CN101443449A - 癌症诊断标记物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用粒细胞群落刺激因子(G－CSF)的基因表达变异的癌症诊断标记物及其制备方法，具体涉及使用具有与G－CSF的外显子2区域的3’－末端和外显子4区域的5’－末端连接的寡聚核苷酸作为癌症诊断标记物的诊断癌症和/或评估癌症发展状态的方法。根据本发明，可使用G－CSF基因表达快速精确地诊断癌症。

Description

癌症诊断标记物和方法
技术领域
本发明涉及一种使用粒细胞群落刺激因子(G-CSF)的基因表达变异体的癌症诊断标记物及其制备方法，具体涉及一种使用具有与G-CSF的外显子4区域的5’-端连接的外显子2区域的3’-端的寡聚核苷酸作为癌症诊断标记物的诊断癌症和/或评估癌症发展状态的方法。
背景技术
癌症诊断一般通过下列方法来实现：(1)使用显微镜诸如光学显微镜或者电子显微镜进行形态学分析；(2)检测在癌组织中特异性表达的蛋白质的免疫组化测定(Iran，Biomed.J.，3：99，1999；Lancet，2：483，1986)，或者(3)分析在癌组织中发现的异常生物分子诸如突变基因的分子诊断。与分子诊断相比，形态学和免疫组化诊断需要更长时间和更高的成本。由于分子诊断具有相对简单的步骤并且产生结果时间较短，已经变成发展新的癌症诊断方法的主要手段。近来，Health Digit公司开发了用于诊断各种癌症的蛋白质芯片系统，并在世界上首次得到中国药品监督管理局(CSDA)临床测试证实(www.health-digit.com)。但是，蛋白质芯片系统不是仅仅使用一种生物标记物来诊断所有种类的癌症，而是使用10种或更多种蛋白质作为标记物。
为了将这种诊断方法有效地应用于癌症诊断，最重要地是选择并使用能够更精确并容易检测癌症发生的癌症诊断标记物。已经报道许多基因(Steve，M.等人，J.Clin.Oncology，20：3165～3175，2002；Sridlhar，R.等人，J.Clin.Oncology，20：1932～1941，2002)和蛋白质(Goessl，等人，Urology，58：335～338，2001；Zhou，等人，Breast Cancer Res.Treat.，66：217～224，2001；韩国专利公开号.2001-0061173)作为诊断标记物，其中的一些已经在临床上用于癌症诊断。在常见的癌症生物标记物中，具有较低器官特异性的CEA、BFP、TPA和IAP具有较低的敏感性，因此产生了假阳性数据。而且，具有较高器官特异性的生物标记物诸如AFP、PIVKA II、酯酶I、CA19-9、CA50、Span-1抗原、CA15-3和BCA225仅仅被用于目标器官。
在候选癌症诊断标记物开发中，许多研究人员使用微阵列技术，试图发现具有诊断应用的根据病理和生理条件显示不同结果的基因，(Liu，H.X.等人，Nat.Genet.，27：55～58，2001；Wilson，C.A.等人，Oncogene，14：1-16，1997；Weissensteiner，T.，Nucleic Acids Res.，26：687，1998；Zolezzi，F.等人，Am.J.Med.Genet.，71：366-370，1997；Mottes J.R.和Iverson，L.E.，Neuron，14：613-623，1995；Crook，R.等人，Nat.Med.，4：452～455，1998；Jiang，Z.H.和Wu，J.Y.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，220：64～72，1999)。
但是，由于通过上述提到的方法发现的候选癌症诊断标记物绝大部分由表达的序列标记(EST)构成，它们仅仅被发现为具有数据的特性，因此难以选择可靠的特异性候选者并获知(catch on)它们来源的真正基因。特别地，通过人类基因组分析得知基因的数目并且还得知许多异构体或者变异体通过它们得到表达而具有生物功能及其复杂性。因此，其已经变成用于未来的另一种大的主题，以发现整个基因组中被表达的基因和条件变异体以及它们的功能是什么。这些变化的变异体可以是找出它们中异常变异体的形成和引起癌症的可能性之间的相关性的良好基础(Cartegni，L.等人Nat.Rev.Genet.，3：285～298，2002；Schweighoffer，F.等人，Pharmacogenomics，1：187～197，2000；Blencowe，B.J.，Treds Biochem.Sci.，25：106～110，2000；Cooper，T.A.和Mattox，W.，Am.J.Hum.Genet.，61：259～266，1997)。
本发明的发明人已经进行了长期研究，来开发新的可诊断各种癌症的癌症诊断标记物，结果，确认在G-CSF基因转录过程中外显子3区域的缺失在肿瘤细胞或者肿瘤组织中特异性显示，从而提出了有关使用G-CSF mRNA，cDNA变异体片段或者蛋白质作为癌症诊断标记物诊断癌症的方法(WO 2003/027288 A1)。在使用G-CSF基因片段作为上述申请的专利的癌症诊断标记物的微阵列中，G-CSF基因的外显子1、2、4和5DNA片段与G-CSF基因的外显子3DNA区域一起被用作检测生物样品中具有缺失外显子3区域的G-CSF基因片段的核酸探针。本发明的通过检测G-CSF基因的外显子3区域缺失表达的诊断癌症的方法是使用基因变异体的特性诊断癌症的技术之一，并被认为是有用的候选癌症诊断标记物，因为该变异体在大多数癌症中存在。
同时，包括G-CSF基因的大多数基因通常表达许多异构体和变异体，于是，固定在微阵列上的探针片段必须在检测G-CSF基因的外显子3区域的缺失中具有高度的敏感性。而且，正常G-CSF或者它们的片段的表达可在肿瘤细胞或肿瘤组织中与突变G-CSF异构体一起存在，因此仅仅通过检测其基因表达中G-CSF的外显子3区域的存在的癌症诊断可导致可信度的丧失或者较低的敏感性，此外，还具有评估癌症发展的状态问题。
