JP6295249B2 - レチノイドアゴニストを用いた好中球減少症の治療方法 - Google Patents

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Description

政府の権利
本発明は、それぞれ、米国国立衛生研究所により与えられた許可番号第CA111440号、第CA120512号および第CA120512−02S1号に基づく政府の支援により行われた。政府は、本発明に対し一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、レチノイドアゴニスト、例えば、タミバロテンを投与することを含む、それを必要とする対象において、好中球減少症を治療、抑制、軽減、および/またはその予防を促進するための方法に関する。
本明細書で引用される全ての出版物は、それぞれ個別の出版物または特許出願が具体的かつ個別に、参照により援用されることが示された場合と同程度にその全体が参照により援用される。以下の説明は、本発明の理解に有用であると思われる情報を含む。これにより、本明細書で提供される情報のいずれかが特許を請求する本発明に対する先行技術であるということ、もしくはこれに関連するということ、または、明確にもしくは暗示的に参照されるいずれかの出版物が先行技術であるということを認めるものではない。
最も一般的な顆粒球である好中球は、主に病原体感染に対して防御を行い、循環白血球の最高70%を占める。癌化学療法によって誘発される好中球減少症は、血流中の好中球の数が大きく減少することを特徴とする血液疾患である。HSCの顆粒球生成を促進することによる後天性および先天性好中球減少症の治療にG−CSFが最初に使用されてから20年以上が経過している1、2。G−CSFの低治療指数、投与の有害作用、および悪性形質転換のリスクのために、腫瘍学における化学療法により誘導された好中球減少症は、罹患率、死亡率、および医療費の主要な原因として残されたままである3、4。近年の研究により、PBNとは対照的に、CD34+細胞由来G−CSFにより誘導された好中球の殺菌機能不全は、分化プロセス初期の異常な顆粒球生成の異常に起因する成熟顆粒の欠如に関連していることが示されている。従って、好中球減少症に対するさらに効果的な療法開発の成否は、顆粒球生成と好中球による免疫の発生との関係を明確化できるかどうかにかかっていると思われる。
レチノイドアゴニストAm806−8は、RAにより活性化される転写因子11、12であるレチノイン酸受容体アルファ(RARα)6、9、10に対し選択的に結合し、白血病性骨髄芽球およびHSCの両方の顆粒球分化を調節する13−17ことによりオールトランスレチノイン酸(RA)の副作用を回復させるように設計されている。天然型ビタミンAのRAは、ボディープランの形成において重要な役割を果たし、多くのタイプの正常および悪性細胞の分化を誘導する18−20。現在まで、急性前骨髄球性白血病(APL)のRA治療は、臨床腫瘍学において分化誘導療法で成功した最良の例21であるが、RA療法に関連する副作用は、概して重篤であり、また、RA抵抗性はよく発生する事象である22−24。いくつかの研究により、RARαがAm80によって誘発される顆粒球分化を調節することが示された25−27。さらに、Am80は、APL患者の分化によって誘発される療法として使用されるRAまたは他のレチノイドより低い毒性で、約10倍効率が高い7、8、28。現在、Am80は、APLの治療のために日本で承認され7、8、米国およびヨーロッパにおいては、他のいくつかの癌/疾患のための臨床試験が行われている(http://www.cytrx.com/tamibarotene.html;http://clinicaltrials.gov)。Am80を使用して顆粒球分化を誘導にする手法が進歩したことにより、免疫発生の間に顆粒球生成から生じる好中球の殺菌力を高める手段として本発明者らがこの薬剤を試験することになった。本発明者らは、CD18活性化に与えるCD66の差次的効果を媒介することによるHSC由来顆粒球生成の促進を介して、Am80が好中球分化および免疫発生の誘導因子としてG−CSFより顕著に大きい活性を有すると想定されることについて本明細書で報告する。
本発明は、それを必要とする対象において、好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および/または各種タイプの先天性好中球減少症を治療、抑制、および/またはその重症度を軽減するための方法を提供する。本方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、有効量のその組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症を治療、抑制、および/またはその重症度を軽減することを含む。本方法は、本発明の組成物と一緒に追加の治療薬を同時に、または順次投与し、対象の好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および/または各種タイプの先天性好中球減少症を治療、抑制、および/またはその重症度を軽減することとをさらに含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。
また、本発明は、それを必要とする対象において、好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および/または各種タイプの先天性好中球減少症を治療、抑制、および/またはその重症度を軽減するための医薬組成物およびキットを提供する。本医薬組成物およびキットは、多量のレチノイドアゴニストを含む。一部の実施形態では、本レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。
[本発明1001]
(i)レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、
(ii)治療有効量の前記組成物を、好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、または好中球減少症の予防の促進を必要とする哺乳類対象に投与することと
を含む方法。
[本発明1002]
それを必要とする対象において、癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療するための方法であって、
(i)レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、
(ii)癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療するために治療有効量の前記組成物を前記対象に投与して、それにより、前記対象の癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療することと
を含む方法。
[本発明1003]
化学療法剤を投与することをさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記化学療法剤と前記レチノイドアゴニストを含む組成物とが、同時にまたは逐次的に投与される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
それを必要とする対象において、急性細菌感染症を治療するための方法であって、
(i)レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、
(ii)抗細菌治療薬を含む組成物を提供することと、
(iii)前記対象の前記急性細菌感染症を治療するために、治療有効量のそれぞれの前記組成物を前記対象に投与し、それにより、前記対象の急性細菌感染症を治療することと
を含む方法。
[本発明1006]
前記レチノイドアゴニストを含む前記組成物と、前記抗細菌治療薬を含む前記組成物とが、同時にまたは逐次的に投与される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記レチノイドアゴニストが、経静脈、筋肉内、腹膜内、経口または吸入経由で投与される、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記有効量の前記レチノイドアゴニストが、約0.1〜0.5mg/kg/日、0.5〜5mg/kg/日、5〜10mg/kg/日、10〜20mg/kg/日、20〜50mg/kg/日、50〜100mg/kg/日、100〜200mg/kg/日、200〜300mg/kg/日、300〜400mg/kg/日、400〜500mg/kg/日、500〜600mg/kg/日、600〜700mg/kg/日、700〜800mg/kg/日、800〜900mg/kg/日、または900〜1000mg/kg/日である、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなる群より選択される、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記レチノイドアゴニストが、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1つまたは複数である、本発明1001、1002または1005のいずれかの方法。
[本発明1011]
(i)一定量のレチノイドアゴニストを含む組成物と、
(ii)好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、好中球減少症の予防の促進、癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療、または急性細菌感染症の治療を必要とする哺乳類対象に、治療有効量の前記組成物を投与するための使用説明書と
を含むキット。
[本発明1012]
レチノイドアゴニストを特定するための方法であって、
(i)CD34+細胞を目的の分子と接触させることと、
(ii)CD34+細胞および前記目的の分子を抗原とさらに接触させて免疫応答を刺激することと、
(iii)(ii)における前記接触がラクトフェリン、LL−37またはこれらの組み合わせの分泌の増加を引き起こすか否かを評価することと
