JP2009523443A

JP2009523443A - 癌診断のためのマーカー及び方法

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Publication number: JP2009523443A
Application number: JP2008551185A
Authority: JP
Inventors: サンユイ; ネチュンユ; ソヨンユ; キチャンクム; ウォンミンユ
Original assignee: Medigenes Co Ltd
Current assignee: Medigenes Co Ltd
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2007-01-18
Publication date: 2009-06-25
Also published as: US20090269750A1; AU2007206165A1; IL192875A0; RU2008134107A; WO2007083929A1; CA2637835A1; KR20070019524A; EP1974036A4; BRPI0706936A2; EP1974036A1; CN101443449A

Abstract

本発明は顆粒性白血球のコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）遺伝子の変異特性を用いて癌を診断するためのマーカー及び方法に係り、さらに詳しくは、癌診断用のマーカーとしてＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたオリゴヌクレオチドを用いた癌診断及び／または進行度評価方法に関する。本発明によれば、Ｇ−ＣＳＦの遺伝子変異特性を用いて高速で且つ正確に癌を診断することができる。

Description

本発明は顆粒性白血球のコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、 Granulocyte Colony Stimulating Factor）遺伝子における変異を用いた癌を診断するためのマーカー及び方法に係り、さらに詳しくは、癌診断用のマーカーとしてＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたオリゴヌクレオチドを用いた癌診断及び／または進行度評価方法に関する。

一般に、癌の診断は、（１）光学顕微鏡、電子顕微鏡などを用いた形態学的な分析による形態学的な診断、（２）癌組織内において発現される特定のタンパク質の分析による免疫組織化学的な診断(Iran, Biomed. J., 3:99, 1999; Lancet, 2:483, 1986)、（３）癌組織内において現れる遺伝子の突然変異などの分子生物学的な異常の分析による分子生物学的な診断などの方法を用いて行われる。これらの方法のうち、形態学的な診断や免疫組織学的な診断の場合、分子生物学的な診断と比較して遥かに長い時間がかかり、経済的な負担も遥かに高い。分子生物学的な方法はその作業が相対的に単純であり、いくつかの場合には短時間で結果が分かるため、現在、新規な診断方法の開発・研究の核心となっている。近年、Health Digit社が様々な癌診断のためのタンパク質チップシステムを開発し、世界初で中国医薬品安全庁から臨床診断許可を受けたという報告もされている(www.health-digit.com)。しかしながら、これもまた、１つのバイオマーカーによりあらゆる癌を診断するものではなく、１０個以上の多いタンパク質をバイオマーカーとして利用するものである。

上記の如き方法の効率よい適用に当たって最も重要なのは、癌の発生の有無をより正確で且つ手軽に確認可能な癌診断マーカーの選択及び使用である。癌診断マーカーとしていくつかの遺伝子(Steve, M. et al., J. Clin. Oncology, 20:3165-3175, 2002; Sridlhar, R. et al., J. Clin. Oncology, 20:1932-1941, 2002)またはタンパク質(Goessl et al., Urology, 58:335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res. Treat., 66:217-224, 2001;大韓民国特許公開番号2001-0061173)が報告されており、これらの中で、実際の診断に利用されている場合もある。既存に用いられている癌に対するマーカーのうち、臓器特異性の低いＣＥＡ、ＢＦＰ、ＴＰＡ、ＩＡＰの場合には感度が低下して偽陽性の恐れがある。これに対し、臓器特異性の高いＡＦＰ、ＰＩＶＫＡＩＩ、Esterase Ｉ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、Antigen、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５などのマーカーの場合には、当初から標的臓器を目的に利用するときに限って有用であるという短所がある。

マイクロアレイ技術を用いて、病理学的・生理学的な状態に応じて異なる癌診断マーカー候補群を発見しながら診断学的な有効性のある遺伝子を発掘しようとしている(Liu, H.X. et al., Nat. Genet., 27:55-58, 2001; Wilson, C.A. et al., Oncogene, 14:1-16, 1997; Weissensteiner, T., Nucleic Acids Res., 26:687, 1998; Zolezzi, F. et al., Am. J. Med. Genet., 71:366-370, 1997; Mottes J.R. and Iverson, L.E., Neuron, 14:613-623, 1995; Crook, R. et al., Nat. Med., 4:452-455, 1998; Jiang, Z.H. and Wu, J.Y., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 220:64-72, 1999)。

しかしながら、上記の如き方法によって見出される癌診断マーカー候補群はほとんどがＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）からなるため、これらは一つのデータの特徴として定義されるだけであり、信頼を与えるべき特定の候補群を選別することや、これらがどの遺伝子由来のものであるかを把握することが決して容易ではないのが現状である。特に、ヒトゲノム遺伝子の解析を通じて知られている遺伝子の数とこれから多くのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）あるいは変異体が発現されて生物学的な機能とその複雑性を有することが見出された。このため、ゲノム全体を通じて、変異体がどの遺伝子から、どのような環境において発現され、これらの機能が何であるかを究めることが今後の別の課題となっている。このような様々な変異体の存在は、異常な変異体の形成と癌の発生との関連の可能性を予測可能にする有効な根拠になりうる(Cartegni, L. et al., Nat. Rev. Genet., 3:285-298, 2002; Schweighoffer, F. et al., Pharmacogenomics, 1:187-197, 2000; Blencowe, B.J., Trends Biochem. Sci., 25:106-110, 2000; Cooper, T.A. and Mattox, W., Am. J. Hum. Genet., 61:259-266, 1997)。

