KR20070019524A - 암 진단 마커 및 방법 - Google Patents

암 진단 마커 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070019524A
KR20070019524A KR1020060006279A KR20060006279A KR20070019524A KR 20070019524 A KR20070019524 A KR 20070019524A KR 1020060006279 A KR1020060006279 A KR 1020060006279A KR 20060006279 A KR20060006279 A KR 20060006279A KR 20070019524 A KR20070019524 A KR 20070019524A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
axon
cancer
region
probe
csf
Prior art date
Application number
KR1020060006279A
Other languages
English (en)
Inventor
이상엽
유내춘
유소영
금기창
유원민
Original Assignee
메디제네스(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메디제네스(주) filed Critical 메디제네스(주)
Priority to KR1020060006279A priority Critical patent/KR20070019524A/ko
Priority to CA002637835A priority patent/CA2637835A1/en
Priority to RU2008134107/13A priority patent/RU2008134107A/ru
Priority to PCT/KR2007/000300 priority patent/WO2007083929A1/en
Priority to AU2007206165A priority patent/AU2007206165A1/en
Priority to US12/161,005 priority patent/US20090269750A1/en
Priority to EP07708508A priority patent/EP1974036A4/en
Priority to BRPI0706936-7A priority patent/BRPI0706936A2/pt
Priority to JP2008551185A priority patent/JP2009523443A/ja
Priority to CNA2007800026283A priority patent/CN101443449A/zh
Publication of KR20070019524A publication Critical patent/KR20070019524A/ko
Priority to IL192875A priority patent/IL192875A0/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01R—ELECTRICALLY-CONDUCTIVE CONNECTIONS; STRUCTURAL ASSOCIATIONS OF A PLURALITY OF MUTUALLY-INSULATED ELECTRICAL CONNECTING ELEMENTS; COUPLING DEVICES; CURRENT COLLECTORS
    • H01R31/00—Coupling parts supported only by co-operation with counterpart
    • H01R31/06—Intermediate parts for linking two coupling parts, e.g. adapter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 암 진단 마커 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF, Granulocyte Colony Stimulating Factor) 유전자의 변이 특성을 이용하여 암을 진단하기 위하여, 암 진단용 마커로서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 염기 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드를 이용한 암 진단 및/또는 진행상태 평가 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, G-CSF의 유전자 변이 특성을 이용하여 빠르고 정확하게 암을 진단할 수 있다.
G-CSF 유전자, 스플라이스 접합 부위, 암 진단

Description

암 진단 마커 및 방법{Marker and Method for Cancer Diagnosis}
도 1은 인체 유래 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 두 가지 형태 (A형, B형)에 의해 이루어 질 수 있는 액손 2 영역과 액손 3 영역의 접합 (junction) 부위를 도시한 것이다.
도 2는 인체 유래 G-CSF 유전자로부터 변이체 및 정상 단백질이 생성되는 과정을 간략하게 도시한 것이다.
도 3은 중합 효소 연쇄반응에 사용된 프라이머가 붙는 위치와 이에 따른 예상할 수 있는 중합 효소 연쇄 반응 산물을 도시한 것이다.
도 4는 증폭된 G-CSF 유전자의 각 부위의 탐침으로 구성된 DNA 칩의 디자인이다 (E2: G-CSF 유전자의 액손 2 영역 중에서 디자인된 탐침; E2E3a: A형 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 3 영역의 5' 말단이 연결된 부위에서 디자인된 탐침; E2E3b: B형 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 3 영역의 5' 말단이 연결된 부위에서 디자인된 탐침; E3-1, E3-3, E3-4 및 E3-6: G-CSF 유전자의 액손 3 영역 중에서 디자인된 탐침들; E2E4a: A형 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 부위에서 디자인된 탐침; E2E4b: B형 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 부위 에서 디자인된 탐침; P: 위치 마커로서 형광표지로 위치를 구분하도록 제작된 탐침; N: 음성 대조구 (고정액(spotting solution)).
도 5는 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 4의 DNA 칩에서의 혼성화 반응결과를 보여준다. 결과의 신뢰도를 예측하기 위하여 각 염기서열을 알고 있는 벡터를 가지고 혼성화 반응을 실시하였다. 붉은색 원은 시그널을 나타내는 탐침을 나타내고 있다.
도 6은 세포 및 조직 종류에 따른 도 4의 DNA 칩에서의 혼성화 반응결과를 나타낸 것이다 (A: 정상 사람 혈액, B: 폐암 (A549), C: 대장암 (SES-T), D: 위암 (1: AGS, 2: YCC-2, 3:황OO), E: 자궁경부암 (1: C33A, 2: HeLa), F: 육종 (HT1080), G: 유방암 (MDA-MB-231), H: 췌장암 (Capan-2), I: 간암(SK-Hep1), J: 흑색종 (SK-Mel), K: 백혈병 (Jurket cDNA library), L: 배아신장 (293)). 도면에서 붉은 색 원은 암조직과 정상조직을 구분할 수 있는 탐침의 시그널을 나타내고 있다.
도 7은 G-CSF 유전자의 스플라이스 접합 (Junction)부위를 표적으로 하여 제작된 탐침으로 이루어진 DNA 칩의 도식도이다 (E2E4: G-CSF 유전자의 두 가지 형태(A형, B형)의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단 연결된 부위에서 디자인된 탐침; E2E3: G-CSF 유전자의 두 가지 형태(A형, B형)의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 3 영역의 5' 말단 연결된 부위에서 디자인된 탐침; P: 위치 마커로서 형광표지로 위치를 구분하도록 제작된 탐침; N: 음성 대조구(고정액).
도 8은 세포 및 조직 종류에 따른 도 7의 DNA 칩에서의 혼성화 반응결과를 나타낸 것이다. 혼성화 반응은 스캔어레이 5000을 이용하여서 이미지를 획득하였다. 도면에서 나타나는 붉은 색원은 암에서만 특이적으로 시그널을 나타낼 수 있는 탐침을 나타낸 것이다.
도 9는 각 탐침들의 진단에 대한 효율성을 시험하기 위해 G-CSF 유전자의 각 액손 영역으로부터 디자인된 탐침들이 고정된 DNA 칩의 도식도이다.
도 10은 G-CSF 유전자에서 각 탐침들의 위치를 나타낸 도식도이다. 액손 3이 결실된 G-CSF의 유전자에 대한 탐침들 중 타원 내에 포함된 탐침은 스플라이싱 변이체의 액손 2의 3' 말단과 액손 4의 5' 말단으로 디자인된 탐침이다.
도 11은 각 탐침들이 세포의 종류에 따라 나타내는 시그널의 정도와 이로부터 추정할 수 있는 실효성 있는 탐침후보군을 표시한 도식도이다.
도 12는 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 9의 DNA 칩에서의 혼성화 반응결과를 보여준다. 결과의 신뢰도를 예측하기 위하여 각 염기서열을 알고 있는 벡터를 가지고 혼성화 반응을 실시하였다. 붉은색 원은 암에서만 특이적으로 시그널을 나타낼 수 있는 탐침을 나타내고 있다.
도 13은 세포 및 조직 종류에 따른 도 9의 DNA 칩에서의 혼성화 반응결과를 나타낸 것이다. 혼성화 반응은 스캔어레이 5000을 이용하여서 이미지를 획득하였다 (A: 정상 혈액(WBC), B: 293(신장 배아 세포), C: SES-N(정상 대장), D: SEES-T (대장암), E: Colo205(대장암), F: DLD-1(대장암), G: 황OO (위암), H: YCC-3(위암), I: YCC-2(위암), J: MDA-MB-231(유방암), K: NCl-H460(폐암), L: Caki-2(신장암), M: Capan-2(췌장암), N: SK-Mel2(흑색종), O: HepG-2(간세포암종), P: SK- Hep1(간암)). 도면에서 나타나는 붉은 색원은 암에서만 특이적으로 시그널을 나타내는 탐침을 나타낸 것이다.