因此，本发明的发明人已经付出了极大的努力来开发新的核酸探针用于检测可满足上述要求或者解决上述问题的没有外显子3区域的G-CSF基因片段，结果发现当含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的5’-末端连接的G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端的核酸序列的寡聚核苷酸被用作癌症诊断标记物时，与其它探针相比其具有显著增加的高度敏感性，并确定癌症发展的状态可通过使用含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的5’-末端连接的G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端的核酸序列的寡聚核苷酸与具有一部分或者全部G-CSF基因的外显子3区域的序列的寡聚核苷酸一起作为癌症诊断标记物精确地被诊断，由此完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的主要目的在于提供用于诊断癌症的寡聚核苷酸，其基本含有具有与粒细胞群落刺激因子基因的外显子4区域的5’-末端连接的外显子2区域的3’-末端的剪接位点的核酸序列。
本发明的另一目的在于提供含有寡聚核苷酸的用于癌症诊断的诊断试剂盒和使用寡聚核苷酸诊断癌症的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了用于癌症诊断标记物的寡聚核苷酸，其基本上含有含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的5’-末端连接的外显子2区域的3’-末端的核酸序列的寡聚核苷酸的剪接位点的核酸序列。
优选地，根据本发明的寡聚核苷酸基本上包括序列号：1或2的核酸序列。
本发明还提供了含有寡聚核苷酸的用于癌症诊断的诊断试剂盒。
在本发明中，用于癌症诊断的诊断试剂盒优选为用于评估癌症发展状态的试剂盒，其另外含有基本上包括一部分或者全部G-CSF基因的外显子3区域的序列的寡聚核苷酸。
在本发明中还提供了用于诊断癌症的方法，所述方法包括下列步骤：(a)从哺乳动物生物样品中获得G-CSF核酸样品；(b)扩增得到的G-CSF核酸样品；和(c)检测扩增的样品中含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的5’-末端连接的外显子2区域的3’-末端的剪接位点的核酸序列的寡聚核苷酸。
在本发明的方法中，步骤(c)优选包括其中在扩增的样品中同时检测包括一部分或者全部G-CSF基因的外显子3区域的序列的寡聚核苷酸与含有具有与G-CSF基因的外显子4区域的5’-末端连接的外显子2区域的3’-末端的剪接位点的核酸序列的寡聚核苷酸的步骤。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其它特征和实施方式将更加显而易见。
附图说明
图1是生产来自人类G-CSF基因的正常蛋白质和变异体的过程的示意图。
图2显示了可通过两种类型(A型、B型)的人类G-CSF基因的外显子2区域形成的外显子2区域和外显子3区域的接合区域。
图3显示了在PCR中引物的连接位置和根据该位置所预期的PCR产物。
图4是DNA芯片的设计，其包括扩增的G-CSF基因的每个区域的探针(E2：由G-CSF基因的外显子2区域设计的探针；E2E3a：由类型A的具有与G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子3区域的5’-末端连接的剪接位点设计的探针；E2E3b：由类型B的具有与G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子3区域的5’-末端连接的剪接位点设计的探针；E3-1，E3-3，E3-4和E3-6：G-CSF基因的外显子3区域设计的探针；E2E4a：由类型A的具有与G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的剪接位点设计的探针；E2E4b：由类型B的具有与G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的剪接位点设计的探针；P：被构造成通过荧光标记作为位置标记物来区分位置的探针；N：阴性对照(点样液)。
图5显示了使用图4的DNA芯片的杂交结果。红色圆圈显示了显示信号的探针。
图6显示了根据细胞和组织类型的图4的DNA芯片的杂交结果(A：正常人血液，B：肺癌(A549)，C：大肠癌(SES-T)，D：胃癌(1：AGS，2：YCC-2，3：Hwang00，E：颈部肿瘤(1：C33A，2：HeLa)，F：增殖肿瘤细胞(HT1080)，G：乳腺癌MDA-MB-231)，H：胰腺癌(Capan-2)，I：肝癌(SK-Hep1)，J：黑素肉瘤(SK-Mel)，K：白血病(Jurket cDNA文库)，L：胚肾(293))。红色圆圈显示能够区分肿瘤组织和正常组织的探针信号。
图7是DNA芯片的示意图，其包括被设计成检测G-CSF基因的剪接位点的探针(E2E4：由具有与两种类型(A型、B型)的G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的剪接位点设计的探针；E2E3：由具有与两种类型(A型、B型)的G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显3区域的5’-末端的剪接位点设计的探针；P：被构造成通过荧光标记作为位置标记物来区分位置的探针；N：阴性对照(点样液))。
图8显示了根据细胞和组织类型的图7的DNA芯片的杂交结果。红色圆圈显示可在癌症的情况下特异性显示信号的探针。
图9是DNA芯片的示意图，其上固定有由每个G-CSF基因的外显子区域设计的探针以检查每个探针的诊断效率。
图10是显示G-CSF基因中每个探针的位置的示意图。包括在用于不具有外显子3的G-CSF基因的探针中的椭圆形中的探针由剪接变异体的外显子2的3’末端和外显子4的5’末端设计。
图11显示了根据细胞类型和显示有效的候选探针的探针信号强度，该有效性可通过信号强度来推断。
图12显示了使用图9的DNA芯片的杂交结果，红色圆圈显示可仅仅在癌症中特异性显示信号的探针。
