상기 절편을 1×TBS로 3×2min 세정하고, 1×TBS 내 1:10000으로 희석된 핵 염색제 DAPI로 10분 동안 염색하였다. 최종적으로 이 절편을 1×TBS로 3×2min 세정하고, 형광광도계(Vectashield, Vector Laboratories, USA)용 배접 배지에 배접시켰다. Olympus IX81 현미경 및 "Analysis" 소프트웨어 팩키지(Soft Imaging Systems, Stuttgart, 독일)로 디지탈 사진을 찍었다.
모든 이중-형광광도계 실험은 제2 채널에 어떠한 형광성 운반체도 없다는 것을 조사하는 병행 단일-염색과 대조되었다. 제2 대조로서, 모든 이중 형광광도계 염색이 이차 항체를 위한 전환된 발색단으로 실행되었다.
결과
GCSF 수용체(도 25 a, d, g)가 해마(도 25 a-c 치상돌기 회, d-f 신문)와 피질(도 25 g-i) 양쪽에서 그의 리간드와 공동배치되는 것을 나타낸다. 동일한 뉴런이 수용체와 리간드 모두를 발현한다는 놀라운 발견이 신경계의 신규한 내인성 신경세포보호 시스템을 지지하는 GCSF의 자가분비 신호화 기작을 제안한다.
실시예 21: 뇌 내 GMCSF 수용체와 GCSF 수용체의 공동 편재화
면역 조직화학적 방법
면역 조직화학은 실시예 20에 기재된 바에 따라 실시되었다. GCSFR 항혈청 및 염소 항-토끼 Fab-FITC과 함께 절편을 배양한 후, 상기 절편을 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)로 3×2min 세정하였다. 그 다음 GMCSFR 항혈청(SC690; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1:100)을 상온에서 1시간 동안 가하였다. 비오틴화된 염소 항-토끼 IgG(Vector Laboratories, USA) 및 TRITC-컨쥬게이트된 스트렙타비딘(dianova; 1:200)으로 배양하는 것을 포함하는 그 다음 과정은 실 시예 2에 GCSF 감지를 위하여 개시된 바와 같이 실행하였다.
모든 이중-형광광도계 실험은 제2 채널에 어떠한 형광성 운반체도 없다는 것을 조사하는 병행 단일-염색과 대조되었다. 제2 대조로서, 모든 이중 형광광도계 염색이 이차 항체를 위한 전환된 발색단으로 실행되었다.
결과
GCSF 수용체(도 26 a, d, g) 및 GMCSF 수용체(도 26 b, e, h)가 해마와 피질 양쪽에서 동일한 뉴런에 발현된다(도 26 c, f, i). 도 26은 피질(g-i) 뿐만 아니라 해마의 치상돌기 회(a-c)과 신문(d-f) 내의 뉴런상 수용체와 리간드 모두의 공동 발현을 나타낸다. 또한 이러한 발견은 GCSF와 GMCSF가 신경학적 증상을 치료하기 위하여 복합적으로 사용될 수 있다는 것과, 조혈 인자의 신경세포보호적 특성이 복합 투여에 의하여 향상될 수 있다는 청구항을 설명한다.
실시예 22: GCSF는 뉴런 내 stat3를 활성화함으로써 항-세포자멸적으로 작용한다.
결과
일차 배양된 뉴런은 작용 기작을 분석하는 도구이다. 따라서, 본 발명자들은 G-CSF 수용체가 배양액 내에서 21일 후 해마상 뉴런 또는 피질 뉴런 상에 발현될 수 있는지를 검토하였다. 사실, 본 발명자들은 대부분의 해마상 뉴런 뿐만 아니라 피질 뉴런에도 PCR(이전 실시예)과 면역-세포화학에 의하여 발현을 확인하였다. 뇌졸중 병리 생리학에서 가장 중요한 기작 중 하나는 지연된 뉴런성 세포 사멸(Choi (1996), Curr Opin Neurobiol, 6, 667-72, Schneider et al. (1999), Nat Med, 5, 554-9, Mattson(2000), Nat Rev Mol Cell Biol, 1, 120-9)이다. 따라서, 본 발명자들은 G-CSF가 뉴런 내 세포자멸적 일련의 반응과 간섭할 수 있다는 것을 가정하였다. G-CSF 수용체를 발현하기 위하여 발견되었던 일차 뉴런 배양액에서, 산화질소에의 노출, 뇌 허혈 동안 관련된 사건이 PARP-분해(도시되지 않음)로 증명되는 바와 같이 프로그램화된 세포 사멸에서 투여량-의존적 증가를 이끈다. 도 27에서 예증되는 바와 같이 50ng/ml G-CSF로 처리하는 것은 NOR3 처리 후 세포자멸성 세포 사멸을 현저하게 감소시킨다. 조혈 계통의 세포에서, GM-CSF 수용체는 그의 항-세포자멸 신호를 자누스 키나아제 2(Janus kinase 2: JAK2), 및 신호변환과 변환활성(stat) 단백질(Jak-stat 경로)(예: (Epling-Burnette et al.(2001), J Immunol, 166, 7486-95, Sakamoto et al.(2003), Int J Hematol, 77, 60-70))을 거쳐 전달한다. 본 발명자들이 stat1이나 stat5의 인산화에 의하여 활성을 감지할 수 없는 반면, stat3은 다른 세포형에서 JAK-stat 운동학의 전형적인 시간-의존성 방식(도 27, IV 부분)으로 G-CSF의 첨가에 의하여 강하게 인산화되었다(도 27, V 부분; Kuroki, M. & O'Flaherty, J.T. Extracellular signal-regulated protein kinase (ERK)-dependent and ERK-independent pathways target STAT3 on serine-727 in human neutrophils stimulated by chemotactic factors and cytokines. Biochem J 341(Pt3), 691-6(1999)으로부터 발췌하여 수정됨). 억제제 AG490에 의한 JAK2/stat3 연결 차단이 G-CSF의 존재하에서 신호를 현저하게 감소시키기 때문에 배양 배지에 G-CSF를 첨가함으로써 일어나는 stat3 tyr705 인산화는 G-CSF 수용체/JAK2 경로를 거쳐 특이적으로 중재되었다(도 X). stat3 활성화는 bcl 계통의 항- 세포자멸성 단백질의 유도를 이끈다(Yoshida et al.(2002), J Exp Med, 196, 641-53, Sakai and Kraft(1997), J Biol Chem, 272, 12350-8, Nielsen et al.(1990), Leukemia, 13, 735-8). 뉴론 배양액으로 G-CSF 첨가는 Bcl-XI와 Bcl-2 모두의, 뉴런 내 강력한 항-세포자멸성 단백질의, 그리고 대뇌허혈 동안의 시간-의존성 증가를 이끈다(도 27, VI 부분). 흥미롭게도, 최근의 보고는 신경 손상후 운동 뉴런을 위한 필수적인 생존 단백질로서 stat3를 제안한다(Schweizer et al.(2002), J Cell Biol, 156, 287-97). 따라서, G-CSF는 stat5와 NF-kB 활성화를 포함하는 EPO의 제안된 항-세포자멸적 기작과 다르게 작용하는 것 같다(Digicaylioglu and Lipton(2001), Nature, 412, 641-7).
방법
래트로부터 일차 피질 뉴런은 다음과 같이 제조되었다: 10 내지 12개의 피질이 래트 배아 E18로부터 절개되었다. 이 조직은 HBSS(BioWhitakker, Taufkirchen, 독일) 중의 10mg/ml 트립신, 5mg/ml EDTA/DNase(Roche diagnostics, Mannheim, 독일)을 사용하여 분리되었다. 1×B-27 보충제(Invitrogen, Karlsruhe, 독일)를 함유하는 4부 신경기저 배지를 사용하여 소화가 중지되었다. 원심분리 후, 펠릿은 5ml 배지에 용해되고, 세포는 폴리-L-라이신으로 코팅된 유리 커버 슬립 상에 24-웰-플레이트의 웰 당 250,000 세포 밀도로 평판 배양되었다. 배지는 전형적으로 다음을 포함한다: 50ml 신경 기저 배지(Life technologies, Karlsruhe, 독일), 1ml 보충제 B27(Life technologies), 5㎕ bFGF(Sigma, 19㎍이 100㎕ 10mM Tris/HCl pH 7에 용해되었다), 및 50㎕ 페니실린/스트렙토마이신(Life technologies).