도 14는 각각의 15mer 프로브를 50uM의 농도로 3X SSC 스폿팅 용액에 혼합하여 제조한 DNA칩을 나타낸 것이다. 파란 네모로 표시된 부분은 암을 나타내는 탐침이 위치하는 영역이다.
도 15는 상기의 DNA칩을 사용하여 실시예 8과 9에 따라 정상인 및 환자로부터 증폭된 프라이머 32 및 33에 대한 증폭 생산물에 대한 혼성화 결과를 나타낸 것이다.
발명의 분야
본 발명은 암 진단 마커 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF, Granulocyte Colony Stimulating Factor) 유전자의 변이 특성을 이용하여 암을 진단하기 위하여, 암 진단용 마커로서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 염기 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드를 이용한 암 진단 및/또는 진행상태 평가 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
현대사회에 있어 각종 사고를 제외한 성인의 사망원인 1-2위를 다투고 있는 질병인 암에 있어서 그 조기 진단 및 근원적 치료법의 개발이 중요한 과제가 되고 있다.　 현재 일반적으로 행해지고 있는 암의 진단은 (1) 광학현미경, 전자현미경 등을 이용한 형태학적 분석을 통한 형태학적 진단, (2) 암조직 내에서 발현되는 특정한 단백질의 분석을 통한 면역조직화학적 진단(Iran. Biomed.J. 3 (3 & 4): 99-101, 1999; Lancet 2:483-6,1986), (3) 암조직 내에서 나타나는 유전자의 돌연변이와 같은 분자 생물학적 이상의 분석을 통한 분자생물학적 진단 등의 방법들을 이용하여 이루어진다.　 이들 방법 중 형태학적 진단이나 면역조직학적 진단의 경우 분자생물학적 진단과 비교하여 훨씬 더 많은 시간이 소요되며 경제적인 부담 또한 훨씬 높다.　 분자생물학적 방법은 그 작업이 상대적으로 단순하며 몇몇 경우에는 단시간에 결과를 알 수 있기 때문에 현재 새로운 진단방법 개발 연구의 중심이 되고 있다.　 최근 상해에 있는 Health Digit사가 다양한 암 진단을 위한 단백질칩 시스템을 개발하였고, 세계 최초로 중국 의약품 안전청으로부터 임상 진단 허가를 받았다는 보고도 있었다(www.health-digit.com).　 하지만, 이것 역시 하나의 바이오마커(biomarker)로 모든 암을 진단하는 형태가 아니라, 10개 이상의 많은 단백질을 이용하는 형태이다.
상기와 같은 방법들의 효율적인 적용에 있어서 가장 중요한 것은 암 발생여부를 보다 정확하고 손쉽게 확인할 수 있는 암 진단 마커의 선택 및 사용이다.　 암 진단 마커(marker)로서 몇몇 유전자(Steve M. et al., J. Clin. Oncology 20:3165-3175, 2002; Sridlhar R. et al, J. Clin. Oncology 20:1932-1941, 2002) 또는 단백질(Goessl et al., Urology 58:335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res Treat 66:217-224, 2001; 김철근 외, 대한민국 특허공개번호 2001-0061173)이 보고되어 있으며 이 중에서 실제 진단에 이용되고 있는 경우도 있다.　 기존에 사용되고 있는 암에 대한 마커의 경우 장기 특이성이 낮은 CEA, BFP, TPA, IAP의 경우는 민감도가 떨어져서 가양성(false positive)의 우려가 있으며, 반면, 장기 특이성이 높은 AFP, PIVKA II, Esterase I, CA19-9, CA50, SPan-1, Antigen, CA15-3, BCA 225 등의 마커의 경우는 당초부터 표적장기를 목적으로 이용하는 때에만 유용한 단점이 있다.
포스트 게놈 시대에 이르러 많은 유전자에 대한 정보와 동시에 이들을 해석하려는 노력으로 고안된 마이크로어레이 기술은 또한 암이 일어나는 기작과 이와 관련된 유전자 후보군들을 발굴하는데 많은 기여를 하여서 이 기술을 통해 많은 종류의 암 진단 마커 후보군이 발굴되고 있는 상황이다. 이들은 다른 병리학적 생리학적 상태에 따라 다르게 나타나게 되는 후보군을 지목하면서 진단학적 유효성이 있는 유전자를 발굴하고자 하고 있다 (Liu, H.X. et al., Nat. Genet. 27: 55-58, 2001; Wilson, C.A. et al., Oncogene 14:1-16, 1997; Weissensteiner T., Nucleic Acids Res. 26: 687, 1998; Zolezzi, F. et al., Am. J. Med. Genet. 71: 366-370, 1997; Mottes J. R. and Iverson, L.E., Neuron 14:613-623, 1995; Crook, R. et al., Nat. Med. 4:452-455, 1998; Jiang, Z.H. and Wu, J.Y., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 220:64-72, 1999).
그러나, 상기 방법들을 통해서 발굴되는 암진단 표지인자 후보군들은 거의 대부분이 EST(Expressed Sequence Tag)로 이루어져 있으므로 이들은 하나의 데이터의 특징으로써 정의되어질 뿐 신뢰를 줄 만한 특정 후보군을 선별하기까지와 이들이 또한 어느 유전자로부터 유래되어 있는지를 알아내는 것 또한 해결해야 될 과제가 된다. 특히 인간 게놈 유전자 해석을 통해 알려진 유전자의 수와 이들로부터 많은 이소형태(isoforms) 혹은 변이체(variants)가 발현되어 생물학적인 기능과 그 복잡성을 가지게 된다는 것을 알게 된 지금 게놈 전체를 통한 변이체들이 어떤 유전자에서 어떤 환경에서 발현되며 이들의 기능이 무엇인지를 알아내는 것이 앞으로의 또 다른 큰 과제가 되었다. 이러한 다양한 변이체의 존재는 이들 중 잘못된 변이체의 형성과 암의 발생과의 가능성을 가늠케 하는 좋은 근거가 될 수 있다 (cartegni, L. et al., Nat. Rev. Genet. 3:285-298, 2002; Schweighoffer, F. et al., Pharmacogenomics 1:187-197, 2000; Blencowe, B.J., Trends Biochem. Sci. 25:106-110, 2000; Cooper, T.A. and Mattox, W., Am. J. Hum. Genet. 61:259-266, 1997).
본 발명자들 또한 다양한 종류의 암을 진단할 수 있는 새로운 암 진단 마커를 개발하기 위해 오랜 기간에 걸쳐 연구해 왔으며, 그 결과 암세포 또는 암조직의 경우 G-CSF 유전자의 전사 과정에서 액손 3 영역의 결손이 특이적으로 나타남을 확인하고 국제특허출원 PCT/KR02/01825 (공개번호: WO 03/027288 A1)를 통해 G-CSF mRNA 또는 cDNA 변이 단편 또는 단백질을 암 진단 마커로 사용하여 암을 진단하는 방법에 관한 발명을 출원하였다. 암 진단 마커로 유전자 단편을 이용하는 마이크로어레이에 있어서, 상기 국제특허출원은 생물학적 시료 중에서 액손 3 영역이 결 실된 G-CSF 유전자 단편을 검출하기 위하여 G-CSF 유전자의 액손3 DNA 단편과 함께 G-CSF 유전자의 액손 1, 2, 4 및 5의 DNA 단편 중 하나 이상의 단편을 탐침 핵산으로 사용한다.
