ES2276822T3 - Metodos y composiciones con analogos del g-csf. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido análogo al factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) humano que comprende la sustitución de un aminoácido de la secuencia del ID. de SEC. núm.: 2, seleccionada del grupo formado por: a) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición número 109, [His109]G-CSF; a) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición número 112, [His112]G-CSF; a) una sustitución de glutamina por histidina en la posición número 119, [His119]G-CSF; d) cualquiera de dichos análogos o subpartes (a-c) que incluyen opcionalmente un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

Description

Métodos y composiciones con análogos del G-CSF.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con composiciones de análogos polipeptídicos del factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"), con ácidos nucleicos relacionados y con vectores, células huésped y procesos para la producción mediante técnicas de DNA recombinante de dichos polipéptidos análogos del G-CSF. Además, también se describen composiciones farmacéuticas y métodos de utilización. Asimismo, algunos aspectos de la invención pueden generalizarse más allá de las composiciones de análogos de G-CSF.

Antecedentes de la invención

Muchos ligandos terapéuticos desencadenan respuestas celulares mediante su unión a receptores de superficie de la célula. El diseño de fármacos normalmente se centra en la capacidad de un ligando a unirse fuertemente y con especificidad a su diana prevista. No obstante, si el fármaco es una proteína y la diana un receptor de superficie celular, existen aspectos adicionales a tenerse en cuenta desde el punto de vista del análisis de sistema. Cuando los ligandos terapéuticos se unen a receptores situados en la superficie celular, se inicia una cascada de señalización intracelular que tiene como resultado final la respuesta celular apropiada. Asimismo, la modulación (generalmente, atenuación) de dichas señales empieza casi inmediatamente a través del tráfico celular de complejos ligando-receptor. Los complejos situados en la superficie de la célula son internalizados en vesículas que se fusionan con los compartimentos endosómicos. Desde los endosomas, las moléculas pueden ser dirigidas hacia la ruta de degradación de los lisosomas o intactas hacia la superficie de la célula para ser recicladas, donde el receptor libre o unido a ligando queda nuevamente expuesto y el ligando libre es liberado al medio extracelular. En el caso de los complejos en los que están implicados factores de crecimiento o citocinas, existen indicios recientes que sugieren que el que la célula dirija los complejos hacia una vía u otra está relacionado con la constante de afinidad endosómica de la interacción ligando-receptor. Los complejos que se mantienen unidos se degradan rápidamente; en cambio, aquellos que se disocian se reciclan [Lauffenburger et al., Chem. Biol. 5:R257-R263 (1998)]. En general, la disociación de los complejos en los endosomas parece ser que mejora el reciclado de receptores porque provoca que la interacción entre los receptores y los componentes de retención endosómicos se altere.

Además, para un pequeño número de complejos intracelulares, que es el caso de muchos sistemas de receptores de citocinas clínicamente importantes, los modelos indican una correlación positiva especialmente fuerte entre la inversa de la afinidad endosómica y la fracción de ligando reciclado [French and Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25:690-707 (1997)]. Así, si se puede diseñar un ligando que mejore la disociación endosómica después de su unión y de desencadenar la respuesta en su célula diana, el fármaco puede disminuir la inhibición del receptor, de manera que las células estarán más sensibles a la estimulación posterior por el ligando. La vida media y la eficacia del fármaco también pueden mejorarse si se aumenta el reciclado del ligando mediante disociación endosómica. Este hecho contrasta con el enfoque convencional de intentar mejorar la potencia del ligando a través de la mejora de su afinidad. Si la mejora de la afinidad extracelular se extiende al endosoma, dicho enfoque será, por tanto, contraproducente dado que incrementará la inhibición del receptor y la posible supresión del ligando. Así, el tráfico celular puede representar un cuello de botella para la mejora de la potencia del ligando, en especial en los casos en los que la degradación a través de endocitosis mediada por receptor es significativa.

Un sistema en el que la optimización de las propiedades del tráfico intracelular puede tener un profundo impacto en su potencia es el formado por el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) y su receptor (G-CSFR). El G-CSF es una citocina de 19 kDa que es uno de los factores de crecimiento hematopoyéticos, también conocidos como factores estimuladores de colonias. El G-CSF se utiliza para incrementar el recuento de leucocitos (neutrófilos) cuando los niveles plasmáticos de dichas células son peligrosamente bajos. Esto suele suceder cuando determinados antibióticos, tratamientos frente al VIH y quimioterapias suprimen la médula ósea. Un estudio reciente documenta que el G-CSF no solo incrementa el número de neutrófilos en la sangre, sino que también mejora su capacidad para matar [Vecchiarelli et al., J. Infect. Dis. 171:1448-1454 (1995)]. El G-CSF estimula específicamente la proliferación y diferenciación de células precursoras de neutrófilos en neutrófilos maduros [Fukunaga et al., Cell 74:1079-1087 (1993)] y es útil para el tratamiento de neutropenias [Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1526-1530 (1985); Souza et al., Science 232:61-65 (1986); Gabrilove, Sem. Hematol. 26(2):1-14 (1989)]. El G-CSF incrementa el número de granulocitos circulantes y se ha descrito que alivia la infección en modelos de sepsis. La adiministración de G-CSF también inhibe la liberación del factor de necrosis tumoral (TNF), una citocina importante en los daños tisulares durante la sepsis y el rechazo [Wendel et al., J. Immunol 149:918-924 (1992)]. El G-CSF es un miembro del Grupo 1 de la superfamilia de las citocinas, que se caracterizan por una estructura en haz con 4 hélices antiparalelas que incluyen otros fármacos terapéuticamente importantes como la eritropoyetina y la hormona del crecimiento. El G-CSF se une específicamente y con una elevada afinidad (K_{D} aparente \sim 100 pM) [Morstyn, Dexter, & Foote (eds.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) en: Clinical Practice, 2ª Ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1998)] al G-CSFR, dando como resultado un complejo ligando-receptor con una estequiometría de 2:2 [Horan et al., Biochemistry 35:4886-4896 (1996); Horan et al., J. Biochem. 121:370-375 (1997)]. La región extracelular de G-CSFR consta de un dominio de homología al receptor de citocina (CRH) de unión a ligando [Fukunaga et al., EMBO J. 10:2855-2865 (1991)] y, recientemente, se ha resuelto la estructura por cristalografía del G-CSF formando complejo con el dominio CRH del G-CSFR
y se ha mostrado la estequiometría esperada ligando-receptor 2:2 [Aritomi et al., Nature, 401:713-717 (1999)].

En los humanos, el G-CSF es detectable en plasma [Jones et al., Bailliere's Clin. Hematol. 2(1):83-111 (1989)]. Los fibroblastos, macrófagos, linfocitos T, trofoblastos, células endotiales y células epiteliales producen el G-CSF, que es el producto de expresión de un gen de copia única que consta de cuatro exones y cinco intrones localizado en el cromosoma 17. La transcripción de ese locus produce una especie de mRNA que se procesa de forma diferencial dando lugar a dos formas de mRNA de G-CSF, una que codifica una proteína de 177 aminoácidos y otra que codifica una proteína de 174 aminoácidos [Nagata et al., EMBO J. 5:575-581 (1986)]. Se ha descrito que la forma que consta de 174 aminoácidos posee una actividad biológica in vivo específica. El ID. de SEC. núm.: 1 representa un DNA que codifica un tipo de G-CSF de 174 aminoácidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos está representada en el ID. de SEC. núm.: 2. Los distintos tipos de G-CSF presentan reacción cruzada entre especies; por ejemplo, cuando se inyecta G-CSF humano en otros mamíferos como el ratón, el perro o el mono, se desencadena una leucocitosis por neutrófilos mantenida [Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7134-7138 (1987)].

El G-CSF humano se puede obtener y purificar de diversas fuentes. El G-CSF humano natural se puede aislar de los sobrenadantes de líneas celulares tumorales humanas. El desarrollo de la tecnología del DNA recombinante ha permitido la producción de cantidades de G-CSF en su forma glicosilada a escala comercial como producto de un sistema de expresión con huésped eucariótico. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense núm. 4 810 643 (Souza).

Se ha demostrado que el G-CSF es útil para el tratamiento de alteraciones en las que un incremento de los neutrófilos puede ser beneficioso. Por ejemplo, en los pacientes de cáncer, el G-CSF tiene efectos beneficiosos como una herramienta para estimular selectivamente la producción de neutrófilos y así compensar los déficits hematopoyéticos provocados por la quimioterapia o la radioterapia. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y alteraciones relacionadas, como la sepsis, que normalmente está causada por un metabolito de las bacterias. El G-CSF es útil, solo o en combinación con otros compuestos como otras citocinas, para el crecimiento o la expansión de células en cultivo (por ejemplo, para los trasplantes de médula ósea o para la expansión ex vivo). El G-CSF se ha administrado en pacientes trasplantados como un complemento para el tratamiento de infecciones o para el tratamiento de una neutropenia [Diflo et al., Hepatology 16:PA278 (1992); Wright et al., Hepatology 14:PA48 (1991); Lachaux et al., J.Ped. 123: 1005-1008 (1993); Colquehoun et al., Transplantation 56:755-758 (1993)]. Sin embargo, el G-CSF es eliminado rápidamente mediante endocitosis mediada por receptor por los neutrófilos periféricos y las células precursoras de la médula ósea que expresan el G-CSFR [Morstyn, Dexter & Foote (eds.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) en Clinical Practice, 2ª Ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1998)]. Así, la potencia del fármaco se reduce gracias a este mecanismo de retroalimentación negativa. Dado que las células expresan de forma natural pequeñas cantidades del G-CSFR, la disminución de la afinidad endosómica del complejo no solo puede reducir la regulación negativa del receptor, sino que también puede aumentar el reciclado del ligando, tal y como se predice con los modelos [French and Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25:690-707 (1997)]. Por tanto, el G-CSF es un candidato principal para la mutagénesis con el objetivo de mejorar las propiedades del tráfico intracelular y, por tanto, mejorar la potencia del fármaco.

Se han descrito diferentes G-CSF alterados. En el caso del diseño de fármacos, se sabe que determinados cambios generalmente provocan determinados efectos estructurales. Por ejemplo, la deleción de una cisteína puede provocar la desnaturalización de la molécula que, en su forma normal, se encuentra plegada mediante un puente disulfuro. Existen otros métodos conocidos por los expertos en la materia para añadir, delecionar o sustituir aminoácidos con el objetivo de cambiar la función de una proteína.

Se han preparado mutantes de G-CSF humana recombinante, pero el método de preparación no incluye la información completa de la relación estructura-función. Por ejemplo, se ha descrito la mutación y la modificación bioquímica de la Cys 18 [Kuga et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 159:103-111 (1989); Lu et al., Arch. Biochem. Biophys. 268:81-92 (1989)].

En la Patente Estadounidense núm. 4 810 643, titulada "Producción de Factor estimulador de colonias de granulocitos pluripotentes" (incorporada en las referencias del presente documento), se describen de forma general análogos polipeptídicos y fragmentos peptídicos del G-CSF. Los análogos G-CSF específicos descritos incluyen aquellos que presentan las cisteínas de las posiciones 17, 36, 42, 64 y 74 (de la proteína de 174 aminoácidos o de aquella que consta de 175 en la que el aminoácido adicional es una metionina N-terminal) sustituídas con otro aminoácido (como la serina), y el G-CSF con una alanina en la primera posición (N-terminal).

La Patente EP 0 335 423 titulada "G-CSF humano modificado" nos informa de la descripción de la modificación de al menos un grupo amino en el polipéptido con actividad hG-CSF.

La Patente EP 0 272 703 titulada "Nuevo polipéptido " nos informa de la descripción de derivados del G-CSF que poseen un aminoácido sustituído o delecionado en el N-terminal o en las regiones cercanas. Asimismo, Okabe et al. [Blood 75(9):1788-1793 (1990)], nos informan de modificaciones de cinco posiciones de la región N-terminal del G-CSF humano.

La EP 0 459 630 titulada "Polipéptidos" nos informa de derivados naturales del G-CSF que poseen al menos una de las propiedades biológicas del G-CSF normal y de una estabilidad en solución de al menos el 35% a 5 mg/ml en la que el derivado posee al menos la Cys^{17} de la secuencia salvaje remplazada por un residuo de Ser^{17}, y la Asp^{27} de la secuencia salvaje remplazada por una residuo de Ser^{27}.

La EP 0 256 843 titulada "Expresión del G-CSF y de muteínas del mismo y sus usos" nos informa de una secuencia de DNA modificada que codifica el G-CSF en el que el N-terminal está modificado para aumentar la expresión de la proteína en células huésped recombinantes, sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína.

La EP 0 243 153 titulada "Expresión de la proteína G-CSF humana" nos informa de la modificación de G-CSF al inactivar al menos un centro de procesamiento de la proteasa KEX2 de levadura para incrementar el rendimiento de la producción recombinante en levaduras.

Shaw, Patente Estadounidense núm. 4 904 584 titulada "Modificación homogénea específica de lugar de polipéptidos", nos informa de proteínas alteradas en lisina.

La patente WO/9012874 nos informa de variantes de la proteínas alteradas en cisteína.

El Documento de Solicitud de Patente Australiana núm. AU-A-10948/92 titulado "Activación mejorada de proteínas recombinantes" nos informa de cómo añadir aminoácidos a ambos extremos terminales de la molécula de G-CSF con el objetivo de facilitar el plegamiento de la molécula después de su expresión en organismos procariotas.

El Documento de Solicitud de Patente Australiana núm. AU-A-76380/91 titulado "Muteínas del factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF)" nos informa de muteínas del G-CSF en la secuencia Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile en las posiciones 50-56 del G-CSF de 174 aminoácidos y en las posiciones 53-59 del G-CSF de 177 aminoácidos, y al menos uno de los cuatro residuos de histidina de las posiciones 43, 79, 156 y 170 de la proteína G-CSF madura con 174 aminoácidos o en las posiciones 46, 82, 159 y 173 de la proteína G-CSF madura de 177 aminoácidos.

En la patente GB 2 213 821 titulada "Gen sintético del factor humano estimulador de colonias de granulocitos" se informa de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una G-CSF sintética que incorpora dianas de restricción para facilitar la mutagénesis por inserción de un casete en regiones concretas y que está flanqueada por dianas de restricción que facilitan la incorporación del gen dentro de un sistema de expresión seleccionado.

La Patente Estadounidense núm. 5 214 132 nos informa de la modificación del G-CSF humano en los aminoácidos de las posiciones 1, 3, 4, 5 y 17 [véase también, Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159:103-111 (1989)].

La Patente Estadounidense núm. 5 218 092 nos informa de la modificación del G-CSF humano en los aminoácidos de las posiciones 1, 3, 4, 5, 17, 145 y 147.

La Patente Estadounidense núm. 5 581 476 nos informa de la estructura tridimensional del G-CSF a escala atómica. A partir de dicha estructura tridimensional, se pueden pronosticar con una certeza sustancial cuales son los cambios en la composición de la molécula del G-CSF que pueden provocar cambios estructurales. Estas características estructurales se pueden correlacionar con la actividad biológica para diseñar y producir análogos del G-CSF.

Actualmente, no se conoce en detalle el proceso de transducción de señal, mecanismo mediante el que el G-CSF afecta al metabolismo celular. En general, el G-CSF se une al receptor de G-CSF situado en la superficie celular y lo activa mediante cambios conformacionales. Dicha unión, por tanto, inicia una cascada de señalización (p. ej., reclutando quinasas del dominio citoplasmáticas) que aparentemente inician cambios en el interior de células progenitoras concretas y que tienen como resultado respuestas celulares como la diferenciación, la proliferación y la migración. Se cree que el complejo G-CSF/G-CSFR experimenta procesos endocíticos de tráfico intracelular que lo internalizan y lo derivan hacia el reciclado o la degradación [Lauffenburger y Linderman, Receptors: Models for Binding, Trafficking and Signaling, New York: Oxford University Press (1993)].

La captación endocítica de G-CSF potencia la degradación proteolítica intracelular de la citocina en los compartimentos endosómico y lisosómico. Los receptores de citocina internalizados, si no se reciclan, pueden ser destruidos. Así, el tráfico intracelular endocítico puede causar la depleción del G-CSF del medio extracelular, así como la regulación negativa del receptor del G-CSF. Por consiguiente, sería beneficioso alterar la estructura del G-CSF de manera que conserve la capacidad de activación del receptor para la tansducción de señal, pero que disminuya la internalización endocítica o favorezca su reciclado en el endosoma y no su degradación [Lauffenburger et al., Scratching The (Cell) Surface: Cytokine Engineering For Improved Ligand/Receptor Trafficking Dynamics, Chem & Biol 5:R257-R263 (1988)].

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar mejores ligandos terapéuticos de G-CSF. Dichos agentes presentarían unos periodos de semivida mayores e inducirían una mayor proliferación celular si el ligando no fuese tan propenso a la endocitosis y a la posterior degradación en los lisosomas. Por consiguiente, es objeto de la presente invención proporcionar dichos ligandos y los métodos de preparación y ensayo de los mismos.

