KR20240017235A - 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암의 진단을 위한 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 난소암 치료에 널리 사용되는 항암제인 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 진단용 키트를 제공한다.
Description
본 발명은 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암의 진단을 위한 분석방법 및 키트에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석방법 및 상기 분석방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
부인과 암 중 두 번째로 흔한 암인 난소암은 모든 여성 생식기 암 중 사망률이 가장 높으며, 전 세계적으로 난소암 발병률 또한 증가하고 있다. 진단, 수술 기술 및 새로운 치료제의 발견에도 불구하고 난소암 환자의 예후는 좋지 않으며, 이는 늦은 진단과 내성 질환에 대한 효과적인 치료 방법의 부족으로 인한 것이다.
시스플라틴은 난소암에 대하여 뛰어난 항암효과를 지녀 가장 일반적으로 사용되는 화학 요법 약물 중 하나이다(Song et al, Therapeutic strategies to overcome cisplatin resistance in ovarian cancer, Eur J Med Chem (2022): 114205). 그러나, 좋은 초기 반응률에도 불구하고 시스플라틴 치료를 받는 대부분의 환자는 다양한 메커니즘으로 인해 내성을 갖게 된다(Galluzzi et al, Molecular mechanisms of cisplatin resistance, Oncogene 31, no. 15 (2012): 1869-1883). 난소암에서 시스플라틴의 뛰어난 항암효과로 환자의 70%는 민감하게 반응하여 치료되지만, 그 중 절반은 시스플라틴 내성 발달로 인해 치료의 실패로 이어지게 되고, 치명적인 재발 및 전이와 낮은 생존율로 이어진다(Yang et al, Exploring cisplatin resistance in ovarian cancer through integrated bioinformatics approach and overcoming chemoresistance with sanguinarine, Am J Transl Res 12, no. 3 (2020): 923).
따라서, 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자를 사전에 확인할 수 있는 바이오마커를 개발할 경우, 난소암 환자에 대한 적절한 치료법을 제공함으로써 치료 효율을 높일 수 있을 것이다. 특히, 이러한 바이오마커의 분석을 통하여 선제적으로 내성의 존재를 확인함으로써, 치료 시간의 단축, 최적의 치료 전략 제시에 기여할 수 있으며, 난소암 항암제 저항성 예측 키트를 제작에도 기여할 수 있다.
본 발명자들은 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암을 진단할 수 있는 바이오마커를 동정하기 위하여, 내성을 지닌 난소암 세포와 내성이 없는 난소암 세포에서 발현 차이가 나는 단백질분해조절 효소 유전자를 Multiplex RT-PCR 분석을 통해 분석하였다. 그 결과, 본 발명자들은 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암과 관련하여 이전에 알려진 바 없는 5종의 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자가 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암에서 유의성 있는 발현의 차이를 나타낸다는 것을 발견하였으며, 그 결과를 qRT-PCR을 통하여 검증하였다. 따라서 이들 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 이들 유전자들은 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 진단을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 특정 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자를 이용한 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암의 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다.
상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자 발현량의 측정은 상기 유전자의 mRNA 양을 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR 또는 qRT-PCR에 의해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 분석방법은 USP12 및 USP51로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 유전자의 발현량 측정은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 사용하여 mRNA 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 분석방법은 USP17, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 유전자의 발현량 측정은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 또는 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 사용하여 mRNA 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 진단용 키트로서, 상기 분자가 상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 키트가 제공된다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4 및 7 내지 12로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 염기 서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
본 발명에 의해, 특정 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자, 즉 USP12, USP17, USP51, OTUD1 또는 PSMD14를 코딩하는 유전자가 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암에서 유의성 있는 발현의 차이를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이들 유전자들을 바이오마커로서 사용하는 본 발명에 따른 분석방법 및 키트는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 난소암 세포주 A2780과 시스플라틴 내성을 지닌 난소암 세포주 A2780/cisR에 시스플라틴(30 μM)을 처리한 후, CCK-8을 사용하여 세포생존력을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 Multiplex RT-PCR을 통해 난소암 세포주 A2780에서 시스플라틴 내성에 따라 감소된 단백질분해조절 효소들의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸다(A: A2780 세포, B: A2780/cisR 세포).