본 발명자들에 의해 개발된 G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 결실여부를 측정하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법은 유전자 변이체의 특징을 응용하여 암을 진단하고자 한 기술 중 하나로 거의 대부분의 암에 그 변이체가 나타남으로써 좋은 암진단 마커의 후보에 속한다고 할 수 있다. 한편, G-CSF 유전자를 포함하여 유전자는 일반적으로 그로부터 많은 종류의 이성질체와 변이체가 생성될 수 있기 때문에, G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 결실여부를 측정함에 있어서 마이크로어레이 상에 고정된 탐침 단편들은 고도의 민감성을 나타내야 한다. 또한, 암세포 또는 암조직의 경우 변이된 G-CSF 유전자와 함께 정상적인 G-CSF 유전자 또는 이의 단편들이 존재할 수 있으므로, G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 결실 여부만을 측정하여 암을 진단하는 것은 신뢰도나 민감도가 떨어질 수 있으며 게다가 암의 진행 상태를 파악하는데 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 액손 3 영역이 결실된 G-CSF 유전자 단편을 검출하기 위한 핵산 탐침 (probe)으로서, 상기 요건을 충족하거나 문제점을 해소할 수 있는 새로운 핵산 탐침을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 염기 서열을 포함한 올리고뉴클레오티 드를 암 진단 마커로 사용하고, 그러한 핵산 탐침은 암을 진단하는데 있어서 다른 탐침에 비하여 현저히 증가된 고도의 민감성을 나타낸다는 것을 확인할 뿐만 아니라, G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 염기 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드를 G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 전체 또는 일부 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 함께 암 진단 마커로 병용함으로써 암의 진행 상태를 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 목적은 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 암 진단용 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 함유하는 암 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드를 이용한 암 진단 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 (splice junction) 부위의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 암 진단 마커용 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오티드를 함유하는 암 진단용 키트를 제 공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 전체 또는 일부 염기 서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드를 추가로 함유하는 암의 진행 상태 평가용인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 포유동물의 생물학적 시료로부터 G-CSF 핵산 시료를 수득하는 단계; (b) 수득된 G-CSF 핵산 시료를 증폭시키는 단계; 및 (c) 증폭된 시료에서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 유무를 확인하는 단계를 포함하는 하는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 (c) 단계에서 증폭된 시료에서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열 유무와 함께 액손 3 영역의 전체 또는 일부 염기 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 유무를 동시에 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 전사 후 과정에서 생겨나는 G-CSF 유전자의 변이 단편으로서 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 스플라이스 접합(Splice Junction) 부위의 염기서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드를 탐침으로 사용하여 마이크로 어레이를 포함한 유전자적 분석 방법으로 암을 진단하고/하거나 암의 진행 상태를 평가하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 G-CSF 유전자에서 액손 3 영역이 결실되어 액손 2 영역과 액손 4 영역이 결합된 G-CSF 유전자의 변이체를 암 진단 마커로 사용하여 암을 진단하고/하거나 암의 진행 상태를 평가하는 방법에 대한 것이다.
암세포에서 특이적으로 발현되는 (또는 억제되는) 유전자 및 유전적 돌연변이 등을 확인하는 분자생물학적 방법으로는 예를 들면, 중합효소 연쇄반응 (PCR, Polymerase Chain Reaction)(Bottema, C.D., Mutat Res. 1993:233, 93-102; Nelson, D.L., Curr . Opin . Genet . Dev. 1991:1, 62-68; Pourzand, C. and Cerutti, P., Mutat. Res. 288: 113-121, 1993; Holland PM et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 8: 7276-7280, 1991), 단일 가닥 입체 다형화(SSCP, Single-Stranded Conformation Polymorphism)(Glavac D., Hum. Mutat. 19:384-394, 2002; Strippoli, P. et al ., Int . J. Mol . Med. 8: 567-572, 2001), DNA 염기서열 분석(DNA Sequencing Analysis) (Sanger, F. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 74:6463-5467, 1997), 단백질 절단 테스트 (PTT, Protein Truncation Test) (Hardy, C.A., Methods Mol . Biol. 187, 87-108 , 2002), 자동염기서열 분석법(Boutin P. et al ., Hum . Mutat. 15(2):201-203, 2000), LOH(loss of heterozygosity) 연구(Yang Q. et al ., Clin . Cancer Res. 8:2890-2893, 2002), MSI(microsatellite instability) 연구(Furlan, D. et al ., J. Pathol . 197:603- 609, 2002), MALDI-TOF를 이용한 유전자 검사(Leushner J., Expert . Rev . Mol . Dign. 1:11-18, 2001), 혼성화 반응(Hybridization)을 통한 유전자 검사(Wetmur, J. G., Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol. 26:227-259, 1991), DNA 칩을 통한 유전자 검사 (Goes니 et al ., Urology , 58:335-338, 2001; Zhou et al ., Brest Cancer Res . Treat . 66:217-224, 2001; 김철근 외, 대한민국 특허공개번호 2001-0061173), 단백질 칩을 이용한 검사(Pharmacogenomics 1:385-393, 2000) 등이 진단에 사용될 수 있다. 따라서 당업자는 상기 열거된 방법을 포함한 공지된 분자생물학적 방법을 적절히 응용하여 G-CSF의 전사 후 과정에서 일어나는 본 발명에 따른 특이 변이체의 스플라이스 접합 부위의 유무를 용이하게 확인할 수 있음을 이해할 것이다. 특히 이러한 변이체의 유무를 확인할 수 있는 가장 실효성 있는 탐침은 Splice Junction부위의 유무를 확인할 수 있는 탐침 후보군만이 가능함을 발견하고 이러한 유무를 확인할 수 있는 진단 방법을 발명하게 되었다. 그러나, 이용될 수 있는 상기 많은 방법 가운데, 본 발명에 따른 G-CSF의 전사 후 과정에서 생겨나는 특이 변이체의 확인은 PCR, 혼성화 반응, DNA 칩을 이용하는 것이 바람직하며 용이하다.
본 발명에 따른 암 진단을 위해 선행되어야 하는 것은 피검 조직 또는 세포로부터 G-CSF 유전자 및 이의 변이체를 획득하는 것이다.　 보통 조직 또는 세포로부터 분리되는 특정 유전자 시료는 미량이므로 PCR 반응에 의해 증폭되어야 하며 이러한 증폭을 위해서는 프라이머가 고안되어야 한다.　 본 발명에 있어서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역과 액손 4 영역의 스플라이스 접합 부위의 전체 또는 이의 일 부를 증폭하기 위해 그러한 스플라이스 접합 부위의 유무를 검출하기 위한 프라이머인 DNA 핵산 단편이 필요하다.　 즉, 본 발명에서 프라이머는 액손 2 영역과 액손 4 영역의 스플라이스 접합 부위의 일부 또는 전체를 포함하는 G-CSF 유전자의 핵산서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.　 이러한 프라이머를 고안하는 것은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.　 따라서, 상기 스플라이스 접합 부위의 일부 또는 전체를 포함하는 G-CSF 유전자 변이체를 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 본 발명의 프라이머 범위에 포함된다.
