MXPA03002045A

MXPA03002045A - Composiciones analogas de factor estimulador de colonias de granulocitos y metodos para su elaboracion.

Info

Publication number: MXPA03002045A
Application number: MXPA03002045A
Authority: MX
Inventors: Casim A Sarkar
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2003-07-24
Also published as: AU2001290846B2; EP1319182A2; WO2002020766A3; AU2006201824A1; WO2002020766A2; MXPA03002046A; US7371370B2; AU9096001A; EP1317537B1; CY1107556T1; US20030166527A1; ES2276822T3; AU2001290960B2; AU9084601A; JP2004508044A; DK1317537T3; CA2421760A1; US6946548B2; WO2002020767A3; DE60125381D1

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones polipeptídicas análogas del factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"),ácidos nucleicos, plásmidos recombinantes de expresión, células hospederas relacionados y procesos para la producción recombinante de los análogos de G-CSF presentes. El concepto que se detalla en la presente involucra mutantes novedosos de G-CSF, utilizando sustitucionesúnicas de aminoácidos, las cuales se eligen de manera razonada para alterar el tránsito celular de G-CSF o de G-CSFR. Además, se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos de u

Description

COMPOSICIONES ANÁLOGAS DE FACTOR ESTIMULADOR DE COLONIAS DE GRANULOCITOS Y MÉTODOS PARA SU ELABORACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones análogas del polipéptido factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF" por sus siglas en inglés), ácidos nucleicos relacionados y vectores, células hospederas y procesos para la producción de ADN recombinante de los presentes polipéptidos análogos de G-CSF. Además, se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos de uso. Algunos aspectos de la invención pueden ser generalizados más allá de las composiciones de análogos de G-CSF también.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos ligandos terapéuticos inducen respuestas celulares al unirse a receptores de la superficie celular para inducir respuestas celulares. El diseño de medicamentos típicamente se enfoca en la capacidad de un ligando para unirse firmemente y de manera especifica a su objetivo propuesto. Sin embargo, si el medicamento es una proteína y el objetivo es un receptor de la superficie celular, existen problemas adicionales a considerar a partir de un análisis a REF: 145204 nivel de sistemas . Cuando los ligandos terapéuticos se unen a receptores en la superficie de una célula, se inicia una cascada de señalización intracelular que finalmente resulta en una respuesta celular apropiada. Adicionalmente , la modulación - generalmente atenuación - de estas señales comienza casi de inmediato con el tránsito celular de los complejos de 1igando-receptor . Los complejos en la superficie de la célula se internalizan en vesículas que se fusionan con los compartimientos endosómicos. Desde los endosomas, las moléculas se pueden dirigir a la degradación en los lisosomas o se reciclan a la superficie celular intacta, en donde se vuelven a mostrar el receptor libre y unido a ligando y se libera ligando libre al medio extracelular. Evidencia reciente sugiere el destino de esta decisión de clasificación para complejos que involucran factores de crecimiento o citocinas con frecuencia se relacionan con la constante de afinidad endosómica para la interacción ligando-receptor: los complejos que permanecen unidos se degradan fácilmente mientras que los que se disocian se reciclan [Lauffenburger et al., Chem. Biol. 5:R257-R263 (1998)]. En general, la disociación de complejos en endosomas parece aumentar el reciclado del receptor, debido a que resulta en interacciones alteradas entre los receptores y los componentes de retención endosómica. Adicionalmente, para un número pequeño de - - complejos intracelulares , lo cual es el caso de muchos sistemas de citocina-receptor clínicamente importantes, la elaboración del modelo indica una correlación positiva particularmente fuerte entre la afinidad endosómica inversa y la fracción de ligando reciclada [French and Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25:690-707 (1997)]. Por lo tanto, ai se debe diseñar un ligando para mejorar la disociación endosómica después de la unión y la generación de señales dentro de la célula objetivo, el medicamento puede reducir la regulación por disminución del receptor, de manera que las células pueden ser más sensibles a estimulación de ligando adicional. La duración y la eficacia del medicamento también puede mejorar si se aumentan el reciclado de ligando por disociación endosómica. Esto contrasta con el punto de vista convencional de intentar mejorar la potencia de ligando al aumentar la afinidad. Si los incrementos de afinidad extracelular se extienden a los endosomas, tales intentos en realidad pueden ser contraproducentes debido a que aumentan la regulación por disminución del receptor y posiblemente la supresión del ligando. Por lo tanto, el tránsito celular puede ser un cuello de botella para mejorar la potencia de ligando, particularmente en casos en donde la degradación a través de la endocitosis mediada por receptor es importante. Un sistema en el cual la optimización de las - - propiedades de tránsito celular puede tener un impacto profundo en la potencia ea aquél del factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF por sus siglas en inglés) y su receptor (G-CSFR, por sus siglas en inglés) . El G-CSF es una citocina de 19-kDa la cual es uno de los factores de crecimiento hematopoyéticos , también denominados factores estimuladores de colonia. Se utiliza G-CSF para aumentar las cuentas leucocíticas (neutró ilos) cuando las concentraciones sanguíneas de tales células son peligrosamente bajas. Esto sucede habitualmente cuando se administran ciertos antibióticos, en terapias contra VIH o en quimioterapias que suprimen a la médula ósea. Un estudio reciente documenta que G-CSF no solo aumenta el número de neutrófilos en sangre sino que también aumenta las capacidades de citólisis funcional de estas células también [Vecchiarelli et al., J. Infect. Dis. 171:1448-1454 (1995)]. G-CSF estimula de manera específica la proliferación y diferenciación de células precursoras neutrofílicas a neutrófilos maduros [Fukunaga et al., Cell 74:1079-1087 (1993)] y es útil para tratar estados neutropénicos [Welte et al., Proc. Nati. Acad. Sel. E.U.A. 82:1526-1530 (1985); Souza et al., Science 232:61-65 (1986); Gabrilove, Sem. Hematol. 26(2):1-14 (1989)]. G-CSF aumenta el número de granulocitos circulantes y se ha informado que disminuye la infección en modelos de septicemia. La administración de G- - - CSF también inhibe la liberación de factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) , una citocina importante para el daño de te ido durante la septicemia y el rechazo [Wendel et al., J. Irrununol . 149:918-924 (1992)]. G-CSF es un miembro de la superfamilia del grupo I de citocinas, caracterizadas por una estructura de conjunto helicoidal 4 antiparalelo y que incluye otros medicamentos terapéuticamente importantes tales como eritropoyetina y hormona del crecimiento. G-CSF se une específicamente y con alta afinidad (KD aparente - 100 pM) [ orstyn, Dexter, & Foote (eds.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) en: Clinical Practice , Edn. 2., arcel Dekker, Inc., New York (1998)] para G-CSFR, lo que resulta en un complejo de ligando: receptor con una estequiometría 2:2 [Horan et al., Biochemistry 35:4886-4896 (1996); Horan et al., J. Biochem. 121:370-375 (1997)]. La región extracelular de G-CSFR contiene un dominio que presenta homología con el receptor de citocina que se une a ligando (CRH) [Fukunaga et al., EMBO J. 10:2855-2865 (1991)] y recientemente se ha resuelto la estructura cristalina de G-CSF formando complejos con el dominio CRH de G-CSFR, lo que muestra la esperada estequiometría de ligando: receptor 2:2 [Aritomi et al., Nature, 401:713-717 (1999)]. En los humanos, G-CSF endógeno es detectable en plasma sanguíneo [Jones et al., Bailliere's Clin. Hematol. - - 2(1); 83-1111 (1989)]. G-CSF se produce por fibroblastos, macrófagos, linfocitos T, trofoblastos , células endoteliales y células epiteliales y es el producto de expresión de una sola copia de un gen constituido de cuatro exones y cinco intrones que se localiza en el cromosoma diecisiete. La transcripción de este locus produce una especie de ARNm la cual es procesada de manera diferencial, que resulta en dos formas de ARNm para G-CSF, una versión codifica para una proteína de 177 aminoácidos, la otra codifica para una proteína de 174 aminoácidos [Nagata et al., EMBO J. 5:575-581 (1986)]. Se ha encontrado que la forma constituida de 174 aminoácidos tiene actividad biológica in vivo específica. La SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 presenta un ADN que codifica para la especie de 174 aminoácidos de G-CSF y la secuencia correspondiente de aminoácidos se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. G-CSF da una reacción cruzada entre especies, de manera que cuando G-CSF humano se administra a otro mamífero tal como un ratón, perro o mono, se induce leucocitosis neutrofílica sostenida [Moore et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 84:7134-7138 (1987) ] . Se puede obtener y purificar G-CSF humano de muchas fuentes. Se puede aislar G-CSF humano natural de sobrenadantes de líneas de células tumorales humanas cultivadas. El desarrollo de la tecnología de ADN - - recombinante ha permitido la producción de cantidades a escala comercial de G-CSF en forma glucosilada como un producto de la expresión de células hospederas eucariotas y de G-CSF en forma no glucosilada como un producto de la expresión de células hospederas procariotas. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,810,643 (Souza) incorporada en la presente como referencia. Se ha encontrado que G-CSF es útil en el tratamiento de indicaciones en donde un aumento de neutrófilos proporcionará beneficios. Por ejemplo, para pacientes con cáncer, G-CSF es benéfico como un medio para estimular selectivamente la producción de neutrófilos para compensar las deficiencias hematopoyéticas que resultan de quimioterapia o terapia por radiación. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y condiciones relacionadas, tales como septicemia, la cual típicamente es causada por un metabolito de bacteria. G-CSF también es útil solo, o combinado con otros compuestos tales como otras citocinas, para el crecimiento o expansión de células en cultivo (por ejemplo para transplantee de médula ósea o para expansión ex vivo) . Se ha administrado G-CSF a pacientes sometidos a transplantes como un adyuvante para el tratamiento de infección o para el tratamiento de neutropenia [Diflo et al., Hepatology 16:PA278 (1992); Wright et al., Hepatology 14:PA48 (1991); Lachaux et al., J.

- - Ped. 123:1005-1008 (1993); Colquehoun et al . , Transplantation 56:755-758 (1993)]. Sin embargo, G-CSF es depurado rápidamente a través de endocitosis mediada por receptor por neutrófilos periféricos y células precursoras en médula ósea que expresa G-CSPR [Morstyn, Dexter, & Foote (eds.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) en: Clinical Practice, Edn. 2., Marcel Dekker, Inc., New York (1998)]. Por lo tanto, la potencia del medicamento se reduce por este mecanismo de retroalimentación negativa. Dado que las células expresan de manera natural G-CSFR en bajas cantidades, una disminución de la afinidad endosómica del complejo puede no solo reducir la regulación por disminución del receptor sino también puede aumentar el reciclado del ligando, como se predice por el establecimiento del modelo [Frenen y Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25:690-707 (1997)]. Por lo tanto, G-CSF es un candidato idóneo para la mutagénesis con el fin de mejorar las propiedades de tránsito y de esta manera mejorar la potencia del medicamento. Se han reportado diversos G-CSF alterados. Generalmente, para el diseño de medicamentos se sabe que ciertos cambios tienen ciertos efectos estructurales. Por ejemplo, la supresión de una cisteína puede resultar en el desdoblamiento de una molécula la cual, en su estado no alterado, habitualmente se pliega por medio de un puente disulfuro. Existen otros métodos conocidos por los expertos - Si ¬ en la técnica para agregar, suprimir o sustituir aminoácidos con el fin de cambiar la función de una proteína. Se han preparado imitantes de G-CSF humano recombinante, pero el método de preparación no incluye la información de relación total de estructura/función. Por ejemplo, se ha reportado la mutación y modificación bioquímica de Cys 18 [Kuga et al., Biochem. Biophy. Rea. Coirm. 159:103-111 (1989) ; Lu et al., Arch . Biochem. Biophys . 268 : 81-92 (1989) ] . En la patente de E.U.A. No. 4,810,643, intitulada "Production of Pluripotent Granulocyte Colony-Stimulating Factor" (incorporada en la presente como referencia) , se describen de manera general análogos polipeptídicos y fragmentos peptídicos de G-CSF. LOB análogos específicos de G-CSF descritos incluyen aquéllos con las cisteínas en las posiciones 17, 36, 42, 64 y 74 (de la especie con 174 aminoácidos o de aquélla que tiene 175 aminoácidos, el aminoácido adicional es una metionina N terminal) sustituidos con otro aminoácido (tal como serina) y G-CSF con una alanina en la primera posición (N terminal) . EP 0 335 423 intitulada "Modified human G-CSF" describe, según se informa, la modificación de por lo menos un grupo aminoácido en un polipéptido que tiene actividad de hG-CSF. EP 0 272 703 intitulada "Novel Polypeptide" - - describe, según se informa, derivados de G-CSF que tienen un aminoácido sustituido o suprimido en o "en la vecindad" de la parte N terminal. Además, Okabe et al. [Blood 75(9):1788-1793 (1990)], describen, según se informa, modificaciones de cinco posiciones de la región N terminal de G-CSF humano. EP 0 459 630, intitulada "Polypeptides" describe, según se informa, derivados de G-CSF que se presentan de manera natural que tienen por lo menos una de las propiedades biológicas de G-CSF que se presentan de manera natural y una estabilidad en solución de por lo menos 35% a 5 mg/ml en el cual el derivado tiene por lo menos Cys17 de la secuencia nativa sustituido por un residuo Ser17 y Asp27 de la secuencia nativa sustituida por un residuo Ser27. EP 0 256 843 intitulada "Expression of G-CSF and Muteins Thereof and Their Uses", describen, según se informa, una secuencia de ADN modificada que codifica para G-CSF en donde la parte N terminal se modifica para expresión aumentada de proteína en células hospederas recombinantes , sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína. EP 0 243 153 intitulada "Human G-CSF Protein Expression", describen, según se informa, G-CSF que se va a modificar al inactivar por lo menos un sitio de procesamiento de proteasa KEX2 de levadura para rendimiento aumentado en producción recombinante utilizando levadura.

