EA005739B1 - Способ амплификации нуклеиновых кислот - Google Patents

Способ амплификации нуклеиновых кислот Download PDF

Info

Publication number
EA005739B1
EA005739B1 EA200300284A EA200300284A EA005739B1 EA 005739 B1 EA005739 B1 EA 005739B1 EA 200300284 A EA200300284 A EA 200300284A EA 200300284 A EA200300284 A EA 200300284A EA 005739 B1 EA005739 B1 EA 005739B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
dna polymerase
rnase
primer
activity
Prior art date
Application number
EA200300284A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300284A1 (ru
Inventor
Хироаки Сагава
Такаси Уемори
Хироюки Мукаи
Дзунко Ямамото
Дзун Томоно
Еидзи Кобаяси
Тацудзи Еноки
Киезо Асада
Икуносин Като
Original Assignee
Такара Био Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Такара Био Инк. filed Critical Такара Био Инк.
Publication of EA200300284A1 publication Critical patent/EA200300284A1/ru
Publication of EA005739B1 publication Critical patent/EA005739B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Abstract

Описываются способ высокочувствительной и специфической амплификации нуклеиновой кислоты-мишени в образце с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, содержащего рибонуклеотид, расположенный на 3'-конце или в 3'-концевой области, эндорибонуклеазы и ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, т.е. способ изотермической инициируемой химерным праймером амплификации нуклеиновой кислоты (ICAN); способ детекции амплифицированного фрагмента, полученного с использованием вышеуказанного способа; способ получения нуклеиновой кислоты-мишени с использованием вышеуказанного способа амплификации и химерные олигонуклеотидные праймеры для использования в указанных способах.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, полезному в области клинической медицины, и к способу синтеза ДНК, полезному в области генной инженерии. Оно относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты как матрицы и к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной указанным способом.
Уровень техники
Синтез ДНК используют для разных целей при исследованиях в области генной инженерии. Большинство синтезов ДНК, за исключением синтеза короткоцепных ДНК, таких как олигонуклеотиды, осуществляют ферментативными способами, при которых используют ДНК-полимеразу. Примером таких способов является способ полимеразной цепной реакции (ПЦР, РСК), подробно описанный в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является способ ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), являющийся сочетанием ПЦР и обратно-транскриптазной реакции, описанный в Тгепбз ίη Вю1сс1то1оду. 10:146-152 (1992). Развитие вышеуказанных способов делает возможной амплификацию представляющего интерес участка ДНК или РНК.
Вышеуказанные способы синтеза ДНК осуществляют, например, с использованием реакции, состоящей из трех стадий. Три стадии представляют собой стадию диссоциации (денатурации) двухцепочечной ДНК до одноцепочечных ДНК, стадию отжига праймера к одноцепочечной ДНК и стадию синтеза (наращивания, достраивания) комплементарной цепочки с праймера для того, чтобы амплифицировать участок ДНК, представляющий интерес. С другой стороны, такие синтезы проводят с использованием реакции, называемой челночной ПЦР (1йе зйиШе РСК (Кесеп! абуапсез ίη РСК ше1йобо1оду), ТапракизЫ1зи Какизап Коизо, Везза!зи (Рго1ет, М.1с1ею Ас1б апб Еп7уше, 8ирр1ешеп1), 41 (5):425-428 (1996)), где стадию отжига праймера и стадию наращивания проводят при одной и той же температуре.
С другой стороны, можно использовать способ лигазной цепной реакции (ЛЦР, ЬСК), описываемый в ЕР 320308, опубликованном 14 июня 1989 г., или способ с системой амплификации на основе транскрипции (ΤΑ8), описанный в РСК Рго1осо1з, Асабешю Ргезз 1пс., 1990, рр. 245-252. Четыре способа, указанные выше, требуют повторения реакции при высокой температуре и реакции при низкой температуре несколько раз для того, чтобы регенерировать одноцепочечную молекулу-мишень для следующего цикла амплификации. Систему реакций надо осуществлять с использованием перемежающихся фаз или циклов, поскольку реакция ограничивается температурой, как указано выше.
Таким образом, указанные способы требуют применения дорогостоящего термоциклера, который может точно поддерживать значение температуры в широком интервале по времени. Кроме того, при реакции требуется время для установления температуры на уровне двух или трех заранее определенных значений. Потеря времени увеличивается пропорционально числу циклов.
Для того чтобы решить указанные проблемы, разрабатываются способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно осуществить в изотермических условиях. Примерами являются способ амплификации с замещением цепи (8ΌΑ), описанный в 1Р-В 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (38К), способ амплификации на основе нуклеотидной последовательности (ΝΑ8ΒΑ), описанный в патенте Японии № 2650159, способ амплификации, опосредуемой транскрипцией (ТМА), способ с Ρβ-репликазой, описанный в патенте Японии № 2710159, и различные модификации способа 8ΌΑ, описанные в патенте США № 5824517, νθ 99/09211, νθ 95/25180 и νθ 99/49081. Способ изотермического ферментативного синтеза олигонуклеотидов описывается в патенте США № 5916777. В таких способах изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтеза олигонуклеотидов при реакции в реакционной смеси при постоянной температуре параллельно происходит достраивание с праймера и/или отжиг праймера к одноцепочечному достроенному продукту (или к исходной последовательности-мишени) с последующим достраиванием с праймера.
Среди изотермических способов амплификации нуклеиновых кислот способ 8ΌΑ является примером системы, в которой ДНК в конечном счете амплифицируется. Способ 8ΌΑ является способом амплификации нуклеиновой кислоты-мишени (и ее комплементарной цепи) в образце путем замещения двух цепей с использованием ДНК-полимеразы и эндонуклеазы рестрикции. Для способа требуются четыре праймера, используемых для амплификации, два из которых должны быть сконструированы так, чтобы они содержали сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции. Способ требует применения модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата в больших количествах в качестве субстрата для синтеза ДНК. Примером модифицированных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов является (а-8)-дезоксирибонуклеозидтрифосфат, в котором атом кислорода фосфатной группы в α-положении заменен на атом серы (8). Проблема стоимости работ, связанная с применением модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата, становится серьезной, если реакцию проводят регулярно, например, при генетических исследованиях. Кроме того, введение в способе модифицированного нуклеотида, такого как (α-8)дезоксирибонуклеотид, в состав амплифицированного фрагмента ДНК может ликвидировать возможность расщепления амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой, например, когда его подвергают анализу на полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (КРЬР).
Модифицированный способ 8ΌΑ, описанный в патенте США № 5824517, является способом ам
- 1 005739 плификации ДНК, в котором используется химерный праймер, состоящий из РНК и ДНК и имеющий существенный элемент структуры, в котором ДНК располагается по меньшей мере на З'-конце. Модифицированный способ 8ΌΆ, описанный в XVО 99/09211, требует использования рестриктазы, дающей 3'выступающий конец. Модифицированный способ 8ΌΆ, описанный в νθ 95/25180, требует использования по меньшей мере двух пар праймеров. Модифицированный способ 8ΌΆ, описанный в νθ 99/49081, требует использования по меньшей мере двух пар праймеров и по меньшей мере одного модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотидов, описанный в патенте США № 5916777, включает синтез ДНК с использованием праймера, содержащего рибонуклеотид на З'-конце, осуществление реакции с использованием праймера, введение ника между праймером и наращенной цепью в достраиваемой с праймера цепи с помощью эндонуклеазы с целью их разделения, расщепление матрицы и возвращение праймера в исходное состояние для его повторного использования. Для этого праймер нужно отделить от реакционной системы и затем снова отжечь его к матрице для того, чтобы повторно использовать праймер в способе. Кроме того, для способа изотермической амплификации, опосредованной петлей (ЪАМР), описанного в νθ 00/28082, требуется четыре праймера для амплификации, и продукты, амплифицированные с использованием такого метода, представляют собой ДНК разного размера, в которых участки-мишени для амплификации повторяются.
Как описано выше, общепринятые способы изотермической амплификации нуклеиновых кислот тем не менее страдают различными недостатками. Таким образом, сохраняется потребность в способе амплификации нуклеиновых кислот, с помощью которого, при низкой стоимости работы, получают фрагмент ДНК, который затем можно использовать в генной инженерии.
Цели изобретения
Основными целями настоящего изобретения являются способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, с помощью которого в образце с высокой чувствительностью специфически амплифицируется нуклеиновая кислота-мишень путем синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, способ детекции амплифицированного фрагмента, полученного указанным способом, способ получения нуклеиновой кислоты-мишени с использованием указанного способа амплификации и химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в указанных способах.
Сущность изобретения
В результате интенсивных исследований авторы сконструировали превосходную систему реакции амплификации гена. Конструирование осуществили путем разработки способа, при котором участок ДНК, представляющий интерес, амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, содержащего рибонуклеотид, расположенный на 3' -конце или в З'-концевой области, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Таким образом осуществлено настоящее изобретение. Способ представляет собой способ амплификации нуклеиновых кислот, в котором используют химерный олигонуклеотидный праймер, и называется в данном описании способом ΙΟΑΝ (изотермическая инициируемая химерным праймером амплификация нуклеиновых кислот).
Первый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислотымишени, включающему (a) приготовление реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, используемой в качестве матрицы, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
По первому аспекту настоящего изобретения можно также использовать реакционную смесь, содержащую химерный олигонуклеотидный праймер с последовательностью, существенно гомологичной нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица.
Второй аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему (a) обработку нуклеиновой кислоты, используемой как матрица по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достраиваемой с праймера цепи, комплементарной матрице, и синтеза двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;
(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения це
- 2 005739 пи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и (с) повторное использование на стадии (Ь) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), как матрицы.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты с использованием по меньшей мере двух праймеров, включающему (a) обработку нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной матрице, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;
(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте как матрице, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты;
(c) повторное использование на стадии (Ь) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), как матрицы;
(б) обработку замещенной цепи, полученной на стадии (Ь), используемой как матрица, по меньшей мере одним праймером, отличающимся от праймера, используемого на стадии (а), и ДНК-полимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной замещенной цепи, где праймер, отличающийся от праймера, используемого на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности замещенной цепи, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;
(е) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и (ί) повторное использование на стадии (е) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), как матрицы.
По второму и третьему аспектам настоящего изобретения в качестве ДНК-полимеразы можно использовать ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему (a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и (c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с З'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему (а) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и (c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, от 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему (a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;
(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, от 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);
(й) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей полученной на стадии (с) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а); и (е) повторное использование на стадии (й) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера, полученной на стадии (й).
Седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему (a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;
(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);
(й) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей полученной на стадии (с) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи;
- 4 005739 (е) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи, полученной на стадии (б), по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (ί) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с З'-конца праймерной части двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенная с праймера цепь расщеплена, полученной на стадии (е), для синтеза замещенной цепи.
По четвертому-седьмому аспектам в качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н.
По первому-седьмому аспектам, где используют РНКазу Н, можно использовать РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода ТйегтоШда. бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Агсйаеод1оЬик, бактерии рода ВасШик или подобной бактерии.
По первому-седьмому аспектам примером подходящей длины специфически амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени являются 200 п.о. или менее.
В случае первого-седьмого аспектов настоящего изобретения можно использовать химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже, общая формула: 5'-б№-ЫЬ-б№-3', где (а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; 6Ν: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из 6Ν в бЫа могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание на З'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).
Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0, и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (а-З)-рибонуклеотид. Кроме того, когда используют такой химерный олигонуклеотидный праймер, реакцию достраивания ДНК проводят при температуре, подходящей для праймера.
Способ амплификации по первому-седьмому аспектам может включать отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с химерным олигонуклеотидным праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, в растворе для отжига, содержащем вещество, которое усиливает отжиг нуклеиновой кислоты с праймером. Например, раствор для отжига может содержать спермидин и/или пропилендиамин. Отжиг можно провести путем инкубации раствора для отжига, содержащего нуклеиновую кислоту, используемую в качестве матрицы, и химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, при 90° или выше и последующего охлаждения раствора до температуры, при которой проводят реакцию амплификации, или до более низкой.
Реакцию амплификации по первому-седьмому аспектам можно провести в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕ8.
По первому-седьмому аспектам, например, в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи можно использовать ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой, Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к1еато1йегторй11ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1еиах.
В одном из вариантов воплощения первого-седьмого аспекта в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи используют Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1еиах, и в качестве эндонуклеазы используют РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из Ексйег1сй1а сой или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик.
По первому-седьмому аспектам можно использовать ДНК-полимеразу с эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1еиах, и реакцию амплификации можно проводить в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНКполимеразы, является ион марганца.
Способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени по первому-седьмому аспектам можно осуществить в присутствии вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы, является фосфономуравьиная кислота.
Первый-седьмой аспекты настоящего изобретения могут быть воплощены с использованием в качестве матрицы одноцепочечной ДНК или двухцепочечной ДНК. Если нуклеиновая кислота, используемая в качестве матрицы, является двухцепочечной ДНК, амплификацию можно проводить после превраще
- 5 005739 ния ее в одноцепочечные ДНК.
Нуклеиновая кислота, используемая в качестве матрицы, может представлять собой кДНК, полученную реакцией обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК. С одной стороны, реакцию амплификации проводят после синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК. Для реакции обратной транскрипции можно использовать ДНКполимеразу, обладающую активностью обратной транскриптазы. Например, реакцию обратной транскрипции и синтез достроенной цепи, комплементарной матрице, можно проводить с использованием только ДНК-полимеразы, обладающей обратно-транскриптазной активностью и активностью замещения цепи. Примерами такой ДНК-полимеразы являются Вк1 ДНК-полимераза, лишенная 5'^3' экзонуклеазной активностью, из ВасШик 81еагоШегторЫ1и8 или Вса ДНК-полимераза, лишенная 5т3' экзонуклеазной активностью, из ВасШик са1бо!епах.
По первому-седьмому аспектам реакцию амплификации можно проводить в изотермических условиях. Ее можно проводить в присутствии аналога дезоксинуклеозидтрифосфата, такого как дезоксиуридинтрифосфат или его производное.
Восьмой аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей (a) по меньшей мере один праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) эндонуклеазу; и (c) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.
Девятый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей (a) по меньшей мере два праймера, существенно комплементарные нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце в 3'-концевой области праймера;
(b) эндонуклеазу и (c) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.
Десятый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, полученной путем смешивания нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и эндонуклеазы, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера.
Одиннадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, полученной путем смешивания нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере двух праймеров и эндонуклеазы, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности каждой цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера.
Примером праймера, входящего в состав композиции по восьмому-одиннадцатому аспектам настоящего изобретения, может являться химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже, общая формула: 5'-6№-№-6№-3'.
где (а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; 6Ν: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из 6Ν в б№ могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).
Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0, и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (а-8)-рибонуклеотид.
- 6 005739
Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕЗ.
Примером композиции по восьмому-одиннадцатому аспектам является композиция, содержащая в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой, В к! ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к!еаго1йегторЫ1ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!епах. В качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. Примером РНКазы Н является РНКаза Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода ТйегтоЮда, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Агсйаеод1оЬик или бактерии рода ВасШик.
В одном из вариантов по восьмому-одиннадцатому аспектам композиция содержит в качестве ДНКполимеразы с активностью замещения цепи Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5%3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!епах, и в качестве эндонуклеазы используют РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из ЕксйепсЫа сой или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик.
Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНКполимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!епах, которую можно использовать в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНКполимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца.
Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, композиция может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридитрифосфата или его производное.
Двенадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам, содержащей (a) РНКазу Н и (b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.
Тринадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам, содержащей (a) эндонуклеазу и (b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.
В качестве эндонуклеазы для композиции по тринадцатому аспекту можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н.
В качестве РНКазы Н для композиции по двенадцатому или тринадцатому аспекту, содержащей РНКазу Н, можно использовать РНКазу Н, выбранную из числа РНКаз Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода ТйегтоЮда, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Агсйаеод1оЬик и бактерии рода Васй1ик.
Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспекту также может содержать буферный компонент, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, композиция может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕЗ.
Примером по двенадцатому или тринадцатому аспекту является композиция, содержащая в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой, Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к1еагоШегторййик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!епах. В качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. Примером РНКазы Н является РНКаза Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода ТйегтоЮда, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода Агсйаеод1оЬик или бактерии рода ВасШик.
В одном из вариантов воплощения композиция по двенадцатому или тринадцатому аспекту содержит в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1еиах, и в качестве эндонуклеазы РНКазу Н из ЕксйепсЫа сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из ЕксйепсЫа сой или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода АгсйаеоДоЬик.
Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспектам может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5%3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1еиах, которую можно использовать в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности
- 7 005739
ДНК-полимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца.
Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, композиция может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридинтрифосфат или его производное.
Четырнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, содержащему (a) РНКазу Н и (b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.
Пятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам настоящего изобретения, содержащему (a) эндонуклеазу и (b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи.
В качестве эндонуклеазы для композиции по пятнадцатому аспекту можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н.
Примером набора по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту, содержащего РНКазу Н, является набор, содержащий РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксйепсЫа сой, РНКазы Н из бактерии рода ТйегтоЮда, РНКазы Н из бактерии рода Тйетшк, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик, РНКазы Н из бактерии рода Агсйаеод1оЬик и РНКазы Н из бактерии рода ВасШик.
Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту также может содержать буферный компонент, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, композиция может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и НЕРЕ8. Набор также может содержать раствор для отжига, содержащий вещество, усиливающее отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты. Например, раствор для отжига может содержать спермидин и/или пропилендиамин.
Примером ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, входящей в состав набора по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту, является ДНК-полимераза, выбранная из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой, Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к1еаго1йегторййик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са16о!еиах.
В одном из вариантов набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту содержит Вса ДНКполимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са16о!еиах, и РНКазу Н из Ексйег1сй1а сой, бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Лгсйаеод1оЬик. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из ЕксйепсЫа сой или РНКаза Н типа II из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Лгсйаеод1оЬик.
Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспектам настоящего изобретения может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са16о!еиах. Набор может содержать вещество, дающее возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНКполимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца.
Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, набор может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридинтрифосфат или его производное.
Шестнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, находящемуся в упакованной форме и содержащему инструкции по применению ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи и РНКазы Н.
Семнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам настоящего изобретения, находящемуся в упакованной форме и содержащему инструкции по применению ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи и эндонуклеазы.
Восемнадцатый аспект настоящего изобретения относится к продукту с реагентом для амплификации нуклеиновой кислоты, состоящему из упаковки и реагента для амплификации нуклеиновой кислоты, заключенного в упаковку, где реагент для амплификации нуклеиновой кислоты содержит ДНК
- 8 005739 полимеразу с активностью замещения цепи и/или РНКазу Н, и на этикетке, наклеенной на упаковку, или в инструкциях, прилагаемых к упаковке, содержится описание того, что реагент для амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать для амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях.
Девятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к продукту с реагентом для амплификации нуклеиновой кислоты, состоящему из упаковки и реагента для амплификации нуклеиновой кислоты, заключенного в упаковку, где реагент для амплификации нуклеиновой кислоты содержит ДНКполимеразу, обладающую активностью замещения цепи, и/или эндонуклеазу, и на этикетке, наклеенной на упаковку, или в инструкциях, прилагаемых к упаковке, содержится описание того, что реагент для амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать для амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях.
Двадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу детекции в образце нуклеиновой кислоты-мишени, включающему (a) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (а).
Способ детекции по двадцатому аспекту настоящего изобретения может включать детекцию амплифицированной нуклеиновой кислоты с использованием зонда для детекции. Зонд может представлять собой зонд, меченный веществом-меткой. Например, можно использовать РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, пространственно разнесенных так, что происходит тушение.
Двадцать первый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру, используемому для двадцатого аспекта. Примером химерного олигонуклеотидного праймера является праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже, общая формула: 5'-6Ν;·ι-№-6Νο-3'.
где (а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; 6Ν: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из 6Ν в б№ могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание на 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).
Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0, и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (п-8)-рибонуклеотид.
Примером праймера по двадцать первому аспекту настоящего изобретения является праймер для детекции патогенного микроорганизма или связанного с заболеванием гена. Настоящее изобретение охватывает химерные олигонуклеотидные праймеры для детекции патогенных микроорганизмов, таких как энтерогеморрагическая ЕксйепсЫа сой, С1о81пбшт Ьо1и1тит, 81арйу1ососси5 аигеик, МусоЬас1етшт 1иЬегси1о8Щ, СЫатуФа, вирус папилломы, вирус гепатита С или вироид.
Двадцать второй аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции энтерогеморрагической ЕксйепсЫа сой, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ № 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114, 130 и 131.
Двадцать третий аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вироида, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ № 59, 60, 119, 120, 122 и 123.
Двадцать четвертый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции С1о81пбшт Ьо1и1тит, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ № 116 или 117.
Двадцать пятый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вируса папилломы, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ № 96 или 97.
Двадцать шестой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вируса гепатита С, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ № 101, 102, 138, 139, 200, 201, 205 и 206.
Двадцать седьмой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции 81арйу1ососси8 аитеик, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЦ ΙΌ № 136 или 137.
Двадцать восьмой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции МусоЬас1епит ШЬегсЫохА имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ № 155, 156, 159-162, 194 и 195.
Двадцать девятый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции СЫатуФа, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из груп
- 9 005739 пы, состоящей из 8ЕС ΙΌ Νο 157, 158, 203 и 204.
Тридцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-пятому аспектам настоящего изобретения, содержащему химерный олигонуклеотидный праймер по двадцать первомудвадцать девятому аспектам.
Тридцать первый аспект настоящего изобретения относится к набору для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, используемому в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по двадцатому аспекту настоящего изобретения, содержащему химерный олигонуклеотидный праймер по двадцать первому-двадцать девятому аспектам.
Тридцать второй аспект настоящего изобретения относится к зонду, используемому в способе по двадцатому аспекту.
Тридцать третий аспект настоящего изобретения относится к зонду, гибридизующемуся с нуклеиновой кислотой, амплифицированной по способу по первому-седьмому аспектам.
Тридцать четвертый аспект настоящего изобретения относится к зонду, гибридизующемуся с фрагментом, амплифицированным с использованием химерного олигонуклеотидного праймера по двадцать первому-двадцать девятому аспектам.
Зонд по тридцать второму-тридцать четвертому аспектам может представлять собой зонд, меченный веществом-меткой, например РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, разнесенных пространственно так, что происходит тушение.
Тридцать пятый аспект настоящего изобретения относится к набору, используемому для детекции нуклеиновой кислоты-мишени способом по двадцатому аспекту, содержащему зонд по тридцать второму-тридцать четвертому аспектам.
Тридцать шестой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему использование ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, для осуществления реакции переключения матрицы.
Примером ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, используемой по тридцать шестому аспекту, является ДНК-полимераза, выбранная из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНКполимеразы I из ЕксйепсЫа сой, В 51 ДНК-полимеразы, лишенной 5%3' экзонуклеазной активности, из ВасШик кГеагоШегторййик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5%3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо!еиах.
Тридцать седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу получения материала, содержащего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота нанесена в виде упорядоченного массива в предварительно заданном месте, включающему (а) амплификацию нуклеиновой кислоты, подлежащей иммобилизации способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения, и (й) нанесение в виде упорядоченного массива и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (а), в предварительно заданном месте.
Тридцать восьмой аспект настоящего изобретения относится к материалу с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором нуклеиновая кислота нанесена в виде упорядоченного массива в предварительно заданном месте, полученному способом по тридцать седьмому аспекту.
Тридцать девятый аспект настоящего изобретения относится к способу получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, включающему (а) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения и (й) сбор нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а). Сороковой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему (а) дупликацию ДНК или РНК, содержащей последовательность, подлежащую амплификации, для получения нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и (й) амплификацию нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, полученной на стадии (а), способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам.
Сорок первый аспект настоящего изобретения относится к способу определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, включающему амплификацию нуклеиновой кислоты согласно способу по первому-седьмому, тридцать девятому или сороковому аспектам.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 2 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 3 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 4 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифи
- 10 005739 цированных способом настоящего изобретения;
фиг. 5 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 6 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 7 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 8 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 9 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 10 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения. А: ΙΟΑΝ; В: ПЦР;
фиг. 11 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 12 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 1З - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 14 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 15 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 16 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 17 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 18 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 19 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 20 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 21 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 22 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 2З - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 24 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 25 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 26 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 27 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. 28 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения, и картину дот-блоттинг гибридизации;
фиг. 29 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. З0 представляет собой диаграмму, на которой сравниваются количества продуктов амплификации, амплифицированных способом настоящего изобретения и при помощи ПЦР;
фиг. З1 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. З2 - картину электрофореза в полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. ЗЗ - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. З4 - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. З5 - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. З6 - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. З7 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифи
- 11 005739 цированных способом настоящего изобретения;
фиг. З8 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения;
фиг. З9 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
В контексте данного изобретения дезоксирибонуклеотид (также обозначаемый как 6Ν) относится к нуклеотиду, в котором углеводная часть представлена Ό-2-дезоксирибозой.