STAT1, pSTAT1, STAT5, pSTAT5, GCSFR, PARP, 분열된 PARP, caspase3, 분열된 caspase3, Bcl2, 및 Bcl ×1의 감지는 웨스턴 블로팅으로 실시되었다. 간략하게, 뉴런은 지시된 바와 같이 150mM NOR-3(Sigma-Aldrich, Seelze, 독일)과 50ng/ml G-CSF(Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)으로 24시간 동안 처리되었다. 세포를 플레이트로부터 긁어내고, 800rpm에서 5분 동안 회전시키고, 2.5mg/ml 펩스타틴(Sigma-Aldrich, Seelze, 독일)과 아프로티닌(1:1000, Sigma-Aldrich)을 함유하는 얼음냉각된 PBS에서 세정하였다. 펠릿은 100㎕ 벤조나아제 용액(10㎕ 10×PBS, 79.5㎕ H2O, 10㎕ 10% SDS, 0.5㎕ 100mM MgCl2, 0.1㎕ 아프로티닌, 0.1㎕ 루펩틴, 0.1㎕ 펩스타틴, 0.1㎕ PMSF, 0.1㎕ 벤조나아제(Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)을 함유함)에 재현탁시켰다. 용해후, 1 부피 PBS가 첨가되고, 단백질 농도가 측정되었다(BCA-Test, Pierce, Rockford, IL, USA). 5분 동안 95℃에서 변성시킨 후, 100㎍을 8%-12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 흘려보냈다. 단백질은 반-건조-브로팅 챔버(Whatman Biometra, Gottingen, 독일)를 사용하여 니트로셀룰로오스 막(Protan BA79, Schleicher & Schuell, Dassel, 독일)에 전달되었다. 블롯(blot)은 PBS/0.02% Tween 20 내의 5% 우유 분말로 차단되었고, PBS/0.02% Tween 20으로 세번 세정되고, 각각의 일차 항체(항-분열된-PARP-항체, Cell Signalling, 1: 1000; 항 PARP, Cell Signalling, 1:1000; 항 분열된 caspase 3, Cell Signalling, 1:200; 항 caspase3, Cell Signalling 1:200; 항 Bcl2, BD Transduction Laboratories, 1:500; 항 Bcl XI, BD Transduction Laboratories, 1:500; 항 pSTAT3tyr, Cell Signalling, 1:500; 항 STAT5, Cell Signalling, 1:200; 항 pSTAT1, Cell Signalling, 1:500)와 함께 4℃에서 밤새 배양되었다. 세정 후, 블롯들은 상온에서 1시간 동안 각각의 이차 항체(항-토끼, 또는 항-마우스-항혈청 HRP-조합된, Dianova, Hamburg, 독일 1:4000)와 함께 배양되었다. 신호는 슈퍼신호 화학발광 시스템(Pierce, Rockford, USA)을 사용하여 감지되었고, 하이퍼필름-ECL(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로 노출되었다. PARP 분열은 윈도우 이미지 J v1.29(http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 스캔화된 자동 방사능 사진상에 정량화되었다.
실시예 23: GCSF와 그 수용체는 뇌 허혈에 의하여 유도된다.
뇌 허혈의 MCAO 모델
국소 뇌 허혈(MCAO, 중뇌동맥 폐색)을 유도하는 과정은 실시예 1에 개시된 바에 따라 실행되었다.
전뇌 허혈 모델
허혈/재관주를 위하여 랜덤화된 동물의 실험적 과정이 이전에 상세하게 개시된 바와 같이 실행되었다(Brambrink, et al.(2000), J Cereb Blood Flow Metab, 20, 1425-36). 간략하게는, 래트가 마취되고(클로랄 하이드레이트), 구강으로 튜브를 삽입하고, 기계적으로 산소를 공급하였다(실험 동안 35-40mmHg PaCO2, 95-110mmHg PaCO2). 양쪽 총경동맥(CCA)이 노출되고, 왼쪽편이 혈관 샘플링과 MABP(Sirecust 310, Siemens, Danvers, MA, USA)의 지속적 관찰을 위하여 폴리에틸 렌 튜브(PE-50)로 카테터를 꽂았다. 오른쪽편에는, 일과성 뇌 허혈을 유도하기 위하여 나중에 사용될 CCA 주위에 나일론 실을 느슨하게 묶었다. 동물의 머리는 EEG와 CBF 측정용 정위고정틀에 고정시켰다(세부사항 참조(Brambrink, Schneider, Noga, Astheimer, Gotz, Korner, Heimann, Welschof and Kempski(2000), J Cereb Blood Flow Metab, 20, 1425-36)). 두개관은 중앙 절개에 의하여 노출되고, 염소 처리된 은 핀 EEG 전극을 고정하도록 설계된 두 침하(depression)가 만들어졌다(Praxinos and Watson(1986) 두뇌 지도에 따라 왼쪽 신체감각 피질과 전두동을 거쳐 배치됨, 고속 치과 드릴). 오른쪽 대뇌 반구를 거쳐, 두개골의 약 24mm2가 얇은 뼈 막(오른쪽 lateralto 1.3-5.3mm, 브레그마로부터 1.5-7.5mm 후두골)을 남기고 제거되었다. 컴퓨터 유도 미세조작기로 조절되는 레이저 도플러-플로우 프로브(파장: 780㎛, BPM 403A, TSI Inc., St. Paul, MN, USA)가 "검색 기술"(Soehle, et al.(2000), Acta Neurochir Suppl, 76, 181-4)을 사용하는 30 부위에서 국소 대뇌 혈류(rCBF)를 결정하기 위하여 사용되었다. 반대측(왼쪽으로 3.3-5.3mm 측면과 브레그마의 후두골 5.0-7.0mm)에, 고정된 레이저 도플러-플로우 프로브(파장: 780㎛, BPM 2, Vasamedices Inc., St. Paul, MN, USA)를 사용하는 국부 대뇌 혈류(lCBF)를 측정하기 위하여 더 작은(4mm2) 윈도우가 설치되었다. 오른쪽 측두근 내, 왼쪽 심이관(auricular tube) 내, 그리고 직장 내 6cm 깊이에 이전에 개시된 바((Brambrink, et al.(1999), J Neurosci Methods, 92, 111-22))와 같이 온도 프로브가 배치되었다. 심부 온도(자동온도 조절되는 열 담요)와 측두근 온도(근 적외선 방열기)는 실 험 과정 내내 37.5±0.1℃로 조절되었다. 동물의 신체 저부는 밀폐 챔버에 두었다. 이는 전기적으로 조절되는 진공 펌프에 의한 저 비중 압력을 만들어 이로 인하여, 조절되는 방식으로("저비중 저혈압") 동물의 동맥 혈압(정맥 풀링)을 낮추는 것이 가능하도록 한다. 후기 외과적 고정기간 30분후, 혈관을 폐색하기 위하여 오른쪽 경동맥 주위의 한정된 중량에 첨부된 나일론실을 잡아당김으로써 일과성 전뇌 허혈이 개시된다(동맥 혈압이 왼쪽 경동맥에 배치된 카테터에 의하여 측정되었다); 동시에 MABP는 저비중 저혈압 기술을 사용하여 35mmHg로 감소되었다. 뇌 허혈은 지속적인 lCBF, rCBF, 및 EEG 측정에 의하여 확인되었다. 전뇌 허혈의 15분 후, 실을 자르고, 진공은 재관류가 가능하도록 종결되었다. 회복 90분 후, CCA 카테터가 제거되고, 절개 부분이 봉합되고, 동물은 산소 공급장치로부터 분리되었다. 탈관시(재관류 110분경)와 안정한 바이탈 신호 존재시, 래트는 케이지로 돌려보내고, 열 담요가 열 손실을 방지하는데 사용되었다.
정량적 PCR
RNA는 표준 프로토콜((Chomczynski and Sacchi(1987), Anal Biochem, 162, 156-9)과 이어서 Quiagen RNeasyTM 미니 키트 정제법에 따라 분리되었다. 조직 샘플은 국소 뇌허혈 후 다양한 시점에서 손상면에 대측과 동측 각각과 전뇌 허혈 후 전체 래트 뇌로부터 추출되었다. cDNA는 표준 조건을 사용하는 윗첨자 II 역전사효소(Gibco), 올리고T 프라이머를 사용하는 전체 RNA 10㎍으로부터 합성되었다. 정량적 PCR은 DNA 이중가닥의 SYBR-그린 염색으로 Lightcycler® 시스템(Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)을 사용하여 실행되었다. 순환 조건은 다음과 같았다: GCSFR: 5분 95℃, 5초 95℃, 10초 66℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 84℃; GCSF: 5분 95℃, 5초 95℃, 10초 64℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 88℃. 용융 곡선은 하기의 변수로 실행되었다: 95℃를 50℃로 냉각; 0.2℃/sec로 99℃로 상승시킴. 하기의 프라이머 쌍이 사용되었다: "래트 GCSFR-프래그-32s" CCA TTG TCC ATC TTG GGG ATC(SEQ ID NO:42), "래트 GCSFR-프래그-265as" CCT GGA AGC TGT TGT TCC ATG(SEQ ID NO:43), "래트 GCSF-345s" CAC AGC GGG CTC TTC CTC TAC CAA(SEQ ID NO:44), 및 "래트 GCSF-862as" AGC AGC GGC AGG AAT CAA TAC TCG(SEQ ID NO:45). Lightcycler® PCR은 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여, 제조자 추천사항(Roche Diagnostics)을 따라 실행하였다. 생성물의 특성은 융점 분석과 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 확인되었다. 샘플의 cDNA 함량은 Cyclophilin(프라이머: "cyc5" ACC CCA CCG TGT TCT TCG AC(SEQ ID NO:46); "acyc300" CATTTGCCATGGACAAGATG(SEQ ID NO:47))의 발현수준으로 표준화되었다. 상대적 조절 수준은 시클로필린으로의 표준화 및 모조 수술된(정상) 동물과의 비교로부터 유도되었다. 오차 표시줄은 표준 편차를 나타내고, 이들은 3-배 일련의 희석된 cDNA-샘플로부터 계산되고, 측정값의 신뢰도를 반영한다.
도 28(I과 II 부분) A는 동측 및 대측면 상에 국소 허혈후 2시간과 6시간에 GCSF의 매우 강한 상향 조절을 나타내는 반면, 수용체는 6시간 후 적절히 조절된다(도 28 B).
GCSF의 유도 발현은 MCAO 모델에 특이적이지 않지만, 전 허혈에서 비록 더 낮은 정도이긴 하지만 나타날 수 있다(도 28C). 이러한 발견은 G-CSF가 뇌-내생성 신경세포보호 리간드이고 GCSF나 GMCSF로 처리하는 것은 신경세포보호의 내생적 원리를 이용한다는 가설을 지지한다.
실시예 24: GCSF와 그 수용체는 뇌피질 경색의 반음영 영역(penumbral zone)에서 상향 조절된다.
방법
광혈전성 뇌피질 허혈의 허혈성 모델이 상기 실시예들에 개시된 바에 따라 실행되었다.