본 발명의 한 양태는 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 스플라이스 접합 부위를 포함한 DNA 단편이 부착되어 있고 암을 진단하는데 유용한 유전자 마이크로어레이 또는 멤브레인을 포함한다.　 유전자 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스(slide glass) 표면 위에 올리고뉴클레오티드 탐침을 부착하여 혼성화 방법으로 탐침에 상보적인 유전자를 검출하는데 이용될 수 있는 것으로 DNA 칩 등이 이에 포함된다.　 멤브레인은 혼성화 반응에 있어서 슬라이드 글라스 대신 사용할 수 있는 것으로 특별히 한정되지 않으며 DNA 단편을 고정화할 수 있는 것은 모두 사용될 수 있다.　 바람직하게는, 나일론 또는 니트로셀룰로스 멤브레인을 이용할 수 있다.
슬라이드 글라스, 멤브레인 등의 표면에 탐침을 고정하는 것은 본 분야의 공지 기술을 통해 용이하게 실시될 수 있다.　 또한, 표적의 준비 및 혼성화와 스트립핑도 통상적인 기술에 따라 실시될 수 있다.
본 발명의 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 스플라이스 접합 부위를 포함한 DNA 단편과 진단학적으로 허용되는 통상적인 담체를 포함하는 암 진단용 조성물을 포함한다.　 본 발명의 또 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3' 말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 스플라이스 접합 부위를 포함한 DNA 단편과 이것을 이용한 DNA 마이크로 어레이를 포함한 진단 키트를 포함한다.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 암 진단 마커로 사용하기 위한 용도로서의 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 관점으로서, 본 발명은 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하고 G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 전체 또는 일부 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 추가로 포함하여 암의 진행 상태를 평가하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 포유동물의 생물학적 시료로부터 G-CSF 핵산 시료를 수득하는 단계, (b) 수득된 G-CSF 핵산 시료를 증폭시키는 단계 및 (c) 증폭된 시료에서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 포함한 핵산 분자의 유무를 확인하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 포유동물의 생물학적 시료로부터 G-CSF 핵산 시료를 수득하는 단계, (b) 수득된 G-CSF 핵산 시료를 증폭시키는 단계 및 (c) 증폭된 시료에서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 포함한 핵산 분자의 유무와 함께 G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 전체 또는 일부 염기 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드의 유무를 동시에 확인하여 암의 진행 상태를 평가하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 조직(세포)별 샘플의 획득
본 발명의 실시예에서 사용한 정상 세포와 암세포는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 표 중에서 색이 쳐진 샘플은 정상과 같은 결과를 나타내는 경우이다.
종 류 분양 기관
배양 세포주 암 A549 폐암 세포주 ATCC CCL-185
HCT116 장암 세포주 ATCC CCL-247
Colo205 ATCC CCL-222
DLD-1 ATCC CCL-221
HeLa 자궁 경부암 세포주 ATCC CCL-2
C33A ATCC HTB-231
HT1080 육종 세포주 ATCC CCL-121
AGS 위암 세포주 ATCC CRL-1739
YCC-2 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
YCC-3 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
MDA-MB-231 유방암 세포주 ATCC HTB-26
Caki-2 신장암 세포주 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
Capan-2 췌장암 세포주 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
HepG-2 간세포암 세포주 ATCC HB-8065
SK-Hep1 간암 세포주 ATCC HTB-52
SK-Mel2 흑색종 세포주 ATCC HTB-68
Jurket cDNA library 백혈병 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
U87-MG 뇌암 세포주 한국세포주은행 KCLB3004
정상 293 신장 배아세포주 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
조직 암 SES-T 장암 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
황OO 위암 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
정상 Human Blood 백혈구 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
SES-N 장 연세대학교 의과대학 암전이연구센터
상기 암세포주 모두는 상기 표에 기재된 기관으로부터 자유롭게 분양 받아 이용될 수 있는 것이다. 연세대학교 의과대학 암전이 연구센터로부터 분양 받은 암세포주의 경우는 다음과 같은 방법으로 제작된 것이다. 진행성 암 환자로부터 무균적으로 복수를 얻어 세포의 클럼핑(clumping)을 방지하기 위하여 헤파린(heparin) 10unit/ml을 첨가 후, 400 x g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리하여 획득한 침전세포를 25㎠ 플라스크에 배양하였다. 적혈구가 다량 함유된 경우에는 피콜-하파큐(Ficoll-Hypaque)로 800 x g 에서 비중원심 분리 후 단핵구층만을 얻어 5% CO2 37℃에서 배양하였다. 배양 하루(16-18시간) 후 배양액을 다시 400 x g에서 10분간 원심분리하고 침전세포를 다른 25㎠ 플라스크에 배양하였다. 배양액중의 세포 상태를 위상차 현미경으로 관찰하면서 주 2-3회 새로운 배지로 교환하였다. 세포 관찰 시 암세포 군락이 확인되면 효소인 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 처리하거나 또는 콜로니(Colony)를 얻거나 또는 스크래퍼(Scraper)를 이용하여 암세포 군락만을 획득하거나 또는 부유액에 존재하는 암세포를 다시 원심 하여 정상세포 등을 제거하여 순수한 암세포만을 얻어서 패시지(passage)별로 세포 동결하여 보관하였다. 사람 백혈구 세포의 경우는 다음과 같은 방법으로 획득할 수 있다. 혈액 8mL을 50mL Corning tube에 옮겨 RBC lysis buffer 24mL을 첨가하여 간간히 섞어주면서 4℃에서 10분간 놓아둔다. 4℃, 2,000rpm에서 12분간 원심 분리하여 백혈구 펠렛을 확인한 후 상층액을 버린다. 만약 RBC(적혈구)가 있는 경우 위의 과정을 반복한다. 최종 얻어진 백혈구 펠렛에 TRIZOL을 넣고 RNA를 뽑을 수 있다.
실시예2 : 세포로부터의 mRNA 및 cDNA 의 제조
각 암세포주, 정상 세포 및 정상 조직으로부터의 전체 RNA는 TRI-REAGENT(Invitrogen, 미국)을 이용하여 분리하였다. 액체질소를 이용해 급속 동결시켜 갈아진 조직샘플(tissue sample)에 트리졸 시약(Trizol reagent) 1 mL을 첨가하고 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 여기에 0.2mL 클로로포름을 첨가한 후 심하게 15초 동안 흔들어준 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 상기 샘플을 12,000 x g, 4℃에서 15분 동안 원심분리 한 후 수용성층 (aqueous phase)을 새로운 튜브로 옮기고 이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)을 동량 첨가하고 4℃에서 10분간 원심분리한 다음 침전물 (pellet)이 떨어지지 않게 상층액을 버리고 70% 에탄올로 75,000 x g, 4℃에서 5분간 침전물을 세척하였다. RNA를 잘 건조시킨 후 RNA 가수분해효소-자유수(RNase-free water)로 용해하였다.
각각의 세포주 및 사람조직 유래의 암세포 및 정상세포로부터 얻은 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위해 다음과 같은 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다. 전체 RNA 2㎍과 올리고(dT)16-프라이머(oligo(dT)16-primer) 1㎕에 RNA 가수분해효소-자유수(RNase-free water)를 첨가하여 최종부피가 11㎕이 되도록 한 후 90℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 빠르게 옮겼다. 다른 튜브에 반응완충용액 4㎕, 10mM dNTPs 2㎕, RNA 가수분해효소 억제제 (RNase inhibitor) 1㎕, RTase 2㎕를 혼합한 후, 이 혼합물을 튜브 (pre-mixture tube)에 8.5㎕씩 분주하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 상기 반응물을 42℃에서 90분 동안 반응시키고 95℃로 옮겨 15분간 다시 반응시킨 후 재빨리 얼음에 옮겨서 반응을 종료시켜 각각의 cDNA를 제조하였다.