を含み、分泌の増加は、前記目的の分子がレチノイドアゴニストであることを示す、
方法。
例示的な実施形態を参照図面に図示する。本明細書で開示される実施形態および図面は、限定するものではなく、例示であると見なされるべきであると意図されている。
本発明の各種実施形態により、Am80が、G−CSFより効果的に好中球分化を促進することを示す一方で、G−CSFと類似の低い毒性を示すことを表す図である。(A)は、6日目対9または12日目のG−CSFで処理したCD34+細胞中のより低い単球誘導に関連した良好な顆粒球誘導を示す。(BとC)は、濃度を下げたAm80(2.5nM)はG−CSFより効果的な顆粒球分化の誘導を引き起こすこと(パネルB)、また、より低い細胞傷害性(パネルC)を示す。(D)顆粒球分化に対し最適であることが明らかになった条件下での、Am80およびG−CSFの全体比較を示す。 本発明の各種実施形態による、Am80によって誘導される好中球(AIN)が、G−CSFによって誘導される好中球(GIN)より効果的に顆粒を産生および分泌することを示す図である。(A)大腸菌刺激時のラクトフェリンの効果的な分泌に対するAINとGINの比較を示す。(B)LL−37のより大きな産生と脱顆粒に対するAINとGINの効果の比較を示す。(C)大腸菌刺激時の、GINとAIN両方における細胞内のMMP9の存在量の増加および不充分な脱顆粒を示す。 本発明の各種実施形態による、抗CD15抗体による無選別および選別AINの両方が、無選別および選別GINよりも高い細菌の排除能力を示す図である。(A)単球の定量を示す(GIN)。(B)帯状核/分葉核好中球の定量を示す(GIN対AIN)。(CとD)細胞内細菌の排除に与える無選別および選別GINならびにAINの効果の比較を示す。排除効率は、感染後に細胞内区画から回収した生菌の数から決定した。 本発明の各種実施形態による、AINがGINより顕著に高い食作用および殺菌活性を有することを示す図である。(A〜D)細胞外細菌(パネルA)、食菌された細菌(パネルB)、回収細胞内細菌(パネルC)、および死菌(パネルD)の数より判定した食作用および殺菌活性を示す。45分にわたる実験で1.26±0.01倍の細菌数の増加が認められた。*:GIN対AIN、少なくともP<0.03。(E)感染後の細胞外細菌、およびGIN、AINおよびヒト末梢血好中球(PBN)中のインサイチュー死菌の両方の定量を示す。*:GIN対AINまたはPBN、少なくともP<0.003。 本発明の各種実施形態による、ATRA(RA)ならびに新規合成レチノイドアゴニストAm80、CH55、およびIT−YA01115(IT−YA)の構造を示す図である。 本発明の各種実施形態による、Am80が、G−CSFおよび他のレチノイド化合物より効果的にCD34+細胞の顆粒球形態学的分化を誘導にすることを示す図である(A〜B)。顆粒球分化の誘導に対するG−CSFより高いRAの効率(パネルA)は、顕著な細胞死と関連していた(パネルB)。CD34+細胞の顆粒球へのG−CSFによる分化誘導のより低い効率は、12日目のより高い単球誘導と関連していた(パネルA)。(C〜D)Am80(10nM)は、顆粒球分化の誘導に関しRAおよびCH55と比較して類似の効率であった(パネルA、C)が、一方、G−CSFまたはIT−YAまたはCH55より少ない単球誘導を示し(パネルA、C)、また、RAおよびCH55より低い割合の細胞死を示した(パネルB、D)。 本発明の各種実施形態による、G−CSFで処理した場合に比べて、AM80が好中球減少症マウスでの競合的な好中球回復を誘導にすることを示す図である。(A)CPA投与後3日目に測定される異なる用量のAm80およびG−CSFによる好中球回復の分析用実験計画の図である。(B)末梢血(PB)を3日目に安楽死させた対照マウスから回収し、Ficoll−paque(1.084)を使用してPB好中球を精製した。(C)3日目に異なる用量のAm80またはG−CSFで処理した好中球減少症マウス由来白血球(WBC)と好中球回復の分析を行った結果を示す。 本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でAm80により動員された好中球が、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図8Aでは、G−CSFは、5日目に、Am80またはビヒクルで処理されたマウスに比べて著しく加速度的好中球回復を誘導したことを示す。 本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でAm80により動員された好中球が、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図8Bでは、5日目のPB好中球の分析を示す。*G−CSF対Am80、P<1.2×10−6;G−CSF対対照、P<4.0×10−5;G−CSF対ビヒクル、P<8.2×10−8;Am80対ビヒクル、P<1.3×10−6;Am80対対照、P<0.016。 本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でAm80により動員された好中球が、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図8Cでは、異なるマウスのPBから単離された好中球の食作用および殺菌活性は、単離好中球を黄色ブドウ球菌に対しインビトロで暴露した後の細胞外細菌、食菌された細菌、および死菌の数により表される。*細胞外:AIN対GIN、P<0.043;AIN対C−MPBN、P<1.1×10−4;MPBN対C−MPBN、P<3.7×10−4;GIN対C−MPBN、P<0.049。*食作用:AIN対GIN、P<0.026;AIN対C−MPBN、P<0.02;MPBN対GIN、P<0.042;MPBN対C−MPBN、P<0.003;GIN対C−MPBN、P<0.009。*殺菌:AIN対GIN、P<0.026;AIN対C−MPBN、P<0.005;MPBN対GIN、P<0.015;MPBN対C−MPBN、P<0.003;GIN対C−MPBN、P<0.009。 本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でAm80により動員された好中球が、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図8Dでは、WBCおよび好中球の加速度的回復は、G−CSFまたはAm80またはビヒクルによる96時間の刺激後、7日目に終わったことを示す。 本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でAm80により動員された好中球が、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図8Eでは、9日目のPB好中球の分析を示す。*G−CSF対対照、P<0.005;Am80対対照、P<3.9×10−4;Am80対ビヒクル、P<0.03;ビヒクル対対照、P<0.03。 本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でAm80により動員された好中球が、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図8Fでは、加速度的好中球回復の停止48時間後としての9日目に、AINはGINよりも顕著に高い食作用および殺菌活性を有することを示す。*細胞外の:AIN対GIN、P<0.02;AIN対C−MPBN、P<0.007;MPBN対GIN、P<0.04;MPBN対C−MPBN、P<0.02。*食作用:AIN対C−MPBN、P<0.034;MPBN対C−MPBN、P<0.043。*殺菌:AIN対C−MPBN、P<0.034;MPBN対C−MPBN、P<0.043。 本発明の各種実施形態による、好中球減少症マウス中でAm80により動員された好中球が、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示すことを表す図である。図8Gでは、好中球減少症マウスに対し、Am80がG−CSFより大きな殺菌力を示す十分に効果的な好中球を誘導にすることを表すインビボデータである。実験のために、20匹のC57BL6/Jマウスを無作為に4群に分けた。0日目に、200mg/kgのシクロホスファミド(CPA)の単回腹腔内注射投与を行った。CPA注射の4時間後、Am80またはG−CSFまたはビヒクルを投与し、これを、3日間続けた。CPA注射後、48〜60時間マウス好中球減少症が誘導された。3×10黄色ブドウ球菌の腹腔内注射の16時間後、3日目に実験を行った。腹腔内(パネルG−i)およびPB(パネルG−ii)の生存細胞外細菌の数を判定することにより精製好中球の殺菌活性を分析した。3mlのPBS洗浄腹水、および、同様に約1.5mlの全血漿についても、生菌の数を計数した。腹腔内生菌のP値:Am80対G−CSF、P<2.4×10−8;対照対G−CSF、P<4.7×10−9;ビヒクル対G−CSF、P<8.3×10−3;Am80対ビヒクル、P<3.1×10−9;Am80対対照、P<0.038。*パネルG−iiiの合計生存細胞外細菌:Am80対G−CSF、P<1.9×10−6;対照対G−CSF、P<9.4×10−9;ビヒクル対G−CSF、P<6.5×10−4;Am80対ビヒクル、P<6.8×10−7;対照対Am80、P<3.8×10−5。生菌の倍数変化をパネルG−ivに示した。対照群の生菌を1倍の規準として使用した。
発明の詳細な説明
本明細書に引用される全ての文献は、完全に記述されているかのように、参照によりその全体が援用される。特段の断りのない限り、本明細書で使用される技術的、科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。Singleton et al.、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed.、J.Wiley & Sons (New York、NY 2001);March、Advanced Organic Chemistry Reactions、Mechanisms and Structure 5th ed.、J.Wiley & Sons(New York、NY 2001);およびSambrook and Russel、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor、NY 2001)は、当業者にとって、本願で使用される多くの用語に対する一般的指標となろう。