면역 조직화학: 파라핀-주입된 조직의 절편(2㎛)이 탈파라핀화되고 마이크로파처리되었다(10분 동안 500W에서 구연산 완충액). 그 다음, 절편을 GCSF 또는 GCSF-수용체 항혈청(SC13102 또는 SC694; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1:500)으로 1시간 동안 습기 챔버 내에서 상온 하에 배양하였다. 염색은 색원체로서 DAB(DAKO, Glostrup, 덴마크)를 이용하는 ABC 기술을 사용하여 가시화되었다. 음성 대조군은 일차 항혈청을 생략하여 행해졌다.
결과
광혈전성 허혈의 유도 후 6시간에, 수용체와 리간드 모두 도 29의 화살표로 나타낸 바와 같이 일차 허혈 손상부("반음영")의 주변 영역에 뉴런의 향상된 염색에 대한 명확한 증거가 있었다. 이 발견은 본 발명자들이 신경계의 신규한 내생성 신경세포보호 시스템을 밝혔다는 원리를 강조한다. 이는 또한 반음영 영역 내 GCSF 작용의 일차 기작이 실제로 거의 항세포자멸적이라는 것을 강조한다.
실시예 25: 해마 내의 이중피질과 GCSFR의 공동배치
사용된 면역 조직화학적 방법
실험은 실시예 21에 개시된 바에 따라 실시되었다. GCSF 항혈청 대신, 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 1:200으로 희석된 기니아-피그 항-이중피질(DCX) 다중크로날 항체(Chemicon International, 독일)가 적용되었다. 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)로 절편을 3×2min 세정한 다음, 이를 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 1:200으로 희석된 비오틴화된 염소 항-기니아-피그 IgG(Vector Laboratories, USA)으로 30분 동안 배양하였다. 상기 절편을 다시 세정한 후, 실시예 21에 개시된 프로토콜에 따라 상온에서 1.5 시간 동안 TRITC-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘(dianova; 1:200)을 적용하였다.
결과
도 30은 해마의 치상돌기 회(a-f)와 신문(g-i) 내 뉴런 상에 GCSF 수용체(a, d, g)와 이중피질(b, e, h)이 발현되는 것을 나타낸다. G-CSF 수용체와 조기 뉴런성 마커 이중피질 양쪽의 발현의 중복(Jin, et al.(2001), Proc Natl Acad Sci USA, 98, 4710-5)(도 30 c,f,i)이 뉴런 분화의 조기 단계에서 G-CSF의 기능적 역할에 영향을 준다.
실시예 26: GCSF는 성인 신경줄기세포의 뉴런성 분화를 유도한다.
신경줄기세포(NSCs)의 발생
성인 신경줄기세포의 발생은 실시예 9에 개시된 바와 같이 실행되었다.
뇌실하 영역(SVZ)으로부터 유도된 39개의 DIV 배양된 신경구가 하기한 GCSF- 농도로 한 번 자극되었다: 각각 10ng/ml, 100ng/ml, 및 500ng/ml. 재조합 인간 GCSF(Neupogen®, Amgen, Europe B.V., 네덜란드)의 첨가 후 4일에 세포가 수확되고 RNA가 분리되었다. 비처리 세포가 대조군으로 제공되었다.
정량적 PCR
SVZ의 GCSF-처리 및 미처리 신경구의 RNA는 Quiagen RNeasyTM 미니 키트를 사용하여 제조자 프로토콜에 따라 분리되었다. cDNA는 표준 조건을 사용하는 윗첨자 II 역전사효소(Gibco), 올리고T 프라이머를 사용하는 전체 RNA 2㎍으로부터 합성되었다. 정량적 PCR은 DNA 이중가닥의 SYBR-그린 염색으로 Lightcycler® 시스템(Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)을 사용하여 실행되었다. 순환 조건은 다음과 같았다:
네스틴 및 NSE(뉴런 특이적 에놀라아제): 3분 95℃, 5초 95℃, 10초 58℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 81℃; 베타 III-튜불린: 3분 95℃, 5초 95℃, 10초 65℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 87℃; PLP: 3분 95℃, 5초 95℃, 10초 62℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 84℃; GFAP: 3분 95℃, 5초 95℃, 10초 60℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 81℃. 용융 곡선은 하기의 변수를 사용하여 결정되었다: 95℃를 50℃로 냉각; 0.2℃/sec로 99℃로 상승시킴. 하기의 프라이머 쌍이 사용되었다: "래트 네스틴-플러스" AGG AAG AAG CTG CAG CAG AG(SEQ ID NO:48), "래트 네스틴-마이너스" TTC ACC TGC TTG GGC TCT AT(SEQ ID NO:49), "래트 NSE-플러스" GGC AAG GAT GCC ACT AAT GT(SEQ ID NO:50), "래트 NSE-마이너스" AGG GTC AGC AGG AGAC TTG A(SEQ IN NO:51), "래트 베타 III-tub-716s" CCA CCT ACG GGG ACC TCA ACC AC(SEQ ID NO:52), "래트 베타 III-tub-1022as" GAC ATG CGC CCA CGG AAG ACG(SEQ ID NO:53), "래트 PLP-518s" TCA TTC TTT GGA GCG GGT GTG(SEQ ID NO:54), "래트 PLP-927as" TAA GGA CGG CAA AGT TGT AAG TGG(SEQ ID NO:55), "래트 GFAP3'-1123s" CCT TTC TTA TGC ATG TAC GGA G(SEQ ID NO:56), "래트 GFAP3'-1245as" GTA CAC TAA TAC GAA GGC ACT C(SEQ ID NO:57). Lightcycler PCR은 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여, 제조자 추천사항(Roche Diagnostics)을 따라 실행하였다. 생성물의 특성은 융점 분석과 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 확인되었다. 샘플의 cDNA 함량은 Cyclophilin(프라이머: "cyc5" ACC CCA CCG TGT TCT TCG AC(SEQ ID NO:58); "acyc300" CAT TTG CCA TGG ACA AGA TG(SEQ ID NO:59))의 발현수준으로 표준화되었다. 상대적 조절 수준은 시클로필린으로의 표준화 및 미처리 세포와의 비교로부터 유도되었다. 도 31은 GCSF 처리 후 뉴런성 마커 NSE 및 베타 III-튜블린 4d의 강하고, 농도 의존적인 상향 조절을 나타낸다. PLP와 GFAP는 GCSF-농도에 의존하여 적절히 조절된다. 오차 표시줄은 표준 편차를 나타내고, 3-배 일련의 희석된 cDNA-샘플로부터 계산되고, 측정값의 신뢰도를 반영한다.
실시예 27: 뇌 내의 GMCSF 및 그 수용체의 공동배치
사용된 면역 조직화학적 방법
파라핀 주입된 조직 절편(2㎛)을 자이롤로 2×5min, 100% 에탄올로 2×2min 처리한 다음, 에탄올 농도를 96%에서 70%까지 낮춤으로써 탈파라핀화하였다. 최종적으로 상기 절편은 증류수로 세정되고 마이크로파 처리되었다(15분 동안 600W에서 구연산 완충액). 그 다음, 이 절편을 증류수로 세정하고, 항원이 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4) 내에 3×5min 차단되었다. 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 희석된 GMCSF-수용체 항혈청(SC690; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA: 1:100)이 습기 챔버 내에서 1시간동안 상온에서 배양되었다. 그 다음 절편들을 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)로 3×2min 세정하였다. 그 다음 이차 항체(염소 항-토끼 Fab-FITC, dianova, 1:50)를 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)내에 4℃에서 밤새 가하였다. 1×TBS(pH7.4) 중의 0.2% BSA로 절편을 3×2min 세정한 다음 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 1:100으로 희석된 GMCSF 항혈청(SC13101; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 상온에서 1시간 동안 투여하였다. 상기한 바와 같이 절편을 3번 세정하고, 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에서 1:200으로 희석된 비오틴화된 염소 항-토끼 IgG(Vector Laboratories, USA)로 30분 동안 배양하였다. 상기 절편을 다시 세정한 후, TRITC-컨쥬게이트된 스트렙타비딘(디아노바; 1:200)을 상온에서 1.5 시간 동안 투여하였다. 그 다음, 상기 절편을 1×TBS로 3×2min 세정하고, 10분 동안 1×TBS에 1:10000으로 희석된 핵 염색제 DAPI로 염색하였다. 최종적으로 이 절편을 1×TBS로 3×2min 세정하고, 형광광도계(Vectashield, Vector Laboratories, USA)용 배접 배지에 배접시켰다. Olympus IX81 현미경 및 "Analysis" 소프트웨어 팩키지(Soft Imaging Systems, Stuttgart, 독일)로 디지탈 사진을 찍었다.
모든 이중-형광광도계 실험은 제2 채널에 어떠한 형광성 운반체도 없다는 것을 점검하는 병행 단일 염색과 대조되었다. 제2 대조로서, 모든 이중 형광광도계 염색이 이차 항체를 위한 전환된 발색단으로 실행되었다.
결과
GMCSF 수용체(도 32 a, d, g)와 GMCSF(도 32 b, e, h)가 치상돌기 회(도 32 a-c), 신문(도 32 d-f), 피질(도 32 g-i) 내 뉴런 상에 공동배치된다. 이들 자료는 GMCSF가 자가분비 리간드라는 개념을 지지한다.
실시예 28: GMCSF와 그 수용체는 뇌 허혈에 의하여 상향 조절된다.
뇌 허혈의 MCAO 모델
병소 뇌 허혈(MCAO, 중뇌동맥 폐색)을 유도하는 과정은 실시예 1에 개시된 바에 따라 실행되었다.