Resumen de la invención

En esta invención, se describe una estrategia para mejorar la potencia del G-CSF a través del diseño de mejoras en el tráfico intracelular. Se ha descubierto que las sustituciones de la presente invención tienen como resultado análogos del G-CSF que presentan efectos sobre el tráfico intracelular si se comparan con el G-CSF de ID. de SEC. núm.: 2 o con G-CSF recombinantes con un residuo de metionina en la posición -1 ("metG-CSF" O "r-met-HuG-CSF"). A menos que se indique lo contrario en el presente documento, dichos subtipos se denominan en conjunto de "tipo salvaje". Los efectos de dichas modificaciones presentan ventajas en cuanto a la estabilidad y la potencia que no muestran otros tipos de G-CSF. Concretamente, dichos análogos mejoran las respuestas celulares (actividad G-CSF tipo agonista). Dichos cambios en las respuestas celulares se producen al afectar la unión al receptor de G-CSF o a los procesos de derivación, reciclado y degradación a través de las vías de tráfico intracelular endocítico ligando-receptor.

La presente invención se refiere a polipéptidos análogos del G-CSF humano que presentan la sustitución de un aminoácido en la secuencia con ID. de SEC. núm.: 2, escogido del grupo formado por: 1) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición número 109, [His^{109}]G-CSF; 2) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición 112, [His^{112}]G-CSF; 3) la sustitución de glutamina por histidina en la posición número 119, [His^{119}]G-CSF; y 4) cualquiera de los análogos polipeptídicos mencionados, incluyendo opcionalmente el residuo de metionina N-terminal. De dichos análogos se pueden además obtener derivados con uno o más polímeros solubles en agua.

Por otro lado, la invención provee de polinucleótidos que codifican polipéptidos análogos al G-CSF humano descrito anteriormente. Actualmente, los polinucleótidos que se prefieren se encuentran descritos en las secuencias de DNA con ID. de SEC. núms.: 3, 5 y 7 (y sus cadenas complementarias), y se incluyen aquellas que codifican adicionalmente un residuo de metionina en el N-terminal.

En otro aspecto, la invención comprende un constructo de expresión que contiene uno de los polinucleótidos descritos anteriormente.

Además, la invención provee de una célula huésped que contiene uno de los polinucleótidos descritos anteriormente. Actualmente, se prefieren las células huésped escogidas del grupo formado por bacterias, células de mamífero, células tumorales, células de levaduras y células de insecto.

En otro aspecto, la presente invención describe un proceso para producir polipéptidos análogos de G-CSF [His^{109}]G-CSF, [His^{112}]G-CSF, [His^{119}]G-CSF y los tipos Met^{-1} de los mismos a partir de una célula huésped que contiene ácidos nucleicos que codifican dichos análogos. Este proceso comprende los siguientes pasos: el cultivo de dicha célula huésped, que contiene un polipéptido como los descritos anteriormente, en condiciones que faciliten la expresión de dichos polipéptidos; y la obtención de dicho polipéptido análogo al G-CSF.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que constan de un polipéptido análogo al G-CSF, tal como se ha descrito anteriormente, y un transportador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones se pueden utilizar en métodos de tratamiento de alteraciones hematopoyéticas, neurológicas o reproductoras que consisten en la administración de una cantidad eficaz de una composición como la antes descrita a un paciente que lo necesite. Entre dichas alteraciones se encuentran en las siguientes: reducción de la función hematopoyética, reducción de la función del sistema inmunitario, disminución del recuento de neutrófilos, reducción en la movilización de los neutrófilos, movilización de células progenitoras sanguíneas periféricas, sepsis, neutropenia crónica grave, trasplantes de médula ósea, enfermedades infecciosas, leucopenia, trombocitopenia, anemia, mejora de la funcionalidad de la médula ósea trasplantada, mejora de la recuperación de médula ósea tras la radioterapia, de la aplasia o mielosupresión de la médula ósea inducida por compuestos químicos o quimioterapia y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para sensibilizar a las células a la quimioterapia y la radioterapia que consiste en la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica tal como se ha descrito anteriormente a un paciente que la necesite.

La invención también proporciona un método para cultivar células hematopoyéticas in vitro que consiste en lo siguiente: la colocación de dichas células en un medio de cultivo apropiado, dicho medio de cultivo apropiado contiene un polipéptido análogo al G-CSF descrito anteriormente, y de proporcionar las condiciones apropiadas para el crecimiento de dichas células hematopoyéticas.

La invención también provee de un método tal como se ha descrito anteriormente en el que dichos tratamiento, sensibilización o cultivo incluyen el uso de al menos un factor adicional seleccionado entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGF-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, el ligando flt-3/flk-2 y un factor de crecimiento de fibroblastos. Por consiguiente, la invención provee de un equipo que contiene componentes para el cultivo de células hematopoyéticas que consta de: cualquiera de los análogos descritos anteriormente; los componentes apropiados para preparar medio para el cultivo de células hematopoyéticas; y, opcionalmente, al menos un factor adicional como los descritos anteriormente.

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto que el G-CSF es útil en el tratamiento de diversas alteraciones en las que un incremento de los neutrófilos tiene efectos beneficiosos. Por ejemplo, en los pacientes con cáncer el G-CSF tiene efectos beneficiosos ya que estimula selectivamente la producción de neutrófilos, compensando así los déficits hematopoyéticos provocados por la quimioterapia o la radioterapia. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y de alteraciones relacionadas, como la sepsis, que está normalmente causada por un metabolito de las bacterias. El G-CSF también es útil solo o en combinación con otros compuestos, como las citocinas, para el crecimiento y la expansión de las células en cultivo (por ejemplo, para el trasplante de médula ósea o la expansión ex vivo). El G-CSF se ha administrado en pacientes trasplantados como un complemento para el tratamiento de infecciones o para el tratamiento de neutropenia. Sin embargo, el G-CSF es eliminado rápidamente mediante endocitosis mediada por receptor por los neutrófilos periféricos y las células precursoras de la médula ósea que expresan el G-CSFR. Así, la potencia del fármaco se reduce gracias a este mecanismo de retroalimentación negativa. Dado que las células expresan de forma natural pequeñas cantidades del G-CSFR, la disminución de la afinidad endosómica del complejo no solo puede reducir la regulación negativa del receptor sino que también puede aumentar el reciclado del ligando, tal y como se predice con los modelos. Por tanto, el G-CSF es un candidato principal para la mutagénesis con el objetivo de mejorar las propiedades de tráfico intracelular y, por tanto, mejorar la potencia del fármaco.

La presente invención trata de nuevos polipéptidos análogos al G-CSF que presentan ventajas en cuanto a la estabilidad que no muestran otros tipos de G-CSF. Concretamente, dichos análogos mejoran las respuestas celulares (actividad G-CSF tipo agonista o superagonista) cuando se comparan con la proteína G-CSF de tipo salvaje. Dichos cambios en las respuestas celulares se producen al afectar la unión al receptor de G-CSF o a los procesos de derivación, reciclado y degradación a través de las vías de tráfico intracelular endocítico ligando-receptor.

Todos los cambios de análogos de la presente invención se basan en la secuencia de 174 aminoácidos del G-CSF de ID. de SEC. núm.: 2. Los expertos en la materia apreciarán que los análogos de la presente invención también pueden construirse con residuo de metionina N-terminal.

Los títulos de los apartados que se usan en el presente documento se utilizan únicamente con finalidades organizativas, y no deben interpretarse de ninguna manera como una limitación a las cuestiones consideradas.

A. Papel del G-CSF en el tratamiento de la neutropenia

Se ha descubierto que el G-CSF es útil en el tratamiento de diversas alteraciones en las que un incremento de los neutrófilos tiene efectos beneficiosos. Por ejemplo, en los pacientes con cáncer, el G-CSF tiene efectos beneficiosos ya que estimula selectivamente la producción de neutrófilos, compensando así los déficits hematopoyéticos provocados por la quimioterapia o la radioterapia. Otras indicaciones incluyen el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas y de alteraciones relacionadas, como la sepsis, que está normalmente causada por un metabolito de las bacterias. El G-CSF también es útil, solo o en combinación con otros compuestos como las citocinas, para el crecimiento y la expansión de las células en cultivo (por ejemplo, para el trasplante de médula ósea o la expansión ex vivo). El G-CSF se ha administrado en pacientes trasplantados como un complemento para el tratamiento de infecciones o para el tratamiento de la neutropenia [Diflo et al., Hepatology 16:PA278 (1992); Wright et al., Hepatology 14:PA48 (1991); Lachaux et al., J. Ped. 123:1005-1008 (1993); Colquehoun et al., Transplantation 56:755-758 (1993)].

El término "neutropenia" se refiere a la alteración en la que aparece un número anormalmente bajo de neutrófilos en la circulación periférica. Los neutrófilos provienen de la médula ósea y son completamente maduros cuando se liberan a la circulación. Entonces se preparan completamente para realizar su función como primera barrera de defensa celular. Estas células se activan, es decir son capaces de llevar a cabo muchas de sus funciones, al entrar en contacto con determinados mediadores proinflamatorios y con factores quimiotácticos que los atraen hacia el lugar donde existe el estímulo activador. Una neutropenia grave puede resultar una amenaza para la vida dado que puede provocar infecciones graves.

Por otro lado, el término "neutrofilia" se refiere a la alteración en la que aparece un número anormalmente alto de neutrófilos en la circulación periférica. La neutrofilia, o aumento del recuento de leucocitos, tiene diversas causas; entre ellas se encuentran las siguientes: frío y calor extremos, cirugía reciente, traumatismos, cualquier tipo de infección, quemaduras, shocks, tumores, inflamación no causada por infección (como la gota, artritis o problemas tiroideos) o fármacos.

B. Análogos del G-CSF de la presente invención

La presente invención abarca la producción de análogos de polipéptidos G-CSF de tipo salvaje y los polipéptidos que los codifican en los que: 1) la histidina sustituye al ácido aspártico en la posición 109, [His^{109}]G-CSF; 2) la histidina sustituye al ácido aspártico en la posición 112, [His^{112}]G-CSF; y 3) la histidina sustituye a la glutamina en la posición 119, [His^{119}]G-CSF, y los tipos Met^{-1} de los mismos. Las sustituciones antes mencionadas se presentan en función de la numeración del ID. de SEC. núm.: 2. Las secuencias de aminoácidos de esos tres análogos se pueden encontrar en los ID. de SEC. núms.: 4, 6 y 8, respectivamente. La presente invención abarca la producción de polipéptidos análogos al G-CSF humano que poseen una semivida más larga y una mayor potencia para estimular la proliferación celular en comparación con el G-CSF de tipo salvaje. Dichos cambios en las respuestas celulares se producen al alterarse la unión al receptor de G-CSF o a los procesos de derivación, reciclado y degradación a través de las vías de tráfico intracelular endocítico ligando-receptor.

Estos análogos se han desarrollado gracias a un marco informático general para el diseño de ligandos, utilizando sustituciones puntuales de histidina que actúan como un interruptor activado por pH que mejora sus propiedades de tráfico intracelular. La estrategia descrita en el presente documento se aprovecha de la diferencia de pH entre el medio extracelular y los compartimentos endosómicos como un interruptor de la protonación de la histidina para reducir la afinidad endosómica del complejo ligando-receptor. Se espera que ese hecho aumente el reciclado del ligando intacto hacia el medio extracelular.

La selección de residuos para mutarlos a histidina se realizó teniendo en cuenta consideraciones electrostáticas. Se realizó con la intención de crear análogos al G-CSF que se unieran al G-CSFR con una afinidad muy parecida (o incluso superior, si fuera posible) que la del ligando de tipo salvaje por las histidinas neutras, pero que se uniera con baja afinidad a las histidinas cargadas positivamente. En un pH ácido, la afinidad de unión disminuiría en comparación con la correspondiente en un pH neutro debido a la desprotonación de la histidina en el G-CSF no unido [Yang and Honig, J. Mol. Biol. 231:459-474 (1993)]. Si el pK_{a} de la histidina de la proteína no unida fuese 6,5 [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta 742:576-585 (1982)], tendría como resultado una afinidad 10 veces inferior a pH 5,5.

Las mutaciones a histidina candidatas se identificaron mediante un proceso in silico de tres fases. En primer lugar, la naturaleza de las interacciones de unión electrostáticas se cuantificaron utilizando un método [Kangas y Tidor, J. Chem. Phys. 109:7522-7545 (1998)] que analiza explícitamente la desolvatación e interacción del ligando, y localiza regiones de la interficie que son demasiado negativas o positivas para permitir una unión óptima. En segundo lugar, se construyeron los análogos de G-CSF con las histidinas de prueba (tanto neutras como cargadas positivamente) y se minimizó su energía. En tercer lugar, se calculó la energía libre de la unión electrostática para cada uno de ellos.

El concepto que se detalla en el presente documento implica nuevos mutantes del G-CSF que se han escogido de forma racional. La estructura cristalina del complejo formado por G-CSF y su receptor (G-CSFR) se utilizó para calcular el potencial electrostático neto en la interficie de unión principal entre el ligando y su receptor. Como candidatos para la mutagénesis se escogieron los residuos de aminoácidos del G-CSF que contribuían al potencial electrostático neto residual. El predominio de regiones demasiado negativas indica una densidad de carga negativa excesiva, incluyendo las localizaciones correspondientes a los residuos cargados G1u^{19}, Asp^{109} y Asp^{l12}, así como los residuos polares Gln^{20}, Thr^{116} y Gln^{119}, indicando que existe una densidad de cargas positivas correspondiente que es insuficiente en el receptor. Las contribuciones electrostáticas a la unión pueden mejorarse disminuyendo la carga negativa del ligando en esos seis lugares. La histidina neutra puede tolerarse en el complejo, pero la histidina cargada positivamente podría repeler la densidad de cargas positivas del receptor. Para comprobar esos lugares, se construyeron por ordenador mutantes de histidina individuales con los residuos identificados.

Mediante la estructura cristalográfica tridimensional del complejo formado por G-CSF y su receptor (G-CSFR) se puede calcular el potencial electrostático neto en la interficie principal de unión entre ligando y receptor. Véase la Patente Estadounidense núm. 5 581 476 (incorporada en las referencias del presente documento) y Aritomi et al., Nature 401(6754):713-718 (1999). Se escogieron como candidatos para la mutagénesis a los residuos de aminoácidos en el G-CSF que contribuían al potencial electrostático neto residual. Se identificaron seis de dichos residuos del G-CSF: Asp^{112}, Asp^{109}, Gln^{119}, Gln^{20}, Thr^{116} y Glu^{19}. Concretamente, se han realizado y analizado tres de las sustituciones puntuales de histidina propuestas: Asp^{109}His([His^{109}]G-CSF), Asp^{112}His([His^{112}]G-CSF) y Gln^{119}His([His^{119}]G-CSF) (utilizando la numeración del ID. de SEC. núm.: 2 con metionina en la posición -1).

El fundamento en el que se basa la mutagénesis con histidina del G-CSF consiste en alterar el tráfico intracelular del G-CSF o del G-CSFR. Tras la unión al G-CSFR en la superficie de la célula, el G-CSF es internalizado hacia el interior de la célula y la derivación se realiza en las vesículas endosómicas. Los componentes del complejo pueden ser tanto degradados en los lisosomas como reciclados nuevamente hacia la superficie intactos. Se sabe que en otros muchos sistemas de ligando-receptor, cuando el ligando y el receptor se mantienen formando el complejo, estos son preferentemente degradados; no obstante, si el complejo se disocia en los endosomas se aumenta el reciclado del ligando o del receptor. En la superficie de la célula, el pH del ambiente es aproximadamente de 7; en los endosomas, el pH se sitúa en alrededor de 5,0 a 6,0. Dado que el aminoácido histidina es el único residuo que se espera que se protone en ese intervalo de pH, se espera que la sustitución por histidina afecte a las propiedades de tráfico intracelular. Más concretamente, los mutantes puntuales de histidina alteran las propiedades de tráfico intracelular sobre la base de las diferencias en la energía libre de unión electrostática entre el pH 7,0 y el pH 5,0 provocadas únicamente por la protonación a pH 5,0 de la histidina mutada.

En la presente invención, se contempla específicamente la mutagénesis específica de lugar de las secuencias genómica, de cDNA o de DNA sintético del polipéptido G-CSF de tipo salvaje. Actualmente, las secuencias de polinucleótidos que se prefieren en la presente invención incluyen las secuencias de DNA de ID. de SEC. núm: 3 [His^{109}]G-CSF; ID. de SEC. núm.: 5 [His^{112}]G-CSF; e ID. de SEC. núm.: 7 [His^{119}]G-CSF; y los tipos con Met^{-1} de los mismos. Estas secuencias de DNA también pueden ser modificadas para que codifiquen otra versión del G-CSF que tenga al menos una de las propiedades biológicas hematopoyéticas del G-CSF humano que se encuentra de forma natural. Preferiblemente, la propiedad biológica es la capacidad de unión al receptor de G-CSF; no obstante, otra propiedad biológica es la capacidad de estimular la proliferación de células hematopoyéticas. Otras propiedades biológicas serán evidentes para los expertos en la materia (Véase, también, Souza, supra).