また、本発明者らは、各種の癌を診断可能な新規な癌診断マーカーを開発するために長年に亘って研究を行い、その結果、癌細胞または癌組織の場合、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の転写過程においてエクソン３領域の欠損が特異的に現れることを確認し、Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ変異断片またはタンパク質を癌診断マーカーとして用いて癌を診断する方法に関する特許を出願している（WO2003/027288A1）。前記特許の癌診断マーカーとしてＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を利用するマイクロアレイにおいては、生物学的な試料中からエクソン３領域の欠失されたＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を検出するために、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３ＤＮＡ断片と共にＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン１、２、４及び５のＤＮＡ断片のうちいずれか１以上の断片を核酸プローブとして使用する。本発明者らにより開発されたＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３領域の欠失の有無を測定することを特徴とする癌診断方法は、遺伝子変異体の特徴を応用して癌を診断するための技術の一つであり、ほとんどの癌においてその変異体が現れるため、有用な癌診断マーカーの候補に属するものであると言える。

一方、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子をはじめとして、遺伝子は、一般に、それから各種のアイソフォームと変異体が生成可能であるため、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３領域の欠失の有無を測定するに当たって、マイクロアレイの上に固定されたプローブ断片は高い感度を示さなければならない。また、癌細胞または癌組織の場合、変異されたＧ−ＣＳＦ遺伝子と共に正常的なＧ−ＣＳＦ遺伝子またはこれらの断片が存在する可能性があるため、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３領域の欠失の有無だけを測定して癌を診断することは信頼度や感度が低下する恐れがあり、さらに、癌の進行状態を把握する上で問題となる。

そこで、本発明者らは、エクソン３領域の欠失したＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を検出するための核酸プローブとして、前記要件を充足し、あるいは、問題点を解消可能な新規な核酸プローブを開発するために鋭意努力した結果、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを癌診断マーカーとして使用する場合、癌診断に際して他のプローブに比べて大幅に増大された高い感度を示すということを確認すると共に、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３領域の一部または全部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと共に癌診断マーカーとして併用することにより、癌の進行度を明確に診断することができるということを確認し、本発明を完成するに至った。

発明の要約

従って、本発明の主たる目的は、顆粒性白血球のコロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列を必須に含有する癌診断用のオリゴヌクレオチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記オリゴヌクレオチドを含有する癌診断用のキット及び前記オリゴヌクレオチドを用いた癌診断方法を提供することにある。

技術的解決方法

前記目的を達成するために、本発明は、顆粒性白血球のコロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列を必須に含有する癌診断用のオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明において、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の塩基配列を必須に含有することを特徴とする。

また、本発明は、前記オリゴヌクレオチドを含有する癌診断用のキットを提供する。

本発明において、前記キットは、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３領域の一部または全部の塩基配列を必須に含有するオリゴヌクレオチドをさらに含有する癌の進行度評価用のものであることを特徴とする。

さらに、本発明は、（ａ）哺乳動物の生物学的な試料からＧ−ＣＳＦ核酸試料を得るステップと、（ｂ）得られたＧ−ＣＳＦ核酸試料を増幅させるステップと、（ｃ）増幅された試料からＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの有無を確認するステップと、を含む癌診断方法を提供する。

本発明において、前記ステップ（ｃ）は、増幅された試料からＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列の有無、及び、エクソン３領域の一部または全部の塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの有無を同時に確認するステップを含むことを特徴とする。