图13显示了根据细胞和组织类型的图9的DNA芯片的杂交结果。通过Scanarray 5000(A：正常血液(WBC)，B：293(胚胎细胞系)，C：SES-N(正常大肠)，D：SES-T(大肠癌)，E：Colo205(克隆的癌细胞系)，F：DLD-1(克隆的癌细胞系)，G：Hwang00(胃癌细胞)，H：YCC-3(胃癌细胞系)，J：MDA-MB-231(乳腺癌细胞系)，K：NCI-H460(肺癌细胞系)，L：Caki-2(肾癌细胞系)，M：Capan-2(胰腺癌细胞系)，N：SK-Mel2(黑素肉瘤)，O：HepG-2(肝细胞癌)，P：SK-Hep1(肝脏癌细胞系))得到的杂交反应图像。红色圆圈显示在癌症的情况下特异性显示信号的探针。
图14显示了通过将每种探针与点样液混合制备的DNA芯片。用蓝色方块标记的部分是代表癌症的探针定位于其上的区域。
图15显示了使用图14的DNA芯片根据实施例8和实施例9的通过利用序列号：32和序列号：33的引物而扩增来自正常和肿瘤临床样品的人类G-CSF核苷酸序列得到的杂交产物的结果。
具体实施方式
本发明涉及一种用于诊断癌症和/或评估癌症发展状态的方法，该方法使用基本上含有具有与在通过包括微阵列的基因分析方法在转录后加工之后产生的G-CSF基因变异体片段的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的剪接位点的核酸序列。换言之，本发明涉及一种用于诊断癌症和/或评估癌症发展状态的方法，该方法使用通过缺失G-CSF基因的外显子3区域以连接外显子2区域和外显子4区域作为癌症诊断标记物得到的G-CSF变异体。
G-CSF基因的外显子1～5在正常人体的剪接过程中正常连接，但剪接以肿瘤细胞或者肿瘤发展细胞中不具有外显子3的变异体形式发生以产生不具有外显子3的mRNA(图1)。人类G-CSF基因的外显子2区域具有两种类型(A型、B型)，因此外显子2区域和外显子3区域的剪接位点也具有两种类型(图2)。而且，G-CSF基因的剪接结果是，具有所有外显子1～外显子5的G-CSF mRNA从正常细胞中被分离，而不具有外显子3的mRNA从肿瘤细胞中被分离，上述mRNAs的差别可通过PCR使用对G-CSF基因特异的引物来确认(图3)。
在识别两种基因在肿瘤细胞中特异性表达(或者抑制)以及基因突变的分子生物学方法以PCR(Bottema，C.D.，Mutat.Res.，233：93-102，1993；Nelson，D.L.，Curr.Opin.Genet.Dev.，1：62-68，1991；Pourzand，C.和Cerutti，P.，Mutat.Res.，288：113-121，1993；Holland，P.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8：7276-7280，1991)、单链构象多态性(SSCP，Glavac，D.，Hum.Mutat.，19：384-394，2002；Strippoli，P.等人，Int.J.Mol.Med.，8：567-572，2001)，DNA序列分析(Sanger，F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：6463-5467，1997)，蛋白截短检测(Hardy，C.A.，Methods Mol.Biol.，187：87-108，2002)，自动核苷酸序列分析(Boutin，P.等人，Hum.Mutat.，15(2)：201-203，2000)，杂合体缺失研究(Yang，Q.等人，Clin.Cancer Res.，8：2890-2893，2002)，微卫星稳定性研究(Furlan，D.等人，J.Pathol.，197：603-609，2002)，使用MALDI-TOF的基因分析(Leushner J.，Expert.Rev.Mol.Dign.，1：11-18，2001)，通过杂交进行基因分析(Wetmur，J.G.，Critical Reviews in Biochem.Mol.Biol.，26：227-259，1991)，使用DNA芯片进行基因分析(Goessl等人，Urology，58：335-338，2001；Zhou等人，Brest Cancer Res.Treat.，66：217-224，2001；韩国专利公开号.2001-0061173)，使用蛋白质芯片进行分析(Pharmacogenomics，1：385～393，2000)作为例证。因此本领域技术人员将会理解，他们通过正确地使用公知的生物学方法包括上述提到的方法，可以很容易检测在G-CSF转录后加工中产生的根据本发明的特异性变异体的剪接位点的存在。本发明的发明人发现，大多数能够检测变异体存在的有效探针仅仅是能够检测剪接位点存在的候选探针，因此发明了诊断方法，通过该方法可检测其存在。但是，在上述方法中，在根据本发明的G-CSF的转录后加工过程中产生的特异性变异体的检测是优选的，并且很容易通过使用PCR、杂交反应和DNA芯片来进行。
为了进行根据本发明的癌症诊断，G-CSF基因或其变异体应当首先从组织样本或者细胞中得到。由于用于特定基因的DNA样品通常从正常组织或者细胞中得到很少的量，特异的基因应当通过PCR进行扩增并且对于所述扩增来说，应当设计适于所述扩增的引物。在本发明中，为了扩增部分或者全部外显子2区域和外显子4区域的剪接位点区域，需要在PCR中用作引物以检测剪接位点的存在的DNA核酸片段。也就是说，在本文中，指的是能够扩增G-CSF基因的核苷酸序列的寡聚核苷酸，包括部分或者全部外显子2区域和外显子4区域的剪接位点区域。本领域技术人员将能够很容易地设计所述引物。因此，由本领域技术人员设计的所有能够扩增G-CSF基因变异体包括部分或者全部剪接位点区域的引物都落入本发明的范围中。
根据本发明的一个方面，提供了基因微阵列或者膜，包括用于癌症诊断的具有与G-CSF基因的外显子2的3’末端和外显子4的5’末端连接的剪接位点的DNA片段固定于其上。基因微阵列包括进行杂交的基因检测中有效的DNA芯片，检测通过包括将互补的寡聚核苷酸探针固定在用特定化学试剂处理的载玻片的表面上杂交来完成。在杂交中可被用于载玻片的替代的膜的非限制性的例子可包括所有能够固定DNA片段的膜，优选为尼龙或者硝酸纤维素膜。
