MX2014014930A - Metodos para el tratamiento de neutropenia mediante agonistas retinoides. - Google Patents

Metodos para el tratamiento de neutropenia mediante agonistas retinoides.

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Abstract

La invención provee métodos para el tratamiento de la neutropenia en un sujeto que lo necesita que comprende la administración de una composición que comprende un agonista de retinoide y la administracion de una cantidad eficaz de la composición al sujeto para tratar la neutropenia, para así tratar la neutropenia en el sujeto que lo necesita.

Description

i MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE NEUTROPENIA MEDIANTE AGONISTAS RETINOIDES DERECHOS GUBERNAMENTALES La presente invención se realizó con apoyo gubernamental conforme a los números de concesión CA111440, CA120512 y CA120512-02S1 otorgados por los Institutos Nacionales de la Salud. El gobierno tiene determinados derechos con respecto a la invención.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención hace referencia a métodos para tratar, inhibir, reducir y/o promover la prevención de la neutropenia en un individuo que lo necesite, lo cual comprende la administración de un agonista retinoide, por ejemplo, tamibaroteno.
ANTECEDENTES Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan mediante esta referencia en su totalidad en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente como incorporada mediante esta referencia. La siguiente descripción incluye información que puede ser útil en la comprensión de la presente invención. No se reconoce que la información proporcionada en la presente es téenica previa o pertinente a la invención actualmente reivindicada o que cualquier publicación a la que se hace referencia específica o implícitamente es téenica previa.
Los neutrófilos, los granulocitos más comunes, constituyen hasta un 70 % de leucocitos en sangre que principalmente defienden contra infecciones de patógenos. La neutropenia inducida por quimioterapia de cáncer es un trastorno hematológico marcado por grandes disminuciones en la cantidad de neutrófilos en el flujo sanguíneo. Han transcurrido más de dos décadas desde que se utilizó G-CSF por primera vez para tratar neutropenia adquirida y congénita1'2 mediante la promoción de granulopoyesis de HSC. Debido al bajo índice terapéutico de G-CSF, sus efectos de administración adversos y el riesgo de transformación maligna,2 la neutropenia inducida por quimioterapia continúa siendo la principal fuente de morbilidad, mortalidad y gastos de salud en la oncología.3,4 Estudios recientes muestran que a diferencia de PBN, la destrucción bacteriana obstaculizada en neutrófilos inducida por G-CSF de células CD34+ está asociada a la falta de gránulos maduros, debido a granulopoyesis anormal al inicio del proceso de diferenciación.5 Por lo tanto, el éxito en idear terapias más eficaces para la neutropenia puede depender de la determinación de cómo se coordina la granulopoyesis con el desarrollo de la inmunidad basada en neutrófilos.
El agonista retinoide Am8068 se diseña para mejorar los efectos secundarios del ácido retinoico (RA) completamente trans a través de su unión selectiva con el receptor alfa de ácido retinoico (RARa),6,9,10 un factor de transcripción activado por RA11,12 para regular la diferenciación granulocítica tanto de mieloblastos como HSC.13-17 El RA, una forma de origen natural de la vitamina A, cumple funciones claves en el desarrollo del plano corporal e induce la diferenciación de muchos tipos de células normales y malignas.1820 A la fecha, el tratamiento con RA de leucemia promielocítica aguda (APL) representa el mejor ejemplo de una terapia exitosa de diferenciación-inducción en la oncología clínica,21 sin embargo, los efectos secundarios asociados a la terapia con RA son generalmente graves y la resistencia a RA es un hecho común.2224 Varios estudios han demostrado que RARa regula la diferenciación granulocítica inducida por Am-80.25-27 Además, Am80 es aproximadamente 10 veces más eficaz, con menor toxicidad, que ya sea RA u otros retinoides utilizados como terapia de diferenciación en pacientes con APL.7,8,28 Actualmente, se ha aprobado Am80 para el tratamiento de APL en Japón7,8 y se evaluó clínicamente para determinar la existencia de otros varios cánceres/enfermedades en Estados Unidos y Europa (http://www.cytrx.com/tamibarotene.html; http://clinicaltrials.gov). Los avances en el uso de Am80 para inducir la diferenciación granulocítica nos llevaron a evaluar este agente como medio para mejorar la actividad bactericida de los neutrófilos que surgen de la granulopoyesis durante el desarrollo inmune. En la presente se informa que Am80 posee una actividad significativamente mayor que G-CSF como inductor del desarrollo inmune y la diferenciación de neutrófilos, posiblemente a través de su promoción de granulopoyesis derivada de HSC mediante la mediación de los efectos diferenciales de CD66 en la activación de CD18.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención provee métodos para tratar, inhibir y/o reducir la gravedad de la neutropenia, infección bacteriana aguda, neutropenia inducida por quimioterapia del cáncer y/o varias formas de neutropenia congénita en sujetos que lo necesitan. Los métodos incluyen proveer una composición que incluye un agonista retinoide y administrar una cantidad eficaz de la composición al sujeto con el fin de tratar, inhibir y/o reducir la gravedad de la neutropenia en el sujeto. Los métodos comprenden además la administración de agentes terapéuticos adicionales en forma simultánea o secuencial con las composiciones de la invención con el fin de tratar, inhibir y/o reducir la gravedad de neutropenia, la infección bacteriana aguda, la neutropenia inducida por quimioterapia del cáncer y/o varias formas de neutropenia congénita en los sujetos. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos.
La invención también provee composiciones farmacéuticas y kits para tratar, inhibir y/o reducir la gravedad de la neutropenia, infección bacteriana aguda, neutropenia inducida por quimioterapia del cáncer y/o varias formas de neutropenia congénita en sujetos que lo necesitan. Las composiciones farmacéuticas y los kits incluyen cantidades de agonistas retinoides. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las modalidades de ejemplo se ilustran en las figuras de referencia. Se pretende que las modalidades y las figuras descritas en la presente sean consideradas a modo ilustrativo en vez de taxativo.
La Figura 1A-1D ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, que Am80 promueve la diferenciación de neutrófilos más eficazmente que G-CSF al tiempo que exhibe una toxicidad similarmente baja. (fig.lA) Mejor inducción granulocítica asociada con inducción monocítica menor en celulas CD34+ tratadas con G-CSF durante 6 contra 9 o 12 días. (fig.lB y 1C) Concentración reducida de Am80 (2,5 nM) conduce a una inducción más eficaz de la diferenciación granulocítica que la lograda con G-CSF (fig.lB), al tiempo que exhibe menor citotoxicidad (fig.lC). (fig.lD) Comparación global de Am80 y G-CSF en condiciones que se consideraron óptimas para la diferenciación granulocítica.
La Figura 2A-2C ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, que los neutrófilos inducidos por Am80 (AIN) producen y secretan gránulos más eficazmente que los neutrófilos inducidos por G-CSF (GIN). (fig.2A) Secreción eficaz de lactoferrina por AIN contra GIN tras estímulo de E. coli . (fig.2B) Mayor producción y degranulación de LL-37 por AIN contra GIN. (fig.2C) Abundancia incrementada de MMP9 intracelular tras estímulo de E. coli, pero degranulación insuficiente tanto en GIN como en AIN.
La Figura 3A-3C ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, que tanto AIN no separado como AIN separado con el anticuerpo anti-CD15 exhibe una capacidad mayor de depuración de bacterias que los GIN separados y no separados. (fig.3A) muestra la cuantificación de monocitos (GIN). (fig.3B) muestra la cuantificación de neutrófilos GIN contra AIN no segmentados/segmentados. (fig.3C y 3D) es una comparación del efecto de GIN y AIN separados o no separados en la depuración de bacterias intracelulares. Se determinó la eficacia de la depuración a partir de la cantidad de bacterias viables recuperadas del compartimiento intracelular después de la infección.
La Figura 4A-4E ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, que AIN presenta actividades fagocxticas y bactericidas significativamente más elevadas que GIN. (fig.4A-4D) Actividades fagocíticas y bactericidas según las determinó la cantidad de bacteria extracelular (fig.4A), bacteria fagocitada (fig.4B), bacteria intracelular recuperada (fig.4C) y bacteria destruida (fig.4D). Hubo un aumento de 1,26 + 0,01 veces en las cantidades bacterianas tras los 45 minutos del experimento . *: GIN contra AIN, P<0,03 al menos. (fig.4eE) Cuantificación tanto de bacterias extracelulares después de la infección como de bacterias destruidas in si tu en GIN, AIN y neutrófilos de sangre periférica humana (PBN). *: GIN contra AIN o PBN, P<0,003 al menos.
La Figura 5 ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, las estructuras de ATRA (RA) y agonistas retinoides Am80, CH55, and IT-YA01115 (IT-YA) recientemente sintéticos.
La Figura 6A-6D ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, que Am80 induce la diferenciación morfológica granulocítica de células CD34+ de manera más eficaz que G-CSF y otros compuestos retinoides. (fig.6A-6B) La eficacia de RA en la inducción de la diferenciación granulocítica mayor que G-CSF (fig.6A) se asoció a una muerte celular significativa (fig.6B). La eficacia menor en la inducción de la diferenciación de células CD34+ en granulocitos mediante G-CSF se asoció a una inducción monocítica mayor en el día 12 (fig.6A). (fig.6C-6D) Am80 (10 nM) presentó una eficacia similar en la inducción de la diferenciación granulocítica en comparación con RA y CH55 (fig.6A, 6C), al tiempo que exhibía menos inducción monocítica que G-CSF o IT-YA o CH55 (fig.6A, 6C) y una tasa menor de muerte celular que RA y CH55 (fig.6B, 6D).
