CN104519879B - 使用类视色素激动剂治疗中性粒细胞减少症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗有需要的受试者中的中性粒细胞减少症的方法，所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物，以及对所述受试者施用有效量的所述组合物来治疗中性粒细胞减少症，从而治疗所述有需要的受试者的中性粒细胞减少症。

Description

使用类视色素激动剂治疗中性粒细胞减少症的方法
政府权利
本发明是根据基金号CA111440、CA120512和CA120512-02S1的政府资助来完成，每项基金号都是由国家卫生研究院授予。政府对本发明享有某些权利。
发明领域
本发明针对用于治疗、抑制、减轻和/或促进预防有需要的受试者中的中性粒细胞减少症的方法，所述方法包括施用类视色素(retinoid)激动剂，例如，他米巴罗汀(tamibarotene)。
背景
本文中引用的所有公布均以引用方式全部并入本文，就如同每个单独的公布或专利申请被明确地并单独地指示为以引用方式并入本文一般。以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息都是现有技术，或与目前要求保护的本发明有关，或并不承认明确或含蓄引用的任何公布是现有技术。
中性粒细胞是最常见的粒细胞，它构成多达70％的主要抵御病原体感染的循环白细胞。癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症是一种血液病，其标志是血流中的中性粒细胞数量大大降低。自从G-CSF首次用于通过促进HSC的粒细胞生成来治疗获得性和先天性中性粒细胞减少症1,2以来，已经有二十多年了。由于G-CSF的治疗指数低、其施用副作用以及恶性转化的风险，2由肿瘤中的化疗诱发的中性粒细胞减少症仍然是发病、死亡和医疗支出的主要来源。3,4最新研究显示，与PBN相比，由于在分化过程早期粒细胞生成异常，由来自CD34+细胞的G-CSF诱发的中性粒细胞的细菌杀灭削弱与成熟粒细胞的缺少相关联。5因此，成功地设计用于中性粒细胞减少症的更有效的治疗可能取决于确定粒细胞生成怎样与基于中性粒细胞的免疫的发展相协调。
类视色素激动剂Am806-8被设计用来通过其与类视色素受体α(RARα)，6,9,10的选择性结合改善全反式类视色素(RA)的副作用，RARα是一种由RA11,12激活从而调控白血病原始粒细胞和HSC粒细胞分化的转录因子。13-17RA是维生素A的天然形式，在身体发育中发挥重要作用并且诱导许多类型的正常和恶性细胞的分化。18-20迄今，急性早幼粒细胞白血病(APL)的RA治疗是在临床肿瘤学中成功的分化诱导治疗的最佳实例，21然而，与RA治疗有关的副作用通常是严重的并且RA抗性是常见的事件。22-24一些研究证明RARα调控Am80诱导的粒细胞分化。25-27此外，与在APL患者中用作分化治疗的RA或其它类视色素相比，Am80的有效性是大约10倍以上，而毒性更低。7,8,28目前，Am80已经在日本批准用于APL的治疗7,8并且在美国和欧洲对于一些其它癌症/疾病进行临床试验(http://www.cytrx.com/tamibarotene.html；http://clinicaltrials.gov)。使用Am80诱导粒细胞分化的进展提示我们作为一种增强来自于免疫发育期间粒细胞生成的中性粒细胞杀菌活性的方法来测试这种药剂。我们在这里报告，作为中性粒细胞分化和免疫发育的诱导剂，Am80具有比G-CSF显著更高的活性，这可能是借助于它通过调节CD66对CD18活化的不同作用促进HSC由来的粒细胞生成。
发明概述
本发明提供用于治疗、抑制和/或减轻有需要的受试者中的中性粒细胞减少症、急性细菌感染、癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症和/或各种形式的先天性中性粒细胞减少症的严重程度的方法。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物以及对所述受试者施用有效量的所述组合物以便治疗、抑制和/或减轻所述受试者中的中性粒细胞减少症的严重程度。所述方法还包括与本发明的组合物同时或依次施用其它治疗剂以便治疗、抑制和/或减轻所述受试者中的中性粒细胞减少症、急性细菌感染、癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症和/或各种形式的先天性中性粒细胞减少症的严重程度。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)或其组合中的任何一种或多种。
本发明还提供用于治疗、抑制和/或减轻有需要的受试者中的中性粒细胞减少症、急性细菌感染、癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症和/或各种形式的先天性中性粒细胞减少症的严重程度的药物组合物和试剂盒。所述药物组合物和试剂盒包含大量的类视色素激动剂。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。
附图简述
在参考图式中示出了示例性实施方案。本文公开的实施方案和各个图意图被视为说明性的而非限制性的。
根据本发明的各种实施方案，图1描绘Am80比G-CSF更有效地促进中性粒细胞分化同时类似地显示低毒性。(图1A)在用G-CSF处理6天对比9或12天的CD34+细胞中更好的粒细胞诱导与更低的单核细胞诱导有关。(图1B&图1C)较低浓度的Am80(2.5nM)比G-CSF产生更有效的粒细胞分化诱导(图1B)，同时显示更小的细胞毒性(图1C)。(图1D)在发现对于粒细胞分化最佳的条件下全面比较Am80和G-CSF。
根据本发明的各种实施方案，图2描绘Am80诱导的中性粒细胞(AIN)比G-CSF诱导的中性粒细胞(GIN)更有效地产生和分泌颗粒。(图2A)在大肠杆菌刺激时AIN对比GIN的乳铁蛋白的有效分泌。(图2B)AIN对比GIN对于LL-37的更强的产生和脱颗粒。(图2C)在GIN和AIN两者中进行大肠杆菌刺激时胞内MMP9数量增加但是脱颗粒不足。
根据本发明的各种实施方案，图3描绘未分选和分选的带有抗CD15抗体的AIN对于细菌清除比未分选和分选的GIN显示更高的能力。(图3A)展示单核细胞的定量(GIN)。(图3B)展示带状/分叶中性粒细胞GIN对比AIN的定量。(图3C&图3D)未分选和分选的GIN和AIN对于胞内细菌清除作用的比较。清除效率是从感染之后的胞内小室回收的活细菌数目测定的。
根据本发明的各种实施方案，图4描绘AIN比GIN具有明显更高的吞噬的和杀菌活性。(图4A-图4D)通过胞外细菌(图4A)、吞噬的细菌(图4B)、回收的胞内细菌(图4C)和杀灭的细菌(图4D)的数目测定的吞噬和杀菌活性。在45min实验中细菌数目有1.26±0.01倍的增加。*：GIN对比AIN，P<0.03至少。(图4E)在GIN、AIN和人外周血液中性粒细胞(PBN)中对感染之后的胞外细菌和原位杀灭的细菌定量。*：GIN对比AIN或PBN，P<0.003至少。
根据本发明的各种实施方案，图5描绘ATRA(RA)和新合成的类视色素激动剂Am80、CH55和IT-YA01115(IT-YA)的结构。
根据本发明的各种实施方案，图6描绘Am80比G-CSF和其它类视色素化合物更有效地诱导CD34+细胞的粒细胞形态分化。(图6A-图6B)RA在诱导粒细胞分化方面比G-CSF更高的效率(图A)与显著的细胞死亡有关(图6B)。CD34+细胞通过G-CSF诱导分化成粒细胞的较低效率与在第12天更高的单核细胞诱导有关(图6A)。(图6C-图6D)与RA和CH55相比，Am80(10nM)在诱导粒细胞分化方面具有相似的效率(图6A、图6C)，同时比G-CSF或IT-YA或CH55显示更低的单核细胞诱导(图6A、图6C)并且比RA和CH55的细胞死亡率更低(图6B、图6D)。
