KR100365482B1 - 종양 억제 유전자의 프라이머쌍을 포함하는 암 진단용 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 억제 유전자의 발현을 정량적으로 분석함으로써 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 진단용 벡터에 관한 것으로, 간암을 비롯한 대부분의 암에서 자주 불활성화를 나타내는 종양 억제 유전자인 p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb의 PCR용 각 프라이머쌍을 포함하는 본 발명의 TS-IS 벡터는, 경합 RT-PCR 방법을 이용하여 조직 세포 내 종양 억제 유전자들의 발현 유무와 발현량을 분석할 수 있게 해주기 때문에, 암의 발병 여부를 유전자 수준에서 진단할 수 있을 뿐 아니라, 어떤 경로로 암이 발생했는지도 예상할 수 있어 이후에 진행될 치료에 많은 정보를 제공할 수 있다.

Description

종양 억제 유전자의 프라이머쌍을 포함하는 암 진단용 벡터{CANCER DIAGNOSIS VECTOR CONTAINING SETS OF PRIMER PAIR AGAINST THE TUMOR SUPPRESSOR GENES}

본 발명은 종양 억제 유전자의 발현을 정량적으로 분석함으로써 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 진단용 벡터에 관한 것으로, 상세하게는 간암을 비롯한 대부분의 암에서 자주 불활성화를 나타내는 종양 억제 유전자인 p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb의 PCR용 각 프라이머쌍을 포함하는 진단용 벡터를 제공함으로써, 경합 RT-PCR 법을 이용하여 조직 세포 내에서 이들 종양 억제 유전자의 발현을 정량적으로 분석할 수 있도록 하여, 암 발생 여부를 신속하고 효율적으로 진단할 뿐 아니라 암의 발생 기전을 밝혀 간암을 비롯한 각종 암의 치료에 응용하고자 하는 것이다.

간암은 우리 나라에서 발생하는 암에 의한 사망 원인 중 위암 다음으로 흔한 암으로서(통계청: 사망원인 통계연보 1990-1994), 조기 진단 및 근원적 치료법의 개발이 중요한 과제로 되고 있다. 이를 위해서는 간암의 정확한 발생 기전과 분자생물학적 및 유전학적 차원에서의 특성 분석이 선행되어야 하는데, 현재까지도 간암에서의 유전적 변화에 대한 지식이 명확하지 않아 어떤 과정으로 간암이 발생하는지에 대해서도 불명확한 상태이다(박찬일, 김호근, 이유복: 간질환의 병리, 서울, 고문사. 1992: pp1-269).

현재까지 진행된 간암에 대한 유전학적 연구 결과에 의하면, 간암 역시 다른 종양의 경우와 마찬가지로 종양 억제 유전자의 불활성화에 의해 발생하는 경우가 많은 것으로 알려져 있다(Piao Z, Kim H, Jeon BK, Lee WJ, Park C., 1997.Cancer80: 865-872). 특히 간암의 경우에는 p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53, pRb의6 가지 종양 억제 유전자의 소실이나 돌연변이가 중요하며(Piao Z, Kim H, Jeon BK, Lee WJ, Park C., 1997.Cancer80: 865-872; Piao Z, Park C, Park JH, Kim H., 1998.Int. J. Cancer75: 29-33), 실제로 간암 세포주를 이용한 실험을 통해 간암의 경우 이들 종양 억제 유전자의 발현 수준이 정상에 비하여 큰 차이를 보인다는 것이 증명되어 있다.

이 6 가지 종양 억제 유전자들이 작용하는 기작을 간단히 설명하면 다음과 같다. 우선, 전반적으로 암의 원인은 세포 주기 정지나 세포 자연사가 정상적으로 일어나지 않고, 이 과정에 관여하는 유전자가 불활성화되어 비정상적인 세포 분열이 계속적으로 일어나는 것에 기인한다. 세포 주기 조절과 세포 자연사 유도에 관여하는 유전자들 중 가장 잘 알려진 것은 p53 경로와 pRb 경로이다. pRb는 G1에서 S기로 넘어가는 과정에서 E2F를 저해함으로써 S기로의 진행을 막는 역할을 하는데, 이때 CDK4/6이 pRb를 과인산화시키면 pRb의 기능이 저해되어 S기로의 변환이 일어난다(Pardee, A. B., 1989.Nature391: 533-536). 여기서 p16^INK4A단백질은 CDK4/6의 pRb 인산화를 저해하여 세포의 G1 정지기를 유도하며(Sherr, C. J., 1996.Science274: 1672-1676), p15^INK4B역시 CDK4/6를 저해하는 역할을 한다(Kamb, Aet al., 1995.Trand Genet. 11: 136-140). p53은 세포 주기 조절과 세포 자연사 유도에 모두 관여하는 전사 활성 인자로 p21과 MDM2 등의 전사를 촉진하고(Levine, A. J., 1997.Cell88: 323-331), p21은 여러 종류의 CDK를 저해하여 세포 주기를 지연시키는 역할을 한다(Ko, L. J., Prives, C., 1996.Genes Dev.10: 1054-1072).MDM2는 p53과 음성적 피드백 관계에 있어, p53에 의해 MDM2의 전사가 활성화되지만 MDM2 단백질은 핵 내에 존재하는 p53에 결합하여 p53을 핵 밖으로 이동시켜 유비키틴에 의해 분해되도록 한다(Haupt, Y.et al., 1997.Nature387: 296-299). 이때 핵 내에 있는 p14^ARF(쥐에서는 p19^ARF)는 MDM2에 작용하여 p53을 단백질 수준에서 안정화시켜 세포 주기 정지나 세포 자연사 유도를 일으키도록 돕는다(Kubbutat, M. H. et al., 1997.Nature387: 299-303).

이와 같이 여러 가지 종양 억제 유전자들이 관여하여 세포 주기를 조절하고 세포 자연사를 유도하게 되는데, 여러 가지 암세포에서는 종양 억제 유전자들이 불활성화되어 있거나 소실 또는 변이가 일어나 있다. 간암 세포에서 발현되는 종양 억제 유전자 역시 발현 양상이 정상 세포와 비교하여 현저한 차이를 보이는데, 그 차이는 종양 억제 유전자들의 정량적 분석을 통해 확인할 수 있다. 따라서, 암의 효율적인 조기 진단을 위해서는 무엇보다도 종양 억제 유전자의 소실이나 변이 여부를 비롯한 유전자 발현 양상을 유전자 수준에서 신속하게 발견하는 것이 중요할 것이다.