当業者であれば、本発明の実施に使用可能な本明細書に記載したものに類似または均等な多くの方法および材料を理解するであろう。事実、本発明は、記載の方法および材料に限定されるものではない。本発明の目的のために、以下の用語が定義される。
「有益な結果」は、限定するものではないが、疾患状態の重症度を減らすまたは軽減すること、疾患状態の悪化を抑制すること、疾患状態を治療すること、疾患状態の進展を防ぐこと、患者の疾患状態の発症の確率を減らすこと、および患者の寿命または余命を延長させることを含んでもよい。
本明細書で使用される「哺乳動物」は、限定するものではないが、ヒトならびにチンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種などの非ヒト霊長類;ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜(farm animal);イヌおよびネコなどの愛玩動物(domestic animal);マウスなどのげっ歯類、ラットおよびモルモットを含む実験動物、などの哺乳綱のいずれかのメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。従って、成人(成体)および新生児(新生仔)対象、ならびに胎児(胎仔)は、男性(雄)または女性(雌)に関わらず、この用語の範囲内に含まれることが意図されている。
本明細書で使用される「好中球減少症」は、血液中の異常に低レベルの好中球を意味する。好中球減少症は、白血球の産生の減少に起因する(例えば、限定するものではないが、骨髄を冒す治療薬、骨髄を冒す遺伝性/先天性障害、再生不良性貧血、癌、放射線療法、ビタミンB12、葉酸または銅欠乏、および/または殺虫剤への暴露などに起因する)場合がある。また、好中球減少症は、白血球の破壊に起因する(例えば、限定するものではないが、急性細菌感染症、特定の自己免疫疾患、化学療法治療、および/または治療薬に起因する)場合もある。また、好中球減少症は、白血球の隔離、および/または遊走に起因する(例えば、限定するものではないが、血液透析、マラリア、および/または細菌感染などの原因で)場合もある。フレカイニド、フェニトイン、インドメタシン、プロピルチオウラシル、カルビマゾール、クロルプロマジン、トリメトプリム/スルファメトキサゾール(コトリモキサゾール)、クロザピン、チクロジピン(ticlodipine)などの特定の薬物も、好中球減少症を発生させる場合がある。本発明の方法および組成物を使用して、上記のいずれかが原因の好中球減少症の治療、抑制、重症度の軽減、および/または予防促進を行うことができる。また、本発明の方法および組成物を使用して、好中球減少症の治療、抑制、症状の軽減、および/または予防促進を行うことにより、上記のいずれかが原因の好中球減少症から生じた疾患状態の治療、抑制、重症度の軽減、および/または予防促進を行うことができる。
本明細書で使用される「治療(Treatment)」および「治療すること(treating)」は、治療処置および予防または予防処置の両方を意味し、この場合の目的は、標的の病的状態を防ぐかもしくは遅らせる(減らす)、病的状態を防ぐ、有益な結果を追究するかもしくはそれを得る、または治療が最終的に成功しない場合であっても、個々の状態の進展の確率を減らすことである。治療を必要とする対象には、既にその状態にある対象、ならびに、状態になる傾向のある対象、または状態が防止されるべき対象が含まれる。
本明細書で使用される「治療有効量」は、好中球減少症の哺乳類対象に対し有益な結果を実現できる量を意味する。治療有効量は、個別基準に基づき決定でき、少なくとも一部は、哺乳動物の生理的な特性、デリバリーシステムの型または使用される治療技術および疾患の進行に対する投与時間の考慮に基づくであろう。
ヒト造血幹細胞(HSC)の顆粒球生成を促進するための組換え型顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の治療上の使用に関する進歩にも関わらず、好中球減少症は、最も重症の癌化学療法合併症の1つとして残されたままである。本発明者らは、基本的なCD34+造血細胞の顆粒球分化を誘導にするエクスビボモデルを使用して、新規レチノイドアゴニストであるAm80(タミバロテン)が、好中球分化と免疫発生を連携して働かせる点に関しG−CSFより強力であることを発見した。顆粒産生、大腸菌感染、および殺菌の機能分析およびインサイチュー画像処理により、ヒト末梢血好中球(PBN)と同様に、Am80によって誘導される好中球(AIN)は、G−CSFによって誘発される好中球(GIN)より大きな殺菌活性を有することが示された。PBNと類似であるが、GINとは対照的に、AINによる強化された殺菌力は、CD66抗原とインテグリンβ2サブユニットCD18のより大きな同時発現に関連していた。抗CD18抗体は、AINのAm80によって誘発される殺菌活性を常に中和した。従って、AINは、G−CSFに比べて、おそらく、CD66とCD18の機能的相互作用を連携して働かせて顆粒球生成の間に好中球免疫の発生を強化することによるなどの、好中球分化および殺菌活性を促進するためのより有効性の高い手段を提供しているように思われる。本明細書中のこれらの知見は、対費用効果の高い治療選択肢としてAm80を使うことによる好中球減少症に対する新規治療を開発するための分子論的根拠を提供する。
従って、本発明は、それを必要とする哺乳類対象において、好中球減少症を治療するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症を治療することとを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれかの1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体および/または塩である。
さらに、本発明は、それを必要とする哺乳類対象において、好中球減少症重症度を軽減するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症の重症度を軽減するとことを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
また、本発明は、それを必要とする哺乳類対象において、好中球減少症を抑制するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症を抑制することとを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
さらに、本発明は、それを必要とする対象において、好中球減少症の予防を促進するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の好中球減少症の予防を推進することとを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
本発明は、さらに、それを必要とする対象において、癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療、抑制、および/またはその重症度を軽減するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療、抑制、および/または重症度の軽減を行うことを含む。方法は、化学療法剤を投与することとをさらに含む。一実施形態では、化学療法剤およびレチノイドアゴニストを含む組成物は、同時に投与される。別の実施形態では、化学療法剤およびレチノイドアゴニストを含む組成物は、逐次的に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
化学療法剤の例には、限定するものではないが、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロランブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレザト、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、5−フルオロウラシル(5−FU)、6−メルカプトプリン(6−MP)、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、またはこれらの組み合わせが含まれる。
また、本発明は、急性細菌感染症それを必要とする対象において治療、抑制、重症度の軽減、および/または予防の促進方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、抗細菌治療薬を含む組成物を提供することと、治療有効量のそれぞれの組成物を対象に投与し、対象の急性細菌感染症の治療、抑制、重症度の軽減、および/または予防の促進を行うこととを含む。一実施形態では、レチノイドアゴニストを含む組成物および抗細菌治療薬を含む組成物は、同時に投与される。別の実施形態では、レチノイドアゴニストを含む組成物および抗細菌治療薬を含む組成物は、逐次的に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
さらに、本発明は、先天性好中球減少症(限定するものではないが、コストマン症候群、周期性好中球減少症またはチェディアック・東病を含む)それを必要とする哺乳類対象において、を治療、抑制、その重症度を軽減、および/または予防を促進するための方法を提供する。当該方法は、レチノイドアゴニストを含む組成物を提供することと、治療有効量の組成物を対象に投与し、対象の先天性好中球減少症の治療、抑制、重症度の軽減、および/または予防促進を行うこととを含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