실시예3 : 암진단을 위한 탐침의 실효성 검사를 위한 DNA 칩 제작 1
암에 있어서 특이 변이체의 특징을 이용한 진단방법에 사용될 수 있는 탐침후보들을 제작하고 이들의 실효성을 검사하였다. 탐침은 G-CSF의 액손 2 영역에서 하나의 탐침, 액손 3 영역에 서로 겹치지 않게 4개의 탐침을, 액손 4 영역에서 하나의 탐침을 20개의 올리고튜클레오티드로 구성하게끔 디자인하였다. G-CSF의 액손 2 부분은 교대 스플라이싱 (alternative splicing) 기작에 의해 두 종류 (사람 G-CSFa, 사람 G-CSF b)를 가지고 있으므로 (Tshuchiya M. et al ., EMBO J. 5:575-581, 1986), 액손 2 영역에서 디자인한 탐침은 각각 두 종류로 디자인하였다. 이들의 염기서열은 표 2에 게시된 바와 같다.
탐침명 염기서열 서열번호 위치
E 2 CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC 1 액손 2
E2E3a AGA AGC TGT GTG CCA C 2 액손 2-3
E2E3b TGA GTG AGT GTG CCA C 3 액손 2-3
E3-1 TGT GCC ACC TAC AAG CTG TG 4 액손 3
E3-3 GAG CTG GTG CTG CTC GGA 5 액손 3
E3-4 GGA CAC TCT CTG GGC ATC 6 액손 3
E3-6 GGA CAC TCT CTG GGC ATC 7 액손 3
E4 GCA GGC TGC TTG AGC CAA 8 액손 4
E2E4a AGA AGC TGG CAG GCT G 9 액손 2-4
E2E4b TGA GTG AGG CAG GCT G 10 액손 2-4
DNA 탐침을 고정화하기 위해서 모든 DNA단편 탐침을 합성할 때, 3 위치에 아미노링커컬럼(Aminolinker Column, Cruachem, Glasgrow, Scotland)을 이용하여 아민기(amino residue)를 가진 염기를 삽입하였고, 슬라이드 글라스(slide glass)은 알데히드기(aldehyde residue)로 코팅화되어 있는 것을 구입(CEL Associates, Inc., Huston Taxas, USA)하였다.
탐침을 3XSSC(0.45 M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH7.0) 완충 용액에 용해시킨 상태로 본 실험실에서 자체 제작한 마이크로어레이어를 이용하여(Yoon et al., J. Microbiol. Biotechnol. 10:21-26, 2000) 집적한 후, 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 1시간 이상 화학 반응을 유도하고, 6시간 이상 방치하여 DNA 탐침을 고정화하였다. 탐침의 농도는 100uM로 하고 전체 탐침을 180㎛ 간격을 두고 순서대로 집적화시켜 마이크로어레이를 제작하였다. 탐침의 아민기와 유리판 위의 알데히드 사이의 반응이 원활이 이루어져 고정화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위해 사이브로 그린II(SYBRO green II, Molecular Probes, Inc., Leiden, Netherlands)로 염색하여 확인하였다.
실시예4 : 특이 변이체 검출 표적 샘플 제작
각각의 세포주에서 추출한 mRNA 혹은 cDNA를 주형으로 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)을 수행하였다. 비대칭 증폭방법을 위한 PCR반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 첫번째 변성은 94℃에서 5분간, 두번째 변성은 94℃에서 1분간 수행하였다. 교잡은 50 - 56℃에서 1분, 연장은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 비대칭 PCR반응에 사용된 프라이머쌍은 다음과 같다. 리버스 프라이머는 검출을 위하여 FITC로 표지되어 있는 프라이머를 사용하였다.
포워드 프라이머: 5'-ACC CCC CTG GGC CCT GCC-3' (서열번호 11)
리버스 프라이머: FITC-5'-CTG CTG CCA GAT GGT GGT-3' (서열번호 12)
PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법으로 확인하였다. 각 균들에 대해 DNA 이중 가닥과 단편 가닥이 동시에 합성되었음을 확인하였다. 혼성황 완충용액(6 X SSPE, 20%(v/v) 포름아미드)에 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)으로 증폭시킨 유전자를 15ul정도 넣어서 총부피가 200ul가 되도록 제조하였다. 제조된 용액을 탐침이 고정되어 있는 유리판 위에 분주한 후 프로브-클립 프레스-씰 배양실(Probe-clip press-seal incubation chamber, Sigma Co., St. Louis, MO.)로 덮은 후, 30℃ 항온진탕배양기(shaking incubator)에서 6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도해 보았다. 시간이 경과한 후 3 X SSPE(0.45M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH7.0), 2 X SSPE (0.3M NaCl, 10mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 1 X SSPE (0.15M NaCl, 5mM C6H5Na3O7, pH7.0) 순으로 각각 5분씩 세척하였다.
실시예5 : 제작된 암진단칩 1 테스트 결과
위의 실시예 3에서 언급한 대로 제작된 DNA 칩에 비대칭 증폭 방법으로 증폭된 표적 산물을 적용한 후, 스캔어레이(Scanarray) 5000 (GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.)을 이용하여 검색하였다. 탐침에 대한 결과를 예측하기 위하여 G-CSF 액손 3 영역이 결실된 플라스미드와 결실되어 있지 않은 플라스미드를 가지고 G-CSF 부분을 비대칭 증폭 방법을 통해 증폭한 후, DNA 칩에 적용하여 먼저 살펴 보았다. 플라스미드에 들어 있는 G-CSF 유전자의 결실된 것(no deletion)과 결실되지 않은 것(deletion)의 염기서열은 아래의 표3과 같다.
결실되지 않은 것 (서열번호 26) acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa　　　　　　　　 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag　　　　　　　 120 ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc　　　　　　　 180 ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc　　　　　　　 240 ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt　　　　　　　 300 cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag　　　　　　　 360 atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc　　　　　　　 420 gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc　　　　　　　 480 ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 525
결실된 것 (서열번호 27) acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa　　　　　　　　 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctggcagg ctgcttgagc　　　　　　　 120 caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc　　　　　　　 180 cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc　　　　　　　 240 atctggcagc agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc　　　　　　　 300 atgccggcct tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctagt tgcctcccat　　　　　　　 360 ctgcagagct tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gccctga　　　　　　　　　　 417
도 5 에서 보듯이 결실된 부위에서는 E2E4a의 탐침에서만 시그널이 나타남을 볼 수 있다. 이 플라스미드는 A형의 액손2를 가지고 있다 (도 1). 반면 결실되어 있지 않은 플라스미드의 경우에서 E2E3a의 탐침과 액손 3 영역의 탐침에서 시그널이 나타남을 볼 수 있다. 만약 결실된 형태와 결실되지 않은 형태가 함께 섞여 있는 상태라면 이 두가지 결과가 혼합된 결과를 예측할 수 있다. 도 6은 세포별 표적 DNA를 도 4의 DNA 칩에 적용하여 스캔어레이 5000으로 검출된 결과이다. 그림에서 보는 바와 같이 각 탐침별로 암세포를 구분할 수 있는 유일한 근거는 특이체만이 가질 수 있는 액손 2 영역과 액손 4 영역으로 제작된 탐침임을 알 수 있다.