도 3a 내지 도 3c는 Multiplex RT-PCR을 통해 난소암 세포주 A2780에서 시스플라틴 내성에 따라 증가된 단백질분해조절 효소들의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸다(A: A2780 세포, B: A2780/cisR 세포).
도 4는 도 2의 결과로부터 단백질분해조절 효소 USP12, USP46, USP51의 상대적인 mRNA 발현 비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
도 5는 도 3의 결과로부터 단백질분해조절 효소 USP17, OTUD1, PSMD14의 상대적인 mRNA 발현 비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
도 6은 qRT-PCR을 수행하여 난소암 세포주 A2780과 비교해 A2780/cisR에서 감소된 단백질분해조절 효소 USP12, USP46, USP51의 상대적인 mRNA 발현비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
도 7은 qRT-PCR을 수행하여 난소암 세포주 A2780과 비교해 A2780/cisR에서 증가된 단백질분해조절 효소 USP17, OTUD1, PSMD14의 상대적인 mRNA 발현비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
도 2a 내지 도 2c는 Multiplex RT-PCR을 통해 난소암 세포주 A2780에서 시스플라틴 내성에 따라 감소된 단백질분해조절 효소들의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸다(A: A2780 세포, B: A2780/cisR 세포).
도 3a 내지 도 3c는 Multiplex RT-PCR을 통해 난소암 세포주 A2780에서 시스플라틴 내성에 따라 증가된 단백질분해조절 효소들의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸다(A: A2780 세포, B: A2780/cisR 세포).
도 4는 도 2의 결과로부터 단백질분해조절 효소 USP12, USP46, USP51의 상대적인 mRNA 발현 비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
도 5는 도 3의 결과로부터 단백질분해조절 효소 USP17, OTUD1, PSMD14의 상대적인 mRNA 발현 비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
도 6은 qRT-PCR을 수행하여 난소암 세포주 A2780과 비교해 A2780/cisR에서 감소된 단백질분해조절 효소 USP12, USP46, USP51의 상대적인 mRNA 발현비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
도 7은 qRT-PCR을 수행하여 난소암 세포주 A2780과 비교해 A2780/cisR에서 증가된 단백질분해조절 효소 USP17, OTUD1, PSMD14의 상대적인 mRNA 발현비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. (***: p < 0.001, **: 0.001 < p < 0.01, *: 0.01 < p < 0.05, ns: p > 0.05)
본 명세서에서, "난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료"라 함은 난소암 환자의 종양 세포로부터 생검(biopsy) 등을 통하여 체외로 분리된 세포 또는 조직 시료를 말한다. 병원에서는 난소암 환자의 진단 및 치료계획의 수립을 위하여 통상적으로 환자로부터 난소암 종양 세포 및 조직을 채취하여, 다양한 검사를 수행한다. 따라서, 본 명세서에서 "난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료"라 함은 병원에서 조직 검사 등을 위하여 환자로부터 체외로 분리된 세포 또는 조직 시료를 말한다.
본 발명자들은 본 연구실에서 제작한 단백질분해조절 효소 유전자 프라이머 세트(예를 들어, 대한민국 특허공개 제10-2018-0050098호의 프라이머 세트를 포함) 를 이용하여 시스플라틴 저항성을 지닌 난소암 세포에서 특이적으로 발현량 차이를 보이는 단백질분해조절 효소 유전자를 다중 중합효소 연쇄 반응(Multiplex RT-PCR)을 통하여 확인하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 시스플라틴 내성 난소암 세포주인 A2780/cisR에서 특이적으로 저발현되거나 과발현되는 단백질분해조절 효소 유전자, 즉 USP12, USP17, USP46, USP51, OTUD1, PSMD14를 대상으로 추가적으로 qRT-PCR를 진행하여 mRNA 발현 차이를 정량화함으로써 검증하였다. 상기 Multiplex RT-PCR 및 qRT-PCR 분석을 통하여, 시스플라틴 내성 난소암 세포주(A2780/cisR)에서 USP12, USP46, USP51의 mRNA 발현이 하향조절된 반면, USP17, OTUD1, PSMD14의 mRNA 발현이 상향조절된다는 것이 밝혀졌다. 이전에 시스플라틴 내성 난소암 세포를 대상으로 진행한 연구에서 발현 차이가 확인된 USP46에 추가하여, USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14는 난소암 치료 시, 시스플라틴 내성 진단을 위한 바이오마커로 작용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다.