La Figura 7A-7C ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, que AM80 induce una recuperación de neutrófilos competitiva en ratones neutropénicos en comparación con aquellos tratados con G-CSF. (fig.7A) Ilustración del diseño experimental para el análisis de la recuperación de neutrófilos evaluada en el día 3 posterior a la administración de CPA con diferentes dosis de Am80 y G-CSF. (fig.7B) Se tomaron muestras de sangre periférica (PB) de ratones de control sometidos a eutanasia en el día 3 y los neutrófilos de PB se purificaron mediante Ficoll-paque (1,084). (fig.7C) Análisis de recuperación de neutrófilos y leucocitos (WBC) de ratones neutropénicos tratados con diferentes dosis de Am80 o G-CSF en el día 3. La Figura 8A-8G ilustra, de conformidad con varias modalidades de la presente invención, que los neutrófilos desplazados por Am80 en ratones neutropénicos exhiben mayor actividad bactericida que aquellos de G-CSF. (FIG.8A) G-CSF indujo una recuperación de neutrófilos notablemente acelerada en comparación con ratones tratados con Am80 o un vehículo en el día 5. (FIG.8B) Análisis de neutrófilos de PB en el día 5. *G-CSF contra Am80, P < 1,2 x 106; G-CSF contra control, P < 4,0 x 10 5; G-CSF contra vehículo, P < 8,2 x 108; Am80 contra vehículo, P < 1,3 x 10~6; Am80 contra control, P < 0,016. (FIG.8C) Las actividades fagocitóticas y bactericidas de los neutrófilos, aislados de la PB de ratones diferentes, fueron reflejadas por la cantidad de bacterias extracelulares, bacterias fagocitadas y bacterias destruidas tras la exposición de los neutrófilos aislados a S. aureus in vi tro. *Extracelular: AIN contra GIN, P < 0,043; AIN contra C-MPBN, P < 1,1 x 10~4; MPBN contra C-MPBN, P < 3,7 X 104; GIN contra C-MPBN, P < 0,049. *Fagocitosis: AIN contra GIN, P < 0,026; AIN contra C-MPBN, P < 0,02; MPBN contra GIN, P < 0,042; MPBN contra C-MPBN, P < 0,003; GIN contra C-MPBN, P < 0,009. *Destrucción: AIN contra GIN, P < 0,026; AIN contra C-MPBN, P < 0,005; MPBN contra GIN, P < 0,015; MPBN contra C-MPBN, P < 0,003; GIN contra C-MPBN, P < 0,009. (FIG.8D) Las recuperaciones aceleradas de WBC y los neutrófilos se suspendieron en el día 7 después de 96 horas de estímulo con G-CSF o Am80 o un vehículo. (FIG.8E) Análisis de neutrófilos de PB en el día 9. *G-CSF contra control, P < 0,005; Am80 contra control, P <3,9 x 104; Am80 contra vehículo, P < 0,03; vehículo contra control, P < 0,03. (FIG.8F) AIN presentó actividades fagocitóticas y bactericidas mayores que GIN en el día 9, 48 horas después de la suspensión de la recuperación acelerada de neutrófilos. *Extracelular: AIN contra GIN, P < 0,02; AIN contra C-MPBN, P < 0,007; MPBN contra GIN, P < 0,04; MPBN contra C-MPBN, P < 0,02. *Fagocitosis: AIN contra C-MPBN, P < 0,034; MPBN contra C- PBN, P < 0,043. *DestruccÍÓn: AIN contra C-MPBN, P < 0,034; MPBN contra C-MPBN, P < 0,043. (fig.8G) Los datos in vivo muestran que en ratones neutropénicos, Am80 induce suficientes neutrófilos eficaces que exhiben mayor actividad bactericida que aquellos por G-CSF. Para los experimentos se dividieron aleatoriamente en 4 grupos 20 ratones C57BL6/J. En el día 0 se administró una única dosis de inyección intraperitoneal de ciclofosfamida (CPA) de 200 mg/kg. Se administró Am80 o G-CSF o un vehículo después de 4 horas de la inyección de CPA durante 3 días consecutivos. La neutropenia de ratón se indujo 48-60 horas después de la inyección de CPA. En el día 3, después de 16 horas de inyección intraperitoneal de 3 x 107 S. aureus, se llevó a cabo el experimento. Los neutrófilos purificados fueron analizados por sus actividades bactericidas mediante la determinación de la cantidad de bacteria extracelular viable en la cavidad peritoneal (fig.8G panel i) y PB (fig.8G panel ii). La cantidad de bacterias viables se contó a partir de 3 mi de líquido peritoneal lavado con PBS así como con un estimado de 1,5 mi del total de plasma en sangre. Valor P de bacterias viables en la cavidad peritoneal: Am80 contra G-CSF, P < 2,4 x 10~8; control contra G-CSF, P < 4,7 x 109; vehículo contra G-CSF, P < 8,3 x 10~3; Am80 contra vehículo, P < 3,1 x 109; Am80 contra control, P < 0,038. *Total de bacteria extracelular viable de la fig.8G panel iii: Am80 contra G-CSF, P < 1,9 x 106; control contra G-CSF, P < 9,4 x 109; vehículo contra G-CSF, P < 6,5 x 104; Am80 contra vehículo, P < 6,8 x 10~7; control contra Am80, P < 3,8xl05. En la fig.8G panel iv se mostraron los cambios en veces de la bacteria viable. Se utilizó la bacteria viable en el grupo de control como estándar de 1 vez.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las referencias mencionadas en la presente se incorporan mediante esta referencia en su totalidad como si se establecieran por completo. A menos que se indique de otro modo, los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton et ál . , Dictionary of Microblology and Molecular Biology 3‘ ed. , J. Wilcy & Sons (Nueva York, NY 2001), marzo, Advanced Organic Che istry Reactions, Mechanisms and Structure 5a ed. , J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001) y Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3 a ed. , Coid Spring Harbor Laboratory Press (Coid Spring Harbor, NY 2001) proveen pautas generales para el experto en la téenica sobre muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.
Un experto en la técnica podrá reconocer muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, que se podrían utilizar en la práctica de la presente invención. En efecto, la presente invención no se encuentra de ninguna manera limitada por los métodos y materiales descritos. A efectos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.
«Resultados beneficiosos» puede incluir, de modo no taxativo, disminuir o aliviar la gravedad de la enfermedad, evitar que la enfermedad empeore, curar la enfermedad, evitar que la enfermedad se desarrolle, disminuir las probabilidades de que el paciente presente la enfermedad y extender la vida o la expectativa de vida del paciente.
«Mamífero», tal como se usa en la presente hace referencia a cualquier miembro de la clase Mammalia que incluye, de modo no taxativo, humanos y primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas y conejillos de india, y similares. El termino no indica edad o sexo específico. Por lo tanto, se pretende abarcar en el alcance de este término a los sujetos adultos y recién nacidos, así como también fetos, ya sean de sexo masculino o femenino.
«Neutropenia» tal como se usa en la presente hace referencia a niveles inusualmente bajos de neutrófilos en la sangre. La neutropenia puede deberse a la disminución de la producción de leucocitos (por ejemplo, incluso de modo no taxativo, debido a agentes terapéuticos que afectan la médula ósea, trastornos hereditarios/congénitos que afectan la médula ósea, anemia aplásica, cáncer, terapia de radiación, deficiencia de vitamina Bc2, folato o cobre, y/o exposición a pesticidas). La neutropenia también puede deberse a la destrucción de leucocitos (por ejemplo, de modo no taxativo, debido a infecciones bacterianas graves, determinadas enfermedades autoinmunitarias, tratamientos de quimioterapia y/o agentes terapéuticos). La neutropenia también puede deberse al secuestro y/o migración de leucocitos (por ejemplo, de modo no taxativo, debido a hemodiálisis, malaria y/o infecciones bacterianas). Determinados medicamentos tales como flecainida, fenitoína, indometacina, propiltiouracilo, carbimazol, clorpromazina, trimetoprima/sulfametoxazol (cotrimoxazol), clozapina, ticlopidina también pueden dar como resultado la neutropenia. Se pueden utilizar los métodos y las composiciones de la invención para tratar, inhibir, reducir la gravedad y/o promover la prevención de la neutropenia que resulta de cualquiera de las causas anteriores. Los métodos y las composiciones de la invención también se pueden utilizar para tratar, inhibir, reducir la gravedad y/o promover la prevención de estados de la enfermedad que resultan de cualquiera de las causas de neutropenia anteriores mediante el tratamiento, la inhibición, la reducción de los síntomas y/o la promoción de la prevención de la neutropenia.
«Tratamiento» y «tratar» tal como se usan en la presente hacen referencia tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en los que el fin es prevenir o enlentecer (disminuir) la afección patológica objetivo, prevenir la afección patológica, buscar u obtener resultados ventajosos o disminuir las probabilidades de que el individuo desarrolle la afección, incluso si en última instancia el tratamiento no es exitoso. Los sujetos que necesitan el tratamiento incluyen quienes ya padecen la afección así como aquellos propensos a padecer la afección o aquellos en los que ha de prevenirse la afección.
«Cantidad terapéuticamente eficaz», tal como se usa en la presente, hace referencia a aquella cantidad capaz de conseguir resultados ventajosos en un mamífero con neutropenia. Una cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar individualmente y, al menos en parte, tendrá en cuenta las características fisiológicas del mamífero, el tipo de sistema de administración o téenica terapéutica empleados y el momento de administración con relación al avance de la enfermedad.