실시예 6: 암진단을 위한 탐침의 실효성 검사를 위한 DNA 칩 2의 제작 및 테스트 결과
도 7은 E2E4의 암진단에의 실효성을 테스트 하기 위해 새로 제작된 DNA 칩 2 의 제작도이다. 한눈에 판독을 쉽게 하기 위하여 두가지 액손의 타입을 모두 가질 수 있도록 하였다(도 7의 E2E4는 A형과 B형의 두 가지 형태를 모두 포함함, E2E3는 E2E3a와 E2E3b의 A형과 B형의 두가지 형태를 모두 포함함). 탐침의 고정은 실시예 3에서 언급된 고정화 방법과 같은 방법으로 고정하였다. 도 7에서 보는 바와 같이 제작된 DNA칩으로 암의 여부를 쉽게 진달할 수 있는 시스템의 개발에 본 액손 2 영역과 액손 4 영역으로 제작된 탐침이 가장 유력함을 알 수 있다. 시그날을 높이기 위해서 스플라이스 접합 부위의 염기서열을 기초로 아래 표 4의 염기서열의 탐침으로 적용하였다.
탐침명 염기서열 서열번호 위치
E2E4A GGA GAA GCT GGC AGG CTG CT 13 액손 2-4
E2E4B GGT GAG TGA GGC AGG CTG CT 14 액손 2-4
실시예7 : 암진단을 위한 탐침의 실효성 검사를 위한 DNA 칩 3의 제작
액손 2 영과 액손 4 영역으로 제작된 탐침이 가장 유력함을 확인하기 위해 각 영역별로 염기서열별로 탐침을 디자인하여 DNA 칩 3을 새로 제작하였다 (도 9). 각 탐침의 G-CSF 유전자 내에서의 대략적인 위치는 도 10과 같고 각 탐침의 염기서열은 아래의 표5에 게시된 바와 같다. 탐침의 고정은 실시예 3에서 언급된 고정화 방법과 같은 방법으로 고정하였다.
탐침명 염기서열 서열번호 위치
E2 1 GAG CTT CCT GCT CAA GTG CT 15 액손 2
E2 2 AGA GCT TCC TGC TCA AGT GC 16 액손 2
E2 3 GCA AGT GAG GAA GAT CCA GG 17 액손 2
E2 4 CCA GAG CTT CCT GCT CAA GT 18 액손 2
E2 5 CAA GTG AGG AAG ATC CAG GG 19 액손 2
E2E4 CTGGTGAGTGGCAGGCTGCT 20 액손 2-3-4
E2E4 1 AGA AGC TGG CAG GCT G 9 액손 2-4
E2E4 2 TGA GTG AGG CAG GCT G 10 액손 2-4
E2E4a GGA GAA GCT GGC AGG CTG CT 13 액손 2-4
E2E4b GGT GAG TGA GGC AGG CTG CT 14 액손 2-4
E2E3 1 AGA AGC TGT GTG CCA C 2 액손 2-3
E2E3 2 TGA GTG AGT GTG CCA C 3 액손 2-3
E3 3 GAG CTG GTG CTG CTC GGA 5 액손 3
E3 4 GGA CAC TCT CTG GGC ATC 6 액손 3
E3 6 GGA CAC TCT CTG GGC ATC 7 액손 3
E4 1 CTT TTC CTC TAC CAG GGG CT 21 액손 4
E4 2 CAT AGC GGC CTT TTC CTC TA 22 액손 4
E4 3 TTT TCC TCT ACC AGG GGC TC 23 액손 4
E4 4 TAG CGG CCT TTT CCT CTA CC 24 액손 4
E4 5 CGG CCT TTT CCT CTA CCA G 25 액손 4
E4 GCA GGC TGC TTG AGC CAA 8 액손 4
실시예7 : 암진단을 위한 탐침의 실효성 검사를 위한 DNA 칩 3의 테스트
제작된 DNA 칩 3 (도 11)에 실시예 4에서 언급한 대로 비대칭 증폭 방법으로 증폭된 표적 산물을 적용한 후, 스캔어레이 (Scanarray) 5000 (GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.)을 이용하여 검색하였다. 탐침에 대한 결과를 예측하기 위하여 G-CSF 액손 3 부위가 결실된 플라스미드와 결실되어 있지 않은 플라스미드를 가지고 G-CSF 부분을 비대칭 증폭 방법을 통해 증폭한 후, DNA 칩에 적용하여 먼저 살펴 보았다.
도 11은 각 탐침의 결과를 적용된 생물학적 시료별로 나타낸 도식도이다. 왼쪽 표에서 녹색으로 표시된 시료는 정상으로 분류된 시료들의 결과이고 중간의 붉은색으로 표시된 시료는 암으로 분류된 시료들의 결과에 대한 것이다 오른쪽 편에 나타난 것은 이들 시료들의 결과를 함께 해석하여 암진단 마커의 최종 후보군에 대한 결과를 나타낸 것이다. 표의 각 칸에서 나타내는 황색의 정도은 시그널의 유무 및 강도를 나타내고 오른쪽 표의 칸에 나타난 붉은색은 암을 판별할 수 있는 실효성을 가진 강력한 탐침 후보군을 나타낸다.
따라서 각 액손 영역에 대해 디자인된 탐침 후보군 중에서 암을 판별할 수 있는 유력한 탐침은 액손 2 영역과 액손 4 영역으로 제작된 탐침이며 여기서 A형에 대한 탐침이 암에서 더욱 잘 나타나며 서열번호 2와 서열번호 13이 동시에 나타날 경우 이것은 A형(도 1)의 액손 2를 가진 암 특이 변이체를 가진다고 해석이 가능하다.
마찬가지로 서열번호 3과 서열번호 14가 동시에 나타날 경우 이것은 B형 (도 1)의 액손 2를 가진 암 특이 변이체를 가진다고 해석이 가능하다. 반면 정상세포를 구분할 수 있는 유력한 후보군은 액손 3 영역의 탐침 (염기서열 6)이라고 할 수 있겠으나 이 탐침이 적용된 암 시료 중 거의 모든 시료에 시그널을 나타내고 있으므로 이 탐침의 유무를 가지고 정상 시료와 암시료를 판별하는 것은 불가능하다. 또한, 액손 3 영역의 다른 부위의 탐침의 경우는 정상시료와 암시료 모두에서 시그널을 나타내지 않으므로 이들을 통한 정상 시료와 암시료를 판단하는 것은 불가능하다.
도 12는 A형의 액손 2 영역을 가진 알고 있는 염기서열의 플라스미드를 주형으로 표적 샘플을 실시예 4에서 언급한 대로 실시 하여 DNA 칩 3 (도 11)에 적용한 결과이다. 플라스미드에 들어 있는 G-CSF 유전자의 결실된 것(no deletion)과 결실되지 않은 것(deletion)의 염기서열은 상기 표3과 같다.
도 13은 각 시료별 표적 DNA를 도 11 의 DNA 칩 3에 적용하여 스캔어레이 5000으로 검출된 결과이다. 그림에서 보는 바와 같이 각 탐침별로 암세포를 구분할 수 있는 유일한 근거인 액손 2 영역과 액손 4 영역의 스플라이스 접합 부위로 제작된 탐침의 유무로 암 유무를 확인할 수 있음을 알 수 있다. 붉은 원으로 표시된 부위가 본 발명자들로부터 실효성이 확인된 암 진단 마커가 된다.