이러한 사실과 연구 결과에 근거하여 볼 때, 간암 예상 환자의 조직 표본에서 종양 억제 유전자인 p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb를 정량적으로 분석할 수 있다면, 간암의 발생 여부를 매우 신속하고도 효율적으로 진단하고 간암의 유전학적인 유형을 판단할 수 있을 뿐 아니라, 간암의 발생 경로를 예상할 수도 있으며 이를 통해 불활성화된 종양 억제 유전자에 대응하는 치료법을 모색할 수도있을 것이다.

간암 세포 내에서 발현되는 특정한 종양 억제 유전자 mRNA의 정량 분석을 실제 임상에서 사용하기 위해서는, 무엇보다도 정확한 결과가 신속하게 얻어질 수 있어야 하며, 비교적 적은 양의 mRNA에도 민감하여야 하고, 여러 번 수행했을 때에도 동일한 결과가 나와야 한다. 이에 생각할 수 있는 것이 세포 내 특정 RNA의 정량을 위해 많이 사용되는 경합 RT-PCR 법으로, 이것은 주로 조직 특이적이라고 생각해 왔던 극미량의 mRNA를 검출하기 위하여 사용되고 있다(Wang, A. M., Doyle, M. V., and Mark, D. F., 1989.Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9717-9721).

경합 RT-PCR을 위해서는 먼저 mRNA로부터 역전사효소 반응을 이용하여 cDNA를 만들고 이것을 PCR법을 이용하여 증폭시키는데, 이때 검출하려고 하는 특정 cDNA에 중합할 수 있는 각 프라이머쌍의 염기 서열을 가진 경합 주형을 함께 첨가한다. 그러면, 대상 cDNA와 경합 주형이 같은 반응 내에서 증폭되면서 프라이머에 대해 경쟁을 하게 되어, 첨가해 준 경합 주형의 양에 따라 상대적으로 대상 cDNA의 증폭량이 달라지게 된다. 즉, 대상 cDNA의 PCR 산물과 길이가 어느 정도 다른 경합 주형을 정확하게 정량하여 첨가해 주는데, 이때 일정량의 세포 cDNA를 포함하는 몇 개의 반응에 연속된 비율로 희석시킨 경합 주형을 첨가하여 PCR을 수행함으로써, 길이가 다른 두 cDNA의 PCR 산물의 농도를 비교하여 세포 내의 대상 cDNA의 양을 정량적으로 측정할 수 있다.

세포 내 특정 cDNA와 서로 길이가 다르지만 동일한 프라이머 염기 서열을 지닌 경합 주형을 만들기 위한 방법으로서, 종래에는 클로닝된 cDNA의 프라이머쌍 내부에 있는 제한 효소 자리를 이용하여 DNA 일부를 소실 또는 삽입하는 방법을 많이 사용하였다. 다중 경합 주형을 만드는 경우에는, 여러 프라이머들을 한 가닥으로 합성하는 방법을 이용하기도 하고, 여러 프라이머들의 각 프라이머 사이에 링커 (linker)를 합성하여 특이적인 수소 결합을 형성시킨 후 중합 효소를 이용하여 빈자리를 메우고 짧은 가닥들을 연결시키는 방법도 이용되고 있다(Micheal A. N., Renato. L., Chris D. P., Ralph S. F., 1998.Jounal of Immunological Methods219: 169-179).

이상과 같은 점을 고려하여, 본 발명의 목적은 암 환자의 조직으로부터 종양 억제 유전자들의 발현 양상을 정량적으로 분석함으로써 간암을 비롯한 각종 암의 발병 여부를 진단하고 암의 형태, 발병 기작 등을 예측할 수 있도록, 간암 세포에서 나타나는 종양 억제 유전자의 발현 양상의 변화를 경합 RT-PCR을 이용하여 정량 분석할 수 있게 해주는 암 진단용 벡터를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 벡터(TS-IS)에서 각 종양 억제 유전자 및 대조군인 HPRT 유전자의 프라이머쌍을 포함하는 부분의 염기 서열을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 벡터(TS-IS)에서 각 종양 억제 유전자의 프라이머쌍의 배열, 프로모터, 폴리(A) 꼬리 및 제한 효소의 위치를 보여주는 모식도,

도 3은 본 발명의 벡터(TS-IS)의 제작 과정을 보여주는 모식도,

도 4는 14 종류의 간암 세포주에서 각 종양 억제 유전자의 프라이머쌍을 이용해 RT-PCR을 수행한 전기 영동 사진,

도 5는 각 종양 억제 유전자의 프라이머쌍이 포함된 pT7-Blue 벡터를 PCR로 확인한 전기영동 사진,

도 6은 14 종류의 간암 세포주에서 본 발명의 벡터(TS-IS)를 이용하여 각각의 종양 억제 유전자 프라이머쌍으로 수행한 경합 RT-PCR의 전기 영동 사진.

이와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb의 유전자의 각 프라이머쌍을 포함하는 암 진단용 벡터를 제공한다.

상기 벡터에 있어서, 대조군으로서 HPRT 유전자의 프라이머쌍을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는, 암 환자의 조직으로부터 경합 RT-PCR 법을 이용하여 6 가지 종양 억제 유전자들의 발현 양상을 정량적으로 분석할 수 있도록 6 가지 종양 억제 유전자의 경합 주형으로 작용하는 벡터를 제조하였는데, 여기에는 p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb의 6가지 종양 억제 유전자의 각 프라이머쌍이 포함되어 있다. 이와 같이 제조된 본 발명의 벡터를 환자의 조직에서 추출한 RNA와 경합 PCR을 수행함으로써 상기 6가지 종양 억제 유전자를 동시에 정량 분석할 수 있으며, 이에 따라 간암을 비롯한 각종 암의 발병 여부를 진단할 수 있고, 암의 형태, 발병 기작 등을 추정할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터에는 상기 6 가지 종양 억제 유전자의 프라이머쌍 외에, 대조군으로서 HPRT 유전자의 프라이머쌍도 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 종래 대부분의 경합 주형에서는 대조군이 될 수 있는 유전자를 포함하지 않기 때문에 RNA의 질적 수준, 즉 RNA의 분해 정도나 PCR 효율에 영향을 미칠 수 있는 단백질의 함량 등을 고려할 수 없는 반면, 본 발명의 벡터는 각 조직과 세포마다 일정하게 발현하는 HPRT 유전자를 대조군으로 이용함으로써 각 시료 간 RNA의 질이나 PCR 효율 등의 조건의 차이를 극복하여 정확한 정량이 가능하다.