전뇌 허혈 모델
외과적 준비와 일과적 전뇌 허혈은 상기한 바와 같이 실행되었다.
정량적 PCR
RNA 분리와 cDNA 합성은 상기한 프로토콜에 따라서 실행되었다. 순환 조건은 다음과 같았다: GMCSFR: 5분 95℃, 5초 95℃, 10초 62℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 80℃; GMCSF: 5분 95℃, 5초 95℃, 10초 60℃, 30초 72℃; 50 사이클 동안 10초 81℃. 용융 곡선은 하기의 변수로 실행되었다: 95℃에서 50℃로 냉각; 0.2℃/sec로 99℃로 상승시킴. 하기의 프라이머 쌍이 사용되었다: 래트 GMCSFR "BR4-4s96" ACG TCG TTG GCT CAG TTA TGT C(SEQ ID NO:60), "BR4-4as272" ATT TAT GTC AGA GAT GGA GGA TGG(SEQ ID NO:61), "래트 GMCSF-723s" GGA GCT CTA AGC TTC TAG ATC(SEQ ID NO:62), 및 "래트 GMCSF-908as" GGC TCA ATG TGA TTT CTT GGG(SEQ ID NO:63). Lightcycler® PCR은 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여, 제조자 추천사항(Roche Diagnostics)을 따라 실행하였다. 생성물의 특성은 융점 분석과 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 확인되었다. 샘플의 cDNA 함량은 Cyclophilin(프라이머: "cyc5" ACC CCA CCG TGT TCT TCG AC(SEQ ID NO:58); "acyc300" CATTTGCCATGGACAAGATG(SEQ ID NO:59))의 발현수준으로 표준화되었다. 상대적 조절 수준은 시클로필린으로의 표준화 및 모조 수술된(정상) 동물과의 비교로부터 유도되었다. 오차 표시줄은 표준 편차를 나타내고, 이들은 3-배 일련의 희석된 cDNA-샘플로부터 계산되고, 측정값의 신뢰도를 반영한다.
도 33 A에 동측 및 대측면 상에 국소 허혈후 2시간과 6시간에 GMCSF의 매우 강한 상향 조절이 도시된다. GMCSF의 유도는 전뇌 허혈에서 비록 더 낮은 정도이긴 하지만 보여질 수 있다(도 33B). GMCSF 수용체 조차도 전뇌 허혈 후 6시간에 약간 상향 조절된다(도 33C). 이러한 자료는 GMCSF가 내생적 신경세포보호 기작의 일부라는 가설을 지지한다.
실시예 29: 해마 내의 이중피질과 GCSFR의 공동배치 발현
사용된 면역 조직화학적 방법
실험은 상기한 바와 같이 실시되었다. GMCSF 항혈청 대신, 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 1:200으로 희석된 기니아-피그 항-이중피질(DCX) 다중크로날 항체(Chemicon International, 독일)가 투여되었다. 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)로 절편을 3×2min 세정한 다음, 이를 0.2% BSA를 함유하는 1×TBS(pH7.4)에 1:200으로 희석된 비오틴화된 염소 항-기니아-피그 IgG(Vector Laboratories, USA)으로 30분 동안 배양하였다. 상기 절편을 다시 세정한 후, 상기한 프로토콜에 따라 상온에서 1.5 시간 동안 TRITC-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘(dianova; 1:200)을 투여하였다.
결과
도 34는 해마의 치상돌기 회(a-c)와 신문(d-i) 내 뉴런 상에 GMCSF 수용체(a, d, g)와 이중피질(b, e, h)이 발현되는 것을 나타낸다. G-CSF 수용체와 조기 뉴런성 마커 이중피질 모두의 발현의 중복(Jin, et al.(2001), Proc Natl Acad Sci USA, 98, 4710-5)(도 34 c,f,i)이 뉴런 분화의 조기 단계에서 GMCSF의 기능적 역할에 영향을 주고, 영향력 있는 신경세포생성이 뇌졸중, 파킨슨 질병, ALS, 및 많은 다른 질병과 같이 치료 표적이 될 수 있는, 모든 신경변성 질병에 대한 GMCSF의 적용성을 강조한다.
실시예 30: GMCSF는 성인 신경줄기세포의 뉴런성 분화를 유도한다.
신경줄기세포(NSCs)의 발생
성인 신경줄기세포의 발생은 실시예 9에 개시된 바와 같이 실행되었다. 세포는 800×g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 1×PBS로 한번 이들을 세정함으로써 매 2~3주 마다 계대하였다. 37℃에서 15분 동안 배양하고 1ml Accutase(Sigma) 내에 재현탁한 후, 상기 세포를 계수하고, 6웰 플레이트 내에 웰 당 1.5-2.0×105 세포의 밀도로 플레이트하였다. 해마로부터 유도된 신경줄기세포가 10ng/ml GMCSF(Leukine®, Berlex, Schering AG 독일)로 4번째 계대 후 자극되고 3 일 후 RNA 분리를 위하여 수확되었다. 비처리 세포가 대조군으로 제공되었다.
정량적 PCR
SVZ의 GMCSF-처리 및 미처리 신경구의 RNA는 Quiagen RNeasyTM 미니 키트를 사용하여 제조자 추천사항에 따라 분리되었다. cDNA는 표준 조건을 사용하는 윗첨자 II 역전사효소(Gibco), 올리고T 프라이머를 사용하는 전체 RNA 5㎍으로부터 합성되었다. 정량적 PCR은 DNA 이중가닥의 SYBR-그린 염색으로 Lightcycler® 시스템(Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)을 사용하여 실행되었다. 베타 III-튜블린, NSE, PLP, 및 GFAP를 위하여 사용되는 프라이머 쌍, 순환 조건, 및 Lightcycler PCR의 실행은 상기한 바와 같다. 상대적 조절 수준은 시클로필린으로의 표준화 및 미처리 세포와의 비교로부터 유도되었다. 도 35A에 분화된 세포의 특이적 마커 발현과 신경줄기세포의 분화 잠재력이 도식적으로 도시된다. 10ng/ml GMCSF로 신경줄기 세포를 처리한 결과 베타 III-튜블린(n=3; p＜0.05, 두-꼬리 t-검정)을 현저하게 유도하여 발현하고, NSE의 더 낮은 정도로, 성숙 뉴런에 대한 지표를 나타낸다(도 35B). PLP와 GFAP의 발현 수준에서 관찰된 변화는 없었다. 이 실시예는 신경세포 발생의 조절에 대한 GMCSF의 적용성을 강조한다. 이는 영향력 있는 내생성 줄기 세포 및 분화하는 뉴런의 인 비트로 발생 모두에 유용하고, 다양한 인간 질병, 특히 신경변성 질병에 적용될 수 있다.
실시예 31: G-CSF는 뇌-혈관-장벽(BBB)을 통과한다.
본 문헌 내에서 얻을 수 있는 대부분의 자료는 G-CSF와 관련된 사이토킨의 혈청 수준에 대한 정보를 갖고 있다. 그러나, 신경학상 장애의 치료에 있어서 G-CSF를 효과적으로 사용하기 위한 한가지 중요한 변수는 뇌-혈관-장벽(BBB)을 통하여 단백질을 통과시키는 것이다. 이 문제는 많은 단백질성 약물이 혈관과 뉴런 사이의 이러한 자연적 경계를 통과할 수 없다고 알려져있기 때문에 특히 흥미롭다. 반면, 과립성 백혈구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 에리트로포이에틴과 같은 조혈 인자를 포함하는 다양한 단백질이 CNS(McLay, et al.(1997), Brain, 120, 2083-91., Brines, et al.(2000), Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10526-31) 내 뉴런에 효력을 가지고, BBB를 통과할 수 있다는 것을 보여주었다.
G-CSF가 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있다는 것을 입증하기 위하여 래트 뇌에 주입된 G-CSF의 외관을 시험하였다. 따라서, 본 발명자들은 매우 민감한 요오드화반응 검사를 적용하였다. G-CSF 및 대조구로서 BSA가 요오도제법(Sigma, Taufkirchen, 독일)에 의하여 131I(Amersham Biosciences, Freiburg, 독일)로 방사성 표지되고, 세파덱스(Sephadex) G-25(Amersham Biosciences, Freiburg, 독일) 컬럼에서 정제되었다. 정제된 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 분석될 때 정확한 분자량의 단일 피크로서 미표지의 표준 화합물과 같이 용출되었다. 방사성 동위원소로 표지된 단백질을 암컷 스프라그-돌리 래트(250-300g)의 꼬리 정맥을 통하여 주입하였다. 경쟁적 흡수 연구를 위하여 냉각 단백질을 표지된 화합물과 혼합하여 같이 주입하였다. 해부 직전, 래트는 Rompun/Ketanest로 마취되고, 혈액 제거를 위하여 하복부 대동맥을 통하여 식염수 100ml를 관류시켰다(주입 후 1, 4, 및 24시간). 전체 뇌와 혈액을 분리하고, 블럿 건조(blot dry)하여, 칭량하였다. 혈액은 혈청을 얻기 위하여 원심분리되었다. 조직의 %ID/g을 계산하기 위하여 주입제 샘플과 함께 γ-계수기(LB 951G, Berthold, 독일)로 방사능을 측정하였다. 결과는 G-CSF가 뇌에 존재하고, 알부민에 비하여 시간이 지남에 따라 4-5의 인자만큼 뇌 혈관 장벽의 통과를 증가시킨다는 것을 나타내었다. 방사성 동위원소 표지된 G-CSF를 주입한 후 24시간에 채취된 샘플은 1 및 4 시간에 채취된 것과 비교하여 증가된 수준을 나타내었다(도 36). 이러한 관찰은 혈액에 정맥으로 주입된 G-CSF가 BBB를 통과하고, CNS-뉴런 상의 특정 수용체를 주로 활성화할 수 있다는 것을 나타낸다.