将探针固定在载玻片和膜的表面上可以很容易地通过本领域的常规技术来实现。另外，靶标的制备、杂交和剥离可根据本领域的常规技术来进行。
在本发明的另一方面，包括用于癌症诊断的组合物，包括含有具有与G-CSF基因的外显子2的3’末端和外显子4的5’末端连接的剪接位点的DNA片段和诊断上可接受的常规载体。在本发明的进一步的方面，包括诊断试剂盒，其包括含有具有与G-CSF基因的外显子2的3’末端和外显子4的5’末端连接的剪接位点的DNA片段和使用该DNA片段的DNA微阵列。
实施例
此后，将通过特定实施例更详细地对本发明进行描述。但是，本发明并不限于这些实施例，对本领域普通技术人员来说显而易见的是，可在本发明的精神和范围内进行许多变化和修改。
实施例1：来自组织(细胞)样品的制备
在本发明的实施例中使用的正常细胞系和肿瘤细胞系在下表1中列出。在表1中下划线的样品具有与正常细胞系中相同的结果。
在表1中列出的肿瘤细胞系来源于在表1中列出的细胞收集中心。来自延世大学医学院的癌症转移病变研究中心的肿瘤细胞系制备如下。在以无菌的方式从晚期癌症患者中得到腹水之后，以每ml 10单位的量加入肝素以防止细胞凝集并以400xg离心10分钟。通过离心得到的沉淀细胞在25cm2的培养瓶中培养。在含有大量红细胞的情况下，以800xg进行聚蔗糖-二乙酰氨基三碘苯甲酸梯度离心以从红细胞中分离单核细胞，并将得到的单核细胞时相在5％CO2 37℃下培养。在培养1天(16-18小时)之后，培养基以400xg离心10分钟，并在新的25cm2的培养瓶中培养沉淀的细胞。在培养过程中，在相差显微镜下观察细胞，并且每周更换两到三次培养基。当肿瘤细胞群落形成时，通过用色氨酸-EDTA处理或者通过得到群落或者通过使用刮板得到肿瘤细胞簇，或者含有肿瘤细胞的液体被离心以除去正常细胞。得到的纯肿瘤细胞根据它们的传代(passages)以冰冻状态存储。
人类白细胞可通过如下方式获得。在将8ml的血液转移到50ml的离心管中之后，加入24ml的RBC裂解缓冲液并将混合物在4℃下静置10分钟，同时偶尔对其进行搅拌。在4℃下以2000rpm对混合物进行12分钟离心后并确认白细胞微粒之后，除去上清。如果留有RBC(血红细胞)，则重复所述步骤。将TRIZOL加入最终得到的白细胞微粒以分离RNA。
表1
Figure A200780002628D00131
Figure A200780002628D00141
Figure A200780002628D00151
实施例2：来自细胞系的mRNA和cDNA的制备
从每个肿瘤细胞系、正常细胞系和正常组织通过使用Trizol试剂(Gibco-BRL，USA)分离总RNA。将1ml的Trizol试剂加入到在使用液氮快速冷冻之后研磨的组织样品中，接着在室温下温育5分钟。将0.2ml的氯仿加入到得到的组织样品中，剧烈蜗旋15秒并在室温下温育5分钟。在4℃下以12,000xg离心15分钟之后，将得到的液相转移到新管中。将等体积的异丙醇加入到管中之后，将管在4℃放置10分钟。在4℃下以12,000xg离心10分钟之后，小心地弃去上清，并用70％的酒精洗涤微粒，接着在4℃下以7500xg离心5分钟。将RNA粒子溶解在无RNase的水中。
为了从每个细胞系以及人源肿瘤以及正常细胞系中分离的mRNA合成cDNA，按照下列方式进行RT-PCR。将2μg总RNA与1μl寡聚(dT)16-引物混合，并加入无RNase的水直到最终体积为11μl。将该混合物在90℃下加热15分钟，并在加热完成之后立即放置到冰上。在将4μl反应缓冲液，2μl10mM dNTPs，1μl RNase抑制剂和2μl逆转录酶加入到另一管中之后，将8.5μl RNA混合物加入到预先混合的管中，接着在室温下温育10分钟。将反应混合物在42℃培养90分钟，然后在95℃培养15分钟。在95℃培养之后，立即将混合物放置到冰上以终止反应，由此得到cDNA样品。
实施例3：制备DNA芯片1以检查癌症诊断探针的有效性
为了研究DNA芯片是否可用作检测G-CSF mRNA或者cDNA的剪接位点的工具，各种能够固定在玻璃片上的DNA片段探针按照如下方式制备，设计与G-CSF的外显子2的一部分对应的探针、四个与外显子3对应的非重叠探针和一个与部分外显子4对应的探针，每个包括20个核苷酸。由于两种不同的G-CSF mRNA(人G-CSFa和G-CSFb mRNA)通过在外显子2区域中交替剪接得到(Tshuchiya，M.等人，EMBO J.，5：575～581，1986)，基于两种不同的G-CSF mRNAs制备与外显子2对应的两种类型的探针。其核酸序列在表2中显示。
表2
 
探针名称     核酸序列                       序列号     位置        
E2          CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC   3          外显子2     
E2E3a        AGA AGC TGT GTG CCA C            4          外显子2-3  
E2E3b        TGA GTG AGT GTG CCA C             5          外显子2-3  
E3-1        TGT GCC ACC TAC AAG CTG TG     6          外显子3     
E3-3        GAG CTG GTG ATG CTC GGA         7          外显子3     
E3-4         GGA CAC TCT CTG GGC ATC          8          外显子3     
E3-6        GGA CAC TCT CTG GGC ATC         9          外显子3     
E4           GCA GGC TGC TTG AGC CAA          10         外显子4     
E2E4a        AGA AGC TGG CAG GCT G           11         外显子2-4  