根据本发明的各种实施方案，图7描绘与用G-CSF处理的那些相比，AM80在粒细胞减少小鼠中诱导有竞争力的中性粒细胞恢复。(图7A)与不同剂量的Am80和G-CSF一起施用CPA后在第3天测定的中性粒细胞恢复分析的实验设计的说明。(图7B)在第3天从执行安乐死的对照小鼠收集外周血液(PB)并且使用Ficoll-paque(1.084)纯化PB中性粒细胞。(图7C)在第3天从用不同剂量的Am80或G-CSF处理的粒细胞减少小鼠恢复的白细胞(WBC)和中性粒细胞的分析。
根据本发明的各种实施方案，图8描绘在粒细胞减少小鼠中由Am80动员的中性粒细胞比G-CSF动员的那些显示更高的杀菌活性。(图8A)在第5天与用Am80或媒介物处理的小鼠相比G-CSF诱导明显加速的中性粒细胞恢复。(图8B)在第5天分析PB中性粒细胞。G-CSF对比Am80，P<1.2x 10-6；G-CSF对比对照，P<4.0x 10-5；G-CSF对比媒介物，P<8.2x 10-8；Am80对比媒介物，P<1.3x 10-6；Am80对比对照，P<0.016。(图8C)从不同小鼠的PB分离的中性粒细胞的吞噬和杀菌活性是通过将分离的中性粒细胞暴露于体外金黄色葡萄球菌之后的胞外细菌、吞噬的细菌和杀灭的细菌的数目来体现的。*胞外：AIN对比GIN，P<0.043；AIN对比C-MPBN，P<1.1x 10-4；MPBN对比C-MPBN，P<3.7X 10-4；GIN对比C-MPBN，P<0.049。*吞噬：AIN对比GIN，P<0.026；AIN对比C-MPBN，P<0.02；MPBN对比GIN，P<0.042；MPBN对比C-MPBN，P<0.003；GIN对比C-MPBN，P<0.009。*杀灭：AIN对比GIN，P<0.026；AIN对比C-MPBN，P<0.005；MPBN对比GIN，P<0.015；MPBN对比C-MPBN，P<0.003；GIN对比C-MPBN，P<0.009。(图8D)用G-CSF或Am80或媒介物刺激96小时之后WBC和中性粒细胞的加速恢复在第7天停止。(图8E)在第9天分析PB中性粒细胞。*G-CSF对比对照，P<0.005；Am80对比对照，P<3.9x 10-4；Am80对比媒介物，P<0.03；媒介物对比对照，P<0.03。(图8F)在第9天AIN比GIN具有明显更高的吞噬和杀菌活性，如同停止加速的中性粒细胞恢复之后48小时。*胞外：AIN对比GIN，P<0.02；AIN对比C-MPBN，P<0.007；MPBN对比GIN，P<0.04；MPBN对比C-MPBN，P<0.02。*吞噬：AIN对比C-MPBN，P<0.034；MPBN对比C-MPBN，P<0.043。*杀灭：AIN对比C-MPBN，P<0.034；MPBN对比C-MPBN，P<0.043。(图8G)体内数据显示在粒细胞减少小鼠中，Am80比G-CSF诱导显示更高杀菌活性的足够有效的中性粒细胞。将二十只C57BL6/J小鼠为实验随机分成4组。在第0天进行200mg/kg的环磷酰胺(CPA)的单个剂量的腹膜内注射。注射CPA 4hr之后连续施用3天Am80或G-CSF或媒介物。CPA注射48hr至60hr之后诱导了小鼠中性粒细胞减少症。腹膜内注射3x107个金黄色葡萄球菌16hr之后，在第3天进行实验。通过测定腹膜腔(图8G-i)和PB(图8G-ii)中的活胞外细菌的数目测定纯化的中性粒细胞的杀菌活性。活细菌的数目是从3ml PBS冲洗的腹膜液以及估计1.5ml总血浆计数的。腹膜腔中的活细菌的P值：Am80对比G-CSF，P<2.4x 10-8；对照对比G-CSF，P<4.7x 10-9；媒介物对比G-CSF，P<8.3x 10-3；Am80对比媒介物，P<3.1x 10-9；Am80对比对照，P<0.038。*图8G-iii的总活胞外细菌：Am80对比G-CSF，P<1.9x10-6；对照对比G-CSF，P<9.4x 10-9；媒介物对比G-CSF，P<6.5x 10-4；Am80对比媒介物，P<6.8x 10-7；对照对比Am80，P<3.8x 10-5。活细菌中的倍数变化在图8G-iv中展示。使用对照组中的活细菌作为1倍的标准。
发明详述
本文引用的所有参考文献都如同充分阐述一般以引用方式整体并入。除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；March,Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure第5版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)以及Sambrook和Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2001)为本领域技术人员提供本申请中使用的许多术语的一般指导。
本领域技术人员将认识到与本文所述的方法和材料类似或等效的可用于实施本发明的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所述方法和材料。出于本发明的目的，下文定义以下术语。
“有益的结果”可以包括，但决不限于，减轻或缓和所述疾病状态的严重程度、预防所述疾病状态恶化、治愈所述疾病状态、预防所述疾病状态发展、降低患者发展所述疾病状态的几率以及延长患者寿命或预期寿命。
如本文所用的“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，不加限制地包括人和非人灵长类动物，如黑猩猩以及其它猿和猴物种；家畜，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如犬和猫；实验室动物，包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。所述术语不指示特定年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿无论雄性或雌性都意欲包括在这个术语的范围内。
如本文所用的“中性粒细胞减少症”是指血液中的中性粒细胞水平低得异常。中性粒细胞减少症可能是由于白细胞的产生降低(例如，由于，包括但不限于影响骨髓的治疗剂、影响骨髓的遗传/先天性病症、再生障碍性贫血、癌症、放射治疗、维生素B12、叶酸或铜缺乏症和/或接触杀虫剂)。中性粒细胞减少症还可能是由于白细胞的破坏(例如，由于，包括但不限于急性细菌感染、某些自身免疫疾病、化疗治疗和/或治疗剂)。中性粒细胞减少症还可能是由于白细胞的隔离(sequestration)和/或迁移(例如，由于，包括但不限于血液透析、疟疾和/或细菌感染)。某些药物如氟卡尼(flecainide)、苯妥英(phenytoin)、吲哚美辛(indomethacin)、丙基硫氧嘧啶、卡比马唑(carbimazole)、氯丙嗪(chlorpromazine)、甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，复方新诺明)、氯氮平(clozapine)、噻氯平(ticlodipine)也可能导致中性粒细胞减少症。本发明的方法和组合物可以用于治疗、抑制、减轻由任何以上原因引起的中性粒细胞减少症的严重程度和/或促进其预防。本发明的方法和组合物还可以通过治疗、抑制、减轻中性粒细胞减少症的症状和/或促进其预防用于治疗、抑制、减轻由任何中性粒细胞减少症的以上原因引起的疾病状态的严重程度和/或促进其预防。
如本文所用的“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)针对的病理性病状、预防所述病理性病状、追求或获得有益的结果或降低个体发展所述病状的几率，即使治疗最终不成功。需要治疗的对象包括已经患有病状的对象，以及易患所述病状的对象或要预防所述病状的对象。
如本文所用的“治疗有效量”是指能够在患有中性粒细胞减少症的哺乳动物受试者中获得有益的结果的量。治疗有效量可以按个体确定并且将基于(至少部分地)对所述哺乳动物的生理特征、使用的输送系统或治疗技术的类型以及相对于疾病进展的施用时间的考虑。