Estas secuencias de DNA pueden incorporar codones que faciliten la transcripción y la traducción de mRNA en huéspedes microbianos. Dichas secuencias sintéticas pueden construirse fácilmente según métodos muy conocidos en el campo. Véase, también, Alton et al., solicitud de PCT publicada WO 83/04053. Las moléculas de DNA anteriores pueden codificar opcionalmente un residuo de metionina N-terminal.

Las secuencias de DNA proporcionadas por la invención son útiles en la generación de vectores de DNA virales y plasmídicos nuevos y útiles; células huésped eucariotas y procariotas transfectadas y transformadas nuevas y útiles (como bacterias, levaduras y células de mamífero en cultivo); y nuevos y útiles métodos de cultivo celular para dichas células huésped capaces de expresar los análogos del G-CSF considerados aquí. Las secuencias de DNA presentes en este documento que codifican análogos activos del G-CSF (o sus RNA correspondientes) pueden utilizarse en terapia génica en los casos en los que se compensaría una producción insuficiente del G-CSF o fuese necesario aumentar los niveles de G-CSF.

La presente invención también proporciona procesos para la producción de DNA recombinante de los análogos del G-CSF considerados. Se proporciona un proceso para producir los análogos del G-CSF en una célula huésped que contiene los ácidos nucleicos que codifican dichos análogos, que consta de los siguientes pasos: a) el cultivo de dicha célula huésped que contiene el ácido nucleico que codifica dicho análogo de G-CSF bajo condiciones que faciliten la expresión de dichas moléculas de DNA, y b) la obtención de dichos análogos del G-CSF.

Opcionalmente, se pueden purificar y aislar dichos análogos de G-CSF de otros componentes obtenidos durante el proceso. Se pueden encontrar los métodos de purificación en la Patente Estadounidense núm. 5 849 883. Existen otros métodos muy conocidos en el campo (véase, también, Souza, supra).

Las células huésped pueden ser procariotas o eucariotas y se incluyen bacterias, células de mamífero (como las células de ovario de hámster chino [CHO], células de mono, células de riñón de hámster, células cancerosas u otros tipos de células), células de levaduras y células de insecto. Se prefiere la utilización de células huésped bacterianas para la producción comercial debido a la facilidad de manejo.

C. Producción de proteína

Dada la descripción anterior de polipéptidos análogos del G-CSF humano, un experto en la materia será capaz de producir polipéptidos análogos al G-CSF humano mediante la síntesis automática de péptidos, técnicas de DNA recombinante o ambos sistemas.

Los análogos del G-CSF humano de la invención pueden sintetizarse en solución o en soporte sólido según las técnicas convencionales. Diversos sintetizadores automáticos están disponibles comercialmente y se pueden utilizar según protocolos conocidos. Véanse, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tarn et al., J. Am. Chem. Soc. 105:6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-347 (1986); y Barany y Merrifield, The Peptides Gross y Meienhofer (eds.), Academic Press, New York, 1-284 (1979)). La proteína activa se puede sintetizar fácilmente en ensayos de cribado diseñados para identificar péptidos reactivos.

Como alternativa, se pueden utilizar una serie de sistemas huésped/vector que contengan y expresen una secuencia que codifica un análogo del G-CSF humano. Entre ellos se encuentran los siguientes: microorganismos como las bacterias transformados con bacteriófagos recombinantes, plásmidos o cósmidos como vectores de expresión de DNA; levaduras transformadas con vectores de expresión para levaduras; sistemas basados en células de insecto infectadas con vectores de expresión víricos (p. ej., baculovirus); sistemas basados en células de plantas transfectadas con vectores de expresión víricos (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión bacterianos (p. ej., los plásmidos pBR322 y Ti); y sistemas basados en células animales. Entre las células de mamífero que resultan útiles como sistemas de producción de proteínas recombinantes se encuentran las siguientes: células VERO, células HeLa, línea celular de ovario de hámster chino (CHO), células COS (como las COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293. Más adelante se describen en este documento ejemplos de protocolos para la expresión recombinante.

Se puede utilizar un sistema basado en levaduras para generar los análogos del G-CSF humano de la presente invención. La región codificante del cDNA del análogos del G-CSF humano se amplifica por PCR. Se amplifica un DNA que codifica la secuencia líder pre-pro-alfa de levaduras a partir de DNA genómicos de levadura en una reacción PCR con un cebador complementario a los nucleótidos 1-20 del gen del factor de conjugación alfa y otro cebador complementario a los nucleótidos 255-235 de dicho gen (Kurjan y Herskowitz, Cell 30:933-943 [1982]). Los fragmentos de la secuencia codificante líder pre-pro-alfa y de la secuencia codificante del análogo del G-CSF humano se ligan en un plásmido que contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa de levaduras (ADH2), de manera que el promotor dirige la expresión de la proteína de fusión formada por el factor pre-pro-alfa y el polipéptido maduro del análogo al G-CSF humano. Tal como se describe en (Meth. Enz. 185:234-279, Goeddel (ed.), Academic Press, Inc., San Diego, CA [1990]), el vector también incluye un terminador en dirección 3' al lugar de clonación, el origen de replicación "2 micras" de levadura, el gen de levaduras leu-2d, los genes de levaduras REP1 y REP2, el gen beta-lactamasa de E. coli y el origen de replicación de E.coli. Los genes de levaduras de la lactamasa y leu-2d permiten seleccionar las bacterias o las levaduras, respectivamente. El gen leu-2d también facilita que se aumente el número de copias del plásmido en las levaduras para incrementar los niveles de expresión. Los genes REP1 y REP2 codifican proteínas implicadas en la regulación del número de copias del plásmido.

El constructo de DNA descrito en el párrafo anterior se utiliza para transformar células de levaduras mediante un método conocido, p. ej., el tratamiento con acetato de litio (Stearns et al., Meth. Enz. 185:280-297 [1990]). El promotor ADH2 es inducido hasta el agotamiento de glucosa en el medio de culivo (Price et al., Gene 55:287 [1987]). La secuencia pre-pro-alfa produce la secreción de la proteína de fusión por parte de las células. Además, la proteína de levaduras KEX2 escinde la secuencia pre-pro de los análogos maduros del G-CSF humano (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330-5334 [1984]).

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De forma alternativa, los análogos del G-CSF humano se pueden expresar con técnicas de DNA recombinante en levaduras utilizando un sistema de expresión disponible comercialmente, p. ej., el Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), según las instrucciones suministradas por el fabricante. Este sistema también se basa en que la secuencia pre-pro-alfa dirija la secreción, pero la transcripción del inserto está dirigida por el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) tras su inducción con metanol.

El análogo del G-CSF humano secretado se purifica del medio de cultivo de las levaduras mediante, p. ej., métodos utilizados para purificar el análogo del G-CSF humano en los sobrenadantes de células bacterianas o de mamífero.

De forma alternativa, el cDNA que codifica análogos del G-CSF humano se pueden clonar en el vector de expresión baculovirus pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Este vector que contiene un análogo del G-CSF humano se usa según las instrucciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio sF9 sin proteínas para la producción de proteínas recombinantes. La proteína se purifica y se concentra a partir del medio utilizando columnas de Sefarosa-heparina (Pharmacia, Piscataway, NJ) y columnas secuenciales de peso molecular, y se resuspende en PBS. El análisis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) muestra una banda única y confirma el tamaño de la proteína, y la secuenciación Edman en un Proton 2090 Peptide Sequencer confirma su secuencia N-terminal.

De forma alternativa, los análogos del G-CSF humano se pueden expresar en sistemas basados en células de insecto. Los expertos en la materia conocen muy bien la utilización de estos sistemas para la expresión de proteínas. En uno de dichos sistemas, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica como vector de expresión de genes exógenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia codificante del análogo del G-CSF humano se clona en una región no esencial del virus, como el gen de la polihedrina, y se coloca bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción correcta del análogo del G-CSF inactivará el gen de la polihedrina y producirá virus recombinantes sin la cubierta proteica. Estos virus recombinantes se utilizan para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa el análogo del G-CSF humano (Smith et al., J. Virol. 46:584 (1983); Engelhard EK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-7 [1994]).

En otro ejemplo, la secuencia de DNA que codifica la forma madura de la proteína se amplifica por PCR y se clona en un vector apropiado, p. ej., pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ). El vector pGEX está diseñado para producir proteínas de fusión que presenten la glutatión-S-transferasa (GST), codificada en el vector, y una proteína codificada por un fragmento de DNA insertado en sitio de clonación del vector. Los cebadores para la PCR se pueden producir de manera que incluyan, p. ej., un sitio de escisión apropiado.

Entonces, la proteína de fusión recombinante se puede escindir de la porción GST de la proteína de fusión. El constructo pGEX-3X/análogo del G-CSF humano se utilizan para transformar células de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA), y las células tranformadas individuales se aislan y se hacen crecer. Los plásmidos de DNA de las células transformadas se purifican y se secuencian parcialmente con un secuenciador automático para confirmar la inserción del gen que codifica al análogo del G-CSF humano en la orientación correcta.

Pese a que algunas realizaciones de la presente invención contemplan la producción de las proteínas análogas del G-CSF humano utilizando sintetizadores de péptidos sintéticos, el posterior análisis por FPLC, y el correcto plegamiento de los dobles enlaces de cisteína, también se contempla la posibilidad de utilizar la producción de proteínas recombinantes para producir las composiciones de péptidos análogos del G-CSF. Por ejemplo, la inducción de proteínas de fusión GST/análogo del G-CSF humano se consigue haciendo crecer el cultivo transformado de XL-1 Blue a 37ºC en medio LB (complementado con carbenicilina) hasta una densidad óptica de 0,4 a 600 nm, seguido de una incubación posterior de 4 horas en presencia de 0,5 mM de isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

La proteína de fusión, que se espera que aparezca en las bacterias en forma de cuerpos de inclusión insolubles, se puede purificar según el método descrito a continuación. Las células se recogen por centrifugación; se lavan en NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; y se tratan con lisozima 0,1 mg/ml (Sigma Chemical Co.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El lisado se sonica y los restos celulares se precipitan mediante una centrifugación de 10 minutos a 12 000 x g. El precipitado que contiene la proteína de fusión se resuspende en Tris 50 mM, pH 8, y EDTA 10 mM colocado sobre glicerol al 50% y centrifugado a 6000 x g durante 30 min. El precipitado se resuspende en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) estándar sin Mg^{++} ni Ca^{++}. La proteína de fusión se purifica posteriormente mediante el fraccionamiento del precipitado resuspendido en gel de poliacrilamida desnaturalizante con SDS (Sambrook et al., supra). El gel se empapa en KCl 0,4 M para visualizar la proteína que se escinde y electroeluye en un tampón de desplazamiento en gel sin SDS. Si la proteína de fusión GST/análogo del G-CSF humano se obtiene en bacterias en forma de proteína soluble, se puede purificar utilizando el GST Purification Module (Pharmacia Biotech).

La proteína de fusión puede ser sometida a digestión para escindir la GST de la proteína análoga al G-CSF humano madura. La reacción de digestión (20-40 \mug de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana [4000 U/mg {Sigma} en 0,5 ml de PBS]) se incuba entre 16 y 48 horas a temperatura ambiente y se carga en un gel desnaturalizantes SDS-PAGE para fraccionar los productos de la reacción. El gel se empapa en KCl 0,4 M para visualizar las bandas de las proteínas. La identidad de cada banda de proteína que se corresponde con el peso molecular esperado del análogo al G-CSF humano puede confirmarse mediante el análisis parcial de la secuencia de aminoácidos utilizando un secuenciador automático (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA).

De forma alternativa, la secuencia de DNA que codifica la secuencia esperada de la proteína análoga al G-CSF humano madura se puede clonar en un plásmido que contiene el promotor deseado y, opcionalmente, una secuencia líder (véase, por ejemplo, Better et al., Science 240:1041-43 [1998]). La secuencia de este constructo se puede confirmar mediante secuenciación automática. Entonces, el plásmido se utiliza para transformar células de E. coli, cepa MC1061, utilizando procedimientos estándar basados en la incubación con CaCl_{2} y el tratamiento por shock térmico de las bacterias (Sambrook et al., supra). Las bacterias transformadas se hacen crecer en medio LB complementado con carbenecilina, y la producción de la proteína expresada se induce al hacerlas crecer en un medio apropiado. Si está presente, la secuencia líder afectará a la secreción de la proteína análoga al G-CSF humano madura y será escindida durante la secreción.

La proteína recombinante secretada se purifica del cultivo bacteriano mediante el método descrito posteriormente en el presente documento.

Los expertos en la materia también conocen bien los sistemas basados en huéspedes mamíferos para la expresión de proteínas recombinantes. Las cepas de células huésped deben seleccionarse por su capacidad particular para procesar la proteína expresada o para producir determinadas modificaciones postraduccionales que son útiles para proporcionar actividad a la proteína. Entre dichas modificaciones del polipéptido se encuentran las siguientes: acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, acilación y modificación con lípidos, entre otros. El procesamiento postraduccional, que escinde la forma "prepro" de la proteína, también puede ser importante para su correcta inserción, plegamiento o funcionalidad. Las distintas células huésped, como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 y similares, poseen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para realizar dichas actividades postraduccionales, y deben escogerse para garantizar la modificación y procesamiento correctos de la proteína exógena introducida.

En un método de expresión recombinante de las proteínas análogas al G-CSF humano especialmente preferido en la presente invención, las células 293 se cotransfectan con plásmidos que contienen el cDNA del análogo del G-CSF humano en el vector pCMV (promotor CMV 5', secuencia 3' HGH poli A) y pSV2neo (que contiene el gen neo de resistencia) por el método del fosfato de calcio. Preferentemente, los vectores deben linealizarse con ScaI antes de la transfección. De forma similar, se puede utilizar un constructo alternativo utilizando el vector pCMV con el gen neo incorporado. Se seleccionan líneas celulares estables a partir de clones celulares únicos mediante la limitación de la dilución en medio de cultivo que contiene 0,5 mg/ml de G418 (un antibiótico del tipo neomicina) durante 10-14 días. Las líneas celulares se criban en busca de la expresión del análogo del G-CSF humano mediante ELISA o transferencia Western, y aquellas líneas celulares que muestran una elevada expresión se expanden para su crecimiento a gran escala.

Es preferible que las células transformadas se utilicen para una producción proteica de alto rendimiento durante un periodo de tiempo largo y, en ese caso, es deseable que la expresión sea estable. Una vez que dichas células han sido transformadas con vectores que contienen marcadores de selección junto con el casete de expresión deseado, las células deben dejarse crecer durante un día o dos en un medio enriquecido antes de pasarlas a un medio selectivo. El marcador de selección se diseña para conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Las colonias resistentes o las células transformadas estables pueden proliferar gracias a técnicas de cultivo celular adecuadas a cada tipo celular.

Se pueden utilizar una serie de sistemas de selección para recuperar las células que han sido transformadas para la producción de proteínas recombinantes. Entre dichos sistemas de selección se encuentran, entre otros, los genes de la timidina quinasa HSV, la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y la adenina fosforribosiltransferasa, en células tk^{-}, hgprt^{-} y aprt^{-}, respectivamente. Asimismo, la resistencia antimetabolito se puede utilizar como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistena al aminoglicósido; G418, también, que confiere resistencia al clorsulfurón; e higro, que confiere resistencia a la higromicina. Entre otros genes adicionales que pueden servir como genes de selección se encuentran el trpB, que permite a la célula utilizar el indol en lugar del triftófano; o hisD, que permite a la célula utilizar el histinol en lugar de la histidina. Entre los marcadores que proporcionan una indicación visual para identificar las células transformadas se encuentran las antocianinas; la \beta-glucoronidasa y su sustrato, GUS; y la luciferasa y su sustrato, la luciferina.

D. Purificación de proteínas

Será deseable purificar las proteínas análogas al G-CSF humano generadas por la presente invención. Las técnicas de purificación de proteína son muy conocidas para los expertos en la materia. Estas técnicas implican, en primer lugar, el fraccionamiento del crudo del medio celular en fracciones con polipéptidos y fracciones sin polipéptidos. Una vez separado el polipéptido del resto de proteína, el polipéptido de interés se purifica más utilizando técnicas electroforéticas y cromatográficas hasta obtener la purificación parcial o completa (o la purificación hasta la homogeneidad). Los métodos analíticos especialmente adecuados para la preparación de un péptido puro son la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel de poliacrilamida e isoelectroenfoque. Un método especialmente eficiente de purificar péptidos es la cromatografía líquida de alta resolución en un sistema FPLC o incluso la cromatografía líquida de alta presión (HPLC).

Determinados aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en realizaciones específicas, la purificación sustancial, de un péptido o una proteína codificada. El término "proteína o péptido purificado" tal como se usa en el presente documento, se utiliza para referirse a una composición, aislable de otros componentes, en el que la proteína o el péptido se purifica hasta un determinado grado relativo al estado en el que se obtiene de forma natural. Por tanto, una proteína o un péptido purificado también se refiere a una proteína o un péptido aislado del ambiente en el que naturalmente se encuentra.