一部の実施形態では、本明細書記載の組成物を必要とする哺乳類対象は、限定するものではないが、骨髄を冒す薬物療法(制癌剤、統合失調症治療薬、抗痙攣薬、など)、骨髄を冒す遺伝性および/または先天性の障害、放射線療法を受けている患者、ビタミンB12欠乏、葉酸欠乏、またはこれらの組み合わせをなどが原因の白血球産生の減少した患者である。
さらなる実施形態では、本明細書記載の組成物を必要とする哺乳類対象は、限定するものではないが、急性細菌感染症、自己免疫障害(全身性エリテマトーデスなど)、スルホンアミド薬物の使用、またはこれらの組み合わせなどが原因で白血球の一定量が損傷を受けた、破壊された、および/または減少した対象である。
さらなる実施形態では、本明細書記載の組成物を必要とする哺乳類対象は、限定するものではないが、血液透析、マラリア、細菌感染、またはこれらの組み合わせが原因で白血球(好中球など)の隔離、および/または遊走が生じている対象である。
さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、限定するものではないが、化学療法剤、および/または放射線療法を含む他の治療薬と同時に、または逐次的に投与しても良い。化学療法剤、および/または放射線療法は、多くの場合、白血球の数を減らし、好中球減少症になる。本発明の組成物を化学療法剤、および/または放射線療法と同時または順次投与することにより、好中球減少症の抑制、および/または重症度の軽減が可能となる。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、化学療法剤、および/または放射線療法の投与の前に、その間に、またはその後に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
同様に、レチノイドアゴニストを含む組成物は、抗痙攣薬、および/または統合失調症治療薬と同時にまたは逐次的に投与して、前記薬剤の使用が原因の好中球減少症の抑制、および/または重症度の軽減を行うことができる。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、抗痙攣薬、および/または統合失調症治療薬の投与の前、その間、またはその後に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
さらに、レチノイドアゴニストを含む組成物は、急性細菌感染症、真菌感染症、および/または自己免疫疾患の治療に使用される治療薬と同時にまたは逐次的に投与して、細菌性および真菌感染症、および/または自己免疫疾患に起因して、および/または細菌感染、真菌感染症、および/または自己免疫疾患の治療に使用できる治療薬に起因して発生する可能性がある好中球減少症の抑制、および/または重症度の軽減を行うことができる。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、急性細菌感染症、真菌感染症、および/または自己免疫疾患の治療に使用される治療薬の投与の前、その間、またはその後に投与される。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。
さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストは、経静脈、筋肉内、腹腔内、経口、または吸入経由で投与される。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテンである。
さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストの有効量は、約0.01〜0.05μg/kg/日、0.05〜0.1μg/kg/日、0.1〜0.5μg/kg/日、0.5〜5μg/kg/日、5〜10μg/kg/日、10〜20μg/kg/日、20〜50μg/kg/日、50〜100μg/kg/日、100〜150μg/kg/日、150〜200μg/kg/日、200〜250μg/kg/日、250〜300μg/kg/日、300〜350μg/kg/日、350〜400μg/kg/日、400〜500μg/kg/日、500〜600μg/kg/日、600〜700μg/kg/日、700〜800μg/kg/日、800〜900μg/kg/日、900〜1000μg/kg/日、0.01〜0.05mg/kg/日、0.05〜0.1mg/kg/日、0.1〜0.5mg/kg/日、0.5〜1mg/kg/日、1〜5mg/kg/日、5〜10mg/kg/日、10〜15mg/kg/日、15〜20mg/kg/日、20〜50mg/kg/日、50〜100mg/kg/日、100〜200mg/kg/日、200〜300mg/kg/日、300〜400mg/kg/日、400〜500mg/kg/日、500〜600mg/kg/日、600〜700mg/kg/日、700〜800mg/kg/日、800〜900mg/kg/日、900〜1000mg/kg/日、またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、その類似体、および/または塩である。レチノイドアゴニストの有効量の代表的投与量は、既知の治療化合物が使用されている製造者による推奨範囲、およびインビトロ応答または動物モデルでの応答によって当業者に示されたような推奨範囲であってもよい。このような投与量は、通常、当該生物活性を失うことなく、約1桁の範囲内の濃度または量まで減らすことができる。実際の投与量は、医師の判断、患者の状態、および、例えば、当該培養細胞または生検悪性腫瘍などの組織培養された生体組織試料のインビトロ応答性、または適切な動物モデルで観察された応答に基づく治療方法の有効性に依存する。さまざまな実施形態において、レチノイドアゴニストを含む本発明の組成物は、1日1回(SID/QD)、1日2回(BID)、1日3回(TID)、1日4回(QID)、またはそれ以上投与して、対象に有効量のレチノイドアゴニストを投与できる。ここで、有効量は、本明細書記載の内のいずれか1以上の用量である。
また、本発明は、レチノイドアゴニストを特定する方法を提供する。方法は、CD34+細胞を目的の分子と接触させ、さらに、CD34+細胞および目的の分子を抗原と接触させて免疫応答を刺激し、CD34+細胞、目的の分子と抗原との間の接触により、ラクトフェリン、LL−37またはこれらの組み合わせの分泌の増加を生ずるかどうかを評価することを含む。一実施形態では、ラクトフェリン、LL−37またはこれらの組み合わせの分泌の増加は、目的の分子がレチノイドアゴニストであることを示す。
レチノイドアゴニストである化合物を特定するために採用されるアッセイには、限定するものではないが、マイクロアレイアッセイ、定量的PCR、ノーザンブロットアッセイ、サザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、結合アッセイ、ゲル遅延度アッセイまたは酵母ツーハイブリッド法を用いたアッセイが含まれる。当業者であれば、当技術分野で既知の多数の技術を採用して、特定の薬剤/目的の分子がレチノイドアゴニストであるかどうかを容易に判定できる。
さまざまな実施形態において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなる群より選択される。
医薬組成物
さまざまな実施形態において、本発明は、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせなどの治療有効量のレチノイドアゴニストと共に、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容可能な賦形剤」は、全体として安全、非毒性、および好ましい医薬組成物の調製に有用な賦形剤で、獣医学への使用、ならびにヒト医薬品としての使用に許容可能な賦形剤を意味する。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には、ガス状であってもよい。
さまざまな実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、どのような投与経路による送達用にも処方できる。「投与経路」は、限定するものではないが、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮、非経口または腸内を含む当技術分野で既知のいずれの投与経路の意味であってもよい。「非経口」は、眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、鞘内、子宮内、経静脈、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜的、または経気管を含む、通常、注射に関連する投与経路を意味する。非経口経路では、組成物は、点滴または注射用溶液または懸濁液の形で、または凍結乾燥粉末あってもよい。非経口経路では、組成物は、点滴または注射用溶液または懸濁液の形であってよい。腸内経路では、医薬組成物は、錠剤、ゲルカプセル剤、糖衣錠、シロップ剤、懸濁液、溶液、粉剤、顆粒、乳剤、微小球もしくはナノ球体または徐放を可能とする脂質小胞もしくはポリマー小胞の形であってよい。
また、本発明に係る医薬組成物は、いずれかの薬学的に許容可能なキャリアを含んでもよい。本明細書で使用される「薬学的に許容可能なキャリア」は、1つの組織、器官、または身体の一部から、別の組織、器官、または身体の一部へ目的の化合物を保持または運ぶことに関与する薬学的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクルを意味する。例えば、キャリアは、液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル化材料、またはこれらの組み合わせであってよい。キャリアの各成分は、他の製剤の成分と両立する必要があるという観点から「薬学的に許容可能」でなければならない。また、キャリアは、接触する可能性のある任意の組織または器官と接触した状態での使用に適するものでなければならない。これは、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他のその治療効果より極度に大きい合併症のリスクを保持してはならないことを意味する。