본 발명의 다중 경합 벡터를 제조할 때는, 각 프라이머쌍을 인산화하고 빈 자리를 채우는 것 보다 먼저 리게이션을 시킴으로써 안정적인 5′프라이머와 3′프라이머들이 연결된 두 개의 가닥을 합성한 후, 중합 효소를 이용하여 온전한 이중 나선으로 합성한다. 즉, 각 프라이머쌍을 디자인한 후, 키나아제를 이용하여 각 프라이머들의 5′말단에 인산기를 첨가하고, 원하는 길이의 PCR 산물이 나오도록 프라이머들을 도 1에 나타낸 순서대로 배열하여 리가아제로 연결한다. 이어서E. coliDNA 중합 효소 Ⅰ로 이중 나선을 형성시키고, 가장 말단에 위치한 프라이머들을 이용하여 PCR 증폭하여 pT7-Blue 벡터에 리게이션시킨다. 이와 같이 하여 형성된 종양 억제 유전자의 각 프라이머쌍이 포함된 pT7-Blue 벡터를 폴리(A) 꼬리를 지니고 있는 pcDNA3 벡터로 서브클로닝을 수행하여 본 발명의 TS-IS 벡터를 완성한다. 각 프라이머들이 정확하게 서브클로닝 되었는지 확인하기 위하여 벡터 DNA의 염기 서열을 분석한다.

본 발명의 TS-IS 벡터를 이용하여 경합 RT-PCR을 수행할 때는, 먼저 TS-IS 벡터를 효소로 선형화한 후in vitro전사를 통해 RNA를 만들고 역전사효소 반응을 이용하여 TS-IS cDNA를 합성한다. 그리고, 예를 들어 간암 세포주로부터 cDNA를 합성하여 그 양을 고정시키고, TS-IS cDNA를 연속된 비율로 희석시켜 경합 주형으로 첨가하여 PCR을 수행한다. 이와 같은 방법에 의하면, 본 발명의 TS-IS 벡터로 14 가지 사람 간암 세포주에서 각 종양 억제 유전자를 정량 분석할 수 있다.

이하에서는 본 발명의 벡터를 제조하는 단계 및 이를 이용하여 간암 세포주에서 종양 억제 유전자들의 발현 양상을 정량적으로 분석하는 단계를 상세히 설명한다.

1. 간암 세포주로부터 RNA 순수 분리 및 역전사효소 반응

간암 세포주인 SK-Hep1, HepG2, HepG2.2.15, Hep3B, Chang liver, PLC/PRF5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449 및 SNU475를 10 % FBS가 포함된 RPMI 배양액에서 배양하여, EDTA와 트립신을 이용해 부착되었던 세포를 떼어내고 회수한 후, RNAzol^TMB를 이용하여 세포의 총 RNA를 순수 분리한다. 분리한 RNA 중 1 ㎍을 취해 역전사효소를 이용하여 역전사 반응을 수행한다.

2. 각 프라이머쌍이 포함된 pT7-Blue 벡터의 제조

p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb의 6가지 종양 억제 유전자와 대조군인 HPRT 유전자의 cDNA 염기 서열에서 PCR 프라이머를 디자인하고, 본 발명의 벡터로부터 얻어지는 RNA가 세포 RNA와 PCR 산물 길이에서 차이가 나도록 각 프라이머를 알맞게 배열하고, 프라이머 간의 특이적인 중합을 위하여 각 프라이머 사이에 링커(linker)를 디자인한다.

키나아제를 이용하여 프라이머들의 5′말단을 인산화시킨 후 해당 링커들을 혼합하고, 95 ℃로부터 상온까지 온도를 낮추며 프라이머들과 링커들 사이에 상보적인 수소 결합을 형성하도록 중합 반응을 수행한다. 여기에 T4 DNA 리가제를 첨가해 나란히 배열된 프라이머들이 연결되도록 하고, 5′과 3′프라이머들을 혼합한 후E. coliDNA 중합효소 Ⅰ을 이용하여 이중 나선으로 합성한다. 양끝에 위치한 프라이머인 p14 1R과 p53 2R을 이용하여 PCR로 증폭하여 pT7-Blue 벡터에 리게이션 시킨다.

3. 각 프라이머에 폴리(A) 꼬리가 첨가된 본 발명의 벡터 제조

세포 RNA와 경합 주형으로 사용될 본 발명의 벡터는 모두 같은 조건에서 폴리(T) 프라이머를 사용하여 역전사 반응을 수행해야 하므로 벡터 내부에 폴리(A) 꼬리를 포함해야 한다. 폴리(A) 꼬리는 기존에 클로닝되었던 JHC001이라 명명된 유전자의 cDNA를 포함하는 pcDNA3 벡터로부터 제공되는데, 이 벡터는 내부에 존재하는 cDNA의 뒷부분에 폴리(A) 꼬리가 연결된 형태이고, 폴리(A) 꼬리 바로 앞에는BstXI의 제한 효소 자리가 존재한다. 또한, 이 벡터에는 다중 제한 효소 자리에 또 다른BstXI 제한 효소 자리가 존재하므로,BstXI으로 효소 반응을 수행하여 폴리 (A) 꼬리를 제외한 불필요한 JHC001의 구조 유전자 부위를 제거할 수 있다.

즉, pcDNA3 벡터를BstXI 제한 효소로 자른 후 S1 뉴클레아제로 단일 나선 부위를 제거하고 리게이션하면 pcDNA3 벡터에 JHC001의 폴리(A) 꼬리 부분만 삽입된 형태의 벡터를 얻을 수 있다.

완성된 벡터에서 T7 프로모터와 폴리(A) 꼬리 사이의 다중 제한 효소 자리 중에서BamHI과HindIII 를 이용하여 효소 반응을 수행하고, 종양 억제 유전자의 각 프라이머쌍이 포함된 pT7-Blue 벡터도 역시BamHI과HindIII로 효소 반응을 수행한 후, 폴리(A) 꼬리가 있는 pcDNA3 부분과 종양 억제 유전자의 각 프라이머쌍이 포함된 DNA 부분을 서로 리게이션하여 벡터를 완성한다. 완성된 벡터는 DNA 염기서열 분석을 이용하여 정확한 서열을 확인한다. 이와 같이 제조된 본 발명의 벡터를 TS-IS 벡터로 명명하였다.

4. TS-IS 벡터로부터의 RNA 및 cDNA 합성

완성된 TS-IS 벡터는 폴리(A) 꼬리 뒤쪽의XhoI 제한 효소를 이용하여 선형으로 만들고 T7 프로모터를 이용하여in vitro전사 방법으로 RNA를 합성한다. 이때 합성된 RNA에는 O.D_.260값에 영향을 주는 NTP들이 많이 존재해서 정량에 오차가 생길 수 있으므로, 스핀 컬럼을 이용하여 NTP들을 제거하고 RNA의 정확한 양을 측정한다.

생성된 TS-IS RNA에 대해 역전사효소를 이용하여 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성한다.

5. TS-IS 벡터를 이용한 경합 RT-PCR 수행

간암 세포주로부터 얻어진 세포 cDNA는 일정 농도로 고정시키고, 여기에 일정한 비율로 단계별 희석한 TS-IS cDNA를 첨가한다. TS-IS cDNA의 희석 단계는, 각 종양 억제 유전자 별로 고유하게 사용하는데, 그 범위는 10^-3∼10^-8ng 사이로 하는 것이 바람직하다. 이와 같이 단계별로 희석한 TS-IS cDNA 일정량을, 간암 세포주로부터 합성된 세포 cDNA 일정량과 혼합한 후 PCR을 수행한다. PCR 산물을 5 % PAGE에 전기 영동하고 Et-Br로 염색하여 관찰한다.

이와 같이, p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53, pRb의 6가지 종양 억제 유전자와 대조군인 HPRT 유전자의 프라이머쌍을 포함하는 본 발명의 TS-IS 벡터를 이용하여 14 가지의 간암 세포주에서 추출한 RNA로 경합 RT-PCR을 수행한 결과, 14개의 간암 세포주에서 각 종양 억제 유전자를 정량 분석할 수 있었다.

따라서, 실제 암 환자의 조직을 대상으로 본 발명의 TS-IS 벡터를 이용하여 경합 RT-PCR을 수행할 경우에도 상기 14개 간암 세포주에서와 같은 결과를 보일 것으로 예상되므로, 본 발명의 TS-IS 벡터는 실제 임상에서도 암 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 간암 세포주로부터 RNA 순수 분리 및 역전사효소 반응

간암 세포주인 SK-Hep1, HepG2, HepG2.2.15, Hep3B, Chang liver, PLC/PRF5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449 및 SNU475를 각각 10 % FBS가 포함된 RPMI 배양액에서 배양하였다. 세포를 수거하기 위해, 1-2 방울의 EDTA와 0.25 % 트립신으로 처리한 후 37 ℃에서 1-2 분 보관하여 부착되었던 세포가 떨어진 것을 확인하고 원심분리(600 rpm, 4 ℃, 5 분)하였다. 상층액을 버리고, 세포가 포함된 침전물에 RNAzol^TMB와 클로로포름을 처리하여 세포를 분해시키고 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 15 분)하였다. RNA가 포함된 상층액을 회수하여 이소프로판올을 첨가하여 다시 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 15 분)한 후, 침전된 총 RNA를 회수하여 TE 완충액이나 증류수에 녹였다. RNA의 상태는 0.8 % 아가로스 겔에서 전기 영동으로 확인하였다.

분리한 RNA 중 1 ㎍을 취해 역전사효소(Gibco/BRL, 미국) 100 U, 10 배 PCR 혼성화 완충액(50 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 0.1 ng/ml BSA), 뉴클레아제 저해제인 rRNasin(Promega, 미국), 4 mM의 각 dNTP, 폴리 d(T) 프라이머 10 pmol이 포함된 반응 용액에서 역전사 반응(45 ℃, 1 시간)을 수행하고, 반응 후에 90 ㎕의 물을 첨가하였다. 다음은 반응 용액의 조성을 나타낸다.

역전사 반응 용액

RNA(1 ㎍/1 ㎕) 1 ㎕

역전사효소(200 U/1 ㎕) 0.5 ㎕

10 배 PCR 혼성화 완충액 1 ㎕

rRNasin(40 U/1 ㎕) 0.2 ㎕

4 mM dNTP 0.5 ㎕

0.1 M DTT 1 ㎕

폴리 d(T) 프라이머(10 pmol/1 ㎕) 1 ㎕

증류수 4.8 ㎕

실시예 2: 각 프라이머쌍이 포함된 pT7-Blue 벡터의 제조

① 종양억제 유전자들의 프라이머 디자인과 확인

p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb의 6가지 종양 억제 유전자와 대조군인 HPRT 유전자의 cDNA 서열을 유전자 은행(Gene bank)으로부터 얻어, 그 유전자 내부에서 각각의 5′과 3′쪽의 PCR용 프라이머를 디자인하였다. 각 프라이머의 길이는 19∼20 bp, GC 함량은 약 50∼70 % 정도이며 두 프라이머 사이에 상보적인 수소 결합이 최소가 되게 하여 프라이머 간의 이량체 형성이 억제되도록 하였다(바이오니아, 한국).

이들 프라이머로 14 가지의 간암 세포주에서 각 종양 억제 유전자 별로 PCR을 수행한 다음 5 % PAGE에 전기영동하여 각 프라이머쌍의 유용함을 확인하였다. 이때 PCR은 94 ℃(30 초), 62 ℃(30 초), 72 ℃(1 분)으로 28 회 수행하였으며, 반응 용액은 RNA로부터 합성된 cDNA 50 ng에TaqDNA 중합 효소, 이 효소의 완충액, 25 mM MgCl₂(Perkin Elmer, 미국), 2.5 mM dNTP, 20 pmol의 각 프라이머쌍의 혼합액, 그리고 PCR 산물 표지를 위한 [α³²P]-dCTP(NEN, 미국)가 포함되어 있다. 다음은 반응 용액의 조성을 나타낸다.

PCR 반응 용액

cDNA(50 ng/1 ㎕) 1 ㎕

TaqDNA 중합효소(5 U/1 ㎕) 0.5 ㎕

10배 PCR 완충액 5 ㎕

25 mM MgCl₂5 ㎕

2.5 mM dNTP 1 ㎕

프라이머 혼합액(10 pmol/1 ㎕) 2 ㎕

[α³²P]-dCTP 0.05 ㎕

증류수 35.45 ㎕

도 4는 14 종류의 간암 세포주에서 각 종양 억제 유전자의 프라이머쌍을 이용해 RT-PCR을 수행한 전기 영동 사진으로, #231은 정상 간 조직에서 추출한 RNA로 RT-PCR을 수행한 것이고, 1∼14번은 각각 SK-Hep1, HepG2, HepG2.2.15, Hep3B, Chang liver, PLC/PRF5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449 및 SNU475의 간암 세포주를 나타낸다.

계속해서, 5′쪽의 프라이머는 1R 이라는 이름을 붙여, p14 1R, p15 1R, p16 1R, p21 1R, p53 1R, pRb 1R 및 HPRT 1R로 명명하고, 3′쪽 프라이머는 p21 2R,p53 2R, pRb 2R 및 HPRT 2R로, 그리고 p14, p15 및 p16은 서로 상동성이 높으므로 서열이 거의 같은 곳에서 3′쪽 프라이머를 디자인하고 p15 4R이라고 명명하였다.

각 프라이머들의 PCR 산물이 세포 RNA의 산물과 길이 차이가 나도록 알맞게 배열하고, 각 프라이머들의 중합을 위해 배열된 단일 가닥의 각 프라이머들 사이에서 전후 프라이머의 부분과 6 bp 씩 상보적인 서열을 갖는 12 bp의 링커를 디자인하였다.

다음 표 1은 세포 내의 RNA로부터 합성된 cDNA와 본 발명의 TS-IS 벡터로부터 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행했을 때 나타나는 각 종양 억제 유전자의 PCR 산물의 길이 차이를 나타낸 것이다.

유전자	세포 cDNA (bp)	TS-IS cDNA (bp)
p14	152	208
p15	259	128
p16	130	188
p21	244	128
p53	416	128
pRb	463	128
HPRT	270	128

도 1은 본 발명의 벡터에서 각 종양 억제 유전자 및 대조군인 HPRT 유전자의 프라이머쌍을 포함하는 부분의 염기 서열을 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명의 벡터에서 각 종양 억제 유전자의 프라이머쌍의 배열, 프로모터, 폴리(A) 꼬리 및 제한 효소의 위치를 보여주는 모식도이다.

여기에서 보면, 링커 7과 8은 5′프라이머들과 3′프라이머들의 사이에 위치하는데, 두 가지 프라이머들을 연결하기 위해 서로 8 bp가 상보적이 되도록 링커 7에는 GAGAGAGA 서열을, 링커 8에는 TCTCTCTC 서열을 첨가하였다.

다음 표 2는 각 프라이머들의 명칭과 염기 서열을 나타낸 것이다.

프라이머	염기 서열
p14	1R 5'-CCCTCGTGCTGATGCTACTG-3'4R 5'-CGGGTGAGAGTGGCAGGGTC-3'
p15	1R 5'-GAGTGTCGTTAAGTTTACGG-3'4R 5'-CGGGTGAGAGTGGCAGGGTC-3'
p16	1R 5'-CTGCCCAACGCACCGAATAG-3'4R 5'-CGGGTGAGAGTGGCAGGGTC-3'
p21	1R 5'-TGAGTTGGGAGGAGGCAGGC-3'2R 5'-TGTGGGCGGATTAGGGCTTC-3'
p53	1R 5'-CATCTTCTGTCCCTTCCCAG-3'2R 5'-ATGGTGGTACAGTCAGAGCC-3'
pRb	1R 5'-CGCGTGCGCTCTTGAGGTTG-3'2R 5'-TGGCTTCTGGGTCTGGAAGG-3'
HPRT	1R 5'-GCTGGTGAAAAGGACCCCA-3'2R 5'-AGCTCTACTAAGCAGATGGC-3'

② 프라이머들의 5′말단 인산화와 중합 반응

각 프라이머 50 pmol씩을 5′군(A: p14 1R, p15 1R, p16 1R, p21 1R, p53 1R, pRb 1R, HPRT 1R)과 3′군(B: p15 4R, p21 2R, p53 2R, pRb 2R, HPRT 2R)으로 나누어 두 개의 튜브에 넣은 후, 95 ℃에서 10 분간 방치하여 단일 가닥 DNA들의 2차 구조를 풀어 주었다. 그 후 T4 DNA 키나아제와 10배 키나아제 완충액, 10 mM rATP(Stratagene, 미국)를 첨가하고 37 ℃에서 30 분간 배양하여 5′말단을 인산화하였다. 그 후, 각각의 키나아제 혼합 용액에 10 pmol 씩의 5＇프라이머들과 링커 1∼7 (A), 3＇프라이머들과 링커 8∼12 (B)를 더 첨가하고, 95 ℃에서 37 ℃까지 온도를 낮추며 프라이머들과 링커들 사이에 상보적인 수소 결합이 형성되도록 하였다. 이때, 반응액의 증발을 막기 위해 반응액 위에 미네랄 오일을 한 방울씩 떨어뜨렸다. 다음은 반응 용액의 조성을 나타낸다.

키나아제 혼합 용액

(A) (B)

각 프라이머 50 pmol 8.8 ㎕(350 pmol) 6.5 ㎕(250 pmol)

T4 DNA 키나아제(10 U/1 ㎕) 2 ㎕ 2 ㎕

10 배 키나아제 완충액 2 ㎕ 2 ㎕

10 mM rATP 3 ㎕ 3 ㎕

증류수 4.2㎕ 6.5 ㎕

③ 프라이머들의 연결과 간격 채우기

중합된 프라이머와 링커가 포함된 반응액 20 ㎕ 중 5 ㎕에 T4 DNA 리가아제와 5배 T4 DNA 리가아제 완충액(Stratagene, 미국), 10 mM rATP를 첨가하고 22 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때 나란히 배열된 프라이머들 간에 포스포디에스테르 결합이 형성되어 하나의 긴 DNA 가닥으로 연결된다. 그 후 (A)와 (B) 두 튜브에 나뉘어져 있던 5′과 3′군의 프라이머들을 혼합하여 가운데 위치한 링커 7과 8의 상보적인 부분이 중합되도록, 반응액에E. coliDNA 중합 효소 Ⅰ와 10 배E. coliDNA 중합 효소 완충액(NEB, 영국), 2.5 mM dNTP를 첨가하고 37 ℃에서 1시간 반응시켜, 단일 가닥으로 존재하는 DNA 부위가 이중 가닥이 되도록 한다.

다음은 반응 용액의 조성을 나타낸다.

리가아제 혼합 용액

(A) (B)

DNA 5 ㎕(140 pmol) 5 ㎕(100 pmol)

T4 DNA 리가아제(10 U/1 ㎕) 1 ㎕ 1 ㎕

5배 T4 DNA 리가아제 완충액 2 ㎕ 2 ㎕

10 mM rATP 1 ㎕ 1 ㎕

증류수 1 ㎕ 1 ㎕

E. coli DNA 중합 효소 혼합 용액

DNA 10 ㎕(A + B, 1.2 ㎍)

E. coliDNA 중합 효소 I(10 U/1 ㎕) 1 ㎕

10배E. coliDNA 중합 효소 완충액 1 ㎕

2.5 mM dNTP 1 ㎕

증류수 7 ㎕

④ 프라이머들의 이중 나선의 증폭 및 pT7-Blue 벡터로의 클로닝

상기 ③에서 완성된 이중 가닥의 프라이머들을 PCR로 증폭하여 pT7-Blue 벡터에 클로닝하기 위하여, 연결된 프라이머들 중 양 끝에 위치한 프라이머인 p14 1R과 p53 2R을 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 반응은 94 ℃(30 초), 62 ℃(30 초), 72 ℃(1 분)으로 28 회 수행하였고, PCR 반응 용액은 약 50 ng의 DNA에TaqDNA 중합 효소, 10배 PCR 완충액, 25 mM MgCl₂(Perkin Elmer, 미국), 2.5 mM dNTP 및 각 프라이머 10 pmol 씩의 혼합액을 첨가하였다.

여기에서 얻어진 PCR 산물 중 1 ㎕를 PCR 클로닝 벡터인 pT7 Blue 벡터 (Novagene, 미국) 50 ng과 혼합한 후 총 10 ㎕ 반응 용액에 T4 DNA 리가아제와 5 배 리가아제 완충액(Gibco/BRL, 미국)을 첨가하여 16 ℃에서 12∼16 시간 정도 리게이션 반응을 시켰다.

다음은 각 반응 용액의 조성을 나타낸다.

PCR 반응 용액

DNA(50 ng/1 ㎕) 1 ㎕

TaqDNA 중합 효소(5 U/1 ㎕) 0.5 ㎕

10배 PCR 완충액 5 ㎕

25 mM MgCl₂액5 ㎕

2.5 mM dNTP 액 1 ㎕

프라이머 혼합액: p14 1R(10 pmol/1 ㎕) 1 ㎕

p53 2R(10 pmol/1 ㎕) 1 ㎕

증류수 35.5 ㎕

리가아제 혼합 용액

DNA(상기 PCR 반응 용액) 1 ㎕

pT7-Blue 벡터(50 ng/1 ㎕) 1 ㎕

T4 DNA 리가아제(1 U/ 1㎕) 1 ㎕

5배 리가아제 완충액 2 ㎕

증류수 5 ㎕

형질 전환은 하나한의 방법(Hanahan O., 1983.J. Mol. Biol.,166: 557-580)을 변형하여 실시하였다. 즉, 5 ㎕의 반응액에 0.5 M CaCl₂를 처리한 대장균 숙주 세포 XL1-blue MRF' 균주 100 ㎕를 섞어 4 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 42 ℃에서 90 초간 열처리하고 LB 배양액 1 ㎖을 첨가하여 37 ℃에서 60 분간 배양하였다.

이 형질 전환체를 원심분리(13,000 rpm, 20 초)하여 100 ㎕ LB로 재현탁한 후, X-gal(50 ㎍/㎖)과 IPTG를 첨가하여 암피실린(50 ㎍/㎖)이 포함된 아가 플레이트에 도말하고 37 ℃에서 14∼16 시간 정도 배양한 다음, 나타난 흰색 콜로니를 무작위로 선택하여 37 ℃에서 2 ㎖ LB 배양액에 밤새 배양하였다. 이 중 1.5 ㎖을 알칼리 용해 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하고, 일부를 여러 가지 제한 효소 반응을 통해 확인하였다.

마지막으로 확인된 벡터는 표 2에 나타난 각 프라이머들을 이용하여 94 ℃(30 초), 62 ℃(30 초), 72 ℃(1 분)으로 PCR을 수행한 후, 5 % PAGE에 전기영동하여 각 PCR 산물의 크기가 예상대로 나오는지 검증하였다.

도 5는 각 종양 억제 유전자의 프라이머쌍이 포함된 pT7-Blue 벡터를 PCR로 확인한 전기영동 사진으로, 왼쪽부터 1 kb DNA 표지, p14, p15, p16, p21, p53, pRb, HPRT이며, 각 PCR 산물의 길이는 표 1에 나타나 있다.

실시예 3: 각 프라이머에 폴리(A) 꼬리가 첨가된 본 발명의 벡터 제조

내부에 존재하는 JHC001 유전자의 뒷부분에 폴리(A) 꼬리가 연결된 형태를 갖는 pcDNA3 벡터에BstXI으로 효소 반응을 수행하여 폴리(A) 꼬리를 제외한 불필요한 JHC001의 구조 유전자 부위를 제거하였다. 효소 반응은 DNA 10 ㎍,BstXI, 10 배 완충액(Poscochem, 한국) 및 1 ㎍/ml BSA(NEB, 미국)을 포함하는 20 ㎕의 제한 효소 반응 혼합액을 50 ℃에서 3 시간 반응시켜 수행하였다. 그 후 S1 뉴클레아제를 처리하여BstXI에 의해 생성된 접착 말단의 단일 나선 부위를 제거하여 블런트 말단으로 만들었다. 이 반응은 DNA 10 ㎍에 S1 뉴클레아제와 10 배 S1 뉴클레아제 완충액(Promega, 미국)을 포함하는 총 30 ㎕의 S1 뉴클레아제 반응 혼합액 중에서 수행하였다. 이 벡터를 리게이션하여 pcDNA3 벡터에서 JHC001 유전자의 폴리(A) 꼬리 부분만 남고 나머지 부분은 소실된 형태의 폴리(A) 꼬리 벡터를 완성하였다. 클로닝된 JHC001의 폴리(A) 꼬리 부분의 염기 서열은 다음과 같다: ATGGTTGAATATGA₁₈(A가 18 bp 연결).

이와 같이 얻어진 벡터를 대장균 숙주 세포에 형질 전환하였다. 즉, 하나한의 방법(Hanahan O., 1983.J. Mol. Biol., 166: 557-580)을 변형하여, 5 ㎕의 반응액을 0.5 M CaCl₂를 처리한 대장균 숙주 세포 XL1-blue MRF' 균주 100 ㎕와 섞어 4 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 42 ℃에서 90 초간 열처리하고 LB 배양액 1 ㎖을 첨가하여 37 ℃에서 60 분간 배양하였다. 이 형질 전환체를 원심분리(13,000 rpm, 20 초)하여 100 ㎖에 재현탁한 후, 암피실린(50 ㎍/㎖)이 포함된 아가 플레이트에 도말하고 37 ℃에서 14∼16 시간 정도 배양한 다음, 몇 개의 콜로니를 무작위로 선택하여 37 ℃에서 2 ㎖ LB 배양액에 밤새 배양하였다. 배양액 1.5 ㎖을 알칼리 용해 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하여 원하는 벡터를 얻었다.

이렇게 제조된 벡터에서 5′쪽의 T7 프로모터와 3′쪽의 폴리(A) 꼬리 사이의 다중 제한 효소 자리 중에서, pT7-Blue 벡터와 일치하는 제한 효소 자리인BamHI(Poscochem, 한국)과HindIII(Promega, 미국)를 이용하여 효소 반응을 수행하고, 종양억제 유전자의 프라이머들이 포함된 pT7-Blue 벡터도 역시BamHI과HindIII로 효소 반응을 수행하였다. 이 효소 반응은 pT7-Blue 벡터와 폴리(A) 꼬리가 있는 pcDNA3 벡터 10 ㎍에,BamHI(Poscochem, 한국)과HindIII(Promega, 미국), 10 배BamHI 완충액(Poscochem, 한국) 및 1 ㎍/ml BSA(NEB, 미국)를 혼합한 총 50 ㎕의 제한 효소 반응 용액 중에서 수행하였다(37 ℃, 2 시간). 이것을 5 % PAGE로 확인한 후, 전기 회수 방법을 이용하여 폴리(A) 꼬리가 있는 pcDNA3 부분과 종양 억제 유전자의 프라이머들이 포함된 DNA 부분을 분리하였다. 회수한 DNA들을 페놀/클로로포름으로 추출하고, T4 DNA 리가아제 및 리가아제 완충액을 포함하는 리가아제 혼합 용액 중에서 반응시켜 리게이션하여 벡터를 완성하였다.

얻어진 벡터를 앞의 방법과 같이 형질 전환하여 플라스미드를 얻은 후,NdeI,XhoI과PstI으로 반응시켜 예상했던 대로 448 bp과 332 bp 크기의 단편이 나오는 것을 확인하고, 이와 같이 제조된 본 발명의 벡터를 TS-IS 벡터로 명명하였다. 도 2에는 이와 같이 제조된 본 발명의 TS-IS 벡터의 제한 효소 지도를 보여준다.

이상과 같이 제조된 본 발명의 TS-IS 벡터는 대장균 숙주 세포(Escherichia coliXL-1 blue MRF')에 형질 전환시켜 생명공학연구소에 1999년 12월 6일자 기탁번호 KCTC 0708BP로서 기탁되어 있다.

다음은 각 반응 용액의 조성을 나타낸다.

제한 효소 반응 혼합액 (pcDNA3 벡터용)

DNA 7 ㎕(10 ㎍)

BstX1(10 U/1 ㎕) 2 ㎕

10 배 완충액 2 ㎕

1 ㎍/ml BSA 2 ㎕

증류수 7 ㎕

S1 뉴클레아제 반응 혼합액

DNA 20 ㎕(10 ㎍)

S1 뉴클레아제(50 U/1 ㎕) 0.6 ㎕

10 배 S1 뉴클레아제 완충액 3 ㎕

증류수 6.4 ㎕

S1 반응 정지 용액

0.8 M Tris (pH 8.0)

20 mM EDTA

80 mM MgCl₂

제한 효소 반응 용액

pT7-Blue 벡터 pcDNA3

DNA 36 ㎕(10 ㎍) 13 ㎕(10 ㎍)

BamHI 2 ㎕(20 U) 1 ㎕(20 U)

HindIII 2 ㎕(20 U) 1 ㎕(20 U)

10 배BamHI 완충액 5 ㎕ 5 ㎕

1 ㎍/ml BSA 5 ㎕ 5 ㎕

증류수 0 ㎕ 13 ㎕

리가아제 혼합 용액

pcDNA3 벡터 0.5 ㎕(300 ng)

프라이머 DNA 부분 3 ㎕(1 ㎍)

T4 DNA 리가아제(1 U/1 ㎕) 1 ㎕

5 배 리가아제 완충액 2 ㎕

증류수 3.5 ㎕

이상과 같이 폴리(A) 꼬리가 포함된 TS-IS 벡터를 완성하여 제한 효소 반응으로 확인한 후, DNA 염기 서열을 분석하여 각 프라이머와 폴리(A) 꼬리의 위치를 최종 확인하였다. DNA 염기 서열 분석은, 3 ㎍의 DNA를 가지고 생거 등의 디데옥시 체인 터미네이션(dideoxy chain termination) 방법(Sanger, F., S. Nicklen and A. R. Coulson, 1977,Proc. Natl. Acad. Sci.,U. S. A., 74: 5463-5467)에 의해 서열 결정 키트(Sequenase version 2.0, USB, 미국)를 사용하여 수행하였다. 다음에, 요소(urea)가 포함된 6 % PAGE에서 60 W, 400 mA, 600 V로 전기 영동한 후, X-선 필름(Fuji, 일본)에 24 시간 정도 노출시키고 현상하여 서열을 확인하였다. 이와 같이 하여 확인된 서열을 서열 1에 나타낸다.

실시예 4: TS-IS 벡터의 RNA 및 cDNA 합성

서열이 확인된 TS-IS 벡터 DNA 6 ㎍, 폴리(A) 꼬리 뒤 쪽의 3′말단에 존재하는 제한 효소XhoI 20 U, 10 배 완충액(NEB, 영국) 및 1 ㎍/ml BSA(NEB, 미국)를 포함하는 제한 효소 반응 용액을 37 ℃에서 3시간 반응시켜 DNA를 선형으로 만들었다. 0.8 % 아가로스 겔에서 전기 영동하여 완전히 선형화된 것을 확인한 후, 총 100 ㎕가 되도록 물을 첨가하고 페놀/클로로포름 추출 과정을 수행하였다. 선형화된 DNA 1 ㎍을 20 U의 T7 프로모터를 이용하여 T7 RNA 중합 효소(Boehringer Mannhiem, 독일)로in vitro전사 방법을 통해 RNA를 합성하였다.in vitro전사 반응 용액은 총 20 ㎕의 용액에 T7 RNA 중합 효소, 10 배 전사 완충 용액 (Boehringer Mannhiem, 독일), 10 mM NTP 및 rRNasin(Promega, 미국)이 포함되어 있으며, 37 ℃에서 1시간 반응시켰다.

이 때 반응액 내에는 합성된 RNA 외에도 O.D.₂₆₀값에 영향을 주는 NTP들이 많이 존재하므로, 이 반응액을 세파덱스 G50으로 만든 스핀 컬럼에 통과시켰다. 이 스핀 컬럼을 800∼900 rpm에서 1 분씩 원심분리하여, 5 개의 30∼50 ㎕ 분획액을 받아 0.8 % 아가로스 젤에 전기 영동하여 확인한 후, 원하는 크기의 RNA가 포함된 분획액 만을 회수하였다. 회수액에 대하여 페놀/클로로포름 추출법을 시행한 후 스펙트로포토메터를 이용하여 이 RNA의 정확한 O.D.₂₆₀을 측정하였다.

정량된 TS-IS RNA 500 ng을 취해 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 반응은 역전사효소(Gibco/BRL, 미국) 100 U, 10 배 PCR 혼성화 완충액(10 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 0.1 ng/ml BSA), 폴리 d(T) 프라이머 10 pmol, 4 mM dNTP 및 0.1 M DTT가 포함된 용액에 리보뉴클레아제의 저해제로 rRNAsin을 첨가하여 45 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후에 98 ㎕의 물을 첨가하였다.

다음은 각 반응 용액의 조성을 나타낸다.

제한 효소 반응 용액 (TS-IS 벡터의 선형화)

DNA 15 ㎕(6 ㎍)

XhoI(20 U/1 ㎕) 1 ㎕

10 배 완충액 3 ㎕

1 ㎍/ml BSA 3 ㎕

증류수 8 ㎕

in vitro 전사 반응 용액

주형 DNA 4 ㎕(1 ㎍)

T7 RNA 중합 효소(20 U/1 ㎕) 2 ㎕

10 배 전사 완충 용액 2 ㎕

10 mM NTP(ATP, GTP, CTP, TTP) 4 ㎕(각 1 ㎕ 씩)

rRNasin(20 U/1 ㎕) 0.5 ㎕

증류수 7.5 ㎕

역전사 반응 용액

RNA 0.94 ㎕(500 ng)

역전사효소(200 U/1 ㎕) 0.5 ㎕

10 배 PCR 혼성화 완충액 1 ㎕

폴리 d(T) 프라이머(10 pmol/1 ㎕) 1 ㎕

4 mM dNTP 0.5 ㎕

0.1 M DTT 1 ㎕

rRNasin(40 U/1 ㎕) 0.2 ㎕

증류수 4.86 ㎕

실시예 5: TS-IS 벡터를 이용한 경합 RT-PCR 수행

경합 RT-PCR을 수행하기 위해 두 종류의 cDNA 주형을 혼합하였다. 간암 세포주로부터 얻은 세포 cDNA는 각 튜브 당 50 ng(역전사 반응에 사용된 RNA양 기준)으로 고정시키고, 여기에 단계별로 희석한 TS-IS cDNA를 첨가하였다. 첨가할 각 TS-IS cDNA의 희석 농도 단계를 정하기 위해서, 먼저 HepG2.2.15 세포로부터 분리·합성된 cDNA와 1/10의 비율로 희석한 10^-4∼10^-12ng 농도의 TS-IS cDNA를 혼합하여 각 유전자의 프라이머 별로 경합 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 종양 억제 유전자 각각에 대하여 농도 결정에 가장 적합하다고 판단되는 4 단계의 TS-IS cDNA 농도가 10^-3∼10^-8ng 사이에서 결정되었다. HPRT 유전자와 p21은 10^-3∼10^-6ng, p14와 p16은 10^-4∼10^-7ng, 그리고 p15, p53과 pRb는 10^-5∼10^-8ng의 TS-IS cDNA를 사용하였다.

이렇게 희석한 4 단계의 TS-IS cDNA 1 ㎕를, 14 가지의 간암 세포주로부터 합성된 cDNA 5 ㎕(50 ng)와 혼합한 후,TaqDNA 중합 효소와 10배 PCR 완충액 (Perkin Elmer, 미국), 2.5 mM dNTP, 25 mM MgCl₂를 첨가하고, 프라이머는 각 종양억제 유전자에 특이적인 5′과 3′의 프라이머들을 사용하여 경합 RT-PCR을 수행하였다. 이때 PCR은 모두 94 ℃(30 초), 62 ℃(30 초), 72 ℃(1 분)로 35 회씩 수행하였다. PCR 산물은 5 % PAGE에 전기영동하고 Et-Br로 염색하여 관찰하였다. 다음은 반응 용액의 조성을 나타낸다.

PCR 반응 용액

해당 단계의 TS-IS cDNA 1 ㎕(10^-3-10^-8ng)

각 세포 cDNA 5 ㎕(50 ng)

TaqDNA 중합효소(5 U/1 ㎕) 0.5 ㎕

10 배 PCR 완충액 5 ㎕

2.5 mM dNTP 1 ㎕

25 mM MgCl₂5 ㎕

각 프라이머들의 혼합액 2 ㎕

증류수 30.5 ㎕

도 6은 14 종류의 간암 세포주에서 본 발명의 TS-IS 벡터를 이용하여 각각의 종양 억제 유전자 프라이머쌍으로 수행한 경합 RT-PCR의 전기 영동 사진이다.

여기에서 보면 하나의 PAGE에 두가지 밴드가 보이는데, 하나는 세포의 cDNA로부터, 다른 하나는 TS-IS의 cDNA로부터 증폭된 PCR 산물을 나타낸다. 이 때 두 밴드의 밝기(density)를 비교하여 두 밴드의 밝기가 같아지는 곳이 두가지 PCR 주형의 농도가 같은 곳이라 할 수 있다. 따라서, 세포의 PCR 산물의 밴드와 같은 밝기를 갖는 TS-IS의 PCR 주형의 농도를 확인하여 세포의 RNA 양을 알 수 있게 된다.

이러한 결과에서 보듯이, 종양 억제 유전자의 각 프라이머쌍을 포함하는 본 발명의 TS-IS 벡터를 이용하여 경합 RT-PCR을 수행하였을 때, 암의 모델로 사용된 여러 간암 세포주에서 각 종양 억제 유전자들의 발현 양상을 정량적으로 분석할 수 있음을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 TS-IS 벡터를 임상에서 사용할 경우, 환자 조직에서의 종양 억제 유전자들을 신속하고 민감하게 정량할 수 있어 간암을 비롯한 다양한 종류의 암의 진단에 매우 유용하게 사용 될 수 있으며, 이에 따라 진단 후에 수행될 여러 가지 치료에 많은 도움을 줄 수 있다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 삭제
3. p14^ARF, p16^INK4A, p15^INK4B, p21^WAF1, p53 및 pRb의 유전자와 HPRT 유전자의 각 프라이머쌍을 포함하는 암 진단용 벡터로서, 서열 1의 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
4. 제 3 항에 있어서, 벡터 TS-IS (KCTC 0708BP).