Generalmente, "purificado" se referirá a una composición proteica o peptídica que ha sido sometida a fraccionamiento para eliminar otros componentes y cuya composición sustancialmente mantiene su actividad biológica expresada. Cuando se utiliza el término "sustancialmente purificado", dicha designación se referirá a una composición en la que los péptidos y las proteínas suponen el componente fundamental de la composición, cuando constituye alrededor del 50%, alrededor del 60%, alrededor del 70%, alrededor del 80%, alrededor del 90%, alrededor del 95% o más de las proteínas de la composición.

Gracias a las descripciones del presente documento, los expertos en la materia conocerán diversos métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, la determinación de la actividad específica de una fracción activa o la valoración de la cantidad de polipéptido en una fracción mediante análisis SDS-PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción consiste en calcular la actividad específica de la fracción y compararla con la actividad específica del extracto inicial para calcular, así, el grado de pureza, valorada en el presente documento mediante el "número de purificación de n veces". Las unidades actuales utilizadas para representar la cantidad de actividad será, por supuesto, dependiente de la técnica de ensayo particular que se haya escogido para seguir la purificación, y si el péptido o la proteína expresada muestra actividad detectable.

Diversas técnicas adecuadas para su utilización en la purificación de proteínas serán muy conocidas por los expertos en la materia. Entre ellas se encuentran, por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares; desnaturalización por calor, seguida por centrifugación; distintas cromatografías como las cromatografías de intercambio iónico, por filtración en gel, en fase inversa, hidroxilapatita y de afinidad; isoelectroenfoque; electroforesis en gel; y combinaciones de esas y otras técnicas. Como se conoce muy bien en el campo, se cree que el orden en el que se lleven a cabo los distintos pasos de purificación puede cambiarse o que determinados pasos pueden omitirse, y aún así, es un método apropiado para la preparación de proteínas o péptidos sustancialmente purificados.

No existe la necesidad general de que la proteína o el péptido siempre se suministre en su forma más pura. Es más, se contempla que productos menos purificados tendrán utilidad en determinadas realizaciones. La purificación parcial puede conseguirse utilizando menos pasos de purificación en combinación o utilizando distintas formas del mismo esquema general de purificación. Por ejemplo, se considera que la realización de una cromatografía en columna de intercambio catiónico, utilizando un aparato de HPLC, generalmente tendrá como resultado una mayor purificación en n veces que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía a baja presión. Los métodos que muestran un grado menor de purificación relativa pueden presentar ventajas en la recuperación total del producto proteico o en mantener la actividad de la proteína expresada.

Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, en ocasiones de forma significativa, con la aplicación de distintas condiciones en el SDS-PAGE (Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 76:425 [1977]). Por tanto, se considerará que bajo condiciones diferentes de electroforesis, los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados pueden variar.

Opcionalmente, se pueden purificar y aislar dichos análogos al G-CSF de otros compuestos obtenidos durante el proceso. Los métodos de purificación se pueden encontrar en la Patente Estadounidense núm. 5 849 883. Son muy conocidos otros métodos en el ámbito (véase, también, Souza, supra, incorporados en el presente documento como referencias). Estos documentos describen ejemplos de métodos específicos para el aislamiento y la purificación de composiciones de G-CSF que pueden ser útiles para aislar y purificar los análogos al G-CSF de la presente invención. Dada la descripción de dichas patentes, es evidente que los expertos en la materia serán conocedores de las numerosas técnicas de purificación que pueden utilizarse para purificar el G-CSF de una fuente dada.

Asimismo, se considera que se puede utilizar la combinación de cromatografía de intercambio aniónico y de inmunoafinidad para producir composiciones purificadas de análogos de G-CSF de la presente invención.

E. Vectores de clonación, transferencia de genes y expresión

Tal y como se ha comentado en el apartado anterior, los vectores de expresión se utilizan para expresar el polipéptido análogo del G-CSF humano, que puede purificarse a continuación y utilizarse para el tratamiento de la neutropenia. En otras realizaciones, los vectores de expresión se pueden utilizar en terapia génica para introducir los ácidos nucleicos que codifican el análogo del G-CSF humano en células que los necesiten o para inducir la expresión de análogos del G-CSF humano en dichas células. En este apartado se presenta una descripción de cómo producir dichos vectores de expresión.

Para la expresión es necesaria la presencia de una serie de señales apropiadas en los vectores, como diversos elementos reguladores, tales como promotores/estimuladores de fuentes tanto víricas como de mamíferos que dirigen la expresión de los genes de interés en las células huésped. También se describen los elementos diseñados para optimizar la estabilidad del RNA mensajero y la traducibilidad en las células huésped. También se suministran las condiciones de utilización de una serie de marcadores de selección de fármacos dominantes para establecer clones celulares estables y permantentes que expresen los productos, como un elemento que conecte la expresión del fármaco que actúa como marcador de selección con la expresión del polipéptido.

a. Elementos reguladores

Promotores y estimuladores. A lo largo de esta solicitud, el término "constructo de expresión" o "vector de expresión" se destina a cualquier tipo de constructo genético que contiene ácidos nucleicos que codifican productos génicos en los que parte o toda la secuencia de ácido nucleico codificante puede ser transcrita. El transcrito puede traducirse en una proteína, pero es posible que no sea así. En determinadas realizaciones, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción del mRNA en un producto génico. El ácido nucleico que codifica un producto génico se encuentra bajo el control transcripcional de una promotor. El término "promotor" se refiere a una secuencia de DNA reconocida por la maquinaria de síntesis de la célula o por una maquinaria de síntesis introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de un gen. La frase "bajo el control transcripcional" significa que el promotor se encuentra en la localización y orientación apropiadas respecto al ácido nucleico para controlar la iniciación de la RNA polimerasa y la expresión del gen.

El término "promotor" se usará en el presente documento para referirse a un grupo de módulos de control transcripcional que se encuentran agrupados en las proximidades del lugar de iniciación de la RNA polimerasa II. Gran parte de los conocimientos sobre cómo se organizan los promotores proviene del análisis de varios promotores víricos, incluyendo aquellos para la timidina quinasa HSV y las unidades de transcripción temprana SV40. Dichos estudios, que han aumentado gracias a más trabajos recientes, han mostrado que los promotores se componen de módulos funcionales discretos que constan cada uno de 7 a 20 pb de DNA, y contienen uno o más sitios de reconocimiento para proteínas activadoras o inhibidoras de la transcripción.

Al menos un módulo de cada promotor funciona para marcar el sitio de inicio para la síntesis de RNA. El ejemplo más conocido es la caja TATA, aunque en algunos promotores no poseen caja TATA, como el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamíferos y el promotor de los genes tardíos del SV40, un elemento discreto que se solapa con el propio sitio de iniciación ayuda a indicar el sitio de iniciación.

Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Generalmente, se localizan en la región a 30-110 pb en dirección 5' del sitio de iniciación, aunque se ha descrito recientemente que una serie de promotores contienen también elementos funcionales en dirección 3' al sitio de iniciación. El espacio entre el promotor y los elementos con frecuencia es flexible, de manera que la función del promotor se mantiene cuando los elementos se invierten o se mueven respecto unos a otros. En el promotor tk, el espacio entre los elementos promotores se puede incrementar en 50 pb antes de que empiece a notarse una disminución en su actividad. En función del promotor, parece que los elementos individuales pueden activar la transcripción tanto de forma cooperativa como independiente.

El promotor concreto utilizado para controlar la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos de interés no se considera importante, siempre y cuando sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula diana. Así, cuando la diana es una célula humana, es preferible colocar la región codificante del ácido nucleico en una región adyacente a un promotor que sea capaz de expresarse en células humanas o bajo el control del mismo. Generalmente, dicho promotor puede incluir tanto un promotor humano como vírico.

En diversas realizaciones, el promotor de los genes tempranos e intermedios del citomegalovirus (CMV); el promotor temprano de SV40; las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de Rous; los promotores de la \beta-actina, de la insulina de rata, de la fosfoglicerol quinasa y la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, todos ellos muy conocidos en el campo y de obtención fácil, se pueden utilizar para obtener una elevada expresión de la secuencia codificante de interés. También se contempla el uso de otros promotores víricos o de mamíferos o de bacteriófagos muy conocidos en el campo para conseguir la expresión de una secuencia codificante de interés, siempre y cuando los niveles de expresión sean suficientes para una determinada finalidad. Mediante la utilización de un promotor de propiedades muy conocidas, se pueden opotimizar el nivel y la pauta de expresión de la proteína de interés tras su transfección o su transformación.

La selección de un promotor que se regula en respuesta a señales sintéticas o fisiológicas específicas puede permitir la expresión inducible de un producto génico. Se encuentran disponibles varios sistemas de promotores inducibles para la producción de vectores víricos. Uno de esos sistemas es el sistema ecdysone (Invitrogen, Carlsbad, CA), que está diseñado para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamífero. Consiste en un mecanismo de expresión altamente regulado que prácticamente no permite la expresión basal del transgén, pero puede inducir su expresión por encima de las 200 veces.

Otros sistemas inducibles que serían útiles son los sistemas Tet-Off^{TM} y Tet-On^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA), desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15;89(12):5547-51 [1992]; Gossen et al., Science 268 [5218]:1766-9 [1995]).

En algunos casos, puede ser interesante la regulación de la expresión de un transgén en un vector para terapia génica. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes promotores víricos con varios niveles de actividad dependiendo del nivel de expresión que se desee.

En células de mamífero, el promotor temprano e intermedio del CMV habitualmente se utiliza para obtener una activación transcripcional importante. También se han utilizado versiones modificadas del promotor del CMV que son menos potentes cuando se prefieren niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas, habitualmente se utilizan promotores retrovirales como los LTR de MLV o de MMTV. Entre otros promotores víricos que pueden utilizarse en función del efecto deseado se encuentran los promotores del SV40, RSV LTR, VIH-1 y VIH-2 LTR y adenovirus, como las regiones E1A, E2A o MLP, AAV LTR, virus del mosaico de la coliflor, HSV-TK y virus del sarcoma aviar. De forma similar, los promotores específicos de tejido se pueden utilizar para afectar a la transcripción en tejidos o células específicos, de manera que se reducen la toxicidad potencial y los efectos no deseados en los tejidos que no son diana. Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores como los de la PSA, la probasina, la ácido prostático fosfatasa y la calicreína glandular específica de próstata (hK2) para que dirijan la expresión génica en la próstata.

En determinadas indicaciones, puede resultar interesante activar la transcripción en momentos específicos tras la administración del vector de la terapia génica. Esto puede realizarse con aquellos promotores que son regulables con citocinas o con hormonas. Por ejemplos, en aquellas aplicaciones de la terapia génica en la indicación son tejidos gonadales donde se producen o se guían esteroides específicos, puede resultar ventajosa la utilización de promotores regulables con andrógenos o estrógenos. Entre dichos promotores regulables hormonalmente se encuentran MMTV, MT-1, ecdisona y RuBisco. También se espera que otros promotores regulables por hormonas, como aquellos que responden frente a las hormonas del tiroides, la pituitaria y la médula adrenal, sean útiles en la presente invención. Entre los promotores que responden a citocinas y a proteínas inflamatorias que podrían utilizarse se encuentran el kininógeno (Kageyama et al., J. Biol. Chem. 262(5):2345-51 [1987]), c-fos, TNF-alfa, proteína C reactiva (Arcone et al., Nucleic Acids Res. 16(8):3195-2O7 [1988]), haptoglobina (Oliviero et al., EMBO J. 6[7]:1905-12 [1987]), amiloide del suero A2, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 (Poli y Cortese, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(21):8202-6 [1989]), C3 del complemento (Wilson et al., Mol. Cell. Biol 10[112]:6181-91 [1990]), IL-8, glicoproteína ácida alfa-1 (Prowse y Baumann, Mol. Cell. Biol. 8[1]:42-51 [1988], antitripsina alfa-1, lipoproteína lipasa (Zechner et al., Mol. Cell. Biol. 8[6]:2394-401 [1988], angiotensinógeno (Ron et al., Mol. Cell. Biol. 11[5]:2887-95 [1991]), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por metales pesados y glucocorticoides), estromelisina (inducible por ésteres de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2 macroglobulina y alfa-1 antiquimiotripsina. Otros promotores que podrían utilizarse según la presente invención incluyen los promotores regulables por Lac, los inducibles por calor (hipertermia) y por radiación, p. ej. EGR (Joki et al., Hum. Gene Ther. 6[12]:1507-13 [1995]), alfa-inhibina, met-tRNA de RNA pol III y otros promotores de aminoácidos, U1 snRNA (Bartlett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 20;93[17]:8852-7 [1996]), MC-1, PGK, \beta-actina y \alpha-globina. Otros muchos promotores que pueden utilizarse se enumeran en Walther y Stein (J. Mol. Med. 74[7]:379-92 [1996]).

Se prevee que cualquiera de los promotores antes mencionados solos o en combinación con otro, puede ser útiles según la presente invención dependiendo de la acción deseada. Además, este listado de promotores no debe entenderse como algo exhaustivo o limitante, ya que los expertos en la materia conocerán otros promotores que pueden utilizarse junto con los promotores y los métodos descritos en el presente documento.

Otro elemento regulador cuya utilización es abarcada en la presente invención es un estimulador. Se trata de elementos genéticos que incrementan la transcripción de un promotor localizado en una posición lejana en la misma molécula de DNA. Los estimuladores se organizan de forma similar a los promotores. Es decir, están compuestos por muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se una a una o más proteínas transcripcionales. La diferencia básica entre estimuladores y promotores se encuentra a nivel operativo. Una región estimuladora completa debe ser capaz de estimular la transcripción a distancia; hecho que no tiene que cumplirse necesariamente en el caso de una región promotora o de sus componentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan la iniaciación de la síntesis del RNA en un lugar específico y en una orientación determinada, mientras que los estimuladores no presentan dichas especificidades. A menudo, los promotores y los estimuladores se solapan y son contiguos, habitualmente parecen presentar una organización modular similar. Los estimuladores que resultan útiles en la presente invención son muy conocidos por los expertos en la materia y dependerán de los sistemas de expresión que se estén utilizando (Scharf et al., Results Probl. Cell. Differ. 20: 125-62 [1994]; Bittner et al., Meth. Enzymol. 153: 516-544 (1987)].

Señales de poliadenilación. Cuando se utiliza un inserto de cDNA, generalmente se desea incluir una señal de poliadenilación para provocar la poliadenilación apropiada del transcrito del gen. No se considera que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica exitosa de la invención, y cualquiera de dichas secuencias se puede utilizar como las señales de poliadenilación de las hormonas de crecimiento humana y bovina y del SV40. También se contempla una secuencia terminadora como un elemento del casete de expresión. Dichos elementos pueden servir para incrementar los niveles del mensaje y para reducir las lecturas erróneas del casete a otras secuencias.

Sitio internos de entrada al ribosoma (IRES). En determinadas realizaciones de la invención, se contempla la utilización de elementos de sitios internos de entrada al ribosoma para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de saltarse el modelo de búsqueda del ribosoma de "cap" metilado 5' para el inicio de la traducción y empezar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, Nature 334: 320-325 [1988]). Se han descrito los elementos IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (poliovirus y virus de la encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988, supra), así como IRES de mensajes de mamíferos (Macejak y Sarnow, Nature 353: 90-94 [1991]). Los elementos IRES pueden asociarse con marcos de lectura abiertos heterólogos. Se pueden transcribir conjuntamente múltiples marcos de lectura abierto, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. Gracias a los elementos IRES, cada marco de lectura abierto se encuentra accesible para que los ribosomas realicen una traducción eficiente. Se pueden expresar múltiples genes utilizando un único promotor/estimulador que transcriba un único mensaje. Cualquier marco de lectura abierto heterólogo se puede asociar a elementos IRES. Esto incluye genes para proteínas secretadas, proteínas con múltiples subunidades codificadas por genes independientes, proteínas intracelulares o de unión a membrana y marcadores de selección. En ese sentido, se puede diseñar la expresión simultánea de varias proteínas en una célula con un único constructo y un único marcador de
selección.

b. Introducción de los vectores de expresión

Existen distintas maneras de introducir los vectores de expresión en el interior de las células. En determinadas realizaciones de la invención, la expresión del constructo comprende un constructo vírico o sintético derivado de un genoma vírico. En otras realizaciones, se contempla la introducción mediante sistemas no víricos. La capacidad que tienen algunos virus para entrar en las células a través de endocitosis mediada por receptor, integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar los genes víricos de forma estable y eficiente, les han convertido en candidatos atractivos para transferir genes exógenos a células de mamífero (Ridgeway, en: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez & Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 467-492, 1988; Nicolas y Rubenstein, en: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodríguez & Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 493-513, 1988; Baichwal y Sugden, en: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York, Plenum Press, 117-148, 1986; Temin, en: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum press, 149-188, 1986)]. Los primeros virus que se utilizaron como vectores génicos fueron virus de DNA como los papovavirus (virus del simio 40, virus del papiloma bovino y virus del polioma) (Ridgeway, 1988, supra; Baichwal y Sugden, 1986, supra) y adenovirus (Ridgeway, 1988, supra, Baichwal y Sugden, 1986, supra). Estos virus poseen una capacidad relativamente baja para incluir secuencias de DNA exógeno y su espectro de huéspedes es limitado. Asimismo, la seguridad de los mismos es motivo de preocupación debido a su potencial oncogénico y sus efectos citopáticos en las células permisivas. Únicamente pueden acoger 8 kb de material genético exógeno aunque se puede introducir fácilmente en distintas líneas celulares y animales de laboratorio (Nicolas y Rubenstein, 1988, supra, Temin, 1986, supra).