Дезоксирибонуклеотиды включают, например, дезоксирибонуклеотиды, содержащие в качестве основания аденин, цитозин, гуанин или тимин. Кроме того, дезоксирибонуклеотиды также включают дезоксирибонуклеотид, содержащий модифицированное основание, такое как 7-деазагуанозин, и аналог дезоксирибонуклеотида, такой как дезоксиинозиннуклеотид.
В контексте данного изобретения рибонуклеотид (также обозначаемый как Ν) относится к нуклеотиду, в котором углеводная часть представлена Ό-рибозой. Рибонуклеотиды включают, например, рибонуклеотиды, содержащие в качестве основания аденин, цитозин, гуанин или урацил. Рибонуклеотиды также включают модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода фосфатной группы в α-положении заменен на атом серы (называемый также (α8)-рибонуклеотидом или (α-8)Ν), или другие производные.
В контексте данного изобретения химерный олигонуклеотидный праймер относится к праймеру, содержащему дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Праймер может содержать нуклеотидный аналог и/или модифицированный рибонуклеотид.
Химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, включают любые химерные олигонуклеотидные праймеры, содержащие рибонуклеотид, расположенный на З'-конце или в З'-концевой области праймера, и могут использоваться для наращивания цепи нуклеиновой кислоты по способу настоящего изобретения, могут расщепляться эндонуклеазой и могут использоваться для осуществления реакции замещения цепи.
В контексте данного изобретения З'-концевая область означает часть от центра к З'-концу нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Аналогично, 5'-концевая область означает часть от центра к 5'-концу нуклеиновой кислоты.
В контексте данного изобретения эндонуклеаза может представлять собой любую эндонуклеазу, действующую на двухцепочечную ДНК, полученную путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, отожженного с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, и специфически расщепляющую ее по участку праймера, содержащему рибонуклеотид.
В контексте данного изобретения ДНК-полимераза относится к ферменту, синтезирующему цепь ДНК бе ηονο с использованием цепи ДНК как матрицы. К ДНК-полимеразам относятся ДНКполимеразы, встречающиеся в природе, и варианты ферментов, обладающие вышеуказанной активностью. Например, к таким ферментам относится ДНК-полимераза с активностью замещения цепи, ДНКполимераза, лишенная 5'^3' экзонуклеазной активности, и ДНК-полимераза, обладающая активностью обратной транскриптазы или эндонуклеазной активностью.
В контексте данного изобретения термин активность замещения цепи относится к активности, которая может приводить к замещению цепи, т.е. которая может осуществлять дупликацию ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, в то же время замещая цепь ДНК, с высвобождением комплементарной цепи, которая была отожжена с матричной целью. Кроме того, цепь ДНК, высвобождаемая из нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, в результате замещения цепи, в данном описании обозначается как замещенная цепь.
Далее настоящее изобретение будет описано подробнее.
(1). Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении.
Праймер, используемый в способе настоящего изобретения, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога. К таким праймерам также относится олигорибонуклеотидный праймер, содержащий немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.
Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, существенно комплементарную фрагменту нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица. Он может вносить вклад в наращивание цепи ДНК в используемых условиях. Кроме того, рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера. Как правило, праймер конструируют таким образом, чтобы он был комплементарен участку, расположенному «выше» (ирйтеат), относительно участка, подлежащего амплификации, т.е. участку, находящемуся в З'-положении по отношению к нуклеотидной последовательности, соответствующей участку, подлежащему амплификации, в нуклеиновой кислоте, используемой как матрица. Используе
- 12 005739 мый в данном описании термин существенно комплементарная нуклеотидная последовательность означает нуклеотидную последовательность, которая может отжигаться с ДНК, используемой как матрица, в используемых условиях реакции.
Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. В контексте данного изобретения рибонуклеотид может представлять собой немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, который может располагаться на З'-конце или в З'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера, и который узнается или расщепляется эндонуклеазой. Рибонуклеотиды включают как немодифицированные рибонуклеотиды, так и модифицированные рибонуклеотиды, как описано выше.
Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание могут быть использованы для химерного олигонуклеотидного праймера настоящего изобретения до тех пор, пока они не уничтожают функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменен на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксигруппа в положении 2 рибозы заменена на метоксигруппу, но не ограничиваясь ими. Такой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий модифицированный рибонуклеотид, можно получить, используя, например, (а-8)-рибонуклеозидтрифосфат, который получают способом с использованием реагента для реакции сульфурирования (С1сп Кекеатсй), как описано в патенте США № 5003097, или реагента 2-ОМе-РНК-цианоэтилфосфоамидита (С1еп Векеатсй).
Можно сконструировать химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации по настоящему изобретению, так, чтобы он содержал модифицированный рибонуклеотид, придающий устойчивость к расщеплению эндонуклеазой. Такой праймер полезен в том отношении, что можно контролировать сайт расщепления эндонуклеазой во время стадий реакции амплификации.
В способе настоящего изобретения можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера, в зависимости от требуемой формы фрагмента ДНК после амплификации (одноцепочечной или двухцепочечной). Конкретно, используют один химерный олигонуклеотидный праймер, когда нужна одноцепочечная ДНК, тогда как два праймера используют, когда нужна двухцепочечная ДНК.
Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения, конкретно не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительнее от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида была существенно комплементарной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, так что он отжигается с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, в используемых условиях реакции. Праймер содержит на 3'-конце или в З'-концевой области последовательность, узнаваемую эндонуклеазой, которая используется на стадии, описываемой ниже.
Например, в способе синтеза ДНК настоящего изобретения в качестве праймера можно использовать олигонуклеотид структуры, представленной приведенной далее общей формулой, хотя имеется в виду, что она не предназначена для ограничения настоящего изобретения.
Общая формула: 5'-б№-ЛЬ-б№-3', где (а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; 6Ν: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из 6Ν в 6Ν;·ι могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на З'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).
Например, в настоящем изобретении предпочтительно можно использовать химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, где а = целому числу 11 или большему, и Ь = 1 и с = 0, или Ь = 2 и с = 0, или Ь = 3-5 и с = 0, или Ь = 2 и с = 0-5. Длина рибонуклеотидного звена на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения, предпочтительно соответствует 1-меру-15-меру, предпочтительнее 1-меру-10-меру, наиболее предпочтительно 1-меру-5-меру. Число с в общей формуле конкретно не ограничивается, но можно выбрать любое число, которое можно использовать в способе настоящего изобретения. Как правило, предпочтительно число 5 или меньшее. Лучшие результаты реакции получают, выбирая значение с, равное 3, а не 4, равное 2, а не 3, и равное 1, а не 2. В частности, наиболее эффективно реакцию можно осуществить в случае с = 0.
Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, имеет структуру, в которой эндонуклеаза узнает или расщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь) по сайту, содержащему рибонуклеотид, располагающийся на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера. Хотя настоящее изобретение не предполагается ограничить случаем, когда, например, РНКаза Н действует на двухцепочечную ДНК, образовавшуюся путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного
- 13 005739 праймера, представленного приведенной выше общей формулой, отожженного с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, химерный олигонуклеотидный праймер расщепляется по рибонуклеотидной части. Затем получают двухцепочечную ДНК, в которую вводят ник (одноцепочечный разрыв) между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезированной путем наращивания. Затем из ник-сайта с помощью ДНК-полимеразы проводят реакцию замещения цепи. Таким образом, в способе настоящего изобретения можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты с 3'-конца праймера, который можно расщепить эндонуклеазой и с которым ДНК-полимераза может осуществлять реакцию замещения цепи. Кроме того, к химерным олигонуклеотидным праймерам настоящего изобретения относятся праймеры, 3'-концы которых модифицированы, так что достраивания под действием ДНК-полимеразы не происходит, и достраивание ДНК происходит с 3'-конца, образованного в результате расщепления эндонуклеазой.
Кроме того, в 5'-концевую область химерного олигонуклеотидного праймера может быть включена промоторная последовательность для РНК-полимеразы. Примерами таких РНК-полимераз являются РНК-полимераза фага Т7 и РНК-полимераза фага 8Р6.
Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать нуклеотидный аналог или другие вещества. Иными словами, в химерном олигонуклеотидном праймере настоящего изобретения могут содержаться один или несколько нуклеотидных аналогов до тех пор, пока сохраняется способность праймера к осуществлению реакции достраивания полимеризацией с 3'-конца под действием ДНК-полимеразы. Можно использовать несколько типов нуклеотидных аналогов в сочетании. Примерами нуклеотидных аналогов являются дезоксиинозиннуклеотид, дезоксиурацилнуклеотид, нуклеотидный аналог с модифицированным основанием, таким как 7деазагуанин, нуклеотидный аналог, содержащий производное рибозы, и т.п., но не ограничиваются ими. Кроме того, химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, могут содержать дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или нуклеотидные аналоги, содержащие различные модификации, такие как присоединение меченных соединений, до тех пор, пока они сохраняют функции, описанные выше.
Введение нуклеотидного аналога в праймер эффективно для подавления образования структуры высшего порядка самого праймера и стабилизации отжига с матрицей. Рибонуклеотид можно ввести в праймер для такой же цели. Хотя не имеется в виду ограничение настоящего изобретения, предпочтительно можно использовать модифицированный рибонуклеотид, такой как (а-8)-рибонуклеотид, для того, чтобы предотвратить расщепление праймера неспецифической эндонуклеазой (РНКазой).
Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную нуклеотидную последовательность, можно синтезировать с использованием, например, синтезатора ДНК типа 394 производства Аррйей Βίο8у81ет8 1пс. (ΑΒΙ), согласно фосфоамидитному методу. С другой стороны, для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера можно использовать любые способы, включая фосфаттриэфирный способ, Нфосфонатный способ и тиофосфонатный способ.
(2). Эндонуклеаза, используемая в настоящем изобретении.
В настоящем изобретении можно использовать любую эндонуклеазу, которая может действовать на двухцепочечную ДНК, полученную достраиванием ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, как описано выше в (1), который отжигается с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, и расщеплять достроенную цепь для осуществления реакции замещения цепи. Иными словами, эндонуклеаза представляет собой фермент, который может вносить ник (одноцепочечный разрыв) в участок двухцепочечной ДНК, соответствующий химерному олигонуклеотидному праймеру. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, но не ограничиваясь ими, являются рибонуклеазы. Из них предпочтительно можно использовать эндорибонуклеазу Н (РНКазу Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из ДНК и РНК. Любую рибонуклеазу, обладающую вышеуказанными активностями, можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении, включая мезофильные и термоустойчивые рибонуклеазы. Например, РНКазу Н из Е. сой можно использовать в способе настоящего изобретения для реакции при примерно 50-70°С, как описывается ниже в примерах. Термоустойчивые рибонуклеазы предпочтительно можно использовать в способе настоящего изобретения. Примерами термоустойчивых рибонуклеаз, которые можно предпочтительно использовать, но не ограничиваясь ими, являются коммерчески доступная рибонуклеаза-термоустойчивая РНКаза Н НуЬййазе™ (ЕрюеШег Тес11по1още8), а также РНКаза Н из термофильной бактерии рода Васй1из, бактерии рода Тйегтиз, бактерии рода Ругососсиз, бактерии рода ТНегтоЮда. бактерии рода Агсйаеод1оЬиз или подобной бактерии. Кроме того, можно предпочтительно использовать как рибонуклеазы, встречающиеся в природе, так и варианты. Единица активности фермента РНКазы, указанная в данном описании, является величиной, выраженной согласно методу определения единицы активности фермента, описанному в ссылочных примерах.
Конкретных ограничений для РНКазы Н не существует до тех пор, пока ее можно использовать в способе настоящего изобретения. Например, РНКаза Н может происходить из разных вирусов, фагов, прокариот или эукариот. Она может представлять собой или клеточную РНКазу, или вирусную РНКазу. Примером клеточной РНКазы Н является РНКаза ΗΙ из ЕзсйегюЫа сой, и примером вирусной РНКазы Н
- 14 005739 является РНКаза ВИЧ-1. В способе настоящего изобретения можно использовать РНКазу Н типа I, типа II или типа III. Например, предпочтительны без ограничений РНКаза ΗΙ из ЕзсйепсЫа сой или РНКаза Н11 из бактерии рода Ругососсиз или бактерии рода Агсйаеод1оЬиз.
Эффективность реакции расщепления эндонуклеазой, такой как РНКаза Н, используемой в способе настоящего изобретения, может изменяться в зависимости от нуклеотидной последовательности вблизи З'-конца праймера и влиять на эффективность амплификации нужной ДНК. Поэтому естественно конструировать праймер, оптимальный для используемой РНКазы Н.
Используемый в данном описании термин введение ника или введение одноцепочечного разрыва (шскшд), означает внутреннее расщепление одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и рибонуклеотидсодержащей ДНК, селективно расщепляя из двух цепей рибонуклеотидсодержащую цепь по рибонуклеотидной части, посредством чего в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводится ник.
(3) . ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении.
В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи ДНК. В частности, можно предпочтительно использовать ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3'-экзонуклеазной активности.
Используемый в данном описании термин активность замещения цепи относится к активности, которая может осуществлять замещение цепи, т. е. которая может проводить дупликацию ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, в то же время замещая цепь ДНК с высвобождением комплементарной цепи, отожженной с матричной цепью. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная из нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, в результате замещения цепи, в данном описании называется замещенной цепью.
В настоящем изобретении можно использовать любую ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи. Ее примерами являются варианты ДНК-полимераз, лишенные 5'^3'-экзонуклеазной активности, полученные из термофильных бактерий рода ВасШиз, таких как ВасШиз са1йо!епах (далее обозначаемой как В. са), и ВасШиз з!еагоШегторЫ1из (далее обозначаемой как В. з!) , а также большой фрагмент (фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I из ЕзсйейсЫа сой (Е. сой). Как мезофильные, так и термоустойчивые ДНК-полимеразы можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении.
В.са является термофильной бактерией с оптимальной температурой роста примерно 70°С. Известно, что Вса ДНК-полимераза из этой бактерии обладает ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратно-транскриптазной активностью), 5'^3'экзонуклеазной активностью и 3'^5'-экзонуклеазной активностью. Фермент может представлять собой или фермент, выделенный в чистом виде из источника своего происхождения, или рекомбинантный белок, полученный с использованием методов генной инженерии. Фермент может быть подвергнут модификации, такой как замещение, делеция, присоединение или вставка с использованием методов генной инженерии или других способов. Примером таких ферментов является ДНК-полимераза ВсаВЕБТ (Такага Б1шхо), представляющая собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную ее 5'^3'-экзонуклеазной активности.
Известно, что некоторые ДНК-полимеразы в определенных условиях обладают эндонуклеазной активностью, такой как активность РНКазы Н. Такую ДНК-полимеразу можно использовать в способе настоящего изобретения. В одном аспекте ДНК-полимеразу можно использовать в условиях, допускающих проявление активности РНКазы Н, например, в присутствии Мп2+. В таком случае способ настоящего изобретения можно осуществлять без добавления РНКазы Н. Авторы изобретения впервые показали, что Вса ДНК-полимераза обнаруживает РНКазную активность в буфере, содержащем Мп2+, и что способ амплификации по настоящему изобретению можно осуществлять в реакционной смеси, не содержащей других ферментов, помимо Вса ДНК-полимераза. Вышеуказанный аспект не ограничивается применением Вса ДНК-полимеразы. В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, о которых известно, что они обладают активностью РНКазы Н, такие как Т!1 ДНК-полимераза из Тйегтиз Шегторййиз.
(4) . Состав реакционного буфера, используемого в настоящем изобретении.
В настоящем изобретении используют реакционный буфер, содержащий буферный компонент, соль магния или другого металла и ЙЛТР. Конечно, тип и концентрацию соли оптимизируют в зависимости от потребностей используемого фермента в металлах и т.п. Примерами буферного компонента, который можно предпочтительно использовать, являются, но не ограничиваются перечисленным, Бицин, Трицин, НЕРЕБ, Трис и фосфат (такой как фосфат натрия и фосфат калия). Среди них для настоящего изобретения предпочтителен буфер, содержащий в качестве буферного компонента Бицин, Трицин, НЕРЕБ или фосфат. Например, но без намерения ограничивать настоящее изобретение, когда температура реакции высокая, предпочтительно использовать бициновый буфер, рН которого мало изменяется с изменением температуры. Буфер НЕРЕБ может быть предпочтительным в зависимости от типа используемой РНКазы Н. Таким образом, оптимальный буфер можно выбирать в зависимости от температуры реакции,
- 15 005739 используемых эндонуклеазы или ДНК-полимеразы и т. п.
Конечная концентрация буферного компонента колеблется от 5 до 100 мМ, предпочтительно в интервале 20-50 мМ. Величина рН колеблется от 6,0 до 9,5, предпочтительно от 7,0 до 9,2. Например, предпочтительно используют буфер, содержащий 22-46 мМ Трицина с рН 7,5-9,2, или буфер, содержащий 2550 мМ фосфата калия с рН 7,0-8,0. Примерами солей магния, которые можно использовать, предпочтительно являются, но не ограничиваются перечисленным, хлорид магния, ацетат магния или сульфат магния. Конечная концентрация соли магния колеблется от 1 до 20 мМ, предпочтительно от 2 до 10 мМ. Конечная концентрация 6ΝΤΡ (смесь бАТР, бСТР, бСТР и бТТР) в смеси как субстратов для реакции достраивания ДНК колеблется от 0,1 до З,0 мМ, предпочтительно от 0,2 до 1,2 мМ. Количество праймеров, используемых в реакционном объеме 50 мкл, колеблется от 1 до 1000 пмоль, предпочтительно от 10 до 150 пмоль. Кроме того, реакционная смесь может содержать добавки, например, для того, чтобы стабилизировать реакцию амплификации. Можно добавлять бычий сывороточный альбумин (БСА) в конечной концентрации 0,1% или менее, диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 10% или менее, дигидрохлорид путресцина в конечной концентрации 4 мМ или менее или пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% или менее. Кроме того, в смеси могут содержаться ΝΜ^ (1-метил-2пирролидинон), глицерин, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид и/или -формамид. Ожидается, что добавление такого органического растворителя уменьшает неспецифический отжиг олигонуклеотидных праймеров.
Способ настоящего изобретения можно осуществлять, добавляя вещество, ингибирующее обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, такое как фосфономуравьиная кислота (РБА). Если добавляют вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность, уменьшается амплификация неспецифических продуктов, отличающихся от нуклеиновой кислоты-мишени.
В другом аспекте отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с химерным олигонуклеотидным праймером, используемым в настоящем изобретении, перед реакцией амплификации, эффективен для уменьшения неспецифического отжига олигонуклеотидного праймера в способе детекции, амплификации или получения по настоящему изобретению. Предпочтительно проводить отжиг с использованием раствора для отжига, содержащего вещество, усиливающее отжиг, такое как полиамин (например, спермин или спермидин) или пропилендиамин. Предпочтительно раствор для отжига, содержащий полиамин, содержит также соль. Например, без ограничений, раствор для отжига может содержать хлорид натрия, хлорид калия, ацетат калия, ацетат натрия или подобную соль и полиамин.
Отжиг обычно проводят путем инкубации раствора для отжига, содержащего праймер и нуклеиновую кислоту, используемую как матрица, при температуре, при которой денатурируется двухцепочечная нуклеиновая кислота (например, при 90°С или выше), и последующего охлаждения раствора до температуры реакции, используемой для способа настоящего изобретения, или до более низкой температуры.
После отжига инициируют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, добавляя в смесь другие необходимые компоненты, такие как ДНК-полимераза, РНКаза Н и б№ТР.
Количество РНКазы Н из ЕзсйепсЫа сой, как пример эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от З до 200 Е, предпочтительнее от 15 до 60 Е. Сходным образом количество РНКазы Н из бактерии рода Ругососсиз или бактерии рода Агсйаеод1оЪи8, как примеры эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от З до 200 Е, предпочтительнее от 4 до 40 Е. Количество ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т (Такага 81шхо), как пример эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от 0,5 до 100 Е, предпочтительнее от 1 до 22 Е.
Когда в способе настоящего изобретения используют сочетание эндонуклеазы и ДНК-полимеразы, например, без ограничений, предпочтительно использовать сочетание РНКазы Н из Езсйепсййа сой, бактерии рода Ругососсиз или бактерии рода Агсйаеод1оЪиз и ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т. Считается, что предпочтительное количество единиц активности эндонуклеазы и ДНК-полимеразы может меняться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав используемого буфера и количество добавляемых ферментов можно подбирать, ориентируясь на повышение чувствительности детекции или количество продукта амплификации в качестве показателя. В любом случае естественно оптимизировать состав реакционного буфера и т. п. в зависимости от типа используемого фермента.
(5). Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.
Способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера, описанного выше в (1), в сочетании с эндонуклеазой, описанной выше в (2), и ДНК-полимеразой, описанной выше в (З). С другой стороны, можно использовать ДНКполимеразу, обладающую активностью РНКазы Н, в условиях, позволяющих проявиться активности РНКазы Н, как описано выше.
бЭТР, используемые для ПЦР, и т.п. (смесь 6АТР, 6СТР, 6СТР и 6ТТР) могут быть предпочтительно использованы в качестве нуклеозидтрифосфатов, служащих в способе в качестве субстратов реакции наращивания. Кроме того, в качестве субстрата можно использовать бИТР. б№ТР могут содержать аналог б№ТР (дезоксирибонуклеозидтрифосфата), такой как 7-деаза-бСТР, 61ТР и т.п., до тех пор, пока он может служить субстратом для используемой ДНК-полимеразы. Можно использовать производное б№ТР или аналог б№ТР. Может содержаться производное с функциональной группой, такое как бИТР, содер
- 16 005739 жащий аминогруппу. В способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер можно получить, например, с использованием синтезатора ДНК согласно обычному способу синтеза. В способе настоящего изобретения можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и обычного олигонуклеотидного праймера.
Если активность фермента, используемого в реакции, может снизиться в ходе реакции, в способе настоящего изобретения фермент можно добавлять по ходу реакции. Например, без намерения ограничивать настоящее изобретение, во время реакции, в которой используют РНКазу Н, можно дополнительно добавлять РНКазу Н из ЕксНепсЫа со11. Добавляемый фермент может быть таким же, какой содержится в реакционной смеси в начале реакции, или он может быть другим ферментом, проявляющим такую же активность. Таким образом, тип или свойство добавляемого фермента не ограничивается конкретным одним ферментом до тех пор, пока добавление во время реакции производит действие, такое как повышение чувствительности детекции или повышение количества продукта амплификации.
Нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), используемую в способе настоящего изобретения в качестве матрицы, можно получить или выделить из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. С другой стороны, образец можно использовать непосредственно при реакции амплификации нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов), и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, предположительно загрязненные или инфицированные микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Образец может представлять собой препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, полученную обработкой вышеуказанных образцов известным способом. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец, полученный путем фракционирования такого продукта, нуклеиновая кислота в образце или образец, обогащенный молекулами определенной нуклеиновой кислоты, такой как мРНК. Кроме того, можно предпочтительно использовать нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, полученную амплификацией нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце.
Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, можно получить из указанных выше материалов с использованием, например, лизиса с детергентом, ультразвука, встряхивания/перемешивания с использованием стеклянных шариков или пресса Френча, без ограничений. В некоторых случаях для способа выгодно дополнительно очистить полученную нуклеиновую кислоту (например, в случае, когда присутствует эндогенная нуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают известным способом, таким как фенольная экстракция, хроматография, ионный обмен, гель-электрофорез или центрифугирование в градиенте плотности.
Когда нужно амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, происходящей от РНК, способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной в реакции обратной транскрипции, в которой в качестве матрицы используют РНК. В способе настоящего изобретения можно применить любую РНК, для которой можно создать праймер, используемый в реакции обратной транскрипции, включая тотальную РНК в образце, молекулы РНК, такие как мРНК, тРНК и рРНК, а также определенные виды молекул РНК.
Любой праймер, который в условиях реакции отжигается с РНК, служащей матрицей, можно использовать в реакции обратной транскрипции. Праймер может представлять собой праймер с олигонуклеотидной последовательностью, комплементарной специфической РНК, используемой как матрица (специфический праймер), олиго-бТ (дезокситимин) праймер, и праймер со случайной последовательностью (случайный праймер). С учетом специфического отжига, длина праймера для обратной транскрипции составляет, предпочтительно, 6 нуклеотидов или более, предпочтительнее 9 нуклеотидов или более. С учетом синтеза олигонуклеотида длина составляет предпочтительно 100 нуклеотидов или менее, предпочтительнее 30 нуклеотидов или менее. Химерный олигонуклеотидный праймер можно использовать в качестве праймера для обратной транскрипции. Химерный олигонуклеотидный праймер также можно использовать в качестве праймера в стандартной реакции замещения цепи в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной после обратной транскрипции. Такой праймер может представлять собой любой праймер, который имеет свойства, описанные выше в (1), и который можно использовать в реакции обратной транскрипции РНК.