A pesar de los avances en el uso terapéutico del factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante (G-CSF) para promover la granulopoyesis de hemocitoblastos (HSC), la neutropenia persiste como una de las complicaciones más graves de la quimioterapia del cáncer. Se descubrió, mediante el uso de un modelo ex vivo para inducir la diferenciación granulocítica de células hematopoyéticas CD34+ primitivas, que Am80 (tamibaroteno), un agonista retinoide novedoso, es más potente que G-CSF en la coordinación de la diferenciación de neutrófilos y el desarrollo de la inmunidad. El análisis funcional y la imaginología de la producción de gránulos, la infección de E. coli y la destrucción bacteriana in si tu demostraron que, de manera similar a los neutrófilos de sangre periférica humana (PBN), los neutrófilos inducidos por Am80 (AIN) presentaron mayor actividad bactericida que los neutrófilos inducidos por G-CSF (GIN). A diferencia de GIN, pero de manera similar que PBN, la destrucción bacteriana mejorada de AIN se asoció a una mayor coexpresión del antígeno CD66 con la subunidad CD18 de la integrina b2. De forma consistente, el anticuerpo anti-CD18 neutralizó las actividades bactericidas inducidas por Am80 de AIN. Por lo tanto, AIN parece ofrecer un medio más eficaz de promoción de la diferenciación de neutrófilos y actividades bactericidas en comparación con G-CSF, probablemente a través de la coordinación de la interacción funcional de CD66 con CD18 para mejorar el desarrollo de la inmunidad de los neutrófilos durante la granulopoyesis. Tales hallazgos contenidos en el presente documento proveen una lógica molecular para idear un tratamiento novedoso contra la neutropenia mediante el uso de Am80 como una opción de tratamiento rentable.
Por consiguiente, la invención provee métodos para el tratamiento de neutropenia en mamíferos que lo necesitan. El método comprende proveer una composición que comprende un agonista retinoide y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto con el fin de tratar la neutropenia en el sujeto. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
Además, la invención provee métodos para reducir la gravedad de la neutropenia en mamíferos que lo necesitan. El método comprende proveer una composición que comprende un agonista retinoide y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto con el fin de reducir la gravedad de la neutropenia en el sujeto. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
La invención también provee métodos para la inhibición de la neutropenia en mamíferos que lo necesiten. El método comprende proveer una composición que comprende un agonista retinoide y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto con el fin de inhibir la neutropenia en el sujeto. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
De manera adicional, la invención provee métodos para promover la prevención de la neutropenia en mamíferos que lo necesitan. El método comprende proveer una composición que comprende un agonista retinoide y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto con el fin de promover la prevención de la neutropenia en el sujeto. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
Además, la invención provee un método para el tratamiento, la inhibición y/o la reducción de la gravedad de la neutropenia inducida por la quimioterapia del cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende proveer una composición que comprende un agonista retinoide y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto con el fin de tratar, inhibir y/o reducir la gravedad de la neutropenia inducida por la quimioterapia del cáncer. Además, el método comprende la administración de un agente quimioterapéutico. En una modalidad, el agente quimioterapéutico y la composición que comprenden un agonista retinoide son administrados en forma conjunta. En otra modalidad, el agente quimioterapéutico y la composición que comprenden un agonista retinoide son administrados en forma secuencial. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, de modo no taxativo, Actinomicina, Alitretinoina, ácido retinoico completamente trans, Azacitidina, Azatioprina, Bevacizumab, Bexaroteno, Bleomicina, Bortezomib, Carboplatino, Capecitabina, Cetuximab, Cisplatino, Clorambucilo, Ciclofosfamida, Citarabina, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Epotilona, Erlotinib, Etopósido, Fluorouracilo, Gefitinib, Gemcitabina, Hidroxiurea, Idarrubicina, Imatinib, Ipilimumab, Irinotecán, Mecloretamina, Melfalán, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Ocrelizumab, Ofatumumab, Oxaliplatino, Paclitaxel, Panitumab, Pemetrexed, Rituximab, Taflupósido, Tenipósido, Tioguanina, Topotecán, Tretinoína, Valrubicina, Vemurafenib, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, Vorinostat, Romidepsina, 5-fluorouracil (5-FU), 6-mercaptopurina (6-MP), Cladribina, Clofarabina, Floxuridina, Fludarabina, Pentostatina, Mitomicina, ixabepilona, Estramustina, prednisona, metilprednisolona, dexametasona o una combinación de estos.
La invención también provee un método para tratar, inhibir, reducir la gravedad y/o promover la prevención de una infección bacteriana grave en un sujeto que lo necesita. El método comprende la provisión de una composición que comprende un agonista retinoide, la provisión de una composición que comprende un agente terapéutico antibacteriano y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cada una de las composiciones al sujeto para tratar, inhibir, reducir la gravedad y/o promover la prevención de una infección bacteriana aguda en el sujeto. En una modalidad, la composición que comprende el agonista retinoide y la composición que comprende el agente terapéutico antibacteriano se administran en forma conjunta. En otra modalidad, la composición que comprende el agonista retinoide y la composición que comprende el agente terapéutico antibacteriano se administran en forma secuencial. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
Además, la invención provee métodos para el tratamiento, la inhibición, la reducción de la gravedad de la neutropenia congénita y/o la promoción de su prevención (que incluye, de modo no taxativo, el síndrome de Kostmann, la neutropenia cíclica o el síndrome de Chediak Higashi) en un mamífero que lo necesita. El método comprende proveer una composición que comprende un agonista retinoide y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto con el fin de tratar, inhibir, reducir la gravedad de la neutropenia congénita en el sujeto y/o promover su prevención. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
En algunas modalidades, los sujetos mamíferos que necesitan las composiciones que se describen en la presente son pacientes con una producción disminuida de leucocitos que resulta, inclusive, pero de modo no taxativo, de medicación que afecta la médula ósea (tal como fármacos para el cáncer, fármacos antipsicóticos , fármacos anticonvulsivos), trastornos hereditarios y/o congénitos que afectan la médula ósea, pacientes que se someten a terapia de radiación, con deficiencia de vitamina B12 con deficiencia de ácido fólico o una combinación de estos.
En modalidades adicionales, los sujetos mamíferos que necesitan las composiciones que se describen en la presente son sujetos con cantidades de leucocitos dañados, destruidos y/o reducidos, debido a, inclusive pero de modo no taxativo, infecciones bacterianas agudas, trastornos autoinmuntarios (tales como lupus eritematoso sistémico), al uso de medicamentos sulfonamidas o una combinación de estos.
En modalidades adicionales, los sujetos mamíferos que necesitan las composiciones que se describen en la presente son sujetos que experimentan el secuestro y/o la migración de leucocitos (tal como neutrófilos) debido a, inclusive pero de modo no taxativo, hemodiálisis, malaria, infecciones bacterianas o una combinación de estos.
En varias modalidades, la composición de la invención que comprende un agonista retinoide se puede administrar en forma conjunta o secuencial con otros agentes terapéuticos que incluyen, de modo no taxativo, agentes quimioterapéuticos y/o terapia de radiación. Usualmente, los agentes quimioterapéuticos y/o la terapia de radiación reducen la cantidad de leucocitos, lo cual tiene como resultado la neutropenia. La administración de la composición de la invención en forma conjunta o secuencial con los agentes quimioterapéuticos y/o la terapia de radiación puede inhibir y/o reducir la gravedad de la neutropenia. En varias modalidades, la composición de la invención que comprende un agonista retinoide se administra antes, durante o después de la administración de agentes quimioterapéuticos y/o de la terapia de radiación. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
De manera similar, la composición que comprende un agonista retinoide se puede administrar en forma conjunta o secuencial con fármacos anticonvulsivos y/o antipsicóticos con el fin de inhibir y/o reducir la gravedad de la neutropenia que resulta del uso de estos fármacos. En varias modalidades, la composición de la invención que comprende un agonista retinoide se administra antes, durante o después de la administración de fármacos anticonvulsivos y/o antipsicóticos. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
De manera adicional, la composición que comprende un agonista retinoide se puede administrar en forma conjunta o secuencial con agentes terapéuticos utilizados para tratar infecciones bacterianas agudas, infecciones fúngicas y/o enfermedades autoinmunitarias con el fin de inhibir y/o reducir la gravedad de la neutropenia que puede ocurrir debido a infecciones bacterianas y fúngicas y/o enfermedades autoinmunitarias y/o debido a los agentes terapéuticos que pueden ser utilizados para tratar una infección bacteriana, una infección fúngica y/o enfermedades autoinmunitarias. En varias modalidades, la composición de la invención que comprende un agonista retinoide se administra antes, durante o después de la administración de agentes terapéuticos utilizados para tratar infecciones bacterianas agudas, infecciones fúngicas y/o enfermedades autoinmunitarias. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este.
En varias modalidades, el agonista retinoide se administra de forma intravenosa, intramuscular, intraperi oneal, por vía oral o mediante inhalación. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno.
En varias modalidades, la cantidad eficaz del agonista retinoide es una cualquiera o más de alrededor de 0,01 a 0,05 mg/kg/día, 0,05-0,1 pg/kg/día, 0,1 a 0,5 pg/kg/día, 0,5 a 5 pg/kg/día, 5 a 10 pg/kg/día, 10 a 20 pg/kg/día, 20 a 50 pg/kg/día, 50 a 100 pg/kg/día, 100 a 150 pg/kg/día, 150 a 200 pg/kg/día, 200 a 250 pg/kg/día, 250 a 300 gp/kg/día, 300 a 350 pg/kg/día, 350 a 400 pg/kg/día, 400 a 500 pg/kg/día, 500 a 600 pg/kg/día, 600 a 700 pg/kg/día, 700 a 800 pg/kg/día, 800 a 900 pg/kg/día, 900 a 1000 pg/kg/día, 0,01 a 0,05 mg/kg/día, 0,05-0,1 mg/kg/día, 0,1 a 0,5 mg/kg/día, 0,5 a 1 mg/kg/día, 1 a 5 mg/kg/día, 5 a 10 mg/kg/día, 10 a 15 mg/kg/día, 15 a 20 mg/kg/día, 20 a 50 mg/kg/día, 50 a 100 mg/kg/día, 100 a 200 mg/kg/día, 200 a 300 mg/kg/día, 300 a 400 mg/kg/día, 400 a 500 mg/kg/día, 500 a 600 mg/kg/día, 600 a 700mg/kg/día, 700 a 800mg/kg/día, 800 a 900mg/kg/día, 900 a 1000 mg/kg/día o una combinación de estas. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80), un análogo y/o una sal de este. Las dosificaciones normales de una cantidad eficaz de un agonista retinoide pueden encontrarse en los intervalos recomendados por el fabricante en los que se utilizan los compuestos terapéuticos, y también según lo indicado por el experto en la téenica mediante las respuestas ín vitro o las respuestas en modelos de animales Normalmente, dichas dosificaciones se pueden reducir en hasta alrededor de un orden de magnitud de concentración o cantidad sin perder actividad biológica pertinente. La dosificación real puede depender del criterio del médico, el estado del paciente y la eficacia del método terapéutico basados, por ejemplo, en la capacidad de respuesta in vitro de cultivos celulares o muestras de tejido histocultivado pertinentes, tales como tumores malignos sometidos a biopsia o las respuestas observadas en los modelos animales adecuados. En varias modalidades, las composiciones de la invención que comprenden el agonista retinoide se pueden administrar una vez al día (SID/QD), dos veces al día (BID), tres veces al día (TID), cuatro veces al día (QID) o más, con el fin de administrar una cantidad eficaz del agonista retinoide al sujeto, en las que la cantidad eficaz es una cualquiera o más de las dosis que se describen en la presente.