虽然在促进人造血干细胞(HSC)的粒细胞生成的重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的治疗性使用中有进展，但是中性粒细胞减少症仍然是癌症化疗最严重的并发症之一。我们使用体外模型诱导原始CD34+造血细胞的粒细胞分化发现，Am80(他米巴罗汀，一种新的类视色素激动剂)在协调中性粒细胞分化和免疫发育中比G-CSF更有效。粒细胞产生、大肠杆菌感染和细菌杀灭的功能分析和原位成像显示，类似于人外周血液中性粒细胞(PBN)，Am80诱导的中性粒细胞(AIN)具有比G-CSF诱导的中性粒细胞(GIN)更高杀菌活性。不同于GIN但是类似于PBN，AIN增强的细菌杀灭与CD66抗原与整联蛋白β2亚基CD18更高的共表达有关。一致地，抗CD18抗体中和AIN的Am80诱导的杀菌活性。因此，与G-CSF相比，AIN似乎是提供促进中性粒细胞分化和杀菌活性的一种更有效的方法，这可能是通过协调CD66与CD18的功能相互作用以增强粒细胞生成期间中性粒细胞免疫的发育。本文中的这些发现为通过使用Am80作为划算的治疗选择设计针对中性粒细胞减少症的新的治疗提供分子理论。
因此，本发明提供用于治疗有需要的哺乳动物受试者中的中性粒细胞减少症的方法。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物以及对所述受试者施用治疗有效量的所述组合物以便治疗所述受试者中的中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
本发明还提供用于减轻有需要的哺乳动物受试者中的中性粒细胞减少症的严重程度的方法。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物以及对所述受试者施用治疗有效量的所述组合物以便减轻所述受试者中的中性粒细胞减少症的严重程度。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
本发明还提供用于抑制有需要的哺乳动物受试者中的中性粒细胞减少症的方法。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物以及对所述受试者施用治疗有效量的所述组合物以便抑制所述受试者中的中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
此外，本发明提供用于促进有需要的受试者中的中性粒细胞减少症的预防的方法。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物以及对所述受试者施用治疗有效量的所述组合物以便促进所述受试者中的中性粒细胞减少症的预防。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
本发明还提供用于治疗、抑制和/或减轻有需要的受试者中的癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症的严重程度。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物以及对所述受试者施用治疗有效量的所述组合物以治疗、抑制和/或减轻癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症的严重程度。所述方法还包括施用化学治疗剂。在一个实施方案中，所述化学治疗剂和所述包含类视色素激动剂的组合物是同时施用的。在另一个实施方案中，所述化学治疗剂和所述包含类视色素激动剂的组合物是依次施用的。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
化学治疗剂的实例包括但不限于放线菌素(Actinomycin)、阿利类视色素(Alitretinoin)、全反式类视色素、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、贝沙罗汀(Bexatotene)、博莱霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、西妥昔单抗(Cetuximab)、顺铂、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、埃罗替尼(Erlotinib)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(Idarubicin)、伊马替尼(Imatinib)、易普利单抗(Ipilimumab)、伊立替康(Irinotecan)、氮芥、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌(Mitoxantrone)、阿仑单抗(Ocrelizumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇、帕尼妥单抗(Panitumab)、培美曲塞(Pemetrexed)、利妥昔单抗(Rituximab)、他氟泊苷(Tafluposide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Tioguanine)、拓扑替康(Topotecan)、类视色素、戊柔比星(Valrubicin)、威罗菲尼(Vemurafenib)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、氟尿苷(Floxuridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、喷司他丁(Pentostatin)、丝裂霉素、伊沙匹隆(ixabepilone)、雌莫司汀(Estramustine)、泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)或其组合。
本发明还提供用于治疗、抑制、减轻有需要的受试者中的急性细菌感染的严重程度和/或促进其预防的方法。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物、提供包含抗细菌治疗剂的组合物以及对所述受试者施用治疗有效量的每种所述组合物以治疗、抑制、减轻所述受试者中的急性细菌感染的严重程度和/或促进其预防。在一个实施方案中，包含所述类视色素激动剂的组合物和包含所述抗细菌治疗剂的组合物是同时施用的。在另一个实施方案中，包含所述类视色素激动剂的组合物和包含所述抗细菌治疗剂的组合物是依次施用的。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
本发明还提供用于治疗、抑制、减轻有需要的哺乳动物受试者中的先天性中性粒细胞减少症(包括但不限于柯士文症候群(Kostmann syndrome)、周期性中性粒细胞减少症或Chediak Higashi)的严重程度和/或促进其预防的方法。所述方法包括提供包含类视色素激动剂的组合物以及对所述受试者施用治疗有效量的所述组合物以便治疗、抑制、减轻所述受试者中的先天性中性粒细胞减少症的严重程度和/或促进其预防。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
在一些实施方案中，需要本文中描述的组合物的哺乳动物受试者是白细胞产生减少的患者，所述白细胞产生减少是由(包括但不限于)影响骨髓的药物(如癌症药物、抗精神病药物、抗惊厥药物)、影响骨髓的遗传和/或先天性病症、进行放射治疗的患者、维生素B12缺乏症、叶酸缺乏症或其组合引起的。
在其它实施方案中，需要本文中描述的组合物的哺乳动物受试者是由于(包括但不限于)急性细菌感染、自身免疫病症(如系统性红斑狼疮)、使用磺胺药物或其组合造成的白细胞的量损失、破坏和/或减少的受试者。
在其它实施方案中，需要本文中描述的组合物的哺乳动物受试者是由于(包括但不限于)血液透析、疟疾、细菌感染或其组合进行白细胞(如中性粒细胞)的隔离和/或迁移的受试者。
在各种实施方案中，包含类视色素激动剂的本发明的组合物可以与包括但不限于化学治疗剂和/或放射治疗的其它治疗剂同时或依次施用。化学治疗剂和/或放射治疗往往会降低白细胞的数量，导致中性粒细胞减少症。与化学治疗剂和/或放射治疗同时或依次施用本发明的组合物可以抑制和/或减轻中性粒细胞减少症的严重程度。在各种实施方案中，包含类视色素激动剂的本发明的组合物是在施用化学治疗剂和/或放射治疗之前、期间或之后施用的。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