혈청과 뇌의 방사성 동위원소 표지된 G-CSF의 양이 측정되고, 뇌/혈청의 비가 시간에 따라 기입되었다. 대조군으로 소 혈청 알부민이 사용되었다. 뇌 조직의 혈액 오염을 피하기 위하여, 래트는 해부에 앞서 식염수 100ml로 관류되었다.
실시예 32: GM-CSF는 뇌-혈관-장벽(BBB)을 통과한다.
GM-CSF가 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있다는 것을 보이기 위하여, 본 발명자들은 G-CSF에 대한 실시예 31에 개시된 바에 따라 요오드화된 GM-CSF를 래트에 주입하였다. 실험은 정맥 내 투여 후 래트 뇌 내에 GM-CSF와 알부민 존재의 비교가 GM-CSF 수준(뇌 대 혈청의 비)이 알부민보다 3-4배 더 높다는 유사한 결과를 나타내었다. GM-CSF는 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있다는 것을 자료가 보여준다(도 37).
도 37에서, 혈청과 뇌의 방사성 동위원소 표지된 GM-CSF의 양이 측정되고, 뇌/혈청의 비가 시간에 따라 기입되었다. 대조구로 소 혈청 알부민이 사용되었다. 뇌 조직의 혈액 오염을 피하기 위하여, 래트는 해부에 앞서 식염수 100ml로 관류되 었다.
실시예 33: 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 치료용 G-CSF
G-CSF와 GM-CSF는 두가지 방향에서 유래된 ALS의 치료에 유용하다는 것이다: 첫째, GCSF와 GMCSF용 수용체와 리간드 모두가 척수의 전각 내 큰 운동뉴런에 발현된다. 둘째, 세포 자멸적 일련의 반응을 반작용함으로써 G-CSF가 부분적으로 작용한다는 사실은 ALS에서 작동되는 세포자멸적 기작(Li, et al.(2000), Science, 288, 335-9)을 위한 증거에 비추어 매우 흥미롭다. 가장 일반적으로 사용되는 ALS용 마우스 모델은 잘 알려진 인간 ALS를 초래하는 것으로 나타나 왔던 SOD1 유전자 내 돌연변이를 운반하는 유전자 도입 마우스이다. 이중 가장 흔하게 사용되는 것은 SOD1(G39A) 유전자 도입주이다. 전형적으로, 이들 마우스는 감소된 수명을 가지고, 행동 테스트(예: 악력 시험, 로타로드 시험)로 쉽게 평가될 수 있는 운동 약화의 진행 신호를 나타낸다. 치료 효능에 대한 많은 시험이 이들 마우스에 행해졌고, 릴루졸(Riluzole), 미노사이클린(Minocycline), 카르니틴(Carnitine) 등과 같은 물질에 대한 생명 연장 활성을 보였다. 인간에게 유일하게 허용된 약제인 릴루졸이 이들 마우스에 보호 효과를 가지는 반면, 인간 시도에 실패했던 BDNF가 이러한 효과를 가지지 않기 때문에, 이들 마우스는 임상적으로 예상할 수 있는 관련성을 가진다고 생각된다. 따라서, 본 발명자들은 G-CSF가 ALS의 SOD1-유전자도입 마우스 모델에서 기능적 성과나 예상 수명을 연장하는지를 시험하였다. SOD1과 야생형 마우스는 생후 60일부터 시작하여 부형약이나 G-CSF를 10㎍/KG 체중으로 피하 주사되었고, 시간에 따라 관찰되었다. 이 결과는 시간이 지남에 따라 여러 측정점에서 유의 점에 도달한 운동 기능 시험(악력 시험(도 38B))의 향상 뿐만 아니라 G-CSF 처리된 군(도 38A)에서 더 긴 예상 수명에 대한 명확한 경향을 나타내었다. 또한, 상기 처리군에 체중이 증가하는 경향이 있었다.
도 38A: SOD1-tg 마우스는 생후 60일부터 시작하여 10㎍/KG 체중으로 주입되었다. G-CSF 처리된 SOD1-tg 마우스에 연장된 예상 수명에 대한 명확한 경향이 있다(실선 대 점선). 몇 지점에서 이들 차이가 유의점에 도달했다.
도 38B: SOD1-tg 마우스는 생후 60일부터 시작하여 10㎍/KG 체중으로 주입되었다. 악력 검사는 G-CSF 처리된 SOD1-tg 마우스에 운동력의 향상을 보여준다(빈 사각형 대 빈 삼각형). 몇 지점에서 이들 차이가 유의점에 도달했다.
실시예 34: 파킨슨병(PD)의 설치류 모델에서 GCSF의 효능
MPTP 모델:
파킨슨병(PD)의 가장 특징적인 모델은 신경독성 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)을 사용하여 개발되었다. 파킨슨 모델에서 GCSF의 효능을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 8주령 수컷 마우스에 MPTP를 투여하였다. 마우스의 각 군(n=15)은 MPTP-HCl이나 식염수가 반복으로 i.p. 주사(30mg/kg, 5ml/kg 농도로 연속 5일 동안 하루에 한번)되고, 완충액, GCSF(0.03mg/kg; 5ml/kg) 또는 미노사이클린(45mg/kg; 5ml/kg)이 반복적으로 s.c. 투여(연속 22일 동안 매일 한번)되었다. GCSF 1차 투여가 MPTP (또는 군 0을 위한 식염수) 후 즉시 실행되는 반면, 양 화합물의 가능한 상호작용때문에 그 후 30분에 미노사이클린이 투여되었다. 각 군의 모든 동물이 22일째에 희생되었다. 그 시점까지, 마우스는 이동작용(가속화 RotaRod)을 위하여 양자를 분석하고 체중이 매일 측정되었다. 또한, 각 뇌는 선조 및 측중격핵(neucleus accumbens) 내에 도파민, 3,4-디하이드록시페닐 아세트산(DOPAC), 및 호모바닐산(HVA)의 농도를 측정하기 위한 전기화학적 감지로 HPLC 분석이 행해진다.
그러나, 이 모델에서 신경세포보호제의 작용을 위한 가장 중요하고 직접적인 변수는 독성물질 후 생존한 뉴런의 수이다. 따라서, 티로신 하이드록실라제(TH)-양성 뉴런의 입체학적 정량과 TH 면역 조직화학이 각 동물의 중뇌 절편으로 실행되었다(Triarhou, et al.(1988), J Neurocytol, 17, 221-32).
결과는 GCSF 처리군에 대한 체중 증가 경향을 나타내었다(자료는 나타내지 않음). 또한, 이동작용의 향상은 가속화 로타로드에서 시험 후 관찰된다(자료는 나타내지 않음). 마우스 내 MPTP 유도 파킨슨에 대한 최근의 연구는 미노사이클린이 이들 동물에서 흑색 선조 도파민성 신경변성을 방지한다는 것을 나타내었다(Du, et al.(2001), Proc Natl Acad Sci USA, 98, 14669-74). 본 연구에서 본 발명자들은 자료를 유효하게 하기 위하여 신경세포보호 화합물 참고물질로서 미노사이클린을 선택하였다. 연속 5일에 걸친 MPTP 아급성 처리는 흑색질 치밀부 내 티로신 하이드롤라제(TH)-양성 뉴런을 현저하게 감소시킨다(도 39A). GCSF와 미노사이클린의 처리는 TH-양성 뉴런의 흑색 수준의 이러한 감소를 거의 동일한 효율로 방해하는 것을 나타내었다(도 39B). 또한, GCSF와 미노사이클린은 도파민의 선조 수준(도 39B)과 그의 대사체를 고려할 때 거의 동일한 치료 효능을 나타내었다.
실시예 35: 파킨슨병(PD)용 모델에서 GMCSF의 효능
MPTP 모델:
GCSF와 관련하여 개시된 바와 같이, 파킨슨 모델에서 GMCSF의 효능은 하기 연구(앞 실시예 참조)에서 확인된다.
마우스의 각 군(n=15)에는 MPTP-HCl이나 식염수가 반복적으로 i.p. 주입(30mg/kg, 5ml/kg 농도에서 연속 5일 동안 하루에 한번)되고 완충액, GMCSF(0.03mg/kg; 5ml/kg) 또는 미노사이클린(45mg/kg; 5ml/kg)가 반복적으로 s.c. 투여(연속 22일 동안 매일 한번)되었다. GMCSF 1차 투여가 MPTP (또는 군 0을 위한 식염수) 후 즉시 실행되는 반면, 양 화합물의 가능한 상호작용때문에 그 후 30분에 미노사이클린이 투여되었다. 각 군의 모든 동물이 22일째에 희생되었다.
GCSF에 의하여 점수화된 결과와 유사하게 GMCSF 투여 후 가속화 로타로드로 이동작용의 개선과 체중 증가의 향상이 관찰되었다(자료는 나타내지 않음). 따라서, TH-양성 뉴런의 흑색 수준을 고려할 때 GCSF와 비교하여 GMCSF의 치료 효능이 더 우수하다고 여겨지고 있다(도 39B). GCSF에 필적하여 GMCSF의 투여 후 선조 도파민 수준과 그 대사체의 감소는 억제될 수 있다(자료는 나타내지 않음).
실시예 36: 래트의 파킨슨병을 위한 6-하이드록시 도파민(6OHDA) 모델에서 GCSF와 GMCSF의 효능
위에서 예증한 바와 같이, GMCSF와 GCSF가 마우스의 MPTP 모델에서 강한 신경세포보호성을 가진다. 이는 MPTP가 인간에게 PD를 유도하는 능력때문에 발견된 독성물질이기 때문에 인간 파킨슨병에 대한 적용성을 위한 매우 강한 증거이다.