- - Shaw, patente de E.U.A. No. 4,904,584, intitulada "Site-Specific Homogeneoua Modification of Polypeptides" , describe, según se informa, proteínas alteradas con lisina. WO/9012874 describe, según se informa, variantes de proteínas alteradas con cisteína. El documento de solicitud de patente australiana No. AU-A-10948/92 , intitulado, "Improved Activation of Recombinant Proteins" describe, según se informa, la adición de aminoácidos a cualquiera de las partes terminales de una molécula de G-CSF con el propósito de ayudar en la naturalización de la molécula después de expresión procariótica . El documento de solicitud de patente australiana No. AU-A-76380/91, intitulado "Muteins of the Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)" describe, según se informa, muteinas de G-CSF en la secuencia Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile en la posición 50-56 de G-CSF con 174 aminoácidos, y la posición 53 a 59 de G-CSF con 177 aminoácidos, o por lo menos uno de los cuatro residuos histidina en las posiciones 43, 79, 156 y 170 de G-CSF maduro con 174 aminoácidos o en las posiciones 46, 82, 159 ó 173 de G-CSF maduro con 177 aminoácidos. GB 2 213 821, intitulada "Synthetic Human Granulocyte Colony Stimulating Factor Gene" describe, según se informa, una secuencia de ácido nucleico que codifica para G-CSF sintético que incorpora sitios de restricción para facilitar la mutagénesis por cásete de regiones seleccionadas, y sitios de restricción flanqueantes para facilitar la incorporación del gen en un sistema de expresión deseado. La patente de E.U.A. No. 5,214,132 describe, según se informa, la modificación de G-CSF humano en las posiciones de aminoácido 1, 3, 4, 5 y 17 [véase también, Kuga et al., Biochem. Biophye . Res. Commun. 159:103-111 (1989) ] . La patente de E.U.A. No. 5,218,092 describe, según se informa, la modificación de G-CSF humano en las posiciones de aminoácidos 1, 3, 4, 5, 17, 145 y 147. La patente de E.U.A. No. 5,581,476 (incorporada como referencia en la presente) describe la estructura tridimensional de G-CSF a nivel atómico. A partir de esta estructura tridimensional, uno puede pronosticar con certidumbre sustancial qué cambios en la composición de la molécula de G-CSF pueden resultar en cambios estructurales. Estas características estructurales se pueden correlacionar con la actividad biológica para diseñar y producir análogos de G-CSF. La transducción de señal, la manera en la cual G-CSF afecta el metabolismo celular, no se ha comprendido a profundidad hasta ahora. En general, G-CSF se une y activa - - al receptor de superficie celular de G-CSF mediante cambios conformacionales . Esta unión por lo tanto inicia una cascada de señalización (por ejemplo reclutando cinaaas al dominio citoplásmico) lo que aparentemente inicia los cambios dentro de células progenitoras particulares, lo que lleva a respuestas celulares tales como diferenciación, proliferación y migración. Se considera que el complejo G-CSF/G-CSFR experimenta procesos de tránsito endocítico de internalización y clasificación para reciclado o degradación [Lauffenburger, y Linderman, Receptors : Modela for Binding, Trafficking, and Signaling, New York: Oxford University Press (1993) ] . La captación endocítica de G-CSF potencia la degradación de citocina proteolítica intracelular en compartimientos endosómicos o lisosómicos. Los receptores de citocina internalizados, si no se reciclan, pueden ser destruidos. Por lo tanto, el tránsito endocítico puede provocar disminución de G-CSF del medio extracelular, así como regulación por disminución del receptor de G-CSF. En consecuencia, sería benéfico alterar la estructura de G-CSF de manera que retenga activación de receptor apropiada para transducción de señal, pero que disminuye la internalización endocítica o que mejore la clasificación endosómica hacia el reciclado en vez de hacia la degradación [Lauffenburger y Linderman et al., Scratching The (Cell) Surface: Cytokine - - Engineering For Improved Ligand/Receptor Trafficking Dynamics, Chew & Biol 5:R257-R263 (1988)]. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar ligandos terapéuticos mejores de G-CSF. Tales agentes pueden tener vidas medias más prolongadas e inducir mayor proliferación celular si el ligando ya no es tan susceptible de endocitosis y degradación lisosómica subsecuente. En consecuencia, un objetivo de la presente invención es proporcionar estos ligandos y métodos para su producción y prueba.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En esta invención describimos un enfoque para mejorar la potencia de G-CSF mediante mejoras diseñadas en el tránsito celular. Se ha encontrado que las sustituciones de la presente invención resultan en análogos de G-CSF que tienen un efecto sobre el tránsito celular en comparación con G-CSF de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 o con G-CSF recombinante que tiene un residuo metionina en la posición -1 ("metG-CSF" o "r-met-HuG-CSF" por sus siglas en inglés) . A menos que se indique de otra manera en la presente, estas especies se denominan colectivamente como de "tipo silvestre" . Los efectos de estas modificaciones demuestran ventajas en estabilidad y potencia, las cuales no - - se observan en otras especies de G-CSF. En particular, estos análogos proporcionan una respuesta celular mejorada (actividad de tipo agonista del G-CSF) . Tales cambios en la respuesta celular se producen al alterar la unión al receptor de G-CSF o los procesos de clasificación, reciclado y degradación por medio de las vías de tránsito endocítico 1igando/receptor . La presente invención se relaciona con polipéptidos análogos de G-CSF humano que comprenden una sustitución de aminoácido en la secuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 que se seleccionan del grupo que consiste de: 1) una sustitución de ácido aspártico con histidina en la posición No. 109, [His109] G-CSF ; 2) una sustitución de ácido aspártico con histidina en la posición No. 112, [His112] G-CSF; 3) una sustitución de glutamina con histidina en la posición No. 119; [His119] G-CSF; y 4) cualquiera de los análogos polipeptídicos que opcionalmente incluyen un residuo metionilo N terminal . Tales análogos pueden deriva izar adicionalmente con uno o más polímeros hidrosolubles . En otro aspecto adicional, la invención proporciona polinucleótidos que codifican para polipéptidos análogos de G-CSF humano descritos antes. Los polinucleótidos preferidos actualmente se establecen en las secuencias de ADN de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NO: 3, 5 ó 7 (y cadenas complementarias) e incluyen aquéllos que codifican adicionalmente un residuo metionilo N terminal. En otro aspecto adicional, la invención abarca un plásmido recombinante de expresión que contiene un polinucleótido como se establece en lo anterior. Además, la invención proporciona una célula hospedera que contiene el polinucleótido que se establece en lo anterior. Las células hospederas preferidas actualmente se seleccionan del grupo que consiste de bacterias, células de mamífero, células tumorales, células de levadura y células de insecto. En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para producir polipéptidos análogos de G-CSF, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, [His119] G-CSF y especies Met"1 de las mismas a partir de una célula hospedera que contiene ácido nucleico que codifica para tales análogos, en donde el proceso comprende: cultivar la célula hospedera que contiene el polipéptido que se establece en lo anterior bajo condiciones que facilitan la expresión de tal polipéptido; y obtener tal polipéptido análogo de G-CSF. La invención también proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido análogo de G-CSF, como se establece en lo anterior y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden utilizar en los métodos para tratar las condiciones hematopoyéticas , neurológicas o relacionadas con la reproducción constituidas de la administrción de una cantidad eficaz de una composición como se establece en lo anterior a un paciente en necesidad de la misma. Tales condiciones incluyen una función hematopoyética reducida, función inmunitaria reducida, cuenta neutrofílica reducida, movilización neutrofílica reducida, movilización de células progenitoras sanguíneas periféricas, septicemia, neutropenia crónica grave, transplantes de médula ósea, enfermedades infecciosas, leucopenia, trombocitopenia, anemia, mejoramiento de injertado de médula ósea durante el transplante, mejoramiento de la recuperación de la médula ósea en el tratamiento de radiación, aplasia de médula ósea inducida química o quimioterapéuticamente o mielosupresión y síndrome de inmunodeficiencia adquirida. En otro aspecto adicional, la invención proporciona un método para sensibilizar células para quimioterapia y radioterapia que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica como se establece en lo anterior a un paciente en necesidad del mismo . La invención también proporciona un método para cultivar células hematopoyéticas in vi tro, que comprende: colocar las células en un medio de cultivo adecuado, el medio de cultivo adecuado contiene un polipéptido análogo de - - G-CSF como se establece en lo anterior; y proporcionar condiciones adecuadas para el crecimiento de las células hematopoyéticas . La invención también proporciona un método como se establece en lo anterior, en donde el tratamiento, sensibilización o cultivo incluye el uso de por lo menos un factor adicional que se selecciona de entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas , IGF-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 y un factor de crecimiento de fibroblastos. De manera correspondiente, la invención proporciona un equipo que contiene componentes para cultivar células hematopoyéticas, constituido de: cualquiera de los análogos polipeptídicos que se establecen en lo anterior; componentes adecuados para preparar un medio para cultivar células hematopoyéticas; y opcionalmente, por lo menos un factor adicional como se establece en lo anterior.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado que G-CSF es útil en el tratamiento de diversas condiciones en donde un incremento en los neutrófilos proporcionará beneficios. Por ejemplo, para pacientes con cáncer, el G-CSF es benéfico como un - - medio para estimular selectivamente la producción de neutrófilos para compensar deficiencias hematopoyéticas que resultan de quimioterapia o terapia de radiación. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y condiciones relacionadas, tales como septicemia, las cuales típicamente son causadas por un metabolito de la bacteria. G-CSF también es útil solo o combinado con otros compuestos, tales como otras citocinas, para el crecimiento o expansión de células en cultivo (por ejemplo, para transplantes de médula ósea o expansión ex vivo) . Se ha administrado G-CSF a pacientes sometidos a transplantes como un adyuvante para el tratamiento de infección o para el tratamiento de neutropenia. Sin embargo, es depurado rápidamente a través de endocitosis mediada por receptor por neutrófilos periféricos y células precursoras en médula ósea que expresan G-CSFR y por lo tanto, la potencia del medicamento se reduce por este mecanismo de retroalimentación negativa. Debido a que las células expresan de manera natural G-CSFR en bajas cantidades, una disminución de la afinidad endosómica del complejo puede no solo reducir la regulación por disminución del receptor sino que también puede mejorar el reciclado de ligando, como se predice por el modelo hipotético. Por lo tanto, se puede mejorar la potencia del medicamento de G-CSF por mutaciones a G-CSF que pueden mejorar las propiedades de tránsito.

- - La presente invención proporciona polipéptidos análogos de G-CSF novedosos los cuales presentan ventajas en estabilidad los cuales no se observan en otras especies de G-CSF. En particular, estos análogos proporcionan una respuesta celular mejorada (actividad de tipo superagonista o agonista de G-CSF) en comparación con G-CSF de tipo silvestre. Tales cambios en la respuesta celular se producen al alterar la unión del receptor de G-CSF o bien los procesos de clasificación, reciclado y degradación por medio de las vías de tránsito endocítico de ligando/receptor. Todos los cambios análogos de la presente invención se basan en la secuencia de 174 aminoácidos para G-CSF en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. Un experto en la técnica apreciará que los análogos de la presente invención también se pueden construir con un residuo metionina N terminal . Los encabezados de sección se utilizan en la presente únicamente con propósitos de organización y no se deben considerar de manera alguna como limitantes de la materia objeto que describen.

A. Papel de 6-CSF en el tratamiento de neutropenla Se ha encontrado que G-CSF es útil en el tratamiento de condiciones en donde un incremento en - - neutrófilos proporcionará beneficios. Por ejemplo, para pacientes con cáncer, G-CSF es benéfico como un medio para estimular selectivamente la producción de neutrófilos para compensar las deficiencias hematopoyéticae que resultan de la quimioterapia o la terapia por radiaciones. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y condiciones relacionadas tales como septicemia, la cual típicamente es causada por un metabolito de las bacterias. G-CSF también es útil solo o combinado con otros compuestos, tales como otras citocinas, para crecimiento o expansión de células en cultivo (por ejemplo, para transplantes de médula ósea o expansión ex vivo) . Se ha administrado G-CSF a pacientes sometidos a transplantes como un adyuvante para el tratamiento de infección o para el tratamiento de neutropenia [Diflo et al., Hepatology 16:PA278 (1992); Wright et al., Hepatology 14-.PA48 (1991); Lachaux et al., J. Ped. 123:1005-1008 (1993); Colquehoun et al., Transplantatlon 56:755-758 (1993) ] . El término "neutropenia" se refiere a una condición con un número anormalmente bajo de neutrófilos en circulación periférica. Los neutrófilos surgen de la médula ósea y están completamente inmaduros cuando son liberados a la circulación. De este modo, se preparan completamente para funcionar en su papel como una defensa de primera línea o - defensa celular. Se activan, es decir, son capaces de realizar muchas de sus funciones, al exponerlos a ciertos mediadores proinflamatorios y a factores quimiotácticos que los atraen al sitio de un estímulo desencadenante. La neutropenia grave puede poner en peligro la vida debido a que puede llevar a infecciones graves. De manera alternativa, el término "neutrofilia" se refiere a una condición en donde existe un número anormalmente elevado de neutrófilos en circulación periférica. La neutrofilia o una cuenta leucocítica aumentada tiene muchas causas, que incluyen exposición a frío extremo, calor, cirugía reciente, trauma físico, infección de cualquier tipo, quemaduras, choques, tumores, inflamación sin infección tales como gota, artritis, problemas en tiroideos y drogas.

B. Análogos de O-CSF de la presente invención La presente invención contempla la producción de análogos de polipéptidos de G-CSF de tipo silvestre y sus polipéptidos codificantes, en donde: 1) la histidina sustituye al ácido aspártico en la posición 109, [His109]G-CSF; 2) la histidina sustituye al ácido aspártico en la posición 112, [His112] G-CSF; y 3) la histidina sustituye a la glutamina en la posición 119, [His119] G-CSF y las especies - - Met" de las mismas. Las sustituciones anteriores concuerdan con la numeración de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. Las secuencias de aminoácidos para estos tres análogos se pueden encontrar en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 4, 6 y 8, respectivamente. La presente invención contempla la producción de polipéptidos análogos de G-CSF humanos que tienen una potencia aumentada en relación a G-CSF de tipo silvestre para estimular la proliferación celular y vidas medias aumentadas. Tales cambios en la respuesta celular se producen al alterar la unión del receptor de G-CSF o el proceso de clasificar, reciclar y degradación por medio de las vías de tránsito endocítico de ligando/receptor. Estos análogos fueron desarrollados por medio de infraestructura de conmutación general para el diseño de ligandos utilizando sustituciones únicas a histidina, las cuales actúan como conmutadores activados por pH para mejorar sus propiedades de tránsito celular. La estrategia que se describe en la presente aprovecha la diferencia de pH entre el medio extracelular y los compartimientos endosómicos como un conmutador para la protonación de histidina para reducir la afinidad endosómica del complejo ligando-receptor y esto se predice que mejora el reciclado del ligando intacto nuevamente al medio extracelular. La selección de residuos para mutación a histidina es guiada por consideraciones electrostáticas. La intención - - es crear análogos de G-CSF puedan unir G-CSFR con cercanía (o si es posible, con mayor) afinidad de tipo silvestre para la histidina neutra pero que se unan poco a histidina cargada positivamente. A pH ácido, la afinidad de unión puede verse disminuida de la que se observa a pH neutro por el costo de la desprotonación de histidina en G-CSF no unida [Yang y Honig, J. Mol. Biol . 231:459-474 (1993)]. Si la pKa de histidina en la proteína no unida es de 6.5 [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742:576-585 (1982)], esto resultará en una afinidad 10 veces menor a pH 5.5. Se identifican mutaciones candidato de histidina mediante un procedimiento de tres partes in silico. En primer lugar, se cuantificó la naturaleza de las interacciones de unión electrostáticas utilizando un método [Kangas y Tidor, J. Chem. Phys . 109:7522-7545 (1998)] que cuenta explícitamente la desolvatación de ligando e interacción y que localiza regiones en la interfase que de alguna manera son demasiado negativas o demasiado positivas para unión óptima. En segundo lugar, se llevó a cabo un ensayo de análogos de G-CSF histidina (tanto neutros como cargados positivamente) y con minimización de energía. En tercer lugar, se calculó la energía libre de unión electrostática de cada uno. El concepto que se detalla en la presente involucra mutantes novedosos de G-CSF los cuales fueron - - elegidos de manera razonada. Se utilizó la estructura cristalina de complejo entre G-CSF y su receptor, G-CSFR para calcular el potencial electrostático neutro como la interfaz de unión principal entre el ligando y el receptor. Los residuos aminoácidos en G-CSP los cuales contribuyeron con el potencial electrostático neutro residual fueron elegidos como candidatos para mutagéneais. La predominancia de regiones negativas exteriores indica una densidad de carga negativa excesiva, que incluye posiciones que corresponden a los residuos cargados Glu19, Asp109 y Asp112, así como los residuos polares Gln20, Thr116 y Gln119, que indica que existe una densidad de carga positiva correspondiente insuficiente desde el receptor. Las contribuciones electrostáticas a la unión se pueden mejorar con una carga negativa disminuida sobre el ligando en estos seis sitios; se puede tolerar en el complejo una histidina neutra, pero una histidina cargada postivamente puede repeler la densidad de carga positiva del receptor. Para probar estos sitios, se construyen mutantes de histidina individuales por vía computacional sobre los residuos identificados . Utilizando la estructura cristalográfica tridimensional del complejo entre G-CSF y su receptor (G-CSFR) , se puede calcular el potencial electrostático en la interfaz de unión principal entre el ligando y el receptor.

- - Véase la patente de E.U.A. No. 5,581,476 (incorporada en la presente como referencia); Aritomi et al., Nature 401 (6754) ,-713-718 (1999). Los residuos aminoácidos sobre G-CSF que contribuyen con el potencial electrostático neto residual se eligen como candidatos para rautagénesis. Se identicaron seis de tales residuos en G-CSF: Asp112, Asp109, Gln119, Gln20, Thr116 y Glu19. En particular, se han realizado y probado tres de las sustituciones de histidina única propuestas : Asp109His ( [His109] G-CSF) , Asp112HÍs ( [His112] G-CSF) y Gln119His ( [His119] G-CSF) (utilizando la numeración de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 con la metionina en -1) . El fundamento razonado para la mutagénesis de histidina de G-CSF es alterar el tránsito celular de G-CSF o de G-CSF , o ambos. Al unirse a G-CSFR sobre la superficie de una célula, se internaliza G-CSF dentro de la célula y se realiza una decisión de clasificación en las versículas endosómicas . Los componentes del complejo que pueden ser degradados en los lisosomas o bien reciclados de regreso a la superficie, intactos. Se conocen muchos otros sistemas de ligando/receptor que cuando el ligando y el receptor permanecen en un complejo, son de manera preferencial degradados; sin embargo, si el complejo se disocia en los endosomas , existe un reciclado aumentado del ligando o del receptor, o de ambos. En la superficie de la célula, el pH del ambiente en general es 7.0; en los endosomas, el pH es - - de aproximadamente 5.0-6.0. Dado que el aminoácido histidina es el único residuo el cual se espera que presente alteraciones en este intervalo de pH, se espera que la sustitución con histidina altere las propiedades de tránsito celular. Más específicamente, dado que los mutantes de histidina alteran las propiedades de tránsito en base en las diferencias en la energía libre de unión electrostática a pH 7.0 veraus pH 5.0, debido únicamente a la protonación de la histidina mutada a pH 5.0. Contemplando de manera específica por la presente invención está la mutagénesis específica de sitio de las secuencias genómica, de TADNc, y de ADN sintético del polipéptido de G-CSF de tipo silvestre. Las secuencias polinucleotídicas preferidas actualmente de la invención incluyen las secuencias de ADN de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 [His109] G-CSF ; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 [His112] G-CSF; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7 [Hislls] G-CSF; y las especies Met"1 de las mismas. Estas secuencias de ADN también se pueden modificar para codificar otra versión de G-CSF que tiene por lo menos una de las propiedades biológicas hematopoyéticas de G-CSF humano que se presenta de manera natural . Preferiblemente, la propiedad biológica es la propiedad de unión a un receptor de G-CSF, pero otra propiedad biológica es la capacidad de estimular la proliferación de células hematopoyéticas . Otras propiedades biológicas serán evidentes para aquéllos expertos en la técnica (véase además Souza, eupra) . Estas secuencias de ADN pueden incorporar codones que faciliten la transcripción y traducción de ARNm en hospederos microbianos . Tales secuencias de fabricación se pueden construir fácilmente de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Véase también, Alton et al., solicitud publicada PCT WO 83/04053. Los ADN anteriores también se pueden codificar opcionalmente con un residuo metionilo N terminal . Las secuencias de ADN proporcionadas por la invención son útiles para generar vectores de ADN virales y plasmídicos nuevos y útiles así como células hospederas procarióticas y eucarióticas transformadas y transíectadas nuevas y útiles (que incluyen a células bacterianas, de levadura y de mamífero que crecen en cultivo) así como métodos nuevos y útiles para el crecimiento cultivado de tales células hospederas capaces de expresión de los análogos de G-CSF actuales. Las secuencias de ADN que codifican para análogos de G-CSF biológicamente activos en la presente (o los ARN correspondientes) pueden ser útiles para terapia de genes en casos en donde se pueda aliviar la producción insuficiente de G-CSF, o en donde se necesiten concentraciones aumentadas de G-CSF.