La invención también provee métodos para identificar agonistas retinoides. El método incluye poner las células CD34+ en contacto con una molécula de interés, poner adicionalmente las células CD34+ y la molécula de interés en contacto con un antígeno para estimular una respuesta inmunitaria y evaluar si el contacto entre las células CD34+, la molécula de interés y el antígeno da como resultado un aumento de la secreción de lactoferrina, LL-37 o una combinación de estos. En una modalidad, el aumento de la secreción de lactoferrina, LL-37 o una combinación de estos indica que la molécula de interés es un agonista retinoide. Los ensayos que se pueden utilizar para identificar los compuestos que son agonistas retinoides incluyen de modo no taxativo, ensayo de micromatriz, PCR cuantitativa, ensayo de inmunotransferencia Northern, ensayo de inmunotransferencía Southern, ensayo de inmunotransferencia Western, ensayos de inmunohistoquímica, ensayos de unión, ensayos de retardo en gel o ensayos que utilizan sistemas de dos híbridos en levadura. Un experto en la téenica puede utilizar fácilmente numerosas técnicas conocidas en la técnica para determinar si una molécula de interés/un agente particular es un agonista retinoide.
En varias modalidades, el sujeto se selecciona del grupo que consiste en humanos, primates no humanos, monos, simios, perros, gatos, vacas, caballos, conejos, ratones y ratas.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS En varias modalidades, la presente invención provee composiciones farmacéuticas que incluyen un excipiente farmacéuticamente aceptable junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista retinoide, tal como tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de estos. «Excipiente farmacéuticamente aceptable» significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que en general es segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables tanto para uso veterinario como para uso farmacéutico humano. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición en aerosol, gaseosos.
En varias modalidades, las composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención se pueden formular para su administración a través de cualquier vía de administración. «Vía de administración» puede hacer referencia a cualquier pasaje de administración conocido en la téenica que incluye, de modo no taxativo, aerosol, vía nasal, oral, transmucosal, transdérmica, parenteral o enteral. «Parenteral» hace referencia a una vía de administración que generalmente se encuentra asociada a la inyección, que incluye intraorbital, infusión, intraarterial, intracapsular, intracardíaca, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intrauterina, intravenosa, subaraenoidea, subcapsular, subcutánea, transmucosal o transtraqueal. A través de la vía parenteral, las composiciones pueden encontrarse en forma de soluciones o suspensiones para infusión o para inyección, o como polvos liofilizados. A través de la vía parenteral, las composiciones pueden encontrarse en forma de soluciones o suspensiones para infusión o para inyección. A través de la vía enteral, las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en forma de comprimidos, cápsulas de gel, comprimidos recubiertos con azúcar, jarabes, suspensiones, soluciones, polvos, gránulos, emulsiones, microesferas o nanoesferas o vesículas de lípidos o vesículas de polímero que permiten la liberación controlada.
Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención también pueden contener cualquier portador farmacéuticamente aceptable. «Portador farmacéuticamente aceptable» tal como se utiliza en la presente hace referencia a un material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo que se encuentra implicado en llevar o transportar un compuesto de interés de un tejido, órgano o parte del cuerpo a otro tejido, órgano o parte del cuerpo. Por ejemplo, el portador puede ser un relleno, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante líquido o sólido, o una combinación de estos. Cada componente del portador debe ser «farmacéuticamente aceptable» en el sentido de que debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación. También debe ser adecuado para su uso en contacto con todo tejido u órgano con el que pueda entrar en contacto, es decir que no debe suponer un riesgo de toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad o cualquier otra complicación que supere en forma excesiva sus ventajas terapéuticas.
Las composiciones farmacéuticas conformes a la invención también se pueden encapsular, comprimir o preparar en una emulsión o jarabe para la administración oral. Los portadores farmacéuticamente aceptables sólidos o líquidos se pueden agregar para mejorar o estabilizar la composición o para facilitar la preparación de la composición. Los portadores líquidos incluyen jarabe, aceite de maní, aceite de oliva, glicerina, solución salina, alcoholes y agua. Los portadores sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio, dihidrato, terra alba, estearato de magnesio o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. El portador también puede incluir un material de liberación sostenida tal como gliceril monoestearato o gliceril diestearato, solo o con una cera.
Las preparaciones farmacéuticas se elaboran siguiendo téenicas convencionales de farmacia que implican molienda, mezcla, granulación y compresión, cuando sea necesario, para formas de comprimidos, o molienda, mezcla y relleno para formas de cápsula de gelatina dura. Cuando se utiliza un portador líquido, la preparación se encontrará en forma de jarabe, elíxir, emulsión o una suspensión acuosa o no acuosa. Dicha formulación líquida se puede administrar directamente por vía oral o como relleno de una cápsula de gelatina blanda.
Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad terapéuticamente eficaz exacta es aquella cantidad de la composición que proveerá los resultados más eficaces en términos de eficacia de tratamiento en un sujeto dado. Esta cantidad variará en función de una variedad de factores que incluyen, de modo no taxativo, las características del compuesto terapéutico (que incluyen actividad, farmacocinética, farmacodinámica y biodisponibilidad), el estado fisiológico del sujeto (que incluye edad, sexo, tipo y etapa de la enfermedad, estado físico general, capacidad de respuesta a una dosis dada y tipo de medicación), la naturaleza del portador o portadores farmacéuticamente aceptables en la formulación y la vía de administración. Un experto en la téenica clínica y farmacológica será capaz de determinar una cantidad terapéuticamente eficaz a través de experimentación rutinaria, por ejemplo, mediante el control de la respuesta de un sujeto a la administración de un compuesto o el consiguiente ajuste de la dosis. Por pautas adicionales, remítase a Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed., 20a edición, Williams & Wilkins, PA, EUA) (2000).
KITS DE LA INVENCIÓN La invención también provee un kit para tratar la neutropenia, inhibir de la neutropenia, reducir la neutropenia o promover de la prevención de la neutropenia en un sujeto que lo necesita. El kit comprende una composición que comprende un agonista retinoide e instrucciones para utilizar la composición en el tratamiento, la inhibición y/o la reducción de la gravedad de la neutropenia, infección bacteriana grave, neutropenia inducida por quimioterapia del cáncer y/o varias formas de neutropenia congénita en sujetos que lo necesitan. En algunas modalidades, el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. En una modalidad, el agonista retinoide es tamibaroteno (AM80).
El kit es un ensamble de materiales o componentes que incluyen al menos una de las composiciones inventivas. Por lo tanto, en algunas modalidades, el kit contiene una composición que incluye un agonista retinoide, tal como uno cualquiera o más de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de estos, tal como se describió anteriormente.
La naturaleza exacta de los componentes del kit de la invención depende de su objetivo. En una modalidad, el kit se configura particularmente para sujetos humanos. En modalidades adicionales, el kit se configura para aplicaciones veterinarias, para tratar sujetos tales como, de modo no taxativo, animales de granja, animales domésticos y animales de laboratorio.
Las instrucciones de uso pueden estar incluidas en el kit.
Por lo general, «instrucciones de uso» incluye una expresión tangible que describe la téenica a ser empleada al usar los componentes del kit para obtener un resultado deseado, tal como para tratar, reducir la gravedad con la que se presenta, inhibir o prevenir la neutropenia en un sujeto. De manera opcional, el kit también comprende otros componentes útiles, tales como herramientas de medida, solventes, soluciones amortiguadoras, portadores farmacéuticamente aceptables, jeringas y otros elementos útiles conocidos por los expertos en la técnica.
Los materiales o componentes que conforman el kit pueden ser provistos al profesional almacenados en cualquier forma conveniente y adecuada para preservar su funcionalidad y su utilidad. Por ejemplo, los componentes pueden encontrarse en forma disuelta, deshidratada o liofilizada, pueden proveerse a temperatura ambiente, refrigerados o congelados. Normalmente, los componentes se encuentran contenidos en materiales de envasado adecuados. Tal como se usa en la presente, la expresión «material de envasado» hace referencia a una o más estructuras físicas utilizadas para contener los contenidos del kit, tales como las composiciones de la invención y similares. El material de envasado es fabricado mediante métodos conocidos, preferentemente para proveer un entorno estéril, libre de contaminantes. Tal como se usa en la presente, el término «envase» hace referencia a un material o matriz sólida tal como vidrio, plástico, papel, papel metalizado y similares que tienen la capacidad de contener los componentes individuales del kit. Por lo tanto, por ejemplo, un envase puede ser una botella utilizada para contener cantidades adecuadas de una composición de la invención que contiene un agonista retinoide, tal como uno o más de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos. El material de envase suele presentar una etiqueta externa que indica el contenido y/o el objetivo del kit y/o de sus componentes.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Células y cultivo celular Las células CD34+ de sangre del cordón umbilical humano provinieron de AllCells (Emeryville, CA). Las células CD34+ se expandieron29 alrededor de 50 veces con medio libre de suero StemSpan (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) durante 6 días conforme al protocolo del fabricante. Las células CD34+ se cultivaron con medio mieloide complementado con 25 ng/ml de G-CSF17'29 durante 6-12 días para inducir granulopoyesis. Durante la granulopoyesis, los linfocitos y eritrocitos fueron bloqueados mediante la adición de hidrocortisona y la exclusión de eritropoyetina.17,29 El ácido retinoico (RA) completamente trans provino de Sigma (St. Louis, MO) y los agonistas retinoides Am80, CH55 e IT-YA-01115 (ITYA) provinieron de Research Foundation ITSUU Laboratory (Tokio, Japón). Se disolvió cada compuesto retinoide en etanol. Las condiciones determinadas experimentalmente con 25 ng/ml de G-CSF17'29 o Am802,5 nM para inducción granulocítica durante 6 días (Figura 1A-1D) fueron aplicadas en los ensayos.