E2E4b        TGA GTG AGG CAG GCT G            12         外显子2-4   
为了使探针具有固定在玻璃片上的能力，当合成所有的DNA片段探针时，将具有氨基的碱基使用氨基连接臂(Cruachem，Glasgrow，Scotland)插入到探针的3’末端，并使用醛基包被的载玻片(CEL Associates，Inc.，HustonTaxas，USA)。
在溶解在3 x SSC(0.45M NaCl，15mM C6H5Na3O7，pH 7.0)中之后，通过使用由本发明的发明人生产的微阵列仪(Yoon等人，J. Microbiol.Biotechnol.，10：21～26，2000)聚集DNA探针来将DNA探针固定在载玻片上，并在55％湿度下反应1小时以上，然后将玻璃在室温下放置6小时(图4)。在这里，探针在玻璃上间隔180μm以100μM的量设置，由此产生微阵列。探针通过探针的氨基与玻璃上的醛基之间的反应的固定通过用SYBRO绿II(Molecular Probes，Inc.，Leiden，Netherlands)染色来评估。
实施例4：用于检测特定变异体的目标样品的制备
使用从实施例2中的每种细胞系分离的mRNA或者cDNA作为模板在下列条件下进行不对称PCR：94℃变性5分钟，94℃变性1分钟30个循环，50-56℃退火1分钟并在72℃延伸30秒，接着在72℃最后一次延伸5分钟。反向引物用FITC标记用于检测。
正向引物：5’-ACC CCC CTG GGC CCT GCC-3’(序列号：13)
反向引物：FITC-5’CTG CTG CCA GAT GGT GGT-3’(序列号：14)
PCR产物在琼脂糖凝胶上分离。通过电泳的结果看出，在每个PCR样品中都产生双链DNA片段和单链DNA片段(图3)。在通过不对称PCR扩增G-CSF基因之后，将杂交液(6 x SSPE，20％(v/v)甲酰胺)加入到15μl扩增产物中直至终体积为200μl。将混合物施加到固定有探针的载玻片上(用于癌症诊断的DNA芯片，图4)，并用探针夹事先密封的温育室(Sigma Co.，St.Louis，MO.)覆盖载玻片，然后在摇床中30℃下培养6小时以诱导与扩增产物互补的探针的结合。此后，用3 x SSPE(0.45M NaCl，15mM C6H5Na3O7，pH7.0)，2 x SSPE(0.3M NaCl，10mM C6H5Na3O7，pH7.0)，并用1 x SSPE(0.15M NaCl，5mM C6H5Na3O7，pH7.0)清洗玻璃5分钟。
实施例5：用于癌症诊断的DNA芯片1的检测结果
在由不对称PCR扩增的目标产物被加入到在实施例3中制备的DNA芯片上之后，使用Scanarray 5000(GSI Lumonics Inc.，Bedford，MA.，USA)对它们进行扫描。为了预告有关探针的结果，在具有没有缺失G-CSF基因中的外显子3的质粒的情况下，通过施加到DNA芯片上检测信号。作为对照，在含有缺失了G-CSF基因中的外显子3的质粒的情况下，通过施加到DNA芯片上检测信号，其中质粒具有序列号：26和27核苷酸序列。
结果如图5所示，仅仅E2E4a探针在缺失位点显示信号。该质粒具有A型外显子2(图1)。相反，在其中G-CSF基因没有缺失的质粒的情况下，E2E3a探针和外显子3中的探针显示信号。如果将没有缺失和缺失了外显子3的G-CSF的序列混合，两种情况下混合的结果可被预告。图6显示了在根据每种细胞的目标DNA被施加到图4的DNA芯片上之后由Scanarray 5000显示的杂交结果。如图6所示，在其中探针由仅仅是特定变异体可具有的外显子2和外显子4接合区域产生的情况下，细胞可被每个探针所检测。
实施例6：用于检查癌症诊断探针和检测结果的有效性的DNA芯片2 的制备
为了检查用于癌症诊断的有效性，制备了新型的DNA芯片2(图7)。为了容易解码，DNA芯片2被设计成具有两种类型的外显子(图7中的E2E4含有A型和B型两种，E2E3含有A型和B型的E2E3a和E2E3b两种)。通过与实施例3中描述的相同方法将探针固定，作为实施例4中制备的目标样品的杂交结果，如图8所示，确定由外显子2和外显子4的接合区域构建的探针在开发可容易地使用生产的DNA芯片诊断癌症的系统中最有有效。为了增强信号强度，具有下表3中列举的核酸序列的探针在剪接位点的核酸序列的基础上被应用。
表3
 
探针名称     核酸序列                       序列号   位置        
E2E4a        GGA GAA GCT GGC AGG CTG CT     1        外显子2-4  
E2E4b        GGT GAG TGAGGC AGG CTG CT      2        外显子2-4  
实施例7：用于检查癌症诊断探针的有效性的DNA芯片3的制备
为了检查由外显子2和外显子4的接合区域构建的探针是否是最有效的，通过由每个区域中的每种核苷酸序列设计探针来制备DNA芯片3(图9)。图10显示了G-CSF基因中每个探针的大致位置，表4显示了每个探针的核酸序列。探针通过与实施例3中描述的相同固定方法固定。
表4
 
探针名称     核酸序列                       序列号   位置          
E21         GAG CTT CCT GCT CAA GTG CT      15       外显子2       
E22         AGA GCT TCC TGC TCA AGT GC      16       外显子2       
E23         GCA AGT GAG GAA GAT CCA GG     17       外显子2       
E24          CCA GAG CTT CCT GCT CAA GT           18      外显子2       
E25         CAA GTG AGG AAG ATC CAG GG       19       外显子2       
E2E4         CTGGTGAGTGGCAGGCTGCT           20       外显子2-3-4  