Actualmente, está muy reconocido que el DNA se puede introducir en una célula mediante diferentes vectores víricos. En dichas realizaciones, los constructos de expresión que constan de vectores víricos que contienen los genes de interés pueden ser vectores de adenovirus (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses núms.: 5 824 544, 5 707 618, 5 693 509, 5 670 488 y 5 585 362); retrovirus (véanse por ejemplo las Patentes estadounidenses núms.: 5 888 502, 5 830 725, 5 770 414, 5 686 278 y 4 861 719); virus adenoasociados (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses núms.: 5 474 935, 5 139 941, 5 622 856, 5 658 776, 5 789 390, 5 834 441, 5 863 541, 5 851 521 y 5 252 479); híbridos de adenovirus y virus adenoasociados (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense núm.: 5 856 152); o un virus vaccinia o herpes (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses núms.: 5 879 934, 5 849 571, 5 830 727, 5 661 033, 5 328 688).

Existen una serie de alternativas a las tranfección vírica de constructos genéticos. Este apartado proporciona una discusión de métodos y composiciones para la transferencia de genes mediante sistemas no víricos. Generalmente, los constructos de DNA de la presente invención se introducen en una célula y, en determinadas situaciones, el ácido nucleico o la proteína se transfieren utilizando métodos no víricos.

La presente invención abarca varios métodos no víricos para la transferencia de constructos de expresión en células de mamífero en cultivo. Estos incluyen precipitación en fosfato de calcio [Graham y Van Der Eb, Virology 52:456-467 (1973); Chen y Okayama, Mol. Cell Biol. 7:2745-2752 (1987); Rippe et al., Mol. Cell Biol. 10:689-695 (1990)], DEAE-dextrano [Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190 (1985)], electroporación [Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol. 6:716-718 (1986); Rippe et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:7161-7165 (1984)], microinyección directa [Harland y Weintraub, J. Cell. Biol. 101:1094-1099 (1985)], liposomas para la liberación de DNA [Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta. 721:185-190 (1982); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348-3352 (1979); Felgner, Sci. Am. 276(6):102-106 (1997); Feigner, Hum. Gene Ther. 7(15):1791-3 (1996)], sonicación celular [Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8463-8467 (1987)], bombardeo génico con microproyectiles de alta velocidad [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:9568-9572 (1990)], y transfección mediada por receptor [Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); Wu y Wu, Biochem., 27:887-892 (1988); Wu y Wu, Adv. Drug Deliv. Rev. 12:159-167 (1993)]. Drug DeIiv. Rey. 12:159-167(1993)].

Una vez que el constructo ha sido introducido en el interior de la célula, el ácido nucleico que codifica el gen terapéutico debe colocarse y expresarse en distintos lugares. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el gen terapéutico puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula. Una vez que el constructo ha sido introducido en el interior de la célula, el ácido nucleico que codifica el gen terapéutico debe colocarse y expresarse en distintos lugares. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el gen terapéutico puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula. En otras realizaciones, el ácido nucleico puede mantenerse de forma estable en la célula como un segmento de DNA episómico separado. Dichos segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican secuencias que permiten su mantenimiento y replicación independiente al ciclo celular de la célula o en sincronización con él. El modo de introducir el constructo de expresión y el lugar en el que el ácido nucleico se mantiene en la célula dependen del tipo de constructo de expresión utilizado.

En una realización particular de la invención, el constructo de expresión puede introducirse en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizados por poseer una bicapa de fosfolípidos que forma una membrana con un medio acuoso en su interior. Los liposomas multilaminares poseen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en una exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y capturan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas [Ghosh y Bachhawat, en: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands. Wu & Wu (ed.), New York: Marcel Dekker, pp. 87-104 (1991)]. La adición de DNA a liposomas catiónicos provoca una transición topológica de los liposomas hacia glóbulos condensados líquido-cristalinos ópticamente birrefringentes [Radier et al., Science 275(5301):810-4 (1997)]. Estos complejos de lípido-DNA son vectores inertes potenciales para utilizar en terapia génica y en la introducción de genes.

La introducción y expresión de DNA exógeno in vitro mediada por liposomas ha tenido mucho éxito. La presente invención también abarca diversas estrategias comerciales que implican la tecnología de la "lipofección". En determinadas realizaciones de la invención, el liposomas puede formar complejos con un virus hemoaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que así se facilita la fusión con la membrana celular y se promueve la entrada en la célula del DNA encapsulado en el liposoma [Kaneda et al., Science 243:375-378 (1989)]. En otras realizaciones, el liposoma puede formar complejos o utilizarse junto con proteínas cromosómicas nucleares no histonas (HMG-1) [Kato et al., J. Biol. Chem. 266:3361-3364 (1991)]. En otras realizaciones, el liposoma puede formar complejos o utilizarse tanto con HVJ como con HMG-1. Dichos constructos de expresión se han utilizado con éxito en la transferencia y expresión de ácidos nucleicos in vitro e in vivo. Por tanto, son aplicables en la presente invención.

Entre otros sistemas de introducción de vectores que se pueden utilizar para introducir ácidos nucleicos que codifican un gen terapéutico en las células se encuentran los vehículos de liberación mediados por receptor. Estos sistemas se aprovechan de la captación selectiva de macromoléculas por endocitosis mediada por receptor en la mayoría de las células eucariotas. Debido a la distribución específica según el tipo celular de diversos rceptores, la introducción puede ser altamente específica (Wu y Wu, 1993, supra).

Los vehículos para la introducción de genes mediados por receptor generalmente constan de dos componentes: un ligando específico para un receptor celular y un agente de unión a DNA. Se han utilizado varios ligandos para la transferencia génica mediada por receptor. Los ligandos más utilizados son el asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987, supra) y la transferrina [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(9):3410-3414 (1990)]. Recientemente, se ha utilizado como vehículo para la introducción de genes una neoglicoproteína sintética que reconoce el mismo receptor que el ASOR [Ferkol et al., FASEB J. 7:1081-1091 (1993); Perales et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:4086-4090 (1994)] y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) también se ha utilizado para la introducción de genes en células escamosas de carcinoma (Myers, EPO 0273085).

En otras realizaciones, los vehículos de introducción pueden constar de un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al. [Methods Enzymol. 149:157-176(1987)] utilizaron lactosil-ceramida, un asialganglósido con galactosa terminal, incorporada en los liposomas y observaron un incremento en la captación del gen de la insulina por los hepatocitos. Por tanto, es posible que un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico también pueda ser introducido de forma específica en una tipo celular concreto utilizando cualquier número de sistemas de receptor-ligando y con liposomas o sin ellos.

En otra realización de la invención, el constructo de expresión puede consistir sencillamente en DNA recombinante o plásmidos desnudos. La transferencia del constructo puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente que física o químicamente permeabilizan la membrana celular. Esto es aplicable, especialmente, para la transferencia in vitro; no obstante, también puede utilizarse in vivo. Dubensky et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7529-7533 (1984)] inyectaron con éxito DNA de poliomavirus en forma de precipitados de CaPO_{4} en hígado y bazo de ratones neonatos y adultos demostrando, así, la replicación vírica activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif [Proc. Nad. Acad. Sci. USA 83:955 19555 (1986)] también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaPO_{4} tenía como resultado la expresión de los genes transfectados.

Otra realización de la presente invención para transferir constructos de expresión de DNA desnudo a las células puede implicar el bombardeo con partículas. Este método se basa en la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos de DNA hasta una velocidad muy alta que les permita atravesar las membranas celulares y penetrar en las células sin matarlas [Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)]. Se han desarrollado varios dispositivos de aceleración de partículas pequeñas. Uno de dichos dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje que genera una corriente eléctrica que, a su vez, proporciona la fuerza motriz [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572 (1990)]. Los microproyectiles utilizados consistían en microesferas de sustancias biológicamente inertes como el tungsteno y el oro.

F. Métodos para el tratamiento de la neutropenia

Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, se contempla la utilización de los análogos del G-CSF humano y de los vectores que constan de los polinucleótidos que codifican dichas proteínas para el tratamiento de la neutropenia. Se ha demostrado que el G-CSF es útil en el tratamiento de diversos trastornos en los que un incremento de los neutrófilos puede tener efectos beneficiosos. Por ejemplo, en el caso de pacientes con cáncer, el G-CSF tiene efectos beneficiosos como una herramienta para estimular la producción de neutrófilos que compense los déficits hematopoyéticos causados por la quimioterapia o la radioterapia. Entre otras indicaciones se encuentran el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas o de alteraciones relacionadas, como la sepsis, que normalmente está causada por un metabolito de las bacterias. El G-CSF también es útil, solo o en combinación con otros compuestos como otras citocinas, para el crecimiento o la expansión de las células en cultivo (por ejemplo, para trasplantes de médula ósea o expansión ex vivo). Se ha administrado G-CSF a pacientes trasplantados como un complemento al tratamiento de infecciones o para el tratamiento de la neutropenia.

a. Tratamiento basado en proteínas

Una de las realizaciones terapéuticas de la presente invención es el suministro, a un individuo que lo necesite, de una composición que contiene análogos del G-CSF humano de la presente invención. Como se ha discutido anteriormente, las proteínas pueden haberse obtenido a través de un sistema recombinante o mediante síntesis automatizada de péptidos. Las formulaciones de análogos del G-CSF humano para dichos tratamientos se pueden seleccionar en función de la vía de administración y pueden ser formulaciones con liposomas así como preparaciones farmacéuticas clásicas.

Las proteínas análogas al G-CSF humano se formulan en preparaciones adecuadas y se administran en una o más partes del individuo en una cantidad terapéuticamente efectiva. En realizaciones que se prefieren especialmente, el tratamiento basado en proteínas análogas al G-CSF humano se efectúa mediante la administración intravenosa intermitente o continua. En la presente invención la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se utiliza para referirse a la cantidad de análogo del G-CSF humano que es suficiente para provocar cambios observables en el nivel de una o más de las actividades biológicas del G-CSF. El cambio también puede ser un incremento en los niveles de actividad del G-CSF. Preferiblemente, el cambio consiste en un incremento en la proliferación de los neutrófilos.

Los expertos en la materia sabrán que las cantidades de análogo del G-CSF para utilización terapéutica pueden variar. Se contempla que la actividad específica de la preparación de proteínas análogas al G-CSF humano pueden encontrarse en el intervalo comprendido entre las 100 unidades/mg de proteína y alrededor de las 500 unidades/mg de proteína. Por tanto, una preparación dada de análogo del G-CSF humano puede contener alrededor de 100 unidades/mg de proteína, alrededor de 125 unidades/mg de proteína, alrededor de 150 unidades/mg de proteína, alrededor de 175 unidades/mg de proteína, alrededor de 200 unidades/mg de proteína, alrededor de 225 unidades/mg de proteína, alrededor de 250 unidades/mg de proteína, alrededor de 275 unidades/mg de proteína, alrededor de 300 unidades/mg de proteína, alrededor de 325 unidades/mg de proteína, alrededor de 350 unidades/mg de proteína, alrededor de 375 unidades/mg de proteína, alrededor de 400 unidades/mg de proteína, alrededor de 425 unidades/mg de proteína, alrededor de 450 unidades/mg de proteína, alrededor de 475 unidades/mg de proteína alrededor de 500 unidades/mg de proteína. Un intervalo que se prefiere particularmente es el que se encuentra entre alrededor de 100 unidades/mg de proteína y alrededor de 200 unidades/mg de proteína, un intervalo aún más preferido es entre alrededor de 150 y alrededor de 200 unidades/mg de proteína. Preferiblemente, la composición proteica se encuentra sustancialmente libre de factores contaminantes, un nivel de contaminación de menos del 0,02% (p/p). Por ejemplo, se pueden preparar las composiciones con análogos del G-CSF humano apropiadas para su inyección a un paciente, mediante la reconstitución en un diluyente farmacológicamente aceptable de una muestra liofilizada que consta de un análogo del G-CSF humano purificado y sales estabilizadoras.

La administración de las composiciones puede ser sistémica o local y puede constar de un único sitio de inyección de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de proteínas análogas al G-CSF humano. Se contempla cualquier vía conocida por los expertos en la materia para la administración de una composición terapéutica de la invención, incluyendo, por ejemplo, las administraciones intravenosa, intramuscular, subcutánea o mediante un catéter para la administración a largo plazo. De forma alternativa, se contempla que la composición terapéutica pueda ser administrada al paciente en distintos sitios. Las administraciones múltiples puede realizarse simultáneamente o durante un periodo de tiempo de varias horas. En determinados casos, puede resultar beneficioso suministrar un flujo continuo de la composición terapéutica. Se pueden administrar tratamientos adicionales en función del tiempo, por ejemplo, diaria, semanal o mensualmente.

b. Tratamientos combinados

Además de los tratamientos basados únicamente en la administración de análogos del G-CSF humano, se contemplan específicamente los tratamientos combinados. En el contexto de la presente invención, se contempla que el tratamiento con análogos al G-CSF humano pueda utilizarse de forma similar en combinación con otros agentes utilizados habitualmente para el tratamiento de la neutropenia.

Para conseguir los resultados terapéuticos adecuados al utilizar los métodos y las composiciones de la presente invención, generalmente debería proporcionarse una composición que contenga el análogo del G-CSF humano y al menos otro agente terapéutico (agente terapéutico secundario). En la presente invención, se contempla que el agente terapéutico secundario puede implicar la administración o inclusión de al menos un factor adicional seleccionado entre EPO, G-CSF, M-GDF, SCF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, L-9, IL-10, IL-11, IL-12 u otras citocinas, IGF-1, LIF, interferón (como el \alpha, \beta, gamma o consensus), factores neurotróficos (como el BDNF, NT-3, CTNF o la nogina), otros factores de crecimiento multipotentes (como, hasta donde ha podido demostrarse que lo son, el ligando flt-3/flk-2, el factor de proliferación de células progenitoras y el factor de células progenitoras totipotentes), factores de crecimiento de fibroblastos (como el FGF), y análogos, moléculas de fusión u otros derivados de los anteriores. Por ejemplo, se ha descrito que el G-CSF en combinación con el SCF mobilizan células progenitoras de sangre periférica in vivo. Por ejemplo, ex vivo se ha descrito que el G-CSF en combinación con el SCF es útil para la expansión de células de sangre periférica. Asimismo, los análogos del G-CSF considerados tendrán las mismas utilidades.

Las composiciones para los tratamientos combinados se suministrarán en una cantidad combinada que sea efectiva para producir el efecto terapéutico deseado en el tratamiento de la neutropenia. Este proceso puede implicar el poner en contacto las células con el análogo del G-CSF humano y con el/los segundo/s agente/s o factor/es al mismo tiempo. Esto puede conseguirse mediante la administración de una única composición o formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o mediante la administración de dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en las que una de las composiciones contengan el análogo terapéutico del G-CSF humano y, el otro, el segundo agente terapéutico.

De forma alternativa, el tratamiento con el análogo del G-CSF humano puede preceder a la administración del otro agente o puede administrarse después en intervalos que pueden oscilar de minutos a semanas. En realizaciones en las que el segundo agente terapéutico y el análogo del G-CSF humano se administran por separado, generalmente debe garantizarse que no pasará un periodo de tiempo significativo entre cada administración, de manera que el segundo agente y el análogo del G-CSF humano sean capaces todavía de ejercer un efecto combinado ventajoso. En esas circunstancias, se contempla que la administración de ambas modalidades se produzca entre alrededor de 12-24 horas entre ellos y, más preferiblemente, entre alrededor de 6-12 horas entre ellos, siendo el periodo de 12 horas el más preferido. No obstante, en determinadas situaciones, puede resultar deseable extender el periodo de tratamiento significativamente, en los que el lapso entre las respectivas administraciones puede oscilar entre varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) y varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).

La introducción sistémica de constructos de expresión de análogos del G-CSF humano o de las mismas proteínas en los pacientes puede resultar un método muy eficiente de introducir genes terapéuticamente efectivos que contrarresten las manifestaciones clínicas inmediatas de la enfermedad. Alternativamente, la administración local de análogos del G-CSF humano o del segundo agente terapéutico puede ser apropiada en determinadas circunstancias.

G. Ensayos para determinar la capacidad de unión y la actividad del análogo del G-CSF humano

En determinados aspectos de la presente invención, puede ser necesario determinar la actividad del análogo del G-CSF humano. En particular, el efecto de las composiciones terapéuticas de la presente invención en la neutropenia necesitan controlarse. Los expertos en la materia son conocedores de numerosos ensayos para determinar la actividad del G-CSF y algunos de ellos se describen en este apartado. Bajo ningún concepto debe considerarse como un listado exhaustivo de dichos análisis sino que únicamente se pretende proporcionar algunos ejemplos de ensayos muy conocidos por los expertos en la materia que pueden utilizarse para determinar la actividad del G-CSF de la presente invención. Asimismo, la presente invención también describe ensayos para determinar la unión de G-CSF a su receptor. A continuación se describen ejemplos de ensayos in vitro e in vivo para determinar dichas actividades.

a. Ensayos in vitro

Ensayos de proliferación celular. Los ensayos de proliferación celular, algunos de los cuales se encuentran aquí descritos, se utilizan para determinar los efectos de los análogos del G-CSF sobre la inducción de la proliferación celular. Muchos ensayos son muy conocidos en el ámbito y algunos de ellos están descritos como sigue a continuación.

Recuento celular. Se realizan pases de las células en medio MEM\alpha (sin G-CSF) 24 h antes del inicio del experimento de proliferación celular, momento en el que se incuban frascos paralelos de células a una densidad de 105 células/ml en medio MEM\alpha con 125 pM del G-CSF salvaje o de los análogos del G-CSF. El crecimiento celular de cada frasco se mide en los días 2, 5 y 8 tal y como se describe a continuación. Brevemente, las células se diluyen en una solución isotónica (ISOTON II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL) y se cuentan en un contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Incorporación de ^{3}H-timidina. Este ensayo se basa en la incorporación del marcador ^{3}H-timidina en DNA sintetizado de novo en las células antes de su división. Algunos investigadores también utilizan el análogo de la timidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en lugar de la [^{3}H]-timidina en los ensayos de proliferación. Se realizan pases de las células en medio MEM\alpha (sin G-CSF) 24 h antes del inicio del experimento de proliferación celular, momento en el que se incuban frascos o pocillos paralelos de células a una densidad de 105 células/ml en medio MEM\alpha con 125 pM del G-CSF salvaje o de los análogos del G-CSF. La ^{3}H-timidina se añade al cultivo celular 12-24 h antes del recuento (finalización del experimento) y al final del ensayo la cantidad de radiactividad incorporada en el DNA se mide en un contador de líquido de centelleo. Los expertos en la materia conocen en detalle esta metodología.

MTT. El MTT se utiliza para determinar cuantitativamente la proliferación y la activación celular, por ejemplo, en respuesta a factores de crecimiento y citocinas. También se utiliza para la cuantificación de los efectos citotóxico y antiproliferativo mediados, por ejemplo, por el factor de necrosis tumoral \alpha y \beta y para medir la acción del interferón. El ensayo se basa en la transformación de la sal de tetrazolio de color amarillo, MTT, en cristales de formazán de color púrpura por parte de las células metabólicamente activas. Esos cristales de sal son insolubles en solución acuosa, pero pueden solubilizarse añadiendo una solución de solubilización adecuada incluida en el equipo, e incubando las placas durante toda la noche en atmósfera humidificada (p. ej., 37ºC, 6,5% CO_{2}). El formazán solubilizado se cuantifica espectrofotométricamente en un lector de ELISA. El incremento en el número de células vivas tiene como resultado un incremento en la actividad metabólica total de la muestra. Ese incremento se correlaciona directamente con la cantidad de cristales de formazán formados que se controla al medir la absorbancia de la muestra. Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) suministra un ensayo MTT comercial.

Ensayo de supresión de ligando. La supresión de ligando para cada proteína se valora en función del tiempo tal y como se describe a continuación. Como en los ensayos anteriores, se realizan pases de las células G-CSF dependientes (OCI/AML1) en medio MEM\alpha (sin G-CSF) suplementado 24 h antes del inicio del experimento de depleción de ligando, momento en el que frascos paralelos de células a una densidad de 105 células/ml se incuban en medio MEM\alpha con 125 pM del G-CSF salvaje o de los análogos del G-CSF. Tras 24 h, se valora el número de células de cada frasco, tal y como se ha descrito anteriormente, y una alicuota de los sobrenadantes de cada uno de los medios, obtenida tras la centrifugación para sedimentar los restos celulares, se almacena a -20ºC para determinar la concentración de G-CSF. Este procedimiento se realiza cada 24 h durante 8 días. Entonces, se cuantifican las concentraciones de G-CSF en los sobrenadantes de las muestras de medio mediante equipos de ensayos inmunoenzimáticos sobre fase sólida (ELISA) obtenidos de R&D Systems (Minneapolis, MN).

Experimentos de internalización y reciclado. Los experimentos de internalización se llevaron a cabo a lo largo de un periodo de tiempo de 5 min, de forma similar a un trabajo publicado [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol 32: E1-E9 (1995)]. Brevemente, se lavan 10^{8} células dos veces con PBS y se incuban en hielo con un ligando marcado durante 30 min hasta obtener complejos en la superficie. Las células se lavan nuevamente dos veces en PBS en hielo y se resuspenden en MEM\alpha a 37ºC en el t=0. Los cambios en los complejos de superficie y en los complejos internos se controlan durante un periodo de tiempo de 5 min; la representación de los complejos internos frente a la integral del tiempo de los complejos de superficie tiene como resultado una relación lineal, la pendiente de la cual es la constante de la tasa de internalización de complejos [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257:4222-4229(1982)]. Los experimentos de reciclado se llevaron a cabo de forma idéntica a los experimentos de internalización, a excepción del tiempo que fue de 25 min. Los resultados de los experimentos de reciclado son parámetros que se utilizan para calcular las constantes de la tasa de reciclado.

Ensayos de unión. Los ensayos de unión molecular, algunos de los cuales se encuentran aquí descritos, se utilizan para determinar la unión de los análogos del G-CSF al G-CSFR. Dichos ensayos in vitro y basados en células se describen a continuación.

BIACORE. La afinidad de unión del análogo del G-CSF como ligando del receptor del G-CSF se valora mediante un BIAcore®2000 (BIAcore, Inc, Piscataway, NJ). El G-CSF de tipo salvaje con cola de histidina se inmobiliza en la superficie del chip, y se hace pasar receptor libre (alrededor de 0,25-10 nM) sobre el chip para generar una curva estándar de equilibrio y calcular la afinidad de unión de la proteína de tipo salvaje mediante un modelo de unión 1:1. Para determinar la afinidad de unión de cada mutante, se mezcla receptor libre a 2 nM con una concentración conocida del ligando mutante y se hace pasar sobre el chip. Se determinan las afinidades de unión en equilibrio de los mutantes con un modelo de unión 1:1 de competición. Los resultados de afinidad de unión se analizan mediante la aplicación BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.), y se determinan las constantes de disociación en equilibrio (K_{D}).

ELISA. La unión de los análogos mutantes del G-CSF al G-CSFR se determina mediante un ensayo ELISA de tipo competitivo. En este ensayo, el G-CSFR se captura con un anticuerpo no neutralizante frente al receptor del G-CSF LMM741 (PharMingen, San Diego, CA) según el protocolo del fabricante. Entonces, se ensaya la capacidad de las proteínas análogas de competir con un G-CSF marcado con HRP por su unión al receptor.

b. Ensayos in vivo

Antes de utilizar las composiciones del análogo del G-CSF humano de la presente invención en humanos, es deseable observar los efectos de dichas composiciones en modelos animales. Existen una serie de modelos animales que se pueden utilizar para realizar ensayos in vivo, muy conocidos en el ámbito, que pueden ser útiles para la presente invención.

Con el objetivo de determinar la eficacia de la proteína análoga al G-CSF humano y de las composiciones para terapia génica de la presente invención, se deben inyectar intramuscular o intravenosamente a dichos animales las composiciones de la presente invención, y se debe determinar la capacidad para estimular la proliferación de los neutrófilos en presencia de las composiciones y en su ausencia. Dichas determinaciones proporcionarán unas indicaciones útiles sobre las dosis y los tiempos de administración y la eficacia de una composición dada frente a la neutropenia. En los protocolos de terapia génica, puede realizarse la tinción inmunofluorescente de secciones obtenidas de biopsias de músculo y se puede determinar la expresión del análogo del G-CSF humano en las fibras musculares de las células transducidas.

H. Composiciones farmacéuticas

La presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que constan de cantidades efectivas de productos polipeptídicos de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes o transportadores farmacéuticamente aceptables útiles en el tratamiento con el G-CSF. Dichas composiciones incluyen diluyentes que pueden ser soluciones amortiguadoras de distinta composición (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), distinto pH y distinta fuerza iónica; aditivos como los detergentes y los agentes solubilizantes (p. ej., Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (p. ej., timerosol , alcohol bencílico) y agentes de carga (p. ej., lactosa, manitol); incorporación del material en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos, como los ácidos poliláctivo y poliglicólico, por ejemplo, o en asociación con liposomas. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de aclaramiento in vivo de los análogos del G-CSF considerados. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton PA, páginas 1435-1712.

En el presente documento también se incluyen derivados de los presentes análogos del G-CSF. Dichos derivados incluyen moléculas modificadas por una o más moléculas poliméricas solubles en agua, como el polietilenglicol, o mediante la adición de poliaminoácidos, incluyendo proteínas de fusión (dichos procedimientos se conocen muy bien en el ámbito). Esta formación de derivados puede darse de forma excepcional en los extremos N- o C- terminal o pueden existir múltiples sitios de modificación. La sustitución de uno o más aminoácidos por lisina puede proporcionar lugares adicionales de modificación. (Véanse las patentes estadounidenses núms. US 5 824 784 y US 5 824 778).

Los análogos y los derivados de los mismos considerados pueden formularse para su administración por inyección, oral, nasal, pulmonar, tópica u otras formas de administración que un experto en la materia puede conocer. La formulación puede ser líquida o puede ser sólida, como sustancias liofilizadas que deben ser reconstituidas.

En general, los análogos considerados (o los derivados de los mismos) pueden ser útiles del mismo modo que los G-CSF disponibles actualmente, excepto que los análogos considerados proporcionan una respuesta celular mejorada (actividad superagonista o agonista G-CSF). Dichos cambios en la respuesta celular ocurren al afectar la unión al receptor del G-CSF y a los procesos de derivación, reciclado y degradación a través de las vías de tráfico intracelular endocítico ligando-receptor.

Entre sus aplicaciones se incluyen el tratamiento de una serie de transtornos hematopoyéticos, neurológicos o relacionados con la reproducción. Por tanto, las composiciones consideradas y los métodos para la fabricación de medicamentos pueden ser útiles para tratar dichos trastornos. Entre los trastornos paliados o modulados por la administración de estos análogos se encuentran típicamente aquellos caracterizados por una función inmunitaria o hematopoyética disminuida y más específicamente, un recuento disminuido de neutrófilos. Dichos transtornos pueden verse inducidos durante el transcurso de un tratamiento de otra enfermedad, como la quimioterapia y la radioterapia. Dichos trastornos pueden ser el resultado de una enfermedad infecciosa, como las infecciones bacterianas, víricas, fúngicas u otras. Por ejemplo, la sepsis es el resultado de una infección bacteriana. O dicha alteración puede ser de origen hereditario o ambiental, como la neutropenia crónica grave o las leucemias. La edad también puede ser un factor, como se evidencia en las instalaciones geriáticas, los pacientes pueden presentar un recuento o una movilización de neutrófilos disminuidos. Algunos de dichos trastornos están descritos en Filgrastim (r-metHuG-CSF) En: Clinical Practice, Morstyn y Dexter (eds.), Marcel Dekker, Inc., New York (1993), p. 351. Otros trastornos menos estudiados que pueden paliarse o modularse mediante la administración de estos análogos pueden incluir la reducción de lípidos (o colesterol) en la circulación sanguínea y ciertas alteraciones cardiovasculares, dado que el G-CSF puede inducir la producción de activadores de plasminógeno. Además, las composiciones de análogos del G-CSF consideradas pueden utilizarse para la mobilización de células progenitoras de sangre periférica.

Los análogos del G-CSF considerados (o las composiciones de derivados) también pueden utilizarse in vitro. Por ejemplo, en sistemas para la terapia génica, es deseable transfectar una célula hematopoyética con DNA exógeno y cultivar dicha célula utilizando las formulaciones de análogos de G-CSF consideradas. Así, en otro aspecto, la presente invención abarca un método de cultivar células hematopoyétics in vitro que se basa en a) colocar dichas células en un medio de cultivo apropiado, dicho medio cultivo apropiado contiene una composición de análogo del G-CSF de acuerdo con la presente invención, y b) proporcionar las condiciones apropiadas para el crecimiento de dichas células hematopoyéticas.

Más concretamente, la presente invención proporciona un método para transfectar células hematopoyéticas con DNA exógeno que consta de: a) el cultivo de dichas células hematopoyéticas con una composición de análogo del G-CSF de acuerdo con la presente invención y b) la transfección de dichas células en cultivo con DNA exógeno. Las células hematopoyéticas pueden ser, por ejemplo, células de la médula ósea o células progenitoras de sangre periférica. Además, los expertos en la materia conocen muy bien otras células que pueden utilizarse.

Con el objetivo de preparar composiciones que contengan análogos del G-CSF humano para su utilización clínica, será necesario preparar los vectores de expresión víricos, las proteínas y los ácidos nucleicos como composiciones farmacéuticas, es decir, en una forma apropiada para sus aplicaciones in vivo.

Generalmente, esto supondrá la preparación de composiciones que se encuentren esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que puedan ser dañinas para los humanos o los animales. Generalmente, es deseable utilizar sales apropiadas y tampones que permitan la estabilidad de los vectores y su captación por parte de las células diana. Los tampones también se utilizarán cuando las células recombinantes se introduzcan en un paciente. Las composiciones de la presente invención constan de una cantidad efectiva de análogo del G-CSF humano o un vector de expresión en células, disuelto o disperso en un transportador farmacéuticamente aceptable o un medio acuoso. Dichas composiciones también se denominan inóculos. La frase "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no provocan reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones inesperadas cuando se administran a un animal o un humano. Tal como se usa aquí, "un transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibióticos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos y similares. Se conoce muy bien en el ámbito la utilización de dichos medios y agentes con sustancias activas farmacológicamente. Excepto en el caso de que un medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o las células de la presente invención, se contempla su utilización en composiciones farmacéuticas. También se pueden incorporar en las composiciones principios activos adicionales. Las composiciones activas de la presente invención incluyen preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de dichas composiciones de acuerdo con la presente invención se hará a través de cualquier vía habitual siempre y cuando el tejido diana esté disponible a través de esa vía. Las composiciones farmacéuticas pueden introducirse en el individuo a través de cualquier método convencional, p. ej. vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar (p. ej., term release); mediante administración oral, sublingual, nasal, anal, vaginal o subcutánea, o mediante la implantación quirúrgica en un sitio concreto. El tratamiento puede consistir en una dosis única o en dosis múltiples durante un periodo de tiempo.

Los principios activos pueden prepararse para su administración como soluciones de base libre o de sales faramacéuticamente aceptables en agua combinadas de forma apropiada con un tensioactivo, como la hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones convencionales de almacenamiento y utilización, dichas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas apropiadas para su utilización como inyectable incluyen soluciones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y lo suficientemente fluida para que sea fácil utilizar una jeringuilla para su administración. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse de la acción contaminante de los microorganismos como las bacterias y los hongos. El transportador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas apropiadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, como la lecitina y por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión por la utilización de un tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibióticos y antifúngicos, por ejemplo, parabens, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos (por ejemplo, azúcares o cloruro sódico). La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante la adición de agentes retardantes de la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina) en las composiciones.

Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación del principio activo en la cantidad necesaria en el solvente apropiado con algunos de los ingredientes enumerados anteriormente, cuando se necesiten, tras la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contengan el medio de dispersión básico y el resto de ingredientes necesarios entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización con los que se obtiene un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución filtrada estéril del
mismo.

Tal como se usa aquí, "un transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibióticos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción isotónicos y similares. Se conoce muy bien en el ámbito la utilización de dichos medios y agentes con sustancias activas farmacéuticamente. Excepto en el caso de que un medio o agente conención sea incompatible con el principio activo, se contempla su utilización en composiciones farmacéuticas. También se pueden incorporar en las composiciones principios activos adicionales.

Para la administración oral de polipéptidos de la presente invención se pueden incorporar excipientes y utilizar en forma de enjuagues y dentífricos no ingeribles. Se puede preparar un enjuague incorporando el principio activo en la cantidad necesaria en un solvente adecuado, como una solución de borato sódico (Solución Dobell). De forma alternativa, el ingrediente activo se puede incorporar en un enjuague antiséptico que contenga borato sódico, glicerina y bicarbonato potásico. El principio activo también puede ser dispersado en dentífricos, incluyendo: geles, pastas, polvos y suspensiones. El principio activo también se puede añadir en una cantidad terapéuticamente efectiva a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saborizantes, agentes espumantes y humectantes.