また、本発明に係る医薬組成物は、経口投与用にカプセル化、錠剤化、または乳剤またはシロップ剤として調製できる。薬学的に許容可能な固体または液体キャリアを加えて、組成物の機能を高める、もしくは安定化でき、または、組成物の調製を容易にできる。液体キャリアには、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブ油、グリセリン、食塩水、アルコールおよび水が含まれる。固体キャリアには、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、滑石、ペクチン、アラビアゴム、寒天またはゼラチンが含まれる。また、キャリアには、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなどの徐放材料を、単独で、または、ろうと一緒に含有させてもよい。
製剤は、錠剤剤形用として、必要に応じ、粉砕、混合、造粒、および、圧縮成形、または、硬ゼラチンカプセル剤形用として、粉砕、混合および充填、などの従来の薬学技術により作製される。液体キャリアが使用される場合は、製剤は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤または水性もしくは非水性懸濁液の形であろう。このような液体製剤は、直接口から、または軟ゼラチンカプセルに充填して投与できる。
本発明に係る医薬組成物は、治療有効量を投与できる。正確な治療有効量は、特定の対象の治療の効力の観点から最も効果的な結果が得られると思われる組成物の量である。この量は、限定するものではないが、治療化合物の特性(活性、薬物動態学、薬力学、およびバイオアベイラビリティを含む)、対象の生理学的条件(年齢、性別、疾患タイプおよび病期、全身健康状態、所与の投与量に対する応答性、および薬物療法のタイプを含む)、薬学的に許容可能なキャリアまたは製剤中のキャリアの性質、ならびに、投与経路、などの種々の因子に応じて変化するであろう。臨床的および薬理学的技術分野の熟練者なら、定常的実験、例えば、化合物投与に対する対象の応答のモニタリングおよび、それに応じて投与量を調節することにより、治療有効量を決定できるであろう。さらなる教示に関しては、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro ed.20th edition、Williams & Wilkins PA、USA)(2000)を参照されたい。
本発明のキット
また、本発明は、好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の軽減または好中球減少症の予防の促進のためのキットを、それを必要とする対象に提供する。キットは、レチノイドアゴニストを含む組成物、ならびに対象の好中球減少症、急性細菌感染症、癌化学療法によって誘発される好中球減少症および/または各種タイプの先天性好中球減少症それを必要とする対象において治療、抑制、および/または重症度の軽減のための組成物の使用説明書を含む。一部の実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上である。一実施形態では、レチノイドアゴニストは、タミバロテン(AM80)である。
キットは、少なくとも1種の本発明の組成物を含む材料または成分の集まりである。従って、一部の実施形態では、キットは、上述の、タミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上などのレチノイドアゴニストを含む組成物を含む。
本発明のキットを構成する成分の明確な性質は、意図される目的に依存する。一実施形態では、キットは、特にヒト対象用として構成される。さらなる実施形態では、キットは、限定するものではないが、家畜、愛玩動物、および実験動物などの対象を治療する獣医学用途向けに構成される。
使用説明書がキット中に含まれてもよい。「使用説明書」は、通常、対象の好中球減少症の治療、重症度の軽減、抑制または防止を行うなどの所望の結果を得るために、キットの成分を使用する際に採用すべき技術を説明する明確な表現を含む。任意選択で、キットは、他の有用な構成、例えば、測定器具、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容可能なキャリア、シリンジ、または当業者であれば容易に認識するその他の有用な備品一式も含む。
その操作性および有用性を維持するための任意の便利で、適切な方法で保管されたキットへの組込み用材料または成分を開業医に提供できる。例えば、成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥された形態であってもよい。それらは、室温、冷蔵温度、または凍結温度で提供できる。成分は、通常、適切な梱包材料中に収容される。本明細書で採用される語句の「梱包材料」は、本発明の組成物などのキットの内容物を収容するために使用される1以上の物理的構造物を意味する。梱包材料は、よく知られた方法、好ましくは、無菌の、混入物のない環境を与える方法で構築される。本明細書で使用される用語の「パッケージ」は、個別キット成分を保持できるガラス、プラスチック、紙、箔、などの適切な固体の基質または材料を意味する。従って、例えば、パッケージは、適切な量のタミバロテン(AM80)、CH55、ITYA(IT−YA−01115)またはこれらの組み合わせの内のいずれか1以上などの本発明のレチノイドアゴニストを含む組成物を収容するために使用されるビンであってもよい。梱包材料は、通常、内容物および/またはキットの目的および/またはその成分を表示する外部ラベルを有する。
実施例1
細胞および細胞培養
正常なヒト原始臍帯血CD34+細胞をAllCells(Emeryville、CA)から入手した。StemSpan無血清培地(StemCell Technologies、Vancouver、Canada)を使用して、メーカーのプロトコルに従って、CD34+細胞を6日間で約50倍に増殖した29。顆粒球生成を誘導にするために、25ng/mlのG−CSF17、29を補充した骨髄培地を使用してCD34+細胞を6〜12日間培養した。顆粒球生成の間、ヒドロコルチゾンの添加およびエリスロポエチンの排除によりリンパ系および赤血球細胞をブロックした17、29。オールトランスレチノイン酸(RA)は、Sigma(St.Louis、MO)から入手し、レチノイドアゴニストAm80、CH55、およびIT−YA−01115(ITYA)は、公益財団法人 乙卯研究所(東京)から入手した。各レチノイド化合物をエタノールに溶解した。この調査では、実験的に決定した条件(6日間の顆粒球誘導に25ng/mlのG−CSF17、29または2.5nMのAm80を使用(図1))を適用した。
ヒトPBN
Children's Hospital Los Angeles/University of Southern California Keck School of Medicine(CHLA/USC)の臨床研究委員会により承認されたプロトコルに従い健康なボランティアから末梢静脈血液を採取した。それぞれ20mlの血液をVacutainer Coagulation Tubes(BD Biosciences、San Jose、CA)中に取り出し、室温で等容量のHBSSを使用して希釈した。希釈血液を10mLのFicoll−paque premium(GE Healthcare、Piscataway、NJ)の上に流し込み、400×gで40分遠心分離した。次に、集めたPBN−赤血球層を15mLの3%デキストランT500(Sigma)と混合し、室温で2時間沈降させた。無菌水を使用して低浸透圧溶解により18秒間赤血球を取り除き、その後、PBNリッチ層を遠心分離により集めた。集めたPBNの純度は、ライト・ギムザ染色を用いた形態学的分析により測定して、95%超であった。PBN単離の完了直後の新しく精製されたPBNをアッセイに用いた。
細胞増殖および細胞死
文献17、29に記載されているように標準的血球計数器を用いた細胞計数により細胞増殖を測定した。簡単に説明すると、同数の細胞を3通り播種し、播種の72時間後13日まで細胞を計数した。トリパンブルー色素排除を使用して、培養液中の細胞増殖およびその関連細胞死を同時に測定した。
顆粒球分化の形態学的分析
文献17、29に記載のように、細胞懸濁液をマイクロスライド上に細胞遠沈し、続けて、メタノールにより固定した後、ライト・ギムザ染色(Sigma)により染色した。文献17に記載のように、Zeiss Axioplan顕微鏡を使用して分化の形態学的指標を評価し、Adobe Photoshopで画像のカラーバランス処理を行った。
透過電子顕微鏡観察
Electron Microscopy Laboratory、Department of Pathology and Laboratory Medicine、CHLA/USCのメンバーにより好中球および細菌感染の超微細構造調査が行われた。以下に手順の詳細を示す。
ウェスタンブロッティング
文献15に記載のように、ウェスタンブロッティング(WB)を行った。ラクトフェリン抗体(Abcam、Cambridge、UK)、MMP−9(Merck Chemicals、Darmstadt、Germany)、およびLL−37(Biolegend、SanDiego、CA)を分析に使用した。
脱顆粒分析
細胞に大腸菌DH5α(MOI:5;細胞/細菌比率:1/5)を加えた場合と加えない場合について、無血清DMEM培地中、37℃で30分間インキュベートした。3,000−rpm、7分間の遠心分離により両方の細胞ペレットおよび上清を集めた。細胞ペレットを100μg/mlのゲンタマイシンに懸濁し、37℃で1時間インキュベートし、続けて、細胞の収集、および細胞タンパク質の抽出を行った。上清を0.22−μmフィルター(Pall corporation、Ann Arbor、MI)で濾過し、3,000ダルトンを超える質量のタンパク質を集めるように設計されたAmicon Ultra−4遠心濾過機(Millipore、Billerica、MA)を使用して上清中のタンパク質を濃縮した。Bio−Rad DC Protein Assay(Hercules、CA)を使用してタンパク質の量を測定した29。大腸菌刺激のある場合とない場合の顆粒タンパク質の量の変化の分析をWBによる分析と並行して行った。