본 발명의 분석방법에 바이오마커로 사용되는 상기 단백질분해조절 효소 USP12, USP17, USP51, OTUD1, PSMD14의 단백질 서열 및 이를 코딩하는 유전자의 염기서열은 모두 공지되어 있으며, 따라서 공지된 단백질 및 유전자 서열을 본 발명의 분석방법에 이용될 수 있다. USP12 (ubiquitin-specific peptidase 12) 단백질의 NCBI 억세션 번호 (NCBI accession number)는 AAH26072.1, AAC23551.1 및 BAF82374.1이며, 이를 코딩하는 mRNA의 NCBI 억세션 번호는 BC026072.1, AF022789.1, AK289685.1 및 AL049221.1 등이다. USP17 (ubiquitin-specific peptidase 17) 단백질의 NCBI 억세션 번호 (NCBI accession number)는 AY509884.1이며, 이를 코딩하는 mRNA의 NCBI의 억세션 번호는 AAR91701.1이다. USP51 (ubiquitin-specific peptidase 51) 단백질의 NCBI 억세션 번호는 CAE47750.2, AAH35907.1 및 CAE48396.2 등이며, 이를 코딩하는 mRNA의 NCBI 억세션 번호는 AI934832.1, AJ583823.2, BC035907.1, BC131541.1, BN000340.2 및 BU101641.1 등이다. OTUD1 (ovarian tumor deubiquitinase 1) 단백질을 코딩하는 mRNA의 NCBI 억세션 번호는 AB188491.1, AI261652.1 및 AK096389.1 등이다. PSMD14 (proteasome 26S subunit, non-ATPase 14) 단백질의 NCBI 억세션 번호는 BAD92457.1, BAG51474.1, AAH09524.1, AAH66336.1, AEE61289.1 및 AAC51866.1이며 이를 코딩하는 mRNA의 NCBI 억세션 번호는 AB209220.1, AK055128.1, AK091095.1, BC009524.1, BC066336.1, BM978668.1, DA133201.1, HM005692.1 및 U86782.1 등이다.
상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량의 수준(level)은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량은 유전자의 mRNA 양을 측정함으로써 수행될 수 있으며, mRNA 양의 측정은 역전사-PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) 또는 정량적 실시간-PCR(quantitative Real Time PCR, qRT-PCR) 등의 방법에 의해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 분석방법은 USP12 및 USP51로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 유전자의 발현량 측정은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 사용하여 mRNA 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
예를 들어, 시스플라틴에 대하여 내성을 갖지 않는 세포[예를 들어, A2780(93112519, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 등] 및 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP12 및/또는 USP51의 발현량을 qRT-PCR의 방법으로 각각 측정하고; qRT-PCR을 통해 2-ΔΔCt 방법으로 분석한 mRNA 발현량을 토대로 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP12 및/또는 USP51의 발현량이 시스플라틴에 대하여 내성을 갖지 않는 세포 중의 USP12 및/또는 USP51의 발현량에 비하여 유의성 있게(예를 들어, 2배 이상) 낮게 발현될 경우, 해당 난소암 환자는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자로 분류할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 분석방법은 USP17, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 유전자의 발현량 측정은 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 또는 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 사용하여 mRNA 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
예를 들어, 시스플라틴에 대하여 내성을 갖지 않는 세포[예를 들어, A2780(93112519, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 등] 및 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP17, OTUD1, 및/또는 PSMD14의 발현량을 qRT-PCR의 방법으로 각각 측정하고; qRT-PCR을 통해 2-ΔΔCt 방법으로 분석한 mRNA 발현량을 토대로 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP17, OTUD1, 및/또는 PSMD14의 발현량이 시스플라틴에 대하여 내성을 갖지 않는 세포 중의 USP17, OTUD1, 및/또는 PSMD14의 발현량에 비하여 유의성 있게(예를 들어, 2배 이상) 높게 발현될 경우, 해당 난소암 환자는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자로 분류할 수 있다.
본 발명은 또한 USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 진단용 키트로서, 상기 분자가 상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머는 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조할 수 있으며, 해당 프라이머를 포함한 진단용 키트를 제조할 수도 있다. 예를 들어, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4 및 7 내지 12로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 염기 서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 키트는 상기 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태를 가짐으로써 DNA 칩 또는 단백질 칩 등의 칩(chip) 형태일 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 시험방법
(1) 난소암 세포주 및 시스플라틴 내성 세포주의 배양
난소암 세포주 A2780(93112519, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 세포주 A2780/cisR(93112517, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)은 10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic (15240062, Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함한 RPMI 1640 배지(31800-022, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
(2) 세포생존력 측정
세포 수를 측정한 후, 96-웰 플레이트에 각각 A2780 및 A2780/cisR의 세포 5 x 103 개가 자라도록 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 다음 날, 이들 세포를 시스플라틴 30 μM가 함유된 RPMI 1640 배지에서 0시간, 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 시스플라틴 30 μM가 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양된 A2780 및 A2780/cisR의 배양액에 각각 CCK-8 용액(Cell Counting Kit-8, CK04-11, Dojindo Molecular Technologies Inc., Japan)을 1:10만큼 첨가하고, 제조사의 프로토콜에 따라 세포를 2시간 동안 추가로 배양한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존력을 확인하였다.
(3) RNA 추출 및 cDNA 합성
RPMI 1640 배지에서 배양된 난소암 세포주 A2780과 시스플라틴에 대하여 내성을 지닌 난소암 세포주 A2780/cisR을 각각 수확하고, Trizol 용액(15596018, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 A2780과 A2780/cisR 세포로부터 RNA을 추출하였다. 겔 전기영동 상에서 관찰되는 18S rRNA, 28S rRNA band를 통해 RNA가 추출되었음을 확인하였다. RNA 정량 후 각각 1 μg의 농도의 RNA로 cDNA 합성키트(CMRTK002, Cosmogenetech, 서울, 대한민국)를 사용하여 cDNA를 합성하여, 이하의 다중 중합효소 연쇄 반응(Multiplex RT-PCR)과 qRT-PCR을 수행하였다.
(4) Multiplex RT-PCR
각각 250 ng으로 희석된 cDNA에 housekeeping 유전자 GAPDH를 증폭시킬 수 있는 프라이머(서열번호 13 및 14) 및 본 연구실에서 제작한 단백질분해조절 효소 유전자 프라이머 세트(대한민국 특허공개 제10-2018-0050098호의 프라이머 세트를 포함)를 사용하여 Multiplex RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 GAPDH의 양이 일정하였을 때 Multiplex RT-PCR를 진행하였다. 각 cDNA에 Multiplex RT-PCR 용 2X premix (SMP01-M25h, Solgent, 대전, 대한민국)와 12개의 그룹으로 나누어진 Multiplex RT-PCR 용 단백질분해조절 효소 프라이머를 첨가하여 Multiplex RT-PCR을 수행하였다. Multiplex RT-PCR에 사용된 프라이머 세트의 각 프라이머 서열은 표 1 내지 표 5와 같다. PCR 조건은 변성 단계 95℃에서 20초, 결합 단계 60℃에서 40초, 신장 단계 72℃에서 60초로 총 40회 진행하였다. 상기 Multiplex RT-PCR 분석은 4회 반복하였다.
(5) qRT-PCR
100 ng으로 희석된 cDNA를 주형으로 사용하여, StepOneTM Real-Time PCR System (4376357, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 qRT-PCR를 실시하였다. SYBRTM Green PCR Master Mix(4309155, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여, qRT-PCR은 다음과 같이 수행하였다. PCR 조건은 변성 단계 95℃에서 15분, 사이클 단계로 변성 단계 95℃에서 20초, 결합 단계 60℃에서 40초, 신장 단계 72℃에서 1분으로 총 40회, 용융 단계 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃에서 15초로 진행하였다. 그 후에 GAPDH에 대하여 USP12, USP17, USP46, USP51, OTUD1, PSMD14의 mRNA 발현을 2-ΔΔCt 방법으로 분석하였다. Housekeeping 유전자인 GAPDH와 해당 단백질분해조절 효소들에 사용된 프라이머 세트는 표 6과 같다.
| 유전자 | 서열번호 | 서열 | |
| USP12 | 1 | 정방향 | 5’- GAA CTC TGA GTC TGG TTA CAT CCT -3’ |
| 2 | 역방향 | 5’- GAG GAG CTG GTA TCT CTG ATT TCA -3’ | |
| USP17 | 3 | 정방향 | 5’- GAG CAA CGC AAG GAG AGC TCA AG -3’ |
| 4 | 역방향 | 5’- AGG GTA CCT TCG ACT TTT CTG ACG -3’ | |
| USP46 | 5 | 정방향 | 5’- CCA ATC CTG CTG ATG TGG CAG TC -3’ |
| 6 | 역방향 | 5’- GCT GAT GGC TGG AAA GAT GTA GTA -3’ | |
| USP51 | 7 | 정방향 | 5’- GGA CCC CAG AGA CTA GGA AAC G -3’ |
| 8 | 역방향 | 5’- CAT AAT CCT TAC ACA TGA AGC A -3’ | |
| OTUD1 | 9 | 정방향 | 5’- ATG GGG CAG ATG CTG AAT GTG A -3’ |
| 10 | 역방향 | 5’- TGC ACC AGT TGT CGT ACT CTG -3’ | |
| PSMD14 | 11 | 정방향 | 5’- GGT TTG ACA CTT CAG GAC TAC A -3’ |
| 12 | 역방향 | 5’- GAG GTC ATA AGT ACA TCC ACAT G -3’ | |
| GAPDH | 13 | 정방향 | 5’- ATC CCA TCA CCA TCT TCC -3’ |
| 14 | 역방향 | 5’- CCA TCA CGC CAC AGT TTG -3’ | |
(6) 도출된 결과 확인 및 분석
덴시토메터 분석 (Densitometric analysis)은 Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 수행하였고, Turkey는 GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)로 수행하였다. ANOVA는 유의성 있는 차이를 나타내기 위한 일원 분석 (one-way analysis)으로 수행하였다.
2. 시험결과
난소암 세포주 A2780과 시스플라틴 내성 난소암 세포주 A2780/cisR에서 시스플라틴(30 μM) 처리 후, 0시간, 24시간, 48시간 동안 배양한 후 CCK-8 키트를 이용하여 세포생존력을 확인한 결과는 도 1과 같다. A2780은 시스플라틴을 처리한 후 세포생존력이 감소하는 반면, A2780/cisR은 시스플라틴에 대한 내성으로 세포생존력이 감소하지 않고 오히려 증식하는 결과를 나타내었다.
난소암 세포주 A2780과 시스플라틴 내성을 가진 난소암 세포주 A2780/cisR에서 RNA를 추출하고 cDNA를 합성한 다음, Multiplex RT-PCR을 수행한 후 겔 전기영동을 통해 분석하였다(도 2 및 도 3). 도 2a 내지 도 2c는 A2780/cisR 세포에서 감소된 mRNA 발현을 보인 단백질분해조절 효소들을 표기한 Multiplex RT-PCR 분석결과이다. 도 3a 내지 도 3c는 A2780/cisR 세포에서 증가된 mRNA 발현을 보인 단백질분해조절 효소들을 표기한 Multiplex RT-PCR 분석결과이다. 도 2 및 도 3의 결과로부터, A2780 세포 및 A2780/cisR에서 mRNA 발현 변화를 나타내는 단백질분해조절 효소는 USP12, USP17, USP46, USP51, OTUD1, PSMD14임을 확인할 수 있다.
도 4는 도 2의 결과로부터 단백질분해조절 효소 USP12, USP46, USP51의 상대적인 mRNA 발현 비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. 도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, USP12는 3.11배, USP46은 2.13배, USP51은 2.80배 발현이 감소하였다. 또한, 도 5는 도 3의 결과로부터 단백질분해조절 효소 USP17, OTUD1, PSMD14의 상대적인 mRNA 발현 비율을 통계·분석한 결과를 나타낸다. 도 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, USP17은 1.46배, OTUD1은 3.35배, PSMD14는 1.58배 발현이 증가하였다.
qRT-PCR을 수행하여 시스플라틴 내성 세포에서 USP12, USP17, USP46, USP51, OTUD1, PSMD14의 mRNA 발현 변화를 확인하여 Multiplex PCR 결과를 검증하였다(도 6 및 도 7). 도 6은 qRT-PCR 결과를 근거로 단백질분해조절 효소 USP12, USP46, USP51의 상대적인 mRNA 발현비율을 통계·분석한 결과이다. 도 6의 결과로부터, 시스플라틴 내성을 지닌 세포에서 USP12는 4.07배, USP46은 2.03배, USP51은 8.83배로 mRNA 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 도 7은 qRT-PCR 결과를 근거로 단백질분해조절 효소 USP17, OTUD1, PSMD14의 상대적인 mRNA 발현비율을 통계·분석한 결과이다. 도 7의 결과로부터, 시스플라틴 내성을 지닌 세포에서 USP17은 3.45배, OTUD1은 4.04배, PSMD14는 3.97배로 mRNA 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
3. 고찰
시스플라틴은 다양한 암을 치료하는 항암제로 사용되며, 전 세계적으로 흔한 부인과 종양 중 하나인 난소암 환자를 치료하기 위해 주로 사용되는 백금 기반 항암제이다. 초기에는 효능이 좋지만 대부분의 환자에게 궁극적으로 내성이 유도되어 재발 및 나쁜 예후를 보이는 문제점이 있다. 본 발명자들은 Multiplex RT-PCR과 qRT-PCR을 통해 내성이 유도된 난소암 세포 A2780/cisR에서 단백질분해조절 효소 유전자 USP12, USP46, USP51의 감소와 USP17, OTUD1, PSMD14의 증가를 확인하였다. 이전에 시스플라틴 내성 난소암 세포를 대상으로 진행한 연구에서 USP46의 발현 차이가 확인된 바 있다. 따라서, USP46에 추가하여, 상기한 5가지의 단백질분해조절 효소 USP12, USP17, USP51, OTUD1, PSMD14를 중심으로 시스플라틴 내성유무를 진단할 수 있는 모델을 구축할 수 있다. 또한, 본 연구결과에 따라 시스플라틴 내성에 따른 단백질분해조절 효소와 시스플라틴 내성 메커니즘 연구가 가능하며, 내성 진단을 위한 바이오마커로서 단백질분해조절 효소 유전자 USP12, USP17, USP51, OTUD1, PSMD14를 사용할 수 있다.
Claims (10)
- 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 환자의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 난소암 환자로부터 체외로 분리된 종양 세포 시료 중 USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자 발현량의 측정이 상기 유전자의 mRNA 양을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
- 제2항에 있어서, 상기 mRNA 양의 측정이 RT-PCR 또는 qRT-PCR에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, USP12 및 USP51로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법.
- 제4항에 있어서, 상기 유전자의 발현량 측정이 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 또는 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 사용하여 mRNA 양을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, USP17, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법.
- 제6항에 있어서, 상기 유전자의 발현량 측정이 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 또는 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 사용하여 mRNA 양을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
- USP12, USP17, USP51, OTUD1 및 PSMD14로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 시스플라틴에 대하여 내성을 갖는 난소암 진단용 키트로서,
상기 분자가 상기 단백질분해조절 효소를 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 키트. - 제8항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 1 내지 4 및 7 내지 12로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
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