本発明の他の特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。

図１は、人体由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子から変異体及び正常タンパク質が生成される過程を簡略に示す図である。図２は、人体由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の２種類のタイプ（Ａ型、Ｂ型）により形成されるエクソン２領域とエクソン３領域との接合部位を示す図である。図３は、ＰＣＲに用いられたプライマーが付着する位置とこれによる予想ＰＣＲ産物を示す図である。図４は、増幅されたＧ−ＣＳＦ遺伝子の各部位のプローブよりなるＤＮＡチップのデザインである（Ｅ２：Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域中においてデザインされたプローブ、Ｅ２Ｅ３ａ：Ａ型Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン３領域の５’末端が連結された部位においてデザインされたプローブ、Ｅ２Ｅ３ｂ：Ｂ型Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン３領域の５’末端が連結された部位においてデザインされたプローブ、Ｅ３−１、Ｅ３−３、Ｅ３−４及びＥ３−６：Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３領域中においてデザインされたプローブ、Ｅ２Ｅ４ａ：Ａ型Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結された部位においてデザインされたプローブ、Ｅ２Ｅ４ｂ：Ｂ型Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結された部位においてデザインされたプローブ、Ｐ：位置マーカーとして蛍光標識により位置を区別するように製作されたプローブ、Ｎ：陰性対照区（固定液）。図５は、図４におけるＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションの結果を示す図である。赤い円はシグナルを示すプローブである。図６は、細胞及び組織の種類による図４のＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーションの結果を示す図である（Ａ：正常人の血液、Ｂ：肺癌（Ａ５４９）、Ｃ：大腸癌（ＳＥＳ−Ｔ）、Ｄ：胃癌（１：ＡＧＳ、２：ＹＣＣ−２、３：黄ＯＯ）、Ｅ：子宮頸部癌（１：Ｃ３３Ａ、２：ＨｅＬａ）、Ｆ：育種（Breeding cancer cell line）（ＨＴ１０８０）、Ｇ：乳房癌(breast cancer )（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、Ｈ：膵臓癌（Ｃａｐａｎ−２）、Ｉ：肝癌（ＳＫ−Ｈｅｐ１）、Ｊ：黒色腫（ＳＫ−Ｍｅｌ）、Ｋ：白血病（Jurket ｃＤＮＡ library）、Ｌ：胚腎臓（２９３））。赤い円は癌組織と正常組織を区別可能なプローブのシグナルを示す。図７は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のスプライス接合部位を標的として製作されたプローブよりなるＤＮＡチップの模式図である（Ｅ２Ｅ４：Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の２種類のタイプ（Ａ型、Ｂ型）のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結された部位においてデザインされたプローブ、Ｅ２Ｅ３：Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の２種類のタイプ（Ａ型、Ｂ型）のエクソン２領域の３’末端とエクソン３領域の５’末端が連結された部位においてデザインされたプローブ、Ｐ：位置マーカーとして蛍光標識により位置を区別するように製作されたプローブ、Ｎ：陰性対照区（固定液）。図８は、細胞及び組織種類による図７のＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションの結果を示す図である。赤い円は、癌においてのみ特異的にシグナルを示しうるプローブを示す図である。図９は、各プローブの診断に対する効率性を試験するためにＧ−ＣＳＦ遺伝子の各エクソン領域からデザインされたプローブが固定されたＤＮＡチップの模式図である。図１０は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子における各プローブの位置を示す模式図である。エクソン３が欠失されたＧ−ＣＳＦの遺伝子に対するプローブのうち、楕円内に含まれているプローブはスプライシング変異体のエクソン２の３’末端とエクソン４の５’末端としてデザインされたプローブである。図１１は、各プローブが細胞の種類により示すシグナルの度合いとこれから推定可能な実効性あるプローブ候補群を示す図である。図１２は、図９のＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションの結果を示す図である。赤い円は癌においてのみ特異的にシグナルを示しうるプローブを示す。図１３は、細胞及び組織種類による図９のＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションの結果を示す図である。ハイブリダイゼーションは、スキャンアレイ５０００を用いてイメージを獲得した（Ａ：正常血液（ＷＢＣ）、Ｂ：２９３（腎臓胚細胞）、Ｃ：ＳＥＳ−Ｎ（正常大腸）、Ｄ：ＳＥＥＳ−Ｔ（大腸癌）、Ｅ：Ｃｏｌｏ２０５（大腸癌）、Ｆ：ＤＬＤ−１（大腸癌）、Ｇ：黄ＯＯ（胃癌）、Ｈ：ＹＣＣ−３（胃癌）、Ｉ：ＹＣＣ−２（胃癌）、Ｊ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房癌）、Ｋ：ＮＣｌ−Ｈ４６０（肺癌）、Ｌ：Ｃａｋｉ−２（腎臓癌）、Ｍ：Ｃａｐａｎ−２（膵臓癌）、Ｎ：ＳＫ−Ｍｅｌ２（黒色腫）、Ｏ：ＨｅｐＧ−２（肝細胞癌腫）、Ｐ：ＳＫ−Ｈｅｐ１（肝癌））。赤い円は癌においてのみ特異的にシグナルを示すプローブを示す図である。図１４は、それぞれの１５ｍｅｒプローブをスポッティング溶液に混合して製造したＤＮＡチップを示す図である。青い四角形で表示された個所は、癌を示すプローブが位置する領域である。図１５は、図１４のＤＮＡチップを用いて実施例８と実施例９により正常人及び患者から配列番号３２及び３３のプライマーを用いて増幅された産物に対するハイブリダイゼーションの結果を示す図である。

発明の詳細な説明及び具体的な実施態様

本発明は、転写後の過程において生じるＧ−ＣＳＦ遺伝子の変異断片であって、エクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列を必須に含有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてマイクロアレイを含む遺伝子的な分析方法により癌を診断し、及び／または癌の進行度を評価する方法に関する。すなわち、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子においてエクソン３領域が欠失されてエクソン２領域とエクソン４領域が結合されたＧ−ＣＳＦ遺伝子の変異体を癌診断マーカーとして用いて癌を診断し、及び／または癌の進行度を評価する方法に関する。

正常的な人体において、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子は、スプライシング過程中にエクソン１〜エクソン５が正常的に連結されるが、癌または癌が進行中の細胞においてはエクソン３が欠失された変異体の形態でスプライシングが起こり、エクソン３の欠失されたｍＲＮＡが生成される（図１）。人体由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域は２種類のタイプ（Ａ型、Ｂ型）を有しており、このため、エクソン２領域とエクソン３領域との接合部位も２種類のタイプを有することになる（図２）。また、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のスプライシング結果、正常細胞においてはエクソン１〜エクソン５をいずれも有するＧ−ＣＳＦｍＲＮＡが分離され、癌細胞においてはエクソン３の欠失されたｍＲＮＡが分離され、このようなｍＲＮＡの違いはＧ−ＣＳＦ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによっても確認することができる（図３）。