- - La presente invención también proporciona un proceso para la producción recombinante de ADN de los presentes análogos de G-CSF. Se proporciona un proceso para elaborar análogos de G-CSF a partir de una célula hospedera que contiene ácido nucleico que codifica para tales análogos, constituido de: a) cultivar la célula huésped que contiene el ácido nucleico que codifica para tales análogos de G-CSF bajo condiciones que facilitan la expresión de tal molécula de ADN; y b) obtener tales análogos de G-CSF. Uno opcionalmente puede purificar y aislar los análogos de G-CSF de otros componentes obtenidos en el proceso. Los métodos para purificación se pueden encontrar en la patente de E.U.A. No. 5,849,883 (incorporada en la presente como referencia) . Otros métodos son bien conocidos en la técnica (Véase también Souza, supra) . Las células hospederas pueden ser procarióticas o eucarióticas e incluyen células de bacterias, de mamíferos (tales como las células de ovario de hámster chino (CHO) , células de mono, células de riñón de hámster bebé, células cancerosas u otras células) , células de levadura y células de insecto. Las preferidas en cuanto a mayor facilidad en la producción comercial es la producción mediante la utilización de células hospederas bacterianas.

- - C. Producción de proteína Dada la descripción anterior de los polpéptidos análogos de G-CSF humano, será posible para una persona experta en la técnica producir polipéptidos análogos de G-CSF humano mediante síntesis peptídica automatizada mediante técnicas recombinantes , o por ambos métodos. Los análogos de G-CSF humano de la invención se pueden sintetizar en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Están disponibles comercialmente diversos sintetizadores automáticos y se pueden utilizar de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc . 105:6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-347 (1986) ; y Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer (eds.), Academic Press, New York, 1-284 (1979), cada uno incorporado en la presente como referencia. La proteína activa se puede sintetizar fácilmente y después se puede someter a análisis en ensayos de determinación diseñados para identificar péptidos reactivos. De manera alternativa, se pueden utilizar diversos sistemas de vector de expresión/hospedero que contengan y expresen una secuencia codificante para el análogo de G-CSF humano. Estos incluyen, pero no se limitan a microorganismos - - tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes , vectores de expresión de ADN plásmidos o cósmidos; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo baculovirus) ; sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo el plásmido Ti o Pbr322) ; o sistemas de células animales. Las células de mamífero que son útiles en las producciones de proteínas recombinantes incluyen, pero no se limitan a células VERO, células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) , células COS (tales como COS-7) , y células 138, BHK, HepG2 , 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12 , K562 y 293. Los protocolos ejemplares para la expresión recombinante de la proteína se describen a continuación en lo siguiente. Se puede utilizar un sistema de levadura para generar análogos de G-CSF humanos de la presente invención. La región codificante del ADNc para el análogo de G-CSF humano se amplifica por PCR. Un ADN que codifique para la secuencia líder pre-pro-oc de levadura se amplifica a partir de ADN genómico de levadura en una reacción de PCR utilizando un cebador que contiene nucleótidos 1-20 del gen - - para el factor coincidente a y otro cebador complementario con los nucleótidos 255-235 de ' este gen [Kurjan y Herskowitz, Cell 30:933-943 (1982)] . La secuencia codificante para el líder pre-pro-a y los fragmentos de la secuencia que codifican para el análogo de G-CSF humano se ligan en un plásmido que contiene el | promotor de levadura de alcohol deshidrogenasa (ADH2) , de manera que el promotor dirige la expresión de una proteina de fusión que consiste del factor pre-pro- fusionado al polipéptido análogo de G-CSF humano maduro. Como se describe por Rose y Broach [Meth. Enz. 195:234-279, Goeddel (ed.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990) ] , el vector incluye además un terminador de i transcripción ADH2 hacia el extremo 3' del sitio de clonación, el origen de replicación de levadura "2-micron", el gen de levadura leu-2d, los genes de levadura REP1 y j REP2, el gen ß-lactamasa de E . ^coli y el origen de replicación de E. coli. Los genes de ß-lactamasa y leu-2d proporcionan la selección en bacterias y levaduras, respectivamente. El gen leu-2d facilita un número aumentado de copias del plásmido en levadura para inducir concentraciones más altas de expresión. Los genes REP1 y REP2 codifican para proteínas involucradas en la regulación del número de copias del plásmido. El plásmido recombinante de ADN descrito en el párrafo precedente ae transforma en células de levadura utilizando un método conocido, por ejemplo tratamiento con acetato de litio [Stearns et al., eth. Enz. 185:280-297 (1990)]. El promotor ADH2 se induce mediante supresión de glucosa en el medio de crecimiento [Price et al. Gene 55:287 (1987)] . La secuencia pre-pro-oc lleva a cabo la secreción de la proteína de fusión desde las células. De manera concomitante, la proteína KEX2 de levadura separa la secuencia pre-pro de los análogos de G-CSF humanos maduros [Bitter et. al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 81:5330-5334 (1984) ] . De manera alternativa, ae pueden expresar de manera recotribinante análogos de G-CSF humanos en levadura, utilizando un sistema de expresión disponible comercialmente , por ejemplo el sistema de expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se basa en la secuencia pre-pro- para secreción directa, pero la transcripción de la pieza de inserción es activada por el promotor de alcohol oxidasa (AOX1) por inducción con metanol . El análogo de G-CSF humano secretado se purifica del medio de crecimiento de levadura, por ejemplo por métodos utilizados para purificar el análogo de G-CSF humano de sobrenadantes de células bacterianas y de mamífero.

- - Alternativamente, el ADNc que codifica para los análogos de G-CSF humano ae pueden clonar en el vector de expresión de baculovirus pVL11393 (PharMingen, San Diego, CA) . Este vector que contiene análogo de G-CSF humano deapuéa se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio sF9 sin proteínas y producir proteína recombinante , La proteína se purifica y concentra desde el medio utilizando una columna de heparina-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) y columnas secuenciales para determinación de tamaño molecular (Amicon, Beverly, MA) , y se resuspende en PBS . El análisis por SDS-PAGE muestra una banda única y confirma el tamaño de la proteína y el secuenciado de EDMAN en un secuenciador Protón 2090 Peptide confirma la secuencia N terminal. Alternativamente, se pueden expresar análogos de G-CSF humano en un sistema de insecto. Los sistemas de insecto para expresión de proteínas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se utiliza uno de tales sistemas, el virus de polihedrosis nuclear de autógrafa californica (AcNPV) para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichopluaia. La secuencia codificante del análogo de G-CSF humano se clona en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y se coloca bajo el control del promotor de - - polihedrina. La inserción exitosa del análogo de G-CSF humano volverá inactivo al gen de polihedrina y producirá un virus recombinante que carezca del recubrimiento de proteína de cubierta. Los virus recombinantes después se utilizan para infectar células de S. fruglperda o larvas de Trichoplusia en las cuales se expresa el análogo de G-CSF humano [Smith et al., J. Virol. 46:584 (1983); Engelhard EK et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 91:3224-7 (1994)]. En otro ejemplo, la secuencia de ADN que codifica para la forma madura de la proteína se amplifica por PCR y se clona en un vector apropiado, por ejemplo, pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ) . El vector pGEX se diseña para producir una proteína de fusión que comprende glutathion-S-transferasa (GST) , codificada por el vector, y una proteína codifica por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Se pueden generar cebadores para la PCR de manera que incluyan, por ejemplo, un sitio apropiado de separación. La proteína de fusión recombinante después se puede separar de la porción de GST de la proteína de fusión. El plásmido recombinante constituido por pGEX-3X/análogo de G-CSF humano se transforma en células E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA) , y los individuos transformantes se aislan y se hacen crecer. El ADN plasmídico de transformantes individuales se purifica y secuencia parcialmente utilizando un secuenciador automatizado para confirmar la preaencia de la pieza de inserción del gen que codifica para el análogo de G-CSF humano deseado, en la orientación apropiada. Si bien algunas modalidades de la presente invención contemplan producir proteína de análogo de G-CSF humano utilizando sintetizadores de péptidos sintéticos y análisis de FPLC subsecuente así como renaturalización apropiada de los dobles enlaces de cisteina, se contempla que la producción de proteína recombinante también se puede utilizar para producir las composiciones peptídicas de análogo de G-CSF humano. Por ejemplo, se obtiene la inducción de la proteína de fusión de GST/análogo de G-CSF humano al hacer crecer el cultivo transformado XL-1 Blue a 37 °C en medio LB (suplementado con carbenicilina) hasta una densidad óptica, a una longitud de onda de 600 nm, de 0.4, seguida por incubación adicional durante 4 horas en presencia de isopropil ß-D-tiogalactopiranósido 0.5 mM (Sigma Chemical Co . , St . Louis MO) . La proteína de fusión, que se espera se produzca como un cuerpo de inclusión insoluble en la bacteria, se puede purificar de la siguiente manera. Se cosechan células por centrifugación; se lavan en NaCl 0.15 M, Tria 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; y se tratan con 0.1 mg/ml de lisozima (Sigma Chemical Co . ) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El - - liaado se depura por sonicación y los residuos celulares se sedimentan por centrifugación durante 10 min a 12,000 X g. El sedimento que contiene proteína de fusión se resuspende en Tris 50 mM, pH 8 y EDTA 10 mM, se estratifica sobre glicerol 50% y se centrifuga durante 30 min a 6000 X g. El sedimento se resuspende en solución salina amortiguada con fosfato estándar (PBS) sin g++ y Ca++. La proteína de fusión se purifica adicionalmente al fraccionar el sedimento resuspendido en gel de SDS poliacrilamida desnaturalizante (Sambrook et al., supra) . El gel se remoja en KC1 0.4 M par visualizar la proteína, la cual se separa y se somete a electroelusión en amortiguador de corrimiento en gel que carece de SDS. Si se produce la proteína fusión de GST/análogo de G-CSF humano en bacteria como una proteína soluble, se puede purificar utilizando el módulo de purificación de GST (Pharmacia Biotech) . La proteína de fusión se puede someter a digestión para separar al GST de la proteína de análogo de G-CSF humano maduro. La reacción de digestión (20-40 µ? de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana [4000 U/mg (Sigma) en 0.5 mi de PBS] se incuba durante 16 a 48 horas a temperatura ambiente y se carga en un gel de SDS-PAGE desnaturalizante para fraccionar los productos de reacción. El gel se remoja en KC1 0.4 M para visualizar las bandas de proteínas. Se puede confirmar la identidad de la - - banda de proteína que corresponde al peso molecular esperado del análogo de G-CSF mediante análisis parcial de secuencia de aminoácidos utilizando un secuenciador automatizado (Applied Biosystems odel 473A, Foster City, CA) . Alternativamente, se puede clonar la secuencia de ADN que codifica para la proteína predicha del análogo de G-CSF maduro en un plásmido que contiene el promotor deseado y, opcionalmente , una secuencia líder [véase, por ejemplo Better et al., Science 240:1041-43 (1988)]. La secuencia de este plásmido recombinante se puede confirmar por secuenciado automatizado. El plásmido después se transforma en E. coli, cepa MC1061 utilizando procedimientos estándar o convencionales utilizando incubación con CaCl2 y tratamiento de la bacteria con choque térmico (Sambrook et al., supra) . Las bacterias transformadas se hacen crecer en medio LB suplementado con carbenicilina y se induce la producción de la proteína expresada por crecimiento en un medio adecuado. Si está presente, la secuencia líder alterará la secreción de la proteína de análogo de G-CSF humano maduro y se separará durante la secreción. La proteína recombinante secretada ee purifica del medio de cultivo bacteriano por el método que se describe en lo siguiente. Los sistemas hospederos de mamífero para la expresión de la proteína recombinante son bien conocidos por loa expertos en la técnica. Se pueden elegir cepas de células hospederas por su capacidad particular para procesar la proteína expresada o para producir ciertas modificaciones posteriores a la traducción que serán útiles para proporcionar actividad de proteína. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento post-traduccional , el cual separa la forma "prepro" de la proteína, también puede ser importante para corregir la inserción, naturalización o la función. Células hospederas diferentes tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, I38 y similares tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades post-traduccionales , y se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña introducida. En un método preferido particularmente de expresión recombinante de las proteínas análogas de G-CSF humanas de la presente invención, se cotransfectan células 293 con plásmidos que contienen ADNc para el análogo de G-CSF humano en el vector pCMV (promotor 5' CMV, secuencia 3'HGH poli A) y pSV2neo (que contiene resistencias del gen neo) por el método de fosfato de calcio. Preferiblemente, los vectores se vuelven lineales con Seal antes de la transíección. De manera similar, se puede utilizar un - - plásmido recombinante alternativo utilizando un vector pC V similar con el gen neo. Se seleccionan líneas de células estables a partir de clones de células únicas por dilución limitante en medio de crecimiento que contiene 0.5 mg/ml de G418 (antibiótico similar a neomicina) durante 10-14 d£as . Se someten a análisis las líneas de células para determinar la expresión de análogo de G-CSF humano por ELISA o transferencia Western, y se expanden las lineas de células que tengan un alto nivel de expresión para crecimiento a gran escala. Es preferible que las células transformadas se utilicen para producción de proteína a largo plazo y con altos rendimientos y, de esta manera, es deseable la expresión estable. Una vez que tales células se transforman con vectores que contienen marcadores seleccionables junto con el cásete de expresión deseado, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El marcador seleccionable se diseña para conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los grupos resistentes de células transformadas de manera estable pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para dichas células.

- - Se pueden utilizar muchos sistemas de selección para recuperar las células que se han transformado para producción recombinante de proteína. Tales sistemas de selección incluyen, pero no se limitan a HSV de timidina cinasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltrans erasa y genes de adenina fosforribosiltransferasa en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, se puede utilizar la resistencia antimetabolito como base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato gpt , que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido, G418; además, que confiere resistencia a clorsulfuron; y hygro que confiere resistencia a higromicina. Los genes seleccionables adicionales que se pueden utilizar incluyen trpB, el cual permite que las células utilicen indol en lugar de triptofano o hisD, lo que permite que la célula utilice histinol en lugar de histidina. Los marcadores que proporcionan una indicación visual para identificación de transformantes incluyen antocianinas, ß-glucuronidasa y su sustrato, GUS, y luciferasa y su sustrato, luciferina.

D. Purificación de proteínas Será deseable purificar las proteínas de análogo de G-CSF humano generadas por la presente invención. Las - - técnicas de purificación de proteína son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas técnicas involucran, a un nivel, el fraccionamiento crudo del medio celular a fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas . Después de separar al polipéptido de otras proteínas, el polipéptido de interés se puede purificar adicionalmente utilizando técnicas cromatográficas y electroforéticas para obtener pufificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad) . Los métodos analíticos adecuados particualrmente para la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel de poliacrilamida y enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficaz para purificar péptidos es la cromatografía líquida de proteína rápida o incluso CLAR . Algunos aspectos de la presente invención se relacionan con la purificación, y en modalidades particulares, la purificación sustancial de una proteína codificada o de un péptido. El término "proteína o péptido purificado", como se utiliza en la presente, se pretende que se refiere a una composición, aislable de otros componentes, en donde la proteína o péptido se purifica en cualquier grado en relación a su estado asequible de manera natural . Una proteína o péptido purificado por lo tanto también se refiere a una proteína o péptido libre de su ambiente en el - - cual se presenta de manera natural . Generalmente, el término "purificado" se referirá a una composición proteínica o peptídica que se ha sometido a fraccionamiento para separar otros componentes diversos, y composición la cual retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se utiliza el término "sustancialmente purificado", esta designación se referirá a una composición en la cual la proteína o péptido constituye el componente principal de la composición, por ejemplo, constituye aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de las proteínas en la composición , Varios métodos para cuan ificar el grado de purificación de la proteína o péptido son conocidos por los expertos en la técnica en base en la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, determinación de la actividad específica de una fracción activa, o determinación de la cantidad de polipéptido dentro de una fracción mediante análisis de SDS/PAGE. Un método preferido para determinar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial y de esta manera calcular el grado de pureza, determinado en la presente por el "número de purificación de veces" . Las unidades reales utilizadas para - - representar la cantidad de actividad, por supuesto, dependerán de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación y de si la proteína o péptido expresa o no actividad detectable. Diversas técnicas adecuadas para uso en la purificación de proteínas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares; desnaturalización por calor, seguido por centrifugación; etapas de cromatografí tales como intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, cromatografía de hidroxilapatita y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforeéis en gel y combinaciones de estas o de otras técnicas. Como se conoce generalmente en la técnica, se considera que el orden para llevar a cabo las diversas etapas de purificación puede cambiar, o que se pueden omitir ciertas etapas y aún así obtener un método adecuado para la preparción de una proteína o péptido sustancialmente purificado. No existe una limitante general de que la proteína o péptido se deba proporcionar siempre en su estado más purificado. En realidad, se contempla que los productos sustancialmente menos purificados tendrán utilidad en algunas modalidades. La purificación parcial se puede llevar a cabo mediante la utilización de menos etapas de purificación en combinación, o al utilizar formas diferentes del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se apreciará que la cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada, utilizando un aparato de CLAR, generalmente resultará en una purificación mayor en "múltiples" que la misma técnica utilizando un sistema de cromatogra ía de baja presión. Los métodos que muestran un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto proteínico o en mantener la actividad de una proteína expresada. Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, algunas veces de manera importante, con diferentes condiciones de SDS/PAGE [Capaldi et al., Bioc em. Biophya. Rea. Comm. 76:425 (1977)]. Por lo tanto, se apreciará que bajo condiciones de electroforesis diferentes, los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o purificados parcialmente pueden variar. Opcionalmente, uno puede purificar y aislar tales análogos de G-CSF de otros componentes obtenidos en el proceso. Los métodos para purificación se pueden encontrar en la patente de E.U.A. No. 5,849,883 (incorporada en la presente como referencia) . Otros métodos son bien conocidos en la técnica (Véase, también, Souza, aupra, cada una incorporada en la presente como referencia) . Estos documentos describen métodos ejemplares específicos para el - - aislamiento y purificación de composiciones de G-CSF que pueden ser útiles en el aislamiento y purificación de los análogos de G-CSF de la presente invención. Dada la descripción de estas patentes, es evidente que una persona experta en la técnica podrá realizar técnicas de purificación diversas que se pueden utilizar para purificar G-CSF a partir de una fuente dada. También se contempla que se pueda utilizar una combinación de intercambio aniónico y cromatografía de inmunoafinidad para producir las composiciones análogas de G-CSF purificadas, de la presente invención.