실시예 8: 정상 및 환자 혈액 또는 조직으로부터 RNA 추출
각 암세포주, 정상 혈액 및 정상 조직으로부터 전체 RNA는 TRI-REAGENT (GIBCO-BRL, 미국)를 이용하여 분리하였다. 혈액의 경우, 혈액 전동 TRI-LS REAGENT (GIBCO-CRL, 미국)를 이용하여 분리하였다. 혈액: LS REAGENT의 비율을 1: 3으로 첨가하였다. 경우에 따라서 혈액샘플을 미리 1:1로 희석한 후에 REAGENT 비율을 1:3으로 첨가할 수도 있다. 혈액샘플 (또는 혈액희석샘플) 0.25ml에 대하여 TRIZOL LS Reagent 0.75ml을 첨가하고 프로토콜에 따라 RNA를 추출할 수 있다. 조직의 경우, 액체질소를 이용해 급속 동결시켜 갈아진 조직샘플 (tissue sample)에 트리졸 시약 (Trizol reagent) 1 mL를 첨가하고 프로토콜에 따라 RNA를 추출할 수 있다.
1mL의 트리졸 시약 혼합 샘플은 이후 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 여기에 0.2 mL 클로로포름을 첨가한 후, 15초 동안 심하게 흔들어준 후 상온에서 5분간 방치시켰다. 상기 샘플을 12000 x g, 4℃에서 15분 동안 원심분리 한 후 수용성층 (aqueous phase)을 새로운 튜브로 옮기고 이소프로필 알콜 (isoproply alcohol)을 동량 첨가하고 4℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액을 12000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리한 다음 침전물(pellet)이 떨어지지 않게 상층액을 버리고, 70% 에탄올로 7500 x g, 4℃에서 5분간 원심분리를 수행하여 침전물을 세척하였다. RNA를 잘 건조시킨 후, RNA 가수분해효소가 없는 증류수 (RNase-free water)로 용해하였다.
실시예 9: RNA 로부터 G- CSF 유전자의 증폭
각각의 혈액 또는 조직 유래의 암세포 및 정상세포로부터 얻은 mRNA로부터 cDNA를 합성하고 G-CSF 유전자의 증폭을 위해 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하였다. 전체 RNA 1-2㎍과 ONE-STEP PCR premix (Intron Inc., 한국) 8ul 에 표 6에 기재된 염기서열의 프라이머 28 및 29를 첨가하고, 최종부피가 20ul가 되도록 RNase-Free Water를 첨가한 다음, 표 7에 기재된 조건으로 증폭반응을 수행함으로써 RNA로부터 바로 증폭할 수 있다. 프라이머 30 및 31을 사용하여 GAPDH에 대한 증폭반응을 수행하여, 이를 RNA 증폭에 대한 대조군으로 사용하였다.
서열번호 프라이머 이름 염기서열(5'→3')
28 프라이머 1 ex1-Fw AGA GCC CCA TGA AGC TGA T
29 프라이머 2 ex5-Re GAC ACC TCC AGG AAG CTC TG
30 프라이머 3 GAPDH F CAT CTT CCA GGA GCG AGA CC
31 프라이머 4 GAPDH R TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA
32 프라이머 5 Full F ACC CCC CTG GGC CCT GCC
33 프라이머 6 E4fulRe CTG CTG CCA GAT GGT GGT
ONE CYCLE
역전사반응 (reverse transcription reaction) 45℃/30min
RTase의 불활성화 94℃/5min
3-STEP-CYCLING
변성 (denaturation) 94℃/20-60 sec
결합 (annealing) 50℃/20-60 sec
신장 (extension) 72℃/1min/kb
Number of cycles: 35
ONE CYCLE
최종신장 (final extension) 72℃/5min
50ul 전체반응 부피를 기준으로 했을 때 ONE-STEP PCR 기법(표 2)에 의해 증폭된 일차산물 1-2ul를 주형으로 사용하고, hG-CSF의 증폭을 위해서는 프라이머 32 및 33을 이용하되 프라이머 33에는 형광 (Cy5 혹은 다른 종류의 형광)을 라벨된 것을 사용하였다. 전방향 프라이머 (프라이머 32)와 역방향 프라이머 (프라이머 33)의 첨가비율을 1:5에서 1:10으로 크게 차이를 두는 비대칭 증폭 방법 (Assymetric PCR)으로 수행하여 두 번째 중합효소연쇄반응을 진행함으로써, 최종 증폭산물을 수득하였다.
GAPDH의 경우도 마찬가지로 역방향 프라이머 (프라이머 31)를 형광 라벨하여 상기 기재한 바와 같은 반응을 수행함으로써 수득할 수 있다.
실시예 10: 실제 환자 진단에의 적용을 위한 DNA 칩의 제작 및 혼성화 결과
각각의 15mer 프로브를 50uM의 농도로 3X SSC 스폿팅 용액에 혼합하여 DNA칩을 제조하였다 (도 14). 도 14에서 파란 네모로 표시된 부분을 암을 나타내는 탐침이 위치하는 영역이다.
도 15는 상기의 DNA칩을 사용하여 실시예 8과 9에 따라 정상인 및 환자로부터 증폭된 프라이머 32 및 33에 대한 증폭 생산물에 대한 혼성화 결과를 나타낸 것이다. 실험에 대한 대조군 확인을 위해 프라이머 30 및 31에 대한 증폭 생산물을 함께 혼성화하였다. 적용된 환자는 각각의 도면에 나타내었다. 도면에서 보라색 타원은 암을 나타내는 탐침에서의 시그널을 표시한 것이다. 본 발명에 따른 암 진단용 DNA칩을 환자 진단에 적용해 본 결과, 제작된 DNA칩 상에서 본 발명자가 제작한 암진단을 위한 탐침이 암 진단 마커로써 우수성을 가짐을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 진술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨구된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 함유하는 암 진단용 키트 및 상기 핵산 분자를 이용한 암 진단 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, G-CSF의 유전자 변이 특성을 이용하여 빠르고 정확하게 암을 진단할 수 있다.
<110> MEDIGENES <120> Marker and Method for Cancer Diagnosis <130> P06-B013 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 1 ctgcagctgc tgctgtggca c 21 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 2 agaagctgtg tgccac 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 3 tgagtgagtg tgccac 16 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 4 tgtgccacct acaagctgtg 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 5 gagctggtgc tgctcgga 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 6 ggacactctc tgggcatc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 7 ggacactctc tgggcatc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 8 gcaggctgct tgagccaa 18 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 9 agaagctggc aggctg 16 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 10 tgagtgaggc aggctg 16 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 acccccctgg gccctgcc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ctgctgccag atggtggt 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 13 ggagaagctg gcaggctgct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 14 ggtgagtgag gcaggctgct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 15 gagcttcctg ctcaagtgct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 16 agagcttcct gctcaagtgc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 17 gcaagtgagg aagatccagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 18 ccagagcttc ctgctcaagt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 19 caagtgagga agatccaggg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 20 ctggtgagtg gcaggctgct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 21 cttttcctct accaggggct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 22 catagcggcc ttttcctcta 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 23 ttttcctcta ccaggggctc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 24 tagcggcctt ttcctctacc 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 25 cggccttttc ctctaccag 19 <210> 26 <211> 525 <212> DNA <213> Human normal cell <400> 26 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag 120 ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc 180 ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc 240 ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt 300 cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag 360 atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc 420 gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc 480 ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga 525 <210> 27 <211> 417 <212> DNA <213> Human breast cancer cell <400> 27 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctggcagg ctgcttgagc 120 caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc 180 cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc 240 atctggcagc agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc 300 atgccggcct tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctagt tgcctcccat 360 ctgcagagct tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gccctga 417 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 agagccccat gaagctgat 19 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gacacctcca ggaagctctg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 catcttccag gagcgagacc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 acccccctgg gccctgcc 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ctgctgccag atggtggt 18

Claims (9)

  1. 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합(splice junction) 부위의 염기 서열을 필수적으로 함유하는 암 진단 마커용 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 하기 염기 서열을 필수적으로 함유하는 암 진단 마커용 올리고뉴클레오티드:
    GGA GAA GCT GGC AGG CTG CT (서열번호 13); 또는
    GGT GAG TGA GGC AGG CTG CT (서열번호 14).