癌細胞において特異的に発現される(または、抑制される)遺伝子及び遺伝的な突然変異などを確認する分子生物学的な方法としては、例えば、ＰＣＲ(Bottema, C.D., Mutat. Res., 233:93-102, 1993; Nelson, D.L., Curr. Opin. Genet. Dev., 1:62-68, 1991; Pourzand, C. and Cerutti, P., Mutat. Res., 288: 113-121, 1993; Holland, P.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,8:7276-7280, 1991)、１本鎖高次構造多型(SSCP、Single-Stranded Conformation Polymorphism)(Glavac, D., Hum. Mutat., 19:384-394, 2002; Strippoli, P. et al., Int. J. Mol. Med., 8:567-572, 2001)、ＤＮＡ塩基配列の分析(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74:6463-5467, 1997)、タンパク質切断テスト(PTT、Protein Truncation Test) (Hardy, C.A., Methods Mol. Biol., 187:87-108, 2002)、自動塩基配列分析法(Boutin, P. et al., Hum. Mutat., 15(2):201-203, 2000)、ＬＯＨ(loss of heterozygosity)解析(Yang, Q. et al., Clin. Cancer Res., 8:2890-2893, 2002)、ＭＳＩ(microsatellite instability)解析(Furlan, D. et al., J. Pathol., 197:603-609, 2002)、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いた遺伝子検査(Leushner J., Expert. Rev. Mol. Dign., 1:11-18, 2001)、ハイブリダイゼーションによる遺伝子検査(Wetmur, J.G., Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol., 26:227-259, 1991)、ＤＮＡチップによる遺伝子検査(Goessl et al., Urology, 58:335-338, 2001; Zhou et al., Brest Cancer Res. Treat., 66:217-224, 2001;大韓民国特許公開番号2001-0061173)、タンパク質チップを用いた検査(Pharmacogenomics, 1:385-393, 2000)などがある。このため、当業者は、上述した方法をはじめとする公知の分子生物学的な方法を適切に応用してＧ−ＣＳＦの転写後過程において起こる本発明による特異変異体のスプライス接合部位の有無を容易に確認できることが理解できるであろう。本発明者らは、このような変異体の有無を確認可能な最も実効性あるプローブは、スプライシング接合部位の有無を確認可能なプローブ候補群だけであることを見出し、それによって、その有無を確認可能な診断方法を発明するに至った。しかしながら、利用可能な前記多くの方法のうち、本発明によるＧ−ＣＳＦの転写後過程において生じる特異変異体の確認はＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、ＤＮＡチップを利用することが好ましく、且つ、容易である。

本発明による癌診断のために先行されるべきことは、被検組織または細胞からＧ−ＣＳＦ遺伝子及びこの変異体を獲得することである。通常、組織または細胞から分離される特定の遺伝子試料は微量であるため、ＰＣＲ反応により増幅されなければならず、このような増幅のためにはプライマーが考案されなければならない。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域とエクソン４領域のスプライス接合部位の全体またはその一部を増幅するために、このようなスプライス接合部位の有無を検出するためのプライマーであるＤＮＡ核酸断片が必要となる。すなわち、本発明において、プライマーとは、エクソン２領域とエクソン４領域のスプライス接合部位の一部または全体を含むＧ−ＣＳＦ遺伝子の核酸配列を増幅可能なオリゴヌクレオチドを意味する。このようなプライマーを考案することは当業者により容易に行うことができる。このため、前記スプライス接合部位の一部または全体を含むＧ−ＣＳＦ遺伝子変異体を増幅するために、当業者がデザイン可能な全てのプライマーが本発明のプライマー範囲に含まれる。

本発明の一様態は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位を含むＤＮＡ断片が付着されており、癌を診断するのに有用な遺伝子マイクロアレイまたはメンブレンを含む。遺伝子マイクロアレイは、一般に、特定の試薬により処理されたスライドガラスの表面上にオリゴヌクレオチドプローブを付着してハイブリダイゼーション法によりプローブに相補的な遺伝子を検出するのに利用可能なものであり、ＤＮＡチップなどがここに含まれる。メンブレンは、ハイブリダイゼーションにおいてスライドガラスの代わりに使用可能なものであり、特に限定されず、ＤＮＡ断片を固定化可能なものであれば、いずれも使用可能である。好ましくは、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレンが使用可能である。

スライドガラス、メンブレンなどの表面にプローブを固定することは、この分野における通常の技術により容易に行うことができる。また、標的の準備及びハイブリダイゼーションとストリッピングも通常の技術により行うことができる。

本発明の他の特定の様態は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位を含むＤＮＡ断片と診断学的に許容される通常の担体を含む癌診断用の組成物を含む。本発明のさらに他の特定の様態は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位を含むＤＮＡ断片とこれを用いたＤＮＡマイクロアレイを含む診断キットを含む。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。