E. Vectores para clonación, transferencia de genes y expresión Como se discute en la sección anterior, los vectores de expresión se utilizan para expresar el producto del polipétido de análogo de G-CSF humano, el cual después se puede purificar y utilizar para el tratamiento de neutropenia. En otras modalidades, se pueden utilizar los vectores de expresión en aplicaciones de terapia de genes para introducir ácidos nucleicos que codifiquen para el análogo de G-CSF humano al interior de células que las necesiten o bien para inducir la expresión del análogo de G-CSF humano en tales células. La presente sección se - - relaciona con una descripción de la producción de tales vectores de expresión. La expresión requiere que ae proporcionen en los vectores señales apropiadas, las cuales incluyen elementos reguladores tales como alargadores/promotores para fuentes virales y de mamífero que activen la expresión de los genes de interés en células hospederas. También se describen elementos diseñados para optimizar la estabilidad y capacidad de traducción de ARN mensajero en células hospederas. Se proporcionan las condiciones para el uso de muchos marcadores de selección de medicamento dominantes para establecer clones de células estables permanentes que expresen los productos, al igual que en los elementos que enlacen la expresión de los marcadores de selección de medicamento con la expresión del polipéptido. a. Elementos reguladores Promotores y alargadores . A través de esta solicitud, los términos "plásmido recombinante de expresión" o "vector de expresión" significa que incluyen cualquier tipo de plásmido recombinante genético que contenga un ácido nucleico que codifique para los productos de gen en los cuales parte o la totalidad de la secuencia codificante de ácido nucleico es capaz de ser transcrita. El transcrito se - - puede traducir en una proteína, pero no necesita ser así. En algunas modalidades, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción de ARNm en un producto de gen. El ácido nucleico que codifica para un producto de gen está bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de un gen. La frase "bajo el control transcripcional" significa que el promotor está en el lugar y orientación correctos en relación al ácido nucleico para controlar el inicio de la ARN polimerasa y la expresión del gen. El término "promotor" se utilizará en la presente para referirse a un grupo de módulos de control transcripcionales que se agrupan alrededor del sitio de inicio para ARN polimerasa II. Muchas de las consideraciones acerca de cómo se organizan los promotores se derivan del análisis en varios promotores virales, que incluyen los de timidina cinasa HSV (tk) y las unidades de transcripción temprana SV40. Estos estudios, aumentados por las investigaciones recientes, han demostrado que los promotores están constituidos de módulos funcionales separados, cada uno consiste de aproximadamente 7-20 pb de ADN y que contienen uno o más sitios de reconocimiento para proteínas - - transcripcionales activadoras o represoras. Por lo menos un módulo en cada promotor funciona para colocar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo más conocido de esto es la secuencia o caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de la caja TATA, tal como el promotor para el gen de deaoxinucleotidiltranaferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos de SV40, un elemento separado que se superpone al sitio de inicio en sí mismo ayuda a fijar el lugar de inicio. Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia del inicio de transcripción. Típicamente, estos se localizan en la región 30-110 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que muchos de los promotores contienen elementos funcionales hacia el extremo 3' del sitio de inicio también. La separación entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de manera que la función promotora se preserva cuando los elementos están invertidos o se han movido uno en relación al otro. En el promotor tk, la separación entre los elementos promotores puede aumentar a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a declinar. En base en el promotor, es evidente que los elementos individuales pueden funcionar ya sea de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción. El promotor particular utilizado para controlar la - - expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés no se considera importante, en la medida en que es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula objetivo. Por lo tanto, cuando el objetivo es la célula humana, es preferible colocar una región codificante de ácido nucleico adyacente y bajo el control de un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana. De manera general, tal promotor puede incluir un promotor humano o viral . En varias modalidades, se pueden utilizar al promotor del gen temprano intermedio de citomegalovirus humano (CMV) , el promotor temprano de SV40, la secuencia repetida terminal larga del virus de sarcoma de Rous, ß-actina, el promotor de insulina de rata, el promotor de foafoglicerol cinasa y el promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la totalidad de los cuales son bien conocidos y están disponibles fácilmente para los expertos en la técnica, para obtener una expresión de alto nivel en la secuencia codificante de interés. El uso de otros promotores celulares de mamíferos o de fagos bacterianos que son bien conocidos en la técnica para obtener la expresión de una secuencia codificante de interés también se contemplan, con la condición de que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado. Al utilizar un promotor con propiedades bien conocidas, se puede optimizar - - el nivel y patrón de expresión de la proteína de interés después de la transfección o transformación. La selección de un promotor que es regulado en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas específicas puede permitir la expresión inducible del producto de gen. Están disponibles varios sistemas promotores inducibles para la generación de vectores virales. Uno de tales sistemas ecdysone (ecdisona) (Invitrogen, Carlsbad, CA) , el cual se diseña para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamífero. Consiste de un mecanismo de expresión regulado estrechamente que virtualmente no permite expresión a nivel basal de un transgen, sino después de una capacidad de inducción de 200 veces. Otro sistema inducible que puede ser útil es el sistema Tet-OffMR o Tet-0nR (Clontech, Palo Alto, CA) , desarrollados originalmente por Gossen y Bujard [Gossen y Bujard, Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 15 ; 89 (12) : 5547-51 (1992) ; Gossen et al., Science 268 (5218) : 1766-9 (1995)] . En algunas circunstancias, puede ser deseable regular la expresión de un transgen en un vector de terapia de gen. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores virales diferentes con resistencias de actividad variables dependiendo del nivel de expresión que se desee. En células de mamífero, el promotor temprano inmediato de CMV con frecuencia se utiliza para proporcionar una activación - transcripcional fuerte. También ae han utilizado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles de expresión reducidos del transgen. Cuando se desea la expresión de un transgen en células hematopoyéticas , con frecuencia se utilizan promotores retrovirales tales como los LT de MLV o MMTV. Los otros promotores virales que se pueden utilizar en base en el efecto que se deseen incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus tales como los de la región E1A, E2A o MLP, AAV LTR, virus de mosaico de coliflor, HSV-TK y virus de sarcoma aviar. De manera similar, estos promotores específicos se pueden utilizar para llevar a cabo la transcripción en tejidos o células específicas de manera que se reduzca la toxicidad potencial o los efectos indeseables a los tejidos que no son el objetivo. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores tales como PSA, probacina, fosfatasa ácida prostética o calicreína glandular específica de próstata (hK2) para dirigir la expresión del gen a la próstata. En algunas indicaciones, puede ser deseable activar la transcripción en momentos específicos después de la administración del vector de terapia de gen. Esto se puede realizar con tales promotores como los regulables por hormona o citocina. Por ejemplo, en aplicaciones de terapia de gen en donde la indicación se dirige al tejido gonadal en - - donde se producen o dirigen esteroides, puede ser ventajoso el uso de promotores regulados por andrógenos o estrógenos . Tales promotores que son regulables por hormonas incluyen a MMTV, MT-1, ecdisona y RuBisco. Otros promotores reguladoa por hormonas, tales como los sensibles a hormonas tiroideas, de la hipófisis y suprarrenales, se espera que sean útiles en la presente invención. Los promotores que son sensibles a citocinas y proteínas inflamatorias y que se pueden utilizar incluyen a cininógeno K y T [Kageyama et al., J. Biol. Chem. 262 (5) :2345-51 (1987)], c-fos, TNF-a proteína C reactiva [Arcone et al., Nucleíc Acida Res. 16 (8) : 3195-207 (1988)], haptoglobina [Oliviero et al., EMBO J. 6(7):1905-12 (1987)], amiloide sérico A2, C/EBP a, IL-1, IL-6 [Poli y Córtese, Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 86 (21) : 8202-6 (1989)], complemento C3 [Wilson et al., Mol. Cell . Biol. 10(12) ¡6181-91 (1990)], IL-8, glucoproteína ácida a-1 [Prowse y Baumann, Mol. Cell. Biol. 8(1) ¡42-51 (1988)], antitripsina a-1, lipoproteína lipasa [Zechner et al., Mol. Cell. Biol. 8 (6) ¡2394-401 (1988)], angiotensinógeno [Ron et al., Mol. Cell. Biol. 11 (5) : 2887-95 (1991)], fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, T F-a, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno) , colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico) , metalotioneina (inducible por metal pesado y glucocorticoides) , - - estromelisina (inducible por éster de forbol , interleucina-1 y EGF) , mac oglob lina a-2 y antiquimiotripsina a-1. Otros promotores que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen los promotores inducibles por calor (hipertermia) regulables por lac e inducibles por radiación, por ejemplo, EGR [Joki et al., Hum. Gene Ther. 6 (12) : 1507-13 (1993)], a-inhibina, ARN pol III tRNA met y otros promotores de aminoácidos, Ul snRNA [Barlett et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 20 ; 93 ( 17) : 8852 -7 (1996)], MC-1, PGK, ß-actina y a-globina. Muchos otros promotores que pueden ser útiles se incluyen en Walther y Stein [J. Mol. Med. 74(7):379-92 (1996)]. Se anticipa que cualquiera de los promotores anteriores, solos o combinados entre sí, pueden ser útiles de acuerdo con la presente invención, en base en la acción que se desee. Además, esta lista de promotores no se debe considerar como exhaustiva o limitante, y los expertos en la técnica conocerán otros promotores que se pueden utilizar junto con los promotores y métodos que se describen en la presente. Otro elemento regulador contemplado para uso en la presente invención es un alargador. Estos son elementos genéticos para aumentar la transcripción de un promotor que se localiza en una posición alejada de la misma molécula de - - ADN. Los alargadores se organizan de una manera muy similar a los promotores. Es decir, están constituidos de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas de transcripción. La distinción básica entre los alargadores y los promotores es operacional. Una región alargadora en su totalidad debe ser capaz de estimular la transcripción a cierta distancia; esto no necesariamente es válido para una región promotora o sus elementos constitutivos. Por otra parte, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan el inicio de la síntesis de ARN en un sitio y en una orientación particular, mientras que los me oradores carecen de esta especificidad. Los promotores y mej oradores con frecuencia se superponen y están contiguos, con frecuencia buscan tener una organización modular muy similar. Los mej oradores útiles en la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica y dependerán del sistema de expresión particular que se utilice [Scharf et al., Results Probl . Cell. Differ. 20: 125-62 (1994); Bittner et al., Meth. Enzymol 153: 516-544 (1987)].

Señales de poliadenilación. Cuando se utiliza una pieza de inserción de ADNc, uno típicamente deseará incluir una señal de poliadenilación para llevar a cabo la poliadenilación adecuada del gen transcrito. No se considera que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea - - fundamental para la práctica exitosa de la invención y cualquiera de tales secuencias se puede utilizar tal como las señales de poliadenilación de hormona del crecimiento bovino y de SV40. También se contempla como un elemento del cásete de expresión a un terminador. Estos elementos pueden servir para mejorar los niveles de mensaje y para minimizar la lectura pasante desde el cásete a otras secuencias.

IRES . En algunas modalidades de la invención, se contempla el uso de elementos de sitio de entrada de ribosoma internos (IRES) para crear multigenes o mensajes policistrónicos . Los elementos de IRES son capaces de desviar el modelo de exploración de ribosoma o la traducción dependiente de Cap metilada 5' y comenzar la traducción en sitios internos [Pelletier y Sonenberg, Nature 334:320-325 (1988)] . Los elementos IRES de dos miembros de la familia de picornavirus (poliovirus y encefalomiocarditis) ya han sido descritos (Pelletier y Sonenberg, 1988, supra) , así como un IRES de un mensajes de mamífero [Macejak y Sarnow, iVature 353:90-94 (1991)] . Los elementos IRES se pueden enlazar a marcos de lectura abiertos heterólogos. Se pueden transcribir juntos marcos de lectura abiertos múltiples, cada uno separado por un IRES, lo que genera mensajes policistrónicos. En virtud de los elementos IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a ribosomas para una - - traducción eficaz. Los genes múltiples pueden expresar de manera eficaz utilizando un promotor/alargador único para transcribir un solo mensaje. Se puede enlazar a los elementos IRES cualquier marco de lectura abierta heterólogo. Esto incluye genes para proteínas secretadas, subunidades múltiples de proteínas, codificadas por genes independientes, proteínas intracelular o unidas a membrana y marcadores seleccionables . De esta manera, se puede someter a ingeniería simultáneamente la expresión de varias proteínas dentro de una célula con un solo plásmido recombinante y un solo marcador seleccionable . b. Administración de vectores de expresión Existen numerosas formas en las cuales se pueden introducir en las células los vectores de expresión. En algunas modalidades de la invención, el plásmido recombinante de expresión comprende un virus o un plásmido recombinante sometido a ingeniería derivado de un genoma viral. En otras modalidades, se contempla la administración no viral . La capacidad de algunos virus para entrar a las células vía endocitosis mediada por receptor, para integrarse al genoma de la célula hospedera y expresar genes virales de manera estable y eficaz los ha vuelto candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños al - - interior de células de mamífero [Ridgeway, En: Vectora : A aurvey of molecular cloning vectora and their uses, Rodríguez & Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 467-492, 1988; Nicolás y Rubenstein, En: Vectors : A aurvey of molecular cloning vectors and their uses, Rodríguez & Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 493-513, 1988; Baichwal y Sugden, En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York, Plenum Press, 117-148, 1986; Temin, En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, 149-188, 1986)] . Los primeros virus utilizados como vectores de genes fueron ADN virus que incluyen papovavirus (virus simio 40, virus de papiloma bovino y polioma) (Ridgeway, 1988, supra; Baichwal y Sugden, 1986, supra) y adenovirus (Ridgeway, 1988, supra; Baichwal y Sugden, 1986, supra). Estos tienen una capacidad relativamente pequeña para secuencias de ADN extraño y tienen un espectro de hospederos limitado. Además, su potencial oncogénico y los efectos citopáticos en células permisivas hacen que surjan preocupaciones respecto a la inocuidad. Pueden albergar solo hasta 8 kb de material genético extraño pero se pueden introducir fácilmente en diversas líneas de células y animales de laboratorio (Nicolás y Rubenstein, 1988, supra); Termín, 1986, supra) . Ahora se reconoce ampliamente que se puede introducir ADN al interior de una célula utilizando una - - variedad de vectores virales. En tales modalidades, los plásmidos recombinantes de expresión que comprenden vectores virales que contienen los genes de interés pueden ser adenovirales (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,824,544; la patente de E.U.A. No. 5,707,618; la patente de E.U.A. No. 5,693,509; la patente de E.U.A. No. 5,670,488; y la patente de E.U.A. No. 5,585,362; cada una incorporada en la presente como referencia) , retrovirales (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,888,502; la patente de E.U.A. No. 5,830,725; la patente de E.U.A. No. 5,770,414; la patente de E.U.A. No. 5,686,278; y la patente de E.U.A. No. 4,861,719; cada una incorporada en la presente como referencia) , virales adenoasociados (véanse, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,474,935; la patente de E.U.A. No. 5,139,941; la patente de E.U.A. No. 5,622,856; la patente de E.U.A. No. 5,658,776; la patente de E.U.A. No. 5,773,289; la patente de E.U.A. No. 5,789,390; la patente de E.U.A. No. 5,834,441; la patente de E.U.A. No. 5,863,541; la patente de E.U.A. No. 5,851,521; y la patente de E.U.A. No. 5,252,479; cada una incorporada en la presente como referencia) , un híbrido adenoviral -viral adenoasociado (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,856,152, incorporada en la presente como referencia) un vector viral de vaccinia o un herpes viral (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,879,934; la patente de E.U.A. No. 5,849,571; la patente de - - E.U.A. No. 5,830,727; la patente de E.U.A. No. 5,661,033; y la patente de E.U.A. No. 5,328,688; cada una incorporada en la presente como referencia) . Existen muchas alternativas para la transferencia viral de plásmidos recombinante genéticos. Esta sección proporciona una discusión de los métodos y composiciones de la transferencia de genes no virales. Los plásmidos recombinantes de ADN de la presente invención generalmente se administran a una célula, y en algunas situaciones, el ácido nucleico o la proteína que se va a transferir se puede transferir utilizando métodos no virales. La presente invención contempla varios métodos no virales para la transferencia de los plásmidos recombinantes expresión a células de mamífero cultivadas. Estos incluyen la precipitación con fosfato de calcio [Graham y Van Der Bb, Virology 52:456-467 (1973); Chen y Okayama, Mol. Cell. Biol 7:2745-2752 (1987); Rippe et al., Mol. Cell. Blol . 10 :689-695 (1990)], DEAE-dextrano [Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190 (1985)], electroporación [Tur-Kaspa et al., Mol. Cell. Biol. 6:716-718 (1986); Potter et al.,. Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 81:7161-7165 (1984)], microinyección directa [Harland y eintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)], liposomas cargados con ADN [Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta. 721:185-190 (1982); Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 76:3348-3352 (1979); Felgner, Sci.