В реакции обратной транскрипции можно использовать любой фермент, обладающий активностью синтеза кДНК, с использованием РНК в качестве матрицы. Его примерами являются обратные транскриптазы, полученные из различных источников, такие как обратная транскриптаза, происходящая из вируса миелоидного лейкоза птиц (АМУ ЯТаке), обратная транскриптаза, происходящая из вируса мышиного лейкоза Молони (ММЬУ ЯТаке), и обратная транскриптаза из вируса саркомы Рауса 2 (обратная транскриптаза ЯАУ-2). Кроме того, можно использовать ДНК-полимеразу, которая также обладает об
- 17 005739 ратно-транскриптазной активностью. Для настоящего изобретения предпочтителен фермент, обладающий обратно-транскриптазной активностью при высокой температуре, такой как ДНК-полимераза из бактерии рода Тйегтик (например, Т!й ДНК-полимераза) и ДНК-полимераза из термофильной бактерии рода ВасШик. Например, предпочтительны ДНК-полимеразы из термофильных бактерий рода ВасШик, такие как ДНК-полимераза из В. к! (Вк1 ДНК-полимераза) и Вса ДНК-полимераза, хотя они и не предназначаются для ограничения настоящего изобретения. Например, Вса ДНК-полимераза не требует иона марганца для обратно-транскриптазной реакции. Кроме того, она может синтезировать кДНК, подавляя в то же время образование вторичной структуры РНК, используемой как матрица, в условиях высокой температуры. Как встречающиеся в природе ферменты, так и варианты ферментов с обратнотранскриптазной активностью можно использовать до тех пор, пока они обладают такой активностью.
В другом аспекте в способе настоящего изобретения после дупликации ДНК или РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая должна быть заранее амплифицирована, продукт дупликации можно использовать в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. Примером способа дупликации является, но не ограничивается им, способ, при котором соответствующего хозяина трансформируют вектором, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий амплифицируемую нуклеотидную последовательность, полученный трансформант культивируют, вектор, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий амплифицируемую нуклеотидную последовательность, экстрагируют и используют. Можно использовать любые векторы до тех пор, пока они устойчиво реплицируются в хозяине. Например, предпочтительно использовать вектора серии рИС, серии рВШекспрк серии рСЕМ, вектора космидного типа и вектора фагового типа. Можно использовать любые хозяева до тех пор, пока они могут поддерживать используемые вектора. Например, примером является ЕксйепсЫа сой, которая легко культивируется.
В другом аспекте способа дупликации после того, как РНК, имеющая нуклеотидную последовательность, которая должна быть амплифицированна, транскрибирована с использованием РНКполимеразы и фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего такую нуклеотидную последовательность, в качестве матрицы, РНК может быть использована в способе настоящего изобретения в качестве матрицы непосредственно или после превращения ее в кДНК в реакции обратной транскрипции. Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, специально не ограничивается до тех пор, пока он содержит промоторную последовательность для РНКполимеразы. Он может быть встроен в вектор, содержащий промоторную последовательность для РНКполимеразы, лигирован с адаптором или кассетой, содержащими промоторную последовательность для РНК-полимеразы на своих концах, или синтезирован ферментативно с использованием праймера, содержащего промоторную последовательность для РНК-полимеразы, и соответствующей матрицы. Таким образом, фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, можно дуплицировать или амплифицировать в форме РНК с использованием промоторной последовательности для РНК-полимеразы, расположенной так, как описано выше. Любые вектора можно использовать до тех пор, пока они содержат промоторные последовательности для РНКполимераз. Например, предпочтительно использовать вектора серии рИС, серии рВйюкспрк серии рСЕМ, вектора космидного типа и вектора фагового типа. Вектор можно предпочтительно использовать в его кольцевой форме или после преобразования в линейную форму. Для способа дупликации или амплификации можно использовать любые РНК-полимеразы. Например, можно предпочтительно использовать РНК-полимеразу фага 8Р6, РНК-полимеразу фага Т7, РНК-полимеразу фага Т3 или подобную РНК-полимеразу.
В настоящем изобретении в качестве матрицы можно предпочтительно использовать как двухцепочечную ДНК, такую как геномная ДНК, выделенная так, как описано выше, или фрагмент ПЦР, и одноцепочечную ДНК, такую как кДНК, полученная реакцией обратной транскрипции тотальной РНК или мРНК. Двухцепочечную ДНК предпочтительно используют после ее денатурации до одноцепочечных ДНК или без такой денатурации.
В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения стадию денатурации можно исключить, если в качестве матрицы используют линейную двухцепочечную ДНК, такую как продукт ПЦР-амплификации. Исключение можно осуществить путем размещения сайта отжига для праймера, используемого в способе настоящего изобретения, примерно на расстоянии 50 оснований от конца ДНК. Если необходимо амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, происходящей от РНК, реакцию амплификации можно инициировать путем добавления двухцепочечной нуклеиновой кислоты РНК-кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы, в реакционную смесь для амплификации настоящего изобретения, содержащую РНКазу Н для расщепления цепи РНК и превращения нуклеиновой кислоты в одноцепочечную кДНК. Кроме того, при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения реакционно-обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы и реакцию амплификации ДНК с использованием в качестве матрицы полученной в реакции обратной транскрипции кДНК можно проводить с одной лишь ДНК-полимеразой. Такая ДНК-полимераза обладает обратно-транскриптазной активностью и активностью замещения цепи.
Подходящей длиной матрицы является длина, обеспечивающая достаточное связывание праймер
- 18 005739 ной последовательности благодаря наличию в фрагменте полной последовательности-мишени или по меньшей мере достаточной части последовательности-мишени.
Без ограничений, если ДНК, используемая в качестве матрицы, представляет собой двухцепочечную ДНК, в способе настоящего изобретения ДНК можно денатурировать до одноцепочечных ДНК для того, чтобы позволить праймеру связываться с цепью ДНК, служащей матрицей. Для денатурации предпочтительна инкубация двухцепочечной ДНК при температуре, при которой она денатурируется (например, около 95°С). Другие способы включают процесс, при котором используют повышенный рН. В таком случае рН перед амплификацией необходимо снизить для того, чтобы позволить олигонуклеотидному праймеру связаться с мишенью. Нуклеиновую кислоту непрерывно амплифицируют в изотермических условиях после денатурации двухцепочечной ДНК до одноцепочечных ДНК или, если в качестве матрицы используют РНК, после получения кДНК (одноцепочечной ДНК) в реакции обратной транскрипции.
Непрерывно означает, что реакция протекает без изменения температуры реакции или состава реакционной смеси. Используемый в данном описании термин изотермические относится к условиям с существенно постоянной температурой, при которых фермент и цепь нуклеиновой кислоты функционируют на каждой стадии.
Реакцию амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно проводить при обычной температуре (например, 37°С) с использованием мезофильной ДНК-полимеразы, такой как фрагмент Кленова. Ее также можно проводить при высокой температуре (например, 50°С или выше, или 60°С или выше) с использованием термостойких ферментов (эндонуклеазы и ДНК-полимеразы). В таком случае подавляется неспецифический отжиг праймера, что приводит к повышению специфичности амплификации ДНК. Кроме того, решается проблема образования вторичной структуры ДНК, используемой как матрица, что приводит к повышению способности ДНК-полимеразы к наращиванию цепи. По способу можно последовательно проводить реакцию обратной транскрипции амплификацию нуклеиновой кислоты. В таком случае ДНК с последовательностью, происходящей от РНК, можно амплифицировать путем сочетания использования обратной транскриптазы и вышеуказанной реакции или путем использования ДНК-полимеразы с обратно-транскриптазной активностью.
В каждом аспекте настоящего изобретения химерный олигонуклеотидный праймер, комплементарный одноцепочечной ДНК как матрице, предпочтительно сначала отжигают с ДНК, хотя это не предполагается как ограничение настоящего изобретения. ДНК, комплементарную ДНК, используемую как матрица (цепь, достроенная с праймера), затем наращивают вдоль остальной последовательности ДНК, используемой как матрица с 3'-конца праймера под действием ДНК-полимеразы, и синтезируют двухцепочечную ДНК. Эндонуклеаза действует на двухцепочечную ДНК и позволяет инициировать вновь наращивание ДНК, начиная с праймерной части достроенной с праймера бе поуо цепи. В одном аспекте настоящего изобретения эндонуклеаза действует как ник-фермент, вводящий ник в двухцепочечную ДНК, или она изменяет структуру двухцепочечной ДНК, состоящей из химерного олигонуклеотидного праймера и ДНК, используемой как матрица, хотя настоящее изобретение не ограничивается какой-либо теорией. ДНК-полимераза с активностью замещения цепи вновь достраивает цепь ДНК с 3'-конца ника, введенного в двухцепочечную ДНК, с образованием новой достроенной с праймера цепи, причем в то же время высвобождая ДНК ниже (бо\упз1геат) от 3'-конца ника. Таким образом, новая достроенная с праймера цепь замещает синтезированную ранее достроенную с праймера цепь.
Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществить с использованием двух праймеров, т.е. химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного замещенной цепи. В таком случае один праймер связывается с цепью ДНК, служащей матрицей, чтобы вызвать реакцию замещения цепи, в то время как другой праймер связывается с замещенной цепью, высвобождаемой в результате реакции замещения цепи, для инициации другой реакции замещения цепи. Ясно, что продукт реакции с одним праймером может функционировать как матрица для другого праймера, если используется такой аспект. Таким образом, количество продукта амплификации нелинейно возрастает с увеличением количества матрицы.
Когда способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения осуществляют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, обе цепи могут служить матрицами в реакции амплификации с использованием химерных олигонуклеотидных праймеров, которые отжигаются к соответствующим двум цепям. Если реакцию инициируют после денатурации двухцепочечной ДНК, в реакционную смесь перед или после денатурации двухцепочечной ДНК добавляют химерный олигонуклеотидный праймер, четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата ^ΝΊΤ), ДНК-полимеразу и эндонуклеазу. Если для денатурации двухцепочечной ДНК используют тепловую обработку и не используют термостойкий фермент, предпочтительно добавлять фермент после денатурации.
По аспекту способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, когда в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК и используют два химерных олигонуклеотидных праймера, может происходить переключение матриц между промежуточными достроенными с матрицы цепями во время реакции достраивания с праймеров, с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, со
- 19 005739 стоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, хотя это зависит от условий реакции и т.п. Двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит химерные олигонуклеотидные праймеры по обоим концам. Затем с обоих концов можно снова инициировать реакцию наращивания комплементарных цепей, включая замещение цепи. В результате реакции образуется продукт амплификации, содержащий на одном конце праймерную последовательность. Кроме того, если во время реакции происходит переключение матриц, снова образуется двухцепочечная нуклеиновая кислота, подобная той, что была описана выше.
Настоящее изобретение предусматривает способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий использование ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи для осуществления реакции переключения матрицы. При реакции переключения матрицы в присутствии двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей в качестве матрицы, двух химерных олигонуклеотидных праймеров, существенно комплементарных нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи синтезируются две достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Во время синтеза достраиваемых с праймеров цепей для каждой достраиваемой с праймера цепи происходит переключение с матрицы на другую достроенную с праймера цепь.
Используемый в данном описании термин реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой, когда комплементарные цепи синтезируются с обеих сторон двухцепочечной нуклеиновой кислоты в реакции замещения цепей, ДНК-полимераза переключает матрицу и затем синтезирует комплементарную цепь с использованием в качестве матрицы другой комплементарной цепи, вновь синтезированной с помощью другой молекулы ДНК-полимеразы. Иными словами, реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, обрабатывают праймерами и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, с образованием достроенных цепей, комплементарных матрице, где ДНК-полимераза, которая синтезирует достроенные с праймеров цепи, во время синтеза достроенных цепей активно переключает матрицу с исходных матриц на другие достроенные с праймеров цепи. Способность ДНК-полимеразы осуществлять реакцию переключения матрицы можно определить, например, согласно способу, описанному ниже в примере 32, хотя такой способ не предназначен для ограничения настоящего изобретения.
ДНК-полимеразу, способную осуществлять реакцию переключения матрицы во время реакции замещения цепи, предпочтительно можно использовать для настоящего изобретения. Например, предпочтительно использовать, в частности, фермент Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5%3'-эндонуклеазной активности. Такой фермент коммерчески доступен как ДНК-полимераза ВсаВЕЗТ (Такага 81шхо). Ее также можно выделить из штамма Ексйепсййа сой НВ101/рИ1205 (ЕЕКМ ВР-3720), который содержит ген для фермента, согласно способу, описанному в патенте Японии № 2978001. Штамм Ексйепсййа сой НВ101/рИ1205 (ЕЕКМ ВР-3720) депонирован в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (1и!егиа!юиа1 Ра!еи! Огдашкт Оерокйагу, №-1бопа1 1ик!йи!е об Лбуаисеб 1пбик1гйа1 Зсйепсе апб Тесйпойоду. ΆΙ8Τ Ткикийа Сеи!га1 6, 1-1, Нйдакйй 1-сйоте, ТкикийакЫ, 1йагак1 305-8566, Япония) с 10 мая 1991 (дата исходного депозита).
Без намерения ограничивать настоящее изобретение, далее рассматривается, примерный механизм реакции по способу амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.
В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей обрабатывают в присутствии РНКазы Н двумя химерными олигонуклеотидными праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которыми отжигаются два праймера. Последнюю двухцепочечную нуклеиновую кислоту используют повторно в качестве матрицы.
Двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, расщепляют РНКазой Н в сайтах, содержащих рибонуклеотиды. Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи достраивают с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, с осуществлением замещения цепей. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которой отжигаются оба праймера.
Если реакция переключения матрицы не происходит, может быть получено два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая.
Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, для осуществления замещения цепей достраивают с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, с которой отжигаются два праймера. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота,
- 20 005739 состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которой отжигаются два праймера. Двухцепочечная нуклеиновая кислота, с которой отжигаются оба праймера, используется повторно как матрица.
Если реакции переключения матрицы не происходит, можно получить два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая.
Два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот расщепляют РНКазой Н в сайтах, содержащих рибонуклеотиды. Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи достраивают с З'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты для осуществления замещения цепей.
В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, обрабатывают в присутствии РНКазы Н двумя химерными олигонуклеотидными праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, и синтезируют достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Если реакции переключения матриц не происходит, можно получить два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая.
В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения цепь, достроенную с химерного олигонуклеотидного праймера, можно расщепить в сайте, содержащем рибонуклеотид, так что 5'-фрагмент (праймерная часть), полученная при расщеплении, не будет содержать рибонуклеотид. Достроенная с праймера цепь, достроенная с образовавшейся таким образом праймерной части, далее не будет расщепляться эндонуклеазой. В результате образуется продукт амплификации, содержащий праймерную последовательность.
Как описано выше, методом амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно получить продукт амплификации без праймерной последовательности или продукт, содержащий праймерную(ые) последовательность(и) на одном или обоих концах. Такие продукты в контексте данного изобретения включаются в продукты амплификации.
Пример способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения иллюстрируется фиг. ЗЗ-З6. Иными словами, фиг. ЗЗ-З6 иллюстрируют примеры амплификации нуклеиновой кислоты по способу амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения.
Фиг. ЗЗ-З6 иллюстрируют пример амплификации нуклеиновой кислоты в присутствии в качестве матрицы ДНК, представляющей собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, пары химерных олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе информации о нуклеотидной последовательности ДНК, используемой как матрица (на фигурах химерные олигонуклеотидные праймеры содержат три рибонуклеотида на своих З'-концах; незаштрихованные кружочки на фигурах представляют рибонуклеотиды), ДНК-синтетазы (ДНК-полимеразы) с активностью замещения цепи, РНКазы Н, представляющей собой рибонуклеазу, расщепляющую гибридный сайт ДНК-РНК, и 6ΝΤΡ, являющихся субстратами, включаемыми в достроенные цепи.
Как видно на фиг. ЗЗ, пара химерных олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе информации о нуклеотидной последовательности ДНК, используемой как матрица, отжигаются к специфическим частям ДНК, служащей матрицей. Цепи ДНК достраиваются с З'-концов соответствующих химерных олигонуклеотидных праймеров в результате реакции замещения цепи, как показано на стадии 1.
Затем, как видно на фиг. З4, некоторые из достроенных с праймеров цепей, достроенные в обратном и прямом направлении, освобождаются от исходных матриц в результате реакции переключения матрицы, как показано на стадии 2. Достроенные с праймеров цепи отжигаются одна с другой в их З'-частях. Комплементарные цепи наращиваются с отожженных цепей, образуя двухцепочечную ДНК, состоящую из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Кроме того, образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещенных цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается упомянутая выше пара химерных олигонуклеотидных праймеров. Она служит в качестве исходного материала на фиг. З4.
Как показано на стадии З на фиг. З5, только одна цепь двухцепочечной ДНК на фиг. З4, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, содержащая РНК, происходящую из химерного олигонуклеотидного праймера, расщепляется под действием РНКазы Н в ДНК/РНК гибридном сайте двухцепочечной ДНК, в результате чего в двухцепочечную ДНК вводится ник.
Затем из ника в двухцепочечной ДНК происходит реакция замещения цепи, и ДНК наращивается, как указывается на стадии 4 на фиг. З5. Затем происходит реакция переключения матрицы, подобная реакции на стадии 2 на фиг. З4, в некоторой степени или с некоторой частотой, как указывается на стадии 5 на фиг. З5, результатом чего является двухцепочечная ДНК, состоящая из продуктов амплификации, т.е. достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой.
Кроме того, образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещаемых цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается упомянутая выше пара химерных олигонуклеотидных праймеров.
Затем, как показано на фиг. З6, в результате реакции замещения цепи ДНК достраиваются с З'
- 21 005739 концов соответствующих химерных олигонуклеотидных праймеров в двухцепочечной ДНК на фиг. 35, состоящей из замещаемых цепей, отожженных одна с другой, с которой отжигаются химерные олигонуклеотидные праймеры. В некоторой степени происходит реакция переключения матрицы, подобная реакции на стадии 2 и на стадии 5, результатом которой является двухцепочечная ДНК, состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Такую двухцепочечную ДНК возвращают на стадию 3, фиг. 35. Снова начинается реакция стадии 3, фиг. 35. Образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещаемых цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается пара химерных олигонуклеотидных праймеров, и используется в качестве исходного материала в реакции, отображенной на фиг. 36. В результате происходит цепная реакция, при которой повторно образуются указанные двухцепочечные нуклеиновые кислоты, приводящая к специфической амплификации и образованию фрагмента, ограниченного парой химерных олигонуклеотидных праймеров.
В способе амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения с использованием химерных олигонуклеотидных праймеров может быть получен полимер, в котором амплифицируемые участки соединены друг с другом. Полимер имеет структуру, в которой множество амплифицируемых участков повторяется в одном и том же направлении. Полимеры обнаруживают при анализе продуктов амплификации методом электрофореза в виде мультимерных полос. Полагают, что на образование таких полимеров влияет амплифицируемый участок, размер участка, фланкирующие области, нуклеотидная последовательность используемого химерного олигонуклеотидного праймера, условия реакции и т. п.
Полимер, описанный выше, содержит множество амплифицируемых участков. Например, поскольку при гибридизации с соответствующей пробой он гибридизуется с несколькими пробами и дает интенсивный сигнал, полимер может быть использован, когда имеется ввиду детекция нуклеиновой кислоты, содержащей амплифицируемый фрагмент. Амплифицируемый участок или его часть можно получить в виде мономера из полимера с использованием расщепления рестриктазой или подобного в сочетании.
ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении, должна синтезировать достроенную цепь с 3'-конца праймерной части в прямом направлении (бо\уп51геат), в то же время замещая достроенную ранее цепь ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не должна проявлять 5'^3'-экзонуклеазную активность, которая может расщепить замещаемую цепь. Например, в качестве таких ДНК-полимераз могут использоваться фрагмент Кленова, представляющий собой лишенный экзонуклеазы вариант ДНКполимеразы I из Е5с11епс1иа со11, аналогичный фрагмент, полученный из В 51 ДНК-полимеразы (Νο\ν Епд1апб Вю1аЬ5), и ДНК-полимераза ВсаВЕ8Т из В.са (Такага δΐιιιζο). Также можно использовать 8ес.|иепа5е 1.0 и 8ес.|иепа5е 2.0 (Ипйеб 81а1ек Вюс11еписа1) и ДНК-полимеразу фага Т5 и ДНК-полимеразу фага ф29, описанную в Сепе, 97:13-19 (1991). Полимеразу, обычно обладающую 5'^3'-экзонуклеазной активностью, можно использовать в способе настоящего изобретения, если ингибировать такую активность может добавление соответствующего ингибитора.
Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществлять при переменной температуре или его можно осуществлять изотермически. Переменная температура означает, что температура реакции изменяется для соответствующих стадий таким образом, что изменение не мешает реакциям на этих стадиях. Конкретно, переменная температура относится к ее изменению до таких значений, которые будут подходить, например, для отжига праймера, для реакции синтеза комплементарной цепи, для введения ника в комплементарную цепь и для реакции замещения.
С другой стороны, термин изотермическая означает, что температура реакции для каждой стадии неизменна, и каждую стадию проводят при существенно постоянной температуре. Естественно, что в обоих случаях выбирают температуру так, чтобы оптимизировать условия реакции.
Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является то, что способ не требует повышения и понижения температуры во время синтеза нуклеиновой кислоты. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу изотермического синтеза нуклеиновой кислоты. Во многих известных способах амплификации нуклеиновых кислот требуется повышение и понижение температуры для диссоциации мишени от синтезированной цепи. Такие способы требуют специального оборудования для указанной цели, такого как термоциклер. Однако способ настоящего изобретения можно проводить с использованием только оборудования, позволяющего поддерживать постоянную температуру. Как описано выше, способ настоящего изобретения можно осуществлять при одной температуре. Предпочтительно, его осуществляют, выбирая температуру реакции и уровень строгости такими, чтобы уменьшить неспецифический отжиг праймера, и такими, чтобы праймер специфически отжигался к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, способ настоящего изобретения можно осуществить в условиях высокой температуры, используя термостойкий фермент, как описано выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ настоящего изобретения при соответствующей температуре для поддержания активности используемого фермента для того, чтобы сохранить эффективность реакции на высоком уровне. Таким образом, температура реакции предпочтительно составляет от примерно 20 до примерно 80°С, предпочтительнее от примерно 30 до примерно 75°С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70°С, хотя она изменяется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию проводят, в частности, в высоко
- 22 005739 температурных условиях, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем в случае реакции при нормальной температуре. Последовательность и длину праймера, соответствующие температуре реакции, можно определить, например, в соответствии с величиной его температуры плавления Тт. С другой стороны, для создания праймера можно использовать коммерчески доступное программное обеспечение, такое как программа ОЬЮО™ Рптег Лиа1ук1к (Такага Б1шхо). Например, когда используют температуру реакции 55-60°С или 65°С, праймер, используемый для способа настоящего изобретения, может иметь, например, без ограничений, длину 12-100 нуклеотидов, предпочтительно длину 14-50 нуклеотидов, предпочтительнее длину 15-40 нуклеотидов. Примером влияния, привносимого повышенной температурой реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры ДНК, используемой как матрица. Повышенная температура реакции создает возможность амплификации нужной нуклеиновой кислоты даже в том случае, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с высоким содержанием ОС. Кроме того, она также эффективна при амплификации участка с большой длиной цепи. Такое действие наблюдают в интервале от примерно 60 п.о. до примерно 20 т.п.о., конкретно от примерно 110 п.о. до примерно 4,3 т.п.о., конкретнее от примерно 130 п.о. до примерно 1500 п.о.
Эффективность амплификации можно повысить путем подбора температуры реакции в соответствии с содержанием ОС в нуклеиновой кислоте, служащей матрицей. Например, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с низким содержанием ОС, реакцию амплификации по настоящему изобретению можно проводить при 50-55°С, хотя температура зависит от длины амплифицируемой цепи и величины Тт праймера.
Использование ДНК-полимеразы с обратно-транскриптазной активностью (например, ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т) в способе настоящего изобретения может сделать удобным проведение амплификации нуклеиновой кислоты, начиная с РНК, включающее стадию получения кДНК из РНК (реакция обратной транскрипции). В качестве альтернативы продукт, полученный путем независимого проведения стадии получения кДНК из РНК, т. е. кДНК, можно использовать в способе настоящего изобретения в качестве ДНК, служащей матрицей.
В каждом случае реакцию в способе настоящего изобретения проводят до остановки ее подходящим способом, например, путем инактивации фермента или путем снижения температуры реакции, или до тех пор, пока реакционная смесь не истощится по одному из субстратов.
Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для различных экспериментальных процедур, в которых используют амплификацию нуклеиновых кислот, включая детекцию, мечение и секвенирование нуклеиновой кислоты.
Кроме того, способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты ίη кйи, способа амплификации нуклеиновой кислоты на твердой подложке, такой как ДНК-чип, или метода мультиплексной амплификации нуклеиновых кислот, при котором одновременно амплифицируют несколько фрагментов.
Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является возможность получения одноцепочечной ДНК. В способе для указанной цели можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера. Например, если используют два химерных олигонуклеотидных праймера, способ настоящего изобретения можно осуществлять, используя соотношение праймеров, подобное тому, что используется в так называемой асимметричной ПЦР, при которой реакция амплификации осуществляется с использованием избыточного количества одного олигонуклеотидного праймера относительно другого. Отношение праймеров находится, без ограничений, предпочтительно в интервале от 1:10 до 1:500, предпочтительнее в интервале от 1:10 до 1:100. В результате количество продукта замещения одной цепи становится избыточным относительно продукта другой цепи.
По способу амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получить одноцепочечную ДНК, в значительной мере свободную от комплементарной ей цепи. Например, можно легко получить за короткий промежуток времени одноцепочечную ДНК для получения материала с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, такого как ДНК-чип, одноцепочечную ДНК-зонд для детекции нуклеиновой кислоты-мишени или мегапраймер для длинной ПЦР. С использованием способа настоящего изобретения можно селективно амплифицировать только смысловую или антисмысловую последовательность. Таким образом, настоящее изобретение также может быть использовано как способ получения нуклеиновой кислоты со смысловой последовательностью или с антисмысловой последовательностью.
Участок нуклеиновой кислоты, представляющий интерес, можно амплифицировать даже из следового количества нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, путем осуществления способа настоящего изобретения в буфере с бицином, Трицином, НЕРЕ8, фосфатом или Трис.
Кроме того, способы амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения не требуют специального оборудования для реакции, которое может регулировать температуру по времени. Поэтому реакцию амплификации можно проводить в большом объеме реакционной смеси. Таким образом, можно промышленно получать нуклеиновую кислоту (например, для применения в медицине) в больших количествах.
Эффективность использования праймера в способе амплификации нуклеиновой кислоты настояще
- 23 005739 го изобретения составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем эффективность при обычном способе, таком как ПЦР.
Способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получить продукт амплификации с высоким соответствием нуклеотидной последовательности матричной нуклеиновой кислоты. Когда подтверждали частоту ошибок при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения путем анализа нуклеотидных последовательностей полученных продуктов амплификации, частота ошибок, обнаруженная в продуктах амплификации, полученных по способу настоящего изобретения, была эквивалента частоте ошибок при ЬА-РСВ, которая, как известно, позволяет амплифицировать нуклеиновую кислоту с высокой точностью. Иными словами, способ настоящего изобретения имеет точность, эквивалентную таковой при ЬА-РСВ.
(6). Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения и набор для такого способа.
Нуклеиновую кислоту-мишень в образце можно обнаружить, используя способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Способ детекции включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, как описано выше; и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, полученной на указанной выше стадии.
На указанной выше стадии (а), если в качестве матрицы используют РНК, реакцию обратной транскрипции и реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно проводить в одну стадию. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, в качестве сочетания обратной транскриптазы и ДНКполимеразы с активностью замещения цепи можно предпочтительно использовать, например, сочетание обратной транскриптазы АМУ, обратной транскриптазы ММЬУ или обратной транскриптазы ВАУ-2 и Вса ДНК-полимеразы.
Способ можно использовать для детекции или количественного определения гена в образце. Иными словами, конкретный ген можно обнаружить или определить количественно во всех образцах, где предполагается наличие нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. Примерами образцов, в которых можно обнаружить конкретный ген или определить его количественно, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов), и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, предположительно загрязненные или инфицированные микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Например, вироиды, вирусы, грибы, бактерии или другие микроорганизмы в образце можно обнаружить или определить количественно на основании присутствия или содержания в специфического гена, происходящего из таких микроорганизмов и являющегося мишенью. В частности, способ детекции патогенных микроорганизмов может быть использован в областях санитарии и охраны окружающей среды. Кроме того, способ настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы отличить генотип организма или определить уровень экспрессии гена. В частности, детекция или подтверждение уровня экспрессии гена, связанного с заболеванием, например, гена, связанного с появлением признаков злокачественности клеток, может быть использовано в области медицины. При детекции в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей можно предпочтительно использовать как РНК, так и ДНК.
Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени по настоящему изобретению можно использовать для того, чтобы распознавать отличие в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислотымишени. В таком аспекте используемый химерный олигонуклеотидный праймер конструируют так, чтобы 3'-концевая часть праймера располагалась вблизи специфического распознаваемого основания нуклеотидной последовательности-мишени. Например, его конструируют так, чтобы между основанием и 3'концевым основанием праймера образовывалась водородная связь. Если имеет место мисматч между нуклеотидной последовательностью 3'-концевой части праймера и нуклеотидной последовательностью матрицы, амплификации нуклеиновой кислоты-мишени не происходит, и продукт амплификации с использованием в реакции амплификации вышеуказанного химерного олигонуклеотидного праймера не образуется. С использованием способа можно получить информацию о специфическом основании в гене, такую как информация о точечной мутация или однонуклеотизном полиморфизме (ЗИР).
Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени по настоящему изобретению можно осуществить путем амплификации нуклеиновой кислоты-мишени непосредственно из образца, содержащего нуклеиновую кислоту. В таком случае длина цепи амплифицируемой нуклеиновой кислоты-мишени на ограничивается определенной длиной. Например, для чувствительной детекции нуклеиновой кислоты-мишени эффективен участок в 200 п.о. или короче, предпочтительно в 150 п.о. или короче. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в образце с высокой чувствительностью, сконструировав химерные олигонуклеотидные праймеры по настоящему изобретению для того, чтобы в результате получить длину амплифицируемой цепи, указанную выше.
- 24 005739
Кроме того, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить с большей чувствительностью даже из следового количества образца нуклеиновой кислоты способом детекции по настоящему изобретению с использованием реакционного буфера, содержащего бицин, Трицин, НЕРЕ8, фосфат или Трис в качестве буферного компонента, и раствора для отжига, содержащего спермидин или пропилендиамин, приведенные в качестве примеров выше в (4). В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНКполимераза не ограничиваются какими-либо конкретными. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из ЕзсейсЫа сой, бактерии рода Ругососсиз или бактерии рода Агсйаеод1оЬиз и ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т. Полагают, что предпочтительное количество единиц активности эндонуклеазы и ДНК-полимеразы может меняться в зависимости от типа ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подобрать, используя в качестве показателя повышение чувствительности детекции или количество продукта амплификации.
В способе детекции настоящего изобретения во время амплификации нуклеиновой кислотымишени в качестве субстрата можно вводить йИТР. Таким образом, если в качестве субстрата используют йИТР, возможно предотвратить контаминацию продуктами амплификации за счет разрушения продуктов амплификации с использованием урацил-Ы-гликозилазы (ϋΝΟ).
Для стадии (Ь) можно использовать известные способы детекции нуклеиновой кислоты. Примерами таких способов являются детекция продукта реакции, имеющего специфический размер, методом электрофореза и детекция путем гибридизации с зондом. Кроме того, можно предпочтительно применять способ детекции, сочетающий использование магнитных бус. При детекции методом электрофореза, как правило, используют флуоресцирующее вещество, такое как бромистый этидий. Гибридизацию с зондом можно сочетать с детекцией методом электрофореза. Зонд может быть мечен радиоизотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование меченого олигонуклеотида на стадии (а) может облегчить детекцию продукта амплификации, в который включен меченый нуклеотид, или, используя метку, можно усилить сигнал для детекции. Также можно использовать для детекции метод поляризации флуоресценции, метод переноса энергии флуоресценции или подобный метод. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить автоматизированным способом или определить количественно, сконструировав подходящую систему детекции. Кроме того, можно предпочтительно использовать детекцию невооруженным глазом с помощью метода гибридной хроматографии.
В способе детекции настоящего изобретения можно использовать рибонуклеотидный (РНК) зонд, меченный двумя или большим числом пространственно разнесенных флуоресцирующих веществ, что приводит к состоянию тушения. Зонд не дает флуоресценции. Когда его отжигают с ДНК, амплифицированной с нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарной зонду, РНКаза Н расщепляет зонд. В результате увеличивается расстояние между флуоресцирующими веществами на зонде, что приводит к появлению флуоресценции. Таким образом, испускание обнаруживает присутствие нуклеиновой кислотымишени. Если в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения используют РНКазу Н, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить путем одного лишь добавления зонда в реакционную смесь. Например, для мечения зонда можно предпочтительно использовать сочетание флуоресцирующих веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-ГАМ) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметил-б-карбоксиродамина (ТАМКА).
Настоящее изобретение также предусматривает зонд, используемый в вышеописанном способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени. Зонд настоящего изобретения на ограничивается каким-либо конкретным зондом до тех пор, пока он в нормальных условиях гибридизации может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, амплифицированной способом амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Имея ввиду специфическую детекцию продукта амплификации, предпочтителен зонд, гибридизующийся в условиях, например, известных специалистам в данной области техники как строгие. Строгие условия гибридизации описываются, например, в Т. Машайз е1 а1., (ейз.), Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЩгу Мапиа1, 2пй ей., 1989, Со1й 8рйпд НагЬог ЬаЬогаЩгу. Конкретно, примером строгих условий являются следующие условия: инкубация при температуре примерно на 25°С ниже Тт используемого зонда на протяжении от 4 ч до ночи в 6х 88С (1 х 88С: 0,15 М №С1, 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0), содержащем 0,5% додецилсульфат натрия (8Ό8), 5 х раствор Денхардта (0,1% бычий сывороточный альбумин (В8А), 0,1% поливинилпирролидон, 0,1% фиколл 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Зонд с меткой, описанный выше, можно использовать в качестве зонда для облегчения детекции нуклеиновой кислоты-мишени.
Способ амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует применения оборудования, такого как термоциклер. Число праймеров, используемых в способе амплификации настоящего изобретения, может равняться одному или двум, что меньше, чем число праймеров, используемых в обычном способе. Так как реагенты, такие как й№ГР, используемый для ПЦР и подобных способов, можно применять в способе настоящего изобретения, эксплуатационные расходы могут быть уменьшены по сравнению с обычным способом. Таким образом, способ настоящего изобретения можно использовать предпочтительно, например, в области генетических анализов, при которых обычно проводят детекцию. Способ настоящего изобретения дает большее количество продукта
- 25 005739 амплификации за более короткий промежуток времени, чем ПЦР. Поэтому способ настоящего изобретения можно использовать как удобный, быстрый и чувствительный способ детекции гена.
При генетическом анализе на геномном уровне предпринимаются попытки сделать реакционную систему небольшой и повысить степень интеграции для того, чтобы анализировать большое количество нуклеотидных последовательностей. Была разработана система для указанной цели с использованием новейших сверхтонких технологий производства, в которой основные процессы для геномного анализа (например, экстракция ДНК из клеток, реакция амплификации ДНК, электрофорез, гибридизация, обнаружение ДНК, представляющей интерес, и т.п.) интегрированы на микрочипе размером от нескольких квадратных сантиметров до кончика пальца. Такая система называется микрочипом или наночипом.
В настоящее время рассматривается использование ПЦР в системе в качестве реакции для амплификации гена. Однако так как для ПЦР требуются средства для повторяющегося регулирования температуры с ее повышением и понижением во времени, система становится сложной. Напротив, так как систему можно упростить, используя способ настоящего изобретения, по которому можно амплифицировать нуклеиновую кислоту в изотермических условиях, такой способ является вполне подходящим для использования в интегрированной системе, описанной выше. Высокоинтегрированную систему можно сконструировать, используя методы настоящего изобретения.
(7) . Набор настоящего изобретения.
Настоящее изобретения предусматривает набор, используемый для способа амплификации или детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанного выше. В одном из вариантов воплощения набор находится в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся применения ДНКполимеразы и эндонуклеазы в реакции замещения цепи. Также для способа настоящего изобретения предпочтительно использовать набор, содержащий ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи, эндонуклеазу и буфер для реакции замещения цепи. В качестве альтернативы можно выбрать коммерчески доступную ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи и/или эндонуклеазу и использовать согласно инструкциям. Кроме того, набор может содержать реагент для реакции обратной транскрипции, который используют, когда в качестве матрицы используют РНК. ДНК-полимеразу можно выбрать из числа ДНК-полимераз, используемых в настоящем изобретении, описанных выше в (3). Эндонуклеазу можно выбрать из числа эндонуклеаз, описанных выше в (2). Реакционный буфер, имеющий состав, описанный выше в (4), можно предпочтительно использовать в качестве буфера для реакции замещения цепи.
Инструкции представляют собой отпечатанный материал, где описывается способ применения набора, например, способ получения раствора реагентов для реакции замещения цепи, рекомендуемые условия реакций и т. п. Инструкции включают руководство по использованию в форме проспекта или листовки, этикетку, наклеенную на набор, и описание на поверхности упаковки, содержащей набор. Инструкции также включают сведения, доступные или предоставляемые через электронные средства передачи данных, такие как Интернет.
Набор настоящего изобретения также может содержать реакционный буфер, содержащий в качестве буферного компонента бицин, Трицин, НЕРЕ8, фосфат или Трис, и раствор для отжига, примеры которого приводятся выше в (4). Кроме того, он может содержать ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, и РНКазу Н. Кроме того, набор может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата.
Набор, используемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени, также может содержать, кроме инструкций и реагентов для амплификации, описанных выше, соответствующий химерный олигонуклеотидный праймер для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и реагент для детекции амплифицированной нуклеиновой кислоты-мишени, такой как зонд.
Кроме того, наборы настоящего изобретения включают набор, содержащий химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, и/или зонд настоящего изобретения, описанные выше.
(8) . Композиция настоящего изобретения.
Настоящее изобретение предусматривает композицию, используемую в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения или способе детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанных выше. Например, композиция может содержать эндонуклеазу, описанную выше в (2), и ДНК-полимеразу, описанную выше в (3). Композиция также может содержать буферный компонент, магниевую соль, 6ΝΤΡ и т.п., как компоненты для проведения реакции амплификации. Кроме того, он может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата. Вещества, описанные выше в (4), можно использовать в качестве буферного компонента и других добавок.
В особенно предпочтительном аспекте композиция может содержать подходящие количества различных компонентов, как перечислено выше для способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Реакцию амплификации можно проводить, добавив в композицию лишь соответствующие матрицу и химерный(ые) олигонуклеотидный(ые) праймер(ы). Если амплифицируемый объект заранее известен, композиция предпочтительно содержит химерный(ые) олигонуклеотидный(ые) прай
- 26 005739 мер(ы), пригодные для амплификации такого объекта.
(9) . Материал настоящего изобретения с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, нанесенной в виде матрицы в заранее определенном участке, и способ его получения.
ДНК-чип (также называемый ДНК-микроматрицей или ДНК-матрицей) представляет собой материал с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором различные фрагменты генов или ДНК нанесены в виде матрицы и иммобилизованы на твердой подложке, такой как предметное стекло, в заранее определенном участке или в заранее определенном положении. ДНК-чип используют для проверки наличия нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновой кислоты с последовательностью, комплементарной ДНК, нанесенной и иммобилизованной в заранее определенном участке ДНК-чипа. Проверку осуществляют, приводя ДНК-чип в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, полученной из образца, предпочтительно образцом меченной нуклеиновой кислоты для гибридизации. Так как ДНК-чип можно использовать для детекции или количественного определения в образце в одной процедуре нескольких нуклеиновых кислот, он является очень полезным средством, существенно ускоряющим анализ экспрессии генов или анализ мутаций или полиморфизма. ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована двухцепочечная нуклеиновая кислота, используют в гибридизации после того, как его подвергли соответствующей денатурации. ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, комплементарная детектируемой нуклеиновой кислоте, особенно предпочтителен для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени.
Как описано выше, нужную ДНК по способу настоящего изобретения можно амплифицировать в одноцепочечной форме. Хотя можно использовать любой способ очистки продукта амплификации, предпочтительна очистка с использованием осаждения изопропанолом. Полученную таким образом ДНК, предпочтительно одноцепочечную ДНК, в значительной мере свободную от комплементарной цепи, можно предпочтительно использовать в качестве фрагмента ДНК для иммобилизации на ДНК-чипе. Таким образом, способ настоящего изобретения предпочтительно используют как способ получения ДНК для нанесения и иммобилизации в заранее определенном участке для получения ДНК-чипа. Можно использовать любой нерастворимый субстрат в качестве подложки, на которой в заранее определенном участке наносят в виде матрицы и иммобилизуют полученную таким образом ДНК, но предпочтительно используют подложку в форме пластины, изготовленной из стекла или пластмассы, и подложку в форме мембраны, изготовленной из нитроцеллюлозы или нейлона. Для иммобилизации нуклеиновой кислоты можно использовать известный способ иммобилизации. ДНК можно иммобилизовать непосредственно на подложке. В качестве альтернативы ДНК можно иммобилизовать через подходящий линкер или после лигирования нескольких молекул ДНК. Кроме того, так как по способу настоящего изобретения в амплифицированную нуклеиновую кислоту можно ввести модифицированный дезоксирибонуклеотид, материал, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, можно получить, используя модифицирующую группу.
Нуклеиновую кислоту-мишень, гибридизующуюся с нуклеиновой кислотой на материале с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована ДНК, амплифицированная по способу настоящего изобретения (например, ДНК-чипе), можно обнаружить или определить количественно. Такую детекцию или количественное определение можно осуществить путем приведения материала в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, полученным из образца, предположительно содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, с целью гибридизации. Из таких материалов ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, амплифицированная по способу настоящего изобретения, позволяет осуществить детекцию нуклеиновой кислоты удобнее, с более высокой чувствительностью и лучшей воспроизводимостью, по сравнению с обычными материалами.
(10) . Способ настоящего изобретения получения нуклеиновой кислоты в больших количествах.
Как описано выше, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, который можно осуществить в изотермических условиях. Нужную нуклеиновую кислоту можно получить, смешивая нуклеиновую кислоту, служащую матрицей для получения амплифицированной нуклеиновой кислоты, и различные компоненты, необходимые для реакции, и проведения реакции в смеси в изотермических условиях. Так как для ПЦР требуется изменение температуры реакционной смеси во времени, реакционный объем ограничивается объемом, в котором можно регулировать температуру (как правило, 200 мкл или менее). Поэтому объем трудно увеличить. С другой стороны, в способе настоящего изобретения такого ограничения не имеется. Можно получить большое количество нуклеиновой кислоты, увеличивая объем реакционной смеси. В способе настоящего изобретения объем составляет, например, предпочтительно более 200 мкл, предпочтительнее З00 мкл или более и наиболее предпочтительно 500 мкл или более, хотя такой объем не предназначен для ограничения настоящего изобретения. В способе настоящего изобретения из одной матричной молекулы синтезируют несколько молекул комплементарной цепи. Кроме того, нуклеиновые кислоты можно синтезировать с использованием этих молекул комплементарной цепи в качестве матриц. Таким образом, нужную нуклеиновую кислоту можно эффективно получить в больших количествах, выбрав соответствующим образом матрицу и праймер. Кроме того, тот факт, что, в отличие от ПЦР, способ настоящего изобретения не требует специ
- 27 005739 ального оборудования или сложного изменения температуры, делает его выгодным с точки зрения стоимости оборудования и энергии. Следовательно, способ является превосходным промышленным способом получения нуклеиновых кислот в больших количествах.
Нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, можно амплифицировать или получать даже из следового количества нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по способу получения настоящего изобретения, используя буфер для реакции и раствор для отжига, примеры которых приводятся выше в (4). В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНК-полимераза не ограничиваются какими-то конкретными вариантами. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из ЕзсйейсЫа сой и ДНКполимеразы ВсаВЕБТ. Полагают, что предпочтительные количества единиц активности эндонуклеаза и ДНК-полимераза могут меняться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подбирать, ориентируясь в качестве показателя на максимальное количество продукта амплификации.
Кроме того, способ настоящего изобретения полезен как способ получения в больших количествах различных фрагментов ДНК, таких как фрагменты для иммобилизации на ДНК-чипе. Конкретно, в одном из вариантов воплощения фрагменты ДНК можно получить в больших количествах с помощью простых реакционных стадий. В другом варианте воплощения для получения различных фрагментов ДНК можно использовать ограниченное число праймеров. В последний вариант воплощения можно включить предварительную стадию амплификации нуклеиновой кислоты, служащей в качестве матрицы в способе настоящего изобретения, известным способом амплификации нуклеиновой кислоты, таким как ПЦР. Все виды нуклеиновых кислот, служащих матрицами, можно амплифицировать с использованием ограниченного числа праймеров, например, на основе способа амплификации нуклеиновой кислоты с использованием случайного праймера с !ад-последовательностью (Лис1ею Лайз Кезеагсй, 24 (19):3778-3783 (1996)) или ПЦРс вырожденным олигонуклеотидом в качестве затравки (ПОР-РСК; Сепотюз, 13:718-725 (1992)), где используют вырожденный праймер. Способ амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно осуществить с использованием на вышеуказанной стадии одного или нескольких праймеров для всех нуклеиновых кислот, служащих матрицами. Это можно осуществить путем конструирования такого праймера, используемого в способе амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения, который соответствует !ад-последовательности, добавляемой к случайному или вырожденному праймеру. Таким образом, сочетание подходящей стадии подготовки нуклеиновой кислоты для использования как матрицы и способа настоящего изобретения может обеспечить получение различных фрагментов ДНК в больших количествах и при более низкой стоимости по сравнению с обычным способом.
Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может содержать двухцепочечную ДНК для экспрессии полезного полипептида в клетке или одноцепочечную антисмысловую ДНК для подавления экспрессии гена, представляющего интерес. Такую нуклеиновую кислоту вводят в организм с использованием подходящих средств доставки, например, носителя для переноса генов, такого как липосома. Способ получения нуклеиновой кислоты настоящего изобретения предпочтителен для получения одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты в больших количествах для медицинского применения. Кроме того, способом настоящего изобретения легко получить нуклеиновую кислоту, содержащую аналог йЛТР, который, например, подавляет разрушение нуклеиновой кислоты ίη угуо.
Так как фрагмент ДНК, амплифицированный по настоящему изобретению, состоит из обычных нуклеотидов, амплифицированную ДНК можно, например, субклонировать в подходящий вектор с использованием сайта рестрикционного фермента в ДНК. Кроме того, ДНК можно без сложностей обработать рестрикционным ферментом, например, для КЕЬР. Следовательно, ДНК можно широко использовать в области генетического анализа. Кроме того, в амплифицированный фрагмент можно ввести промоторную последовательность для РНК-полимеразы. Амплифицированный фрагмент можно использовать в качестве матрицы для синтеза РНК, которую можно использовать, например, как зонд. Безусловно, можно получить ДНК-зонд, меченный флуоресцирующим веществом, осуществляя способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения с использованием меченного флуоресцентной меткой йЛТР вместо обычного йЛТР.
Ниже перечисляются особенности способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.
1. Можно амплифицировать большое количество нуклеиновой кислоты из небольшого количества матрицы. Количество продукта амплификации возрастает квадратично при использовании двух праймеров.
2. Способ можно осуществлять изотермически. В таком случае не требуется использования такого оборудования, как термоциклер. Поэтому можно легко увеличить реакционный объем.
3. Как правило, реакцию амплификации проводят с использованием одного или двух химерных олигонуклеотидных праймеров и двух ферментов (ДНК-полимеразы и эндонуклеазы).
4. Так как с одной молекулы праймера синтезируется несколько цепей ДНК, количество праймера не ограничивает количество продукта амплификации. Кроме того, эффективность использования прай
- 28 005739 мера близка к 100%, что значительно выше, чем эффективность ПЦР.
5. Можно селективно амплифицировать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, в зависимости от цели.
6. Так как для реакции амплификации не требуется аналог бNТР, такой как (а-8)-бХТР, стоимость реагентов низкая. Кроме того, можно получить нуклеиновую кислоту в естественной форме, не содержащую аналога б№ГР.
7. Можно получать амплифицированный фрагмент ДНК с низкой стоимостью в больших количествах, комбинируя способ настоящего изобретения с другим способом дупликации нуклеиновой кислоты.
8. Способ детекции настоящего изобретения имеет равную или более высокую чувствительность детекции по сравнению с обычным способом. Способ детекции настоящего изобретения можно осуществить с равной чувствительностью за более короткий промежуток времени, чем тот, который требуется для обычного способа.
9. Способ подходит для амплификации нуклеиновой кислоты, автоматизированной детекции, детекции малого количества и высокоинтегрированной детекции на микрочипе или наночипе.