＜実施例１：組織（細胞）別サンプルの調製＞
本発明の実施例において用いた正常細胞と癌細胞は、下記の表１に示す。表１中、下線のサンプルは正常と同様な結果を示す場合である。

前記癌細胞株はいずれも表１に記載の機関から自由に分譲されて利用可能なものである。延世大学医科大学癌転移研究センターから分譲された癌細胞株の場合には、下記の方法により製作されている。進行性癌患者から無菌的に腹水を得て細胞のクランピングを防ぐためにヘパリン１０ｕｎｉｔ／ｍｌを添加後、４００ｘｇにおいて１０分間遠心分離した。遠心分離して得られた沈殿細胞を２５ｃｍ^２フラスコに培養した。赤血球が多量含有されている場合には、フィコールパーク（Ficoll-Hypaque）により８００ｘｇにおいて比重遠心分離後、単核球層だけを得て５％ＣＯ_２、３７℃の条件下において培養した。培養一日後（１６−１８時間後）、培養液をさらに４００ｘｇにおいて１０分間遠心分離し、沈殿細胞を他の２５ｃｍ^２フラスコに移して培養した。培養液中の細胞状態を位相差顕微鏡により観察しながら週２−３回新たな培地に入れ替えた。細胞の観察に際し、癌細胞群落が確認されれば、酵素であるトリプシン−ＥＤＴＡを処理するか、あるいは、コロニーを得るか、あるいは、スクレーパーを用いて癌細胞群落だけを得るか、あるいは、浮遊液に存在する癌細胞をさらに遠心分離して正常細胞などを除去して純粋な癌細胞だけを得てパッセージ別に凍結して保管した。

ヒト白血球細胞の場合には、下記の方法により得ることができる。血液８ｍＬを５０ｍＬのコーニングチューブに移してＲＢＣ溶解緩衝溶液２４ｍＬを添加して間歇的に混和しながら４℃において１０分間静置した。４℃、２、０００ｒｐｍにおいて１２分間遠心分離して白血球ペレットを確認した後、上澄液を除去した。もし、ＲＢＣ（赤血球）が残っている場合には、上記の過程を繰り返し行った。最終的に得られた白血球ペレットにトリゾールを添加してＲＮＡを分離した。

＜実施例２：細胞からのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製＞
各癌細胞株、正常細胞及び正常組織からの総ＲＮＡはＴＲＩ−試薬（Invitrogen、アメリカ）を用いて分離した。液体窒素を用いて急速凍結した組織サンプルにトリゾール試薬１ｍＬを添加し、常温において５分間反応させた。ここに０.２ｍＬクロロホルムを添加し、１５秒中にボルテックスした後、常温において５分間反応させた。前記サンプルを１２、０００ｘｇ、４℃において１５分間遠心分離した後、水溶性層を新たなチューブに移し、イソプロピルアルコールを同量添加し、４℃において１０分間遠心分離した後、ペレットが外れないように上澄液を除去し、７０％エタノールにより７５、０００ｘｇ、４℃において５分間沈殿物を洗浄した。ＲＮＡペレットをよく乾燥した後、ＲＮａｓｅフリーの蒸留水により溶解させた。

それぞれの細胞株及びヒト組織由来の癌細胞及び正常細胞から得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。総ＲＮＡ２μｇとオリゴ（ｄＴ）_１６−プライマー１μＬにＲＮａｓｅフリーの蒸留水を添加して最終的な体積が１１μＬとなるようにした後、９０℃において５分間反応させ、アイスにより素早く冷却した。他のチューブに反応緩衝溶液４μＬ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ２μＬ、ＲＮＡａｓｅインヒビター１μＬ、ＲＴａｓｅ２μＬを混合した後、この混合物をチューブに８．５μＬずつ分注し、室温において１０分間反応させた。前記反応物を４２℃において９０分間反応させ、９５℃のものに移して１５分間さらに反応させた後、素早くアイスにより冷却させて反応を終了し、それぞれのｃＤＮＡを調製した。

＜実施例３：癌診断のためのプローブの実効性検査のためのＤＮＡチップ製作１＞
癌に特異的な変異体の特徴を用いた診断方法に使用可能なプローブ候補を製作し、これらの実効性を検査した。プローブは２０個のオリゴヌクレオチドでＧ−ＣＳＦのエクソン２領域において１個、エクソン３領域において重なり合わないように４個、エクソン４領域において１個ずつデザインした。Ｇ−ＣＳＦのエクソン２部分は選択的スプライシングにより２種類（ヒトＧ−ＣＳＦａ、ヒトＧ−ＣＳＦｂ）を有しているため(Tshuchiya, M. et al., EMBO J., 5:575-581, 1986)、エクソン２領域においてデザインしたプローブはそれぞれ２種類にデザインした。これらの塩基配列は、表２に示す。

ＤＮＡプローブを固定化するために全てのＤＮＡ断片プローブを合成するとき、３’位置にアミノリンカーカラム（Cruachem、Glasgrow、Scotland）を用いてアミン基を有する塩基を挿入し、スライドガラスはアルデヒド基によりコーティングされているものを購入(CEL Associates, Inc., Huston Taxas, USA)した。