Los compuestos de la presente invención pueden formularse en forma neutra o de sal. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se encuentran las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman a partir de ácidos inorgánicos como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico y fosfórico, o de ácidos orgánicos como los ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse a partir de bases inorgánicas como, por ejemplo, los hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y a partir de bases orgánicas como la isopropilamina, la trimetilamina, la histidina, la procaína y similares.

Los compuestos de la presente invención pueden formularse en forma neutra o de sal. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se encuentran las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman a partir de ácidos inorgánicos como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico y fosfórico, o de ácidos orgánicos como los ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse a partir de bases inorgánicas como, por ejemplo, los hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y a partir de bases orgánicas como la isopropilamina, la trimetilamina, la histidina, la procaína y similares.

En función de la formulación, las soluciones se administrarán de una forma compatible con las dosis de la formulación y en una cantidad terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una serie de formas de dosificación como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución deberá estar tamponada apropiadamente si fuese necesario y el diluyente líquido primero debe ser isotónico con la cantidad suficiente de salino o glucosa. Dichas soluciones acuosas son especialmente apropiadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.

Generalmente, se determinará la cantidad efectiva de los análogos del G-CSF considerados (o sus derivados) en función de la edad, el peso, la enfermedad y la gravedad de la misma, del paciente. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, páginas 697-773, incorporado aquí como referencia. Típicamente, se puede utilizar una dosis entre alrededor de 0,001 \mug/kg de peso corporal/día a alrededor de 1000 \mug/kg de peso corporal/día, pero puede utilizarse más cantidad o menos, como un médico experto reconocerá. La dosificación puede ser de una o más veces al día, o menos frecuentemente y puede realizarse junto con otras composiciones tal y como se ha descrito anteriormente. Cabe destacar que la presente invención no está limitada a las dosificaciones enumeradas aquí.

"Dosis unitaria" se define como una cantidad discreta de una composición terapéutica dispersa en un transportador apropiado. Por ejemplo, cuando los polipéptidos se administran por vía parenteral, las composiciones de polipéptidos se inyectan generalmente en dosis que oscilan entre 1 \mug/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente en dosis que oscilan entre 0,1 mg/kg y 50 mg/kg de peso corporal/día. La administración parenteral puede llevarse a cabo con un bolo inicial seguido de la infusión continua para mantener los niveles terapéuticos circulantes del producto farmacológico. Los habituados a trabajar en este ámbito fácilmente optimizarán los regímenes de administración y dosificación efectivos determinados por las buenas prácticas médicas y el estado clínico de cada paciente individual.

La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y de las vías de administración. Un experto en la materia determinará la formulación farmacéutica óptima dependiendo de la vía de administración y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, páginas 1435-1712. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de aclaramiento in vivo de los agentes administrados. En función de la vía de administración, se puede calcular la dosis apropiada según el peso corporal, las áreas de superficie corporal y el tamaño del órgano. Los expertos en la materia realizan de forma rutinaria un refinamiento posterior de los cálculos necesarios para determinar la dosis de tratamiento apropiada sin experimentación indebida, especialmente a la luz de la información de dosificación descrita aquí, así como de los datos farmacocinéticos observados en animales o en ensayos clínicos en humanos.

Se debe establecer la dosificación apropiada a través de la utilización de ensayos establecidos para determinar los niveles de neutropenia junto con datos relevantes dosis-respuesta. El régimen de dosificación final será determinado por el médico que atienda al paciente, considerando los factores que modifican la acción de los fármacos, p. ej., la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la sensibilidad del paciente, la edad, el trastorno, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. A medida que se realizan los estudios, se dispondrá de más información referente a los niveles de dosificación apropiados y la duración del tratamiento para enfermedades y alteraciones específicas.

En las realizaciones de terapia génica que utilizan liberación vírica, la dosis unitaria debe calcularse en función de la dosis de partículas víricas que se administren. Las dosis virales incluyen un número concreto de partículas víricas o de unidades formadoras de calvas (ufc). Las realizaciones que implican la utilización de adenovirus, entre las dosis unitarias se encuentran las siguientes: 10^{3}, 10^{4}, 10^{5}, 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9}, 10^{10}, 10^{11}, 10^{12}, 10^{13} y 10^{14} ufc. Las dosis de partículas deben ser ligeramente superiores (entre 10 y 100 veces) debido a la presencia de partículas infecciosas defectuosas.

Cabe resaltar que las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento de la invención pueden ser útiles en la medicina humana y en la veterinaria. Así, el sujeto tratado puede ser un mamífero, preferiblemente un humano u otro animal. En el caso de aplicaciones veterinarias, entre los sujetos se incluyen, por ejemplo, animales de granja como vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras; animales de compañía como perros y gatos; animales exóticos y del zoo; animales de experimentación como ratones, ratas, conejos, cobayas y hámsters; y aves de corral como pollos, pavos, patos y ocas.

Ademas, la presente invención contempla un equipo que contiene los componentes para el cultivo de células de médula ósea o de células progenitoras de sangre periférica que consta de a) una composición con un análogo del G-CSF de la presente invención; y b) componentes apropiados para preparar medio para el cultivo de células de médula ósea o de células progenitoras de sangre periférica.

I. Ejemplos

La presente invención se describe en más detalle gracias a los siguientes ejemplos que no son limitantes y que se ofrecen para ilustrar completamente la invención, pero no deben entenderse como una limitación del ámbito de la misma. Los ejemplos ilustran la preparación de los análogos del G-CSF considerados y su ensayo en sistemas in vitro. Los expertos en la materia reconocerán que las técnicas descritas en dichos ejemplos representan técnicas descritas por los inventores para obtener un buen resultado durante la puesta en práctica de la invención, y como tales constituyen las maneras preferidas de llevar a cabo la misma. No obstante, cabe aclarar que los expertos en la materia deben apreciar, teniendo en cuenta la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en los métodos específicos que se describen y, aún así, obtener el mismo resultado o un resultado similar sin alejarse del concepto ni del ámbito de aplicación de la invención.

Ejemplo 1 Fundamento del diseño de los mutantes de histidina

Los mutantes de G-CSF se diseñaron basándose en el principio de que la titulación de la histidina podría mantener una unión relativamente fuerte sobre la superficie celular, pero provocaría una unión más débil en los compartimentos endosómicos. Los mutantes se diseñaron para aprovechar el descenso de pH entre la superficie celular, que es de aproximadamente 7, y los endosomas, que se encuentra entre 5 y 6, de modo que mantienen (o mejoran) en gran medida las interacciones electrostáticas a pH extracelular, pero empeoran la interacción a pH endosómico. El pKa de la histidina en la superficie del ligando libre (\sim6.5) [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742:576-585 (1982)] sugiere que, si se dispone del ambiente proteico local apropiado, la titulación de la histidina puede tener como resultado efectos importantes dependientes de pH sobre la unión entre los medios extracelular y endosómico. Se utilizaron cálculos para identificar localizaciones candidatas para las sustituciones con histidina. Se prefirieron las localizaciones en las que su afinidad de unión calculada era comparable a la de la proteína de tipo salvaje cuando las histidinas eran neutras, y significativamente más débil cuando las histidinas tenían carga positiva.

Ejemplo 2 Preparación y caracterización de los análogos del G-CSF

Los análogos del G-CSF se prepararon por mutagénesis insercional o dirigida de DNA que codifica r-met-HuG-CSF mediante el método de la extensión solapada [Aiyar et al., Meth. Mol. Biol. 57:177-191 (1996)]. Tras confirmar la presencia de las mutaciones por análisis de secuencia, se expresó cada uno de los mutantes en E. coli K12, se permitió su plegamiento y se purificaron tal y como se describe en [Lu et al., J. Biol. Chem. 267:8770-8777 (1992)]. Para los protocolos y los procedimientos [véase, también "Recombinant PCR" Russell Higuchi, en: PCR Protocols, Innis, Gelfand, Sninsky y White (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990); y "Site-directed mutagenesis of cloned DNA", En: Molecular Cloning. A Lab Manual, Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.), Cold Spring Harbor Press, CSH, N.Y. (1989)]. La expresión en E. coli de r-met-HuG-CSF ya estaba previamente descrita. Véanse las patentes estadounidenses núms. US 4 810 643 y US 5 849 883. El DNA que codifica el G-CSF humano recombinante poseía un codón inicial de metionina seguido por los codones para los 174 aminoácidos del G-CSF humano. Los análogos de r-met-HuG-CSF purificados mantienen la Met de iniciación (posición Met -1).

La secuencia de aminoácidos y de ácidos nucleicos para el [His^{l09}]G-CSF se muestran en el ID. de SEC. núm.: 3 (DNA) y 4 (aminoácidos). La secuencia de aminoácidos y de ácidos nucleicos para el [His^{l12}]G-CSF se muestran en el ID. de SEC. núm.: 5 (DNA) y 6 (aminoácidos). La secuencia de aminoácidos y de ácidos nucleicos para el [His^{l12}]G-CSF se muestran en el ID. de SEC. núm.: 7 (DNA) y 8 (aminoácidos).

Se confirmó la identidad de los análogos del G-CSF de la presente invención mediante secuenciación de aminoácidos N-terminales de proteínas intactas. Las secuencias de los análogos del G-CSF purificados coincidían con las secuencias predichas a partir de las secuencias de DNA respectivas como las mostradas en los ID. de SEC. núms.: 3, 5 y 7. Estos métodos se conocen muy bien en el ámbito [Shively, EXS 88:99-117 (2000)].

Preparación de la estructura de los mutantes de histidina

Aritomi et al. [Nature 401:713-717 (1999)] resolvieron la estructura del G-CSF en complejo 2:2 con el dominio de unión a ligando del G-CSFR por cristalografía de rayos X utilizando datos de hasta 2,8 \ring{A} de cristales obtenidos y mantenidos a pH 7,5 [Aritomi et al., Acta Crystallogr. D Biol. Cristallogr. 56: 751-753 (2000)]. La estructura (entrada 1CD9) se obtuvo del Protein Data Bank (Base de datos de proteínas) (www.rcsb.org/pdb/) [Berman et al., Nucl. Acids Res. 28:235:242 (2000)]. Los cálculos descritos aquí se centran en la interficie formada por los segmentos A y B, que es la interficie de unión principal que implica una molécula de G-CSF (A) y un dominio CRH del G-CSFR. Las coordenadas de estas cadenas se extrajeron del archivo de coordenadas, y las posiciones de los átomos de hidrógeno aromáticos y polares se construyeron utilizando CHARMM [Brooks t al., J. Comput. Chem. 4:187-217(1983); Brunger y Karplus, Proteins 4: 148-156 (1988)].

\newpage

Además, se construyeron una pequeña cantidad de posiciones vacías de átomos pesados, todas distantes de la interficie, con geometría estándar utilizando CHARMM. El examen de las cadenas laterales titulables en la interficie del complejo de tipo salvaje, ninguna de las cuales eran de histidina, sugirió el hecho de dejar todos en su estado de titulación estándar a pH neutro.

Mutagénesis in silico de G-CSF de los mutantes de histidina

Mediante un procedimiento in silico se identificaron los sitios potenciales para introducir las mutaciones de histidina. Las conformaciones de las cadenas laterales de todos los ligandos y del receptor en la interficie de unión dentro de una distancia de 10 \ring{A} de la mutación, incluyendo la propia mutación, se volvieron a empaquetar en un esqueleto rígido utilizando una biblioteca de rotámeros estándar [Dunbrack y Karplus, J. Mol. Biol. 230:543-574 (1993)]. La función energética incorporó interacciones de van der Waals e interacciones electrostáticas con una constante dieléctrica dependiente de la distancia (\varepsilon=4r, donde r se expresa en \ring{A}) y sin corte, como se ha puesto en marcha en CHARMM19 [Brooks et al., J. Comput. Chem. 4:187-217 (1983); Gilson y Honig, Nature 330:84-86 (1987)], ampliado para incluir las cargas atómicas parciales PARSE [Sitkoff et al., J. Phys. Chem. 98: 1978-1988 (1994)]. Los complejos de mínima energía se localizaron utilizando la eliminación de extremos cerrados (y A*) [Desmet et al., Nature 356:539-542(1992); Goldstein, Biophys. J. 66:1335-1340(1994)]. Cuando se aplicó este procedimiento al complejo de tipo salvaje, se reconstruyó correctamente la estructura cristalina dentro de la resolución de la biblioteca de rotámeros.

Cálculos electrostáticos de los mutantes de histidina

Los residuos del G-CSF objeto de las mutaciones de histidina se seleccionaron sobre la base de consideraciones electrósticas. Los detalles informáticos fueron similares a los de trabajos publicados [Hendsch y Tidor, Protein Sci. 8:1381-1392(1999)]. Los cálculos electrostáticos continuos se llevaron a cabo mediante la resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann linealizada con métodos de diferencia-finita utilizando una versión modificada localmente del programa informático DELPHI [Gilson y Honig, Nature 330:84-86(1987); Gilson et al., J. Comput. Chem. 9:327-335(1988); Sharp y Honig, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19:301-332(1990)]. Los parámetros PARSE se utilizaron para las cargas atómicas parciales y los radios atómicos [Sitkoff et al., J. Phys. Chem. 98:1978-1988(1994)]. Se utilizó un valor de 4 para la constante dieléctrica de la proteína y de 80 para el solvente. La superficie molecular se describió utilizando una sonda esférica de 1,4 \ring{A}, y la fuerza iónica aparente se escogió para que fuese 145 mM con una capa Stern de 2 \ring{A}. Los cálculos se realizaron utilizando un procedimiento de enfoque en dos etapas con un relleno del 23 y el 92%. Para la visualización de los potenciales electrostáticos, se utilizó un entramado cúbico de 65 x 65 x 65 unidades de rejilla. Para los cálculos de la energía libre de unión electrostática, se utilizó una rejilla de 191 x 191 x 191 (espaciado final de la rejilla 0,476 \ring{A}) y cada valor dado era la media de 10 desplazamientos de la molécula en relación con la rejilla. La complementariedad electrostática sugirió seis sitios candidatos para la mutación. El predominio de regiones demasiado negativas indica una densidad de cargas negativas excesiva, incluyendo las localizaciones correspondientes a los residuos cargados Glu^{19}, Asp^{109} y Asp^{112}, así como los residuos polares Gln^{20}, Thr^{116} y Gln^{119}.

Generación de las estructuras mutantes de histidina

Los complejos mutantes, en los que cada uno de los seis residuos de los ligandos (Glu^{19}, Gln^{20}, Asp^{109}, Asp^{112}, Thr^{116} y Gln^{119}) fueron mutados a histidina individualmente, se generaron por ordenador. Cada posición se sustituyó con dos tautómeros de histidina neutra (protonados en los nitrógenos \delta o \varepsilon, indicados por His\delta^{0} e His\varepsilon^{0}, respectivamente) e histidina cargada positivamente (His^{+}). Se utilizó un procedimiento de minimización obligada en el que se permitió a la cadena lateral del mutante y las de los residuos cercanos una libertad total para reempaquetarse utilizando algoritmos basados en la eliminación de extremos cerrados [Desmet et al., Nature 356:539-542 (1992); Goldstein, Biophys. J. 66:1335-1340 (1994); Leach y Lemon, Proteins 33:227-239 (1998)]. Se visualizó la complementariedad de los complejos mutantes y se comparó con la del tipo salvaje.

Selección de candidatos para mutantes de histidina

Los candidatos para los ensayos experimentales se seleccionaron basándose en el principio de que los mutantes deben unirse tan fuertemente al receptor como el tipo salvaje (o quizá mejor) para que se de una unión mejor del tautómero His^{0} (correspondiente a las condiciones en la superficie celular), y significativamente peor que el tipo salvaje para el tautómero His^{+} (correspondiente a las condiciones en el endosoma). Una vez que la diferencia entre la unión de His^{0} y His^{+} alcanzó valores superiores a unas cuantas kcal/mol, no representaba ningún beneficio aumentarla porque sería superior al coste de desprotonar His^{+} en su estado libre y su unión como His^{0}. Por tanto, se construyeron y purificaron Asp^{l09}His y Asp^{112}His para su caracterización experimental. Además, dado que se predijo que Gln^{ll9}His se uniría mejor que el tipo salvaje en la superficie celular, también se construyó y purificó Gln^{ll9}His, aunque no estaba claro por los cálculos si la unión sería significativamente más débil en el interior de los endosomas.