Как описано выше, способ настоящего изобретения подходит для детекции генов и промышленного получения нуклеиновой кислоты.
Примеры
Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение подробнее, но не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.
Ссылочный пример 1. Получение РНКазы Н из термофила ВасШик са1бо!еиах.
ВасШик са1бо!еиах УТ-6 (приобретенную у ОеШксйе 8итт1ипд уои М1кгоогдатктеи; Ό8Μ406) инокулировали в 100 мл среды, содержащей 0,2% триптона (Э|Гсо ЬаЬога!опек) и 1,5% дрожжевого экстракта (Э|Гсо ЬаЬогаЮпек) (рН 6,5), культивировали при 60°С в течение 140 мин при встряхивании и использовали в качестве стартовой культуры. Стартовую культуру (30 мл) инокулируют в 3 л среды того же состава и культивируют при температуре 60°С в течение 5 ч с аэрацией 2,5 л/мин и при перемешивании при 250 об./мин.
Клетки собирают путем центрифугирования культуры при 5000 х д в течение 15 мин. Клетки (402 г, масса во влажном состоянии) суспендируют в 1000 мл 50 мМ Трис-НС1 буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ меркаптоэтанол, 0,5 М №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мкМ РАРМ8Е, и разрушают с использованием МЮТЬаЬ (АРУ бАИМЫ/ РАНМЕ). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием для получения супернатанта.
К полученному супернатанту добавляют раствор полиэтиленимина до конечной концентрации 0,1%. После перемешивания смесь оставляют на 1 ч. Затем супернатант извлекают центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения. Осадок, полученный центрифугированием, растворяют в 20 мл Трис-НС1 буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ меркаптоэтанол, 0,11 мМ ЭДТА, 50 М №1С1 и 10% глицерин. Раствор диализуют против такого же буфера. Диализованный образец наносят на 280-мл колонку с ЭЕ52 (Айа!таи), уравновешенную тем же буфером, и собирают фракции несвязавшегося материала.
Затем колонку промывают 420 мл буфера, используемого для уравновешивания, и собирают вымывающиеся фракции. Несвязавшиеся фракции и фракции, вымытые при колоночной хроматографии на ЭЕ52, смешивают вместе и наносят на 240-мл колонку с Р-11 (Айа!таи), уравновешенную 20 мМ ТрисНС1 буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М №1С1 и 10% глицерин. Затем осуществляют элюирование с использованием буфера для уравновешивания, содержащего 0-0,5 М №С1.
Полученные активные фракции помещают в мешок для диализа. Мешок помещают на твердый полиэтиленгликоль 20000 при 4°С для дегидратации-концентрирования. Затем концентрат фермента наносят на 300-мл колонку с 8ирегбех 6-200 (Атегкйат Рйагташа Вю!есй), уравновешенную 25 мМ ТрисНС1 буфером (рН 7,5), содержащим 5 мМ меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, 30 М №1С1 и 50% глицерин. Осуществляют элюирование буфером, используемым для уравновешивания, для получения активных фракций. Активные фракции наносят на 15-мл колонку с гепарин-Сефарозой (Атегкйат Рйагташа Вю!есй), уравновешенную 20 мМ Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М №1С1 и 10% глицерин. Элюирование осуществляют буфером, используемым для уравновешивания, содержащим 0-0,5 М №С1.
Полученные активные фракции наносят на 5-мл колонку с НШар-8Р (Атегкйат Рйагташа Вю!есй), уравновешенную 20 мМ Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М №1С.'1 и 10% глицерин. Элюирование осуществляют буфером, используемым для уравновешивания, содержащим 0-0,5 М №С1. Полученные активные фракции снова наносят на 300-мл колонку с 8ирегбех 6-200 (Атегкйат Рйагташа Вю!есй), уравновешенную 25 мМ Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 5 мМ меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, 30 М №1С1 и 50% глицерин. Полученные активные фракции используют в качестве препарата РНКазы Н (раствор фермента).
Активность термостойкой РНКазы Н измеряют следующим образом.
В 1 мл 40 мМ Трис-НС1 (рН 7,7), содержащем 1 мМ ЭДТА, растворяют 1 мг поли(гА) или поли(бТ)
- 29 005739 (оба препарата от Атегккат Рйагтааа В1о1есН), и получают раствор поли(гА) и раствор поли(бТ).
Затем добавляют раствор поли(гА) (до конечной концентрации 20 мкг/мл) и раствор поли(бТ) (до конечной концентрации 30 мкг/мл) к 40 мМ Трис-НС1 буферу (рН 7,7), содержащему 4 мМ МбС12, 1 мМ ΌΤΤ, 0,003% В8А и 4% глицерин. Смеси дают реагировать при 37°С в течение 10 мин и затем охлаждают до 4°С для получения раствора поли(гА)-поли(бТ).
К 100 мкл раствора поли(гА)-поли(бТ) добавляют 1 мкл раствора фермента. Смеси дают реагировать при 40°С в течение 10 мин. К смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В качестве контроля к реакционной смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА, полученной смеси дают реагировать при 40°С в течение 10 мин и затем измеряют поглощение. Получают величину (разница в поглощении), вычитая поглощение в случае контроля из поглощения в случае реакции в отсутствии ЭДТА. Таким образом, на основании разницы в поглощении, определяют концентрацию нуклеотида, высвобожденного из гибрида поли(гА)-поли(бТ) в ходе ферментативной реакции. Одна единица РНКазы Н определяется как количество фермента, увеличивающее А260, соответствующее высвобождению 1 нмоль рибонуклеотида за 10 мин, вычисленное согласно уравнению, приведенному далее. Если используют разбавленный раствор фермента, величину, полученную с использованием уравнения, приведенного далее, корректируют с учетом степени разбавления.
Единица = [разница в поглощении х реакционный объем (мл)]/0,0152
Ссылочный пример 2. Клонирование гена РНКазы НИ из ВасШик са1бо!еиах.
(1) . Получение геномной ДНК из ВасШик са1бо!еиах.
ВасШик са1бо!еиах ΥΤ-0 (Ό8Μ406) инокулируют в 60 мл среды ЬВ (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,5% №С1, рН 7,2) и культивируют при 65°С в течение 20 ч. После культивирования культуру центрифугируют и собирают клетки. Клетки суспендируют в 2 мл 25% сахарозы и 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к суспензии 0,2 мл раствора 10 мг/мл хлорида лизоцима Щасаки Тексще) в воде. Смеси дают реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 12 мл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 0,1 мл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 81шхо) и 1 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч.
Затем к смеси добавляют 2,1 мл 5 М раствора №101 и 2 мл раствора СТАВ-КаС1 [10% бромида цетилтриметиламмония ЩасаЫ Тексще) и 0,7 М №С1] и полученную смесь тщательно перемешивают и инкубируют при 65°С в течение 10 мин. Добавляют к смеси равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1, об./об.). Полученную смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют в течение 10 мин при 10000 х д После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют равный объем смеси фенола, насыщенного 100 мМ Трис-НС1 (рН 8,0)/хлороформа/ изоамилового спирта (25:24:1, об./об.). Полученную смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют в течение 10 мин при 10000 х д После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют 0,6 об. 2-пропанола. Полученный волокнистый осадок вытягивают с использованием стеклянной палочки, промывают 70% этанолом в воде, сушат на воздухе и затем растворяют в 0,5 мл буфера ТЕ и получают раствор геномной ДНК.
(2) . Клонирование средней части гена РНКазы.
Синтезируют олигонуклеотиды ВкиП-3 и ВкиП-6, представленные 8ЕО ΙΌ № 1 и 2, на базе мотива Ι и мотива ΙΙΙ - консервативных участков аминокислотных последовательностей РНКаз НИ из различных организмов (ВюсНетМгу, 38:605-608 (1999)).
Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 1 мкл раствора геномной ДНК ВасШик са1бо1еиах, полученного так, как в ссылочном примере 2-(1), и 100 пмоль ВкиИ-3 и 100 пмоль ВкиИ-6 в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Тас.|полимеразу (Такага Шшхо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 50 циклов 94°С в течение 30 с, 45°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. После реакции реакционную смесь подвергают обработке фенолом с последующим осаждением этанолом для очистки ДНК. У полученной ДНК тупят концы с использованием ДНК-полимеразы фага Т4 (Такага 5>1шхо), и затем подвергают ее электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 0,4 т.п.о. Фрагмент ДНК примерно в 0,4 т.п.о. с использованием ДНК-лигазы фага Т4 (Такага Шшхо) лигируют с плазмидой рИС119 (Такага 8Ни/о), расщепленной 8та Ι (Такага 8Нихо). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйепсЫа со11 ДМ109. Полученные трансформанты культивируют и получают плазмиду 21-12, в которую встроена ДНК примерно в 0,4 т.п.о.
(3) . Клонирование расположенной против хода транскрипции (иркИеат) части гена РНКазы ΙΙ.
Была определена нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента примерно в 0,4 т.п.о., полученного в ссылочном примере 2-(2). На базе установленной нуклеотидной последовательности синтезируют олигонуклеотиды ΚΝΙΙ-81 и ΚΝΙΙ-82, представленные 8ЕО ΙΌ № 3 и 4.
Геномную ДНК ВасШик са1бо1еиах, полученную так, как в ссылочном примере 2-(1), расщепляют ВатН Ι (Такага 8Нихо) и лигируют с кассетой Αιιι3ΑΙ (Такага Шшхо) с использованием Т4 ДНК-лигазы. Процедуру осуществляют согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования ίη νίίΐΌ ТаКаКа ЬА РСК (Такага 5>1шхо), с использованием лигазной смеси в качестве матрицы, ΚΝΙΙ-82 в качестве
- 30 005739 праймера для первичной ПЦР и ΒΝΙΙ-81 в качестве праймера для вторичной ПЦР. ДНК выделяют из раствора после вторичной ПЦР экстракцией фенолом с последующим осаждением этанолом. У полученной ДНК тупят концы с использованием Т4 ДНК-полимеразы, и затем подвергают ее электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из теля амплифицированный фрагмент ДНК длиной примерно в 1,5 т.п.о. Фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о. с использованием Т4 ДНК-лигазы лигируют с рИС119, расщепленной Зта I. Лигазную смесь используют для трансформации ЕксЕепсЫа сой ΙΜ109.
Полученные трансформанты культивируют, и получают плазмиду Β25Ν16, в которую встроена ДНК примерно в 1,5 т.п.о.
(4) . Клонирование полноразмерного гена РНКазы II.
Синтезируют олигонуклеотиды ΒΝΙΙ-85 и ΒΝΙΙ-86, представленные ЗЕЦ Ш Νο 5 и 6, на базе нуклеотидной последовательности встроенного фрагмента длиной около 0,4 т.п.о. в плазмиде 21-12, определенной, как описано в ссылочном примере 2-(З).
Осуществляют ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды 21-12, полученной так, как в ссылочном примере 2-(2), и ΒΝΙΙ-85 и ΒΝΙΙ-86 в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаВа Ех Тад-полимеразу (Такага 81шхо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 циклов 94°С в течение З0 с, 55°С в течение З0 с, и 72°С в течение З0 с. После реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в агарозном геле. Из геля извлекают амплифицированный фрагмент ДНК размером около 0,З т.п.о. Фрагмент ДНК примерно в 0,З т.п.о. метят дигоксигенином с использованием ΌΙΟ Шдй-рпте (Восйе П1адпо8Йс).
Осуществляют гибридизацию по Саузерну геномной ДНК ВасШик са1бопе1ах, полученной так, как в ссылочном примере 2-(1), после расщепления ΗίηάΙΙΙ (Такага ЗНихо), 8ас! (Такага ЗЕихо) или смеси НшбШ и ЗаЛ с использованием меченной дигоксигенином ДНК в качестве зонда. Гибридизацию и детекцию осуществляют с использованием набора ΌΙΟ ЬитШексеШ Эе1ес11оп КЕ (ВосЕе П1адпокйск) согласно приложенному к нему протоколу. В результате в гидролизатах, полученных с использованием НшбШ/ЗаШ и НтбШ и ЗасЕ с зондом гидридизуются фрагменты размером около 4,5 т.п.о., около 5,8 т.п.о. и около 1,З т.п.о. соответственно.
На основании полученных результатов геномную ДНК ВасШик са1бопе1ах расщепляют НтбШ и подвергают электрофорезу в агарозном геле и извлекают из геля ДНК длиной около 4,5 т.п.о. Полученные фрагменты ДНК расщепляют 8аШ и подвергают электрофорезу в агарозном геле и извлекают из геля ДНК длиной около 1,З т.п.о. Полученные ДНК лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с рИС19 (Такага ЗЕихо), расщепленной ΗίηάΙΙΙ и 8аск Лигазную смесь используют для трансформации ЕксЕепсШа сой НВ101.
Полученные трансформанты переносят методом отпечатков на мембрану НуЬоп6-М™ (Атегкйат РЕагтааа Вю1есЕ). Затем осуществляют гибридизацию колоний с использованием вышеуказанного меченного дигоксигенином зонда согласно обычному способу. Из полученного таким образом положительного клона выделяют плазмиду рВНВ 1.
Затем определяют нуклеотидную последовательность ДНК, встроенной в рВНВ1. Из сравнения аминокислотной последовательности, предсказанной на основе нуклеотидной последовательности, с аминокислотной последовательностью РНКазы НИ из ВасШик киЬййк следует, что в ДНК рВНВ 1 вблизи инициирующего кодона отсутствует участок длиной около 40 п. о. Затем конструируют полноразмерный ген РНКазы Н следующим образом.
В25Ю6, полученную так, как описывается в ссылочном примере 2-(З), расщепляют НШбШ и подвергают электрофорезу в агарозном геле и извлекают из геля фрагмент ДНК длиной около 160 п.о. Фрагмент ДНК около 160 п.о. с использованием Т4 ДНК-лигазы лигируют с рВНВ1, расщепленной НтбШ. Лигазную смесь используют для трансформации ЕксЕепсШа сой НВ101. Из полученных трансформантов выделяют плазмиды.
Затем синтезируют олигонуклеотид ΒΝΙΙ-Νάο, представленный ЗЕЦ ΙΌ № 7, на базе предполагаемой нуклеотидной последовательности вблизи инициирующего кодона. ПЦР проводят с использованием в качестве матриц плазмид, выделенных из трансформантов, и ΒΝΙΙ-Νάο и ΚΝΙΙ-86 в качестве праймеров. Плазмиду, из которой амплифицирован фрагмент размером примерно 0,7 т.п.о., отбирают и обозначают как рВНВ11.
Определяют нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в полученную таким образом плазмиду рВНВ11. Анализ результатов выявляет открытую рамку считывания, предположительно кодирующую РНКазу НИ. Эта нуклеотидная последовательность приведена в ЗЕЦ ΙΌ № 8. Аминокислотная последовательность, предсказанная на основе нуклеотидной последовательности, показана в ЗЕ С ΙΌ Ν 9.
Штамм ЕксЕепсШа сой НВ101, трансформированный плазмидой рВНВ11, обозначен и указывается как ЕксЕепсШа сой !М109/рВНВ11, депонирован 5 сентября 2000 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов (Iηΐе^ηаΐ^οηа1 Ра1еи1 Огдашкт Эерокйагу, №1йона1 ШкШШе о£ Абνаηсеб Iηбикΐ^^а1 Заеисе аиб ТесЕмШ^, АкТ ТкикиЬа СеШга1 6, 1-1, ШдакШ 1сЕоте, ТкикиЬа-кЫ, Шагай З05-8566), Япония, под инвентарным номером ГЕВМ ВР-7655.
(5) . Экспрессия гена РНКазы НИ ВасШик са1бοΐеηаx.
- З1 005739
Езсйегйсййа сой НВ101, трансформированную рКНВ11 или рКНВ1, инокулируют в 5 мл среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение ночи. После культивирования клетки, собранные центрифугирвоанием, суспендируют в 0,5 мл ТЕ-буфера и обрабатывают ультразвуком. Суспернатант, полученный центрифугированием, используют в качестве грубого клеточного экстракта. Смешивают вместе 10 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ дитиотреитол (№1са1ай Тезсще), 0,003% бычий сывороточный альбумин (фракция V, 8йдша), 4% глицерин, 20 мкг/мл поли(бТ) (Лтегзйат Рйагшасйа Вюйесй) и 30 мкг/мл поли(гА) (Лтегзйат Рйагшасйа Вюйесй). Смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин и используют в качестве раствора субстрата для измерения активности РНКазы Н.
К 100 мкл раствора субстрата добавляют 1 мкл 1 М раствора МпС12. Смесь инкубируют при 40°С. К смеси для инициации реакции добавляют 10 мкл грубого клеточного экстракта, разведенного в 10 раз. После реакции при 40°С в течение 30 мин к смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА для прекращения реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В результате поглощение при 260 нм реакционной смеси, в которой используют грубый клеточный экстракт, полученный из Езсйегйсййа сой НВ 101, содержащей рКНВ11, было явно выше, чем поглощение реакционной смеси, в которой используют грубый клеточный экстракт, полученный из Езсйепсййа сой НВ101, содержащей рКНВ1. Таким образом демонстрируется, что рКНВ11 содержит ген РНКазы Н и что Езсйегйсййа сой НВ101, несущая рКНВ11, экспрессирует активность РНКазы.
(6). Получение очищенного препарата РНКазы Н11.
Езсйепсйиа сой НВ101, трансформированную рКНВ11, полученную в ссылочном примере 2-(4), инокулируют в 1 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 52,3 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком.
Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об./мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, прогревают при 60°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом получают 50,0 мл прогретого супернатанта.
Раствор наносят на колонку КЕ8ОИКСЕ О (ΑιικίΈΐκιιη Рйагшасйа Вйо1есй), уравновешенную буфером С [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Αте^зйат Рйагшасйа Вйо1есй). В результате РНКаза Н11 проскакивает через колонку КЕ8ОИКСЕ О.
Наносят 51 мл такой проскочившей через колонку РНКазы Н11 на колонку КЕ8ОИКСЕ 8 (Αιηο зйат Рйагшасйа Вйо1есй), уравновешенную буфером С, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при 240 мМ №С1. Наносят 3,0 мл фракции РНКазы Н11 в два приема на колонку с РЭ-10 (Αте^зйат Рйагшасйа Вйойесй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ №С1. Полученный элюат (7,0 мл) наносят на колонку с НйТгар-гепарином (Лте^зйат Рйагшасйа Вйойесй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при приблизительно 310 мМ №С1. Концентрируют 4,4 мл фракции РНКазы Н11 путем ультрафильтрации с использованием Сепйпсоп10 (Αт^соη). Концентрат (280 мкл) подвергают гель-фильтрации на колонке с 8ирегбех 200 ^ше^ат Рйагшасйа Вйойесй), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате РНКаза Н11 элюируется в положении, соответствующем молекулярной массе в 35 кДа. Такая молекулярная масса соответствует РНКазе Н11 в мономерной форме. Элюированную таким образом РНКазу Н11 используют в качестве препарата Вса РНКазы Н11.
Ферментативную активность полученного таким образом препарата Вса РНКазы Н11 измеряют следующим образом.
Реакционную смесь (100 мкл) [20 мМ НЕРЕ8-гидроксида калия (рН 7,8), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (Такага 8йихо), 1% диметилсульфоксида, 10 мМ хлорида марганца, 20 мкг/мл поли(бТ) (Αте^зйат Рйагшасйа Вйойесй), 30 мкг/мл поли(гА) (Αте^зйат Рйагшасйа Вйойесй)], икубированную при 40°С, добавляют к 1 мкл препарата Вса РНКазы НП. Смеси дают прореагировать при 40°С в течение 10 мин. Затем реакцию останавливают, добавляя 10 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Затем измеряют поглощение при 260 нм.
В результате в препарате Вса РНКазы Н11 отмечают активность РНКазы Н.
Ссылочный пример 3. Клонирование гена РНКазы Н111 Васййиз са1бойепах.
(1). Клонирование фрагмента гена РНКазы НШ.
Праймеры для скрининга гена, кодирующего РНКазу Н111, Взи111-1, Взи111-3, Взи111-6 и Взи111-8, представленные 8ЕЦ ΙΌ № 10-13, синтезируют на основе аминокислотных последовательностей участков, весьма консервативных среди Васййиз зиййййз и других организмов, определенных на основе гомологии аминокислотных последовательностей РНКазы Н111 из Васййиз зийййз [Вюсйешйзйгу, 38:605-608 (1999)] и других организмов.
- 32 005739
Первую ПЦР осуществляют в объеме 50 мкл с использованием в качестве матрицы 200 нг геномной ДНК ВасШик сайоТеиах, полученной так, как описывается в ссылочном примере 2-(1), и 100 пмоль ВкиШ-1 и 100 пмоль ВкиШ-8 в качестве праймеров. Затем осуществляют вторую ПЦР в объеме 100 мкл с использованием 1 мкл реакционной смеси после первой стадии ПЦР в качестве матрицы и 100 пмоль ВкиШ-3 и 100 пмоль ВкиШ-б в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для двух ПЦР используют ТаКаКа Тад-полимеразу (Такага 81ιιιζο) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 (первая ПЦР) или 30 (вторая ПЦР) циклов - 94°С в течение 30 с, 45°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин.
У амплифицированного фрагмента ДНК размером около 450 п.о. тупят концы с использованием Т4 ДНК-полимеразы (Такага δΐιιιζο). и затем его подвергают электрофрезу в агарозном геле и извлекают амплифицированный фрагмент ДНК около 450 п.о. Фрагмент ДНК длиной около 450 п.о. лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с рИС119 (Такага δΐιιιζο). расщепленной 8та1 (Такага 81ιιιζο). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйепсЫа сой 1Μ109. Полученные трансформанты культивируют и получают плазмиду рВСА3204, в которую встроен фрагмент ДНК длиной около 450 п.о.
(2) . Клонирование гена РНКазы ΗΙΙΙ с использованием метода гибридизации по Саузерну.
Определяют нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в рВСА3204, полученную в ссылочном примере 3(1). На основе определенной нуклеотидной последовательности синтезируют праймеры ΚΝΙΙΙ-83 и ВсаКШП-3, представленные 8Еф ΙΌ Νο 14 и 15. Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием ΚΝΙΙΙ-83 и ВсаКМП-3 в качестве праймеров и рВСА3204 в качестве матрицы. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Ζ-Тад (Такага 81ιιιζο) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 98°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 20 с. После реакции реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом, осаждению этанолом и электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля фрагмент ДНК длиной примерно 0,4 т.п.о. Фрагмент ДНК длиной около 0,4 т.п.о. метят с использованием набора ΌΙΟ ΌΝΑ ЬаЬе1шд К11 (Вοейπηде^ Маппйет), и получают зонд.
Геномную ДНК ВасШик са^Темх (10 мкг), полученную в ссылочном примере 2-(1), полностью расщепляют ВатШ, ΕοοΚΙ, ΗίηάΙΙΙ, ΡκΐΙ или ХЬа! (все от Такага 81ιιιζο). Затем половину каждого гидролизата подвергают электрофорезу в агарозном геле. ДНК из агарозного геля переносят на нейлоновую мембрану с использованием 0,4 N раствора гидроксида натрия и фиксируют при 120°С в течение 30 мин. Мембрану предварительно инкубируют при б0°С в течение 4 ч в запаянном мешке, содержащем 30 мл буфера для гибридизации [43,4 г/л хлорида натрия, 17,б г/л цитрата натрия, 1% блокирующего вещества (Вοейπηде^ Маппйе1т), 0,1% Ν-лауроилсаркозина, 0,02% лаурилсульфата натрия (8Ό8)], и затем инкубируют при б0°С в течение 1б ч в запаянном мешке, содержащем 5 мл буфера для гибридизации, содержащем зонд.
Мембрану дважды промывают 50 мл 2 х 88С (17,5 г/л №С1, 8,8 г/л цитрата натрия), содержащим 0,1% 8Ό8, при комнатной температуре и дважды 50 мл 0,5 х 88С (4,3 г/л хлорида натрия, 1,9 г/л цитрата натрия), содержащим 0,1% 8Ό8, при 45°С. Затем детектируют фрагмент Ε^ΚΙ размером около 8 т.п.о., фрагмент ΡκΐΙ около 4,5 т.п.о. и фрагмент ΗίπάΙΙΙ около 1 т.п.о., имеющие последовательности, комплементарные зонду, с использованием набора для обнаружения нуклеиновых кислот ΌΙΟ (Вοей^^ηде^ Маппйет).
Оставшуюся половину геномной ДНК ВасШик са1άοΐеηаx, полностью расщепленную ΡκΐΙ, подвергают электрофорезу в агарозном геле. Из геля извлекают фрагменты ΡκΐΙ размером около 4,5 т.п.о. Затем фрагменты ДНК лигируют с плазмидным вектором рТУ119Н расщепленным ΡκΐΙ и дефосфорилированным щелочной фосфатазой (Такага 81ιιιζο). Лигазную смесь используют для трансформации ЕксйепсЫа той 1Μ109.