类似地，包含类视色素激动剂的组合物可以与抗惊厥和/或抗精神病药物同时或依次施用以便抑制和/或减轻由使用所述药物引起的中性粒细胞减少症的严重程度。在各种实施方案中，包含类视色素激动剂的本发明的组合物是在施用抗惊厥和/或抗精神病药物之前、期间或之后施用的。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
此外，包含类视色素激动剂的组合物可以与用于治疗急性细菌感染、真菌感染和/或自身免疫疾病的治疗剂同时或依次施用以便抑制和/或减轻可能由于细菌和真菌感染和/或自身免疫疾病和/或由于可以用于治疗细菌感染、真菌感染和/或自身免疫疾病的治疗剂发生的中性粒细胞减少症的严重程度。在各种实施方案中，包含类视色素激动剂的本发明的组合物是在施用用于治疗急性细菌感染、真菌感染和/或自身免疫疾病的治疗剂之前、期间或之后施用的。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。
在各种实施方案中，所述类视色素激动剂是通过静脉内、肌内、腹腔内、口服或通过吸入施用的。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀。
在各种实施方案中，所述类视色素激动剂的有效量是以下任何一种或多种：约0.01μg/kg/天至0.05μg/kg/天、0.05μg/kg/天至0.1μg/kg/天、0.1μg/kg/天至0.5μg/kg/天、0.5μg/kg/天至5μg/kg/天、5μg/kg/天至10μg/kg/天、10μg/kg/天至20μg/kg/天、20μg/kg/天至50μg/kg/天、50μg/kg/天至100μg/kg/天、100μg/kg/天至150μg/kg/天、150μg/kg/天至200μg/kg/天、200μg/kg/天至250μg/kg/天、250μg/kg/天至300μg/kg/天、300μg/kg/天至350μg/kg/天、350μg/kg/天至400μg/kg/天、400μg/kg/天至500μg/kg/天、500μg/kg/天至600μg/kg/天、600μg/kg/天至700μg/kg/天、700μg/kg/天至800μg/kg/天、800μg/kg/天至900μg/kg/天、900μg/kg/天至1000μg/kg/天、0.01mg/kg/天至0.05mg/kg/天、0.05mg/kg/天至0.1mg/kg/天、0.1mg/kg/天至0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至1mg/kg/天、1mg/kg/天至5mg/kg/天、5mg/kg/天至10mg/kg/天、10mg/kg/天至15mg/kg/天、15mg/kg/天至20mg/kg/天、20mg/kg/天至50mg/kg/天、50mg/kg/天至100mg/kg/天、100mg/kg/天至200mg/kg/天、200mg/kg/天至300mg/kg/天、300mg/kg/天至400mg/kg/天、400mg/kg/天至500mg/kg/天、500mg/kg/天至600mg/kg/天、600mg/kg/天至700mg/kg/天、700mg/kg/天至800mg/kg/天、800mg/kg/天至900mg/kg/天、900mg/kg/天至1000mg/kg/天或其组合。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、其类似物和/或盐。有效量的类视色素激动剂的典型剂量可以在已知治疗化合物使用的制造商推荐范围内，并且还通过体外响应或动物模型中的响应向本领域技术人员表明。此类剂量一般可以在浓度或量上降低最多约一个数量级而不丧失相关的生物活性。实际剂量可以取决于医师的判断、患者的病状以及治疗方法的有效性，所述治疗方法基于例如相关的培养细胞或组织培养组织样品(如活检恶性肿瘤)的体外响应或在适当的动物模型中观察到的响应。在各种实施方案中，包含所述类视色素激动剂的本发明的组合物可以每天一次(SID/QD)、每天两次(BID)、每天三次(TID)、每天四次(QID)或每天更多次施用，以便对所述受试者施用有效量的所述类视色素激动剂，其中所述有效量是任何一种或多种本文中描述的剂量。
本发明还提供用于鉴定类视色素激动剂的方法。所述方法包括用目标分子接触CD34+细胞，进一步使CD34+细胞和所述目标分子与抗原接触以刺激免疫应答并且评价CD34+细胞、所述目标分子和所述抗原之间的接触是否导致乳铁蛋白、LL-37或其组合的分泌增加。在一个实施方案中，乳铁蛋白、LL-37或其组合的分泌增加表明所述目标分子是类视色素激动剂。
可以用于鉴定是类视色素激动剂的化合物的试验包括但不限于微阵列试验、定量PCR、RNA印迹(Northern blot)试验、DNA印迹(Southern blot)试验、蛋白质印迹(Westernblot)试验免疫组织化学试验、结合试验、凝胶阻滞试验或使用酵母双杂交系统的试验。本领域技术人员可以容易地使用本领域已知的众多技术来确定特定的药剂/目标分子是否是类视色素激动剂。
在各种实施方案中，所述受试者选自由人、非人灵长类动物、猴、猿、犬、猫、奶牛、马、兔、小鼠和大鼠组成的组。
药物组合物
在各种实施方案中，本发明提供包含可药用的赋形剂以及治疗有效量的诸如他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)或其组合等类视色素激动剂的药物组合物。“可药用的赋形剂”是指适用于制备药物组合物的通常安全、无毒且合乎需要的赋形剂，并且包括可为兽医学用途以及人医药用途所接受的赋形剂。此类赋形剂可为固体、液体、半固体，或在气雾剂组合物的情况下可为气体。
在各种实施方案中，根据本发明的药物组合物可被配制来通过任何施用途径进行输送。“施用途径”可指本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、经鼻、经口、经粘膜、经皮、胃肠外或肠内。“胃肠外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊椎内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液或混悬液形式，或呈冻干粉末形式。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液或混悬液形式。通过经肠途径，医药组合物可呈片剂、凝胶胶囊、糖包衣片剂、糖浆、混悬液、溶液、粉末、颗粒剂、乳剂、允许控释的微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡形式。
根据本发明的药物组合物还可含有任何可药用的载体。如本文所用的“可药用的载体”是指涉及自身体的一种组织、器官或部分携带或运送目标化合物至身体的另一组织、器官或部分的可药用的物质、组合物或媒介物。举例而言，载体可为液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包载物质或其组合。载体的各组分必须是“可药用的”，因为它必须与配方的其它成分相容。它还必须适用于与它可能与之接触的任何组织或器官接触，这意味着它必须不携有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过度超过其治疗益处的任何其它并发症的风险。
根据本发明的药物组合物也可被包载、制片或以乳剂或糖浆形式制备以供口服施用。可添加可药用的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或有助于制备组合物。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、白土、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体还可以包括持续释放物质，如单独或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