PBN humanos Se extrajeron muestras de sangre de venas periféricas de voluntarios sanos conforme a un protocolo aprobado por el Comité de investigación clínica de la Facultad de medicina de la Universidad Keck del sur de California/Hospital pediátrico de Los Ángeles (CHLA/USC). Cada muestra de 20 mi de sangre fue colocada en tubos de coagulación Vacutainer (BD Biosciences, San José, CA) y se diluyó con 1 volumen de HBSS a temperatura ambiente. Se cargó la sangre diluida en 10 mL de Ficoll-paque premium (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y se centrifugó a 400xg durante 40 minutos. Luego se mezcló la capa de PBN-eritrocitos con 15 mL de dextrano T500 al 3 % (Sigma) para producir sedimentación durante 2 horas a temperatura ambiente. Se eliminaron los eritrocitos mediante lisis hipotónica con agua estéril durante 18 segundos y luego se recogió la capa rica en PBN mediante centrifugado. La pureza de los PBN recolectados fue >95 %, según fue determinada mediante análisis morfológico con tinción Wright-Giemsa . Los PBN recientemente purificados fueron utilizados en los ensayos inmediatamente después de finalizado su aislamiento.
Proliferación y muerte celular La proliferación celular fue determinada mediante recuento de células con un hemocitómetro estándar, tal como se describió.17,29 A grandes rasgos, se contó la misma cantidad de células colocadas en placas por triplicado durante hasta 13 días luego de transcurridas 72 horas desde su colocación en las placas. Se utilizó exclusión con azul de tripano para medir en forma simultánea la proliferación celular y su muerte celular asociada en los cultivos.
Análisis morfológico de diferenciación granulocítica Las suspensiones celulares fueron criocentrifugadas en portaobjetos, seguida por fijación con metanol y tinción con Wright-Giemsa (Sigma) tal como se describió.17,29 Se evaluaron los indicadores morfológicos de diferenciación con un microscopio Zeiss Axioplan y se realizaron ajustes de equilibrio de color de las imágenes obtenidas mediante Adobe Photoshop tal como se describió.17 Microscopía de transmisión de electrones Un estudio ultraestructural de infecciones bacterianas y de neutrófilos fue llevado a cabo por miembros del Laboratorio de microscopía electrónica, Departamento de patología y laboratorio médico, CHLA/USC. A continuación se detallan los procedimientos.
Transferencia Western La transferencia Western (WB) fue llevada a cabo tal como se describió.15 Se utilizaron anticuerpos para lactoferrina (Abcam, Cambridge, RU), MMP-9 (Merck Chemicals, Darmstadt, Alemania) y LL-37 (Biolegend, San Diego, CA) en los análisis. Ensayos de degranulación Las células fueron incubadas con E. coli DH5a (moi 5, relación entre células y bacterias 1:5) en medio DMEM libre de suero durante 30 minutos a 37 °C. Se recogieron tanto los sedimentos celulares como los sobrenadantes mediante centrifugado a 3000 rpm durante 7 minutos. Se suspendieron los sedimentos celulares con 100 mg/ml de gentamicina y se incubaron a 37 °C durante 1 hora, seguido por la recolección de células y la extracción de las proteínas celulares. Se filtró el sobrenadante a través de un filtro 0,22 mm (Pall Corporation, Ann Arbor, MI) y luego se concentraron las proteínas en el sobrenadante con una unidad de filtrado por centrifugación Amicon Ultra-4 diseñada para recoger proteínas con una masa por encima de los 3000 daltons (Millipore, Billerica, MA). La cantidad de proteínas fue determinada mediante ensayos proteicos DC Bio-Rad (Hercules, CA).29 Paralelamente, se evaluó el cambio de los niveles de proteínas granulares con estímulo de E. coli o sin él mediante WB.
Ensayos de destrucción bacteriana y fagocitosis Cada 5 x 105 a 2 x 106 de PBN recientemente purificados, así como GIN y AIN inducidos ex vivo, fueron suspendidos con 500 ml de medio de cultivo (DMEM con 10 % de FBS) en tubos de 1,5 mi. Se incubaron las células con Escherichia coli (E. coli) DH5a en fase exponencial (provista por un colaborador) o Staphylococcus aureus ( S . aureus,- ATCC) con un MOI de 5 o 10 a 37 °C durante 15, 30 y/o 60 minutos, y las bacterias fueron utilizadas para determinar el crecimiento en ausencia de células. Las muestras con células o sin ellas fueron centrifugadas a 1000 rpm en cada momento. Se recolectaron las bacterias extracelulares en presencia de células de los sobrenadantes y se enumeraron mediante la colocación en placas de diluciones diferentes (20 mL cada una) sobre agar sangre. Los sedimentos celulares de las muestras infectadas con bacterias fueron incubados adicionalmente con 100 mg/ml de gentamicina (Sigma) durante 1 hora a 37 °C para destruir las bacterias externas. Luego, las células fueron lavadas dos veces y se U saron con 100 mL de Tritón X-100 al 0,5 %. Se colocaron alícuotas de diferente dilución (20 pL por cada una) de bacterias intracelulares viables recuperadas de los U sados celulares en agar sangre. Se determinó la cantidad de bacterias extracelulares e intracelulares viables en cada momento mediante recuentos de unidades formadoras de colonias (CFU), tal como se describió,5,30 al tiempo que la cantidad de bacterias destruidas y fagocitadas se basó en los recuentos de bacterias extracelulares e intracelulares viables respecto a la cantidad de bacterias de control relevantes en condiciones libres de neutrófilos.5,30 Separación magnética de neutróf ilos CD15+ Se mezclaron las células suspendidas en PBS con BSA al 0,5 % y EDTA 2 mM con anticuerpos antiCD15 conjugados con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Alemania) para su incubación durante 30 minutos a 4 °C. Luego, se purificó la subpoblación de CD15+ con un separador magnético (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Alemania) conforme al protocolo del fabricante.
Análisis estadístico La estadística descriptiva, que incluye medias, desviaciones estándar e intervalos, fue considerada, cuando fue necesario, y analizada mediante prueba t de Student desapareada de dos colas. Los valores de P iguales o menores de 0,05 fueron considerados estadísticamente significantes.
Destrucción por bactericidas in situ Se incubó las células con E. coli o S. aureus durante 15 minutos y/o 60 minutos, seguido por la recolección de células mediante centrifugado a 1000 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos celulares fueron suspendidos con 100 mg/mL de gentamicina y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Luego de tres lavados, se permeabilizaron las células con solución Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) a 4 “C durante 20 minutos. Se volvió a lavar las células y se las resuspendió en PBS para etiquetar las bacterias intracelulares vivas y muertas con el kit de viabilidad LIVE/DEAD BacLight (Life Technologies, Grand Island, NY) conforme al protocolo del fabricante. Las células fueron centrifugadas en portaobjetos y fueron examinadas por microscopía confocal con líneas de 488 y 564 nm de láser de kriptón/argón. Las bacterias vivas teñidas con marcador fluorescente SYT09 con membranas intactas se presentan de color verde, al tiempo que las bacterias muertas con membranas dañadas se tiñeron de rojo con marcador fluorescente yoduro de propidio (PI).
Detección de infecciones bacterianas mediante inmunofluorescencia Se incubaron GIN, AIN y PBN con E. col i o S. aureus a MOI de 10 a 37 °C durante 15 minutos y 60 minutos. Se fijaron las células con paraformaldehído al 2 % a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido por el bloqueo con PBS con suero de cabra normal al 5 % durante 30 minutos. Con el objetivo de bloquear los antígenos OmpA de las bacterias retenidas en la superficie celular luego de la infección, en primer lugar, las células fueron incubadas con anticuerpo antiOmpA durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida por incubación con anticuerpo IgG anticonejo conjugado con HRP a temperatura ambiente durante 30 minutos para bloquear los sitios de anticuerpos primarios externos. Luego de lavar bien, se permeabilizaron las células con una solución de permeabilización (BD Biosciences) durante 20 minutos y luego se incubaron con anticuerpo antiOmpA para etiquetar las bacterias intracelulares a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación de la incubación de las células con anticuerpo IgG de cabra anticonejo conjugado con FITC durante 30 minutos, se centrifugaron las células en portaobjetos y se fijaron con solución de fijación Vectashield (Vector laboratories, Burlingame, CA). Se obtuvieron imágenes de las bacterias teñidas con FITC mediante microscopio confocal. Análisis mediante citometría de flujo Tanto los anticuerpos antihumanos CD66-PE (subunidades CD66a, CD66c, CD66d y CD66e reconocidas), CDllb-APC, CD18-FITC y CD66b-PE, como sus isotipos correspondientes provinieron de BD Biosciences. CD66a-PE antihumano y su isotipo correspondiente provinieron de R&D Systems (Minneapolis, MN). Los datos fueron obtenidos y analizados con software FlowJo (versión 7.6.5; Tree star, Ashland, OR).
Ejemplo 2 Am80 promueve la diferenciación de neutrófilos en forma más eficaz que G-CSF Am80, CH55 e ITYA conforman un grupo de agonistas retinoides que fueron sintetizados mediante la introducción de heteroátomos en estructuras tipo RA (Figura 5). Debido a que todos estos agonistas presentan actividades retinoides potentes, se compararon las eficacias de estos compuestos con G-CSF y RA en la inducción de granuíopoyesis de células CD34+ mediante la metodología establecida.17,29 Los inventores demostraron que G-CSF fue menos eficaz que RA para inducir la diferenciación morfológica de células CD34+ en granulocitos, acompañada de una mayor inducción de monocitos (Figura 6A). Sin embargo, G-CSF indujo mayor proliferación celular y una menor proporción de muerte celular en comparación con RA (Figura 6B). De los otros agonistas retinoides, Am80 (10 nM) y CH55 (5 ñM) promovieron >75 % de diferenciación granulocítica al día 13, en contraste con ITYA (5 nM) que produjo >60 % de monocitos (Figura 6C). Aunque tanto Am80 como CH55 inhibieron la proliferación celular (Figura 6D), tal como lo hizo RA (Figura 6B), la tasa de muerte celular asociada al tratamiento con Am80 fue menor que la observada con CH55 o RA (Figura 6B, 6D). En conjunto, estos datos muestran que G-CSF es significativamente menos eficaz como inductor de diferenciación granulocítica que RA, CH55 y Am80, al tiempo que ITYA mayormente induce diferenciación monocítica. Mientras que Am80, RA y CH55 promueven la diferenciación granulocítica con eficacia similar, Am80 induce una menor tasa de muerte celular.
Debido a que se asocia el menor nivel de diferenciación de células CD34+ en granulocitos inducida por G-CSF el día 12 con un nivel más elevado de inducción monocítica, G-CSF puede inducir la diferenciación granulocítica en forma más eficaz en un breve período de tiempo. Por lo tanto, las células CD34+ fueron tratadas con G-CSF durante 6, 9 y 12 días. Al analizar la diferenciación morfológica de dichas células, los inventores encontraron diferenciación granulocítica más eficaz con la menor velocidad de inducción monocítica el día 6 en comparación con el día 9 o el día 12 (Figura 1A). Se comparó la capacidad de G-CSF y Am80 para inducir la diferenciación granulocítica de células CD34+ con la condición de inducción óptima del día 6. Debido a que Am80 10 nM indujo más muerte celular (Figura 6C), se sustituyó una concentración reducida de Am80 (2,5 nM o 5 nM) en los ensayos. Los resultados demostraron que Am80 2,5 nM no sólo indujo diferenciación granulocítica profunda con prácticamente ninguna inducción monocítica (Figura IB), pero también produjo menos toxicidad que Am80 5 nM (Figura 1C). Por lo tanto, estos resultados indican que el período de inducción óptimo de 6 días para G-CSF también puede ser adecuado para Am80 (2,5 nM), lo que llevó a aplicar tales tiempo de exposición al fármaco y dosis de fármaco durante el resto del estudio.
Se analizó la diferenciación de neutrófilos en células CD34+ en las etapas de promielocito, mielocito, metamielocito y neutrófilo no segmentado hasta la etapa de neutrófilo maduro.
Las células CD34+ fueron tratadas con G-CSF o Am80 durante 6 días. El análisis morfológico granulocítico mostró que el desarrollo secuencial de neutrófilos fue inducido en forma suficiente por Am80. En contraste, G-CASF indujo más mieloblastos, así como promielocitos y mielocitos, que neutrófilos no segmentados y segmentados (Figura ID). Además, G-CSF indujo monocitos en forma regular (alrededor de 10 %, Figura 1A, ID). Estos resultados demuestran que Am80 es más eficaz que G-CSF para inducir la diferenciación morfológica de neutrófilos con una tasa de toxicidad celular similar. AIN son más eficaces que GIN para producir y secretar gránulos Durante la diferenciación celular, se producen poblaciones de proteínas granulares heterogéneas en forma secuencial y se almacenan en el citoplasma como primera línea de defensa contra diferentes patógenos.32,33 Los inventores investigaron si la maduración de neutrófilos mejorados con Am80 se asocia con la producción aumentada de gránulos. Se analizaron los neutrófilos inducidos durante 6 días a partir de células CD34+ por G-CSF y Am80 mediante microscopía de transmisión de electrones. Las imágenes ultraestructurales mostraron que, en el nivel de neutrófilos segmentados, GIN presentaron cantidades variables de vesículas que en muchos casos contenían material menos denso y amorfo, junto con algunos gránulos de tipo primario y secundario. En contraste, las vesículas encontradas en los AIN se encontraron frecuentemente llenas de material denso o tanto con material denso como amorfo. En comparación con los GIN, los AIN contenían cantidades mayores de gránulos de tipo primario y secundario, tal como se observó en los PBN. Por lo tanto, los datos indican diferencias marcadas en la formación de vesículas y la producción de gránulos entre GIN y AIN.
Los inventores comprobaron si la diferenciación granulocítica inducida por Am80 se asociaba efectivamente a suficiente producción de gránulos y evaluaron la capacidad de degranulación de AIN en respuesta a estímulos bacterianos. Las células CD34+ fueron tratadas con G-CSF o Am80 durante 6 días. Se incubaron los GIN y AIN resultantes con E. coli, o en su ausencia, durante 30 minutos, seguido por extracción de proteínas tanto de los lisados celulares como de los sobrenadantes. Los análisis mediante WB de la producción y la secreción de gránulos demostraron que lactoferrina, un gránulo secundario con potente actividad antimicrobiana de amplio espectro34,35, se almacenó en AIN y se secretó al medio en cantidades suficientes ante estímulos bacterianos. En contraste, aunque los niveles de lactoferrina aumentaron ante estímulos bacterianos en los GIN, la eficacia de la secreción de lactoferrina en los GIN fue mucho menor que la observada en los AIN (Figura 2A). De manera similar, se observó un nivel elevado de gránulos secundarios IL-37 en los AIN y, ante estímulos bacterianos, los gránulos LL-37 se liberaron efectivamente en el medio. Por otro lado, los GIN mostraron tanto ausencia de producción de LL-37 como de degranulación (Figura 2B). Por lo tanto, tanto lactoferrina como LL-37 son producidos y secretados en forma eficaz por AIN, pero no por GIN.
Incluso en ausencia de E. coli, los GIN secretaron MMP-9 (gránulos terciarios) en el medio y dicha secreción fue inhibida por los estímulos bacterianos (Figura 2C). Sin embargo, aunque E. coli mejoró la expresión de MMP-9 en los AIN, los estímulos bacterianos no lograron inducir la secreción de MMP-9 en AIN (Figura 2C). Estas observaciones indican posibles defectos en la inducción de MMP-9 o en la degranulación (o en ambos) en GIN y AIN inducidos ex vivo.
AIN presentan actividades bactericida y fagocítica significativamente más elevadas que GIN Los estudios anteriores demuestran que Am80 es más eficaz que G-CSF para promover tanto la diferenciación morfológica granulocítica como la producción/secreción de gránulos (Figuras 1A a 2C). Los inventores determinaron si dicho grado más elevado de diferenciación de neutrófilos inducido por Am80 se traduce en mayor inmunidad neutrofílica contra infecciones bacterianas. Debido a que Am80 induce más neutrófilos segmentados y no segmentados que G-CSF (Figura 1A-1D), se evaluó si los neutrófilos segmentados y no segmentados de GIN y AIN presentaban actividades bactericidas similares. Dado que los neutrófilos son células CD15+36, se purificaron GIN y AIN con anticuerpo antiCD15 conjugado con microesferas MicroBeads. Luego de la purificación, la proporción de neutrófilos no segmentados/segmentados en GIN sin separar aumentó de 21 % a 63 % en GIN separados, similar a lo observado en AIN separados (Figura 3B). Asimismo, la fracción de monocitos residuales en GIN separados fue únicamente de alrededor de 1 % (Figura 3A). Entonces, se evaluó dichos GIN y AIN sin separar para determinar su capacidad para destruir E. coli en fase logarítmica, junto con PBN recientemente asilado/purificado que consiste en >95 % de neutrófilos segmentados (Figura 3B). Cabe destacar que los conteos de CFU indicaron que únicamente se recuperaron pocas bacterias viables de compartimientos intracelulares de PBN y AIN no separados en comparación con GIN sin separar (Figura 3C). Tal como con los GIN no separados, los GIN separados también fueron significativamente menos capaces de destruir bacterias que los AIN separados (Figura 3D). Se confirmó la depuración bacteriana mejorada en AIN mediante etiquetado in situ de E. coli con anticuerpo antiOmpA que reconoce específicamente la membrana externa de E. coli . Estos resultados indican que los niveles de diferenciación de neutrófilos que emergen de la granulopoyesis inducida por Am80 son esenciales para una inmunidad neutrofílica eficaz contra infecciones bacterianas. Esta observación es apoyada por los datos de que los GIN con morfología de neutrófilos segmentados también presentan un menor nivel de moléculas tipo gránulo y contienen una cantidad mayor de vesículas amorfas menos densas.