E2E41       AGA AGC TGG CAG GCT G           9        外显子2-4    
E2E42       TGA GTG AGG CAG GCT G          10       外显子2-4    
E2E4a        GGA GAA GCT GGC AGG CTG CT    13       外显子2-4    
E2E4b        GGT GAG TGA GGC AGG CTG CT    14       外显子2-4     
E2E31       AGA AGC TGT GTG CCAA            2        外显子2-3    
E2E32       TGA GTG AGT GTG CCA C             3        外显子2-3    
E33         GAG CTG GTG CTG CTC GGA        5        外显子3       
E34         GGA CAC TCT CTG GGC ATC         6        外显子3       
E36         GGA CAC TCT CTG GGC ATC        7        外显子3       
E41         CTT TTC CTC TAC CAG GGG CT      21       外显子4       
E42         CAT AGC GGC CTT TTC CTC TA      22       外显子4       
E43         TTT TCC TCT ACC AGG GGC TC      23       外显子4       
E44         TAG CGG CCT TTT CCT CTA CC       24       外显子4       
E45         CGG CCT TTT CCT CTA CCA G         25       外显子4       
E4           GCA GGC TGC TTG AGCC CAA       8        外显子4       
实施例8：检测DNA芯片3以便检查用于癌症诊断的探针的有效性
在由实施例4中描述的不对称PCR扩增的目标产物被施加到实施例7中制备的DNA芯片3之后(图9)，使用Scanarray 5000(GSI Lumonics Inc.，Bedford，MA.，USA)对它们进行扫描。事先，通过应用DNA芯片，在使用具有不缺失外显子3序列的情况下和使用G-CSF基因中没有外显子3的情况下的序列测定芯片信号。
图11显示了根据施加的生物样品的每种探针的结果。在表的左侧绿色标记的样品显示了被分类为正常的样品的结果，在中间以红色标记的样品显示被分类为癌症的样品的结果。右侧代表了通过分析所有结果得到的用于癌症诊断标记物的最终候选结果。表中每列中的黄色深度显示其信号的存在与其强度，表的右侧列中红色代表了具有可检测癌症的有效性的强探针候选。
如图11中所示，由外显子2和外显子4接合区域构建的探针是有效探针，在由每个外显子区域中设计的探针候选中它们是可检测癌症的探针。这里，用于A型的探针在大多数癌症的情况下以及在同时用序列号：4和序列号：1对信号进行检测的情况下显示了高强度，这可被解释为探针具有A型外显子2的癌症特异性变异体。在同一行中，在其中信号用序列号：5和序列号：2同时检测的情况下，其可被解释为探针具有B型外显子2的癌症特异性变异体(图1)。
相反，可区分正常细胞的有力候选是来自外显子3区域的探针(序列号：8)，但由于信号在加入探针的所有癌症样品中都显示，在使用这种探针的情况下区分正常样品和癌症样品是不可能的。而且，由于来自外显子3区域的不同位点的探针在正常样品中和癌症样品中由于它们的弱敏感性而都不显示，使用这种探针区分正常样品和癌症样品是不可能的。
目标样品通过不对称PCR使用如实施例4中描述的具有A型外显子2区域作为模板进行扩增并且将目标样品施加到DNA芯片3上(图9)。结果，如图12所示，E2E4a探针仅仅在其中G-CSF基因的外显子3被缺失的质粒样品中显示信号。具有不缺失G-CSF基因和缺失的G-CSF基因的质粒分别为序列号：26和序列号：27。
图13显示了在根据每种样品的目标DNA被施加到图11的DNA芯片3之后通过Scanarray 5000检测的结果。如图13所示，确定癌症的存在可通过由外显子2区域和外显子4区域的剪接位点构建的探针上的信号存在来检测，这仅仅是通过每种探针区分肿瘤细胞的基础。用红色圆圈标记的位点为癌症诊断标记物，其有效性由本发明的发明人确认。
实施例9：从正常个体和患者血液或组织中分离RNA
来自每种癌症细胞系、正常血液和正常组织的总RNA使用
Figure A200780002628D00211
试剂(GIBCO-BRL，USA)分离。在血液的情况下，使用
Figure A200780002628D00212
 LS试剂(GIBCO-BRL，USA)对其进行分离。为了制备样品，将血液和LS试剂按1:3的比例加入。根据情况，事先将血液样品以1:1的比例进行稀释，然后可以1:3的比例加入试剂。将0.75ml TRIZOL LS试剂加入到0.25ml血液样品中(或者稀释的血液样品中)并根据操作手册抽提RNA。如果是组织的时候，将1mL Trizol试剂加入到使用液氮快速冰冻之后研磨的组织样品中以根据操作手册分离RNA。
将添加有1mL Trizo试剂的所得到的组织样品在室温下培养5分钟。得到的组织样品添加0.2 mL氯仿，轻微混合15秒，并在室温下培养5分钟。4℃下以12,000xg离心15分钟之后，将上清液相转移到新管中。将等体积的异丙醇加入到管中，并将管在4℃放置10分钟。在4℃下以12,000xg离心10分钟之后，小心地除去上清，并用70％的酒精洗涤微粒，接着在4℃下以7,500xg离心5分钟。干燥之后，将RNA颗粒溶解在无RNase的水中。
实施例10：由RNA扩增G-CSF基因