Am. 276 (6) : 102-106 (1997); Felgner, Hum. Gene Ther. 7(15): 1791-3 (1996)], sonicación celular [Pechheimer et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 84:8463-3467 (1987)], bombardeo de genes utilizando microproyectiles a alta velocidad [Yang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 87:9568-9572 (1990)] y tranafección mediada por receptor [Wu y Wu, J. Biol. Chew. 262:4429-4432 (1987); Wu y Wu, Biochem. , 27:887-892 (1988); Wu y Wu, Adv. Drug Deliv. Rev. 12 : 159-167 (1993) ] . Una vez que el plásmido recombinante ae ha suministrado al interior de la célula, el ácido nucleico que codifica para el gen terapéutico se puede colocar y expresar en sitios diferentes. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica para el gen terapéutico puede integrarse de manera estable al genoma de la célula. Esta integración puede ser en un lugar y en una orientación similares por medio de recombinación homóloga (sustitución de genes) o bien se pueden integrar en un lugar aleatorio e inespecífico (aumento de genes) . En modalidades adicionales, el ácido nucleico se puede mantener de manera estable en la célula como un segmento episómico separado de ADN. Tales segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican para secuencias suficientes que permiten el mantenimiento y replicación independiente de, o sincronizado con el ciclo de la célula hospedera. La manera en que el plásmido - - recombi ante de expresión se administra a una célula y el lugar en donde permanece el ácido nucleico dentro de la célula dependen del tipo de plásmido recombinante de expresión que se utiliza. En una modalidad particular de la invención, el plásmido recombinante de expresión puede quedar atrapado en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interior. Los liposomas multilamelares tienen capas lipídicas múltiples separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipidíeos experimentan autorrearreglo antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas [Ghosh y Bachhawa , En: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptora and ligands, Wu f¿ Wu (ed.), New York: Marcel Dekker, p . 87-104 (1991)]. La adición de ADN a liposomas catiónicos provoca una transición topológica de los liposomas a glóbulos condensados cristalinos con líquido ópticamente birrefringente [Radler et al., Sciences 275 (5301) : 810-4 (1997)]. Estos complejos de ADN-lípido son vectores potenciales no virales para uso en terapia y administración de genes. La administración de ácido nucleico mediada por - - liposomas y la expresión de ADN extraño in vi tro ha sido muy exitosa. También se contempla en la presente invención diversos enfoques comerciales que involucran la tecnología de "lipofección" . En algunas modalidades de la invención, el liposoma puede formar un complejo con un virus hemaglutinante (HVJ) . Esto se ha demostrado que facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada en las células de ADN encapsulado en liposoma [Kaneda et al., Science 243:375-378 (1989)]. En otras modalidades, el liposoma puede formar un complejo o se puede utilizar junto con proteínas cromosómicas nucleares que no son histonas (HMG-1) [Kato et al., J. Biol . Che . 266:3361-3364 (1991)]. En modalidades adicionales, el liposoma puede formar un complejo o se puede utilizar junto tanto con HVJ como con HMG-1. En tales plásmidos reconbinantes de expresión que han sido utilizados con éxito en la transferencia y expresión de ácido nucleico in vi tro e in vivo. Son aplicables para la presente invención. Otros sistemas de administración de vectores que se pueden utilizar para suministrar un ácido nucleico que codifica para un gen terapéutico al interior de células incluyen los vehículos de administración mediados por receptor. Aprovechando la captación selectiva de macromoléculas por endocitosis mediada por receptor en casi todas las células eucarióticas . Debido a la distribución - - específica del tipo de célula de los diversos receptores, el suministro puede ser altamente específico (Wu y Wu, 1993, sup ) . Los vehículos remitidos al gen mediados por receptor generalmente consisten de dos componentes: un ligando específico para la célula receptora y un agente que se une a ADN. Se han utilizado varios ligandos para la transferencia de genes mediada por receptor. Los ligandos caracterizados de manera más exhaustiva son los asialoorosomucoides (ASOR) (Wu y Wu, 1987, aupra) y transferrina [Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sel. E.U.A. 87 (9) :3410-3414 (1990)]. Recientemente, se ha utilizado una neoglucoproteína sintética, la cual reconoce los mismos receptores que ASOR, como un vehículo para la administración de genes [Ferkol et al. FASEB J. 7:1081-1091 (1993); Perales et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 91:4086-4090 (1994)] y también se ha utilizado el factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) para administrar genes a células de carcinoma escamosas (Myers, EPO 0273085) . En otras modalidades, el vehículo de administración puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al. [Methoda Enzymol. 149:157-176 (1987) ] utilizan lactosil-ceramid , un asialgangliosido terminal con galactosa, incorporado en lipoaomas y observan un aumento en la captación del gen de insulina por - - hepatocitos. Por lo tanto, es factible que un ácido nucleico que codifica para un gen terapéutico también pueda administrarse específicamente en un tipo de célula particular por cualquier cantidad de sistemas de receptor-ligando con o sin liposomas. En otra modalidad de la invención, el plásmido recombinante de expresión puede consistir simplemente de ADN recombinante desnudo o plásmidos . La transferencia del plásmido recombinante se puede llevar a cabo por cualquiera de los métodos mencionados en lo anterior que permeabilizan física o químicamente a la membrana celular. Esto es aplicable, particularmente para la transferencia in vi tro. Sin embargo, se puede aplicar también para uso in vivo. Dubensky et al. [Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. 81:7529-7533 (1984)] inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en forma de precipitados de CaP04 en hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos mostrando replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif [Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 83:9551-9555 (1986)] también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaP04 resulta en la expresión de genes transfectados . Otra modalidad de la invención para transferir un plásmido recombinante de expresión de ADN desnudo al interior de células puede involucrar bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad para - - acelerar micropoyectiles recubiertos con ADN a alta velocidad lo que permite que perforen las membranas celulares y entren a las células sin destruirlas [Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)]. Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de tales dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica que a su vez proporciona la fuerza motriz [Yang, et <al . , Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 87:9568-9572 (1990)] . Los microproyectiles utilizados consisten de sustancias biológicamente inertes tales como esferas de tungsteno o de oro.

F. Métodos para tratar neutropenia Como se menciona en lo anterior en este documento, se contempla que los análogos de G-CSF humano o los vectores que comprenden polinucleótidos que codifican para tales proteínas se utilizarán en protocolos de tratamiento restitutivo para el tratamiento de neutropenia. Se ha encontrado que G-CSF es útil en el tratamiento de diversas condiciones, en donde un aumento en los neutrófilos proporcionará beneficios. Por ejemplo, para pacientes con cáncer, G-CSF es benéfico como un medio para estimular selectivamente la producción de neutrófilos para compensar las deficiencias hematopoyé icas que se generan por la - - quimioterapia o terapia de radiación. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y condiciones relacionadas, tales como septisemia, la cual habitualente es causada por un metabolito de las bacterias. G-CSF también se puede utilizar solo o combinado con otros compuestos, tales como otras citosinas, para el crecimiento o expansión de células en cultivo (por ejemplo, para transplantes de médula ósea o expansión ex vivo) . Se ha administrado G-CSF a pacientes quienes han experimentado transplantes como un adyuvante para el tratamiento de infección o para el tratamiento de neutropenia. a. Tratamiento basado en proteínas Una de las modalidades terapéuticas de la presente invención es la administración a un sujeto quien lo necesite, de composiciones que comprenden los análogos de G-CSF humanos de la presente invención. Como se discute en lo anterior, las proteínas que se pueden haber generado mediante medios recombinantes o bien por síntesis peptídica automatizada. Las formulaciones de análogo de G-CSF humano para tal terapia se pueden seleccionar en base en la vía de administración y pueden incluir formulaciones liposómicas así como preparaciones farmacéuticas clásicas. Las proteínas de análogo de G-CSF humano se - - formulan en una preparación apropiada y se administran en uno o más sitios dentro del sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. En las modalidades preferidas particularmente, la terapia basada en la proteína de análogo de G-CSF humano se lleva a cabo por administración intravenosa continua o intermitente. Por "cantidad terapéuticamente eficaz", la presente invención se refiere a aquélla cantidad de análogo de G-CSF humano que es suficiente para sustentar un cambio observable en el nivel de una o más actividades biológicas de G-CSF. El cambio puede ser un aumento en el nivel de actividad de G-CSF. Preferiblemente, el cambio será un aumento en la proliferación de neutrófilos. Los expertos en la técnica comprenderán que las cantidades de análogo de G-CSF humano para uso terapéutico pueden variar. Se contempla que la actividad específica de la preparación de proteína de análogo de G-CSF humano puede estar en el intervalo de aproximadamente 100 unidades/mg de proteína a aproximadamente 500 unidades/mg de proteína. Por lo tanto, una preparación dada de un análogo de G-CSF humano puede comprender aproximadamente 100 unidades/mg de proteína, aproximadamente 125 unidades/mg de proteína, aproximadamente 150 unidades/mg de proteína, aproximadamente 175 unidades/mg de proteína, 200 unidades/mg de proteína, 225 unidades/mg de proteína, 250 unidades/mg de proteína, - - 275 unidades/mg de proteína, 300 unidades/mg de proteína, 325 unidadea/mg de proteína, 350 unidades/mg de proteína, 375 unidades/mg de proteína, 400 unidades/mg de proteína, 425 unidades/mg de proteína, 450 unidades/mg de proteína, 475 unidades/mg de proteína, y 500 unidades/mg de proteína. Un intervalo preferido particularmente es de aproximadamente 100 unidades/mg de proteína a aproximadamente 200 unidades/mg de proteína; un intervalo mucho más preferible está entre aproximadamente 150 y aproximadamente 200 unidades/mg de proteína. Preferiblemente, la composición de proteína está sustancialmente libre de factores contaminantes, con una concentración de contaminación menor de 0.02% (p/p) . Las composiciones de análogo de G-CSF humano, adecuadas para inyección en un paciente se pueden preparar, por ejemplo, por disolución en un diluyente farmacológicamente aceptable de una muestra liofilizada que comprende análogo de G-CSF purificado y sales estabilizantes . La administración de las composiciones puede ser sistémica o local y puede comprender un solo sitio de inyección o bien una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de proteína de análogo de G-CSF humano. Se contempla cualquier vía conocida por los expertos en la técnica para la administración de una composición terapéutica y que incluye, por ejemplo, la administración - - intravenosa, intramuscular, subcutánea o por catéter a largo plazo. Alternativamente, se contempla que la composición terapéutica se pueda suministrar al paciente en sitios múltiples. Las administraciones múltiples se pueden volver simultáneas o se pueden administrar durante un período de varias horas. En algunos casos, puede ser benéfico proporcionar un flujo continuo de la composición terapéutica. Se puede administrar terapia adicional en una base periódica, por ejemplo diaria, semanal o mensualmente . b. Tratamiento conjunto Además de las terapias basadas únicamente en la administración de análogos de G-CSP humano, se contempla específicamente el tratamiento conjunto. En el contexto de la presente invención, se contempla que el tratamiento con análogo de G-CSF humano se puede utilizar de manera similar junto con otros agentes utilizados habitualmente para el tratamiento de neutropenia. Para obtener el resultado terapéutico apropiado utilizando los métodos y composiciones de la presente invención, uno generalmente proporcionará una composición que comprende el análogo de G-CSF humano y por lo menos otro agente terapéutico (segundo agente terapéutico) . En la presente invención, se contempla que el segundo agente terapéutico puede involucrar la administración o inclusión de por lo menos un factor adicional que se selecciona de entre EPO, G-CSF, M-GDF, SCF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, u otras diversas interleucinas , IGF-1, LIF, interferón (tal como a, ß, gama o de consenso) , factores neurotróficos (tales como BDNF, NT- 3, CTNF o noguina) , otros factores de crecimiento multipotentes (tales como, en la medida en que se demuestra que estos son tales factores de crecimiento multipotentes , ligando flt-3/flk-2, factor de proliferación de hemocitoblastos y factor de hemocitoblastos totipotentes) , factores de crecimiento de fibroblastos (tales como FGF) y análogos, moléculas de fusión u otros derivados de los anteriores. Por ejemplo, se ha encontrado que G-CSF combinado con SCF moviliza células progenitoras de sangre periférica in vivo. Ex vivo, por ejemplo, se ha encontrado que G-CSF combinado con SCF, IL-3 e IL-6 es útil para la expansión de células sanguíneas periféricas. De igual manera, los análogos de G-CSF actuales proporcionarán usos similares. Las composiciones de tratamiento conjunto se proporcionarán en una cantidad combinada eficaz para producir el resultado terapéutico deseado en el tratamiento de neutropenia. Este proceso puede involucrar poner en contacto a las células con el análogo de G-CSF humano y uno - - o varios del segundo agente o factor, al mismo tiempo. Esto se puede llevar a cabo al administrar una sola composición o una formulación farmacológica que incluya a ambos agentes, o bien por administración de dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en donde una composición incluye a la composición terapéutica de análogo de G-CSF humano y la otra incluye al segundo agente terapéutico. De manera alternativa, el tratamiento, con análogo de G-CSF humano puede preceder o seguir a un tratamiento con otro agente por intervalos que varían de minutos a semanas. En las modalidades en donde el segundo agente terapéutico y el análogo de G-CSF humano se administran por separado, uno generalmente se asegurará de que no haya transcurrido un período de tiempo importante entre el momento de cada administración, de manera que el segundo agente y el análogo de G-CSF humano aún sean capaces de ejercer un efecto combinado útil. En tales casos, se contempla que uno puede administrar ambas modalidades dentro de un período de aproximadamente 12-24 horas entre sí y, de manera más preferible, dentro de un período de aproximadamente 6-12 horas entre sí, con un retraso en tiempo de únicamente aproximadamente 12 horas como el más preferido. En algunos casos, puede ser deseable prolongar el período de tiempo para el tratamiento de manera significativa, sin embargo, en donde transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) a varias - - semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre administraciones respectivas . La administración sistémica de los plásmidos recombinantes de expresión para el análogo de G-CSF humano o las proteínas a los pacientes puede ser un método muy eficaz para administrar un gen terapéuticamente eficaz que contrarreste las manifestaciones clínicas inmediatas de la enfermedad. Alternativamente, en ciertas circunstancias puede ser apropiado la administración local del análogo de G-CSF humano o del segundo agente terapéutico.

G. Ensayos para determinar la actividad y unión del análogo de G-CSF En algunos aspectos de la invención, puede ser necesario determinar la actividad del análogo de G-CSF humano. En particular, se puede necesitar supervisar el efecto de las composiciones terapéuticas de la presente invención en nuetropenia. Los expertos en la técnica tendrán conocimiento de los numerosos ensayos para determinar la actividad de G-CSF, algunos de los cuales se describen en la presente sección. De ninguna manera esto significa que sea una lista exhaustiva de tales ensayos sino únicamente se pretende que proporcione algunos ensayos ejemplares bien conocidos por los expertos en la técnica que se puedan - utilizar para determinar la actividad de G-CSF de la presente invención. Además, la presente sección también describe ensayos para la determinación de unión de G-CSF a su receptor. Los ensayos in vi tro e in vivo ejemplares para determinar estas actividades se proporcionan a continuación en la presente. a. Ensayos In vi ro Enaayos de proliferación celular. Los ensayos de proliferación celular, algunos de los cuales se describen en la presente, se utilizan para determinar el efecto del análogo de G-CSF para inducir proliferación celular. Muchos ensayos son bien conocidos en la técnica y algunos de estos ensayos se describen en lo siguiente.

Cuenta celular. Se someten a pasajes a células en medio MEMa suplementados (sin G-CSF) 24 h antes del inicio del experimento de proliferación celular, punto en el cual se incuban matraces paralelos de células con una densidad de 105 células/ml, en medio MEMa con G-CSF de tipo silvestre o análogos de G-CSF 125 pM. Se mide el crecimiento celular en cada matraz los días 2, 5 y 8, como sigue. Brevemente, se diluyen las células en una solución isotónica (1SOTON II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL) y se cuentan en un - - contador (Coulter Electronics, Hialeah, FL) .

Incorporación de timidina tritlada. Este ensayo se basa en la incorporación de timidina 3H marcada, en ADN recién sintetizado de células ante la división celular. Algunos investigadores también utilizan el análogo de timidina 5-bromo-2 ' -desoxiuridina (BrdU) en vez de [3H] -timidina en los ensayos de proliferación. Brevemente, se someten a pasaje a las células en medio MEMa suplementado (sin G-CSF) 24 h antes del inicio del experimento de proliferación celular, punto en el cual pozos/matraces paralelos de células con una densidad de 105 células/ml se incuban en medio MEMa con G-CSP tipo silvestre o análogos de G-CSF 125 pM. Se agrega timidina tritiada al cultivo celular 12 a 24 h antes de realizar la cuenta (finalización del experimento) y al final del ensayo se mide la cantidad de incorporación radioactiva en el ADN mediante un contador de centelleo líquido. Los detalles de este método son bien conocidos por los expertos en la técnica.

MTT . Se utiliza MTT para la determinación cuantitativa de proliferación y activación celular por ejemplo, en respuesta a factores de crecimiento y citocinas. También se utiliza para la cuantificación de efectos antiproliferativos o citotóxicos, por ejemplo mediados por - - factor de necrosis tumoral a o ß, y para la medición de la acción del interferón. El ensayo se basa en la separación de la sal de tetrazolio amarilla, MTT, a cristales de formazano púrpuras por células metabólicamente activas. Estos cristales de sal son insolubles en solución acuosa, pero se pueden solubilizar al agregar la solución de solubilización que se incluye en el equipo e incubar las placas durante la noche en una atmósfera humidificada (por ejemplo 37°C, C02 6.5%). El producto de formazano solubilizado se cuantifica espectrofotométricamente utilizando un lector de ELISA. Un aumento en el número de células vivas resulta en un aumento en la actividad metabólica total en la muestra. Este aumento se correlaciona directamente con la cantidad de cristales de formazano púrpuras que se forman, determinado por la absorbancia. Se puede adquirir el ensayo MTT comercial de Roche Diagnostics (Indianapolis , IN) .