파킨슨병을 위한 조혈인자의 효능을 연구하기 위한 한 추가적 모델은 6-OHDA 모델이다. 이 모델은 흑색질이나 선조체 내로 직접 6OHDA를 주입하는 것에 기초한다. 이 약은 도파민성 뉴런에 선택적으로 축적되어 이들 세포의 자멸사를 유도한다. 래트에서, 6OHDA는 일측성 장애를 만들기 위하여 주로 사용되었던 효과적인 독성물질이다. 도파민 감소 정도는 암페타민이나 아포몰핀에 반응하는 회전 행동을 시험하여 측정될 수 있다(Ungerstedt 1971). 쉽고 우수한 정량가능한 운동 결함은 이 모델의 주된 장점을 이룬다. 행동 변수에 더하여 HPLC 분석 후 도파민과 그 대사체의 수준 및 면역 조직화학 후 티로신 하이드록실라제(TH) 양성 뉴런의 선조 수준이 또한 결정될 수 있다. 6OHDA는 PD 래트 모델에서 GCSF와 GMCSF의 효능을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 성년 스프라그-돌리 래트(체중 250g)는 흑색질이나 선조체 내에 2㎕ 6OHDA 중 8㎍의 한번의 정위방법의 주입 후 일측성 손상된다. GCSF의 여러 투여량(0.03mg/kg; 0.1mg/kg, 또는 기타)은 2주 동안 손상 후 즉시 피하로 매일 투여될 수 있다. 처리된 동물의 다른 군들은 6OHDA 주입 후 즉시 내선조 또는 내흑색질 GCSF 또는 GMCSF(300㎍/ml)의 단일 투여를 받는다. MPTP 모델 연구에 대하여, 미노사이클린은 신경세포보호 참고 화합물로 사용될 수 있다(매일 한번 s.c. 45mg/kg). 완충액으로 처리된 정상 동물과 손상된 동물이 대조군으로 사용된다. 2주 후 손상 동물은 회전 행동 검사를 받았다. 래트는 아포몰핀이 피하 주사되고, 보올 케이지에 두고, 1시간에 걸쳐 대측 회전수가 기록되었다. 각 동물군에 대한 회전수는 표준 통계 검정을 사용하여 비교된다. 행동 검사 후, 동물들을 죽이고, 뇌를 도파민 수준을 결정하기 위한 HPLC를 위하여 그리고 TH-양성 뉴런의 총 수를 측정하기 위한 면역 화학을 위하여 가공하였다.
실시예 37: GMCSF는 stat3 경로를 활성화함으로써 뉴런에서 항-세포자멸적으로 작용한다.
이미 예증한 바와 같이(실시예 22), GCSF는 일차 뉴런에서 세포자멸사를 억제함으로써 강력한 활성을 가진다. 본 발명자들은 GMCSF가 강한 항-세포자멸적 활성-기작을 또한 가질 수 있다는 것을 예상하였다. 따라서, 실시예 22에서 예증된 바와 같이 동일한 형태의 실험을 GMCSF에 대하여 수행하였다. 여기서, 뉴런에 투여된 농도는 50ng GMCSF(Leukine, Immunex)/ml 배지였다.
도 40, I 부분은 GMCSF가 세포자멸사의 징후로 특징적으로 일어나는 PARP 분열을 억제한다는 것을 나타낸다. NO-공여자 NOR-3를 사용하여 일차 뉴런에 세포 사멸을 유도하였다.
도 40, II 부분은 비록 단백질 그 자체가 뉴런에서 발현되지만, GMCSF가 STAT1("pSTST1") 또는 STAT5("pSTST5")의 증가된 인산화를 유도하지 못한다는 것을 나타낸다.
도 40, III A 부분은 GMCSF 자극 후 5분에 최대인 STAT3의 시간 의존성 활성을 유도한다는 것을 나타낸다. 60분에, pSTAT3의 수준이 조혈 시스템의 세포로부터 알려진 반응 운동학, 초기 수준 이하로 떨어진다. B, 세가지 독립적 실험의 정량화. C, 인산화에 의한 STAT3의 활성은 JAK2 억제제 AG490에 의하여 억제될 수 있다. GMCSF 투여 후 5분, pSTAT3의 수준이 억제제의 존재 하에서 매우 다르다.
도 40, IV 부분은 GMCSF가 stat3 표적 유전자 Bcl2, 및 BclXI의 발현을 강하게 유도한다는 것을 나타낸다. 이 유전자들은 항세포자멸성이 있는 것으로 알려진 다.
이 실험은 1) GMCSF가 뉴런에서 항세포자멸적으로 작용하고, 2) 이는 stat3 경로에 의하여 매개된다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 실험은 또한 GCSF와 GMCSF의 신규한 모방약을 포함하는 신규한 신경세포보호제를 발견하기 위한 검색 도구로서 뉴런 내 stat3 시스템을 사용하는 가능성을 나타낸다.
실시예 38: GMCSF는 설치류 뇌졸중 모델에서 경색 용적을 감소시킨다.
본 발명자들은 중뇌 동맥 폐색 모델(MCAO), 래트 뇌졸중에 가장 잘 응하는 모델에 GMCSF로 실험을 수행하였다.
원칙적으로, 실험은 실시예 1과 19에서 예시한 바와 같이 실시하였다. 간략하게, 수컷 위스타 래트가 흡입 마취(할로탄/N2O/O2)로 마취되었다. 경동맥이 노출되고, 코팅된 나일론 필라멘트가 총경동맥 내에 삽입되고, MCA로의 혈류를 차단할 때까지 진행되었다. 이 필라멘트의 정확한 배치가 레이저 도플러 유량측정기로 감독되었다. 폐색 90분 후, 필라멘트는 재관류가 가능하도록 제거되었다. GMCSF(Leukine, Immunex)는 허혈의 개시 후 30분이나 3시간에 주입 펌프에 의하여 약 20분의 기간에 거쳐 정맥내 카테터(대퇴부 정맥)를 거쳐 래트에 250㎍/kg 체중의 투여량으로 투여되었다. 경색 용적은 TTC-염색의 표준 방법과 컴퓨터-기저 용적기로 24시간 후 측정되었다.
도 41은 GMCSF-처리된 동물 내 경색 용적의 현저한 감소가 초기(도 41, I 부분) 뿐만 아니라 3시간의 후기 시간대(도 41, II 부분)에도 있다는 것을 나타낸다.
이는 일반적으로 신경변성 장애, 특히 뇌졸중 치료에 GMCSF의 적용가능성을 예증한다.
분명한 것은, 본 발명의 다양한 수정이나 변형이 상기한 가르침에 기초하여 가능하다는 것이다. 따라서, 청구항의 범위 내에서 본 발명이 여기 특별히 개시된 것 이외의 것을 실행할 수 있다는 것이 이해된다.