Осуществляют ПЦР в объеме 50 мкл с использованием ΚΝΙΙΙ-83 и ВсаКМП-3 в качестве праймеров и одной из колоний в качестве матрицы, с целью отбора колонии, предположительно содержащей ген РНКазы ΗΙΙΙ. Для ПЦР используют ТаКаКа-Ζ Тад-полимеразу (Такага 81ιιιζο) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 98°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 20 с. В результате обнаруживают, что ген, представляющий интерес, содержится в колонии № 88.
Осуществляют ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды, выделенной из колонии № 88, и пары праймеров ΚΝ-Ν (Такага 81ιιιζο) и ВсаКМП-3 или пары праймеров М4 (Такага 81ιιιζο) и ΚΝΙΙΙ-83 для того, чтобы проверить, содержится или нет в плазмиде полный ген РНКазы ΗΙΙΙ. В результате обнаруживают, что полный ген РНКазы ΗΙΙΙ содержится в плазмиде, которую обозначают рВСА3Р88.
(3) . Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК гена РНКазы ΗΙΙΙ.
Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рВСА3Р88, полученную в ссылочном примере 3-(2), определяют дидезоксиметодом.
Анализ определенной нуклеотидной последовательности показывает наличие открытой рамки считывания, кодирующей аминокислотную последовательность, содержащую Ν-концевую аминокислотную последовательность РНКазы ΗΙΙΙ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания и ами
- 33 005739 нокислотная последовательность РНКазы НШ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показаны в ЗЕО ГО Ио 16 и ЗЕО ГО Ио 17 соответственно.
(4) . Конструирование плазмиды для экспрессии РНКазы НШ.
Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы плазмиды рВСА3Р88, описанной в ссылочном примере 3-(2), праймера ВсаВИШИбе, представленного ЗЕО ГО Ио 18, сконструированного с учетом последовательности вблизи вышеуказанной открытой рамки считывания для РНКазы НШ, и М13-праймера М4 (Такага З1шхо). В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ДНК-полимеразу РугоЬек! (Такага З1шхо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 3 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК размером около 4 т.п.о. расщепляют NбеI (Такага З1шхо) и подвергают электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля фрагмент ДНК около 1,4 т.п.о. Фрагмент ДНК длиной около 1,4 т.п.о. лигируют с рТУ119Иб (плазмида, в которой сайт Исо1 в рТУ119И превращен в сайт ИбеЦ которая расщеплена NбеI и дефосфорилирована щелочной фосфатазой (Такага ЗНихо). Лигазную смесь используют для трансформации ЕкскепсЫа сой 1М109.
Затем осуществляют ПЦР в объеме 50 мкл с использованием одной из колоний в качестве матрицы и ВИ-И (Такага З1шхо) и ВсаВИШ-3 в качестве праймеров для скрининга плазмиды, в которой ген РНКазы НШ во фрагменте NбеI расположен по направлению транскрипции (бо\упк1геат) от 1аспромотора в векторе рТУ119Иб. Затем отбирают колонию, предположительно содержащую ген РНКазы НШ. Для ПЦР в качестве ДНК-полимеразы используют ТаКаВа-Ζ Тад (Такага З1шхо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 98°С в течение 0 с, 55°С в течение 0 с и 72°С в течение 20 с. В результате обнаруживают, что плазмиду, в которой ген РНКазы НШ во фрагменте NбеI расположен по направлению транскрипции от 1ас-промотора в векторе рТУ119Иб, содержит колония № 2. Такую плазмиду обозначают рВСА3Иб2.
Определение дидезокси-методом нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду, показывает, что не имеется мутаций из-за ПЦР, за исключением того, что инициирующий кодон СТС заменяется на АТС.
Штамм ЕксйегюЫа сой 1М109, трансформированный плазмидой рВСА3Иб2, был обозначен и указывается как ЕксйейсШа сой ДМ 109/ рВСА3Иб2, депонирован 5 сентября 2000 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (!п1егпа1юпа1 Ра1еп1 Огдап1кт Лерокйагу, Иайопа1 [пкП(и1е о£ Абуапсеб !пбик1г1а1 Заепсе апб Тес1то1оду, АШТ ТкикиЬа Сеп1га1 6, 11, Н1дакЫ 1-скоте, ТкикиЬа-кЫ, ФагакЕкеп 305-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕВМ ВР7653.
(5) . Получение очищенного препарата РНКазы НШ.
ЕксйепсЫа сой 1М109, трансформированную рВСА3Иб2, полученную в ссылочном примере 3-(4), инокулируют в 2 л среды ЕВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 39,6 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об./мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, нагревают при 60°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом получают 39,8 мл прогретого супернатанта.
Прогретый супернатант наносят на колонку ВЕЗОИВСЕ О (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкйат Рйагташа Вю1есй). В результате РНКаза НШ сходит с колонки ВЕЗОИВСЕ О в свободном объеме.
Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы НШ (45 мл) диализуют против 2 л буфера В [50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА] в течение 2 ч. Диализ повторяют еще два раза в тех же условиях. Диализованный раствор фермента (55,8 мл) наносят на колонку ВЕЗОИВСЕ О (Атегкйат Рйагташа Вю1есй), уравновешенную буфером В, и элюируют линейным градиентом ИаС1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу НШ, элюированную при примерно 105 мМ ИаС1.
К 7,0 мл фракции добавляют буфер В, содержащий 1 М ИаС1, для получения концентрации ИаС1 150 мМ. Смесь наносят на колонку с Н1Тгар-гепарином (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенную буфером В, содержащим 150 мМ ИаС1. В результате РНКаза НШ сходит с колонки с Н1Тгар-гепарином в свободном объеме.
Фракцию РНКазы НШ (7,5 мл), сошедшую с колонки в свободном объеме, концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сеп1псоп-10 (Аписон). Концентрат (190 мкл) подвергают гельфильтрации на колонке Зирегбех 200 (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ ИаС1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазу НШ в положении, соответствующем молекулярной массе в 33 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы НШ в мономерной форме.
Элюированную таким образом РНКазу НШ используют в качестве препарата Вса РНКазы НШ.
- 34 005739
Ферментативную активность полученного таким образом препарата Вса РНКазы ΗΙΙΙ измеряют следующим образом.
Реакционную смесь (100 мкл) [20 мМ ΗΕΡΕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 0,01% бычий сывороточный альбумин (Такага 81шхо). 1% диметилсульфоксид, 4 мМ ацетат магния, 20 мкг/мл поли(бТ) (Атегзйат Рйагташа Вю!есй), 30 мкг/мл поли(гА) (Атегзйат Рйагтас1а Вю!есй)], икубированную при 40°С, добавляют к 1 мкл препарата Вса РНКазы ΗΙΙΙ. Смесь оставляют реагировать при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливают, добавляя 10 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Затем измеряют поглощение при 260 нм. В результате для препарата Вса РНКазы ΗΙΙΙ наблюдают активность РНКазы Н.
Ссылочный пример 4. Клонирование гена РНКазы ΗΙΙ Ругососсиз Гипозиз.
(1) . Получение геномной ДНК из Ругососсиз Гитюзиз.
Среду (2 л), содержащую 1% триптона (Όίίοο ЕаЬота!ог1ез), 0,5% дрожжевого экстракта (Όίίοο ЬаЬогаФпез), 1% растворимого крахмала (Ыаса1а1 Тездие), 3,5% Еипагше 8 зо11б (1атаипе ЕаЬогаФту), 0,5% Еипагше 8 йдшб (1атапие ЕаЬога!огу), 0,003% Мд8О4, 0,001% ЫаС1, 0,0001% Ее8О4 · 7Η2Ο, 0,0001% Со8О4, 0,0001% СаС12.· 7Η2Ο, 0,0001% Ζη8Ο4, 0,1 ч/млн Си8О4 · 5Η2Ο, 0,1 ч/млн КА1(8О4)2, 0,1 ч/млн Η3ΒΟ3, 0,1 ч/млн Ыа2МоО4.· 2Η20 и 0,25 ч/млн Νίί,’Ε.· 6Η2Ο, помещают в 2-л бутыль, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин, барботируют газообразным азотом для удаления растворенного кислорода, затем в среду инокулируют Ругососсиз Гипозиз (приобретенную у ЭеШзсйе 8атт1ипд уоп М1кгоогдашзтеп; Ό8Μ3638) и культивируют при 95°С в течение 16 ч без встряхивания. После культивирования клетки собирают центрифугированием.
Затем полученные клетки суспендируют в 4 мл 25% сахарозы, 50 мМ Трис-ΗΟ (рН 8,0). Добавляют к смеси 0,4 мл 10 мг/мл хлорида лизоцима (Ыаса1а1 Тездие) в воде. Смесь оставляют реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 24 мл смеси, содержащей 150 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-ΗΟ (рН 8,0), 0,2 мл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 8йихо) и 2 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После реакции смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом с последующим осаждением этанолом, и получают примерно 1 мг геномной ДНК.
(2) . Клонирование гена РНКазы ΙΙ.
Полная геномная последовательность Ругососсиз Гипозиз опубликована [ΌΝΑ Кезеагсй, 5:55-76 (1998)]. Известно существование в геноме одного гена, кодирующего гомолог РНКазы НИ (РН1650) (8ЕО ΙΌ Νο 19, домашняя страница №11юпа1 !пз11(и1е оГ Тесйпо1оду апб Еуа1и!юп йир://\\л\лулШе.до.)р/).
Исследуют гомологию между геном РШ650 и частично опубликованной геномной последовательностью Ругососсиз Гипозиз (домашняя страница Ишуетзйу оГ ИГай, ИГасй Сепоте Сеп1ет: 1Шр://\\л\л\\8епотел11асй.еби/зедиепсе.й1т1). В результате обнаруживают высоко гомологичную последовательность. На базе гомологичной последовательности синтезируют праймеры 1650Нбе (8ЕО ΙΌ Νο 20) и 1650Ват (8ЕО ΙΌ Νο 21).
Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 200 нг геномной ДНК Ругососсиз Гипозиз, полученной в ссылочном примере 4-(1), и 20 пмоль 1650Ше и 20 пмоль 1650Ваш в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Ех Тад (Такага 8йихо) согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК размером около 0,7 т.п.о. расщепляют NбеI и ВашШ (обе от Такага 8йихо). Полученный фрагмент ДНК встраивают между сайтом NбеI и сайтом ВашШ в плазмидном векторе рЕТ3а (№уадеп), для получения плазмиды рРЕИ220.
(3) . Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген РНКазы НИ.
Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рРЕИ220, полученную в ссылочном примере 4-(2), определяют дидезокси-методом.
Анализ определенной нуклеотидной последовательности показывает существование открытой рамки считывания, предположительно кодирующей РНКазу НИ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания показана в 8ЕО ΙΌ Νο 22. Аминокислотная последовательность РНКазы ΗΙΙ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в 8ЕО ΙΌ Νο 23.
Штамм ЕзсйепсЫа сой 1М109, трансформированный плазмидой рРЕИ220, был обозначен и указывается как ЕзсйепсЫа сой 1М109/рРЕи220, депонирован 5 сентября 2000 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, ([п1егпа1юпа1 Ра!еп1 Отдашзт Оерозйату, №1йопа1 !пз11(и1е оГ Абуапсеб !пбиз1г1а1 8с1епсе апб Тесйпо1оду, АКТ ТзикиЬа Сеп1та1 6, 1-1, ШдазЫ 1-сйоте, ТзикиЬа-зЫ, !Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7654.
(4) . Получение очищенного препарата РНКазы НИ.
ЕзсйепсЫа сой ΗΜ8174 (№уадеп) трансформируют рРЕИ220, полученной в ссылочном примере 4(2). Полученную ЕзсйепсЫа сой ΗΜ8174 (ОЕ3), содержащую рРЕИ220, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 66,0 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ ТрисШС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обраба- 35 005739 тывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об./мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, прогревают при 60°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом получают 61,5 мл прогретого супернатанта.
Прогретый супернатант наносят на колонку КЕ8ОИКСЕ О (Атегзйат Рйагтасйа Вю!есй), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегзйат Рйагтасйа Вю!есй). В результате РНКазаНП сходит с колонки КЕ8ОИКСЕ О в свободном объеме.
Сошедшую в свободном объеме с колонки фракцию РНКазыНП (60,0 мл) наносят на колонку КЕ8ОИКСЕ 8 (Атегзйат Рйагтасйа Вю!есй), уравновешенную буфером А, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазуНП, элюированную при примерно 150 мМ №С1. Фракцию РНКазыНП (2,0 мл) концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сеп1псоп-10 (Анисов). Концентрат (250 мкл) подвергают гель-фильтрации на колонке 8ирегбех 200 (Атегзйат Рйагтасйа Вю!есй), уравновешенной 50 мМ ТрисНС1 (рН 8,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазуНП в положении, соответствующем молекулярной массе 17 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы Н11 в мономерной форме.
Элюированную таким образом РНКазу Н11 используют в качестве препарата Р£ц РНКазы Н11.
Ферментативную активность полученного таким образом препарата Р£ц РНКазы Н11 измеряют так, как описывается в ссылочном примере З-(5). В результате в препарате Р£ц РНКазы Н11 наблюдают активность РНКазы Н.
Ссылочный пример 5. Клонирование гена РНКазыНП ТйегтоЮда тапйта.
(1) . Получение геномной ДНК из ТйегтоЮда тагШта.
Среду (2 л), содержащую 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% растворимого крахмала, З,5% 1атагше 8 8о11б, 0,5% 1атагше 8 I .кцпсЕ 0,00З% Мд8О4, 0,001% №С1, 0,0001% Ее8О4-7Н2О, 0,0001% Со8О4, 0,0001% СаС12-7Н2О, 0,0001% 2п8О4, 0,1 ч/млн Си8О4-5Н2О, 0,1 ч/млн КА1(8О4)2, 0,1 ч/млн НЗВОЗ, 0,1 ч/млн №12МоО.-г2Н2О и 0,25 ч/млн Н|С12-6Н2О, помещают в 2-л бутыль, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин, барботируют газообразным азотом для удаления растворенного кислорода, затем в среду инокулируют ТйегтоЮда тапйта (приобретенную у ЭеШзсйе 8атт1ипд уоп Мйкгоогдапктеп ипб 2е11кийигеп СтЪН/ Э8МЗ109) и культивируют при 85°С в течение 16 ч без встряхивания.
Затем клетки, собранные центрифугированием из З00 мл культуры, суспендируют в З мл ТЕ-буфера [10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА]. Добавляют к смеси 150 мкл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия (№са1ай Тезсще) и 15 мкл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 8йнхо). Смесь инкубируют при З7°С в течение 1 ч. После реакции к смеси добавляют 0,5 мл 5 М раствора №С1. После тщательного перемешивания к смеси добавляют 0,4 мл раствора СТАВ-ЫаС1 [10% бромида цетилтриметиламмония (№са1а1 Тездне), 0,7 М №С1]. После тщательного перемешивания смесь инкубируют при 65°С в течение 10 мин. К смеси добавляют 1,5 мл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1, об./об.). Смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и центрифугируют при 20000 х д в течение 5 мин. После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют равный объем смеси фенола, насыщенного 100 мМ Трис-НС1 (рН 8,0)/хлороформа/изоамилового спирта (25:24:1, об./об.). Смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют при 20000 х д в течение 5 мин. После центрифугирования к супернатанту добавляют 0,6 об. 2-пропанола. Осадок, полученный центрифугированием при 10000 х д в течение 5 мин, промывают 70% этанолом в воде, сушат на воздухе и затем растворяют в 200 мкл ТЕ, получая раствор геномной ДНК.
(2) . Клонирование гена РНКазы Н11.
На базе нуклеотидной последовательности части, идентифицированной как ген РНКазы Н11 в нуклеотидной последовательности геномной ДНК ТйегтоЮда тапйта (ййр://^те^.Пдг.огд/!бЪ/ СМК/Ъ!т/й!тк/8р1а5йРаде.й!т1), синтезируют олигонуклеотиды 915-Е1, 915-Е2, 915-К1 и 915-К2, представленные 8ЕО ΙΌ № 24-27 для того, чтобы получить амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий ген РНКазы Н, путем осуществления ПЦР с использованием геномной ДНК ТйегтоЮда тапйта в качестве матрицы.
ПЦР осуществляют с использованием геномной ДНК ТйегтоЮда тапйта, полученной в ссылочном примере 5-(1), в качестве матрицы и 915-Е1 и 915-К1, 915-Е1 и 915-К2, 915-Е2 и 915-К1 или 915-Е2 и 915-К2 в качестве пар праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Ех Тад согласно приложенному протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 циклов - 95°С в течение 0,5 мин, 55°С в течение 0,5 мин и 72°С в течение 1,5 мин. После реакции соответствующие продукты ПЦР подвергают электрофорезу в агарозном геле, и экстрагируют и очищают амплифицированные фрагменты ДНК длиной около 0,7 т.п.о. ДНК, амплифицированные с использованием пары праймеров 915-Е1 и 915-К1 или 915-Е1 и 915-К2, расщепляют НшбШ и ХЪа1 (обе от Такага 8йнхо) и лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с рИС19, расщепленной НйпбШ и ХЪаЕ Лигазную смесь используют для трансформации Езсйепсййа сой ДМ109. Полученные транформанты культивируют, и выделяют плазмид- З6 005739 ные ДНК, в которые встроены ДНК длиной около 0,7 т.п.о. В результате получают плазмиды № 1 и № 2, содержащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Р1 и 915-К1, и плазмиды № 3 и № 4, содержащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Р1 и 915-К2. Кроме того, ДНК, амплифициро в энные с использованием пары праймеров 915-Р2 и 915-К1 или 915-Р2 и 915-К2, расщепляют №о1 (Такага 8йто) и ХЬа1 и лигируют с использованием Т4 ДНК-лигазы с ρΤν119Ν (Такага 8йто), расщепленной №о1 и ХЬа1. Лигазную смесь используют для трансформации ЕзсйепсЫа сой ΙΜ109.
Полученные транформанты культивируют и получают плазмидные ДНК, в которые встроены ДНК размером около 0,7 т.п.о. В результате получают плазмиды № 5 и № 6, содержащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Р2 и 915-К1, и плазмиды № 7 и № 8, содержащие ДНК, амплифицированные с использованием 915-Р2 и 915-К2.
Штамм ЕксйепсЫа сой ΙΜ109, трэнсформировэнный плазмидой № 7, был обозначен и указывается как ЕксйепсЫа сой •/МИО/рТМ-КУН, депонирован 5 сентября 2000 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микрооргзнизмов, (1п!егпайопа1 Ра1еШ ОгдапЦт Иерокйагу, №йопа1 [пкШШе о£ Абуапсеб 1пби51па1 8сйепсе апб Тесйпо1оду, А18Т ТкикиЬа СеШга1 6, 1-1, НйдакИ 1сйоте, Т5икиЬа-5Й1, 1Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером РЕЕМ ВР-7 652.
(3) . Экспрессия гена РНКазы Н11 ТйегтоЮда тапйта.
ЕксйепсЫа сой ΙΜ109, трансформированную одной из плазмид №№ 1-7 или рИС19, инокулируют в 5 мл среды ЬВ (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л №С1 рН 7,2), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С. Когда поглощение при 660 нм достигнет 0,5, к смеси добавляют изопропил-Р-Э-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 1 мМ, и клетки культивируют в течение ночи. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера и обрабатывают ультразвуком. Обработанную ультразвуком суспензию прогревают при 80°С в течение 10 мин. Супернатант, полученный центрифугированием, используют в качестве грубого клеточного экстракта. Измеряют поглощение с использованием грубого клеточного экстракта, как описывается в ссылочном примере 2-(5). В результате, когда реакцию проводят в присутствии МпС12, поглощение при 260 нм в каждой из реакционных смесей, в которой используют грубые клеточные экстракты, полученные из ЕксйепсЫа сой ΙΜ109, содержащие плазмиды №№ 3, 5, 6 или 7, явно выше, чем поглощение реакционной смеси, в которой используют грубый клеточный экстракт из Е5сйепсййа сой ΙΜ109, содержащей рИС19. Таким образом, демонстрируется, что плазмиды №№ 3, 5, 6 и 7 содержат гены РНКазы Н, и что Е^сйепсййа сой, содержащая одну из указанных плазмид, экспрессирует активность РНКазы Н.
Определяют частичные нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, встроенных в плазмиды, демонстрирующие экспрессию активностей в Е^сйепсййа сой. Анализ установленных нуклеотидных последовательностей выявляет наличие открытой рамки считывания, предположительно кодирующей РНКазуНП. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания приведена в 8ЕЦ ΙΌ № 143. Аминокислотная последовательность, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в 8ЕЦ ΙΌ № 144. Затем обнаруживают, что наблюдается одно замещение основания, которое предположительно образуется в результате ПЦР, в участке нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду № 7, что приводит к изменению кодируемого аминокислотного остатка.
(4) . Получение очищенного препарата РНКазы Н11.
ЕксйепсЫа сой ΙΜ109 трансформируют ρΤΜ-КNН. полученной в ссылочном примере 5-(2). Полученную Е^сйепсййа сой ΙΜ109, содержащую ρΤΜ-КNН. инокулируют в 1 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°с в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 31,0 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, прогревают при 70°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин, и собирают супернатант. Таким образом получают 32,0 мл прогретого супернатанта.
Прогретый супернатант наносят на колонку КЕ8ОиКСЕ Ц (Атегайат Рйагтасйа Вю1есй), уравновешенную буфером С [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин], и хроматографируют с использованием системы РРЬС (Атегайат Рйагтасйа Вю1есй). В результате РНКаза Н11 сходит с колонки КЕ8ОиВСЕ О в свободном объеме. Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы Н11 (32,5 мл) наносят на колонку КЕ8ОиКСЕ 8 (Атегайат Рйагтасйа Вю1есй), уравновешенную буфером С, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы РРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 240 мМ ИаС1. Фракцию РНКазы Н11 (2,0 мл) наносят на колонку РЭ-10 (Атегайат Рйагтасйа Вю1есй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ йаС1. Полученный элюат (3,5 мл) наносят на колонку с НйТгар-гепарином (Атег5йат Рйагтасйа Вю1есй), уравновешенную буфером С, содержащим 50 мМ ИаС1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы РРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 295 мМ ИаС1. Элюированную таким образом РНКазу Н11 используют в качестве препарата Тта РНКазы Н11.
- 37 005739
Ферментативную активность полученного таким образом препарата Тта РНКазыНП измеряют так, как описывается в ссылочном примере 2-(6). В результате в препарате Тта РНКазы НИ наблюдают активность РНКазы Н.
Ссылочный пример 6. Клонирование гена РНКазыНШ из Ругососсик йопкокйи.
(1) . Получение геномной ДНК из Ругососсик йопкокйн Среду (2 л), содержащую 1% триптона (Э|Гсо йаЬогаЮпек), 0,5% дрожжевого экстракта (Эйсо ЬаЬогаЫпек), 1% растворимого крахмала (Ыаса1а1 Тексще), 3,5% Ытаппе 8 8ойб (Ытаппе ЬаЬога1огу), 0,5% Ытаппе 8 Ыс.|ш6 (Ытаппе ЬаЬога1огу), 0,003% Мд8О4, 0,001% ЫаС1, 0,0001% Ее8О4-7Н2О, 0,0001% Со8О4, 0,0001% СаС12-7Н2О, 0,0001% Ζη8Ο4, 0,1 ч/млн Си8О4-5Н2О, 0,1 ч/млн КА1(8О4)2, 0,1 ч/млн Н3ВО3, 0,1 ч/млн Ыа2МоО4-2Н2О и 0,25 ч/млн Νίί.’Ε· 6Н2О, помещают в 2-л бутыль, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин, барботируют газообразным азотом для удаления растворенного кислорода, затем в среду инокулируют Ругососсик йопкокйи ОТЗ (приобретенную у ЫкШЫе оГ Рйукюа1 апб Сйетка1 Кекеагсй (ΚΚΕΝ); 1СМ9974) и культивируют при 95°С в течение 16 ч без встряхивания. После культивирования клетки собирают центрифугированием.
Затем клетки суспендируют в 4 мл 25% сахарозы, 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к смеси 0,4 мл 10 мг/мл хлорида лизоцима (№1сак-п Тексще) в воде. Смесь оставляют реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 24 мл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 0,2 мл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 81шхо) и 2 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч.
После реакции смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом с последующим осаждением этанолом и получают примерно 1 мг геномной ДНК.
(2) . Клонирование гена РНКазы II.
Полная геномная последовательность Ругососсик йопкокйи опубликована [ΌΝΑ Кекеагсй, 5:55-76 (1998)]. Известно существование в геноме одного гена, кодирующего гомолог РНКазы НИ (РН1650) (8ЕО ГО Νο 145, домашняя страница №бопа1 [пк111и1е оГ Тесйпо1оду апб ЕгаЫйоп йир://\\л\лу.пЦе.до.]р/).