プローブを３ｘＳＳＣ（０.４５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭＣ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７、ｐＨ７．０）緩衝溶液に溶解させた状態で、本発明者自身で製作したマイクロアレイヤーを用いて(Yoon et al., J. Microbiol. Biotechnol., 10:21-26, 2000)ＤＮＡプローブを集積した後、５５％程度の湿度が維持される条件下において１時間以上化学反応を誘導し、６時間以上放置してＤＮＡプローブを固定化した（図４）。プローブの濃度は１００μＭにし、全体のプローブを１８０μｍの間隔をおいて順番に集積化してマイクロアレイを製作した。プローブのアミン基とガラス板上のアルデヒドとの間の反応が円滑に行われて固定化が上手く行われているかを確認するために、サイブログリーンＩＩ(Molecular Probes, Inc., Leiden, Netherlands)により染色して確認した。

＜実施例４：特異変異体検出標的サンプルの製作＞
実施例２において、それぞれの細胞株から抽出したｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型としてアシンメトリックＰＣＲ法を行った。非対称増幅方法のためのＰＣＲ反応は、下記の条件下において行った。１回目の変性は９４℃において５分間、２回目の変性は９４℃において１分間行った。アニーリングは５０〜５６℃において１分、伸長は７２℃において３０秒間行い、これを３０回繰り返し行った。この後、７２℃において５分間最後の伸長を１回行った。非対称ＰＣＲ反応に用いられたプライマー対は、下記の通りである。リバースプライマーとしては、検出のためにＦＩＴＣにより標識されているプライマーを用いた。

フォワードプライマー：５’−ＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー：ＦＩＴＣ−５’−ＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号１４）

ＰＣＲ反応結果として生成された産物は、アガロースゲル電気泳動法により確認した。各ＰＣＲ産物において、二本鎖ＤＮＡ断片及び１本鎖ＤＮＡ断片が同時に合成されていることを確認した（図３）。ハイブリダイゼーション緩衝溶液（６ｘＳＳＰＥ、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）にアシンメトリックＰＣＲ法により増幅させた遺伝子を１５μＬ程度入れて合計の体積が２００μＬになるように製造した。製造された溶液をプローブが固定されているガラス板（癌診断ＤＮＡチップ１、図４）の上に分注した後、プローブ−クリップ・プレス−シール培養室(Sigma Co., St. Louis, MO.)により覆った後、３０℃の恒温震とう培養器において６時間かけて反応させて相補的な結合を誘導した。時間が経過した後、３ｘＳＳＰＥ（０.４５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭＣ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７、ｐＨ７．０）、２ｘＳＳＰＥ（０.３ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７、ｐＨ７．０）、１ｘＳＳＰＥ（０.１５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＣ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７、ｐＨ７．０）の順にそれぞれ５分ずつ洗浄した。

＜実施例５：癌診断ＤＮＡチップ１のテスト結果＞
実施例３において製作されたＤＮＡチップにアシンメトリックＰＣＲ法により増幅された標的産物を適用した後、スキャンアレイ５０００（GSI Lumonics Inc., Bedford,MA., USA）を用いて検索した。プローブに対する結果を予測するために、先ず、Ｇ−ＣＳＦエクソン３領域の欠失されたプラスミドと非欠失のプラスミドをもって、Ｇ−ＣＳＦ部分をアシンメトリックＰＣＲ法により増幅した後、ＤＮＡチップに適用して調べてみた。プラスミドに含まれているＧ−ＣＳＦ遺伝子の欠失されたものと非欠失のものの塩基配列はそれぞれ配列番号２６及び２７と同様である。

その結果、図５に示すように、欠失された部位においてはＥ２Ｅ４ａのプローブにおいてのみシグナルが現れることを分かる。このプラスミドは、Ａ型のエクソン２を有している（図１）。これに対し、非欠失のプラスミドの場合において、Ｅ２Ｅ３ａのプローブとエクソン３領域のプローブにおいてシグナルが現れることを確認することができた。もし、欠失されたタイプと非欠失のタイプが混在している状態であれば、これらの２種類の結果が混合された結果を予測することができる。図６は、細胞別の標的ＤＮＡを図４のＤＮＡチップに適用してスキャンアレイ５０００により検出された結果である。図６に示すように、特異体だけが有しうるエクソン２領域とエクソン４領域により製作されたプローブを用いた場合に限って、各プローブ別に癌細胞を区別することができた。

＜実施例６：癌診断のためのプローブの実効性検査のためのＤＮＡチップ２の製作及びテスト結果＞
Ｅ２Ｅ４の癌診断への実効性をテストするために、新規なタイプのＤＮＡチップ２を製作した（図７）。判読を容易にするために、２種類のエクソンのタイプを両方とも併せ持たせた（図７のＥ２Ｅ４はＡ型とＢ型の２種類のタイプをいずれも含む、Ｅ２Ｅ３はＥ２Ｅ３ａとＥ２Ｅ３ｂのＡ型とＢ型の２種類のタイプをいずれも含む）。プローブの固定は実施例３において述べた固定化方法などの方法により行い、実施例４において用意された標的サンプルをハイブリダイゼーションさせた結果、図８に示すように、製作されたＤＮＡチップにより癌の有無を容易に診断可能なシステムの開発に、このエクソン２領域とエクソン４領域により製作されたプローブの方が最も有力であることが分かった。シグナルを高めるために、スプライス接合部位の塩基配列を基に下記表３の塩基配列のプローブに適用した。