Ensayo de disminución de ligando. Se mide con respecto al tiempo, como se describe en la presente, la disminución de ligando para cada proteína. Al igual que en los experimentos anteriores, se someten a pasaje células dependientes de G-CSF (0CI/AML1) en medio MEMa suplementado (sin G-CSF) 24 h antes del inicio de los experimentos de supresión de ligando, punto en el cual se incuban matraces paralelos de células a una densidad de 105 células/ml en - - medio ??? con G-CSF de tipo silvestre o análogo de G-CSP 125 pM. Después de 24 h, se mide el número de células en cada matraz, como se describe en lo anterior, y las alícuotas de cada sobrenadante de medio, que se obtiene después de centrifugación para sedimentar los residuos celulares, se almacena a -20 °C para medición de la concentración de G-CSF. Esto se repite cada 24 h durante ocho días . Las concentraciones de G-CSF en las muestras de sobrenadante de medio se cuantifican después utilizando equipos de ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) obtenido de R&D Systems (Minneapolis , MN) .

Experimentos de InternallzaclÓn y roelelado . Se realizan experimentos de internalización durante un período de 5 min, similarmente a las investigaciones publicadas [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol . Metabol . 32:E1-E9 (1995)] . Brevemente, se lavan dos veces 10a células con ??? y después se incuban en hielo y el ligando marcado durante 30 min para obtener complejos de superficie. Las células se lavan nuevamente dos veces con PBS enfriado con hielo y se resuspenden en MEMoc a 37°C a t = 0. El cambio en los complejos de superficie y los complejos internos es seguido por un período de tiempo de 5 min; una gráfica de los complejos internos versus el tiempo integral de los complejos de superficie proporciona una relación lineal, - - cuya pendiente es la constante de la tasa de internalización compleja [Wiley et al., J. Blol . Chem. 257:4222-4229 (1982)]. Se realizan experimentos de reciclado de manera idéntica a los experimentos de internalización, excepto que se realizan durante un período de tiempo de 25 min. Los datos de los experimentos de reciclado se ajustan en cuatro parámetros para obtener las constantes de velocidad de reciclado .

Ensayos de unión. Se utilizan ensayos de unión molecular, algunos de los cuales se describen en la presente, para determinar la unión del análogo de G-CSF a G-CSFR. Estos ensayos in vitro y basados en células se describen como sigue.

BIAcore"^. Se mide la afinidad de unión de ligando de análogo de G-CSF al receptor G-CSF utilizando el sistema biacore™ 2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . Se inmoviliza G-CSF de tipo silvestre, marcado con histidina sobre la superficie del c ip y se hace pasar el receptor libre (-0.25 - 10 nM) sobre el chip para generar una curva de equilibrio estándar y para calcular la afinidad de unión tipo silvestre utilizando un modelo de unión 1:1. Para determinar cada afinidad de unión de mutante, se mezclan 2 nM de receptor libre con una concentración conocida de - - ligando mutante y ae hace pasar por el chi . Se determinan las afinidades de unión al equilibrio de mutante utilizando el modelo de unión 1:1, con competencia. Se analizan los datos de afinidad de unión utilizando el software de evaluación vía 3.1 (BIAcore, Inc.); y se determinan las constantes de disociación al equilibrio (KD) .

ELISA. Se mide la unión de loa análogos de mutante de G-CSF a G-CSFR en un ensayo de competencia con formato ELISA. En este ensayo, se retiene G-CSFR con el anticuerpo de receptor de G-CSF neutralizante L M741 (Phar Mingen, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas análogas después se hacen pasar para determinar su capacidad para competir por G-CSF marcado con HRP para unión de receptor. b. Ensayos in vivo Antes de que se utilicen las composiciones de análogo de G-CSF humano de la presente invención en protocolos terapéuticos en humanos, es deseable supervisar los efectos de tales composiciones en modelos en animales. Existen muchos modelos animales que se pueden utilizar en ensayos in vivo, conocidos por los expertos en la técnica que pueden ser útiles en la presente invención.

Para determinar la eficacia de la protelna de análogo de G-CSF humano y las composiciones de terapia de genes de la presente invención, a tales animales se les inyecta intramuscular o intravenosamente con las composiciones de la presente invención y se puede determinar la capacidad para estimular la proliferación de neutrófilos en presencia y ausencia de estas composiciones. Tales determinaciones serán útiles para proporcionar una guía respecto a las dosificaciones y tiempos de administración así como la eficacia contra la neutropenia de una composición dada. En los protocolos de terapia de genes, se puede llevar a cabo la tinción inmunofluorescente de secciones, obtenidas de músculo extraído por biopsia y se puede determinar la expresión del análogo de G-CSF humano en la fibra de músculo sometidas a transducción .

H. Composiciones farmacéuticas La presente invención también comprende composiciones f rmacéuticas constituidas por cantidades eficaces de productos polipeptídicos de la invención junto con diluyentes, conservadores, solubilizantes , emulsificantes, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables, útiles en la terapia de G-CSF. Tales composiciones incluyen diluyentes de diferente contenido de - - amortiguador (por ejemplo Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo Tween 80, Polysorbate 80), antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservadores (por ejemplo timersol, alcohol bencílico) y sustancias que proporcionan volumen (por ejemplo lactosa, manitol) ; la incorporación del material en preparaciones articuladas de compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en asociación con liposomas. Tales composiciones influirán en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo de los actuales análogos de G-CSF. Véase, por ejemplo, emington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, páginas 1435-1712, las cuales se incorporan en la presente como referencia. También se abarcan en la presente los derivados de los actuales análogos de G-CSF. Tales derivados incluyen moléculas modificadas por una o más moléculas de polímero hidrosoluble, tales como polietilenglicol o por la adición de poliaminoácidos que incluyen proteínas de fusión (procedimientos para los cuales son bien conocidos en la técnica) . Tal formación de derivados se puede llevar a cabo de manera singular en la parte N o C terminal, o puede realizarse en sitios múltiples de formación de derivados. La - - sustitución de uno o más aminoácidos con lisina puede generar sitios adicionales para la formación de derivados (véase la patente de E.U.A. No.: 5,824,784 y la patente de E.U.A, No.: 5,824,778, incorporadas en la presente como referencia) . Los actuales análogos o derivados de los mismos se pueden formular para inyección o para administración oral, nasal, pulmonar, tópica u otros tipos de administración, como lo puede reconocer un experto en la técnica. La formulación puede ser líquida o puede ser sólida, por ejemplo liofilizada para su disolución. En general, los análogos actuales (o derivados de los mismos) serán útiles de la misma manera que los G-CSF disponibles actualmente, excepto que loa presentes análogos proporcionan una respuesta celular mejorada (actividad superagonista o agonista de G-CSF) . Tales cambios en la respuesta celular se producen al alterar la unión del receptor de G-CSF o el proceso de clasificación, reciclado y degradación por medio de las vías de tránsito endocítico de ligando/receptor. Estos usos incluyen el tratamiento de diversas condiciones hematopoyéticas , neurológicas y relacionadas con la reproducción. Así, las presentes composiciones y métodos para la elaboración de medicamentos pueden ser útiles para el tratamiento de tales condiciones. Las condiciones - - aliviadas o moduladas por la administración de los presentes análogos típicamente son aquéllas caracterizadas por una función hematopoyética o inmunitaria reducida y de manera más específica una cuenta neutrofílica reducida. Tales condiciones se pueden inducir como un curso de terapia para otros propósitos, tal como quimioterapia o terapia de radiaciones. Tales condiciones pueden resultar de una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad bacterial, viral, micótica u otra enfermedad infecciosa. Por ejemplo, la septisemia es el resultado de una infección bacteriana. O bien, tal condición puede ser causada hereditaria o ambientalmente, por ejemplo las neutropenias crónicas graves o leucemias. La edad también puede jugar un factor, por ejemplo, en el ámbito geriátrico; los pacientes pueden tener una cuenta reducida de neutrófilos o una movilización reducida de neutrófilos. Algunas de tales condiciones se revisan en Filgrastim (r-metHuG-CSF) En: Clinical Practice, Morstyn y Dexter (eds.), Marcel Dekker, Inc., New York (1993), p. 351. Otras condiciones menos estudiadas las cuales pueden ser aliviadas o moduladas por la administración de los presentes análogos pueden incluir la reducción de lípidos (o colesterol) en la corriente sanguínea y en ciertas condiciones cardiovasculares, pues G-CSF puede inducir la producción de activadores de plasminógeno . Además, las actuales composiciones de análogos de G-CSF se pueden utilizar para la movilización de células progenitoraa de aangre periférica. Los actuales análogos de G-CSF (o las composiciones de derivados) también se pueden utilizar in vi tro. Por ejemplo, en el establecimiento de terapia de genes, uno puede desear transfectar una célula hematopoyética con ADN exógeno, y cultivar la célula utilizando las formulaciones actuales de análogos de G-CSF. Por lo tanto en otro aspecto, la presente invención involucra un método para cultivar células hematopoyéticas in vi tro, comprendido de: a) colocar a las células en un medio de cultivo adecuado, el medio de cultivo adecuado contiene una composición de análogo de G-CSF de acuerdo con la presente invención, y b) proporcionar condiciones adecuadas para el crecimiento de las células hematopoyéticas. Más particularmente, la presente invención proporciona un método para transfectar células hematopoyéticas con ADN exógeno, que comprende: a) cultivar las células hematopoyéticas con una composición análoga de G-CSF, de acuerdo con la presente invención, y b) transfectar las células cultivadas con ADN exógeno. Las células hematopoyéticas pueden ser, por ejemplo, células de médula ósea o células progenitoraa de sangre periférica. Además, se pueden utilizar otras células bien conocidas por los expertos en la técnica.

- - Para preparar un análogo de G-CSF humano que contenga composiciones para uso clínico, será necesario preparar los vectores de expresión viral, proteínas y ácidos nucleicos como composiciones farmacéuticas, es decir, en una forma apropiada para aplicaciones in vivo. Generalmente, esto involucra preparar composiciones que estén esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que pueden ser dañinas para los humanos o los animales . Generalmente se deseará utilizar sales y amortiguadores apropiados para volver a los vectores de administración estables y permitir la captación por las células objetivo. También se utilizarán amortiguadores cuando se introduzcan en un paciente células recombinantes . Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz del análogo de G-CSF humano o un vector de expresión a las células, disuelto o dispersado en un excipiente o medio acuoso, f rmacéuticamente aceptables. Tales composiciones también se denominan como un inóculo. La frase "f rmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas o indeseables de alguna otra manera cuando se administran a un animal o un humano. Como se utiliza en la presente, un "excipiente f rmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera - - y la totalidad de solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos , agentes isotónicos y que retardan la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquiera de los medios convencionales o los agentes no sea compatible con los vectores o células de la presente invención, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. Los ingredientes suplementarios activos también se pueden incorporar en las composiciones . Las composiciones activas de la presente invención incluyen preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención serán vía cualquier ruta común en la medida en que el tejido objetivo esté disponible por esa vía. Las composiciones farmacéuticas se pueden introducir en el sujeto por cualquier método convencional, por ejemplo, por administración intravenosa, intradérmica , intramuscular, intramamaria, intraperitoneal , intratecal, retrobulbar, intrapulmonar (por ejemplo liberación de término); o por administración oral, sublingual, nasal, anal, vaginal o transdérmica o bien por implantación quirúrgica en algún sitio particular. El tratamiento puede consistir de una sola dosis o una pluralidad de dosis durante cierto período.

- - Los compuestos activos se pueden preparar para administración como soluciones de la base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa . Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones comunes de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe estar fluida en la medida en que pueda salir con facilidad de una jeringa. Debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar impidiendo la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El excipiente puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de - - partícula necesario en el caso de dispersión o mediante el uso de tensioactivoe . Para evitar la acción de los microorganismos se puede llevar a cabo por diversos agentes antibacterianos y antimicóticos , por ejemplo parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos (por ejemplo azúcares o cloruro de sodio) . La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción (por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina) . Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar los compuestos activos en la cantidad necesaria en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes mencionados antes, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones al incorporar los diversos ingredientes activos esterilzados, en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los ingredientes adicionales necesarios a los mencionados antes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y liofilización que generan un polvo del ingrediente activo más el ingrediente de cero adicional de la solución filtrada estéril previamente de la - - misma . Como se utiliza en la presente, el "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y la totalidad de solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos , agentes isotónicos y que retrasan la absorción y similares. El uso de tal medio y los agentes para sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Es cierto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones . Para administración oral, los polipéptidos de la presente invención se pueden incorporar con excipientes y se utilizan en forma de enjuagues bucales no ingeribles y dentrífieos. Un enjuague bucal se puede preparar incorporando al ingrediente activo en la cantidad necesaria en un solvente apropiado, tal como una solución de borato de sodio (solución de Dobell) . De manera alternativa, el ingrediente activo se puede incorporar en un lavado antiséptico que contenga borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El ingrediente activo también se puede dispersar en dentífricos que incluyen: geles, pastas, polvos y suspensiones. Se puede agregar el ingrediente - - activo en una cantidad terapéuticamente eficaz a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saborizantea , agentes espumantes y humectantes. Las composiciones de la presente invención se pueden formular en forma neutra o de sal . Las sales farmacéutic mente aceptables incluyen sales de adición de ácido (que se forman con los grupos amino libres de la proteína) y las cuales se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio e hidróxidos férricos y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares . Las compsiciones de la presente invención se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases - - inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidoa férricos y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaina y similares . Cuando se formulan, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formación de dosificación y en una cantidad tal que sean terapéuticamente eficaces. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de medicamentos y similares. Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser amortiguada adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero se vuelve isotónico con solución salina o glucosa suficientes. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal . Generalmente la cantidad eficaz de los presentes análogos de G-CSF (o sus derivados) se determinarán por la edad, peso y condición o gravedad de la enfermedad de quien la reciba. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, páginas 697-773, incorporado en la presente como referencia. Típicamente, se puede utilizar una dosificación de entre aproximadamente 0.001 µ?/kg de peso corporal/día hasta aproximadamente 1000 g/kg de peso corporal/día, pero se puede utilizar una cantidad mayor o menor, como lo puede determinar un experto en la técnica. La dosificación puede realizarse una o más veces al día, o con menos frecuencia, o puede aer de manera conjunta con otras composiciones, como se describe en la presente. Debe hacerse notar que la presente invención no se limita a las dosificaciones mencionadas en la presente. El término "dosis unitaria" se define como una cantidad separadora de una composición terapéutica dispersada en un excipiente adecuado. Por ejemplo, cuando se administran parenteralmente polipéptidos , las composiciones polipeptídicas generalmente se inyectan en dosis que varían de 1 µg/kg a 100 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente a dosis que varían de 0.1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal/día. La administración parenteral se puede llevar a cabo con una inyección rápida inicial seguida por infusión continua para mantener las concentraciones circulantes terapéuticas del producto medicamentoso. Aquéllos habitualmente expertos en la técnica optimizarán con facilidad las dosificaciones eficaces y los regímenes de administración, determinado por la buena práctica médica y la condición clínica del paciente individual. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y las vías de - - administración. La formulación farmacéutica óptima estará determinada por una persona experta en la técnica en base en la vía de administración y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, supra, páginas 1435-1712, incorporado en la presente como referencia. Tales formulaciones pueden alterar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo o velocidad de depuración in vivo de los agentes administrados. En base en la vía de administración, se puede calcular una dosis adecuada de acuerdo con el peso corporal, las áreas de superficie corporal o el tamaño del órgano. Una precisión adicional en el cálculo necesario para determinar las dosis del tratamiento apropiada se puede realizar de manera habitual por aquéllos que comúnmente son expertos en la técnica sin que realicen experimentación indebida, especialmente en base en la información de dosificación y los ensayos que se describen en la presente, así como los datos farmacocinéticos que se observan en ensayos clínicos en animales o humanos. Se pueden determinar las dosificaciones apropiadas mediante el uso de ensayos establecidos para determinar el nivel de neutropenia o junto con los datos pertinentes de dosis y respuesta. El régimen de dosificación final se determinará por el médico que atienda, considerando factores que modifiquen la acción de los medicamentos, por ejemplo, la actividad específica del medicamento, gravedad del daño y la capacidad de respuesta del paciente, edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. Conforme se llevan a cabo estudios, surgirá más información respecto a los niveles de dosificación apropiados así como la duración de tratamiento para enfermedades y condiciones específicas. En las modalidades de terapia de genes que involucran la administración viral, la dosis unitaria se puede calcular en términos de dosis de partículas virales que se administren. Las dosis virales incluyen un miembro particular de partículas virales o unidades formadoras de placas (ufp) . Para modalidades que involucran adenovirus, las dosis unitarias particulares incluyen 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 o 1014 ufp. Las dosis de partículas pueden ser un poco mayores (10 a 100 veces) , debido a la presencia de partículas incapaces de infección. Se apreciará que las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento de la invención pueden ser útiles en campos de medicina humana y medicina veterinaria. Por lo tanto, el sujeto que va a ser sometido a tratamiento puede ser un mamífero, preferiblemente un humano u otro animal. Para propósitos veterinarios, los sujetos incluyen, por ejemplo, animales de granja, que incluyen vacas, borregos, - - cerdos, caballos y chivos, animales de compañía tales como perros y gatos, animales exóticos o de zoológico, animales de laboratorio que incluyen ratones, ratas, conejos, cobayos y hámsters; y aves tales como pollos, pavos, patos y gansos. Además, la presente invención contempla un equipo que contiene componentes para cultivar células de médula ósea o células progenitoras de sangre periférica constituido de: a) una composición de análogo de G-CSF de la presente invención; y b) componentes adecuados para preparar medio para cultivar células de médula ósea o células progenitoras de sangre periférica.