为了从每种细胞系、人源肿瘤和正常细胞系分离的mRNA合成cDNA并扩增G-CSF基因，按照如下方式进行RT-PCR。将1-2μg总RNA和8μlONE-STEP PCR预混合物(Intron Inc.，Korea)与表5中序列号：28和29的引物混合，并加入无RNase酶的水直到终体积为20μl。然后，可由RNA通过在表5中描述的条件下进行扩增反应直接扩增G-CSF基因。使用序列号：30和序列号：31的引物扩增GAPDH并且其被用作RNA扩增的对照。
表5
 
序列号     引物     名称         核酸序列(5’→3’)          
28         1        Ex1-Fw      AGA GCC CCA TGA AGC TGAT    
29         2        ex5-Re     GAC ACC TCC AGG AAG CTC TG  
30         3        GAPDH F     CAT CTT CCA GGA GCG AGA CC  
31        4        GAPDH R     TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA   
32         5        Full F       ACC CCC CTG GGC CCT GCC   
33         6        E4fullRe      CTG CTG CCAGAT GGT GGT      
表6
Figure A200780002628D00221
使用1-2μl第一次PCR产物作为模板扩增hG-CSF，该产物可通过ONE-STEP PCR方法基于50μl总反应体积以序列号：32和序列号：33的引物扩增(表2)，其中、序列号：33用荧光标记物标记(Cy5或者不同种类的荧光标记物)。具有正向引物(序列号：32)和反向引物(序列号：33)从1：5到1：10的较大加入比例差的不对称PCR第二次被进行以得到最终的扩增产物。
GAPDH还可通过以荧光标记物标记反向引物(序列号：33)进行扩增反应得到，如上所述。
实施例11：用于应用到患者诊断和杂交结果的DNA芯片的制备
通过将每种探针(E2E4a和E2E4b)以50μM的浓度混合到3X SSC点样液中(图14)。图14中用蓝色方块标记的部分为指示癌症的探针定位于其上的探针。
使用序列号：32和序列号：33的引物扩增的来自正常个体和患者的PCR产物与根据实施例8和实施例9的DNA芯片杂交(图15)。为了识别用于实验的对照，使用序列号：30和序列号：31的引物扩增的GAPDH也被杂交。应用的患者在每幅图中显示。在图15中，紫色椭圆显示指示癌症的探针信号。
如图15所示，作为根据本发明的用于癌症诊断的DNA芯片应用以诊断患者的结果，确定根据本发明的用于癌症诊断的探针作为制备的DNA芯片上的癌症诊断标记物是极好的。
工业实用性
如上面详细描述和证明的那样，本发明提供了基本上包括具有与G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的核酸序列的寡聚核苷酸的剪接位点的核酸序列的寡聚核苷酸、包括该寡聚核苷酸的用于癌症诊断的诊断试剂盒和使用核酸分子诊断癌症的方法。根据本发明，使用G-CSF基因可快速精确地诊断癌症。
虽然已经详细描述了本发明的特定实施方式，本领域技术人员将会理解，本说明书仅仅是优选的实施方式，而不构成对本发明的范围的限制。因此，本发明的实际范围由所附的权利要求书及其等同物来限定。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>株式会社美迪基尼斯
<120>癌症诊断标记物和方法
<130>FP08KR634
<140>10-2006-0006279
<141>2006-01-20
<150>PCT/KR2007/000300
<151>2007-01-18
<160>33
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Probe
<400>1
Figure A200780002628D00241
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Probe
<400>2
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Probe
<400>3
Figure A200780002628D00243
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<211>16
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Probe
<400>4
Figure A200780002628D00251
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<211>16
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<212>DNA
<213>Artificial
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<400>6
Figure A200780002628D00253
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<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Probe
<400>7
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<213>Artificial
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<223>Probe
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Figure A200780002628D00261
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<213>Artificial