食作用および殺菌アッセイ
それぞれ、5×10〜2×10の新しく精製されたPBN、ならびにエクスビボ誘導されたGINおよびAINを1.5−mlのチューブ中の500μlの培地(10%FBS含有DMEM)に懸濁した。対数期大腸菌(E.coli)DH5α(共同研究者から提供を受けた)または黄色ブドウ球菌(S.aureus;ATCC)と共に、MOI:5または10で、37℃の温度下、15、30、および/または60分間細胞をインキュベートした。他方、細胞が無い場合は、細菌を使用して増殖を測定した。それぞれの時点で、細胞のある場合とない場合の試料を1000−rpmで遠心分離した。上清から細胞の存在下の細胞外細菌を集め、異なる稀釈度(20μL毎の)で血液寒天培地に播種して数え上げた。細菌感染試料から集めた細胞ペレットを100μg/mlのゲンタマイシン(Sigma)と共に37℃で1時間さらにインキュベートして細胞外細菌を死滅させた。その後、細胞を2回洗浄し、100μLの0.5%トリトンX−100に溶解した。細胞ライセートから回収した生存細胞内細菌の異なる希釈度の一定量(それぞれ、20μL)を血液寒天培地に播種した。文献5、30に記載のようにして、各時点で、細胞外および生存細胞内細菌の数をCFU数により測定した。他方、食菌された菌および死菌の数は、好中球不含条件の当該細菌対照の数に対する細胞外および生存細胞内細菌の数に基づいて求めた5、30
CD15+好中球の磁気選別
0.5%のBSAおよび2mMのEDTAを含むPBS中懸濁細胞を磁気ミクロビーズ(Miltenyi Biotec、Bergish Gladbach、Germany)に結合させた抗CD15抗体と混合し、4℃で30分間インキュベートした。その後、磁気選別機(Miltenyi Biotec、Bergish Gladbach、Germany)を使い、メーカーのプロトコルに従ってCD15+亜集団を精製した。
統計解析
必要に応じ、平均、標準偏差、および分布範囲を含む記述統計を算出し、スチューデント独立両側t検定で解析した。0.05以下のP値を統計的に有意であると見なした。
インサイチュー殺菌
細胞を大腸菌または黄色ブドウ球菌と共に15分間、および/または60分間インキュベートし、続けて、1,000−rpm、5分間の遠心分離で細胞を集めた。細胞ペレットを100μg/mLのゲンタマイシンに懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。3回洗浄後、細胞をCytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)を使用して4℃で20分間透過処理した。細胞を再度洗浄し、細胞内生存および死細菌の標識のために、LIVE/DEAD BacLight Viability Kit(Life Technologies、Grand Island、NY)を使用してメーカーのプロトコルに従ってPBS中に再懸濁した。細胞をマイクロスライド上に遠心沈降させ、クリプトン/アルゴンレーザーの488および564nmの波長を使用して共焦点顕微鏡下で検査した。無傷膜を有する蛍光染料SYTO9染色生細菌は、緑色に見え、一方、傷害膜を有する死細菌は、蛍光染料ヨウ化プロピジウム(PI)で赤色に染色された。
細菌感染の免疫蛍光法検出
GIN、AIN、およびPBNを大腸菌または黄色ブドウ球菌と共にMOI:10で、37℃において、15分間および60分間インキュベートした。細胞を2%パラホルムアルデヒドを使用して室温で20分間固定し、その後、5%正常ヤギ血清を含むPBSで30分間ブロッキングした。感染後に細胞表面に保持されている細菌のOmpA抗原を遮断するために、最初に、細胞を抗OmpA抗体で1時間、室温でインキュベートし、続けて、HRP標識抗ウサギIgG抗体と共に室温で30分間インキュベートして、外部一次抗体部位を遮断した。徹底的に洗浄後、細胞を透過処理溶液(BD Biosciences)を使用して20分間透過処理した後、細胞内細菌標識用抗OmpA抗体と共に室温で1時間インキュベートした。FITC標識ヤギ抗ウサギIgG抗体と共に30分間の細胞のインキュベーション後、細胞をマイクロスライド上に遠心沈着させ、vectashield退色防止溶液(Vector laboratories、Burlingame、CA)を使用してマウントした。FITC−染色細菌を共焦点顕微鏡で画像化した。
フローサイトメトリー解析
抗ヒトCD66−PE(CD66a、CD66c、CD66d、およびCD66eサブユニットを識別する)、CD11b−APC、CD18−FITC、およびCD66b−PE抗体、ならびに、それらの対応するアイソタイプをBD Biosciencesから入手した。抗ヒトCD66a−PEおよびその対応するアイソタイプをR&D systems(Minneapolis、MN)から入手した。データを取得し、FlowJoソフトウェア(バージョン7.6.5;Treestar、Ashland、OR)で解析した。
実施例2
Am80は、G−CSFより効果的に好中球分化を促進する
Am80、CH55、およびITYAは、ヘテロ原子をRA様構造に導入することにより合成されたレチノイドアゴニストの群である(図5)。これら全てのアゴニストが強力なレチノイド様活性を有することから、本発明者らが確立した方法17、29を使用して、CD34+細胞からの顆粒球生成の誘導の観点からこれらの化合物の効率をG−CSFおよびRAと比較した。本発明者らは、G−CSFが、より大きい単球の誘導が伴うCD34+細胞から顆粒球への形態学的分化の誘導においてRAよりも効果的ではなかったことを示した(図6A)。しかし、G−CSFは、RAに比べて、より大きな細胞増殖およびより低い比率の細胞死を誘導した(図6B)。他のレチノイドアゴニストの中で、60%を超える単球を産生したITYA(5nM)とは対照的に、Am80(10nM)およびCH55(5nM)は、13日目までに75%を超える顆粒球分化を進めた(図6C)。Am80およびCH55の両方ともRA(図6B)と同様に細胞増殖を抑制したが(図6D)、Am80処理に関連する細胞死比率は、CH55またはRAで認められたものより低かった(図6B、6D)。同時に、これらのデータは、G−CSFの場合、顆粒球分化の誘導因子としての有効性がRA、CH55、およびAm80よりも有意に低く、一方、ITYAは、主に、単球分化を誘導にすることを示す。Am80、RA、およびCH55は、類似の有効性で顆粒球分化を推進するが、Am80は、より低い比率の細胞死を誘導にする。
12日目のG−CSF誘導による低レベルのCD34+細胞の顆粒球への分化が、より高いレベルの単球誘導と関連していたために、G−CSFは、短期間でより効果的に顆粒球分化を誘導できる可能性がある。従って、CD34+細胞を6、9、および12日間G−CSFで処理した。これらの細胞の形態学的分化の分析により、本発明者らは、9または12日目に比べて、6日目の最低比率の単球誘導に伴うより効果的な顆粒球分化を認めた(図1A)。この最適の6日誘導条件を使用して、CD34+細胞の顆粒球分化誘導能力に関して、G−CSFおよびAm80を比較した。10nMのAm80がより多くの細胞死を誘導したので(図6C)、この試験では、低減した濃度(2.5nMまたは5nM)のAm80で置換した。結果は、Am80の2.5nMは、無視できる程度の単球誘導と共に、顆粒球分化を著しく誘導した(図1B)のみでなく、5nMのAm80より少ない毒性である(図1C)ことを示した。従って、これらの結果は、G−CSFにおける6日目間の最適誘導期間は、Am80(2.5nM)にも同様に適切であり、調査の残りの部分に対して、このような薬剤暴露時間および薬剤用量を適用するよう本発明者らに促していることを示す。
CD34+細胞の好中球分化を、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、および帯状核好中球段階から分葉核成熟好中球段階までについて解析した。CD34+細胞をG−CSFまたはAm80で6日間処理した。顆粒球の形態学的分析は、Am80により好中球の逐次的成長が十分に誘導されたことを示した。対照的に、G−CSFは、帯状核および分葉核好中球よりも多くの骨髄芽球、ならびに前骨髄球および骨髄球を誘導した(図1D)。さらに、G−CSFは、常に、単球を誘導した(約10%;図1A、1D)。これらの結果は、類似の比率の細胞毒性でありながら、好中球の形態学的分化の誘導では、Am80がG−CSFより効果的であることを示す。
顆粒の産生と分泌に関し、GINよりAINがより効果的である
好中球分化の間、異なる病原体に対する最前線の防衛のために、顆粒タンパク質の異種集団が順次産生され、細胞中に貯蔵される32、33。本発明者らは、Am80強化好中球成熟が顆粒産生の増加と関連しているかどうかを調査した。G−CSFおよびAm80によりCD34+細胞から6日間誘導された好中球を、透過電子顕微鏡により解析した。超微細構造画像は、分葉核好中球レベルでは、GINは、僅かの一次および二次様顆粒と共に、より低密度の無定形物質を含むことが多い種々の数の小胞を有していることを示した。対照的に、AIN中に認められた小胞は、密な物質または無定形かつ密な物質で満たされていることが多かった。GINに比べて、AINは、PBN中に認められるような、増加した数の一次および二次様顆粒を含んでいた。従って、データは、小胞形成および顆粒産生に関し、GINとAINとの間で、顕著な違いを示している。
本発明者らは、Am80誘導された顆粒球分化が実際に十分な顆粒産生と関連しているかどうかを検証し、細菌性刺激時のAINの脱顆粒能力を試験した。CD34+細胞をG−CSFまたはAm80で6日間処理した。その後、得られたGINおよびAINを大腸菌のある場合と無い場合について、30分間インキュベートし、続けて、細胞ライセートおよび上清の両方からタンパク質を抽出した。顆粒産生および分泌のWB分析は、強力で広範な抗微生物活性を有する二次顆粒のラクトフェリン34、35がAIN中に貯蔵され、細菌性刺激時に十分な量で培地中に分泌されたことを示した。対照的に、ラクトフェリンのレベルは、細菌性刺激に伴いGIN中で増加したが、GINによるラクトフェリン分泌の効率は、AINで認められるよりはるかに低かった(図2A)。同様に、高レベルの二次顆粒LL−37がAIN中で観察され、細菌性刺激時に、LL−37顆粒が効果的に培地中に放出された。他方、GINは、LL−37産生および脱顆粒の両方の欠如を示した(図2B)。従って、AINによりラクトフェリンおよびLL−37の両方が効率的に産生され、分泌されたが、GINではそうではなかった。