На базе последовательности гена РН1650 синтезируют праймеры РйоШе (8ЕО ГО Νο 146) и РйоВат (8 ЕС) ГО Νο 147).
Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 100 нг геномной ДНК Ругососсик йопкокйи, полученной в ссылочном примере 6-(1), и 20 пмоль РйоШе и 20 пмоль РйоВат в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ТаКаКа Ех Тад (Такага 8йпхо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 40 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 0,7 т.п.о. расщепляют NбеI и ВатШ (обе от Такага 8йпхо) . Затем создают плазмиду рРНО238, встраивая полученный фрагмент ДНК между сайтами NбеI и ВатШ в плазмидном векторе рЕТ3а (№уадеп).
(3) . Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген РНКазы НИ.
Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рРНО238, полученную в ссылочном примере 6-(2), определяют дидезокси-методом.
Анализ определенной нуклеотидной последовательности выявляет открытую рамку считывания, предположительно кодирующую РНКазуНИ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания представлена в 8ЕО ГО Νο 148. Аминокислотная последовательность РНКазы НИ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в 8ЕО ГО Νο 149.
Штамм ЕксйепсЫа со11 1М109, трансформированный плазмидой рРНО238, был обозначен и указывается как ЕксйепсЫа со11 !М109/рРНО238, депонирован 22 февраля 2001 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов (!п1егпа1юпа1 Ра1еп1 ОгдаЫкт Эерокйагу, №1йопа1 !пк11(и(е оГ Абуапсеб [пбик1па1 8аепсе апб Тесйпо1оду, АКТ ТкикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, Н1дакЫ 1-сйоте, ТкикиЬа-кЫ, !Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7692.
(4) . Получение очищенного препарата РНКазы НШ.
ЕксйепсЫа со11 НМ8174(ЭЕ3) (№уадеп) трансформируют рРНО238, полученной в ссылочном примере 6-(2). Полученную ЕксйепсЫа сой НМ8174(ЭЕ3), содержащую рРНО238, инокулируют в 1 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 34,3 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об./мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, прогревают при 80°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом получают 33,5 мл прогретого супернатанта.
Прогретый супернатант наносят на колонку КЕ8ОИКСЕ О (Атегкйат РйагтасЫ Вю1есй), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (Атегкйат РйагтасЫ Вю1есй). В результате РНКаза НИ сходит с колонки КЕ8ОИКСЕ О в свободном объеме.
Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы НИ (35,0 мл) диализуют против 2 л буфера В [50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА] в течение 2 ч. Диализ повторяют еще два раза. Диали
- 38 005739 зованный раствор фермента (34,5 мл) наносят на колонку КЕ8ОИКСЕ 8 (Атегкйат Рйагтасйа Вю!есй), уравновешенную буфером В, и элюируют линейным градиентом №-1С1 от 0 до 500 мМ с использованием системы ЕРЬС. Получают фракцию, содержащую РНКазу ΗΙΙΙ, элюированную при примерно 155 мМ №С1.
Добавляют буфер В к 4,0 мл фракции, чтобы довести концентрацию №-1С1 до 50 мМ. Смесь наносят на колонку с НйТгар-гепарином (Атегкйат Рйагтасйа Вю!есй), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №-1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу НИ, элюированную при примерно 160 мМ №С1.
Фракцию РНКазы НИ (6,9 мл) концентрируют путем ультрафильтрации с использованием СеШпсои-10 (Аписон). Две части, выделенные каждая из 250 мкл концентрата, подвергают гель-фильтрации на колонке с 8ирегоке 6 (Атегкйат Рйагтасйа Вю!есй), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ №-1С.’1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазу НИ в положении, соответствующем молекулярной массе в 24,5 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы НИ в мономерной форме.
Элюированную таким образом РНКазу НИ используют в качестве препарата Рйо РНКазы НИ.
Ферментативную активность полученного таким образом препарата Рйо РНКазы НИ измеряют так, как описывается в ссылочном примере 3-(5). В результате в препарате Рйо РНКазы НИ наблюдают активность РНКазы Н.
Ссылочный пример 7. Клонирование гена РНКазы НИ из АгсйаеоДойнк ГиЩбик.
(1) . Получение геномной ДНК из Агсйаеод1ойик Ги1д1бик.
Клетки АгсйаеоДойнк Ги1д1бик (приобретенной у ОеШксйе 8атт1иид уои Мйкгоогдатктеи ииб 2е11кийигеи СтйН; Ό8Μ4139), собранные из 8 мл культуры, суспендируют в 100 мкл 25% сахарозы, 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к смеси 20 мкл 0,5 М ЭДТА и 10 мкл 10 мг/мл хлорида лизоцима Щаса1а1 Теэдие) в воде. Смеси дают реагировать при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 800 мкл смеси, содержащей 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 10 мкл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 8йнхо) и 50 мкл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После реакции смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом, осаждают этанолом и сушат на воздухе, и затем растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера, с получением раствора геномной ДНК.
(2) . Клонирование гена РНКазы НИ.
Полная геномная последовательность Агсйаеод1ойик ГиЩбик опубликована Щайге, 390:364-370 (1997)]. Известно существование одного гена, кодирующего гомолог РНКазы НШ (АЕ0621) (8ЕО ΙΌ № 150, й11р://тетете.11дг.огд/1бй/СМК/Ыт/й1т1к/8р1акйРаде.йЙт).
На основе последовательности гена АЕ0621 (8ЕО ΙΌ № 150) синтезируют праймеры АГ№бе (8ЕО ΙΌ № 151) и АГиВат (8ЕО ΙΌ № 152).
Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 30 нг геномной ДНК Агсйаеод1ойик ГиЩбик, полученной в ссылочном примере 7-(1), и 20 пмоль каждого из АГиШе и АГиВат в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для РСК используют ДНК-полимеразу Ругойек! (Такага 8йихо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 40 циклов 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 0,6 т.п.о. расщепляют NбеI и ВатН (обе от Такага 8йнхо). Затем получают плазмиду рАЕИ204, встраивая полученный фрагмент ДНК между сайтами NбеI и ВатШ в плазмидном векторе рТУ119Ш (плазмида, в которой сайт №ой в рТУ119Ш превращен в сайт ШеЦ (3) . Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген РНКазы НИ.
Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рАЕИ204, полученную в ссылочном примере 7-(2), определяют дидезокси-методом.
Анализ определенной нуклеотидной последовательности выявляет наличие открытой рамки считывания, предположительно кодирующей РНКазу НИ. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания показана в 8ЕО ΙΌ № 153. Аминокислотная последовательность РНКазы НИ, предсказанная на основании нуклеотидной последовательности, показана в 8ЕО ΙΌ № 154.
Штамм ЕксйепсЫа сой 1М109, трансформированный плазмидой рАЕИ204, был обозначен и указывается как ЕксйепсЫа сой 1М109/рАЕи204, депонирован 22 февраля 2001 г. (дата первоначального депозита) в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов ([п1егпа11опа1 Ра!еи1 Огдапйкт Оерокйагу, №Шопа1 Ι^ΐίω^ оГ Абуаисеб Шбик!^ 8аеисе аиб Тесйио1оду, АКТ Ткикийа Сеи1га1 6, 1-1, НщакЫ 1-сйоте, Ткикийа-кЫ, Шагай 305-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7691.
(4) . Получение очищенного препарата РНКазы НИ.
ЕксйепсЫа сой ГМ109 трансформируют рАЕи204, полученной в ссылочном примере 7-(2). Полученную ЕксйепсЫа сой ГМ109, содержащую рАЕИ204, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 37,1 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторид] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об./мин в течение 10 мин обрабо
- 39 005739 танной ультразвуком суспензии, прогревают при 70°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом получают 40,3 мл прогретого супернатанта.
Прогретый супернатант наносят на колонку ЯЕ8ОиЯСЕ О (АтегкЕат РЕагтааа Вю1есЕ), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (АтегкЕат РЕагтааа Вю1есЕ). В результате РНКаза Н11 сходит с колонки ЯЕ8ОиЯСЕ О в свободном объеме.
Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы Н11 наносят на колонку ЯЕ8ОиЯСЕ 8 (АтегкЕат РЕагтааа Вю1есЕ), уравновешенную буфером А, и хроматографируют с использованием системы ЕРЬС (АтегкЕат РЕагтааа Вю1есЕ). В результате РНКаза Н11 сходит в свободном объеме с колонки ЯЕ8ОиЯСЕ 8.
Сошедшую с колонки в свободном объеме фракцию РНКазы Н11 (40,0 мл) диализуют против 2 л буфера В [50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА], содержащего 50 мМ №С1, в течение 2 ч. Диализ повторяют еще два раза. Диализованный раствор фермента (40,2 мл) наносят на колонку с НГТгаргепарином (АтегкЕат РЕагтааа Вю1есЕ), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №101 от 50 до 550 мМ с использованием системы ЕРЬС. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу НШ, элюированную при примерно 240 мМ №С1.
Фракцию РНКазы Н11 (7,8 мл) концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сеп1псоп-10 (Аписон). Четыре части, выделенные, каждая, из 600 мкл концентрата, подвергают гельфильтрации на колонке с 8ирегоке 6 (АтегкЕат РЕагтааа Вю1есЕ), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате элюируют РНКазу Н11 в положении, соответствующем молекулярной массе в 30,0 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы Н11 в мономерной форме.
РНКазу Н11, элюированную так, как описано выше, используют в качестве препарата АЕи РНКазы НИ.
Ферментативную активность полученного таким образом препарата А£и РНКазы Н11 измеряют так, как описывается в ссылочном примере 3-(5). В результате в препарате А£и РНКазы Н11 наблюдают активность РНКазы Н.
Ссылочный пример 8.
Величину активности РНКазы Н из ЕксЕепсЫа со11, используемую в способе настоящего изобретения, измеряют согласно способу, описанному далее.
(1) . Получение растворов используемых реагентов.
Реакционная смесь для определения активности: в стерильной воде содержатся перечисленные далее вещества в указанных конечных концентрациях: 40 мМ Трис-гидрохлорид (рН 7,7 при 37°С), 4 мМ хлорид магния, 1 мМ ΌΤΤ, 0,003% В8А, 4% глицерин и 24 мкМ поли(бТ).
Раствор поли[8-3Н] адениловой кислоты: в 200 мкл стерильной воды вносят 370 кБк раствора поли [8-3Н] адениловой кислоты.
Раствор полиадениловой кислоты: полиадениловую кислоту разводят сверхчистой стерильной водой до концентрации 3 мМ.
Разведение раствора фермента: в стерильной воде в указанных конечных концентрациях содержатся следующие вещества:
мМ Трис-гидрохлорид (рН 7,5 при 37°С), 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА (рН 7,5 при 37°С), 30 мМ хлорид натрия и 50% глицерин.
Получение ДНК тимуса теленка, денатурированной под действием тепла: суспендируют 200 мг ДНК тимуса теленка и оставляют набухать в 100 мл ТЕ-буфера. Раствор разбавляют до концентрации 1 мг/мл стерильной сверхчистой водой, основываясь на поглощении в УФ-области при 260 нм. Разбавленный раствор нагревают при 100°С в течение 10 мин и затем быстро охлаждают на ледяной бане.
(2) . Способ измерения активности.
Раствор поли[8-3Н]адениловой кислоты (7 мкл) добавляют к 985 мкл реакционной смеси для определения активности, полученной выше в (1). Смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин. К смеси добавляют 8 мкл полиадениловой кислоты для получения конечной концентрации 24 мкМ. Затем смесь инкубируют при 37°С в течение 5 мин. Таким образом получают 1000 мкл реакционной смеси с поли [8-3Н]гА-поли-бТ. Затем 200 мкл реакционной смеси инкубируют при 30°С в течение 5 мин. К смеси добавляют 1 мкл подходящего серийного разведения раствора фермента. Для использования в последующих измерениях из реакционной смеси по времени отбирают 50 мкл каждого из образцов. Период времени в минутах от момента добавления фермента до момента отбора образца определяют как Υ. Готовят по 50 мкл реакционной смеси для подсчета общего числа импульсов (срт) и в качестве контроля, добавляя 1 мкл раствора для разведения фермента вместо раствора фермента. К образцу добавляют 100 мкл 100 мМ раствора пирофосфата натрия, 50 мкл раствора ДНК тимуса теленка, денатурированной под действием тепла, и 300 мкл 10% трихлоруксусной кислоты (300 мкл сверхчистой воды для измерения общего срт). Смесь инкубируют при 0°С в течение 5 мин и затем центрифугируют при 10000 об./мин в течение 10 мин. После центрифугирования помещают во флакон 250 мкл полученного супернатанта. Добав
- 40 005739 ляют 10 мл аквазола-2 (ΝΈΝ ЫГе Бс1епсе РгойисГз). Измеряют срт в жидкостном сцинтилляционном счетчике.
(3). Вычисление единиц.
Величину активности (в Е) для каждого фермента вычисляют согласно следующему уравнению:
Единиц/мл = {(измеренное срт - срт в контроле) х 1,2* х 20 х 1000 х степень разведения}200(мкл)/ (общее срт х У(мин) х 50(мкл) х 9**)
1,2* - количество, в нмоль, поли[8-3Н]гА-поли-йТ, соответствующее общему срт в расчете на 50 мкл.
9** - поправочный коэффициент.
Пример 1.
Способ настоящего изобретения используют для обнаружения энтерогеморрагической Е. сой О157.
Последовательности праймеров, используемых в данном примере, показаны в БЕЦ ΙΌ № 31-34 в перечне последовательностей. Конструируют комбинацию праймеров, каждый с последовательностью БЕЦ ΙΌ № 31 или 32, для обнаружения последовательности, кодирующей веротоксин (УТ) 1 Е. сой О157, и комбинацию праймеров, каждый с последовательностью БЕЦ ГО № 33 или 34, для обнаружения последовательности, кодирующей веротоксин 2 Е. сой О-157. В качестве матрицы используют экстракт, полученный культивированием энтерогеморрагической Е. сой О-157 (АТСС, инвентарный № 43895), сбором клеток, суспендированием клеток в стерильной воде при соответствующей плотности клеток и обработкой суспензии при 98°С в течение 10 мин. Состав реакционной смеси следующий: 27 мМ фосфатный буфер (рН 7,3), 0,01% бычий сывороточный альбумин (ВБА), 5% диметилсульфоксид (ДМСО), 1 мМ каждого йКТР, 8 мМ ацетат магния, 60 пмоль каждого праймера, ДНК как матрица (полученная экстракцией горячей водой), соответствующая 104-106 клеток, и стерильная вода до реакционного объема 48 мкл. Реакционную смесь денатурируют под действием тепла при 98°С в течение 1 мин и затем охлаждают до 55°С. К смеси добавляют 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ и 60 Е РНКазы Н Е. сой. Реакционную смесь инкубируют при 55°С в течение 60 мин. Затем смесь прогревают при 90°С в течение 2 мин для инактивации ферментов. По 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле М^есе-агароза 3:1 (Такага Бйихо). В результате можно обнаружить веротоксин 1 и 2 Е. сой О-157 с использованием соответствующей пары праймеров и ДНК в качестве матрицы, соответствующей 104 клеток, что подтверждает, что способ настоящего изобретения можно использовать как способ обнаружения вирулентных бактерий.
Пример 2.
(1) . Проверяют влияние типа буфера, используемого в способе настоящего изобретения. В данном примере используют праймеры для амплификации λ ДНК с последовательностями, представленными БЕЦ ГО № 39 и 40. Реакцию осуществляют следующим образом.
Коротко, 10 мкл смеси, содержащей по 120 пмоль каждого праймера, 0,01% водный раствор пропилендиамина и 10 нг или 1 нг ДНК в качестве матрицы, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают на льду для отжига праймеров к матричной ДНК. Амплифицированный продукт (1005 п.о.), полученный ПЦР с использованием λ ДНК (Такага Бйихо) в качестве матрицы и праймеров, представленных БЕЦ ГО Ν 41 и 42, который затем очищают с использованием Биргес02 (Такага Бйихо), используют в качестве матрицы.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буфера для реакции (42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3) и 42,5 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащего 0,625 мМ каждого из й№ТР, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (ВБА), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНКполимеразы ВсаВЕБТ, до конечного объема 50 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для подтверждения. Затем наблюдают наличие представляющих интерес амплифицированных фрагментов для обоих количеств матрицы. В частности, большее количество продукта амплификации получают в случае реакционной системы, содержащей буфер бицин-гидроксид калия (рН 8,5).
(2) . Проверяют улучшение реакционной способности за счет использования буфера НЕРЕБгидроксид калия. В качестве матрицы используют плазмидную ДНК рИС19 с фрагментом ДНК длиной около 150 п.о., встроенным в участок, содержащий множественные сайты для клонирования. Такую матрицу получают следующим образом.
Осуществляют ПЦР с использованием верхнего ПЦР-праймера рИС19 иррег 150 и ПЦР-праймера рИС19 1о\гег с последовательностями, представленными БЕЦ ГО № 134 и 135, и 100 пг плазмидной ДНК рИС19 в качестве матрицы. Полученный амплифицированный фрагмент очищают с использованием М1сгосоп-100, тупят концы с использованием набора для затупления ДНК (Такага Бйихо) и субклонируют в сайт НшсП плазмиды рИС19. Плазмиду с встроенным амплифицированным фрагментом используют для трансформации ЕзсйейсЫа сой ГМ 109. Трансформант культивируют. Плазмиду со встроенной ДНК очищают из клеток с использованием набора ОШСЕН р1азт1й т1ш кй (01адеп) и используют
- 41 005739 в качестве матрицы.
Фрагмент ДНК, амплифицированный ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК рИС19-150, полученной, как описано выше, и праймеров МСБ-Е и МСБ-К с нуклеотидными последовательностями, представленными БЕО ГО Ло 35 и 36, использовали в качестве матрицы. Праймеры МЕ2Л3(24) и МК1Л3(24) с нуклеотидными последовательностями, представленными БЕО ГО Ло 37 и 38, используют в качестве химерных олигонуклеотидных праймеров. Размер амплифицированного фрагмента, полученного с использованием комбинации указанных праймеров, составляет примерно 350 п.о.
В качестве буфера для проверки выбирают буферную систему НЕРЕБ-гидроксид калия. Калий фосфатную буферную систему и Трициновую буферную систему используют как контроли. Составы реакционных смесей указаны ниже.
Реакционная смесь А: 10 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента, 50 пмоль каждого из праймеров МЕ2Л3(24) и МК1Л3(24), 0,01% водный раствор пропилендиамина и стерильная дистиллированная вода до реакционного объема 10 мкл.
Реакционная смесь В: готовят три указанных далее типа.
Калий-фосфатная буферная система: готовят 40 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечной концентрации, 35 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5), 1,25% ДМСО, 0,0125% ВБА, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из йЛТР, 60 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ.
Трициновая буферная система: готовят 40 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечной концентрации, 42,5 мМ трициновый буфер (рН 8,7), 12,5 мМ хлорид калия, 12,5 мМ сульфат аммония, 1,25% ДМСО, 0,0125% ВБА, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из йЛТР, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ.
Буферная система НЕРЕБ-гидроксид калия: готовят 40 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечной концентрации, 25 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 1,25% ДМСО, 0,0125% ВБА, 5 мМ ацетат магния 0,625 мМ каждого из йЛТР, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНКполимеразы ВсаВЕБТ.
Реакционную смесь А денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 60 или 65°С и затем оставляют на льду. Одну из реакционных смесей В добавляют к реакционной смеси А на льду и смешивают для получения реакционного объема 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 60 или 65°С в течение 1 ч. После реакции их охлаждают до 4°С, и к каждой смеси добавляют 1/10 об. 0,5 М ЭДТА для прекращения реакции. По 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле ЛиБ1еуе-агароза 3:1. В результате в случае трех буферных систем независимо от используемой температуры реакции отмечают появление представляющих интерес амплифицированных фрагментов. В частности, в данном примере самое большое количество продукта амплификации и самую высокую реакционную способность наблюдают в случае буферной системы НЕРЕБ-гидроксид калия.
Пример 3.
(1). Проверяют условия, используемые в способе настоящего изобретения для отжига праймеров к матрице. Используют праймеры с нуклеотидными последовательностями, представленными БЕО ГО Ло 43 и 44, основанными на неполной нуклеотидной последовательности бактерии вида Е1ауоЬас!егшт БА0082, как описывается в XVО 97/32010 (депонирована 29 марта 1995 г. в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов (Й11егпа1юпа1 Ра!еп! Огдашзт Оерозйагу, Лайопа1 КзйШе о£ Айуапсей МиЗпа Баепсе апй Тесйпо1оду, АКТ ТзикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, Н1дазй1 1-сйоте, ТзикиЬа-зЫ, !Ьагак1 3058566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ Р-14872, и депонирована в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (Iηΐетайоηа1 Ра!еп! Огдашзт Оерозйагу, Лайопа1 КзйШе о£ Айуапсей Й1йиз1па1 Баепсе апй Тесйпо1оду, АКТ ТзикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, Н1дазй1 1-сйоте, ТзикиЬа-зЫ, !Ьагак1 305-8566), Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-5402 (дата требования для передачи международному депозитарному учреждению 15 февраля 1996)). В данном примере в качестве ДНК как матрицы используют амплифицированный продукт (573 п.о.), полученный ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК бактерии Е1ауоЬас!егшт БА-0082 и комбинации праймеров, представленных БЕО ГО Ло 45 и 46, который затем очищают с использованием Биргес02 (Такага Бйнхо). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 2 мкл одного из растворов для отжига (500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин или 0,05% пропилендиамин) добавляют к 120 пмоль каждого из праймеров. Каждую реакционную смесь, также содержащую 10 нг или 1 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента, в конечном объеме 10 мкл денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин. После денатурации смеси быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буфера (42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3) и 42,5 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащего 0,625 мМ каждого из йЛТР, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (ВБА), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ, до конечного объема 50 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 52°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 1. Фиг. 1 иллюстрирует результаты электрофореза реакционных смесей с использованием соответствующих сочетаний растворов для отжига и буферов. Полоса 1: маркер молекулярной массы (сту
- 42 005739 пенчатый маркер с шагом в 100 п.о., Такага 81шхо); полоса 2: пропилендиамин/Трицин (10 нг матрицы); полоса 3: пропилендиамин/НЕРЕ8 (10 нг матрицы); полоса 4: пропилендиамин/НЕРЕ8 (1 нг матрицы); полоса 5: пропилендиамин/Бицин (10 нг матрицы); полоса 6: пропилендиамин/Бицин (1 нг матрицы); полоса 7: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/Бицин (10 нг матрицы); полоса 8: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/Бицин (1 нг матрицы); полоса 9: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 10: пропилендиамин/Трицин (1 нг матрицы); полоса 11: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/Трицин (1 нг матрицы); полоса 12: пролилендиамин/НЕРЕ8 (1 нг матрицы); полоса 13: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/НЕРЕ8 (1 нг матрицы); полоса 14: пропилендиамин/Бицин (1 нг матрицы); и полоса 15: 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин/Бицин (1 нг матрицы).
Как видно на фиг. 1, большее количество представляющего интерес продукта амплификации получают, когда для отжига праймеров к матрице используют раствор для отжига, содержащий 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин, в случае любого из трех буферов независимо от количества ДНК, используемой в качестве матрицы. В частности, в данном примере хорошие результаты дает комбинация раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин, и буфера Бицин-гидроксид калия.
(2). Проверяют влияние раствора для отжига в случае, когда в качестве матрицы используют ПЦРамплифицированный фрагмент ДНК фага λ. В данном примере используют химерные олигонуклеотидные праймеры, описанные в примере 2(1). В качестве матричной ДНК используют ПЦРамплифицированный фрагмент, полученный в примере 2(1) или ДНК фага λ. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 2 мкл одного из трех типов растворов для отжига (500 мМ хлорид калия 8 мкМ спермидин, 0,05% пропилендиамин или стерильная вода) добавляют к 120 пмоль каждого праймера. Готовят по 10 мкл смесей, также содержащих 10 нг или 1 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента. Смеси денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буфера (42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3) и 42,5 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащего 0,625 мМ каждого из б№ГР, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8А), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО) , 30 Е РНКазы Н Е. со11 и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, до конечного объема 50 мкл. Реакционную смесь инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 2. Фиг. 2 иллюстрирует результаты электрофореза, показывающие результаты проверки сочетаний количеств матрицы, буферов для реакции и растворов для отжига. Полоса 1: маркер (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: 10 нг матрицы, сочетание Трицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 3: 1 нг матрицы, сочетание Трицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 4: 10 нг матрицы, сочетание Бицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 5: 1 нг матрицы, сочетание Бицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 6: 10 нг матрицы, сочетание НЕРЕ8/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 7: 1 нг матрицы, сочетание НЕРЕ8/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 8: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 9: 10 нг матрицы, сочетание Трицин/500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин; полоса 10: 1 нг матрицы, сочетание Трицин/пропилендиамин; полоса 11: 10 нг матрицы, сочетание Бицин/пропилендиамин; полоса 12: 1 нг матрицы, сочетание Бицин/пропилендиамин; полоса 13: 10 нг матрицы, сочетание НЕРЕ8/пропилендиамин; полоса 14: 1 нг матрицы, сочетание НЕРЕ8/пропилендиамин; полоса 15: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 16: 10 нг матрицы, сочетание Трицин/вода; полоса 17: 1 нг матрицы, сочетание Трицин/вода; полоса 18: 10 нг матрицы, сочетание Бицин/вода; полоса 19: 1 нг матрицы, сочетание Бицин/вода; полоса 20: 10 нг матрицы, сочетание НЕРЕ8/вода; и полоса 21: 1 нг матрицы, сочетание НЕРЕ8/вода.