La inmunidad innata contra infecciones bacterianas se desarrolla durante la diferenciación neutrofílica. Para comparar esta función entre AIN y GIN, se trató las células CD34+ con G-CSF o Am80 durante 6 días, seguido por análisis de destrucción fagocítica y bacteriana. Mediante el uso de la metodología previamente descrita31,37 se incubaron GIN, AIN y PBN con E. coli en fase logarítmica a MOI de 5 durante 15 o 60 minutos, o se utilizó E. coli en ausencia de neutrófilos para controlar el crecimiento bacteriano. Se cuantificaron tanto las bacterias celulares como las intracelulares viables recuperadas mediante conteo de CFU en muestras en las que los neutrófilos fueron expuestos a bacterias. Se calcularon las cantidades de bacterias fagocitadas y destruidas mediante la sustracción de bacterias extracelulares exclusivamente o tanto extracelular como intracelular, respectivamente, de la cantidad de bacterias en condición libre de neutrófilos. Las bacterias extracelulares se redujeron en forma significativa en las muestras de PBN y AIN (Figura 4A, 4B). Los PBN destruyeron rápidamente las bacterias en un plazo de 15 minutos y a los 60 minutos, únicamente se encontraban pocas bacterias intracelulares viables en las muestras de PBN o de AIN (Figura 4C). En contraste, al trascurrir 60 minutos desde la infección, los GIN exhibieron depuración sustancialmente impedida de las bacterias intracelulares, mantuvieron un nivel más elevado de bacterias extracelulares y presentaron deficiencia en la destrucción bacteriana (Figura 4A-D). Para confirmar que AIN presentan mayor actividad bacteriana que los GIN, se evaluó la destrucción bacteriana in si tu mediante microscopía confocal tanto en bacterias viables etiquetadas con el marcador fluorescente SYT09 y bacterias destruidas etiquetadas con marcador fluorescente yoduro de propidio (PI). Los resultados demostraron que se retuvieron significativamente más E. coli supervivientes en las muestras de GIN, en las que se encontraron mucho menos bacterias muertas en contraste con las observaciones en muestras de AIN o PBN. Se confirmó mediante cuantificación de bacterias extracelulares luego de la infección y de bacterias muertas in situ que tanto AIN como PBN presentaban mayor actividad bactericida que GIN (Figura 4E). Además, las imágenes ultraestructurales de la infección con E. coli obtenidas mediante microscopio electrónico mostraron que gran cantidad de bacterias intactas/supervivientes se vieron retenidas en GIN con vesículas menos densas, al tiempo que, similarmente a lo que ocurre en PBN, sólo se identificaron pocas bacterias intactas/supervivientes en los AIN cuyo citoplasma contenía vesículas densas junto con algunos gránulos de tipo primario y secundario. Si se consideran en conjunto, estos datos sugieren que la diferenciación granulocítica inducida por Am80 se asocia con la inmunidad innata neutrofílica mejorada contra infecciones bacterianas.
Ejemplo 3 Am80 induce una recuperación de neutro filos competitiva en comparación con G-CSF Se dividieron 30 ratones C57BL6/J aleatoriamente en seis grupos para llevar a cabo los experimentos. En la Figura 7A se ilustra el diseño experimental para el análisis de la recuperación de neutrófilos mediante el uso de dosis diferentes de Am80 y G-CSF. Se administró una única dosis de inyección intraperitoneal de ciclofosfamida (CPA) de 200 mg/kg el día 0 para inducir la neutropenia. Se administró Am80 o G-CSF o un vehículo 4 horas después de la inyección de CPA durante 3 días consecutivos. Se indujo neutropenia en los ratones 48-60 horas después de la inyección de CPA. El experimento fue llevado a cabo el día 3. Se tomaron muestras de sangre periférica (PB) de ratones de control sometidos a eutanasia en el día 3 y se purificaron los neutrófilos de PB mediante Ficoll-paque (1,084). Se identificó la mayoría de los neutrófilos en el nivel menor de Ficoll paque, tal como se fue reflejado por el análisis de morfología granulocítica (Figura 7B). En la Figura 7C se ilustra el análisis de recuperación de neutrófilos y leucocitos (WBC) de ratones neutropénicos tratados con diferentes dosis de Am80 o G-CSF en el día 3. Am80 de 5 mg/kg demostró una recuperación de neutrófilos competitiva en el nivel inferior de Ficoll-paque en comparación con G-CSF de 250 pg.
Ejemplo 4 Neutrófilos movilizados por Am80 en ratones neutropénicos exhiben mayor actividad bactericida que los movilizados por G-CSF Se observó que se produjo una reducción importante tanto de WBC como de neutrófilos en todos los ratones experimentales 3 días después de la inyección con CPA en comparación con los ratones de control (Figura 8A). Luego, el día 5 con inyección de G-CSF o Am80 o vehículo durante 2 días consecutivos, se indujo una recuperación de neutrófilos notoriamente acelerada mediante G-CSF en comparación con Am80, al tiempo que los recuentos de neutrófilos en el grupo vehículo también volvieron prácticamente al valor de control (Figura 8A-8B). Dichos neutrófilos fueron purificados de PB de diferentes grupos de ratones (un total de 20 ratones), tal como se observa en la muestra de GIN, y fueron utilizados para analizar las actividades bactericidas contra la infección con S. aureus in vitro. Se observó (Figura 8C) la eliminación significativa de las bacterias extracelulares ya sea mediante MPBN, AIN, o GIN respecto a los neutrófilos aislados de C-MPBN tratadas con vehículo, al tiempo que los AIN fueron marcadamente más eficaces para la eliminación de bacterias que tanto GIN como C-MPBN. De manera similar a lo que ocurre con los MPBN, los AIN fagocitaron y destruyeron significativamente más bacterias que los GIN o C-MPBN. Debido a que la recuperación acelerada de neutrófilos cesó el día 7 (Figura 8D), se purificaron neutrófilos de PB de diferentes ratones el día 9 (Figura 8E) para comparar su actividad bactericida luego del cese de la recuperación acelerada de neutrófilos. Los resultados demostraron que tanto los MPBN como los AIN exhibieron significativamente más actividad bactericida que C-MPBN, mientras que no se observó diferencia en la fagocitosis o la destrucción bacteriana entre GIN y C-MPBN (Figura 8F). Estos hallazgos demuestran que, de forma similar a lo que ocurre en el caso de MPBN, los neutrófilos movilizados por Am80 en ratones neutropénicos son significativamente más eficaces con la infección de S aureus que los movilizados por G-CSF, a pesar de que G-CSF puede inducir notoriamente más neutrófilos que Am80 en etapas anteriores de recuperación neutrofílica. Asimismo, aunque los recuentos de C-MPBN alcanzan un valor significativamente mayor que los valores de control en una etapa posterior de recuperación neutrofílica, las actividades bactericidas de C-MPBN siguen siendo significativamente inferiores que las de MPBN o AIN.
Mediante el uso de un modelo de ratón neutropénico inducido por una dosis única de CPA, tal como se describió31,32, los inventores evaluaron si los neutrófilos movilizados in vivo por Am80 realmente presentan la misma inmunidad neutrofílica contra infecciones bacterianas mayor respecto al caso de G-CSF, según lo observado en el modelo ex vivo (Fig.8A-8F). Se dividieron 20 ratones C57BL6/J aleatoriamente en cuatro grupos para llevar a cabo los experimentos in vivo. Se administraron 200 mg/Kg de CPA el día 0. Se administraron 250 mg/Kg de G-CSF o 5 mg/Kg de Am80 los días 0, 1 y 2. Luego de 16 horas de inoculación intraperitoneal de 3 x 107 S. aureus en fase de crecimiento logarítmico, se analizó la actividad bactericida de neutrófilos purificados mediante la determinación de la cantidad de bacterias extracelulares viables en la cavidad peritoneal (Figura 8G panel i) y PB (Figura 8G panel ii). Se determinó la cantidad de bacterias viables a partir de 3 mi de líquido peritoneal lavado con PBS, así como con un estimado de 1,5 mi del total de plasma en sangre. Valor P de bacterias viables en la cavidad peritoneal: Am80 contra G-CSF, P < 2,4 E-8; control contra G-CSF, P < 4,7 E-9; vehículo contra G-CSF, P < 8,3 E-3; Am80 contra vehículo, P < 3,1 E-9; Am80 contra control, P < 0,038. La Figura 8G panel iii ilustra el total de bacterias extracelulares viables de las Figuras 8G panel i y 8G panel ii. Am80 contra G-CSF, P <1,9 E-6; control contra G-CSF, P < 9,4 E-9; vehículo contra G-CSF, P < 6,5 E-4; Am80 contra vehículo, P < 6,8 E-7; control contra Am80, P < 3,8 E-5. La Figura 8G panel iv ilustra los cambios en veces en las bacterias viables de la Figura 8G panel iii. Las bacterias viables en el grupo de control fueron utilizadas como estándar de 1 vez.
Mediante el uso de un modelo de ratón neutropénico inducido por una dosis única de CPA, tal como se describió31'32, los inventores evaluaron si los neutrófilos movilizados in vivo por A 80 realmente presentan la misma inmunidad neutrofílica contra infecciones bacterianas mayor respecto al caso de G-CSF, según lo observado en el modelo in vivo (Fig.8A). Se observó que se produjo una reducción importante tanto de WBC como de neutrófilos en todos los ratones experimentales 3 días después de la inyección con CPA en comparación con los ratones de control (Figura 8B). Luego, el día 5 con inyección de G-CSF o Am80 o vehículo durante 2 días consecutivos, se indujo una recuperación de neutrófilos notoriamente acelerada mediante G-CSF en comparación con Am80, al tiempo que los recuentos de neutrófilos en el grupo vehículo también volvieron prácticamente al valor de control (Figura 8B-8C). Dichos neutrófilos fueron purificados de PB de diferentes ratones, tal como se observa en la muestra de GIN, y fueron utilizados para analizar las actividades bactericidas contra la infección con S. aureus in vitro. Se observó (Figura 8D) la eliminación significativa de las bacterias extracelulares ya sea mediante MPBN, AIN, o GIN respecto a los neutrófilos aislados de C-MPBN tratadas con vehículo, al tiempo que los AIN fueron marcadamente más eficaces para la eliminación de bacterias que tanto GIN como C-MPBN. De manera similar a lo que ocurre con los MPBN, los AIN fagocitaron y destruyeron significativamente más bacterias que los GIN o C-MPBN. Debido a que la recuperación acelerada de neutrófilos cesó el día 7 (Figura 8E), se purificaron neutrófilos de PB de diferentes ratones el día 9 (Figura 8F) para comparar su actividad bactericida luego del cese de la recuperación acelerada de neutrófilos. Los resultados demostraron que tanto los MPBN como los AIN exhibieron significativamente más actividad bactericida que C-MPBN, mientras que no se observó diferencia en la fagocitosis o la destrucción bacteriana entre GIN y C-MPBN (Figura 8G). Estos hallazgos demuestran que, de forma similar a lo que ocurre en el caso de MPBN, los neutrófilos movilizados por Am80 en ratones neutropénicos son significativamente más eficaces con la infección de S aureus que los movilizados por G-CSF, a pesar de que G-CSF puede inducir notoriamente más neutrófilos que Am80 en etapas anteriores de recuperación neutrofílica. Asimismo, aunque los recuentos de C-MPBN alcanzan un valor significativamente mayor que los valores de control en una etapa posterior de recuperación neutrofílica, las actividades bactericidas de C- MPBN siguen siendo significativamente inferiores que las de MPBN o AIN.