＜実施例７：癌診断のためのプローブの実効性検査のためのＤＮＡチップ３の製作＞
エクソン２領域とエクソン４領域により製作されたプローブが最も有力であることを確認するために、各領域別に塩基配列別にプローブをデザインしてＤＮＡチップ３を新規に製作した（図９）。各プローブのＧ−ＣＳＦ遺伝子内における大まかな位置は図１０の通りであり、各プローブの塩基配列は下記表４の通りである。プローブは、実施例３において述べた固定化方法と同様の方法により固定した。

＜実施例８：癌診断のためのプローブの実効性検査のためのＤＮＡチップ３のテスト＞
実施例７において製作されたＤＮＡチップ３（図９）に実施例４において述べたアシンメトリックＰＣＲ法により増幅された標的産物を適用した後、スキャンアレイ５０００(GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.)を用いて検索した。プローブに対する結果を予測するために、先ず、Ｇ−ＣＳＦエクソン３部位が欠失されたプラスミドと非欠失のプラスミドをもってＧ−ＣＳＦ部分をアシンメトリックＰＣＲ法により増幅した後、ＤＮＡチップに適用して調べてみた。

図１１は、各プローブの結果を適用された生物学的な試料別に示す図である。左側の表において、緑色により表示された試料は正常として分類された試料の結果であり、中間の赤色により表示された試料は癌として分類された試料の結果であり、右側のものはこれらの試料の結果を一緒に解析して癌診断マーカーの最終候補群に対する結果を示すものである。表の各欄において示す黄色の度合いは、シグナルの有無及び強度を示し、右側の表の欄に示す赤色は癌を判別可能な実効性を有する強力なプローブ候補群を示す。

図１１に示すように、各エクソン領域に対してデザインされたプローブ候補群のうち、癌を判別可能な有力なプローブはエクソン２領域とエクソン４領域により製作されたプローブであり、ここで、Ａ型に対するプローブが癌においてさらに上手く現われ、配列番号４と配列番号１が同時に現われる場合、これは、Ａ型（図１）のエクソン２を有する癌特異変異体を有していると解釈することができる。同様に、配列番号５と配列番号２が同時に現われる場合、これは、Ｂ型（図１）のエクソン２を有する癌特異変異体を有していると解釈することができる。

これに対し、正常細胞を区別可能な有力な候補群は、エクソン３領域のプローブ（塩基配列８）であると言えるが、このプローブが適用された癌試料のうち、ほとんどの試料にシグナルを示しているため、このプローブの有無をもって正常試料と癌試料を判別することは不可能である。なお、エクソン３領域の他の部位のプローブの場合には、正常試料と癌試料の両方においてシグナルを示さないため、これらによって正常試料と癌試料を判断することは不可能である。

Ａ型のエクソン２領域を有するプラスミドを鋳型として標的サンプルを実施例４における方法と同様に製作してＤＮＡチップ３（図９）に適用した結果、図１２に示すように、Ｅ２Ｅ４ａプローブはＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３が欠失されたプラスミドサンプルにおいてのみシグナルが現われた。プラスミドに含まれているＧ−ＣＳＦ遺伝子の欠失されたものと非欠失のものの塩基配列はそれぞれ配列番号２６及び２７と同様である。

図１３は、各試料別の標的ＤＮＡを図１１のＤＮＡチップ３に適用してスキャンアレイ５０００により検出した結果である。図１３から明らかなように、各プローブ別に癌細胞を区別可能な唯一の根拠であるエクソン２領域とエクソン４領域のスプライス接合部位により製作されたプローブの有無により癌有無を確認することができる。赤い円により表示された個所が、本発明者らにより実効性が確認された癌診断マーカーとなる。

＜実施例９：正常及び患者血液または組織からのＲＮＡの抽出＞
各癌細胞株、正常血液及び正常組織から、総ＲＮＡは、ＴＲＩ−試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、アメリカ）を用いて分離した。血液の場合、血液用ＴＲＩ−ＬＳ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＣＲＬ、アメリカ）を用いて分離した。血液：ＬＳ試薬を１：３の割合にて添加した。場合によっては、血液サンプルを予め１：１に希釈した後に、試薬を１：３の割合にて添加することもできる。血液サンプル（または、血液希釈サンプル）０.２５ｍｌに対してＴＲＩＺＯＬＬＳ試薬０.７５ｍｌを添加し、プロトコルによってＲＮＡを抽出することができる。組織の場合、液体窒素を用いて急速凍結させて砕いた組織サンプルにトリゾール試薬１ｍＬを添加し、プロトコルによってＲＮＡを抽出することができる。