药物制剂是遵循常规制药技术制备的，所述技术涉及研磨、混合、粒化和必要时压制(针对片剂形式)；或研磨、混合和填充(针对硬质明胶胶囊形式)。当使用液体载体时，制剂将呈糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水性混悬液形式。此类液体制剂可直接口服施用或填充至软质明胶胶囊中。
根据本发明的医药组合物可以以治疗有效量递送。精确的治疗有效量是就在给定受试者中的治疗疗效而言，组合物将产生最有效的结果的那个量。这个量将取决于多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药物动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质以及施药途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验，例如通过监测受试者对施用化合物的反应以及相应调整剂量来确定治疗有效量。对于其它指导，参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy(Gennaro编，第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。
本发明的试剂盒
本发明还提供用于在有需要的受试者中治疗中性粒细胞减少症、抑制中性粒细胞减少症、减轻中性粒细胞减少症或促进中性粒细胞减少症的预防的试剂盒。所述试剂盒包括：包含类视色素激动剂的组合物，和用于治疗、抑制和/或减轻有需要的受试者中的中性粒细胞减少症的严重程度、急性细菌感染、癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症和/或各种形式的先天性中性粒细胞减少症的组合物的使用说明书。在一些实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合。在一个实施方案中，所述类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM80)。
所述试剂盒是包括至少一种本发明组合物的材料或组分的集合。因此，在某些实施例中，所述试剂盒含有包含类视色素激动剂的组合物，所述类视色素激动剂诸如他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合(如上所述)。
本发明试剂盒中配置的组分的准确性质取决于所述试剂盒的预定目的。在一个实施方案中，所述试剂盒是特别针对人受试者配置的。在其它实施方案中，所述试剂盒被配置来用于治疗如但不限于家畜、家养动物和实验室动物的受试者的兽医学应用。
使用说明书可包括在试剂盒中。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述，以便治疗受试者中的中性粒细胞减少症、减轻其严重程度、抑制或预防。任选地，试剂盒还含有其它适用组分，如测量工具、稀释剂、缓冲剂、可药用的载体、注射器或将易于由本领域技术人员认识到的其它适用附件。
可向从业者提供试剂盒中组装的以保持材料或组分的可操作性和效用的任何便利和适合方式储存的材料或组分。举例而言，组分可呈溶解、脱水或冻干形式；它们可提供在室温、冷藏温度或冷冻温度下。组分通常包含于合适的包装材料中。如本文所用的短语“包装材料”是指一种或多种用于容纳试剂盒的内容物(如本发明组合物等)的物理结构。包装材料是通过熟知方法构造的，优选提供无菌、无污染物的环境。如本文所用的术语“包装”是指诸如玻璃、塑料、纸、箔等能够容纳个别试剂盒组分的合适的固体基质或材料。因此，例如，包装可以是用于含有合适的量的含有诸如他米巴罗汀(AM80)、CH55、ITYA(IT-YA-01115)中的任何一种或多种或其组合的类视色素激动剂的本发明组合物的小瓶。所述包装材料通常具有指示试剂盒和/或其组分的内容物和/或目的的外部标签。
实施例
实施例1
细胞和细胞培养
正常人原始脐带血CD34+细胞来自AllCells(Emeryville,CA)。按照制造商的流程，使用StemSpan无血清培养基(StemCell Technologies,Vancouver,Canada)经6天将CD34+细胞扩增29约50x。为了诱导粒细胞生成，用补充有25ng/ml G-CSF 17,29的中幼粒细胞培养基将CD34+细胞培养6天至12天。在粒细胞生成期间通过添加氢化可的松以及除去促红细胞生成素阻滞淋巴细胞和红细胞。17,29全反式类视色素(RA)购自Sigma(St.Louis,MO)，而类视色素激动剂Am80、CH55和IT-YA-01115(ITYA)都来自研究基金ITSUU实验室(东京,日本)。将各种类视色素化合物溶于乙醇。实验确定的条件，使用25ng/ml G-CSF17,29或2.5nMAm80用于粒细胞的6天诱导(图1)，应用于所述研究。
人PBN
外周静脉血依照洛杉矶儿童医院/南加利福尼亚州大学Keck医学院(CHLA/USC)委员会对临床研究批准的流程取自健康志愿者。向真空采血管凝固管(VacutainerCoagulation Tube)(BD Biosciences,San Jose,CA)中各抽取20ml血液并且在室温下用1体积HBSS稀释。将稀释的血液加载在10mL Ficoll-paque premium(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上并且在400xg离心40min。随后将收集的PBN红细胞层与15mL 3％葡聚糖T500(Sigma)混合以在室温下沉淀2hr。通过用无菌水低渗裂解18 sec除去红细胞，随后用离心收集富含PBN的层。通过用Wright-Giemsa染色进行形态分析测定，收集的PBN的纯度>95％。完成PBN分离之后立即在试验中使用新纯化的PBN。
细胞增殖和细胞死亡
如所述，细胞增殖是用标准血细胞计数器通过细胞计数确定的。17,29简单地说，在铺板72hr之后将一式三份铺板的相等数目的细胞计数最多13天。通过使用台盼蓝拒染法(trypan blue exclusion)，同时测定培养物中的细胞增殖及其相关的细胞死亡。
粒细胞分化的形态分析
将细胞悬浮液细胞离心到载玻片上，接着用甲醇固定并且按照描述用Wright-Giemsa(Sigma)染色。17,29在Zeiss Axioplan显微镜下评价分化的形态指标，并且按照描述用Adobe Photoshop平衡色彩。17
透射电子显微镜
通过电子显微镜实验室、病理学和实验室医学系、CHLA/USC的成员进行中性粒细胞和细菌感染的超微结构研究。操作在下面详细描述。
蛋白质印迹
按照描述进行免疫印迹(WB)。15分析中使用针对乳铁蛋白(Abcam,剑桥,UK)、MMP-9(Merck Chemicals,达姆施塔特,德国)和LL-37(Biolegend,圣地亚哥,CA)的抗体。
脱颗粒分析
在37℃下无血清DMEM培养基中将细胞在有或没有大肠杆菌DH5α(MOI为5；细胞与细菌的比例为1:5)的条件下孵育30min。通过3,000rpm离心7min收集细胞沉淀和上清液。用100μg/ml庆大霉素将细胞沉淀悬浮并且在37℃下孵育1hr，接着收集细胞并且提取细胞蛋白。用0.22μm过滤器(Pall corporation,安娜堡,MI)过滤上清液并且随后使用设计成收集质量大于3,000道尔顿的蛋白的Amicon Ultra-4离心过滤器单元(Millipore,比尔里卡,MA)浓缩上清液中的蛋白。使用Bio-Rad DC Protein Assay(赫苦斯,CA)测定蛋白的量。29通过WB平行分析有或没有大肠杆菌刺激条件下的颗粒蛋白水平的变化。
吞噬和细菌杀灭试验
在1.5ml管中用500μl培养基(含有10％FBS的DMEM)悬浮各自5x 105至2x 106新纯化的PBN以及体外诱导的GIN和AIN。在37℃下将细胞与对数期大肠杆菌(E.coli)DH5α(由合作者提供)或金黄色葡萄球菌(S.aureus；ATCC)以5或10的MOI孵育15、30和/或60min，而使用不存在细菌的细胞测定生长。在每个时间点将有或没有细胞的样品以1000rpm离心。从上清液收集不存在细胞的胞外细菌，并且通过在血琼脂上接种不同稀释物(各20μL)计数。在37℃下将从感染细菌的样品收集的细胞沉淀进一步与100μg/ml庆大霉素(Sigma)孵育1hr以杀灭外部细菌。随后将细胞冲洗两次并且用100μL的0.5％Triton X-100裂解。将从细胞裂解液回收的活细胞内细菌的不同稀释物等分试样(各20μL)接种在血琼脂上。按照描述通过CFU计数测定每个时间点的胞外和活细胞内细菌的数目，5,30而吞噬和杀灭的细菌数目基于胞外和活细胞内细菌的计数与无中性粒细胞条件中的相关细菌对照的数目。5,30
CD15+中性粒细胞的磁力分选
将悬浮在含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS中的细胞与缀合到磁性微珠(MiltenyiBiotec,Bergish Gladbach,德国)的抗CD15抗体混合以在4℃孵育30min。随后按照制造商的流程使用磁性分选机(Miltenyi Biotec,Bergish Gladbach,德国)纯化CD15+亚群。
统计分析
描述性统计学，包含平均值、标准偏差和极差，必要时是用学生未配对双侧t-测验计算和分析的。0.05或更小的P值认为是统计上显著的。
原位灭菌剂杀灭
将细胞与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌一起孵育15min和/或60min，接着通过1,000rpm离心5min收集细胞。用100μg/mL的庆大霉素将细胞沉淀悬浮并且在37℃下孵育1hr。冲洗三次之后，在4℃下用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)将细胞渗透20min。按照制造商的流程使用LIVE/DEAD BacLight Viability Kit(Life Technologies,格兰德岛,NY)，再次冲洗细胞并且在PBS中重新悬浮以标记细胞内的活的和死的细菌。将细胞旋涂在载玻片上并且在共焦显微镜下用氪/氩激光器的488和564nm波长下观察。具有完整的膜的荧光染料SYTO9染色的活细菌呈现绿色，而膜损坏的死细菌被荧光染料碘化丙啶(PI)染成红色。
细菌感染的免疫荧光检测
在37℃下将GIN、AIN和PBN与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌以MOI为10的条件下孵育15min和60min。在室温下将细胞用2％多聚甲醛固定20min，接着用含有5％正常山羊血清的PBS封闭30min。为了封闭感染之后保留在细胞表面上的细菌的OmpA抗原，首先在室温下将细胞与抗OmpA抗体一起孵育1hr，接着在室温下与HRP缀合的抗兔IgG抗体一起孵育30min以便封闭外部的一级抗体位点。彻底冲洗之后，用透化溶液(BD Biosciences)将细胞渗透20min，随后在室温下与抗OmpA抗体一起孵育1hr以标记细胞内细菌。将细胞与缀合到FITC的山羊抗兔IgG抗体一起孵育30min之后，就将细胞旋涂在载玻片上并且用vectashield抗褪色溶液(Vector laboratories,伯林盖姆,CA)固定。用共焦显微镜对FITC染色的细菌成像。
流式细胞术分析
抗人CD66-PE(识别CD66a、CD66c、CD66d和CD66e亚基)、CD11b-APC、CD18-FITC和CD66b-PE抗体以及它们对应的同种型均购自BD Biosciences。抗人CD66a-PE及其对应的同种型均购自R&D system(Minneapolis,MN)。数据是用FlowJo软件(版本7.6.5；Tree star,阿什兰,OR)获得和分析的。
实施例2
Am80比G-CSF更有效地促进中性粒细胞分化
Am80、CH55和ITYA是通过向RA样结构(图5)中引入杂原子合成的一组类视色素激动剂。因为所有这些激动剂都具有有效的类视色素活性，所以使用我们建立的方法，比较这些化合物与G-CSF和RA在从CD34+细胞诱导中性粒细胞生成方面的效率。17,29发明人证明G-CSF在诱导CD34+细胞到粒细胞的形态分化方面比RA有效性差，而伴随更高的单核细胞诱导(图6A)。然而，与RA相比，G-CSF诱导更高的细胞增殖以及更低的细胞死亡率(图6B)。在其它类视色素激动剂中，Am80(10nM)和CH55(5nM)在第13天促进>75％的粒细胞分化，相比之下ITYA(5nM)产生>60％的单核细胞(图6C)。虽然Am80和CH55都像RA那样(图6B)抑制细胞增殖(图6D)，与Am80处理有关的细胞死亡率低于对于CH55或RA观察到的死亡率(图6B、6D)。总之，这些数据显示与RA、CH55和Am80相比，G-CSF作为粒细胞分化的诱导剂有效性显著更差，而ITYA主要诱导单核细胞分化。虽然Am80、RA和CH55促进粒细胞分化的有效性类似，但是Am80诱导更低的细胞死亡率。
因为G-CSF在第12天诱导CD34+细胞分化成粒细胞的较低水平与单核细胞诱导的较高水平有关，所以G-CSF可以在短时间内更有效地诱导粒细胞分化。因此，用G-CSF将CD34+细胞处理6、9和12天。通过分析那些细胞的形态分化，发明人发现与第9天或第12天相比，在第6天有更有效的粒细胞分化同时具有最低的单核细胞诱导率(图1A)。使用这种最佳的6天诱导条件，比较G-CSF和Am80诱导CD34+细胞的粒细胞分化的能力。因为10nM的Am80诱导更多的细胞死亡(图6C)，在测试中替换降低的Am80浓度(2.5nM或5nM)。结果显示2.5nM的Am80不仅深深地诱导粒细胞分化同时具有可忽略的单核细胞诱导(图1B)，而且比5nM的Am80产生更低的毒性(图1C)。因此，这些结果表明对于G-CSF的6天最佳诱导期还适用于Am80(2.5nM)，提示我们对剩余的研究应用这种药物接触时间和药物剂量。
在早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞和带状中性粒细胞阶段到分叶成熟中性粒细胞阶段分析CD34+细胞的中性粒细胞分化。用G-CSF或Am80处理CD34+细胞6天。粒细胞形态分析显示中性粒细胞的连续发育充分地受Am80诱导。相比之下，G-CSF比带状和分叶中性粒细胞诱导更多的原始粒细胞以及早幼粒细胞和中幼粒细胞(图1D)。此外，G-CSF一贯地诱导单核细胞(约10％；图1A、1D)。这些结果显示Am80在诱导中性粒细胞形态分化方面比G-CSF更有效，而细胞毒性率相似。
AIN在产生和分泌颗粒方面比GIN更有效
在中性粒细胞分化期间，依次产生颗粒蛋白的异源种群并且储存在细胞质中用于针对不同病原体的一线防御。32,33发明人研究了Am80增强的中性粒细胞成熟是否与颗粒产生增加有关。通过透射电子显微镜分析由G-CSF和Am80从CD34+细胞诱导6天的中性粒细胞。超微结构图像显示，在分叶中性粒细胞水平下，GIN具有可变数目的往往含有低密度和非晶形物质的囊泡，以及很少的一级和二级样颗粒。相比之下，在AIN中发现的囊泡常常充满致密材料或充满非晶形材料和致密材料两者。与GIN相比，如同在PBN中观察到的，AIN含有增加数目的一级和二级样颗粒。因此，数据表明GIN和AIN之间的囊泡形成和颗粒产生有显著的区别。
发明人验证了Am80诱导的粒细胞分化是否确实与充足的颗粒产生有关，并且测试了AIN在细菌刺激时的脱颗粒能力。用G-CSF或Am80处理CD34+细胞6天。随后在有或没有大肠杆菌的条件下将所得的GIN和AIN孵育30min，接着从细胞裂解液和上清液提取蛋白。颗粒产生和分泌的WB分析显示，具有有效的广谱抗微生物活性的二级颗粒乳铁蛋白34,35储存在AIN中并且在细菌刺激时以充足的量分泌到培养基中。相比之下，虽然在GIN中乳铁蛋白的水平随细菌刺激而增加，但是GIN的乳铁蛋白分泌效率比AIN低得多(图2A)。类似地，在AIN中观察到高水平的二级颗粒LL-37，并且在细菌刺激时，LL-37颗粒被有效地释放到培养基中。另一方面，GIN显示同时缺乏LL-37产生和脱颗粒(图2B)。因此，AIN有效地产生和分泌乳铁蛋白和LL-37，而GIN不能。
即使在不存在大肠杆菌的情况下，GIN向培养基中分泌MMP-9(三级颗粒)，并且这种分泌受细菌刺激的抑制(图2C)。另一方面，虽然大肠杆菌增强AIN中的MMP-9表达，细菌刺激未能诱导AIN分泌MMP-9(图2C)。这些观察结果表明体外诱导的GIN和AIN中的MMP-9诱导或脱颗粒(或两者)可能有缺陷。
AIN比GIN具有显著更高的吞噬和杀菌活性
以上研究显示Am80在促进粒细胞形态分化和颗粒产生/分泌方面比G-CSF更有效(图1、2)。发明人测定了Am80诱导的这种更高程度的中性粒细胞分化是否转化成针对细菌感染的更强的中性粒细胞免疫。因为Am80比G-CSF诱导更多的带状和分叶中性粒细胞(图1)，所以测试了从GIN和AIN分选的带状和分叶中性粒细胞是否具有相似的杀菌活性。因为中性粒细胞是CD15+细胞，36所以使用缀合到磁性微珠的抗CD15抗体纯化GIN和AIN。纯化之后，未分选的GIN中的带状/分叶中性粒细胞的比例为21％，分选的GIN中的比例升高到63％，类似于在分选的AIN中观察到的(图3B)。此外，分选的GIN中的残余单核细胞的百分率只有约1％(图3A)。随后测试这些未分选和分选的GIN和AIN杀灭对数期大肠杆菌的能力，连同新分离/纯化的由>95％分叶中性粒细胞组成的PBN(图3B)。值得注意的是，CFU计数表明，与未分选的GIN相比只从PBN和未分选的AIN的细胞内小室回收少量活细菌(图3C)。正如未分选的GIN，分选的GIN与分选的AIN相比其杀灭细菌的能力也显著更小(图3D)。AIN中细菌清除的增强通过使用特异性识别大肠杆菌外膜的抗OmpA抗体对大肠杆菌进行原位标记得到证实。这些结果表明从Am80诱导的粒细胞生成升高的中性粒细胞分化的水平对针对细菌感染的有效的中性粒细胞免疫来说是必要的。这个观察结果得到具有分叶中性粒细胞形态的GIN仍然显示较低水平的颗粒样分子并且含有更高数目的低密度、非晶形囊泡的数据的支持。
针对细菌感染的先天免疫在中性粒细胞分化期间发育。为了比较AIN和GIN之间的这种功能，用G-CSF或Am80将CD34+细胞处理6天，接着分析吞噬和细菌杀灭。使用先前描述的方法，31,37将GIN、AIN和PBN与对数期大肠杆菌以5的MOI孵育15或60min，或在不存在中性粒细胞的情况下使用大肠杆菌监测细菌生长。通过在暴露于细菌的中性粒细胞的样品中进行CFU计数对胞外和回收的活细胞内细菌两者定量。随后通过从无中性粒细胞条件中的细菌数目分别只扣除胞外细菌或同时扣除胞外和胞内细菌计算吞噬和杀灭的细菌数目。PBN和AIN样品中的胞外细菌都显著减少(图4A、4B)。PBN在15min内迅速杀灭细菌，而到60min时在PBN或AIN样品中只有少数活的胞内细菌(图4C)。相比之下，GIN显示在感染60min时胞内细菌的清除大大削弱，保留更高水平的胞外细菌，并且细菌杀灭不足(图4A-D)。为了证实AIN具有比GIN更高的杀菌活性，使用SYTO9荧光染料标记的活细菌和碘化丙啶(PI)荧光染料标记的杀灭细菌两者的共焦显微镜研究了原位细菌杀灭。结果显示在GIN样品中有显著更多的存活大肠杆菌，和AIN或PBN样品中的观察结果对比，我们在其中发现的死细菌少得多。感染之后的胞外细菌以及原位死细菌两者的定量证实AIN和PBN都具有比GIN更高的杀菌活性(图4E)。此外，通过电子显微镜获得的大肠杆菌感染的超微结构图像显示在含有低密度囊泡的GIN中保留大量完整/存活细菌；而类似于PBN，在细胞质中含有致密囊泡连同一些一级和二级样颗粒的AIN中只发现少数完整/存活细菌。一起考虑，这些数据表明Am80诱导的粒细胞分化与针对细菌感染的中性粒细胞先天免疫增强有关。
实施例3
与G-CSF相比Am80诱导有竞争力的中性粒细胞恢复
将三十只C57BL6/J小鼠为实验随机分成六组。通过使用不同剂量的Am80和G-CSF分析中性粒细胞恢复的实验设计在图7A中说明。在第0天进行单个剂量的200mg/kg环磷酰胺(CPA)腹膜内注射以诱导中性粒细胞减少症。注射CPA 4hr之后连续施用3天Am80或G-CSF或媒介物。CPA注射48-60hr之后诱导了小鼠中性粒细胞减少症。在第3天进行实验。在第3天从执行安乐死的对照小鼠收集外周血液(PB)并且使用Ficoll-paque(1.084)纯化PB中性粒细胞。粒细胞形态分析显示，在较低水平的Ficoll paque中发现大部分中性粒细胞(图7B)。来自在第3天用不同剂量的Am80或G-CSF处理的粒细胞减少的白细胞(WBC)中性粒细胞恢复在图7C中展示。5mg/kg的Am80与250μgG-CSF相比它在较低水平的Ficoll-paque中显示有竞争力的中性粒细胞恢复。
实施例4
在粒细胞减少小鼠中由Am80动员的中性粒细胞比G-CSF动员的那些显示更高的杀菌活性
我们发现，与对照小鼠相比，注射CPA 3天之后在所有实验小鼠中出现WBC和中性粒细胞的剧烈减少(图8A)。此后迅速在第5天连续注射G-CSF或Am80或媒介物2天，与Am80相比G-CSF诱导明显加速的中性粒细胞恢复，而在媒介物组中的中性粒细胞计数也几乎回到对照值(图8A至8B)。如通过GIN样品所示，这些中性粒细胞是从不同组的小鼠(总共20只小鼠)的PB纯化的，并且用于分析针对体外金黄色葡萄球菌感染的杀菌活性。我们发现(图8C)，与从用媒介物处理的C-MPBN分离的中性粒细胞相比，MPBN、AIN或GIN都显著地清除胞外细菌，而AIN与GIN和C-MPBN两者相比在除去细菌方面明显更有效。类似于MPBN，AIN比GIN或C-MPBN吞噬和杀灭明显更多的细菌。因为加速的中性粒细胞恢复在第7天停止(图8D)，所以我们在第9天从不同小鼠的PB纯化中性粒细胞(图8E)以比较它们在终止加速中性粒细胞恢复之后的杀菌活性。结果显示，MPBN和AINs都仍然比C-MPBN表现出明显更高的杀菌活性，而在GIN和C-MPBN之间的吞噬或细菌杀灭没有差异(图8F)。这些发现证明与MPBN类似，Am80在粒细胞减少小鼠中动员的中性粒细胞针对金黄色葡萄球菌感染比G-CSF动员的那些明显更有效，即使在中性粒细胞恢复前期G-CSF可能诱导比Am80明显更多的中性粒细胞。此外，虽然在中性粒细胞恢复的后期C-MPBN计数达到比对照值明显更高的水平，但是C-MPBN的杀菌活性仍然比MPBN或AIN明显更低。
按照描述，使用单个剂量的CPA诱导的粒细胞减少小鼠模型，31, 32发明人检测了由Am80体内动员的中性粒细胞与G-CSF动员的那些相比是否确实具有针对细菌感染同样更强的中性粒细胞免疫，在体外模型中观察(图8A-F)。将二十只C57BL6/J小鼠为体内实验随机分成四组。在第0天施用200mg/Kg的量的CPA。在第0、1和2天施用250μg/Kg的G-CSF或5mg/Kg的Am80。在对数生长期中腹膜内接种3x 107金黄色葡萄球菌16hr之后，通过测定腹膜腔(图8G-i)和PB(图8G-ii)中的活胞外细菌数目分析纯化的中性粒细胞的杀菌活性。活细菌的数目是从3ml PBS冲洗的腹膜液以及估计1.5ml总血浆计数的。腹膜腔中的活细菌的P值：Am80对比G-CSF，P<2.4E-8；对照对比G-CSF，P<4.7E-9；媒介物对比G-CSF，P<8.3E-3；Am80对比媒介物，P<3.1E-9；Am80对比对照，P<0.038。图8A-iii展示来自图8G-i和8G-ii的总活胞外细菌。Am80对比G-CSF，P<1.9E-6；对照对比G-CSF，P<9.4E-9；媒介物对比G-CSF，P<6.5E-4；Am80对比媒介物，P<6.8E-7；对照对比Am80，P<3.8E-5。图8G-iv展示来自图8G-iii的活细菌中的倍数变化。使用对照组中的活细菌作为1倍的标准。
按照描述，使用单个剂量的CPA诱导的粒细胞减少小鼠模型，31,32发明人检测了由Am80体内动员的中性粒细胞与G-CSF动员的那些相比是否确实具有针对细菌感染同样更强的中性粒细胞免疫，在体内模型中观察(图8A)。我们发现，与对照小鼠相比，注射CPA 3天之后在所有实验小鼠中出现WBC和中性粒细胞的剧烈减少(图8B)。此后迅速在第5天连续注射G-CSF或Am80或媒介物2天，与Am80相比G-CSF诱导明显加速的中性粒细胞恢复，而在媒介物组中的中性粒细胞计数也几乎回到对照值(图8B-C)。这些中性粒细胞是从不同小鼠的PB纯化的，如通过GIN样品所示，并且用于针对体外金黄色葡萄球菌感染的杀菌活性的分析。我们发现(图8D)，与从用媒介物处理的C-MPBN分离的中性粒细胞相比，MPBN、AIN或GIN都显著地清除胞外细菌，而AIN与GIN和C-MPBN两者相比在除去细菌方面明显更有效。类似于MPBN，AIN比GIN或C-MPBN吞噬和杀灭明显更多的细菌。因为加速的中性粒细胞恢复在第7天停止(图8E)，所以我们在第9天从不同小鼠的PB纯化中性粒细胞(图8F)以比较它们在终止加速中性粒细胞恢复之后的杀菌活性。结果显示，MPBN和AIN都仍然比C-MPBN表现出明显更高的杀菌活性，而在GIN和C-MPBN之间的吞噬或细菌杀灭没有差异(图8G)。这些发现证明与MPBN类似，Am80在粒细胞减少小鼠中动员的中性粒细胞针对金黄色葡萄球菌感染比G-CSF动员的那些明显更有效，即使在中性粒细胞恢复前期G-CSF可能诱导比Am80明显更多的中性粒细胞。此外，虽然在中性粒细胞恢复的后期C-MPBN计数达到比对照值明显更高的水平，但是C-MPBN的杀菌活性仍然比MPBN或AIN明显更低。