Los estudios comprendidos en la presente demuestran que los neutrófilos generados ex vivo e in vivo por tratamiento con Am80 de células CD34+ no sólo exhiben mayor madurez de diferenciación, sino que también presentan mayor eficiencia contra infecciones bacterianas que G-CSF. Es probable que esto ocurra mediante la coordinación de la interacción funcional de CD66 con CD18 para mejorar el desarrollo de la inmunidad innata neutrofílica que emerge de la granulopoyesis. La determinación adicional de tal mecanismo de regulación debería proporcionar nueva información respecto a la granulopoyesis mediada por retinoides y la diferenciación neutrofílica. A su vez, esto proveerá una base molecular sólida para la elaboración de terapias eficaces contra la neutropenia, así como para los granulocitos generados ex vivo en terapias de transfusión para reducir el período de padecimiento de la neutropenia, con el uso de Am80 como una molécula terapéutica económica.
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Los varios métodos y téenicas descritos anteriormente proveen una variedad de modos para implementar la aplicación. Por supuesto, debe entenderse que no necesariamente pueden alcanzarse todos los objetivos o ventajas descritos conforme a cualquier modalidad particular descrita en la presente. Por lo tanto, los expertos en la técnica reconocerán, por ejemplo, que los métodos pueden ponerse en práctica en una forma que logre u optimice una ventaja o un conjunto de ventajas tal como se indica en la presente, sin que necesariamente se logren otros objetivos o ventajas que puedan indicarse o sugerirse en la presente. Se mencionan en la presente una variedad de alternativas. Debe entenderse que algunas modalidades preferidas incluyen específicamente una, otra o varias características, al tiempo que otras específicamente excluyen una, otra o varias características y que aun otras mitigan una característica específica mediante la inclusión de una, otra o varias características ventajosas.
Adicionalmente, el experto en la téenica reconocerá la aplicabilidad de varias características de las diferentes modalidades. De manera similar, el experto en la técnica puede emplear los diversos elementos, características y etapas anteriormente descritos, así como otros equivalentes conocidos de dichos elementos, características o etapas, en diversas combinaciones para poner en práctica métodos conforme a los principios descritos en la presente. Entre los diferentes elementos, características y etapas, algunos se incluirán específicamente y otros se excluirán específicamente en distintas modalidades.
Si bien la aplicación ha sido descrita en el contexto de determinadas modalidades y ejemplos, el experto en la técnica entenderá que las modalidades de la aplicación se extienden más allá de las modalidades específicamente descritas a otras modalidades y/o usos alternativos, y a modificaciones y equivalentes de estos.
En algunas modalidades, los términos «un», «una», «el», «la» y referencias similares usadas en el contexto de descripción de una modalidad particular de la aplicación (especialmente en el contexto de determinadas reivindicaciones de las que se encuentran a continuación) pueden ser interpretados como términos que abarcan tanto el singular como el plural. La mención de intervalos de valores en la presente pretende meramente servir como un método taquigráfico para referirse de forma individual a cada valor independiente comprendido en el intervalo. Salvo que se indique lo contrario en la presente, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva tal como si se hubiera mencionado en forma individual en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden ser llevados a cabo en cualquier orden adecuado, salvo que se indique lo contrario en la presente o en caso de que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera de los ejemplos y de todos ellos, o de lenguaje de ejemplificación (por ejemplo, «tal como») provisto respecto a determinadas modalidades de la presente tiene el mero propósito de aclarar la solicitud y no representa una limitación para el alcance de la solicitud reivindicada en otro modo. No se debe interpretar ninguna expresión utilizada en la memoria descriptiva como indicación de algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la aplicación.
En la presente se describen modalidades preferidas de esta aplicación que incluyen el mejor modo conocido por los inventores para desarrollar la aplicación. Las variaciones a aquellas modalidades preferidas serán evidentes para los expertos en la téenica luego de leer la descripción que antecede. Se contempla que los expertos en la técnica puedan emplear tales variaciones según sea apropiado y la aplicación puede ponerse en práctica en formas diferentes a las descritas específicamente en la presente. Por consiguiente, muchas modalidades de esta aplicación incluyen todas las modificaciones y equivalentes del objeto descrito en las reivindicaciones adjuntas a la presente, como lo permita la legislación aplicable. Asimismo, la aplicación comprende toda combinación de los elementos anteriormente descritos en todas sus variaciones posibles, salvo que se indique lo contrario en la presente o que lo contradiga claramente el contexto. Todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones de solicitudes de patentes y otro material, tal como artículos, libros, memorias descriptivas, publicaciones, documentos, instrumentos y/o similares, a los que se hace referencia en la presente se incorporan en ella en su totalidad mediante esta referencia para todo fin, a excepción de cualquier registro de seguimiento asociado a ellos, cualquier parte de ellos que no sea consistente con el presente documento o que entre en conflicto con él, o cualquiera de ellos que pueda ejercer un efecto limitativo del alcance más amplio de las reivindicaciones asociadas en la actualidad o en el futuro al presente documento. Por ejemplo, en caso de que se observara una inconsistencia o conflicto entre la descripción, definición y/o uso de un término asociado con cualquiera de los materiales asociados al presente documento, prevalecerá la descripción, definición y/o uso del término en el presente documento.
En conclusión, se debe comprender que las modalidades de la aplicación descritas en la presente ilustran los principios de las modalidades de la aplicación. El alcance de la aplicación puede comprender otras modificaciones que pueden ser empleadas. Por lo tanto, a modo de ejemplo, pero de forma no taxativa, se pueden utilizar configuraciones alternativas de las modalidades de la aplicación de acuerdo conforme a las indicaciones de la presente. Por consiguiente, las modalidades de la presente aplicación no se encuentran limitadas en forma tan precisa como se muestra y se describe.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo que comprende: (i) la provisión de una composición que comprende un agonista retinoide y (ii) la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición a un sujeto mamífero que necesita recibir tratamiento para neutropenia, inhibir la neutropenia, disminuir la gravedad de la neutropenia o promover la profilaxis de la neutropenia.
2. Un método para tratar la neutropenia asociada a la quimioterapia del cáncer en un sujeto que lo necesita, el que comprende: (i) la provisión de una composición que comprende un agonista retinoide y (ii) la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al sujeto para tratar la neutropenia asociada a la quimioterapia del cáncer, lo que resulta en el tratamiento de la neutropenia asociada a la quimioterapia del cáncer en el sujeto.
3. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la administración de un agente quimioterapéutico.
4. El método de la reivindicación 3 en el que el agente qui ioterapéutico y la composición que comprende un agonista retinoide son administrados en forma conjunta o secuencial.
5. Un método para tratar una infección bacteriana grave en un sujeto que lo necesita que comprende: (i) la provisión de una composición que comprende un agonista retinoide, (ii) la provisión de una composición que comprende un agente terapéutico antibacteriano y (iii) la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cada una de las composiciones al sujeto para tratar la infección bacteriana grave en el sujeto, y así tratar una infección bacteriana grave en el sujeto.
6. El método de la reivindicación 5 en el que la composición que comprende el agonista retinoide y la composición que comprende el agente terapéutico antibacteriano son administradas en forma conjunta o secuencial.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 en el que el agonista retinoide es administrado en forma intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, oral o mediante inhalación.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 en el que la cantidad eficaz de agonista retinoide es de alrededor de 0,1 a 0,5 mg/kg/día, 0,5 a 5 mg/kg/día, 5 a 10 mg/kg/día, 10 a 20 mg/kg/día, 20 a 50 mg/kg/día, 50 a 100 mg/kg/día, 100 a 200 mg/kg/día, 200 a 300 mg/kg/día, 300 a 400 mg/kg/día, 400 a 500 mg/kg/día, 500 a 600 mg/kg/día, 600 a 700 mg/kg/día, 700 a 800 mg/kg/día, 800 a 900 mg/kg/día o 900 a 1000 mg/kg/día.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 en el que el sujeto se selecciona del grupo que consiste en humanos, primates no humanos, monos, simios, perros, gatos, vacas, caballos, conejos, ratones y ratas.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 en el que el agonista retinoide es uno o más cualesquiera de tamibaroteno (AM80), CH55, ITYA (IT-YA-01115) o una combinación de ellos.
11. Un kit que comprende: (i) una cantidad de una composición que comprende un agonista retinoide e (ii) instrucciones para la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición a un sujeto mamífero que necesita recibir tratamiento para neutropenia, inhibir la neutropenia, disminuir la gravedad de la neutropenia, promover la profilaxis de la neutropenia, tratar la neutropenia asociada a la quimioterapia del cáncer o tratar una infección bacteriana grave.
12. Un método para identificar un agonista retinoide que comprende: (i) poner las células CD34+ en contacto con una molécula de interés, (ii) poner adicionalmente en contacto las células CD34+ y la molécula de interés con un antígeno para estimular una respuesta inmunitaria, y (iii) evaluar si el contacto en (ii) tiene como consecuencia una secreción aumentada de lactoferrina, LL-37 o una combinación de ellos, la que es indicativa de que la molécula de interés es un agonista retinoide.
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