SEQUENCE LISTING <110> AXARON Bioscience AG <120> METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL CONDITIONS WITH HEMATOPOEITIC GROWTH FACTORS <130> 229530US <160> 65 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> computer generated consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(41) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(41) <223> may be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> Xaa may be any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (47)..(49) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (47)..(49) <223> amino acids may be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (50)..(60) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(60) <223> may be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (63)..(64) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> may be present or 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745 750 Tyr Gly Gln Val Leu Glu Ser Pro Thr Ser Pro Gly Val Met Gln Tyr 755 760 765 Ile Arg Ser Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Gly Gly Pro Thr Pro Ser 770 775 780 Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Ile Trp Phe His Ser Arg Pro Gln Glu Thr 785 790 795 800 Phe Val Pro Gln Pro Pro Asn Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro 805 810 815 Pro Phe Asp Phe Pro Leu Phe Gln Gly Leu Gln Val His Gly Val Glu 820 825 830 Glu Gln Gly Gly Phe 835 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 36 Leu Glu Gly Cys Gly Gln Ile Arg Ile Ser Pro Pro Ile Val His Leu 1 5 10 15 Gly Asp Pro Val Leu Ala Ser Cys Thr Ile Ser Pro Asn Cys Ser Lys 20 25 30 Leu Asp Arg Gln Pro Lys Ile Leu Trp Arg Leu Gln Asp Glu Pro Asn 35 40 45 Gln Pro Gly Asp Arg Gln His His Leu Pro Asp Gly Ser Gln Glu Ser 50 55 60 Ile Ile Thr Leu Pro His Leu Asn Tyr Thr Gln Ala Phe Leu Phe Cys 65 70 75 80 Leu Val Pro Trp Asn Asn Ser Phe Gln Val Leu Asp Gln Ala Glu Leu 85 90 95 Arg Ala Gly Cys Lys Ser Leu Gln Pro Pro Thr His Leu Leu Gln Cys 100 105 110 <210> 37 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 38 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 65 70 75 80 Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 175 <210> 39 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His 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gagttacacc gcggggtcga cctggaggtt 300 gcgggggaca aaggccatgc ccaagtccat cagactctgc gcttcgagaa tgaaggtgcc 360 ccaggctccg gggcagagaa cctgacctgt gagatccttg ctgcccactt cctgtgctgt 420 tattgggcgg tggggccggc tgcacccgat gacatcagat actcactgcg cgtgctcaac 480 gccactggtc atgaggtcgc cagctgctcc gctgcccccg gaaccccacc cacgcgttgc 540 caggctgatg atctcacaca tctgccccgc ctcgcataca tcgtcgtcac tgggcagagc 600 cggacggggc tggtgcggtt cctggatgcc gtggtcaaca ccaagggcat tgagcgcctg 660 ggtcccccag ataacgtctc tgcctcctgt aacttctccc actgcaccat cacctgggct 720 ccgcccccta cctgggcgcc tatgacggaa caggatttcc gctttgagat cgagtggaag 780 aaggcggagc ccagcagcat tgcccagaag gtggttatcg cagggcgcga ggacaacgcc 840 ttcgccttcc ccagccccgc cccccgtggc cgcctctggg tcagagttcg tgcaggggac 900 acacgcagtg atcggtggag cgactggagc cccgccctgg agctcggctc ggaggccaca 960 accccgccgc gggccctggt gttggcggcg tcgagctgtg cagccctgct gtgtgcgctg 1020 gcactggggg cggcctgcag gagactcgcg ctctcacgcc gcctcctccc ccccatcccc 1080 gggatccggg accgcgtatc tgatgacgag cgtgtcaact 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185 190 Tyr Ile Val Val Thr Gly Gln Ser Arg Thr Gly Leu Val Arg Phe Leu 195 200 205 Asp Ala Val Val Asn Thr Lys Gly Ile Glu Arg Leu Gly Pro Pro Asp 210 215 220 Asn Val Ser Ala Ser Cys Asn Phe Ser His Cys Thr Ile Thr Trp Ala 225 230 235 240 Pro Pro Pro Thr Trp Ala Pro Met Thr Glu Gln Asp Phe Arg Phe Glu 245 250 255 Ile Glu Trp Lys Lys Ala Glu Pro Ser Ser Ile Ala Gln Lys Val Val 260 265 270 Ile Ala Gly Arg Glu Asp Asn Ala Phe Ala Phe Pro Ser Pro Ala Pro 275 280 285 Arg Gly Arg Leu Trp Val Arg Val Arg Ala Gly Asp Thr Arg Ser Asp 290 295 300 Arg Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ala Leu Glu Leu Gly Ser Glu Ala Thr 305 310 315 320 Thr Pro Pro Arg Ala Leu Val Leu Ala Ala Ser Ser Cys Ala Ala Leu 325 330 335 Leu Cys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Ala Cys Arg Arg Leu Ala Leu Ser 340 345 350 Arg Arg Leu Leu Pro Pro Ile Pro Gly Ile Arg Asp Arg Val Ser Asp 355 360 365 Asp Glu Arg Val Asn Ser Glu Thr Leu Arg Lys Asp Leu Leu Arg Pro 370 375 380 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 ccattgtcca tcttggggat c 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 cctggaagct gttgttccat g 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 44 cacagcgggc tcttcctcta ccaa 24 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 45 agcagcggca ggaatcaata ctcg 24 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 accccaccgt gttcttcgac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 47 catttgccat ggacaagatg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 aggaagaagc tgcagcagag 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 49 ttcacctgct tgggctctat 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 50 ggcaaggatg ccactaatgt 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 51 agggtcagca ggagacttga 20 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 52 ccacctacgg ggacctcaac cac 23 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 53 gacatgcgcc cacggaagac g 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 54 tcattctttg gagcgggtgt g 21 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 55 taaggacggc aaagttgtaa gtgg 24 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 56 cctttcttat gcatgtacgg ag 22 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 57 gtacactaat acgaaggcac tc 22 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 58 accccaccgt gttcttcgac 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seq拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓拓 24 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 62 ggagctctaa gcttctagat c 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 63 ggctcaatgt gatttcttgg g 21 <210> 64 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro 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Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170

Claims (128)

  1. 포유동물에서 신경학적 질환의 치료 방법으로, GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체, 및 그것의 조합으로부터 선택되는 조혈 인자를 상기 신경학적 질환을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1항에서, 상기 신경학적 질환은 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 신경퇴행 질환 및 신경세포 사멸에 의해 동반된 신경계의 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환인 것인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환은 뇌졸증인 것인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 1이상의 추가 조혈 인자를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 정신병적 질환인 것인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 정신병적 질환은 우울증인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 치매 또는 다발성 경화증인 것인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 추가 조혈 인자는 마크로파지 자극 인자, 인터루킨 및 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, GCSF 및 에리트로포이에틴이 포유동물에 투여되는 것인 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 뇌졸증, 파킨슨병, 근위축성측삭경화증, 신경외상(neurotrauma), 심장정지에 기인한 대뇌 허혈, 또는 수술 과정 중의 대뇌 허혈인 것인 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 조혈 인자는 GCSF 또는 GCSF 유도체인 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 조혈 인자는 GMCSF 또는 GMCSF 유도체인 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 추가로 혈류역학적으로(hemodynamically) 활성 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 추가로 포유동물에 조직 플라스미노겐 활성제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 추가로 혈액 뇌 장벽을 넘어 통과를 촉진하는 약제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 추가로 항-자멸사 약제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제 15항에 있어서, 신경학적 질환은 뇌졸증인 방법.
  19. 제 10항에 있어서, 추가로 포류동물에게 조직 플라스미노겐 활성제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 조혈 인자는 인간 인자 또는 인간 인자로부터 유래된 것인 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 포유동물은 인간인 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 조혈 인자는 직접 대뇌 주입, 정맥내 주입, 동맥내 주입, 경구 주입 및 피하주입으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 투여 방식에 의해 투여되는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 조혈 인자의 투여는 포유동물에 투여될때 신경학적 질환을 치료하기에 충분한 양의 조혈인자를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 또는 리포좀으로 투여되는 것인 방법.
  25. 포유동물에서 신경학적 질환의 치료 방법으로, GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체, 및 그것의 조합으로부터 선택되는 조혈 인자와 신경 줄기세포 조성물을 접촉시키고, 상기 신경 줄기세포를 그것이 요구되는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제 25항에서, 상기 신경학적 질환은 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 신경퇴행 질환 및 신경 세포 사멸에 의해 동반된 신경계의 질환으로 이루어지는 군 으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환인 것인 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환은 뇌졸증인 것인 방법.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 정신병적 질환인 것인 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 정신병적 질환은 우울증인 방법.
  31. 제 25항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 치매 또는 다발성 경화증인 것인 방법.
  32. 제 25항에 있어서, 상기 신경 줄기세포 조성물을 1이상의 추가 조혈 인자와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 추가 조혈 인자는 마크로파지 자극 인자, 인터루킨 및 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 신경 줄기세포 조성물이 GCSF 및 에리트로포이에틴과 접촉되는 것인 방법.
  35. 제 25항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 뇌졸증, 파킨슨병, 근위축성측삭경화증, 신경외상, 심장정지에 기인한 대뇌 허혈, 또는 수술 과정 중의 대뇌 허혈인 것인 방법.
  36. 제 25항에 있어서, 상기 조혈 인자는 GCSF 또는 GCSF 유도체인 방법.
  37. 제 25항에 있어서, 상기 조혈 인자는 GMCSF 또는 GMCSF 유도체인 방법.
  38. 제 25항에 있어서, 조혈 인자는 인간 인자 또는 인간 인자로부터 유래된 것인 방법.
  39. 제 25항에 있어서, 포유동물은 인간인 방법.
  40. 제 25항에 있어서, 상기 신경 줄기세포 조성물은 인간 신경 줄기세포를 포함하는 방법.
  41. 뉴런성 세포상의 과립구 콜로니 자극 인자 수용체에 조합하고 뉴런성 세포에서 STAT를 활성화하는 화합물을 확인하는 방법으로,
    뉴런성 세포를 상기 화합물과 접촉시키고; 상기 화합물과 접촉되지 않은 뉴런성 세포에서 STAT 활성화에 비하여 STAT 활성화에서 증가를 측정하는 것으로 이루어지고, 여기서 STAT 활성에서의 증가는 뉴런성 세포 상의 과립구 콜로니 자극 인자 수용체에 조합하는 화합물의 표시인 것인 방법.
  42. 제 41항에서, STAT 유전자는 STAT-3인 방법.
  43. 제 41항에서, STAT 유전자는 STAT-5인 방법.
  44. 제 41항의 방법에 따라서 확인된 화합물.
  45. 포유동물에서 신경학적 질환의 치료 방법으로, 포유동물에게 제44항의 화합물을 상기 신경학적 질환을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제 45항에서, 상기 신경학적 질환은 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 신경퇴행 질환 및 신경 세포 사멸에 의해 동반된 신경계의 질환으로 이루어지는 군 으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환인 것인 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환은 뇌졸증인 것인 방법.
  49. 제 45항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 정신병적 질환인 것인 방법.
  50. 제 49항에 있어서, 상기 정신병적 질환은 우울증인 방법.
  51. 제 45항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 치매 또는 다발성 경화증인 것인 방법.
  52. 제 48항에 있어서, 추가로 포유동물에 조직 플라스미노겐 활성제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  53. 제 45항에 있어서, 1이상의 추가 조혈 인자를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 추가 조혈 인자는 마크로파지 자극 인자, 인터루킨 및 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  55. 제 45항에 있어서, 추가로 혈류역학적으로 활성 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  56. 제 45항에 있어서, 추가로 혈액 뇌 장벽을 넘어 통과를 촉진하는 약제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제 45항에 있어서, 추가로 항-자멸사 약제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  58. 제 45항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  59. 제 45항에 있어서, 상기 화합물은 직접 대뇌 주입, 정맥내 주입, 동맥내 주입, 경구 주입 및 피하주입으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 투여 방식에 의해 투여되는 방법.
  60. 제 45항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 뇌졸증, 파킨슨병, 근위축성측삭경화증, 신경외상, 심장정지에 기인한 대뇌 허혈, 또는 수술 과정 중의 대뇌 허혈인 것인 방법.
  61. 뉴런성 세포상의 과립구 콜로니 자극 인자 수용체에 조합하고 뉴런성 세포에서 STAT 유전자 발현을 활성화하는 화합물을 확인하는 방법으로,
    뉴런성 세포를 상기 화합물과 접촉시키고; 상기 화합물과 접촉되지 않은 뉴런성 세포에서 STAT 유전자 활성화에 비하여 STAT 활성화에서 증가를 측정하는 것으로 이루어지고, 여기서 STAT 활성에서의 증가는 뉴런성 세포 상의 과립구 콜로니 자극 인자 수용체에 조합하는 화합물의 표시인 것인 방법.
  62. 제 61항에서, STAT 유전자는 STAT-3인 방법.
  63. 제 61항에서, STAT 유전자는 STAT-5인 방법.
  64. 제 61항의 방법에 따라서 확인된 화합물.
  65. 포유동물에서 신경학적 질환의 치료 방법으로, 포유동물에게 제64항의 화합물을 상기 신경학적 질환을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  66. 제 65항에서, 상기 신경학적 질환은 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 신경퇴행 질환 및 신경세포 사멸에 의해 동반된 신경계의 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환인 것인 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환은 뇌졸증인 것인 방법.
  69. 제 67항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 정신병적 질환인 것인 방법
  70. 제 69항에 있어서, 상기 정신병적 질환은 우울증인 방법.
  71. 제 57항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 치매 또는 다발성 경화증인 것인 방법.
  72. 제 68항에 있어서, 추가로 포유동물에 조직 플라스미노겐 활성제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  73. 제 65항에 있어서, 1이상의 추가 조혈 인자를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 상기 추가 조혈 인자는 마크로파지 자극 인자, 인터루킨 및 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  75. 제 65항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  76. 제 65항에 있어서, 상기 화합물은 직접 대뇌 주입, 정맥내 주입, 동맥내 주입, 경구 주입 및 피하주입으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 투여 방식에 의해 투여되는 방법.
  77. 향상된 GCSF 수용체 작용제(agonist) 활성을 갖는 화합물을 확인하는 방법으로,
    GCSF 수용체를 갖는 신경세포를 상기 화합물과 접촉시키고; 신경세포에 대해 상기 화합물의 신경보호 효과를 측정하고 그리고 GCSF 효과에 대해 상기 화합물의 효과를 비교하는 것으로 이루어지고, 여기서 GCSF 효과에 비하여 상기 화합물에 의한 더 높은 신경보호 효과는 상기 화합물이 향상된 GCSF 수용체 작용제 활성을 갖는다는 것을 표시하는 것인 방법.
  78. 제 77항의 방법에 따라서 확인된 화합물.
  79. 포유동물에서 신경학적 질환의 치료 방법으로, 포유동물에게 제78항의 화합물을 상기 신경학적 질환을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  80. 제 79항에서, 상기 신경학적 질환은 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 신경퇴행 질환 및 신경 세포 사멸에 의해 동반된 신경계의 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  81. 제 79항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환인 것인 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환은 뇌졸증인 것인 방법.
  83. 제 79항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 정신병적 질환인 것인 방법.
  84. 제 83항에 있어서, 상기 정신병적 질환은 우울증인 방법.
  85. 제 79항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 치매 또는 다발성 경화증인 것인 방법.
  86. 제 81항에 있어서, 추가로 포유동물에 조직 플라스미노겐 활성제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  87. 제 79항에 있어서, 1이상의 추가 조혈 인자를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  88. 제 87항에 있어서, 상기 추가 조혈 인자는 마크로파지 자극 인자, 인터루킨 및 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  89. 제 79항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  90. 제 79항에 있어서, 상기 화합물은 직접 대뇌 주입, 정맥내 주입, 동맥내 주입, 경구 주입 및 피하주입으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 투여 방식에 의해 투여되는 방법.
  91. 제 79항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 뇌졸증, 파킨슨병, 근위축성측삭경화증, 신경외상, 심장정지에 기인한 대뇌 허혈, 또는 수술 과정 중의 대뇌 허혈인 것인 방법.
  92. 향상된 GCSF 수용체 작용제 활성을 갖는 화합물을 확인하는 방법으로,
    GCSF 수용체를 갖는 신경세포를 상기 화합물과 접촉시키고; 신경세포에서 STAT 유전자 발현 수준을 GCSF와 접촉된 제2 신경세포와 비교하는 것으로 이루어지고, 여기서 제2신경세포에서 STAT 활성에 비하여 화합물과 접촉된 신경세포에서 STAT 활성의 증가는 상기 화합물이 향상된 GCSF 수용체 작용제 활성을 갖는다는 표시인 것인 방법.
  93. 제 92항에 있어서, 상기 STAT 활성은 STAT3 및 STAT5 활성화중 하나 또는 둘 다인 것인 방법.
  94. 제 92항의 방법에 따라서 확인된 화합물.
  95. 포유동물에서 신경학적 질환의 치료 방법으로, 포유동물에게 제94항의 화합물을 상기 신경학적 질환을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  96. 제 95항에서, 상기 신경학적 질환은 허혈 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환, 신경퇴행 질환 및 신경 세포 사멸에 의해 동반된 신경계의 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  97. 제 95항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환인 것인 방법.
  98. 제 97항에 있어서, 허혈 또는 저산소증 관련 병리생리학적 메카니즘을 갖는 신경학적 질환은 뇌졸증인 것인 방법.
  99. 제 95항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 정신병적 질환인 것인 방법.
  100. 제 99항에 있어서, 상기 정신병적 질환은 우울증인 방법.
  101. 제 95항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 치매 또는 다발성 경화증인 것인 방법.
  102. 제 95항에 있어서, 추가로 포유동물에 조직 플라스미노겐 활성제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  103. 제 95항에 있어서, 1이상의 추가 조혈 인자를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  104. 제 103항에 있어서, 상기 추가 조혈 인자는 마크로파지 자극 인자, 인터루킨 및 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  105. 제 95항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  106. 제 95항에 있어서, 상기 화합물은 직접 대뇌 주입, 정맥내 주입, 동맥내 주입, 경구 주입 및 피하주입으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 투여 방식에 의해 투여되는 방법.
  107. 제 95항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 뇌졸증, 파킨슨병, 근위축성측삭경화증, 신경외상, 심장정지에 기인한 대뇌 허혈, 또는 수술 과정 중의 대뇌 허혈인 것인 방법.
  108. 포유동물로 이식된 세포의 생존을 향상시키는 방법으로,
    GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 조혈인자를 코드하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포로 도입하는 것으로 이루어지고, 여기서 상기 세포는 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입하기 전 세포 생존에 비하여 세포의 생존을 향상시키기에 충분한 양으로 조혈인자를 발현하는 것인 방법.
  109. 제 108항에 있어서, 상기 세포는 추가로 1 이상의 추가 조혈인자를 발현하고 분비하는 것인 방법.
  110. 제 109항에 있어서, 상기 추가 조혈 인자는 마크로파지 자극 인자, 인터루킨 및 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  111. 제 108항에 있어서, 상기 조혈 인자는 GCSF 또는 GCSF 유도체인 방법.
  112. 제 108항에 있어서, 상기 조혈 인자는 GMCSF 또는 GMCSF 유도체인 방법.
  113. 제 108항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인 방법.
  114. 제 108항에 있어서, 상기 세포는 신경세포인 것인 방법.
  115. 제 114항에 있어서, 상기 신경세포는 신경 줄기세포인 것인 방법.
  116. 제 114항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 방법.
  117. 제 108항에 있어서, 상기 세포는 추가로 GCSF 수용체 및 GMCSF 수용체중 하나 또는 둘 다를 발현하는 것인 방법.
  118. 제 108항에 있어서, 상기 세포는 포유동물의 신경조직으로 이식되는 것인 방법.
  119. 신경세포 배양물의 생존을 향상시키는 방법으로,
    신경세포를, 조혈인자와 접촉전의 배양물에 비하여 신경세포 배양물의 생존성을 향상시키기에 충분한 양의 GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 조혈인자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  120. 제 119항에 있어서, 상기 신경세포 배양물은 신경 줄기세포를 포함하는 방법.
  121. 신경세포 배양물의 생존을 향상시키는 방법으로,
    GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 조혈인자로 발현되는 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 신경세포 배양물의 세포로 도입하는 것으로 이루어지고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 조혈인자를 접촉하기 전 배양물에 비하여 신경세포 배양물의 생존을 향상시키기에 충분한 양으로 조혈인자를 발현하는 것인 방법.
  122. 제 121항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 또는 리포좀으 로 투여되는 방법.
  123. 포유동물의 요구되는 인식 능력을 향상시키는 방법으로,
    GMCSF, GMCSF 유도체, GCSF, GCSF 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 조혈인자를 투여 전 포유동물에 비하여 포유동물의 인식 능력을 향상시키기에 충분한 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
  124. 제 123항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인 방법.
  125. 뇌에서 과립구 자극 인자 및 과립구 마크로파지 자극 인자중 1 이상의 내인성 수준을 증가시키는 화합물을 확인하는 방법으로,
    뉴런성 세포를 화합물과 접촉시키고; 그리고 화합물과 접촉되지 않은 뉴런성 세포에서의 수준과 비교하여 과립구 자극 인자, 과립구 마크로파지 자극 인자 또는 둘 다의 수준의 증가를 측정하는 것으로 이루어지고, 여기서 과립구 자극 인자, 과립구 마크로파지 자극 인자 또는 둘 다의 수준의 증가는 화합물이 뉴런성 세포에서 과립구 자극 인자, 과립구 마크로파지 자극 인자 또는 둘 다의 내인성 수준의 증가시킨다는 것의 표시인 것인 방법.
  126. 제 125항의 방법에 따라 확인된 화합물.
  127. 신경학적 질환 치료 방법으로, 포유동물에게 제 126항의 화합물을 신경학적 질환을 치료하기 위해 충분한 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 방법.
  128. 제 127항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
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