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Figure A200780002628D00262
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<213>Artificial
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<223>Probe
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<212>DNA
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<213>Artificial
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Figure A200780002628D00274
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Probe
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Figure A200780002628D00275
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Figure A200780002628D00281
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Probe
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Figure A200780002628D00282
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Probe
<400>22
Figure A200780002628D00283
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Probe
<400>23
Figure A200780002628D00284
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Probe
<400>24
Figure A200780002628D00285
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Probe
<400>25
<210>26
<211>525
<212>DNA
<213>Human normal cell
<400>26
Figure A200780002628D00292
<210>27
<211>417
<212>DNA
<213>Human breast cancer cell
<400>27
Figure A200780002628D00293
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>28
Figure A200780002628D00301
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>29
Figure A200780002628D00302
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>30
Figure A200780002628D00303
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>31
Figure A200780002628D00304
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>32
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>33
Figure A200780002628D00306

Claims (9)

1、一种用于诊断癌症的寡聚核苷酸，其基本含有具有与粒细胞群落刺激因子基因的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的剪接位点的核酸序列。
2、根据权利要求1所述的用于诊断癌症的寡聚核苷酸，其特征在于，基本上包括序列号：1或2的核酸序列。
3、一种含有权利要求1或2所述的寡聚核苷酸的用于癌症诊断的诊断试剂盒。
4、根据权利要求3所述的用于癌症诊断的诊断试剂盒，其特征在于，优选为用于评估癌症发展状态的试剂盒，其另外含有基本包括一部分或者全部G-CSF基因的外显子3区域的序列的寡聚核苷酸。
5、根据权利要求4所述的用于癌症诊断的诊断试剂盒，其特征在于，所述寡聚核苷酸基本包括序列号：1或2的核酸序列。
6、根据权利要求3所述的用于癌症诊断的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为微阵列。
7、一种用于诊断癌症的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)从哺乳动物生物样品中获得G-CSF核酸样品；
(b)扩增得到的G-CSF核酸样品；和
(c)检测扩增的样品中含有具有与G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的剪接位点的核酸序列的寡聚核苷酸。
8、根据权利要求7所述的诊断癌症的方法，其特征在于，步骤(c)优选包括其中在扩增的样品中同时检测包括一部分或者全部G-CSF基因的外显子3区域的序列的寡聚核苷酸与含有具有与G-CSF基因的外显子2区域的3’-末端和外显子4区域的5’-末端连接的剪接位点的核酸序列的寡聚核苷酸的步骤。
9、根据权利要求7或8所述的诊断癌症的方法，其特征在于，所述寡聚核苷酸基本上包括序列号：1或2的核酸序列。
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