大腸菌が存在しない場合であっても、GINは、MMP−9(三次顆粒)を培地中に分泌するが、この分泌は細菌性刺激により抑制された(図2C)。他方、大腸菌は、AIN中のMMP−9発現を増強するが、細菌性刺激は、AINのMMP−9の分泌誘導ができなかった(図2C)。これらの観察は、エクスビボ誘導GINおよびAINでのMMP−9誘導または脱顆粒(または両方)における欠陥の存在の可能性を示している。
AINはGINより有意に高い食作用および殺菌活性を有する
上記調査は、顆粒球の形態学的分化および顆粒産生/分泌の両方の促進に関し、Am80がG−CSFより効果的であることを示す(図1、2)。本発明者らは、Am80により誘導されたこのより高い好中球分化の程度が細菌感染に対するより強力な好中球免疫に繋がるのかどうかを明確化した。Am80が、G−CSFよりも多くの帯状核型および分葉核型好中球を誘導にする(図1)ことから、GINおよびAINから選別された帯状核および分葉核好中球が類似の殺菌活性を有するかどうかを試験した。好中球は、CD15+細胞36であるから、GINおよびAINを磁気ミクロビーズ結合抗CD15抗体を使用して精製した。精製後、未選別GIN中の帯状核/分葉核好中球比率は、選別AINでの知見と同様に、選別GIN中では21%から63%に増加した(図3B)。さらに、選別GIN中の残留単球の比率は、約1%にすぎなかった(図3A)。次に、新しく単離/精製された95%超の分葉核好中球から構成されるPBNと一緒に、これらの未選別および選別GINおよびAINの対数期大腸菌を死滅させる能力を試験した(図3B)。注目すべことに、未選別GINに比べて、ほんの僅かの生菌のみが、PBNおよび未選別AINの細胞内の区画から回収されたことがCFU数から示された(図3C)。未選別GINの場合と同様に、選別GINもまた、細菌を死滅させる能力が選別AINよりも有意に低い(図3D)。AINの増強された細菌排除能は、特異的に大腸菌外膜を識別する抗OmpA抗体を使用して大腸菌のインサイチュー標識により確認された。これらの結果は、Am80により誘導された顆粒球生成により生ずる好中球分化のレベルが細菌感染に有効な好中球免疫形成には不可欠であることを示す。この観察は、分葉核好中球形態を有するGINは、いまだ、低レベルの顆粒様分子状態を示し、より大きな数のより低い密度の無定形小胞を含むというデータにより裏付けられている。
細菌感染に対する生来の免疫は、好中球分化の間に発生する。この機能をAINとGINとの間で比較するために、CD34+細胞をG−CSFまたはAm80で6日間処理し、続けて、食作用と殺菌の分析を行った。以前記載の方法31、37を使用して、GIN、AIN、およびPBNを対数期大腸菌と共にMOI:5で、または、好中球が無い場合は、細菌増殖をモニターするために大腸菌を使用して、15または60分間インキュベートした。細胞外細菌および回収生存細胞内細菌の両方を、好中球を細菌に暴露した試料中のCFU数により定量した。次に、好中球不含の条件の細菌の数から細胞外細菌のみ、または細胞外および細胞内細菌の両方の数をそれぞれ減算することにより、食菌された菌および死菌の数を計算した。PBNおよびAINの両試料で、細胞外細菌が有意に減少した(図4A、4B)。PBNは、細菌を急速に15分以内に死滅させ、PBNまたはAIN試料中には、60分までに、僅かの生存細胞内細菌しか存在しなくなる(図4C)。対照的に、GINは、感染の60分までに細胞内細菌の実質的な排除障害を示し、より高レベルの細胞外細菌を残し、殺菌が不完全であった(図4A〜D)。AINがGINより大きな殺菌力を有することを確認するために、SYTO9蛍光染料標識生菌およびヨウ化プロピジウム(PI)蛍光染料標識死菌の両方の共焦点顕微鏡を使用してインサイチュー殺菌を試験した。結果は、AINまたPBN試料中の観察の場合とは対照的に、GIN試料中には、有意により多くの生存大腸菌が残され、はるかに少ない死細菌が認められることを示した。感染後の細胞外細菌、ならびにインサイチュー死細菌の両方の定量化により、AINおよびPBNの両方がGINより大きな殺菌活性を有することが確認された(図4E)。さらに、電子顕微鏡による大腸菌感染の超微細構造画像により、より低密度小胞を含むGIN中には、多数の無傷の/生存細菌が残され、一方、PBNと同様に、AIN中ではほんの僅かの無傷の/生存細菌のみが特定され、その細胞質はいくつかの一次および二次様顆粒と共に密な小胞を含んでいることが示された。まとめると、これらのデータは、Am80によって誘導される顆粒球分化が、細菌感染に対し増強された好中球の生来の免疫と関連することを示唆している。
実施例3
Am80は、G−CSFに比べて競合的な好中球回復を誘導にする
実験用に、30匹のC57BL6/Jマウスを無作為に6群に分けた。異なる用量のAm80およびG−CSFを用いた好中球回復の分析用実験計画を図7Aに示す。0日目に、200mg/kgのシクロホスファミド(CPA)の単回腹腔内注射投与を行って好中球減少症を誘導した。CPA注射の4時間後から続けて3日間、Am80またはG−CSFまたはビヒクルを投与した。CPA注射の48〜60時間後、マウス好中球減少症が誘導された。3日目に実験を行った。3日目に安楽死対照マウスから末梢血(PB)を集め、Ficoll−paque(1.084)を使用してPB好中球を精製した。顆粒球の形態学分析(図7B)により分かるように、好中球の大部分をFicoll−paqueの下位層で特定した。3日目の異なる用量のAm80またはG−CSFで処理された好中球減少症マウス由来の白血球(WBC)および好中球回復の分析を図7Cに示す。5mg/kgのAm80は、Ficoll−paqueの下位層中に、250μgのG−CSFに比べて競合的な好中球回復を示した。
実施例4
好中球減少症マウスでAm80により動員された好中球は、G−CSFの場合より大きな殺菌力を示す
本発明者らは、CPA注射後3日目に、対照マウスに比べて、全実験マウスでWBCおよび好中球の両方の極度の減少が生じたことに気付いた(図8A)。その後5日目に、急いで2日続けてG−CSFまたはAm80またはビヒクルの注射を行い、Am80に比べて、G−CSFにより極めて加速度的な好中球回復が誘導される一方、ビヒクル群の好中球数も同様に、ほぼ対照値に戻った(図8A〜B)。GIN試料で示されるように、これらの好中球を異なる群のマウスのPB(全体中の20マウス)から精製し、黄色ブドウ球菌感染に対するインビトロ殺菌活性の解析用に使用した。本発明者らは、ビヒクルで処理されたC−MPBNから単離された好中球よりも、MPBN、AIN、またはGINによって細胞外細菌が大きく除去され、また、AINは、細菌除去に関しGINおよびC−MPBNの両方よりより極めて効果的であることを見出した(図8C)。MPBNと同様に、AINは、GINまたはC−MPBNより有意に多くの細菌を食菌し、死滅させた。加速度的好中球回復は、7日目に終わったので(図8D)、本発明者らは、9日目に異なるマウスのPB由来の好中球を精製して(図8E)加速度的好中球回復の停止後のそれらの殺菌活性を比較した。結果は、MPBNおよびAINの両方がまだC−MPBNより有意に高い殺菌力を示し、一方、GINとC−MPBNとの間で食作用または殺菌における差が認められないことを示した(図8F)。これらの知見は、好中球回復の初期段階で、G−CSFがAm80より顕著に多くの好中球を誘導できる場合であっても、MPBNと同様に、好中球減少症マウス中でAm80に動員された好中球は、黄色ブドウ球菌感染に対し、G−CSFより有意に高い有効性を示すことを実証する。さらに、C−MPBN数は、好中球回復の後期に対照値より有意に高いレベルに達するが、C−MPBNの殺菌活性は、MPBNまたはAINより有意に低いままである。
文献31、32に記載のように、単回用量のCPAにより誘導された好中球減少症マウスモデルを使用して、本発明者らは、Am80によりインビボで動員された好中球が実際に、G−CSFに比べて、細菌感染に対しエクスビボモデルで観察されたのと同じ大きな好中球免疫を有するかどうかを試験した。(図8A〜F)。インビボ実験用として、20匹のC57BL6/Jマウスを無作為に4群に分けた。0日目に200mg/Kgの量のCPAを投与した。250μg/KgのG−CSF、または5mg/KgのAm80を0、1および2日目に投与した。3×10黄色ブドウ球菌の腹腔内接種の16時間後の対数増殖相で、腹腔中(図8G−i)およびPB中(図8G−ii)の生存細胞外細菌の数を測定することにより、精製好中球の殺菌活性を解析した。3mlのPBS洗浄腹水、ならびに推定1.5mlの全血漿を使用して生菌の数を計数した。腹腔中生菌のP値:Am80対G−CSF、P<2.4E−8;対照対G−CSF、P<4.7E−9;ビヒクル対G−CSF、P<8.3E−3;Am80対ビヒクル、P<3.1E−9;Am80対対照、P<0.038。図8A−iiiは、図8G−iおよび8G−iiからの合計生存細胞外細菌を示す。Am80対G−CSF、P<1.9E−6;対照対G−CSF、P<9.4E−9;ビヒクル対G−CSF、P<6.5E−4;Am80対ビヒクル、P<6.8E−7;対照対Am80、P<3.8E−5。図8G−ivは、図8G−iiiからの生菌の倍数変化を示す。対照群中の生菌を1倍の規準として使用した。