  3. 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 암 진단용 키트.
  4. 제3항에 있어서, G-CSF 유전자의 액손 3 영역의 전체 또는 일부 염기 서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드를 추가로 함유하는 암의 진행 상태 평가용 키트.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하기 염기 서열을 필수적으로 함유하는 것을 특징으로 하는 키트:
    GGA GAA GCT GGC AGG CTG CT (서열번호 13); 또는
    GGT GAG TGA GGC AGG CTG CT (서열번호 14).
  6. 제3항 내지 제5항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
  7. 다음의 단계를 포함하는 하는 암 진단 방법:
    (a) 포유동물의 생물학적 시료로부터 G-CSF 핵산 시료를 수득하는 단계; (b) 수득된 G-CSF 핵산 시료를 증폭시키는 단계; 및 (c) 증폭된 시료에서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5' 말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 유무를 확인하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, (c) 단계에서, 증폭된 시료에서 G-CSF 유전자의 액손 2 영역의 3'말단과 액손 4 영역의 5'말단이 연결된 스플라이스 접합 부위의 염기 서열 유무와 함께 액손 3 영역의 전체 또는 일부 염기 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 유무를 동시에 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하기 염기 서열을 필수적으로 함유하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법:
    GGA GAA GCT GGC AGG CTG CT (서열번호 13); 또는
    GGT GAG TGA GGC AGG CTG CT (서열번호 14).
KR1020060006279A 2005-08-12 2006-01-20 암 진단 마커 및 방법 KR20070019524A (ko)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060006279A KR20070019524A (ko) 2005-08-12 2006-01-20 암 진단 마커 및 방법
US12/161,005 US20090269750A1 (en) 2006-01-20 2007-01-18 Marker and method for cancer diagnosis
RU2008134107/13A RU2008134107A (ru) 2006-01-20 2007-01-18 Маркер и способ для диагностики рака
PCT/KR2007/000300 WO2007083929A1 (en) 2006-01-20 2007-01-18 Marker and method for cancer diagnosis
AU2007206165A AU2007206165A1 (en) 2006-01-20 2007-01-18 Marker and method for cancer diagnosis
CA002637835A CA2637835A1 (en) 2006-01-20 2007-01-18 Marker and method for cancer diagnosis
EP07708508A EP1974036A4 (en) 2006-01-20 2007-01-18 MARKERS AND METHOD FOR CANCER DIAGNOSIS
BRPI0706936-7A BRPI0706936A2 (pt) 2006-01-20 2007-01-18 marcador e método para diagnóstico de cáncer
JP2008551185A JP2009523443A (ja) 2006-01-20 2007-01-18 癌診断のためのマーカー及び方法
CNA2007800026283A CN101443449A (zh) 2006-01-20 2007-01-18 癌症诊断标记物和方法
IL192875A IL192875A0 (en) 2006-01-20 2008-07-17 Marker and method for cancer diagnosis

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050074355 2005-08-12
KR1020060006279A KR20070019524A (ko) 2005-08-12 2006-01-20 암 진단 마커 및 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070019524A true KR20070019524A (ko) 2007-02-15

Family

ID=38287835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060006279A KR20070019524A (ko) 2005-08-12 2006-01-20 암 진단 마커 및 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20090269750A1 (ko)
EP (1) EP1974036A4 (ko)
JP (1) JP2009523443A (ko)
KR (1) KR20070019524A (ko)
CN (1) CN101443449A (ko)
AU (1) AU2007206165A1 (ko)
BR (1) BRPI0706936A2 (ko)
CA (1) CA2637835A1 (ko)
IL (1) IL192875A0 (ko)
RU (1) RU2008134107A (ko)
WO (1) WO2007083929A1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE348883T1 (de) * 2000-09-08 2007-01-15 Massachusetts Inst Technology Zusammensetzungen und verfahren mit analogen von g-csf
US20040247562A1 (en) * 2001-09-28 2004-12-09 Sang Yup Lee Diagnostic method for cancer characterized in the detection of the deletion of g-csf exon 3
US20040018520A1 (en) * 2002-04-22 2004-01-29 James Thompson Trans-splicing enzymatic nucleic acid mediated biopharmaceutical and protein

Also Published As

Publication number Publication date
CN101443449A (zh) 2009-05-27
WO2007083929A1 (en) 2007-07-26
AU2007206165A1 (en) 2007-07-26
JP2009523443A (ja) 2009-06-25
IL192875A0 (en) 2009-02-11
RU2008134107A (ru) 2010-02-27
EP1974036A1 (en) 2008-10-01
BRPI0706936A2 (pt) 2011-04-12
US20090269750A1 (en) 2009-10-29
CA2637835A1 (en) 2007-07-26
EP1974036A4 (en) 2009-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2739430T3 (es) Ensayos para la detección de una sola molécula y uso de los mismos
JP7372927B6 (ja) 遺伝子およびタンパク質の発現を検出する生体分子プローブおよびその検出方法
WO2021247568A1 (en) Spatial trancriptomics for antigen-receptors
ES2688458T3 (es) Recuento varietal de ácidos nucleicos para obtener información del número de copias genómicas
CA2525122A1 (en) Identification of clonal cells by repeats in t-cell receptor and immunoglobulin v/d/j genes
CA2282753A1 (en) Contiguous genomic sequence scanning
CN110079594A (zh) 基于dna和rna基因突变检测的高通量方法
CN109735622A (zh) 与结直肠癌相关的lncRNA及其应用
KR20230146139A (ko) 암 유전자 및 항암제 대사 관련 유전자 변이 분석을 위한 차세대 염기 서열 분석(ngs) 기반 혼합 진단 패널
CN109988842B (zh) 一种寡核苷酸标记探针原位检测pdl1的试剂组与应用
WO2009129693A1 (zh) Egfr基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法
KR20050098821A (ko) Ｇ-ｃｓｆ의 액손3 영역이 결실된 단백질 및 이에 특이적인항체 및 이들의 제조방법
CN110820051B (zh) 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用
KR20070019524A (ko) 암 진단 마커 및 방법
CN106811537A (zh) 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用
CN107988349B (zh) Kras基因检测引物组、试剂盒及检测方法
KR20120031740A (ko) 위암 환자의 항암제 민감성을 예측하기 위한 키트 및 방법
CN111118157B (zh) 一种长链非编码RNA lncBCBMAT及其作为乳腺癌脑转移分子标记物的应用
WO1992020820A1 (en) Method to determine metastatic potential of tumor cells
CN108251531B (zh) Ensg00000267549在判断骨肉瘤转移中的应用
JP2006166789A (ja) 癌の新規診断方法
KR20240017235A (ko) 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암의 진단을 위한 분석방법
JP3336230B2 (ja) テロメラーゼ活性の検出方法
EP1847618A2 (en) Method for detecting gastric cancer by detecting vldlr gene
JPWO2004099407A1 (ja) 抗癌剤感受性試験方法

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid