KR20050098821A

KR20050098821A - Ｇ-ｃｓｆ의 액손3 영역이 결실된 단백질 및 이에 특이적인항체 및 이들의 제조방법

Info

Publication number: KR20050098821A
Application number: KR1020050089651A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 정기준; 정현철; 금기창; 유내춘; 유원민
Original assignee: 메디제네스(주); 유원민; 유내춘; 금기창
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2005-09-27
Publication date: 2005-10-12
Also published as: US20040247562A1; US20050266430A1; US20050244856A1; EP1446485A1; US20050170416A1; AU2002343900B2; DE60235568D1; US20120329078A1; JP4413611B2; KR20030027870A; KR100716014B1; KR100523328B1; US20100286381A1; WO2003027288A9; JP2005503810A; US20140005365A1; US20120322684A1; US20050158810A1; US8324363B2; CN100491527C

Abstract

본 발명은 암 진단용 마커로서 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF, Granulocyte colony stimulating factor) 유전자에서 나타나는 액손3 결실여부나 결실에 의해 생성된 G-CSF 변이 단백질의 농도를 분석함으로써 암의 발생 여부를 예측 내지 진단하는 방법, 조성물, 마이크로어레이, 항체 또는 키트에 관한 것이다.

Description

Ｇ-ＣＳＦ의 액손3 영역이 결실된 단백질 및 이에 특이적인 항체 및 이들의 제조방법{G-CSF Exon 3-Deleted Protein and Antibody thereof, and Producing Method thereof}

본 발명은 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF, Granulocyte Colony Stimulating Factor) 유전자의 변이 특성을 이용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 진단용 마커로서 G-CSF에서 나타나는 액손3 결실여부를 유전자 또는 단백질 수준에서 분석함으로써 암의 발생 여부를 예측 내지 진단하는 방법에 관한 것이다.

현대사회에 있어 각종 사고를 제외한 성인의 사망원인 1-2위를 다투고 있는 질병인 암에 있어서 그 조기 진단 및 근원적 치료법의 개발이 중요한 과제가 되고 있다. 일반적으로 말기상태의 암은 치료가 거의 불가능한 반면 초기 상태의 암은 치료율이 훨씬 높으며 치료방법 또한 훨씬 간단하다고 알려져 있다. 따라서 정확하고 신속한 진단방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

현재 일반적으로 행해지고 있는 암의 진단은 (1) 광학현미경, 전자현미경 등을 이용한 형태학적 분석을 통한 형태학적 진단, (2) 암조직 내에서 발현되는 특정한 단백질의 분석을 통한 면역조직화학적 진단(Iran. Biomed.J. 3 (3 & 4): 99-101, 1999; Lancet 2:483-6,1986), (3) 암조직 내에서 나타나는 유전자의 돌연변이와 같은 분자 생물학적 이상의 분석을 통한 분자생물학적 진단 등의 방법들을 이용하여 이루어진다. 이들 방법 중 형태학적 진단이나 면역조직학적 진단의 경우 분자생물학적 진단과 비교하여 훨씬 더 많은 시간이 소요되며 경제적인 부담 또한 훨씬 높다. 분자생물학적 방법은 그 작업이 상대적으로 단순하며 몇몇 경우에는 단시간에 결과를 알 수 있기 때문에 현재 새로운 진단방법 개발 연구의 중심이 되고 있다. 최근 상해에 있는 Health Digit사가 다양한 암 진단을 위한 단백질칩 시스템을 개발하였고, 세계 최초로 중국 의약품 안전청으로부터 임상 진단 허가를 받았다는 보고도 있었다(www.health-digit.com). 하지만, 이것 역시 하나의 바이오마커(biomarker)로 모든 암을 진단하는 형태가 아니라, 10개 이상의 많은 단백질을 이용하는 형태이다.

상기와 같은 방법들의 효율적인 적용에 있어서 가장 중요한 것은 암 발생여부를 보다 정확하고 손쉽게 확인할 수 있는 암 진단 마커의 선택 및 사용이다. 암 진단 마커(marker)로서 몇몇 유전자(Steve M. et al., J. Clin. Oncology 20:3165-3175, 2002; Sridlhar R. et al, J. Clin. Oncology 20:1932-1941, 2002) 또는 단백질(Goessl et al., Urology 58:335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res Treat 66:217-224, 2001; 김철근 외, 대한민국 특허공개번호 2001-0061173)이 보고되어 있으며 이 중에서 실제 진단에 이용되고 있는 경우도 있다. 기존에 사용되고 있는 암에 대한 마커의 경우 장기 특이성이 낮은 CEA, BFP, TPA, IAP의 경우는 민감도가 떨어져서 가양성(false positive)의 우려가 있으며, 반면, 장기 특이성이 높은 AFP, PIVKA II, Esterase I, CA19-9, CA50, SPan-1, Antigen, CA15-3, BCA 225 등의 마커의 경우는 당초부터 표적장기를 목적으로 이용하는 때에만 유용한 단점이 있다. 따라서 암 진단에 있어 정확성뿐만 아니라 경제적이고 간편한 진단을 위해서도 다양한 종류의 암을 진단할 수 있는 새로운 마커의 개발이 절실히 요구된다.

이에 따라, 본 발명자들은 다양한 종류의 암을 진단한 수 있는 암 진단 마커를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과 암환자의 경우 G-CSF의 전사 과정에서 액손3 영역의 결손이 나타남을 확인하고 G-CSF mRNA 단편 또는 단백질을 암 진단 마커로 사용함으로써 다양한 암환자를 간편하고 경제적으로 또한 빠르게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

한 가지 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 DNA 서열이 결손된 G-CSF 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질의 제조 방법 및 이로부터 제조된 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질을 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 동물에 투여하는 단계; 상기 동물로부터 혈액을 채취하는 단계; 및 상기 혈액으로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체의 제조 방법 및 이로부터 제조된 항체를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 동물에 투여하는 단계; 상기 동물로부터 상기 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 생산하는 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 세포와 골수종 세포를 세포융합 하는 단계; 상기 세포융합된 세포로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마를 분리하는 단계; 및 상기 하브리도마를 이용하여 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 얻는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체의 제조 방법 및 이로부터 제조된 항체를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 G-CSF의 엑손3 영역의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 진단제, 암 진단용 키트, 또는 암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명은 암 진단용 마커로서 인체유래 G-CSF에서 나타나는 액손3 결실여부를 유전자 또는 단백질 수준에서 분석함으로써 암의 발생 여부를 예측 내지 진단하는 방법에 관한 것이다.

단구성 대식세포(macrophage), T-세포 및 섬유아세포와 같은 세포에서 생산되는 것으로 알려진 콜로니 자극인자(colony stimulating factor, CSF)는 정상적으로 생체내에서 광범위하게 분포되어 있다. CSF는 크게 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF), 단구성 대식세포 콜로니 자극인자 및 과립성 백혈구-단구성 대식세포 콜로니 자극인자의 3가지로 구분되며, 이중 G-CSF는 조혈성 간세포가 증식 및 분화되어 일어나는 여러 가지 혈구 생성에 매우 중요한 역할을 하는 단백질이다. 이의 주요 작용은 과립구 특히 외부 감염으로부터 생체를 보호하는데 중요한 역할을 하는 호중구(neutrophil)의 수적 증가를 촉진시키는 일이다. 증식성 종양에 대해 최근 널리 이용되고 있는 화학적 치료법은 종양의 성장을 억제하는 동시에 호중구 전구체의 성장 또한 억제하므로 환자로부터 호중구 보호작용의 감소현상을 일으켜 심한 부작용을 유발하게 된다. G-CSF는 이러한 약물치료 환자들에게 투여되었을 때 호중구의 수적 증가를 촉진시켜 감염성 질환을 예방하고 치료하는데 효과가 있는 것으로 알려졌다. 1986년 인체유래 G-CSF 유전자가 나가타(Nagata) 등에 의해 그 염기서열이 처음 밝혀졌고 이의 COS 세포내에서의 발현이 보고되었다(Nagata et al., Nature 319:415-418, 1986).

사람 G-CSF(hG-CSF)는 30개의 아미노산으로 구성된 분비신호 펩타이드(signal peptide)와 174개의 아미노산으로 구성된 당단백질(glycoprotein)이다. 5개의 시스테인(cystein)이 존재하며 이 중 4개의 시스테인(Cys³⁶-Cys⁴², Cys⁶⁴-Cys⁷⁴)이 두 개의 황이중 결합(disulfide bond)을 형성하여 단백질 접힘(folding) 및 활성(activity)에 중요하게 관여하는 것으로 알려졌다(Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167-5171, 1993). 도 1에 나타낸 바와 같이 인체 유래 G-CSF 유전자는 인체 게노믹 DNA 상에 모두 5개의 액손 및 4개의 인트론으로 구성되어 있으며 이 게노믹 DNA로부터 전사작용(transcription)을 통하여 mRNA가 만들어지고 다시 스프라이싱(splicing)과정을 통하여 4개의 인트론이 제거되고 5개의 액손으로만 구성된 성숙 mRNA가 만들어진다. 이후 번역작용(translation)을 통하여 204개의 아미노산으로 구성된 G-CSF 전구체가 만들어지고 다시 N-말단에 존재하는 30개의 아미노산으로 구성된 분비신호서열(signal peptide)가 제거되면서 비로소 생물학적 활성을 갖는 G-CSF 단백질(174개 아미노산)이 생산되게 된다(Nagata et al., EMBO J. 5:575-581, 1986; Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167-5171, 1993).

본 발명자들은 사람 G-CSF 유전자를 클로닝하여 이의 생산을 위한 연구를 수행하던 중 암세포에서 유래한 G-CSF cDNA에서 액손3 부분(108 bp)이 정확하게 결실되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 특정 액손의 결실은 G-CSF가 아닌 다른 유전자에서는 적지 않게 보고가 되어 있었으나 인체유래 G-CSF 유전자에 있어서는 아직까지 보고된 적이 없다. 사람 G-CSF 유전자는 액손2 말단의 3개 아미노산이 있는 경우와 없는 경우가 있고 이들 두 가지 경우 모두 같은 활성을 갖고 있다고 보고된 바 있다(Nagata et al., EMBO J. 5:575-581, 1986). 따라서, G-CSF 유전자의 액손3의 결실 여부를 측정하여 암을 진단하는 방법은 G-CSF의 모든 아형에 동일한 원리에 따라 적용될 수 있다. 또한, 다른 포유동물 유래의 G-CSF 또한 거의 동일한 활성을 나타내고 있는 것으로 알려져 있으므로, 당업자는 본 발명에 따른 G-CSF 유전자의 액손3의 결실 여부를 측정하여 암을 진단하는 방법이 다른 동물 유래의 G-CSF에도 동일한 원리에 따라 적용될 수 있음을 이해할 것이다.

암세포에서 특이적으로 발현되는 (또는 억제되는) 유전자 및 유전적 돌연변이 등을 확인하는 분자생물학적 방법으로 예를 들면 (a) 중합효소 연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)(Bottema, C.D., Mutat Res. 233:93-102, 1993; Nelson, D.L., Curr. Opin. Genet. Dev. 1: 62-68, 1991; Pourzand, C. and Cerutti, P., Mutat. Res. 288:113-121, 1993; Holland PM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 7276-7280, 1991), (b) 단일 가닥 입체 다형화(SSCP, Single-Stranded Conformation Polymorphism)(Glavac D., Hum. mutat. 19:384-394, 2002; Strippoli, P. et al., Int. J. Mol. Med 8:567-572, 2001; Methods Mol Biol 187:151-63, 2002), (c) DNA 염기서열분석(DNA Sequencing Analysis)(Sanger, F. et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1997), (d) 단백질 절단 테스트(PTT, Protein Truncation Test)(Hardy, C.A., Methods Mol. Biol. 187:87-108, 2002), (e) 자동염기서열 분석법(Boutin P. et al., Hum. Mutat. 15(2):201-203, 2000), (f) LOH(loss of heterozygosity) 연구(Yang Q. et al., Clin. Cancer Res. 8:2890-2893, 2002), (g) MSI(microsatellite instability) 연구(Furlan, D. et al., J Pathol 197:603-609, 2002), (h) MALDI-TOF를 이용한 유전자 검사(Leushner J., Expert Rev. Mol. Diagn. 1:11-18, 2001), (i) 혼성화 반응(Hybridization)을 통한 유전자 검사(Wetmur, J. G., Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol. 26:227-259, 1991), (j) DNA 칩을 통한 유전자 검사(Goessl et al., Urology 58:335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res. Treat. 66:217-224, 2001; 김철근 외, 대한민국 특허공개번호 2001-0061173), (k) 단백질 칩을 이용한 검사(Pharmacogenomics 1:385-393, 2000) 등이 진단에 사용될 수 있다. 당업자는 상기 열거된 방법을 포함한 공지된 분자생물학적 방법을 적절히 응용하여 G-CSF 유전자 또는 단백질의 액손3 영역 결손을 용이하게 확인할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 이용될 수 있는 상기 많은 방법 가운데, 본 발명에 따른 G-CSF 유전자 또는 단백질의 액손3 영역 결손 확인은 PCR, 혼성화 반응, DNA 칩, 단백질 칩 또는 효소면역측정법을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 암 진단을 위해 선행되어야 하는 것은 피검 조직 또는 세포로부터 G-CSF 유전자 또는 단백질 시료를 획득하는 것이다. 보통 조직 또는 세포로부터 분리되는 특정 유전자 시료는 미량이므로 PCR 반응에 의해 증폭되어야 하며 이러한 증폭을 위해서는 프라이머가 고안되어야 한다. 본 발명에 있어서 G-CSF 유전자의 액손3 영역의 전체 또는 이의 일부를 증폭하기 위해 액손3 영역의 결실 여부를 측정하기 위한 프라이머인 DNA 핵산 단편이 필요하다. 즉, 본 발명에서 프라이머는 액손3 일부 또는 전체를 포함하는 G-CSF 유전자의 핵산서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 의미한다. 이러한 프라이머를 고안하는 것은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 따라서, 액손3 일부 또는 전체를 포함하는 G-CSF를 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 본 발명의 프라이머 범위에 포함된다. 본 발명 프라이머의 일 예는 hG-CSF 유전자의 액손2의 일부부터 액손5까지(Thr1 - Pro174) 증폭할 수 있는 서열번호 1과 서열번호 2로 표시된 올리고뉴클레오티드, hG-CSF 유전자의 액손2의 일부부터 액손3(Ile24 - Leu71)까지 증폭할 수 있는 서열번호 3과 서열번호 5로 표시된 올리고뉴클레오티드, hG-CSF 유전자의 액손3 부터 액손4의 일부(Cys36 - Ser80)를 증폭할 수 있는 서열번호 4와 서열번호 6으로 표시된 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명자들은 8종의 정상조직 및 세포와 17종의 암세포주로부터 mRNA 및 cDNA를 확보하여 이들 프라이머 군으로부터 G-CSF 유전자 및 액손 3을 확인할 수 있었다.

본 발명은 G-CSF 유전자의 액손3 영역을 증폭하여 그 결실여부를 측정하는데 사용하는 프라이머쌍으로서 이들로 한정되는 아니지만 다음의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:

센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과

안티센스 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(서열번호 2);

센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과

안티센스 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(서열번호 5);

센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과

안티센스 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(서열번호 6);

센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과

안티센스 5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(서열번호 9);

센스 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(서열번호 3)과

안티센스 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(서열번호 2);

센스 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(서열번호 3)과

안티센스 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(서열번호 5);

센스 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(서열번호 3)과

안티센스 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(서열번호 6);

센스 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(서열번호 4)와

안티센스 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(서열번호 2);

센스 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(서열번호 4)와;

안티센스 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(서열번호 5); 및

센스 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(서열번호 4)와;

안티센스 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(서열번호 6).

상기 핵산 단편은 G-CSF 유전자의 액손3 영역을 포함하지 않아도 액손2 또는 액손4 영역에 해당하는 프라이머를 이용하여 액손3 영역의 결실을 확인할 수 있는 핵산 단편을 포함한다.

본 발명의 한 양태는 G-CSF 유전자의 액손 3 영역 전체 또는 이의 일부를 포함한 DNA 단편이 부착되어 있고 암을 진단하는데 유용한 유전자 마이크로어레이 또는 멤브레인을 포함한다. 유전자 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스(slide glass) 표면 위에 올리고뉴클레오티드 탐침을 부착하여 혼성화 방법으로 탐침에 상보적인 유전자를 검출하는데 이용될 수 있는 것으로 DNA 칩 등이 이에 포함된다. 멤브레인은 혼성화 반응에 있어서 슬라이드 글라스 대신 사용할 수 있는 것으로 특별히 한정되지 않으며 DNA 단편을 고정화할 수 있는 것은 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는, 나일론 또는 니트로셀룰로스 멤브레인을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이의 표면에는 탐침으로서 G-CSF 유전자의 액손3 영역에 해당하는 핵산 단편과 함께 액손1, 2, 4 및 5로 이루어진 그룹중에서 선택되는 한 개 이상의 핵산 단편이 부착된다. 여기서 핵산 단편 탐침은 각 액손의 전체 길이 또는 이의 일부분이 모두 가능하다. 본 발명에서 탐침으로 사용되는 액손3 영역의 핵산 단편으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 TGTGCCACCTACAAGCTGTG(서열번호 14), GAGCTGGTGCTGCTCGGACA(서열번호 15), GGACACTCTCTGGGCATCCC(서열번호 16) 및 CTGAGCAGCTGCCCCAGCCA이 포함된다. 액손1, 2, 4 및/또는 5의 핵산 단편은 대조용 탐침으로 사용되며 이의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC(서열번호 10), AGAAGCTGTGGTGCCAC(서열번호 12), TGAGTGAGTGTGCCAC(서열번호 13), GCAGGCTGCTTGAGCCAA(서열번호 18), AGAAGCTGGCAGGCTG(서열번호 19) 및 TGAGTGAGGCAGGCTG(서열번호 20)이 포함된다.

슬라이드 글라스, 멤브레인 등의 표면에 탐침을 스폿팅하는 것은 본 분야의 공지 기술을 통해 용이하게 실시될 수 있다. 또한, 표적의 준비 및 혼성화와 스트립핑도 통상적인 기술에 따라 실시될 수 있다.

본 발명의 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손3 영역 전체 또는 이의 일부를 포함한 DNA 단편과 진단학적으로 허용되는 통상적인 담체를 포함하는 암 진단용 조성물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손3 영역의 아미노산이 결실된 G-CSF 변이체와 이 변이체에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 이용하여 암을 진단하는 방법을 포함한다. 여기서, "액손3 영역의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체"는 성숙한 단백질이 번역되는 과정에서 액손1 영역 내지 액손5 영역 중에서 액손3 영역을 포함하여 결실이 일어나서 생성된 G-CSF 변이 단백질을 말한다. 본 발명의 또 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손3 영역 전체 또는 이의 일부를 포함한 DNA단편과 이것을 이용한 DNA 마이크로 어레이를 포함한 진단 키트를 포함한다. 본 발명의 또 다른 특정 양태로서, 본 발명은 G-CSF 변이체 및 G-CSF 변이체에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날항체를 이용한 단백질 어레이를 포함한 진단 키트를 포함한다.

본 발명에 따른 액손3 영역의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체 및 이에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체는 본 분야의 통상적인 방법으로 생산할 수 있다(Harlow, E. and Lane, D., Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Wilson, L. and Matsudaira, P. eds. Antibodies in Cell Biology (Methods in Cell Biology, Vol.37). New York: Academic Press, 1933).

본 발명에 따르면, 17종의 암세포주로부터 mRNA 및 cDNA를 제조하고 hG-CSF 유전자의 액손3 부위를 포함하는 서열을 증폭한 다음 그 염기서열을 분석함으로써 위암, 유방암, 육종, 장암, 폐암 자궁경부암 및 악성 흑색종 세포에서 유래한 hG-CSF cDNA의 경우 액손3 부위(108bp)가 결실되어 있는 것으로 밝혀졌다(도 2 및 도 3). 17종의 암세포주 유래의 hG-CSF cDNA를 주형으로 하여 상기 본 발명에 따른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과, 16종의 암세포주로부터 유래된 PCR 산물이 정상 세포주로부터 유래된 PCR 산물에 비해 그 크기가 작음을 확인하였고 이의 유전자 염기서열을 확인한 결과 정상적인 G-CSF 유전자를 구성하는 다섯 개의 액손 중에 정확히 액손3 부위가 결실되어 있음이 확인되었다.

또한, 혼성화 반응을 이용하여 G-CSF cDNA의 액손3 결실여부를 확인할 수 있다. 예를 들면, 정상 hG-CSF 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행함으로써 액손3 부위의 DNA 절편과 액손2 영역의 DNA 절편을 획득하고 이를 나일론 멤브레인에 고정화한 다음 암세포주의 cDNA 표적과 혼성화시킨 후 표적와 액손3 DNA 단편과의 결합여부를 확인하여 액손3 결핍 여부를 용이하게 확인할 수 있다.

또한, DNA칩을 이용하여 G-CSF cDNA의 액손3 결실여부를 확인할 수 있다. 각 액손 영역의 올리고뉴클레오타이드를 탐침으로 슬라이드 상에 고정화한 뒤 hG-CSF 액손 영역의 유전자를 주형으로 하여 PCR를 수행한 것을 탐침과 반응시킴으로서 액손3 영역의 결실여부를 확인할 수 있다.

또한, 액손3 영역의 결실이 일어난 변이 염기서열로부터 변이 G-CSF에 대한 재조합 단백질을 만들고 여기에 대한 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체를 제작하여 효소면역측정법을 통해 정상인과 여러 가지 암환자간의 G-CSF 변이 단백질의 수치를 측정함으로써 액손3 영역의 결실여부를 쉽게 확인할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 면역크로마토그라피 분석을 포함한다. 이의 대표적인 것으로 측방유동분석법(lateral flow assay)이 있다. 이 측방유동분석 타입의 키트 구조를 살펴보면 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 막(주로, 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다. 탐지용 항체는 탐지를 표지하기 위하여 예를 들면 콜로이드성 금입자에 고정되어 있다. 금입자 대신 라텍스 비드(latex bead) 또는 탄소입자를 사용하기도 한다. 측방유동분석용 진단 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안되어 있다. 시료 속에 들어 있는 분석물이 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출패드에 코팅되어 탐지용항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 금입자의 양으로 판단한다.

본 발명의 또 다른 관점은 G-CSF 유전자의 액손3 부위의 결실여부를 분석함으로서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 인간 또는 동물의 조직 또는 세포 시료로부터 핵산시료를 획득한 다음 분자생물학적 방법을 이용하여 상기 핵산시료에서 G-CSF 유전자의 액손3 부위가 결실되었는지 여부를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. 인간의 조직 또는 세포 시료는 인간 기원의 액상시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 시료들은 시약처리, 가용화된 시료 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적상 인간의 조직 또는 세포시료는 종양 조직 또는 종양성으로 생각되는 조직을 포함하며, 예컨대 절제수술, 생검, 흡인법 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 얻어진다. 인간의 조직 또는 세포시료로부터 핵산시료의 분리는 당업계에 공지된 방법에 의해 획득될 수 있다.

본 발명에 따른 암 진단 방법은 상기에 설명한 바와 같이 액손3 결실여부를 유전자의 염기서열분석을 통해서 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 유전자가 발현되어 만들어진 G-CSF 단백질상의 액손3에 특이적인 탐침 예를 들어, 액손3의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체에 특이적인 항체를 이용하여 그 결실여부를 측정함으로서도 가능하다.

본 발명의 암의 진단방법의 대상 암으로는 위암, 유방암, 육종, 장암, 폐암 자궁경부암, 간암, 전립선암, 설암, 후두암, 인두암, 구강암, 갑상선암, 대장암, 식도암, 고환암 등의 암을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

암세포주로부터 mRNA 및 cDNA의 제조

8종의 정상 세포 및 조직과 17종의 암세포주로부터 mRNA 및 cDNA를 제조하였다. 본 발명의 실시예에서 사용한 정상 세포주와 암세포주는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

본 발명에 사용한 정상 세포주와 암세포주

세포 종류			분양기관
암세포주	YCC-7	위암 세포주	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
	AGS	위암 세포주	ATCC CRL-1739
	SNU-1	위암 세포주	서울대학교 세포주 은행
	MDA-MB-231	유방암 세포주	ATCC HTB-26
	MCF-7	유방암 세포주	ATCC HTB-22
	SK-BR-3	유방암 세포주	ATCC HTB-30
	HT-1080	육종 세포주	ATCC CCL-121
	HCT-116	장암 세포주	ATCC CCL-247
	COLO205	장암 세포주	ATCC CCL-222
	DLD-1	장암 세포주	ATCC CCL-221
	HT-29	장암 세포주	ATCC HTB-38
	A549	폐암 세포주	ATCC CCL-185
	NCI-H460	폐암 세포주	ATCC HTB-177
	HeLa	자궁경부암 세포주	ATCC CCL-2
	C-33A	자궁경부암 세포주	ATCC HTB-31
	B16	악성 흑색종 세포주	ATCC CRL-6322
	U-87MG	뇌암세포주	ATCC HTB-14
293	사람신장 배아세포주	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
정상세포주	샘플 1	사람 임파구(lymphocyte)	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
	샘플 2	사람 단핵구(monocyte)	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
	샘플 3	사람 표피조직(epidermis)	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
	샘플 4	사람 진피조직(dermis)	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
	샘플 5	사람 모낭세포(hair pollicle)	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
	샘플 6	사람 지방세포(fat)	연세대학교 의과대학 암전이연구센터
	샘플 7	사람 근육세포(muscle)	연세대학교 의과대학 암전이연구센터

상기 암세포주 모두는 상기 표에 기재된 기관으로부터 자유롭게 분양받아 이용될 수 있는 것이다. 또한, 사람의 정상 임파구, 단핵구, 표피조직, 진피조직, 모낭세포, 지방세포, 근육세포 등도 연세대학 의과대학 암전이연구센터로부터 용이하게 분양받을 수 있다. 연세대학교 의과대학 암전이연구센터로부터 분양받은 암세포주 YCC-7은 다음의 방법으로 제작된 것이다. 진행성 암환자로부터 무균적으로 복수를 얻어 세포의 클럼핑(clumping)을 방지하기 위하여 헤파린(heparin) 10unit/ml을 첨가 후, 400 x g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리하여 획득한 침전세포를 25㎠ 플라스크에 배양하였다. 적혈구가 다량 함유된 경우에는 피콜-하파큐(Ficoll-Hypaque)로 800 x g에서 비중원심 분리 후 단핵구층만을 얻어 5% CO₂ 37℃에서 배양하였다. 배양 하루(16-18시간)후 배양액을 다시 400 x g에서 10분간 원심분리하고 침전세포를 다른 25㎠ 플라스크에 배양하였다. 배양액중의 세포 상태를 위상차 현미경으로 관찰하면서 주 2-3회 새로운 배지로 교환하였다. 세포 관찰시 암세포 군락이 확인되면 효소인 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 처리하거나 또는 콜로니(colony)를 얻거나 또는 스크래퍼(scraper)를 이용하여 암세포 군락만을 획득하거나 또는 부유액에 존재하는 암세포를 다시 원침하여 정상세포 등을 제거하여 순수한 암세포만을 얻어 패시지(passage)별로 세포 동결하여 보관하였다.

각 암세포주, 정상 세포 및 정상 조직으로부터 전체 RNA는 TRI-REAGENT (GIBCO-BRL, 미국)를 이용하여 분리하였다. 액체질소를 이용해 급속 동결시켜 갈아진 조직샘플(tissue sample)에 트리졸 시약(Trizol reagent) 1 mL를 첨가하고 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 여기에 0.2 mL 클로로포름을 첨가한 후 심하게 15초 동안 흔들어준 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 상기 샘플을 12000 x g, 4℃에서 15분 동안 원심분리 한 후 수용성층(aqueous phase)을 새로운 튜브로 옮기고 이소프로필 알콜(isoproply alcohol)을 동량 첨가하고 4℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액을 12000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리한 다음 침전물(pellet)이 떨어지지 않게 상층액을 버리고 70% 에탄올로 7500 x g, 4℃에서 5분간 침전물을 세척하였다. RNA를 잘 건조시킨 후 RNA 가수분해효소-자유수(RNase-free water)로 용해하였다.

각각의 세포주 및 사람조직 유래의 암세포 및 정상세포로부터 얻은 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위해 다음과 같은 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하였다. 전체 RNA 2㎍과 올리고(dT)₁₆-프라이머(oligo(dT)₁₆ -primer) 1㎕에 RNA 가수분해효소-자유수(RNase-free water)를 첨가하여 최종부피가 11㎕이 되도록 한 후 90℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 빠르게 옮겼다. 다른 튜브에 반응완충용액 4㎕, 10mM dNTPs 2㎕, RNA 가수분해효소 억제제(RNase inhibitor) 1㎕, RTase 2㎕를 혼합한 후, 이 혼합물을 튜브(pre-mixture tube)에 8.5㎕씩 분주하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 상기 반응물을 42℃에서 90분 동안 반응시키고 95℃로 옮겨 15분간 다시 반응시킨 후 재빨리 얼음에 옮겨서 반응을 종료시켜 각각의 cDNA를 제조하였다.

실시예 2

중합효소 연쇄반응을 통한 hG-CSF 유전자의 검색

각각의 암세포주에서 정상적인 hG-CSF 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 cDNA를 주형(template DNA)으로 하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다. PCR은 도 2에 나타낸 바와같이, hG-CSF 유전자의 액손2의 일부부터 액손5까지(Thr1 - Pro174)를 증폭한 PCR1 반응과 액손2의 일부부터 액손3까지(Ile24 - Leu71)를 증폭한 PCR2 반응 및 액손3부터 액손4의 일부분(Cys36 - Ser80)을 증폭한 PCR3 반응을 수행하였다.

PCR1 반응은 각각의 암세포주 cDNA를 주형으로 하여 프라이머쌍 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(센스, 서열번호 1)과 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(안티센스, 서열번호 2)를 이용하여 수행하였다. PCR2 반응은 각각의 암세포주 cDNA를 주형으로 하여 프라이머쌍 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(센스, 서열번호 3)과 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(안티센스, 서열번호 5)를 이용하여 수행하였다. PCR3 반응은 각각의 암세포주 cDNA를 주형으로 하여 프라이머쌍 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(센스, 서열번호 4)과 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(안티센스, 서열번호 6)을 이용하여 수행하였다. PCR 반응은 고도의 PCR 시스템(High Fidelity PCR system, Boehringer Mannheim Co., 독일)을 이용하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 7분간 한번 하였고, 두 번째 변성은 94℃에서 40초, 교잡(annealing)은 56℃에서 40초, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다.

PCR 반응결과로 생성된 산물을 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 확인하였다. 전기영동 실험 결과, PCR1 반응산물의 경우 암세포주로부터 유래된 대부분의 PCR 산물은 정상적인 G-CSF 유전자보다 작은 크기를 갖고 있었으며 U-87MG의 경우에만 정상적인 G-CSF 유전자의 크기를 갖고 있었다(도 3a에서 M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:YCC-7, 레인3:AGS, 레인4:SNU-1, 레인5:MDA-MB-231, 레인6:MCF-7, 레인7:SK-BR-3, 레인8:HT-1080, 레인9:HCT-116, 레인10:COLO205; 도 3b에서 M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:DLD-1, 레인3:HT-29, 레인4:A549, 레인5:NCI-H460, 레인6:HeLa, 레인7:C-33A, 레인8:B16, 레인9:U-87MG). PCR2 반응산물과 PCR3 반응산물의 각 아가로스 겔 전기영동 분석결과의 경우는 상기 PCR1의 반응산물에서 정상으로 확인된 U-87MG 세포주에서만 PCR 산물을 얻을 수 있었으며 나머지 암세포주에서는 PCR 산물을 획득할 수 없었다(도 6 및 도 7). 또한, 상기 PCR2 반응과 PCR3 반응을 통해 획득한 U-87MG 세포주의 PCR 산물은 정상세포로부터 획득한 PCR 산물과 크기가 같음을 알 수 있었다.

또한, PCR1 반응산물의 유전자 염기서열을 자동염기서열 분석기(automatic DNA sequencer, ABI Prism model 377, Perkin Elmer Co. 미국)로 분석하였다. PCR1 반응산물의 염기서열 분석 결과, U-87MG 세포주로부터 획득한 PCR 산물은 정상 세포의 G-CSF 유전자와 동일한 서열(서열번호 7)을 갖고 있는 반면 나머지 암세포주에서 획득한 PCR 산물은 정상 세포의 G-CSF 유전자 염기서열과 비교하였을 때 중간에 108bp가 결실(deletion)된 서열(서열번호 8)을 갖고 있음을 확인하였다(도 4 및 도 5). 결실된 부분을 제외한 나머지 부분은 정상 세포 G-CSF 유전자의 염기서열과 완전히 일치하였다. 결실된 108bp에 해당하는 G-CSF 유전자의 염기서열을 확인한 결과, 총 5개의 액손으로 구성된 G-CSF 유전자에서 액손3에 해당하는 부분임을 알 수 있었다.

본 발명자들은 정상인의 조직에서도 정상 세포와 같은 PCR 결과가 나타나는지 알아보기 위해 정상인 임파구, 단핵구, 표피조직, 진피조직, 모낭세포, 지방세포, 근육세포 등에서 RNA를 채취하여 RT-PCR을 실시한 결과 정상조직에서는 액손 3결실이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 암세포에서 G-CSF 유전자의 액손3 결실이 단순히 PCR 과정에서 일어날 수 있는 결과가 아님을 보여주는 것이다. 실제로, 액손3 결실에 의해 암세포에서는 정상의 G-CSF가 아닌 변이 G-CSF 단백질이 만들어지고 있다는 것을 확인하였다(도 11). 또한, 상기 액손3이 결실된 변이 G-CSF 단백질은 그 원래의 활성부위가 없어지고 결합(folding)구조도 정상의 G-CSF 단백질과는 상이하게 형성될 가능성이 크며 이에 따라 암세포에서는 G-CSF 단백질이 정상적인 역할을 하지 못할 것으로 생각된다.

실시예 3

혼성화(Hybridization)방법을 통한 G-CSF 유전자의 검색

혼성화 방법을 통해 암세포주에서의 G-CSF cDNA의 액손3 결실을 확인하였다. 정상 세포주로부터 유래된 G-CSF 유전자를 주형으로 하고 프라이머쌍 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(센스, 서열번호 4)와 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(안티센스, 서열번호 5)를 이용하여 PCR을 수행하여 G-CSF 유전자의 액손3 부위의 DNA절편(108bp)를 획득하였다.

또한, 정상 세포주로부터 유래된 G-CSF 유전자를 주형으로 하고 프라이머쌍 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(센스, 서열번호 1)과 5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(안티센스, 서열번호 9)를 이용하여 PCR을 수행함으로써 G-CSF 유전자의 액손2 부위의 DNA절편(105bp)을 획득하였다.

나일론 멤브레인(Boehringer Mannheim, 독일)에 각각의 분리 정제한 각각의 DNA 단편 50ng/㎕를 스팟팅(spotting)한 다음 80℃에서 2시간동안 놓아두어 고정화하였다.

멤브레인의 액손2 및 액손3의 혼성화 반응을 위한 각 세포주의 표적(target)은 다음과 같은 방법으로 제작하였다. 역전사 반응은 먼저 반응액 A(총 RNA 2㎍, 올리고(dT)₁₆-프라이머(oligo(dT)₁₆-primer) 1㎕, 최종부피 15㎕)만 넣어둔 튜브를 94℃에 2분간 두어 변성(denaturation) 과정을 수행하였으며, 이후 온도를 42℃로 천천히(20분 이내) 낮춘 후 반응액 B(dATP, dGTP, dCTP 각 333μM, 역전사효소 완충용액 1x, 20μCi [α-³³P] dCTP (2,000 내지 3,000 Ci/mmol), AMV 역전사효소 50 U, 최종 부피 30㎕)를 더한 후 42℃에 2시간동안 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 반응 후 중합반응에 이용되지 않은 [α-³³P] dCTP를 비롯한 dNTP는 QIAquick Nucleotide Removal Kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 제거하였다.

이렇게 제작된 cDNA 표적을 이용하여 G-CSF의 액손2 및 액손3 부분이 고정화되어 있는 나일론 멤브레인에서 혼성화 반응을 수행하였다. 먼저 나일론 멤브레인을 2X SSPE 완충용액[1x SSPE : 0.18M NaCl, 10 mM 인산나트륨, pH 7.7, 1mM EDTA] 에 5분간 담궈둔 뒤 이를 제거하고 65℃로 미리 데워진 혼성화 용액[5x SSPE, 2% SDS, 1x Denhardt 시약, 100㎍/mL 음파 변성된 연어 정자 DNA] 2mL를 다시 첨가하였다. 65℃에서 1시간 동안 놓아둔 뒤, cDNA 프로브 10㎕를 혼성화 용액 0.5mL에 더한 후 10분간 끓였다. 이를 멤브레인이 담긴 밀봉된 비닐에 같이 넣어 65℃에서 18시간 동안 혼성화 과정을 수행하였다. 혼성화 과정이 끝난 뒤 세척용액[0.5x SSPE, 0.2% SDS]을 이용하여 65℃에서 30분씩 모두 세 번을 교환하여 수행하였다. 모든 혼성화 과정이 끝난 뒤 X-선 필름을 이용하여 혼성화 되어 있는 방사능을 판독하였다.

실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 암세포주(YCC-7, AGS, HT-29, A549, MCF-7)에서 분리한 표적의 경우 액손2에는 결합을 하고 있으나 액손3에는 결합하지 않았다(도 8a, 8b, 8c, 8d, 8e). 반면에, 정상 유전자를 갖고 있는 U-87MG의 경우 액손2와 액손3에 모두 결합하고 있음을 확인할 수 있었다(도 8f). 이와 같이 혼성화 방법을 이용하여 액손3 결핍 여부를 쉽게 확인할 수 있었다. 혼성화 방법은 최근 급발전하고 있는 DNA 마이크로어레이를 이용한 검색 방법에도 쉽게 적용이 가능하며, 따라서 이를 이용한 다양한 방법들이 용이하게 개발이 될 수 있으며 이를 통한 암 진단이 매우 용이하고 정확하게 이뤄질 수 있을 것으로 생각된다.

실시예 4

액손 3 결실 검색용 DNA 칩을 통한 G-CSF 유전자 검사

G-CSF의 액손3 부분이 결실여부를 확인하기 위한 도구로서 DNA 칩을 적용할 수 있는지를 알아보기 위해 유리판 위에 고정화시킬 DNA 단편 탐침을 제작하였다.

탐침은 G-CSF의 액손2 부분에서 하나의 탐침, 액손3 부분에 서로 겹치지 않게 4개의 탐침을, 액손4 부분에서 하나의 탐침을 20개의 올리고뉴클레오티드로 구성하게끔 디자인하였다. 또한, 액손2-액손3에 걸쳐 하나의 탐침을, 액손3-액손4에 걸쳐 하나의 탐침을, 액손2-액손4에 걸쳐 하나의 탐침을 각 액손의 염기서열을 8개씩 가지고 있게끔 하여 디자인하였다. G-CSF 의 액손2 부분은 교대 스플라이싱(alternative splicing) 기작에 의해 두 종류(사람 G-CSFa, 사람 G-CSFb)를 가지고 있으므로(Tshuchiya M. et al., EMBO J 5:575-581, 1986), 액손 2부분에서 디자인한 탐침은 각각 두 종류 모두 디자인하였다.

DNA 탐침을 고정화하기 위해서 모든 DNA 단편 탐침을 합성할 때, 3' 첫번째 위치에 아미노링커컬럼(Aminolinker column, Cruachem, Glasgrow, Scotland)을 이용하여 아민기(amino residue)를 가진 염기를 삽입하였고, 슬라이드 글라스(slide glass)은 알데히드기(aldehyde residue)로 코팅화되어 있는 것을 구입(CEL Associates, Inc., Huston, Taxas, USA)하였다. 탐침을 3× SSC (0.45M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH 7.0) 완충 용액에 용해시킨 상태로 본 실험실에서 자체 제작한 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하여(Yoon et al, J. Microbiol. Biotechnol. 10:21-26, 2000) 집적한 후, 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 1시간 이상 화학 반응을 유도하고, 6시간 이상 방치하여 DNA 탐침을 고정화하였다. 균 검색용 탐침은 100μM의 농도로 전체 탐침을 275㎛ 간격을 두고 순서대로 집적화시켜 마이크로어레이를 제작하였다.

탐침의 아민기와 유리판 위의 알데히드 사이의 반응이 원활히 이루어져 고정화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위해 사이브로 그린 II (SYBRO green II, Molecular Probe, Inc., Leiden, Netherlands)로 염색하여 확인하였다.

각각의 세포주에서 추출한 G-CSF 유전자를 주형으로 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)을 수행하여 단편 유전자를 제작하고 이를 유리판 위에 고정될 탐침으로 사용하였다. 단편 유전자는 프라이머쌍 5'-CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC-3'(센스, 서열번호 10)와 5'-FITC-CTGCTGCCAGATGGTGGT-3'(안티센스, 서열번호 11)의 첨가비율을 1:5로 차별화 함으로써 한번의 중합효소연쇄반응으로 획득하였다. 슬라이드 글라스 위에 고정화시킨 탐침은 하기 표 2에 수록되어 있다.

염기서열	위치	서열번호
CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC	엑손2	10
AGAAGCTGTGGTGCCAC	엑손2-3(hG-CSFa)	12
TGAGTGAGTGTGCCAC	엑손2-3(hG-CSFb)	13
TGTGCCACCTACAAGCTGTG	엑손3	14
GAGCTGGTGCTGCTCGGACA	엑손3	15
GGACACTCTCTGGGCATCCC	엑손3	16
CTGAGCAGCTGCCCCAGCCA	엑손3	17
GCAGGCTGCTTGAGCCAA	엑손4	18
AGAAGCTGGCAGGCTG	엑손2-4(hG-CSFa)	19
TGAGTGAGGCAGGCTG	엑손2-4(hG-CSFb)	20

비대칭 증폭방법을 위한 PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간 수행하였다. 교잡은 56℃에서 1분, 연장은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 10회 반복하였다. 그 후, 다시 세 번째 변성은 94℃에서 1분, 교잡은 58℃에서 1분, 연장은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다.

PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법으로 확인하였다. 각 균들에 대해 DNA 이중 가닥과 단편 가닥이 동시에 합성되었음을 확인하였다. G-CSF 액손3이 결실된 플라스미드와 결실되어 있지 않은 플라스미드를 가지고 G-CSF 부분을 비대칭 증폭 방법을 통해 증폭한 후, DNA 칩을 이용하여 검색하여 보았다. 혼성화 완충용액(6× SSPE, 20%(v/v) 포름아미드)에 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)으로 증폭시킨 유전자를 15㎕ 넣어서 총 부피가 200㎕가 되도록 제조하였다. 제조된 용액을 탐침이 고정화되어 있는 유리판 위에 분주한 후 프로브-클립 프레스-씰 배양실(probe-clip press-seal incubation chamber, Sigma Co., St. Louis, MO.)로 덮은 후, 30℃ 항온진탕배양기(shaking incubator)에서 6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도해 보았다. 시간이 경과한 후 3× SSPE(0.45M NaCl, 15mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0), 2× SSPE(0.3M NaCl, 10mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0), 1× SSPE(0.15M NaCl, 5mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0) 순으로 각각 5분씩 세척하였다. 스캔어레이(Scanarray) 5000(GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.)을 이용하여 검색하였다.

도 9에서 보듯이, 액손3이 결실되지 않은 플라스미드의 경우, 모든 탐침에 시그널이 나타나는 반면, 액손3이 결실된 플라스미드의 경우, 액손2와 액손4 부분에만 시그널이 나타남을 볼 수 있다. 이 플라스미드는 액손2의 a타입의 염기서열을 가지고 있다.

이 결과로 인해, 상기에 제시한 프라이머와 탐침을 이용하여 G-CSF의 액손3 부분의 결실여부를 검색할 수 있는 DNA 칩 개발이 가능함을 알 수 있다.

실시예 5

유가식 재조합 G-CSF 변이체 단백질 생산

재조합 대장균을 이용하여 G-CSF 변이 단백질을 대량 생산하기 위하여 재조합 플라스미드 pED-CSF4BLIIE를 가지고 있는 E. coli BL21(DE3)(Novagen Inc., USA)의 유가식 발효를 수행하였다. pED-CSF4BLIIE는 플라스미드 pET21c(Novagen Inc., USA)에 액손 3영역의 염기서열이 결실된 G-CSF 변이체에 대한 염기서열을 클로닝한 것이다. 제조방법은 다음과 같다. 먼저 사람 유방암 cDNA 라이브러리(library)를 주형으로 하여 EcoRI 부위를 가지고 있는 포워드 프라이머(Primer 1) 5'-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3'과 BamHI 부위를 가지고 있는 리버스 프라이머(Primer 2) 5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3'를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후 반응물에 EcoRI과 BamHI으로 제한효소 처리하여 먼저 pUC19(Stratagene, USA)에 클로닝하여 p19CSF 플라스미드를 작제하였다(도 12). pUC19내에 클로닝된 이 CSF 유전자는 액손3 영역이 없는 상태이다.

p19CSF 플라스미드를 주형으로 하여 Nde I을 가지고 있는 포워드 프라이머(Primer 4) 5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3'과 BamHI 부위를 가지고 있는 리버스 프라이머 5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3' (Primer 2)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후 얻은 DNA에 NdeI과 BamHI 제한효소로 처리하여 pET21c 플라스미드에 클로닝하였다. 여기서 첫 번째 아미노산이 번역되는 시점의 염기서열을 박테리아에게 최적한 염기서열로 바꾸기 위해 상기 포워드 프라이머를 5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3' 대신에 5'-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3'로 바꿔 마찬가지로 중합효소연쇄반응을 실시한 후 얻은 DNA에 NdeI과 BamHI 제한효소로 처리하여 pET21c 플라스미드에 클로닝하여 최종적으로 pED-CSF4BLIIE를 제작하였다(도 13). 유가식 배양에 사용한 배지 및 공급 기질은 표 3에 나타내었다.

출발		공급액
성분	농도(g/L)	성분	농도(g/L)
(NH4)2HPO4	3.0	글루코즈	700.0
KH2PO4	7.0	MgSO4·7H2O	15.0
MgSO4·7H2O	1.0	효모 추출물	50.0
시트르산	0.8
효모 추출물	2.0
글루코즈	20.0
미량 금속액	3(mL)

종배양은 회전 진탕기(rotary shaker)에서 250ml 플라스크를 이용하여 8시간 동안 37℃에서 배양하였다. 200mL의 종배양물을 1.8L의 발효액을 포함하는 5.0L 발효기(5.0L, NBS 발효기)에 접종을 하였다. 온도와 pH는 각각 37℃와 6.8로 제어가 되었다. pH는 28% NH₄OH 용액을 이용하여 유지하였다. 필요한 경우에 순수 산소도 공급하였다. 기질의 공급(feeding) 전략으로 pH-stat를 사용하였는데, pH가 6.88로 증가하면 글루코즈 2.0-3.0g, 효모 추출물 0.3g, MgSO₄·7H₂O 0.1g을 배양액에 자동적으로 첨가하였다. 유가식 배양중 배양액 중의 글루코즈 농도는 5 g/L이하를 유지하였고, OD₆₀₀ = 30에서 1mM IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)를 이용하여 유도하여 미생물의 농도가 OD₆₀₀ = 90 까지 이르는 고농도 배양이 이루어졌다. 생산된 G-CSF 변이 단백질의 양은 밀도측정기(densitometer)를 이용하여 염색된 단백질 밴드의 강도를 측정하여 정량화 하였다(도 10). 성숙 G-CSF의 분자량은 18.7 kDa정도이나 액손 3영역이 결실된 염기로부터 번역된 G-CSF 변이체 단백질의 분자량은 약 13 kDa 정도가 된다.

실시예 6

G-CSF 변이 단백질 특이적 폴리클로날 항체의 제조

본 실시예에서는 재조합 G-CSF 변이체를 대장균(E. coli)로부터 획득한 후에 항 토끼 변이 사람 G-CSF를 얻기 위한 항원으로 사용하였다. 항원 특이적 폴리클로날 항체를 생성하기 위하여 1mg/ml 농도로 인산완충용액 중에 용해된 정제된 돌연변이 사람 G-CSF 용액 400㎕를 동량의 프로인트 면역보강제(Freund's adjuvant, BRL사에서 시판)로 유화시킨 후 10주된 토끼에게 11일 간격으로 4회 근육주사하였다. 4번째 근육주사한 10일 후 심장천공법으로 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 상온에서 30분 그리고 4℃에서 하룻밤동안 방치하여 완전 응고시킨 후 2,500rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취함으로써 혈청을 얻었다. 이것에 최종 농도가 40%되도록 황산암모늄을 첨가하여 침전시키고 10mM 인산완충용액(pH 7.0)에 하룻밤동안 투석시킨 후 DEAE Affi-Gel Blue gel(Bio-Rad사에서 시판)로 항체를 정제하였다(Smith, C.P., Jensen, D., Allen, T. and Kreger, M. (Eds.) Information Resources for Adjuvants and Antibody Production. U. S. Dept. of Agriculture, 1997; Hanly W. C. et al., ILAR Journal 37:93-118, 1995)

실시예 7

G-CSF 변이 단백질 특이적 모노클로날 항체의 제조

1mg/ml 농도의 정제된 사람 G-CSF 변이 단백질 100㎕을 동일한 양의 프로인트 면역보강제로 유화시킨 후 생후 6-8주된 BALB/c 생쥐에게 2주 간격으로 3회 복강내에 주입하였다. 마지막 주입 후 항 G-CSF 변이 단백질에 대한 항체의 생성을 확인하고 2주 후에 100㎍의 사람 G-CSF 변이 단백질로 마지막으로 면역시킨 다음 3일 후 생쥐로부터 비장세포를 추출하고 Sp2/0-Ag14 골수종(myeloma) 세포와 10:1 비율로 혼합하여 이 혼합액을 50% 폴리에틸렌글리콜 1500 용액에 3분 동안 방치시켜 세포융합을 실시하였다. 이것을 1,200rpm에서 8분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 얻은 후 10% 우태아 혈청(fetal calf serum)을 함유한 HAT RPMI-1640 배지에 ml당 3.5×10⁶세포가 되도록 부유시켜 96-웰 평판(96-well plate)에 웰당 0.1ml씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 3일 후 10% 우태아 혈청 함유 HAT RPMI-1640 배지를 웰당 0.1ml씩 첨가하고 4일 마다 배지의 반 정도를 신선한 배지로 갈아주었다(Amyx, H.L., JAVMA 191:1287-1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135:2589-2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989).

HAT 선택 배양 후 하이브리도마 세포의 항체 생산 여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. 즉, 상기에서 면역에 사용했던 사람 G-CSF 변이 단백질을 0.01 M 카보네이트 바이카보네이트(carbonate-bicarbonate) 완충액(pH 9.6)에 0.1㎍/ml로 희석하여 웰마다 50㎕씩 넣고 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 그 다음에 PBST(phosphate buffer saline, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄, 0.15 % Tween 20)로 4회 세척하고, 0.1% 알부민으로 37℃에서 30분 동안 반응(blocking)시켰다. 세포의 배양상등액은 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후에 PBST로 4회 세척하였다. 바이오틴이 붙어있는 2차 항체인 항 생쥐 면역글로불린 항체(Biotin conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody)를 1㎍/ml이 되도록 0.1% BSA-PBST로 희석한 후에 웰마다 50㎕씩 넣고 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 다시, PBST로 4회 세척한 후에 스트렙트아비딘-퍼옥시다아제(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)를 0.1% BSA-PBST로 1000배 희석하여 웰마다 50㎕씩 넣고 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후에 다시 PBST로 4회 세척하였다. 효소반응을 위한 기질로는 티엠비(Tetra-Methylbenzidine, TMB)용액을 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 반응시킨 후에 2N-황산으로 반응을 정지시키고 450nm 파장에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 항 사람 G-CSF 변이 단백질 항체의 생성여부를 확인하여 양성을 보이는 웰에서 얻은 세포들은 제한희석법(limiting dilution)으로 웰당 0.3 세포가 되도록 3회 전클로닝(subcloning)하여 배양함으로써 모노클로날화하여 항 사람 G-CSF 변이체 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다. 하이브로도마로부터 항 사람 G-CSF 변이체 모노클로날 항체를 얻었다(Amyx, H.L., JAVMA 191:1287-1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135:2589-2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989)

실시예 8

효소면역측정법(ELISA) 방법을 통한 G-CSF 변이 단백질 수치를 이용한 진단

상기에서 면역에 사용했던 재조합 G-CSF 변이체에 대한 항 토끼 변이 사람G-CSF 또는 항 생쥐 변이 사람 G-CSF를 셀룰로플라스민을 0.01M 카보네이트-바이카보네이트 완충액(pH 9.6)에 10㎍/웰로 희석하여 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 그 다음에 PBST(0.15% Tween 20)로 4회 세척하고, 0.1% 알부민으로 37℃에서 1시간동안 반응(blocking)시켰다. 같은 방법으로 세척한 다음 표준 희석 완충액(Standard Diluent Buffer) 50㎕와 샘플을 넣고 천천히 섞어주면서 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후에 PBST로 4회 세척하였다. 페록시다아제가 붙어있는 2차 항체인 항 면역글로불린 항체(Peroxidase conjugated anti-human immunoglobulin antibody)를 2.5㎍/웰이 되도록 0.15N NaCl이 들어있는 10mM 포스페이트 완충액에 희석한 후에 웰마다 넣고 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 PBST로 4회 세척하였다. 효소반응을 위한 기질로는 티엠비 용액을 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 암반응시킨 후에 2.5N-황산으로 반응을 정지시키고 450 nm 파장에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다.

도 11에서 나타난 바와 같이, 사람 G-CSF 변이 단백질의 수치는 암환자에서 훨씬 상승되는 결과를 알 수 있다. 각 암환자 별로 수치를 비교해 보았을 때, 특히 유방암의 경우 사람 G-CSF 변이 단백질의 수치가 월등히 상승되었음을 알 수 있다.

이상의 실시예에서 자세히 예시하였듯이 G-CSF 액손3 영역의 결실을 PCR이나 DNA 칩으로 혹은 G-CSF 변이 단백질에 대한 효소면역측정법을 사용함으로써 암의 진단이 수월하여질 것이다. 기존에 사용되고 있는 암에 대한 마커의 경우 장기 특이성이 낮은 CEA, BFP, TPA, IAP의 경우는 민감도가 떨어져서 가양성(false positive)의 우려가 있으며, 반면, 장기 특이성이 높은 AFP, PIVKA II, 에스터라제 I, CA19-9, CA50, SPan-1 항원, CA15-3, BCA 225 등의 마커의 경우는 당초부터 표적 장기를 목적으로 이용하는 때에만 유용한 단점이 있다. 본 발명자들이 발견한 G-CSF 액손3 영역의 결실에 대한 암진단 마커는 면역화학적요법 및 분자생물학적 방법으로 검색에 이용하면 간단하고 용이하게 암진단이 가능하다. 이 신규 암 진단 마커의 개발 및 사용으로 앞으로 암의 조기 발견이 수월하게 되어 암의 진단에 큰 기여를 하게 될 것이다.

본 발명은 G-CSF 유전자의 액손3 결실여부를 판별하여 종양을 진단할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 암진단 방법은 하나의 특정 암이 아닌 여러 종류의 암 진단에 널리 이용될 수 있으며 중합효소 연쇄반응 또는 혼성화 반응과 DNA 칩을 통한 분자생물학적 방법이나 ELISA와 같은 비교적 간단한 면역화학적 방법을 이용하여 용이하게 암을 진단할 수 있는 효과가 있다. 이와 더불어, G-CSF 액손3 결실 확인용 DNA 칩은 한 유전자를 가지고 모든 암을 진단할 수 있다는 장점과 더불어 기존의 방법보다 보다 간편하고 빠르고 정확한 암 진단을 할 수 있으며, 한꺼번에 많은 수의 임상 검체를 적용할 수 있어 인류 의학 개발 발전과 복지 향상에 이바지함은 물론, DNA 칩 관련 기술에도 크게 공헌할 것으로 기대된다.

또한, 본 발명자들이 발명한 액손3 영역의 아미노산이 결실된 G-CSF 변이체에 대한 항체로 G-CSF 변이체 단백질을 측정함으로써 정상인과 암환자를 용이하게 구분할 수 있다. 이것 또한 G-CSF 변이체에 대한 확인만으로도 정확히 암을 진단할 수 있음을 시사하고 있으며, 한꺼번에 많은 수의 임상 검체를 적용할 수 있고, 나아가 단백질 어레이 관련 기술에도 크게 공헌하게 될 것이다.

도 1은 인체유래 G-CSF 유전자의 정상적인 전사, 스프라이싱 및 번역과정을 도시한 것이다.

도 2는 중합효소 연쇄반응에 사용한 각각의 프라이머 위치를 도시한 것이다.

도 3a는 PCR1 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:YCC-7, 레인3:AGS, 레인4:SNU-1, 레인5:MDA-MB-231, 레인6:MCF-7, 레인7:SK-BR-3, 레인8:HT-1080, 레인9:HCT-116, 레인10:COLO205).

도 3b는 PCR1 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타내 것이다(M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:DLD-1, 레인3:HT-29, 레인4:A549, 레인5:NCI-H460, 레인6:HeLa, 레인7:C-33A, 레인8:B16, 레인9:U-87MG).

도 4는 정상세포에서 유래한 PCR1 반응산물의 유전자 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 암세포에서 유래한 PCR1 반응산물의 유전자 염기서열 분석결과를 나타낸 것이다.

도 6a는 PCR2 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3a에 나타낸 바와 같음).

도 6b는 PCR2 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3b에 나타낸 바와 같음).

도 7a는 PCR3 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3a에 나타낸 바와 같음).

도 7b는 PCR3 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3b에 나타낸 바와 같음).

도 8은 정상세포의 액손2 DNA 단편과 액손3 DNA 단편이 고정된 나일론 멤브레인과 암세포주로부터 유래된 표적을 혼성화(hybrization)한 다음 X-선으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(A: YCC-7, B: AGC, C: HT-29, D: A549, E: MCF-7, F: U-87MG).

도 9는 G-CSF 유전자의 액손3 영역의 결손 여부를 DNA 칩으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 재조합 G-CSF 변이체 단백질을 생산하고 분리한 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.

도 11은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질의 수치를 변이 단백질에 대한 항체를 이용하여 정상인과 암환자에서 측정한 결과이다.

도 12는 플라스미드 p19CSF의 작제도이다.

도 13은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질을 발현하는 재조합 플라스미드 pED-CSF4BLIIE의 작제도이다.

<110> MEDIGENES YOO, WON MIN YOO, NAE CHOON KEUM, KI CHANG <120> G-CSF Exon 3-Deleted Protein and Antibody thereof, and Producing Method thereof <130> P05-0788 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 acccccctgg gccctgcc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcagggctgg gcaaggtg 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atccagggcg atggcgcagc g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgtgccacct acaagctgtg c 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagctgcagg gcctggct 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgctatggag ttggctcaag c 21 <210> 7 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(523) <223> G-CSF <400> 7 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag 120 ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc 180 ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc 240 ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt 300 cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag 360 atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc 420 gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc 480 ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga 525 <210> 8 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(417) <223> exon 3 deletion G-CSF <400> 8 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctggcagg ctgcttgagc 120 caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc 180 cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc 240 atctggcagc agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc 300 atgccggcct tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctagt tgcctcccat 360 ctgcagagct tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gccctga 417 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cagcttctcc tggagcgc 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer and probe <400> 10 ctgcagctgc tgctgtggca c 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgctgccag atggtggt 18 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 agaagctgtg gtgccac 17 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 13 tgagtgagtg tgccac 16 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 14 tgtgccacct acaagctgtg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 gagctggtgc tgctcggaca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 ggacactctc tgggcatccc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 17 ctgagcagct gccccagcca 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 18 gcaggctgct tgagccaa 18 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 agaagctggc aggctg 16 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 tgagtgaggc aggctg 16

Claims

액손3 영역의 DNA 서열이 결손된 G-CSF 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계;

상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및

상기 배양물로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질의 제조 방법.
청구항 1에 기재된 방법에 의하여 제조된, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질.
액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 동물에 투여하는 단계;

상기 동물로부터 혈액을 채취하는 단계; 및

상기 혈액으로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체의 제조 방법.
액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 동물에 투여하는 단계;

상기 동물로부터 상기 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 생산하는 세포를 분리하는 단계;

상기 분리된 세포와 골수종 세포를 세포융합 하는 단계;

상기 세포융합된 세포로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마를 분리하는 단계; 및

상기 하브리도마를 이용하여 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 얻는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체의 제조 방법.
청구항 3 또는 청구항 4에 기재된 방법에 의하여 제조된, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체.
G-CSF의 엑손3 영역의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체에 특이적으로 결합하는 항체.
청구항 6에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체.
청구항 6에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체.
액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질에 특이적인 항체를 포함한 암 진단제.
액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질에 특이적인 항체를 포함한 암 진단용 키트.
액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질에 특이적인 항체가 부착된 암 진단용 마이크로어레이.