文献31、32に記載のように、単回用量のCPAにより誘導された好中球減少症マウスモデルを使用して、本発明者らは、Am80によりインビボで動員された好中球が、実際に、G−CSFに比べて、細菌感染に対し、インビボモデル(図8A)で観察されたのとおなじ強力な好中球免疫を有するかどうかを試験した。本発明者らは、CPA注射後3日目に、対照マウスに比べて、全実験マウスでWBCおよび好中球の両方の極度の減少が生じたことに気付いた(図8B)。その後5日目に、急いで2日続けてG−CSFまたはAm80またはビヒクルの注射を行い、Am80に比べて、G−CSFにより極めて加速度的な好中球回復が誘導され、一方、ビヒクル群の好中球数も同様に、ほぼ対照値に戻った(図8B〜C)。GIN試料で示されるように、これらの好中球を異なるマウスのPBから精製し、黄色ブドウ球菌感染に対するインビトロ殺菌活性の解析用に使用した。本発明者らは、ビヒクルで処理されたC−MPBNから単離された好中球よりも、MPBN、AIN、またはGINによって細胞外細菌が大きく除去され、また、AINは、細菌除去に関しGINおよびC−MPBNの両方よりより極めて効果的であることを見出した(図8D)。MPBNと同様に、AINは、GINまたはC−MPBNより有意に多くの細菌を食菌し、死滅させた。加速度的好中球回復は、7日目に終わったので(図8E)、本発明者らは、9日目に異なるマウスのPB由来の好中球を精製して(図8F)加速度的好中球回復の停止後のそれらの殺菌活性を比較した。結果は、MPBNおよびAINの両方がまだC−MPBNより有意に高い殺菌力を示し、一方、GINとC−MPBNとの間で食作用または殺菌における差が認められないことを示した(図8G)。これらの知見は、好中球回復の初期段階で、G−CSFがAm80より顕著に多くの好中球を誘導できる場合であっても、MPBNと同様に、好中球減少症マウス中でAm80に動員された好中球は、黄色ブドウ球菌感染に対し、G−CSFより有意に高い有効性を示すことを実証する。さらに、C−MPBN数は、好中球回復の後期に対照値より有意に高いレベルに達するが、C−MPBNの殺菌活性は、MPBNまたはAINより有意に低いままである。
本明細書の調査は、CD34+細胞のAm80処理によりエクスビボおよびインビボ生成された好中球は、より大きな分化成熟度を示すのみならず、細菌感染に対しG−CSFより高い有効性も有することを示している。これは、CD66のCD18との機能的相互作用を連携して働かせて顆粒球生成から生ずる好中球生来の免疫の発生を強化することによると思われる。さらにこのような調節機構の特定により、レチノイド媒介顆粒球生成および好中球分化に対する新しい洞察が得られるであろう。これは、さらには、好中球減少症に対する効果的な治療を開発するための、ならびに、好中球減少症の持続期間を減らすための、対費用効果の高い治療分子としてAm80を利用した輸血治療用のエクスビボ生成顆粒球のための説得力のある分子学的基礎を与えるであろう。
参考文献
Figure 0006295249
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上述の種々の方法および技術は、本願を実施する多くの方法を提供する。むろん、記載した全ての目的または利点が必ずしも本明細書記載のいずれかの特定の実施形態により達成できるわけではないことは理解されたい。従って、例えば、当業者であれば、方法により、本明細書で教示された、または示唆された他の目的または利点を達成することを必ずしも必要とせずに、本明細書で教示の1つの利点または一群の利点を達成または最適化するように行うことができることが理解するであろう。種々の選択肢が本明細書で述べられている。いくつかの好ましい実施形態では、特に、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴が含まれる一方で、他の実施形態では、特に、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴が除外され、また一方で、他の実施形態では、ある特徴、別の特徴、またはいくつかの特徴を包含することにより特定の特徴が弱められていることを理解されたい。
さらに、当業者であれば、異なる実施形態からの種々の特徴の適用性についても理解できるであろう。同様に、上記で考察した種々の要素、特徴、およびステップ、ならびに、それぞれのこのような要素、特徴またはステップに対する他の既知の均等物の種々の組み合わせが当業者により採用され、本明細書記載の原理に基づく方法が実行できる。様々な実施形態においては、種々の要素、特徴、およびステップの内で、いくつかが特に包含され、また、他のものが特に除外されることがあるであろう。
本願が特定の実施形態および実施例に照らして開示されてきたが、当業者であれば、本願の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて他の代替実施形態および/または用途、ならびにその変形物および均等物に展開できることを理解するであろう。
一部の実施形態では、本願の特定の実施形態の記載に関連して(特に、特定の次の請求項に関連して)使用される用語の「a」および「an」および「the」ならびに類似の言及は、単数形および複数形の両方を包含すると解釈できる。本明細書における値の記載の範囲は、その範囲内に入るそれぞれ別々の値を個別に参照する省略表現法として機能することを意図しているに過ぎない。本明細書で特に指示がない限り、それぞれの個別値は、あたかもそれが個別に本明細書中に記述されているかのように明細書中に組み込まれる。本明細書で特に指示がない限り、または別の理由で文脈と明確に矛楯することがない限り、全ての本明細書記載の方法は、任意の適切な順番で実行できる。本明細書の特定の実施形態に関連して用いられるいずれかのおよび全ての例、または代表を意味する用語(例えば、「such as」)の使用は、本願をより良く解明する意図によるものに過ぎず、別に請求される本願の範囲に制限を課すものではない。明細書中のどの用語も、本願の実施に必須のいずれかの非請求要素を示すものと解釈されるべきではない。
本願の好ましい実施形態は、本明細書に記載されており、これには、本発明者らに既知の、本願を実行するための最良の形態が含まれる。これらの好ましい実施形態に対する変更は、前出の記載を読めば当業者には明らかになるであろう。当業者であれば、必要に応じてこのような変更を採用して、本明細書で具体的に記載の方法とは別の方法で本願を実施できることは考慮されている。従って、本願の多くの実施形態は、適用法で認められている本明細書に添付の請求項に記載の主題の全ての変形物および均等物を含む。さらに、本明細書で特に指示がない限り、または別の理由で文脈と明確に矛楯することがない限り、その全ての可能な変形における上述の要素のいずれかの組み合わせは、本願に包含される。
本明細書で参照された全ての特許、特許出願、特許出願公報、および、論文、本、仕様書、出版物、文書、種々資料などの他の資料は、上述の資料、本文書と一致しない、または矛盾する上述の資料のいずれか、または、本文書と関連する現時点のまたは以後の時点の請求項の最も広範な範囲に関して限定する作用をする可能性のある上述の資料のいずれかに関連するいずれかの審査履歴を除いて、その参照によりその全体が本願において本明細書に援用される。例えば、組み込まれた資料に関連するいずれかの説明、定義、および/または用語の使用と本文書に関連するそれらとの間に何らかの不一致または矛盾が存在する場合は、本文書中の説明、定義、および/または用語の使用が優先されるものとする。
最後に、本明細書で開示の出願の実施形態は、本願の実施形態の原理の例示となるものであることを理解されたい。採用可能な他の変形は、本願の範囲内に入る可能性がある。従って、例えば、限定するものではないが、本願の実施形態の別の構成を、本明細書の教示に従って利用可能である。従って、本願の実施形態は、図示および記載された通りの形態に正確に限定されるものではない。

Claims (10)

  1. タミバロテン(AM80)を含む、好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、または好中球減少症の予防の促進のための医薬組成物であって、それを必要とする哺乳類対象への投与用の医薬組成物であり、該好中球減少症が白血病に起因しない、医薬組成物。
  2. タミバロテン(AM80)を含む、癌化学療法によって誘発される好中球減少症を治療するための医薬組成物であって、それを必要とする哺乳類対象への投与用の医薬組成物であり、該癌化学療法が白血病の治療のために実施されたものではない、医薬組成物
  3. 化学療法剤と組み合わせて使用される、請求項2に記載の医薬組成物。
  4. 前記化学療法剤とタミバロテン(AM80)を含む前記組成物の投与が、同時または逐次的である、請求項3に記載の医薬組成物。
  5. タミバロテン(AM80)の投与が、経静脈、筋肉内、腹腔内、経口または吸入経由の投与である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  6. タミバロテン(AM80)の有効量が、約0.01〜0.05mg/kg/日、0.05〜0.1mg/kg/日、0.1〜0.5mg/kg/日、0.5〜1mg/kg/日、0.5〜5mg/kg/日、1〜5mg/kg/日、または5〜10mg/kg/日である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  7. 前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  8. タミバロテン(AM80)の投与対象において殺菌活性を有する好中球を誘導する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  9. 好中球減少症が先天性好中球減少症である、または好中球減少症が急性細菌感染症もしくは化学療法に起因する、請求項1および5〜のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  10. 好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、好中球減少症の予防の促進、または癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療のための医薬キットであって、該好中球減少症が白血病に起因せず、該癌化学療法が白血病の治療のために実施されたものではなく、かつ該キットが
    (i)請求項1〜のいずれかに記載の医薬組成物と、
    (ii)好中球減少症の治療、好中球減少症の抑制、好中球減少症の重症度の軽減、好中球減少症の予防の促進、または癌化学療法によって誘発される好中球減少症の治療を必要とする哺乳類対象に、治療有効量の前記組成物を投与するための使用説明書と
    を含む、医薬キット。
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