Valores de energía libre de unión electrostática del tipo salvaje y de los mutantes de histidina

La contribución electrostática a la energía libre de unión en la proteína de tipo salvaje y en cada uno de los mutantes His\delta^{0}, His\varepsilon^{0} e His^{+} se calculó informáticamente mediante un modelo de unión rígida simple y energía electrostática continua. A pesar de no tratar todo los detalles de la unión de forma explícita, este modelo se aplica de forma sencilla y puede ser capaz de distinguir diferencias de unión moderadas y grandes entre los complejos. Los resultados muestran algunos comportamientos distintos. La mayoría de los mutantes muestran una unión de His^{0} (al menos uno de los tautómeros de histidina) casi tan buena como el tipo salvaje, pero no igual (hasta 2,5 kcal/mol peor). Son excepciones a este hecho los siguientes: Glu^{19}His^{0}, que no se tolera en el complejo (se calcula que se une casi 10 kcal/mol peor que el tipo salvaje); y Gln^{119}His^{0}, que se calcula que se une algo mejor que el tipo salvaje (alrededor de 1,7 kcal/mol para el tautómero His\delta^{0}). De modo interesante, Glu^{19} parece ser esencial para la unión al receptor [Reidhaar-Olson et al., Biochemistry 35:9034-9041 (1996); Layton et al., J. Biol. Chem. 274:17445-17451 (1999)]. En un ensayo de proliferación celular, Glu^{19}Ala esencialmente no desencadena respuesta alguna (datos no mostrados) coherente con este cálculo. Para los tres mutantes [Glu^{19}His([His^{19}]G-CSF), Asp^{109}His([His^{109}]G-CSF) y Asp^{112}His([His^{112}]G-CSF)], se predice que cambiará la dependencia de la unión al pH en la dirección deseada porque His^{+} posee una energía libre de unión teórica casi 5 o más kcal/mol peor que His^{0} (y más de 7 kcal/mol peor que el tipo salvaje). Para los otros tres mutantes [Gln^{21}His([His^{21}]G-CSF), Thr^{117}His([His^{117}]G-CSF) y Gln^{119}His([His^{119}]G-CSF)], la diferencia de unión entre His^{0} e His^{+} es demasiado pequeña para estar seguros de las predicciones (menos de 1 kcal/mol).

Ejemplo 3 Materiales de experimentación y cultivo celular

Los siguientes reactivos se obtuvieron de Life Technologies, Inc. (Rockville, MD): medio esencial mínimo alfa (MEM\alpha), L-glutamina, penicilina-estreptomicina y suero fetal bovino (FBS). La solución isotónica para el contador Coulter (ISOTON II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL) fue suministrada por Curtin Matheson Scientific Inc. (Houston, TX).

Para todos los experimentos se utilizó la línea celular en suspensión dependiente de G-CSF OCI/AML1, cedida generosamente por Ernest A. McCulloch [Ontario Cancer Institute (OCI), Princess Margaret Hospital, 610 University Avenue, Toronto, Ontario, M5G 2M9, Canadá]. Las células se cultivaron de forma rutinaria en frascos de cultivo tisular Corning de 75 cm^{2} en medio MEM\alpha con un 20% de FBS, L-glutamina 200 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina y 270 pM de G-CSF en atmósfera humidificada con un 5% de CO^{2}. Se realizaron pases de las células a 10^{5} céls./ml cada 3 o 4 días.

Ejemplo 4 Resultados experimentales obtenidos con los mutantes de histidina Ensayo de proliferación celular

Se compararon los tres mutantes de histidina, [His^{109}]G-CSF), [His^{112}]G-CSF e [His^{119}]G-CSF, con la proteína G-CSF de tipo salvaje en un ensayo de proliferación celular dependiente del G-CSF. Se realizaron pases de las células OCI/AML1 en medio MEM\alpha (sin G-CSF) 24 h antes del inicio del experimento de proliferación celular, momento en el que se incubaron frascos paralelos de células a una densidad de 10^{5} células/ml en medio MEM\alpha con 125 pM del G-CSF salvaje, [His^{109}]G-CSF, [His^{112}]G-CSF o [His^{119}]G-CSF. Se midió el crecimiento celular de cada frasco en los días 2, 5 y 8 con un contador Coulter. Después de dos días, no se detectaron diferencias en la proliferación celular. No obstante, tras cinco días, [His^{119}]G-CSF incrementó significativamente la proliferación celular. En el día ocho, las células tratadas con [His^{119}]G-CSF eran casi el doble de la cantidad de control, y las células tratadas con [His^{109}]G-CSF e [His^{112}]G-CSF mostraron un incremento menor, pero significativo, respecto al control. Por tanto, todos los mutantes mostraron más potencia para estimular la proliferación celular que el G-CSF de tipo salvaje, a pesar del hecho que todos los residuos mutados se encuentran directamente en la interficie con el receptor.

Supresión de ligandos

La supresión de ligandos para cada proteína se valoró en función del tiempo. Como en los experimentos anteriores, se realizaron pases de las células OCI/AML1 en medio MEM\alpha (sin G-CSF) 24 h antes del inicio del experimento de supresión de ligandos, momento en el que en frascos paralelos de células a una densidad de 10^{5} células/ml se incubaron en medio MEM\alpha con 125 pM de G-CSF salvaje, [His^{109}]G-CSF, [His^{112}]G-CSF o [His^{119}]G-CSF. Tras 24 horas, se determinó el número de células en cada frasco tal y como ya se ha descrito y, tras la centrifugación de los sobrenadantes obtenidos mediante centrifugación para sedimentar los restos celulares, se almacenó una alícuota a -20ºC para determinar la concentración de G-CSF. Este procedimiento se realiza cada 24 h durante 8 días. Entonces, se cuantificaron las concentraciones de G-CSF, [His^{109}]G-CSF, [His^{112}]G-CSF e [His^{119}]G-CSF en los sobrenadantes de las muestras de medio mediante equipos de ensayos inmunoenzimáticos sobre fase sólida (ELISA) obtenidos de R&D Systems (Minneapolis, MN). Cada muestra de sobrenadante se valoró por duplicado. Los dos mutantes Asp\rightarrowHis, de los que se predijo que serían los mejores en cuanto a sus propiedades de tráfico intracelular, presentaron semividas 10 veces superiores al G-CSF de tipo salvaje. Además, parece ser que la mejora apreciada inicialmente de la proliferación celular presentada por los dos mutantes Asp\rightarrowHis {[HiS^{109}]G-CSF e [His^{112}]G-CSF} en el día 8 en comparación con el tipo salvaje es el resultado directo de tener suficiente ligando disponible para estimular las células. Además, el mutante Gln\rightarrowHis, [His^{119}]G-CSF, presentó una semivida 6 veces superior al tipo salvaje. Esto fue significativo dado que la potencia de este mutante dio lugar a casi el doble de células que el tipo salvaje en el día 8 y, por tanto, es de esperar que el tráfico intracelular de ese mutante sea superior que el de la proteína de tipo salvaje.

Se llevaron a cabo al menos dos experimentos independientes tanto para los estudios de proliferación celular como para la supresión de ligandos.

Unión de ligandos

La afinidad de unión del análogo del G-CSF como ligando del receptor del G-CSF se valora mediante un
BIAcore®2000 (BIAcore, Inc, Piscataway, NJ). El G-CSF de tipo salvaje con cola de histidina se inmobiliza en la superficie del chip, y se hace pasar receptor libre (alrededor de 0,25-10 nM) sobre el chip para generar una curva de equilibrio estándar y calcular la afinidad de unión de la proteína de tipo salvaje mediante un modelo 1:1. Para determinar la afinidad de unión de cada ligando mutante, se mezcla receptor libre a 2 nM con una concentración conocida del ligando mutante y se hace pasar sobre el chip. Se determinan las afinidades de unión en equilibrio de los mutantes con un modelo de unión competitivo 1:1. Los resultados de afinidad de unión se analizan mediante la aplicación BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.), y se determinan las constantes de disociación en equilibrio (K_{D}).

Para determinar si el aumento de la semivida y de la potencia de los mutantes son atribuibles a unas tasas de reciclado de ligando superiores, se determinaron y presentaron las constantes de esas tasas indicativas de la internalización de complejos y del reciclado de ligando tal y como se describe a continuación.

Internalización de los análogos del G-CSF

Los experimentos de internalización se llevaron a cabo con dos de los análogos del G-CSF,[HiS^{109}]G-CSF e [His^{112}]G-CSF, a lo largo de un periodo de tiempo de 5 min, de forma similar a un trabajo publicado [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol 32:El-E9 (1995)]. Brevemente, se lavaron 10^{8} células dos veces con PBS y se incubaron en hielo con un ligando marcado durante 30 min hasta obtener complejos de superficie. Las células se lavaron nuevamente dos veces en PBS en hielo y se resuspendieron en MEM\alpha a 37ºC en el t=0. Los cambios en los complejos de superficie y en los complejos internos se controlaron durante un periodo de 5 min; la representación de los complejos internos frente a la integral del tiempo de los complejos de superficie tiene como resultado una relación lineal, la pendiente de la cual es la constante de la tasa de internalización de complejos [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257: 4222-4229(1982)]. No se detectaron diferencias en las tasas de internalización entre el G-CSF de tipo salvaje y los análogos [His^{l09}]G-CSF e [His^{112}]G-CSF. Los errores asociados a los experimentos de internalización son las desviaciones estándar de al menos tres experimentos independientes.

Reciclado de los análogos del G-CSF

Los experimentos de internalización se llevaron a cabo con dos de los análogos del G-CSF,[HiS^{109}]G-CSF e [His^{112}]G-CSF, de la misma manera que los experimentos de internalización anteriores, excepto que se hicieron a lo largo de un periodo de 25 min. Los datos obtenidos de los experimentos de reciclado se ajustaron para obtener las constantes de las tasas de reciclado. Se detectó que las constantes de las tasas de reciclado de los mutantes eran al menos un 50% superiores a la del tipo salvaje con un intervalo de confianza del 95% calculado mediante un test t de dos muestras. Los errores asociados a los experimentos de reciclado fueron las desviaciones estándar de al menos tres experimentos independientes. Dichas mejoras en el reciclado del ligando eran el objetivo concreto que se buscaba con la utilización de los modelos informáticos presentados aquí. Mientras que el aumento encontrado en el reciclado proviene efectivamente de un ciclo de internalización, el inmenso aumento de la semivida de los mutantes es el resultado del efecto combinado de la internalización, el reciclado y la reinternalización, y así sucesivamente. Por tanto, el efecto iterativo del fenómeno del reciclado puede mejorar enormemente la potencia al incrementar su vida in vivo y reducir la retroalimentación negativa transmitida por la expansión de las células que poseen el receptor diana inducida por el fármaco.

Por consiguiente, tal como se ha indicado anteriormente, se ha detectado que las sustituciones de histidina de la presente invención tienen como resultado análogos del G-CSF que poseen la misma potencia o superior que el G-CSF de tipo salvaje referente al ensayo de proliferación celular. Asimismo, las semividas de los mutantes fueron entre 6 y 10 veces superiores que las del G-CSF de tipo salvaje. Además, el análogo [HiS^{119}]G-CSF indujo una proliferación celular de casi el doble que el G-CSF de tipo salvaje en el día 8. Asimismo, se mejoró significativamente el reciclado de ligando, aunque la tasa de internalización no cambió. Estos resultados son importantes dado que sugieren que el tráfico intracelular de este mutante está mejorado en relación al tipo salvaje. Dichos cambios en la respuesta celular ocurren al a afectar la unión al receptor del G-CSF o a los procesos de derivación, reciclado y degradación a través de las vías de tráfico intracelular endocítico ligando-receptor.

La metodología presentada aquí es generalizable a otros sistemas distintos al sistema G-CSF/G-CSFR. Dada una estructura en cristal de un complejo ligando-receptor, la técnica del "cambio a histidina" proporciona un método para la generación de mutantes que aporta una mejora en el reciclado endosómico de sus componentes durante el tráfico intracelular de complejos. Este trabajo constituye el primero que demuestra el diseño racional de un fármaco en el contexto del análisis de sistemas a nivel celular, y no únicamente la unión individual o los acontecimientos de señalización en sí mismos.

Aunque la presente invención ha sido descrita en términos de realizaciones preferidas, los expertos en la materia entenderán que pueden presentarse variaciones y modificaciones. Por tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas cubran todas esas variaciones que entran dentro del ámbito de aplicación de la invención tal y como se reivindica.

<110> Sarkar, Casim

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Lauffenburger, Douglas

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Tidor, Bruce

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<120> Composiciones de análogos del G-CSF y métodos

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<130> 01017/37377

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 565

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (33)..(554)

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 565

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (359)

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<223> y = c o t

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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5

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<210> 5

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<211> 565

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (33)..(554)

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (368)

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<223> y = c o t

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<400> 5

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6

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<210> 6

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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7

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<210> 7

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<211> 565

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<221> misc_feature

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<222> (389)

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<223> y = c o t

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<221> CDS

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<222> (33)..(554)

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<400> 7

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8

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<210> 8

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

9

Claims (16)

1. Un polipéptido análogo al factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) humano que comprende la sustitución de un aminoácido de la secuencia del ID. de SEC. núm.: 2, seleccionada del grupo formado por:

a) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición número 109, [His^{109}]G-CSF;

b) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición número 112, [His^{112}]G-CSF;

c) una sustitución de glutamina por histidina en la posición número 119, [His^{119}]G-CSF;

d) cualquiera de dichos análogos o subpartes (a-c) que incluyen opcionalmente un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

2. Un polipéptido análogo al G-CSF de la reivindicación 1, del que se obtiene un derivado con uno o más polímeros solubles en agua.

3. Una composición farmacéutica que consta de un polipéptido análogo al G-CSF de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, y un transportador farmacéuticamente aceptable.

4. Un polinucleótido que codifica un polipéptido análogo al G-CSF humano que comprende la sustitución de un aminoácido en la secuencia con ID. de SEC. núm.: 2, seleccionada del grupo formado por:

a) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición número 109, [His^{109}]G-CSF;

b) una sustitución de ácido aspártico por histidina en la posición número 112, [His^{112}]G-CSF;

c) una sustitución de glutamina por histidina en la posición número 119, [His^{119}]G-CSF; y

d) cualquiera de dichos análogos o subpartes (a-c) que incluyen opcionalmente un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

5. Un polinucléotido de la reivindicación 4 en el que dicha molécula se selecciona del grupo formado por:

a) las secuencias de DNA presentadas en los ID. de SEC. núms.: 3, 5 y 7 (y sus cadenas complementarias); y

b) cualquiera de dichas secuencias de DNA o subpartes (a) que adicionalmente codifican un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

6. Un constructo de expresión que contiene un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4.

7. Una célula huésped que contiene un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4.

8. La célula huésped de la reivindicación 7 en la que dicha célula huésped es seleccionada del grupo formado por bacterias, células de mamífero, células cancerosas, células de levaduras y células de insecto.

9. Un procedimiento para producir los polipéptidos análogos al G-CSF [His^{109}]G-CSF, [His^{112}]G-CSF e [His^{119}]G-CSF, o las proteínas Met^{-1} de los mismos, en una célula huésped que contiene ácidos nucleicos que codifican dichos análogos, en el que dicho procedimiento comprende:

a) el cultivo de dicha célula huésped, que contiene un polipéptido según la reivindicación 4, en condiciones que facilitan la expresión de dicho polipéptido; y

b) la obtención de dicho polipéptido análogo al G-CSF.

10. La utilización de un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 para preparar una composición farmacéutica destinada al tratamiento de alteraciones hematopoyéticas, neurológicas o relacionadas con la reproducción.

11. La utilización de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicha alteración se selecciona del grupo formado por: función hematopoyética disminuida, función inmunitaria disminuida, recuento de neutrófilos disminuido, movilización de neutrófilos disminuida, movilización de células progenitoras de sangre periférica, sepsis, neutropenia crónica grave, trasplantes de médula ósea, enfermedades infecciosas, leucopenia, trombocitopenia, anemia, mejora de la funcionalidad de la médula ósea trasplantada, mejora de la recuperación de médula ósea tras la radioterapia, aplasia o mielosupresión de la médula ósea inducida por compuestos químicos o quimioterapia y síndrome de la inmunodeficiencia adquirida.

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12. La utilización de un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 para preparar una composición farmacéutica destinada a sensibilizar las células a la quimioterapia y la radioterapia.

13. La utilización de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en la que dicha composición farmacéutica incluye al menos un factor adicional seleccionado entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGP-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 y un factor de crecimiento de fibroblastos.

14. Un método para el cultivo de células hematopoyéticas in vitro que comprende:

a) la colocación de dichas células en un medio de cultivo apropiado, dicho medio de cultivo apropiado contiene un polipéptido análogo al G-CSF de acuerdo con la reivindicación 1; y

b) la provisión de las condiciones apropiadas para el crecimiento de dichas células hematopoyéticas.

15. El método de la reivindicación 14 en el que dichas técnicas de cultivo incluyen la utilización de al menos un factor adicional seleccionado entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGP-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 y un factor de crecimiento de fibroblastos.

16. Un equipo que contiene componentes para el cultivo de células hematopoyéticas que comprende:

a) cualquier de los polipéptidos análogos de la reivindicación 1;

b) componentes apropiados para la preparación de medio para el cultivo de células hematopoyéticas; y

c) opcionalmente, al menos un factor adicional seleccionado entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1, IL0, IL-12, interleucinas, IGP-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 y un factor de crecimiento de fibroblastos.