I. Ejemplos La presente invención describe con mayor detalle, con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, los cuales se proporcionan para ilustrar de manera más completa la invención, pero que no deben considerarse como limitantes del alcance de la misma. Los ejemplos ilustran la preparación de los actuales análogos de G-CSF y las pruebas de estos análogos in vitro. Aquéllos expertos en la técnica comprenderán que las técnicas que se describen en estos ejemplos representan técnicas descritas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención y como tales constituyen modos preferidos para llevar a la práctica - - la misma. Sin embargo, se debe apreciar que los expertos en la técnica pueden, en base en la presente descripción, darse cuenta que pueden realizarse muchos cambios en los métodos específicos que se describen y aún así obtener un resultado parecido o similar sin por esto apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Diseño razonado para imitantes de histidina Se diseñan mutantes de G-CSF en base en el principio en el que la titulación con histidina puede mantener una unión relativamente estrecha en la superficie celular pero puede llevar a un debilitamiento de la unión en compartimientos endosómicos. Aprovechando la disminución de pH de aproximadamente 7 en la superficie celular a entre 5 y 6 en los endosomas, se diseñan mutantes que mantienen en gran medida (o que mejoran) las interacciones electrostáticas a pH extracelular pero que empeoran la interacción a pH endosómico. La pK¾ de histidina en la superficie del ligando libre (~6.5) [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742:576-585 (1982)] sugieren que, dado el ambiente proteínico local apropiado, la titulación con histidina puede resultar en grandes efectos que dependen del - - H cuando se una entre los medios extracelular y endosó-mico. Se utilizaron cálculos para identificar posiciones candidato para sustitución con histidina. Las posiciones preferidas fueron aquéllas para las cuales la afinidad de unión calculada por computadora fue comparable con la de tipo silvestre para histidina neutra y significativamente más débil para histidina cargada positivamente.

EJEMPLO 2 Preparación y caracterización de análogos de Q-CSF Se prepararon análogos de G-CSF ya sea por inserción o por mutagénesis dirigida al sitio de ADN que codifica para r-met-HuG-CSF utilizando el método de extensión de superposición de PCR [Aiyar et al., Meth. Mol. Biol. 57:177-191 (1996)]. Después de confirmar las mutaciones por análisis de secuencia, cada uno de los mutantes se expresa en E. coli K12, se renaturaliza y purifica como se describe en [Lu et al., J. Biol. Chem. 267:8770-8777 (1992)]. Para protocolos y procedimientos [véase también, "Recombinant PCR," Russell Higuchi, En: PCR Protocols, Innis, Gelfand, Sninsky y hite (eds.), Academic Prese, Inc., San Diego, CA (1990); y "Site-directed mutagénesis of cloned DNA" , En Molecular Cloning, A Lab - - Manual , Sambrook, Fritsch, y Maniatis (eds.), Cold Spring Harbor Press, CSH, N.Y. (1989) , ambas incorporadas como referencia en la presente] . Previamente se ha reportado la expresión, en E. coli de r-met-HuG-CSF . Véanse las patentes de E.U.A. No. 4,810,643 y 5,849,883, ambas incorporadas en la presente como referencia. El ADN que codifica para G-CSF humana recombinante tiene un codón metionina inicial seguido por codones para la especie de 174 aminoácidos de G-CSF humano. Los análogos de r-met-HuG-CSF purificados retienen la Met inicial (posición Met -1) . La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico para [His109] G-CSF se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS : 3 (ADN) y 4 (aminoácido) . La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico para [His112] G-CSF se muestran en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NOS: 5 (ADN) y 6 (aminoácido). La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico para [His119] G-CSF se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 7 (ADN) y 8 (aminoácidos) . La confirmación de la identidad de los análogos de G-CSF de la presente invención se lleva a cabo por secuenciado de los aminoácidos de la parte N terminal de las proteínas intactas. Las secuencias de los análogos de G-CSF purificados coinciden con las secuencias predichas de las secuencias de ADN respectivas tales como las que se muestran - - en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 3, 5 y 7. Tales métodos son bien conocidos en la técnica [Shively, EXS 88 :99-117 (2000) ] .

Preparación de estructura de mutantas de istidina La estructura cristalina por rayos X de G-CSF en un complejo 2:2 con el dominio de ligando-unión de G-CSFR se resuelve por Aritomi et al. [Nature 401:713-717 (1999)] utilizando datoa a 2.8 Á a partir de cristales que crecen y se mantienen a pH 7.5 [Aritomi et al., Acta Cryetallogr. D Biol. Crystallogr 56:751-753 (2000)] . La estructura (entrada 1CD9) se obtiene de Protein Data Bank (www . rcsb . org/pdb/ ) [Berman et al., Nucí. Acide. Res. 28:235-242 (2000) . Los cálculos que se describen en la presente se enfocan en la interfase que se forma por los segmentos A y B, la cual es la interfase de unión principal que involucra una molécula de G-CSF (A) y un dominio de CRH de G-CSFR (B) . Las coordenadas de estas cadenas se extraen del archivo de coordenadas y de las posiciones polares y aromáticas de átomos de hidrógeno que fueron construidos utilizando CHARMM [Brooks et al., J. Comput. Chem. 4:187-217 (1983) ; Brunger y Karplus, Proteina 4:148-156 (1988)] . Adicionalmente un número pequeño de posiciones de átomos pesados perdidos, todos alejados de la interfase, fueron construidos en estequiometría estándar utilizando CHARMM. El examen de las cadenas laterales titulables en la interfase en el complejo de tipo silvestre, ninguna de las cuales era histidina, sugiere dejar la totalidad en sus estados de titulación de pH neutro estándar.

Mutagéneels in silico de G-C3F para mutan es de histidina Los sitios potenciales para mutaciones de histidina se identifican por un procedimiento in eilico. Las conformaciones de todos los ligandos y las cadenas laterales de receptores en la interfase de unión dentro de 10 Á de la mutación, incluyendo la mutación misma, se vuelven a empacar sobre una estructura principal rígida utilizando una biblioteca de rotámero estándar [Dunbrack y Karplus, J\ Mol. Biol. 230:543-574 (1993)] . La función de energía incorpora las interacciones de van der Waals y las interacciones electrostáticas con una constante dieléctrica que depende de la distancia (e = 4r, en donde r está en Á) y sin recorte, como se implementa en CHARMM 19 [Brooks et al., J. Comput. Che . 4:187-217 (1983); Gilson y Honig, Nature 330:84-86 (1987)], extendido a las cargas atómicas parciales PARSE [Sitkoff et al., J. Phys. Chem. 98:1978-1988 (1994)] . Se encuentran complejos de energía minimizada utilizando la eliminación de extremo inactivo (y A*) [Desmet et al., - - Nature 356:539-542 (1992); Goldatein, Biophya . J. 66:1335-1340 (1994)] . Este procedimiento, cuando se aplica a un complejo de tipo silvestre, vuelve a construir correctamente la estructura cristalina dentro de la resolución de la biblioteca de rotámeros.

Cálculos electrostáticos para imitantes de hlstldlna Se determinó por consideraciones electrostáticas la selección de residuos en G-CSF para mutaciones a hiatidina. Los detalles del cálculo por computadora fueron similares al trabajo publicado [Hendsch y Tidor, Protein Sci. 8:1381-1392 (1999)]. Se llevaron a cabo cálculos electrostáticos en continuo al resolver la ecuación linealizada de Poisson-Boltzmann con métodos de diferencia finita utilizando la versión modificada localmente del programa de computadora DELPHI [Gilson y Honig, Nature 330:84-86 (1987); Gilson et al., J. Coput. Chem. 9:327-335 (1988); Sharp y Honig, Annu. Rev. Biophys . Biophya. Chem. 19:301-332 (1990)]. Se usaron los parámetros PARSE para los radios atómicos y las cargas atómicas parciales [Sitkoff et al., J. Phys. Chem. 98:1978-1988 (1994)]. Se utilizó un valor de 4 para la constante dielétrica de proteína y 80 para el solvente. Se describe la superficie molecular utilizando una esfera de sonda de 1.4 Á y se elige la fuerza - - iónica en volumen como 145 nM con una capa Stern de 2 Á. Se realizaron los cálculos utilizando el procedimiento de enfoque en dos etapas con un llenado de 23% y 92%. Para la visualización de los potenciales electrostáticos se utiliza una retícula cúbica de 65 x 65 x 65 unidades de rejilla. Para los cálculos de energía libre de unión electrostática se utilizó una rejilla de 191 x 191 x 191 (rejilla final separada 0.476 Á) y cada valor proporcionado fue el promedio de 10 desviaciones de la molécula en relación a la rejilla. La complementariedad electrostática sugiere seis sitios de mutación candidatos. La predominancia de regiones negativas superpuestas indica una densidad de carga negativa excesiva, que incluye las posiciones que corresponden a los residuos cargados Glu19, Asp109, y Asp112, así como los residuos polares Gln20, Thr116 y Gln119.

Generación de una estructura mu ante de histldina Se generaron por computadora complejos mutantes, en los cuales cada uno de los seis residuos ligandos (Glu19, Gln20, Asp109, Asp112, Thr116 y Gln119) fueron mutados una sola vez a histidina. Cada posición fue sustituida con dos tautómeros de histidina neutros (protonados en el nitrógeno d o e, indicado commo His5°, o HisE°, respectivamente) , y una histidina cargada positivamente (His+) . Se utilizó un - - procedimiento de minimización de restricción en el cual a la cadena lateral mutante y a los residuos vecinos se les proporciona libertad completa para volver a empacarse utilizando algoritmos basados en eliminación del extremo inactivo y A* [Desmet et al., Nature 356:539-542 (1992); Goldatein, Biophys . J. 66:1335-1340 (1994); Leach y Lemon, Proteins 33:227-239 (1998)]. La complementariedad de los complejos mutantes se visualiza y se compara con el tipo silvestre .

Selección de candidato para mutantes de hlstldlna Se seleccionaron candidatos para las pruebas experimentales en base en el principio de que los mutantes deben unirse al receptor de manera general también como (o tal vez incluso mejor que) el tipo silvestre para el tautómero His° con mejor unión (que corresponde a las condiciones de superficie celular) y de manera significativamente más pobre en comparación con el tipo silvestre para His+ (que corresponde a las condiciones endosómicag) . Una vez que la diferencia entre las uniones His° y His+ es mayor de algunas kcal/mol, no hay ventaja en volver esta diferencia más grande debido a que puede ser mayor que el costo de desprotonar His+ en el estado no unido y unirse como His°. Por lo tanto, Asp109 y Asp112 se elaboraron - - y purificaron para caracterización experimental. Adicionalraente, debido a que Gln119 Hia se predice que se une mejor que el tipo silvestre sobre la superficie celular, también se elaboró y purificó incluso aunque no estaba claro de los cálculos si la unión es significativamente más débil en los endoaomas .

Valoree de energía libre de unión electrostática para el tipo silvestre y los mutantea de hlatldlna Se realizan cálculos por computadora de la contribución electrostática de la energía libre de unión para el tipo silvestre y cada uno de los imitantes His6c, HisE° y His+ utilizando el modelo de unión rígido sencillo y electrostática continua. Aunque no se tratan todos los detalles de unión de manera explícita, este modelo es directo para su aplicación y debe ser capaz de mostrar variaciones moderadas a grandes en las diferencias de unión entre los complejos. Los resultados muestran algunos comportamientos diferentes. La mayor parte de los mutantes muestran His° (por lo menos uno de los tautómeros de histidina) que se unen casi, pero no tan bien como el tipo silvestre (de hasta 2.5 kcal/mol peor) . Dos excepciones son Glu19His°, el cual no es tolerado en el complejo (calculado que se une de manera general a 10 kcal/mol peor que el tipo - - silvestre) y Gln119His°, el cual se calcula que se une un poco mejor que el tipo silvestre (en 1.7 kcal/mol para el tautómero His5°) . De manera interesante, Glu19 parece esencial para unión al receptor [Reidhaar-Olson et al., Biochemietry 35:9034-9041 (1996); Layton et al., J. Biol. Chem. 274:17445-17451 (1999)]. En un ensayo de proliferación celular, Glu19Ala esencialmente no induce respuesta (datos no mostrados), lo que concuerda con este cálculo. Para los otros tres mutantes [Glu19His ( [His19] G-CSP) , Asp109His ( [His109] G-CSF) y Asp112His ( [His112] G-CSF) ] , la dependencia del pH de la unión se predice que cambia en la dirección deseada debido a que His+ tiene una energía libre de unión calculada de manera general en 5 o más kcal/mol peor que His0 (y más de 7 kcal/mol peor que el tipo silvestre) . Para los otros tres mutantes [Gln21His ( [His21] G-CSF) , Thr117His ( [His117] G-CSF) , y Gln119His ( [His119] G-CSF) ] la diferencia en la unión entre His0 y His+ es demasiado pequeña para que pueda ser confiable respecto a las predicciones (menos de 1 kcal/mol) .

EJEMPLO 3 Materiales experimentales y cultivo celular El medio esencial mínimo a (MEM ) , L-glutamina, - - penicilina-estreptomicina y suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) se obtiene de Life Technologies, Inc. (Rockville, D) . La solución isotónica separa el contador Coulter (ISOTON II, Coulter Diagnostica, Hialeah, FL) se obtiene de Curtin Matheson Scientific Inc. (Houston, TX) . La línea de suspensión dependiente de G-CSF, OCI/AML1, un obsequio generoso de Ernest A. McCulloch [Ontario Cáncer Institute (OCI) , Princesa Margaret Hospital, 610 University Avenue, Toronto, Ontario, M5G 2M9 , Canadá], fue la que se utilizó para todos los experimentos. Las células se cultivaron de manera sistemática en matraces de cultivo de tejido Corning de 75 cm2 en MEMa suplementado con FBS 20%, L-glutamina 200 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina y 270 pM de G-CSF en una atmósfera humidificada con C02 5%. Las células se someten a pasaje hasta 10E células/ml, cada 3 a 4 días.

EJEMPLO 4 Resultados experimentales con mutantes de histidina Enaayoa de proliferación celular Se compararon los tres mutantes de histidina - [His109] G-CSF, [His112] G-CSF y [His119] G-CSF de tipo silvestre - - en un ensayo de proliferación celular dependiente de G-CSF. Las células OCI/AML1 se hacen pasar a medio MEMa suplementado (sin G-CSF) 24 h antes del inicio del experimento de proliferación celular, punto en el cual los matraces en paralelo de las célula a una densidad de 105 células/ml se incuban en medio MEMa con G-CSF tipo silvestre, [His109] G-CSF , [???112] G-CSF o [His119] G-CSF 125 pM. El crecimiento celular en cada matraz se mide en los días 2, 5 y 8 utilizando el contador Coulter. Después de dos días, no se pudieron detectar diferencias en la proliferación celular. Sin embargo, después de cinco días, [His119] G-CSF incrementa significativamente la proliferación celular. En el día ocho, las células tratadas con [His119] G-CSF fueron casi el doble de número que el control y las células tratadas con [His109] G-CSF y [His112] G-CSF mostraron incrementos menores aunque significativos con respecto al control. Por lo tanto, todos los rautantes fueron más potentes que G-CSF tipo silvestre para promover la proliferación celular, pese al hecho de que la totalidad de los residuos mutados se encuentran directamente en la interfase con el receptor.

Supresión de ligando Se mide la supresión de ligando para cada proteína - - con respecto al tiempo. Al igual que en los experimentos anteriores, se someten a pasaje a células OCI/AML1 en medio MEMa auplementado (sin G-CSF) 24 h antes del inicio de los experimentos de supresión de ligando, punto en el cual se incubaron matraces en paralelo de células a una densidad de 105 células/ml, en medio MEMa con G-CSF tipo silvestre, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, o [His119] G-CSF 125 p . Después de 24 h se mide el número de células en cada matraz como se describe en lo anterior y una alícuota de cada medio sobrenadante, que ae obtiene después de centrifugación para sedimentar el residuo celular, se almacena a -20 °C para medición de la concentración de G-CSF. Esto se repite cada 24 h, durante ocho días. Se cuantificaron las concentraciones de [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, o [His119]G-CSF en las muestras de sobrenadante de medio utilizando equipos de ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) obtenido de R&D Systems (Minneapolis , MN) . Cada muestra de sobrenadante se somete a ensayo por duplicado. Ambos imitantes Asp His, los cuales se predice que son mejores en términos de propiedades de tránsito, resultan en vidas medidas por lo menos 10 veces la de G-CSF de tipo silvestre. En realidad, parece que el incremento notado anteriormente en la proliferación celular de ambos mutantes Asp His { [His109] G-CSF y [His112] G-CSF} en el día 8 en relación al tipo silvestre es el resultado directo de tener suficiente - - ligando disponible para estimular a las células. Adicionalmente , el mutante Gln His, [His119] G-CSF, tiene una vida media mayor de 6 veces la del tipo silvestre. Esto resulta importante dada la potencia de este mutante que resulta en casi dos veces tantas células como el tipo silvestre en el día 8 y por lo tanto uno puede esperar que el tránsito celular de este mutante sea mayor que el de tipo silvestre . Se realizaron por lo menos dos experimentos independientes tanto para la proliferación celular como para los estudios de disminución de ligando.

Unión de ligando Se mide la afinidad de unión de ligando del análogo de G-CSP respecto al receptor de G-CSF utilizando BIAcoreMR 2000 (BIAcore, Inc., Piscata ay, NJ) . Se inmoviliza G-CSF tipo silvestre etiquetado con histidina en la superficie de un chip, y se hace pasar receptor libre (-0.25 -10 nM) sobre el chip para generar una curva de equilibrio estándar y para calcular la afinidad de unión de tipo silvestre utilizando un modelo 1:1. Para determinar la afinidad de unión de cada ligando mutante, se mezclan receptor 2 nM libre con una concentración conocida de ligando mutante y se hace pasar sobre el chip. Se determinan - - las afinidades de unión al equilibrio de imitante utilizando el modelo 1:1 con competencia. Los datos de afinidad de unión se analizan utilizando elementos de programación (software) BIA de evaluación 3:1 (BIAcore, Inc.); y se determinan (KD) las constantes de disociación al equilibrio. Para determinar si el incremento en la vida media y la potencia de los mutantes es atribuible a velocidades de reciclado de ligando mayores, se midieron y reportaron como sigue las constantes de velocidad indicativas de la internalización del complejo y reciclado del ligando.