本文中的研究证明通过Am80处理CD34+细胞在体外和体内产生的中性粒细胞不仅比G-CSF显示更高的分化成熟度，而且还对细菌感染有更高的疗效。这可能是通过协调CD66与CD18的功能相互作用从而增强源自粒细胞生成的中性粒细胞先天免疫的发育。进一步确定这种调控机制应该会提供对类视色素介导的粒细胞生成和中性粒细胞分化的新的认知。反过来，这又会为设计针对中性粒细胞减少症的有效疗法以及为用于输液治疗以降低中性粒细胞减少症持续时间的体外产生的粒细胞提供令人信服的分子基础，使用Am80作为划算的治疗分子。
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上述各种方法和技术提供若干实现本申请的途径。当然，应理解根据本文中描述的任何特定实施方案不一定可以实现所述的所有目标或优势。因此，例如，本领域技术人员将认识到，所述方法可以以实现或最优化如本文中教导的一个优势或一组优势的方式进行，而不一定需要实现本文中教导或指出的其它目标或优势。本文中提到多种替代方案。应理解，一些优选实施方案专门地包括一个、另一个或几个特征，而其它的实施方案专门地排除一个、另一个或几个特征，而又一些其它的实施方案通过包括一个、另一个或几个有利的特征而弱化特定的特征。
此外，本领域技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地，本领域的普通技术人员可以以各种组合使用上述各种元素、特征和步骤以及各个这样的元素、特征或步骤的其它已知等价物来执行根据本文中描述的原理的方法。在不同的实施方案中，所述各元素、特征和步骤中的一些将被专门地包括而其它的则被专门地排除。
虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本申请，但是本领域技术人员将理解，本申请的实施方案将专门公开的实施方案扩展到其它替代实施方案和/或用途以及其修改和等价物。
在一些实施方案中，在描述本申请的特定实施方案的环境(特别是在某些下列权利要求的环境中)中使用的术语“一个”和“一种”和“所述”和类似的引用可以理解为涵盖单数和复数。本文中列举的数值范围仅仅希望作为单独提及落入范围中的每个独立数值的简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独数值均并入在本说明书中，如同本文单独列举每个单独数值一样。可按任何适合的顺序来执行本文所述的全部方法，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。使用相对于本文中的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的目的仅仅是希望更好地阐明本申请而不对另外要求的本申请施加限制。不应该将说明书中的语言理解为表示对实践本发明必需的任何未要求的要素。
本文中描述了本申请的优选实施方案，包括发明人已知的实现本申请的最佳方式。通过阅读上述描述，那些优选实施方案的演变形式对普通技术人员而言将变得显而易见。预计本领域技术人员可以适当地使用这些演变形式，并且可以用本文中特定描述的其它方式实践本应用。因此，经适用的法律许可，本申请的许多实施方案包括在此附加的权利要求中叙述的所有标的物的改良形式和等价物。此外，除非另外在文中指出或明显与上下文矛盾，否则本申请涵盖所有可能的演变形式的上述元素的任何组合。
本文中提及的所有专利、专利申请、专利申请公布和其它材料(如论文、书籍、说明书、出版物、记录、事物和/或类似的东西)均在此通过引用的方式全部并入本文以达到所有目的，与上述文件相关的任何起诉文档记录、与本文件不一致或冲突的任何上述文件或对迟早与本文件相关的权利要求书的广泛范畴有限定作用的任何上述文件除外。举例来说，如果任何并入材料相关的与本文件相关的描述、定义和/或术语使用之间有任何不一致或冲突，那么本文件中的描述、定义和/或术语使用应该优先。
最后，应理解本文中公开的本申请的实施方案是本申请的实施方案的原理的说明。可以使用的其它修改可以在本申请的范畴之内。因此，举例来说，但不限制，可以根据本文中的教导使用本申请的实施方案的替代构造。因此，本申请的实施方案不严格限于如图所示和所述的实施方案。

Claims (13)

1.有效量的包含他米巴罗汀的组合物在制备用于治疗中性粒细胞减少症、抑制中性粒细胞减少症、降低中性粒细胞减少症严重程度或促进中性粒细胞减少症预防的药物中的用途，其中所述他米巴罗汀在受试者中诱导中性粒细胞的分化，并且所述中性粒细胞具有杀菌活性。
2.根据权利要求1的用途，其中所述药物用于治疗癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述药物与化学治疗剂联合使用。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述化学治疗剂和包含他米巴罗汀的所述组合物为被同时或依次施用的治疗剂型。
5.如权利要求1的用途，其中所述药物用于治疗与中性粒细胞减少相关的急性细菌感染。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述药物与抗细菌治疗剂联合使用。
7.如权利要求6所述的用途，其中包含他米巴罗汀的组合物和包含抗细菌治疗剂的组合物为被同时或依次施用的治疗剂型。
8.如权利要求1、2或5中任一项所述的用途，其中所述他米巴罗汀为被静脉内施用、肌内施用、腹腔内施用、口服施用或通过吸入施用的治疗剂型。
9.如权利要求1、2或5中任一项所述的用途，其中所述他米巴罗汀的有效量是0.1mg/kg/天至0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、5mg/kg/天至10mg/kg/天、10mg/kg/天至20mg/kg/天、20mg/kg/天至50mg/kg/天、50mg/kg/天至100mg/kg/天、100mg/kg/天至200mg/kg/天、200mg/kg/天至300mg/kg/天、300mg/kg/天至400mg/kg/天、400mg/kg/天至500mg/kg/天、500mg/kg/天至600mg/kg/天、600mg/kg/天至700mg/kg/天、700mg/kg/天至800mg/kg/天、800mg/kg/天至900mg/kg/天或900mg/kg/天至1000mg/kg/天。
10.如权利要求1、2或5中任一项所述的用途，其中所述受试者选自由人、非人灵长类动物、犬、猫、奶牛、马、兔、小鼠和大鼠组成的组。
11.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)一定量的包含他米巴罗汀的组合物；以及
(ii)对需要治疗中性粒细胞减少症、抑制中性粒细胞减少症、降低中性粒细胞减少症的严重程度、促进中性粒细胞减少症预防的哺乳动物受试者施用治疗有效量的所述组合物、并且其中所述他米巴罗汀在受试者中诱导中性粒细胞的分化、所述中性粒细胞具有杀菌活性的说明书。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述组合物用于治疗癌症化疗诱发的中性粒细胞减少症。
13.权利要求11的试剂盒，其中所述组合物用于治疗与中性粒细胞减少相关的急性细菌感染。
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