１ｍＬのトリゾール試薬混合サンプルは常温において５分間反応させた。ここに０.２ｍＬクロロホルムを添加した後、１５秒かけて激しく震とうさせた後、常温において５分間放置した。前記サンプルを１２０００ｘｇ、４℃において１５分間遠心分離した後、水溶性層を新たなチューブに移し、イソプロピルアルコールを同量添加し、４℃において１０分間反応させた。反応液を１２０００ｘｇ、４℃において１０分間遠心分離した後、沈殿物が外れないように上澄液を捨て、７０％エタノールにより７５００ｘｇ、４℃において５分間遠心分離を行い、沈殿物を洗浄した。ＲＮＡをよく乾燥した後、ＲＮａｓｅフリーの蒸留水により溶解した。

＜実施例１０：ＲＮＡからＧ−ＣＳＦ遺伝子の増幅＞
それぞれの血液または組織由来の癌細胞及び正常細胞から得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の増幅のために逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。総ＲＮＡ１〜２μｇとＯＮＥ−ＳＴＥＰＰＣＲｐｒｅｍｉｘ（Intron Inc.,大韓民国）８μＬに表５に記載の配列番号２８及び２９のプライマーを添加し、最終的な体積が２０μＬになるようにＲＮａｓｅフリーの蒸留水を添加した後、表５に記載の条件下で増幅反応を行うことにより、ＲＮＡから直接増幅することができる。配列番号３０及び３１のプライマーを用いてＧＡＰＤＨに対する増幅反応を行い、これをＲＮＡ増幅に対する対照群として用いた。

５０μＬの全体反応体積を基準としたとき、ＯＮＥ−ＳＴＥＰＰＣＲ技法（表２）により増幅された１次産物１−２μＬを鋳型として用い、ｈＧ−ＣＳＦの増幅のためには配列番号３２及び３３のプライマーを用いるが、配列番号３３には蛍光（Ｃｙ５あるいは他の種類の蛍光）が標識されたものを用いた。フォワードプライマー（配列番号３２）とリバースプライマー（配列番号３３）の添加割合を１：５から１：１０へと変えて大差を置くアシンメトリックＰＣＲ法により２回目のＰＣＲを行うことにより、最終的な増幅産物を得た。

ＧＡＰＤＨの場合にも同様に、リバースプライマー（配列番号３１）を蛍光標識して上記の反応を行うことにより得ることができる。

＜実施例１１：実際の患者診断への適用のためのＤＮＡチップの製作及びハイブリダイゼーションの結果＞
それぞれのプローブ（Ｅ２Ｅ４ａ及びＥ２Ｅ４ｂ）を５０μＭの濃度にて３ＸＳＳＣスポッティング溶液に混合してＤＮＡチップを製造した（図１４）。図１４中、青い四角形により表示された個所が、癌を示すプローブが位置する領域である。

前記ＤＮＡチップを用いて、実施例８と９に従い正常人及び患者から配列番号３２及び３３のプライマーを用いて増幅された産物に対するハイブリダイゼーションを行った（図１５）。実験に対する対照群の確認のために、配列番号３０及び３１のプライマーを用いて増幅された産物を一緒にハイブリダイゼーションした。適用された患者はそれぞれの図面に示す。図１５中、紫色の楕円は、癌を示すプローブにおけるシグナルを示すものである。

その結果、図１５に示すように、本発明による癌診断用のＤＮＡチップを患者診断に適用した結果、製作されたＤＮＡチップ上において、本発明による癌診断用のプローブが癌診断マーカーとして優秀性を有していることを確認することができた。

以上述べたように、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列を必須に含有するオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを含有する癌診断用のキット及び前記核酸分子を用いた癌診断方法を提供する効果がある。本発明によれば、Ｇ−ＣＳＦの遺伝子変異特性を用いて高速で且つ正確に癌を診断することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。

Claims

顆粒性白血球のコロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列を必須に含有する癌診断用のオリゴヌクレオチド。
配列番号１または配列番号２の塩基配列を必須に含有する請求項１に記載の癌診断用のオリゴヌクレオチド。
請求項１または請求項２に記載のオリゴヌクレオチドを含有する癌診断用のキット。
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン３領域の一部または全部の塩基配列を必須に含有するオリゴヌクレオチドをさらに含有する、癌の進行度評価用の請求項３に記載のキット。
前記オリゴヌクレオチドは配列番号１または配列番号２の塩基配列を必須に含有することを特徴とする請求項４に記載のキット。
前記キットはマイクロアレイであることを特徴とする請求項３に記載の癌診断用のキット。
以下のステップを含む癌診断方法：
（ａ）哺乳動物の生物学的な試料からＧ−ＣＳＦ核酸試料を得るステップと、
（ｂ）得られたＧ−ＣＳＦ核酸試料を増幅させるステップと、
（ｃ）増幅された試料からＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端が連結されたスプライス接合部位の塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの有無を確認するステップ。
前記ステップ（ｃ）は、増幅された試料からＧ−ＣＳＦ遺伝子のエクソン２領域の３’末端とエクソン４領域の５’末端とが連結されたスプライス接合部位の塩基配列の有無、及び、エクソン３領域の一部または全部の塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの有無を同時に確認するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の癌診断方法。
前記オリゴヌクレオチドは配列番号１または配列番号２の塩基配列を必須に含有する請求項７または請求項８に記載の癌診断方法。