Internallzaclón de los análogos de Q-C8F Se llevaron a cabo experimentos de internalización en dos de los análogos de G-CSF, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, durante un período de tiempo de 5 min, de manera similar a trabajo publicado [Kuwabara et al., Amer. J. Phyaiol. Endocrinol . Metabol. 32:E1-E9 (1995)]. Brevemente, se lavan dos veces 108 célulasl con PBS y después se incuban en hielo en ligando etiquetado durante 30 min para obtener complejos en la superficie. Las células se lavan nuevamente, dos veces, con PBS enfriado con hielo y se resuspenden en MEMa a 37 °C en t = 0. Se realiza un seguimiento del cambio en los complejos en la superficie y los complejos internos durante un período de tiempo de 5 min; una gráfica de los complejos - - internos versus tiempo integral de complejos en la superficie proporciona una relación lineal, cuya pendiente es la constante de la velocidad de internalización del complejo [ iley et al., J. Biol. Chew. 257:4222-4229 (1982) ] . No se detectaron diferencias en la velocidad de internalización entre G-CSF de tipo silvestre y los análogos [His109] G-CSF y [His112] G-CSF . Los errores asociados con los experimentos de internalización son desviaciones estándar de por lo menos tres experimentos independientes.

Reclclado de loe análogos de G-CSF Se llevaron a cabo experimentos de reciclado en dos de los análogos de G-CSF, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, de manera idéntica a los experimentos de internalización anteriores, excepto que se llevaron a cabo durante un período de tiempo de 25 min. Los datos a partir de los experimentos de reciclado se ajustaron en cuatro parámetros para obtener las constantes de velocidad de reciclado. Las constantes de velocidad de reciclado para los mutantes se encontró que son de por lo menos 50% mayores que las de tipo silvestre con una confianza de 95% por la prueba t de dos muestras. Los errores asociados con los experimentos de reciclado son las desviaciones estándar de por lo menos tres experimentos independientes. Esta mejoría en el reciclado de - - ligandos es exactamente el objetivo que se busca mediante el uso de la elaboración de modelos por computadora que se presenta en este documento. Aunque el aumento medido en el reciclado es eficaz a partir de una ronda de inte nalización, el aumento notable en la vida media del mutante resulta del efecto combinado de la internalización, reciclado, reinternalización y así sucesivamente. Por lo tanto, el efecto repetitivo del fenómeno de reciclado puede mejorar en gran medida la potencia del medicamento aumentando su vida media in vivo y al reducir la retroalimentación negativa propagada por la expansión, inducida por el medicamento, de células que expresan el receptor objetivo. En consecuencia, como se indica en lo anterior, se ha encontrado que las sustituciones con histidina de la presente invención generan análogos de G-CSF que tienen una potencia igual o mayor en relación a G-CSF de tipo silvestre, en un ensayo de proliferación celular. Además, las vidas medias de los mutantes son 6-10 veces mayores que las de G-CSF tipo silvestre. Además, [His109] G-CSF induce la proliferación celular casi al doble con respecto a G-CSF tipo silvestre en el día 8. Además, el reciclado de ligandos mejora de manera significativa, incluso aunque la velocidad de internalización permanezca sin cambios. Estos resultados resultan importantes debido a que sugieren que el tránsito - - celular de este mutante mejora en relación al de tipo silvestre. Tales cambios en la respuesta celular se producen al alterar la unión del receptor de G-CSF o los procesos de clasificación, reciclado y degradación por medio de las vías de tránsito endocítico de ligando/receptor. La metodología que se presenta en este documento es generalizable a otros sistemas más allá del sistema G-CSF/G-CSFR también. Dada la estructura cristalina del complejo ligando-receptor, la técnica de "conmutación de histidina" proporciona un elemento fundamental para generar mutantes con reciclado endosómico mejorado de componentes de los complejos en tránsito. Este es la primera investigación que demuestra un diseño razonado de medicamentos en el contexto del análisis del tránsito celular a nivel de sistemas, en vez de los eventos individuales de unión o de señalización por sí mismos. Aunque la presente invención se ha descrito en términos de las modalidades preferidas, se entiende que se le ocurrirán a los expertos en la técnica variaciones y modificaciones. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas abarquen la totalidad de tales variaciones equivalentes las cuales se encuentran dentro del ámbito de la invención como se reclama. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

- - Listado de Secuencias <110> Suri-tur, Cesiin Lauftanburgar, Douglas Tidor, Bruce el20> Composiciones an logas dtt factor estimulador de colonias da granulocxtos y métodos para su elaboración <130> 01017/37377 <160> 6 <170> Patentln veraion 3.0 <210> 1 <211> 565 «212? ADN <213> Bono «apiana <220> <221> CUS <222> (33).. (554) <400> 1 tctagaaaaa accaaggagg taataaataa tg act cea tta ggt ect gct tet 53 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser l 5 tet ctg ceg ca age ttt ctg ctg aaa tgt ctg gaa cag gtt cgt aaa 101 Ser Leu Pro Gln Ser Pbe Leu Leu Lya Cys Leu G u Gln Val Arg Lys 10 15 20 cag ggt gac ggt gct gca ctg ca gaa aaa ctg tg gct act tac Gln Gly Aap Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lye Leu Cye Ala Thr Tyr 25 30 35 aaa ctg tgc cat ceg gaa gaa ctg gta ctg ctg ggt cat tet tt ggg 197 Lys Lau Cys His Pro Slu Olu Lau Val Leu Leu Gly Eif Ser Leu Gly 40 45 50 55 ate ceg tgg gct ceg ctg tet tet tgc cea tet caá gct ctt cag ctg 245 lie Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cye Pro Ser Gln Ala Lau Gln Leu 60 65 70 gct ggt tgt ctg tet cae ctg cat tet ggt ctg ttc ctg tat cag ggt 293 Ala Gly Cye Lau Ser Gln Leu Hia Ser Gly Leu phe Lau Tyr Gln Qly 75 80 85 ctt ctg caá gct ctg gaa ggt ate tet ceg gaa ctg ggt ceg act ctg 341 Leu Leu Gln Ala Leu Glu Qly lie Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu 90 95 100 gac act ctg cag cta gat gta gct gac ttt gct act act att tgg ca 309 Aap Thr Leu Gln Leu Aap Val Ala Aap Phe Ala Thr Thr lie Trp Gln OS 110 115 cag atg gaa gag etc ggt atg gca cea gct ctg caá ceg act caá ggt 437 Gln Met Glu Olu Leu Gly Mat Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly 120 125 130 135 gct atg ccg gca ttc gct tct gca ttc cag cgt cgt gca gga ggt gta 485 Ala Met Pro Ala Phe Ala Sar Ala Phe Gln Arg Arg Ala Oly Qly Val 140 145 150 ctg gtt gct tct cat ctg ca tct ttc ctg gaa gta tct tac cgt gtt 533 Lau Val Ala Ser Hia Leu Ola Bar Phe Leu Qlu Val Sar Tyr Arg v&l 155 160 165 ctg cgt cat ctg gct cag ceg taatagaatt c 5S5 Leu Arg Hia Leu Ala Gln Pro 170 <210> 2 <211> 174 <212> PRT <213> Homo «apiana <400> 2 Thr Pro Leu Oly Pro Ala Sar Ser Leu Pro Qln Sar Phe Leu Leu Lya 1 5 10 15 Leu Glu Qln Val Arg Lya l a Sin Oly A*p Oly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Qlu Lya Leu Cya Ala Thr Tyr Lya Leu ya Hia Pro Qlu Qlu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Oly Hie Ser Leu Oly lie Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cya 50 55 60 Pro Ser Qln Ala Leu Oln Leu Ala Oly Cya Leu Ser Oln Leu Hia Sar 65 70 75 T0 Oly Leu Phe Lau Tyr Oln Oly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Qly lie Ser 85 90 95 Pro Olu L«u Qly Pro Thr Leu A*p Thr Leu Oln Leu Aep Val Ala Asp 100 IOS 110 Phe Ala Thr Thr lia Trp Oln Oln Met Olu Olu Leu Qly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Oln Pro Tbr Oln Oly Ala Met Pro Ala Phe Ala Sar Ala Phe 130 135 140 Oln Arg Arg Ala Gly Oly Val Leu Val Ala Ser Hia Leu Oln Ser Pba 145 150 155 160 Lau Glu Val Ser Tyr Arg Val Lau Arg Hia Leu Ala Oln Pro 165 170 - - <210> 3 <211> 565 «212> ADN «213> Homo aapiene <220> <221> CDS <222> (33).. (554) <220> <221> miac_f«ature <222> (359) <223> y ¦ C O t <400> 3 tctagaaaaa eccaaggagg taataaataa tg act cca tta gg ect gct tct Thr Pro Leu Qly Pro Ala Sar 1 5 tct ctg ccg ca age ctt ctg ctg aaa tgt ctg gaa cag gtt cgt aaa Ser Leu Pro aln Ser Pbe Leu Leu Lys Cya Leu Qlu aln Val Arg Lya 10 15 20 ate cag ggt gac ggt gct gca ctg ca gaa aaa ctg tgc gct act tac lie Qln Oly Aap Oly Ala Ala Leu Qln Qlu Lys Leu Cya Ala Thr yr 25 30 35 aaa ctg tgc cat ccg gaa gaa ctg gta ctg gaa ggt cat tct ctt ggg Lye Leu Cya His Pro Qlu Qlu Lau Val Leu Olu Oly Hie ser Lau Oly 40 45 50 55 ate ccg tgg gct ccg ctg tct tct tgc cca tct caá gct ctt cag ctg l a Pro Trp Ala Pro Leu Ser Sar Cya Pro Ser Qln Ala Leu Qln Leu 60 65 70 gct ggt tgt ctg tct caá ctg cat tct ggt ctg ttc ctg tat cag ggt 293 Ala Gly Cya Lau Ser Qln Leu Hia Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Qln Oly 75 80 B5 ctt ctg caá gct ctg gaa ggt at tct ccg gaa ctg ggt ccg act ctg 341 Leu Leu aln Ala Leu Olu Oly 11· Ser Pro Olu Leu aly Pro Thr Leu 90 95 100 gac act ctg cag cta cay gta gct gac ttt gct act act att tgg caá 389 Aap Thr Leu Gln Leu Hie Val Ala Aap Pht Ala Thr Thr Ha Trp Oln 105 lio 115 cag atg gaa gag etc ggt atg gca cca gct ctg caá ccg act caá ggt 437 ala Hat Olu Olu Leu Oly Met Ala Pro Ala Leu Gln pro Thr Qln aly 120 125 130 135 gct atg ccg gca ttc gct tct gca ttc cag cgt cgt gca gga ggt gta Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala oly Oly Val 140 145 150 ctg gtt gct tct cat ctg caá tct ttc ctg gaa gta tct tac cgt gtt Lau Val Ala Ser Bis Leu Oln Ser Phe Leu Qlu Val Ser Tyr Arg Val 155 160 165 ctg cgt eat ctg gct cag ccg taatagaatt c 565 Leu Arg Hia Lau Ala 01B Pro 170 <210> 4 <211> 174 < 12> PRT <213> Homo aapiena <400v 4 Thr Pro Leu Qly Pro Ala sar Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Lau Lya 1 5 10 15 Cya Leu alu Qln Val Arg Lya lie Oln Qly Aap Qly Ala Ala Leu Oln 20 25 30 alu Ly» Leu Cya Ala Thr Tyr Lya Leu Cya Eia Pro Qlu alu Leu Val 35 40 45 Leu Qlu Qly Hia Ser Lau Qly lia Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Oln Ala Leu Gln Lau Ala Qly Cya Leu Ser Qln Leu Eia Sar 65 70 75 80 Oly Leu Phe Leu Tyr Oln Qly Lau Lau Gln Ala Leu Olu Qly lie Ser 85 90 95 Pro Olu Leu Qly Pro Thr Leu Aap Thr Lau Qln Leu Hia Val Ala Aap 100 105 110 Pbe Ala Thr Thr lia Trp Gln Oln Met Glu Glu Leu Oly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Oln aly Ala Met Pro Ala Pha Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Oly Oly Val Leu Val Ala Ser Hia Leu Gln Ser Pha 145 1B0 155 160 Leu Qlu al Ser Tyr Arg Val Leu Arg Hia Leu Ala Oln Pro 165 170 <210> 5 <211> 565 <212> ADN <213> Homo aapians <220> <221> CDS <222> (33).. 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(554) <400> 7 t tagaaaaa accaaggagg taataaataa tg aet cea tta ggt ect gct tet 53 Thr Pro Leu Oly Pro Ala Ser l 5

Claims

- 115 -
REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un polipéptido análogo del factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés) humano, que comprende una sustitución de aminoácidos en la secuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) una sustitución de ácido aspártico con histidina en la posición No. 109, [His109] G-CSF; b) una sustitución de ácido aspártico con histidina en la posición No. 112, [His112] G-CSF ; c) una sustitución de glutamina con histidina en la posición No. 119, [Hislls] G-CSF ; y d) cualquiera de los análogos de los incisos (a-c) que opcionalmente incluyen un residuo metionilo N terminal. 2. El polipéptido análogo de G-CSF, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque forma derivados con uno o más polímeros hidrosolubles. 3. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un polipéptido análogo de G-CSF, de - 116 - conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
4. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido análogo a G-CSF humano, caracterizado porque comprende una sustitución de aminoácido en la secuencia de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2, que se selecciona del grupo que consiste de: a) una sustitución de ácido aspártico con hiatidina en la posición No. 109, [His109] G-CSF; b) una sustitución de ácido aspártico con histidina en la posición No. 112, [His112] G-CSF ; c) una sustitución de glutamina con histidina en la posición No. 119, [His119] G-CSF; y d) cualquiera de los análogos de los incisos (a-c) que opcionalmente incluyen un residuo metionilo N terminal .
5. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la molécula se selecciona del grupo que consiste de: a) las secuencias de ADN que se establecen en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 3, 5, ó 7 (y cadenas complementarias) ; y b) cualquiera de las secuencias de ADN del inciso (a) que adicionalmente codifican para un residuo metionilo N terminal. - 117 -
6. Un plásmido recombinante de expresión, caracterizado porque contiene un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.
7. Una célula hospedera, caracterizada porque contiene un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.
8. La célula hospedera, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de una bacteria, una célula de mamífero, una célula cancerosa, una célula de levadura y una célula de insecto.
9. Un proceso para producir polipéptidos análogos de G-CSF, [His109] G-CSF, [His111] G-CSF, [His119] G-CSF o especies Met"1 de los mismos, a partir de células hospederas que contienen ácido nucleico que codifica para tales análogos, el proceso está caracterizado porque comprende : a) cultivar la célula hospedera que contiene un polipéptido de conformidad con la reivindicación 4 bajo condiciones que faciliten la expresión de tal polipéptido; y b) obtener tal polipéptido análogo de G-CSF.
10. Un método para tratar condiciones hematopoyéticas , neurológicas o relacionadas con la reproducción, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición de - 118 - conformidad con las reivindicaciones 1 6 2 a un paciente en necesidad de la misma.
11. El método de tratamiento, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la condición se selecciona del grupo que consiste de: función nematopoyética reducida, función inmunitaria reducida, conteo neutrofílico reducido, movilización neutrofílica reducida, movilización de células progenitoras de sangre periférica, septicemia, neutropenia crónica grave, trasplantes de médula ósea, enfermedades infecciosas, leucopenia, trombocitopenia, anemia, mejoramiento de injertos de médula ósea durante el transplante, mejoramiento de recuperación de médula ósea en el tratamiento de radiación, químico o quimioterapéutico inducido por aplasia de médula ósea o mielosupresión y síndrome de inmunodeficiencia adquirida.
12. Un método para sensibilizar células a quimioterapia y radioterapia, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición de conformidad con las r ivindicaciones 1 ó 2 a un paciente en necesidad del mismo.
13. Un método para cultivar células hematopoyéticas in vitro, caracterizado porque comprende: a) colocar a las células en un medio de cultivo adecuado, el medio de cultivo adecuado contiene un polipéptido análogo de G-CSF, de conformidad con la - 119 - reivindicación 1; y b) proporcionar condiciones adecuadas para el crecimiento de tales células hematopoyéticas . 1 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el tratamiento, sensibilización o cultivo incluye el uso de por lo menos un factor adicional que se selecciona de entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGF-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 y factor de crecimiento de fibroblastos . 15. Un equipo, caracterizado porque contiene componentes para cultivar células hematopoyéticas, que consisten de: a) cualquiera de los polipéptidos análogos de conformidad con la reivindicación 1; b) componentes adecuados para preparar medio para cultivar células hematopoyéticas; y c) opcionalmente , por lo menos un factor adicional que se selecciona de entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGF-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 y factor de crecimiento de fibroblastos. - 120 - RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones polipeptídicas análogas del factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"), ácidos nucleicos, plásmidos recombinantes de expresión, células hospederas relacionados y procesos para la producción recombinante de los análogos de G-CSF presentes. El concepto que se detalla en la presente involucra mutantes novedosos de G-CSF, utilizando sustituciones únicas de aminoácidos, las cuales se eligen de manera razonada para alterar el tránsito celular de G-CSF o de G-CSFR. Además, se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos de uso.