Как видно на фиг. 2, представляющие интерес амплифицированные фрагменты наблюдают в случае соответствующих сочетаний трех буферов и трех растворов для отжига, независимо от количества матричной ДНК. В частности, установлено, что большее количество амплифицированного фрагмента получают с использованием сочетания Бицинового буфера и раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин.
Пример 4.
Проверяют влияние присутствия ингибитора обратной транскриптазы (ревертазы) в способе настоящего изобретения. В качестве ингибитора ревертазы используют фосфономуравьиную кислоту (РГА). В данном примере используют праймеры, представленные 8Е0 ГО № 47 и 48. Амплифицированный продукт (576 п.о.), полученный ПЦР с использованием геномной ДНК энтерогеморрагической Е. со11 0-157 в качестве матрицы и праймеров, представленных 8Е0 ГО № 49 и 50, затем очищают с использованием 8иргес02 (Такага Шшхо) и используют в качестве матричной ДНК. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, полученной добавлением 1 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента к 120 пмоль каждого праймера и 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают
- 43 005739 на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси для отжига до конечного объема 50 мкл добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из άΝΤΡ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8А), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, а также ΡΕΆ до концентрации 500 мкг/мл или 50 мкг/мкл. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. В качестве контроля готовят также систему без добавления ΡΕΆ. После реакции по 9 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 3. Фиг. 3 иллюстрирует результаты электрофореза, показывающие влияние ингибитора обратно-транскриптазной активности. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: без добавления ΡΕΆ; полоса 3: с добавлением ΡΕΆ в концентрации 500 мкг/мл; полоса 4: с добавлением ΡΕΆ в концентрации 50 мкг/мл.
Как видно на фиг. 3, когда добавляют ΡΕΆ, подавляется неспецифическая амплификация, и наблюдают амплификацию фрагмента, представляющего интерес. В частности, подтверждается, что продукт неспецифической амплификации, который наблюдают в системе без добавления ΡΕΆ, не образуется, а амплифицированный фрагмент, представляющий интерес, явно амплифицируется в системе, в которую ΡΕΆ добавляют в концентрации 500 мкг/мл.
Пример 5. Проверяют взаимосвязь между длиной амплифицируемого фрагмента и чувствительностью детекции в способе настоящего изобретения.
(1). Синтезируют праймеры для амплификации веротоксина ЕксйепсЫа сой 0-157, представленные 8ЕО ΙΌ Νο 51-53. Также используют химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в примере 4. Длина фрагмента, амплифицируемого с каждым сочетанием праймеров, составляет 247 п.о. (8ЕО ΙΌ Νο 51 и 48); 166 п.о. (8ЕО ΙΌ Νο 52 и 53); 206 п.о. (8ЕО ΙΌ Νο 52 и 48); 135 п.о. (8ЕЕ) ΙΌ Νο 47 и 53) и 173 п.о. (8ЕО ΙΌ Νο 47 и 48). В данном примере в качестве матрицы используют очищенный ПЦРамплифицированный фрагмент длиной 576 п.о., полученный в примере 4. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, содержащей 60 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина и от 10 фг до 10 нг ПЦР-амплифицированного фрагмента, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С в термоциклере Тйегша1 Сус1ег Ρе^8οηа1 (Такага δΐιιιζο) для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из άΝΤΡ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8Л), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. отЕ 5,5 Е ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т, и стерильную воду до конечного объема 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В качестве контроля осуществляют детекцию 10 фг-1 пг ПЦР-амплифицированного фрагмента с использованием праймеров, представленных 8ЕО ΙΌ Νο 54 и 55. Фрагмент длиной 135 п.о. амплифицируют с использованием сочетания указанных праймеров.
Готовят раствор для ПЦР (50 мкл), содержащий 60 пмоль каждого праймера, 5 мкл 10-кратного буфера Ех Тад (Такага δΐιιιζο). 1,25 Е ТаКаВа Ех Тад-ДНК-полимеразы (Такага δΐιιιζο) и 0,2 мМ каждого из άΝΤΡ. ПЦР осуществляют следующим образом: 25 или 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с (2 мин 38 с/цикл). После реакции по 1 мкл (ΚΑΝ) или 5 мкл (ПЦР) реакционных смесей подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 4 и в табл. 1.
Таблица 1
Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.)_______Предел детекции
ΙΟΑΝ (общее время 70 минут)
247 100 пг
168 100 фг
206 100 пг
135 10 фг
173 100 фг
ПЦР (25 циклов. общее время примерно 65 минут)
135 100 фг
ПЦР (30 циклов. общее время примерно 80 минут)
135 10 фг
Фиг. 4 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают пределы обнаружения при амплификации цепи длиной в 135 п.о., осуществляемой методом ΚΑΝ (наносится 1/50 реакционной
- 44 005739 смеси) и ПЦР (наносится 1/10 реакционной смеси). Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: ΙΕΆΝ с использованием 1 пг матрицы; полоса 3: ΙΕΆΝ с использованием 100 фг матрицы; полоса 4: ΙΕΆΝ с использованием 10 фг матрицы; полоса 5: ПЦР (25 циклов) с использованием 1 пг матрицы; полоса 6: ПЦР (25 циклов) с использованием 100 фг матрицы; полоса 7: ПЦР (25 циклов) с использованием 10 фг матрицы; полоса 8: ПЦР (30 циклов) с использованием 1 пг матрицы; полоса 9: ПЦР (30 циклов) с использованием 100 фг матрицы; полоса 10: ПЦР (30 циклов) с использованием 10 фг матрицы.
Как видно из табл. 1, подтверждается, что почти такая же чувствительность детекции, как при ПЦР, достигается при ΙΕΆΝ. Кроме того, общее время реакции для ПЦР составляет примерно 80 мин, в то время как время реакции, необходимое для получения такой же чувствительность детекции с использованием способа настоящего изобретения, составляет 70 мин, что подтверждает, что время реакции можно сократить, применяя способ настоящего изобретения.
(2). Синтезируют праймеры для амплификации λ, ДНК с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 39,40 и 56. Длина фрагмента, амплифицируемого с использованием каждого сочетания праймеров, составляет 151 п.о. (8ЕО ΙΌ № 39 и 40) и 125 п.о. (8ЕО ΙΌ Ν 56 и 40). В данном примере используют матричную ДНК, полученную в примере 2(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 2 мкл раствора для отжига (500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин), 1 фг-1 нг матрицы добавляют к 120 пмоль каждого праймера и доводят до объема 10 мкл стерильной водой. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из άΝ'ΓΡ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8А), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО), 30 Е РНКазы Н Е. со11 и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл. 2.
Таблица 2
Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.)_______Предел детекции
125 10 фг
151 100 фг
Как видно из табл. 2, подтверждается, что когда в качестве матрицы используют λ ДНК, также можно достичь такой чувствительности детекции как 10 фг при анализе оптимального участка.
(3). Получают плазмиду, встраивая амплифицированный фрагмент (длина 340 п.о.) в плазмиду Т7В1ие Т-тесЮг (Такага 8Нихо). Фрагмент получают так, как описано в ДР-А 9-140383, с использованием для амплификации гена вироида хризантемы синтетических праймеров с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 57 и 58, и в качестве матрицы - РНК из хризантемы, инфицированной вироидом. Плазмиду используют для трансформации компетентных клеток ЕкйепсЫа сой 1М109 (Такага 81шхо). Трансформант культивируют в 5 мл среды ЕВ при 37°С в течение 16 ч. Плазмиду выделяют из собранных клеток в чистом виде с использованием набора ΟΙΛΟΡΝ Р1акт1б Μίηί Кй (01адеп) согласно руководству. Получают разведения, содержащие 0 фг, 1 фг, 10 фг, 100 фг, 1 пг, 10 пг, 100 пг или 1 нг плазмиды в 1 мкл стерильной воды, основываясь на концентрации плазмиды, измеренной с использованием спектрофотометра Весктап Όυ-600 (Весктап). Используют 1 мкл одного из приготовленных таким образом растворов плазмиды в качестве матрицы для 50 мкл каждой из реакционных систем для проведения ΙΕΆΝ. В данном примере используют праймеры С8УЭ-Е2 и С8УО-К6 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 59 и 60. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 1 мкл полученного раствора плазмиды и пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%. Смесь нагревают при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 60°С, инкубируют при указанной температуре в течение 1 мин в термоциклере Т1егта1 Сус1ег Регкопа1 (Такага 81шхо) и затем помещают на лед.
После отжига к смеси добавляют в конечных концентрациях буфер 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из άNΤΡ, 30 Е РНКазы Н Е. со11 и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой.
Реакционные смеси помещают в термоциклер ТНегта1 Сус1ег Регкопа1, установленный на 60°С, и проводят реакцию в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №18|ете-агароза 3:1. В результате отмечают образование представляющих интерес продуктов амплификации (длиной около 90 п.о., около 70 п.о. и около 50 п.о.) при использовании матрицы в концентрации 10 фг.
Пример 6. Проверяют праймеры, используемые в способе настоящего изобретения.
- 45 005739 (1). Проверяют величину Тт праймера и температуру реакции. Синтезируют праймеры для амплификации Е1ауоЬас1епит кр. 8А-0082, имеющие нуклеотидные последовательности, представленные 8ЕО ΙΌ № 43 и 61-63. Указанные праймеры конструируют так, чтобы амплифицировать участок в 160 п.о. или, короче, с содержанием ОС примерно 20%. Длина фрагмента, амплифицируемого с использованием каждой пары праймеров, составляет 126 п.о. (8ЕО ΙΌ № 43 и 62); 158 п.о. (8ЕО ΙΌ № 43 и 63); 91 п.о. (8ЕО ΙΌ № 61 и 62) и 123 п.о. (8ЕО ΙΌ № 61 и 63). В данном примере в качестве ДНК-матрицы используют продукт ПЦР-амплификации, полученный в примере 3(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого праймера, 2 мкл одного из трех типов растворов для отжига (500 мМ хлорид калия - 8 мкМ спермидин, 0,05% пропилендиамин или вода) и от 1 фг до 10 нг матрицы. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл одного из трех типов буферов (17 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 17 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3) и 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8)), содержащих 0,625 мМ каждого из 6№ТР, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% бычий сывороточный альбумин (В8А), 1,25% диметилсульфоксид (ДМСО) , 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и получают конечный объем 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 52, 55 или 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате отмечают обрывание представляющего интерес амплифицированного фрагмента при использовании температуры реакции 52°С. В частности, большее количество представляющего интерес амплифицированного фрагмента получают с использованием сочетания раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, и Трицино- или Бицино-буфера. Пара праймеров, длина амплифицированного фрагмента и чувствительность детекции для температуры реакции 52°С приводятся на фиг. 5 и в табл. 3.
Таблица 3
Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.) Предел детекции
126 100 фг
158 1 пг
91 1 пг
123 100 фг
Фиг. 5 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают взаимосвязь между длиной амплифицированного фрагмента и количеством ДНК, служащей матрицей, когда амплифицируют участок, богатый АТ. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 3: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 100 фг матрицы; полоса 4: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 10 фг матрицы; полоса 5: амплификация фрагмента длиной 91 п.о. с использованием 1 фг матрицы; полоса 6: амплификация фрагмента длиной 123 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 7: амплификация фрагмента длиной 123 п.о. с использованием 100 фг матрицы; полоса 8: амплификация фрагмента длиной 123 п.о. с использованием 10 фг матрицы; полоса 9: амплификация фрагмента длиной 12 6 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 10: амплификация фрагмента длиной 126 п.о. с использованием 100 фг матрицы; полоса 11: амплификация фрагмента длиной 126 п. о. с использованием 10 фг матрицы; полоса 12: амплификация фрагмента длиной 158 п.о. с использованием 1 пг матрицы; полоса 13: амплификация фрагмента длиной 158 п.о. с использованием 100 фг матрицы; и полоса 14: амплификация фрагмента длиной 158 п.о. с использованием 10 фг матрицы.
Как видно на фиг. 5 и из табл. 3, показано, что хорошие результаты получают при более низкой температуре реакции в зависимости от величины Тт праймера, когда способ настоящего изобретения осуществляют с использованием матрицы, богатой АТ, и набором праймеров, богатых АТ.
(2). Структура более высокого порядка праймера может влиять на реакционноспособность в способе настоящего изобретения. Поэтому проверяют модификацию праймера с целью избежать образования структуры более высокого порядка праймера и для получения праймера, легко отжигающегося к матрице. Используют праймеры, представленные 8ЕО ΙΌ № 47, 48 и 64-69. Конкретно, используют праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕО ΙΌ № 47, праймеры 120Ι4, 121Ι5 и 122Ι6, являющиеся праймерами с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 64-66, и содержащие инозиндезоксинуклеотид в четвертом, пятом или шестом положении от 3'-конца, праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕО ΙΌ № 104 и праймеры 123Ι4, 124Ι5 и 125Ι6, которые являются праймерами с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 67-69, содержащими инозиндезоксинуклеотид в четвертом, пятом или шестом положении от 3'-конца. В данном примере в качестве матрицы используют ДНК, полученную в примере 4. Реакцию осуществляют
- 46 005739 следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина, от 1 нг до 10 нг ДНК как матрицы и стерильную дистиллированную воду, нагревают при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 55°С и инкубируют при указанной температуре в течение 1 мин с использованием термоциклера (6еηеΑшр РСК 8узйеш 9600, Αрр1^еб Вюзузйешз).
После отжига к смеси добавляют 0,625 мМ каждого из б№ТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% Β8Α, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой или 5 Е термостойкой РНКазы Н из Тйегшиз ййегшорййиз (Тйй) (Тоуйо, далее называется Тйй РНКаза Н) и 5,5 Е ДНКполимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 6.
Фиг. 6 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают действие химерных олигонуклеотидных праймеров, содержащих инозиндезоксинуклеотиды, когда используют РНКазу Н Е. сой и Тйй РНКазу Н. Полосы 2-9 представляют результаты, полученные с использованием РНКазы Н Е. сой. Полосы 10-17 представляют результаты, полученные с использованием Тйй РНКазы Н. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: пара праймеров, представленных 8ЕЦ ΙΌ № 47 и 48, 1 нг матрицы; полоса 3: пара праймеров 120Ι4 и 123Ι4, 1 нг матрицы; полоса 4: пара праймеров 121Ι5 и 124Ι5, 1 нг матрицы; полоса 5: пара праймеров 122Ι6 и 125Ι6, 1 нг матрицы; полоса 6: пара праймеров, представленных 8ЕЦ ΙΌ № 47 и 48, 10 нг матрицы; полоса 7: пара праймеров 120Ι4 и 123Ι4, 10 нг матрицы; полоса 8: пара праймеров 121Ι5 и 124Ι5, 10 нг матрицы; полоса 9: пара праймеров 122Ι6 и 125Ι6, 1 нг матрицы; полоса 10: пара праймеров, представленных 8ЕЦ ΙΌ № 47 и 48, 1 нг матрицы; полоса 11: пара праймеров 120Ι4 и 123Ι4, 1 нг матрицы; полоса 12: пара праймеров 121Ι5 и 124Ι5, 1 нг матрицы; полоса 13: пара праймеров 122Ι6 и 125Ι6, 1 нг матрицы; полоса 14: пара праймеров, представленных 8ЕЦ ΙΌ № 47 и 48, 10 нг матрицы; полоса 15: пара праймеров 120Ι4 и 123Ι4, 10 нг матрицы; полоса 16: пара праймеров 121Ι5 и 124Ι5, 10 нг матрицы; и полоса 17: пара праймеров 122Ι6 и 125Ι6, 10 нг матрицы.
Как показано на фиг. 6, когда используют праймеры с инозинами, включенными в четвертое или пятое положение от 3'-концов праймеров, отмечают увеличение продукта амплификации, представляющего интерес, с использованием или РНКазы Н Е. сой и термостойкой РНКазы Н из Тйегшиз ййегшорйй1из, независимо от количества матрицы. Такие результаты показывают, что реакционная способность в способе Ιί.ΆΝ повышается за счет введения инозина в соответствующую позицию.
(3). Проверяют праймеры с той же целью, какая указана выше в (2). Синтезируют олигонуклеотидные праймеры 18 и 48 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕЦ ΙΌ N3 84 и 85, в которых три основания с 3'-конца представляют собой α-8 (или альфа-тио) рибонуклеотиды, т.е. содержащие 5'-фософтиоатные связи в РНК-компоненте. Кроме того, синтезируют олигонуклеотидные праймеры 1Ν3Ν3 и 4Ν3Ν3 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕЦ ΙΌ № 70 и 71, содержащие рибонуклеотиды в трех основаниях от 3'-конца и в части последовательности дезоксирибонуклеотидного компонента, т.е. рибонуклеотиды в одиннадцатом и тринадцатом положениях от 3'-конца праймера. Используют матричную ДНК, полученную так, как в примере 4. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина, 10 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильную воду, нагревают при 98°С в течение 2 мин с использованием термоциклера и затем помещают на лед для охлаждения.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из 6№ТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% Β8Α, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой или 5 Е Тйй РНКазы Н и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч в термоциклере.
После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате в случае использования сочетания праймеров 18 и 48 или 1Ν3Ν3 и 4Ν3Ν3 отчетливо отмечают продукт амплификации в ожидаемом положении, независимо от используемой РНКазы Н. Эти результаты подтверждают, что модификация праймера по 3'-концу 5'-фосфотиоатом является эффективной для способа настоящего изобретения. Дополнительно установлено, что замещение рибонуклеотидом по подходящему внутреннему положению в дополнение к 3'-концу праймера эффективно для повышения реакционной способности в способе настоящего изобретения.
Пример 7.
Проверяют использование в способе настоящего изобретения ДНК-полимеразы с активностью РНКазы Н Е. сой в присутствии определенного иона металла. Денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого из химерных олигонуклеотидных праймеров, используемых в примере 2(1), 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, 1 нг ДНК как матрицы, используемой в примере 2(1), и стерильную воду, и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице. После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из б№ТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% Β8Α, 1,0% ДМСО и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т и хлорид марганца (№1са1ай Тездие) в конечной концентрации 0,5, 2,5 или 10 мМ, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной
- 47 005739 водой. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч. Кроме того, готовят в качестве контроля смесь без добавления хлорида марганца и смесь, в которую добавляют 30 Е РНКазы Н Е. сой, но хлорид марганца не добавляют. После реакции 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приведены на фиг. 7.
Фиг. 7 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают результаты метода IСΑN с использованием активности РНКазы Н ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: без добавления хлорида марганца/с добавлением РНКазы Н Е. сой; полоса 3: без добавления хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; полоса 4: с добавлением 0,5 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; полоса 5: с добавлением 2,5 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; полоса 6: с добавлением 5,0 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой; и полоса 7: с добавлением 10,0 мМ хлорида марганца/без добавления РНКазы Н Е. сой.
Как видно на фиг. 7, образование представляющего интерес продукта амплификации отмечают в случае реакционной системы, в которую добавляют хлорид марганца в концентрации 2,5 мМ в отсутствие РНКазы Н Е. сой.
Пример 8.
Проверяют способ настоящего изобретения с использованием реального биологического образца.
(1). Осуществляют детекцию с использованием в качестве матрицы полученного с использованием горячей воды экстракта из культуры энтерогеморрагической Езйепсййа сой О-157 (АТСС, инвентарный № 43895). Энтерогеморрагическую ЕзйепсЫа сой О-157 культивируют в среде тЕС, содержащей новобиоцин, при 42°С в течение 18 ч и затем нагревают при 95°С в течение 10 мин. Вытяжки горячей водой из Е. сой О-157, соответствующие 0, 1, 10, 102, 103, 104 или 105 клеток получают разведением вытяжки стерильной водой. Ген веротоксина 2 (УТ2) амплифицируют с использованием одной из таких водных вытяжек Е. сой О-157 в тех же условиях, что и в примере 5(1). Кроме того, в качестве контроля проводят ПЦР с использованием той же матрицы в условиях, описанных в примере 5(1). После реакции 1 мкл (ТСАЦ) или 5 мкл (ПЦР) каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл. 4 и на фиг. 8.
Таблица 4
Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.) Предел детекции (клетки)
1САЫ (общее время 70 минут) 135 173 102 103
ПЦР (25 циклов, общее время примерно 66 минут)
135 10э
ПЦР (30 циклов, общее время примерно 80 минут)
135 102
Фиг. 8 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают возможности детекции Езсйепсййа сой О-157 с использованием IСΑN и ПЦР. Длина амплифицируемой цепи 135 п.о. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: IСΑN для 104 клеток; полоса 3: IСΑN для 103 клеток; полоса 4: IСΑN для 102 клеток; полоса 5: ПЦР, 25 циклов для 104 клеток; полоса 6: ПЦР, 25 циклов для 103 клеток; полоса 7: ПЦР, 25 циклов для 102 клеток; полоса 8: ПЦР, 30 циклов для 104 клеток; полоса 9: ПЦР, 30 циклов для 103 клеток; и полоса 10: ПЦР, 30 циклов для 102 клеток.
Как видно из табл. 4 и фиг. 8, подтверждается, что чувствительность детекции способа детекции настоящего изобретения эквивалентна чувствительности ПЦР и что способ настоящего изобретения требует меньшего времени для детекции по сравнению со временем, требуемым в случае ПЦР.
(2). Обнаруживают λ ДНК с использованием праймеров, представленных БЕЦ ΙΌ № 40 и 56, используемых в примерах 2 и 4. Реакцию проводят следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого праймера, 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, от 10 фг до 1 нг λ ДНК (Такага Бйихо) и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из άΝΊΤ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВБА, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной
- 48 005739 смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл. 5.
Таблица 5
Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.)_______Предел детекции
125 1 пг
Как видно из табл. 5, подтверждается, что способ настоящего изобретения эффективен для детекции λ ДНК.
(3). Осуществляют детекцию с использованием геномной ДНК из бактерии Р1аνοЬасΐе^^ит кр. 8А0082 в качестве матрицы и праймеров, представленных 8ЕО ΙΌ Νο 61 и б2, используемых в примере б(1). Геномную ДНК как матрицу получают согласно обычному способу из бактерии рода Р1аνοЬасΐе^^ит, культивированной так, как описывается в АО 97/32010. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, получают 10 мкл смеси, содержащей 120 пмоль каждого праймера, 2 мкл раствора для отжига, содержащего 500 мМ хлорид калия и 8 мкМ спермидин, от 10 фг до 1 нг геномной ДНК и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,б25 мМ каждого из άΝΊΡ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% В8А, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сοI^ и 11 Е ДНК-полимер азы ВсаВЕ8Т, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 52°С в течение 1 ч. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся в табл. б и на фиг. 9.
Таблица б
Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.)_______Предел детекции
100 фг
Фиг. 9 иллюстрирует результаты электрофореза, которые показывают обнаружение бактерии рода Ρ1·ινο^κ^πι.ιιη. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: 1 нг матрицы; полоса 3: 10 пг матрицы; полоса 4: 1 пг матрицы; полоса 5: 100 фг матрицы; и полоса б: 10 фг матрицы.
Как видно из табл. б и фиг. 9, подтверждается, что способ настоящего изобретения эффективен для детекции бактерий.
Пример 9.
Проверяют способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, в котором объединяют способ амплификации настоящего изобретения и способ гибридизации. В качестве мишени выбирают энтерогеморрагическую ЕксйепсЫа сοI^ О-157. ДНК как матрицу получают так, как описывается в примере 8(1). В качестве фрагмента для амплификации выбирают участок длиной около 100 п.о. с содержанием ОС около 40%. В качестве праймеров используют праймеры УТ2-ГР20 и УТ2-!К.20-2 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ Νο 51 и 72. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого из праймеров УТ2-ГР20 и УТ2-!К.20-2, раствор для отжига, содержащий пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%, одну из вытяжек горячей водой, соответствующую 0-104 клеткам, и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 55°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин в термоциклере Т11егта1 Сус1ег Ρе^κοηа1 (Такага 81ιι.ιζο), и затем помещают на лед для отжига.
После отжига к смеси добавляют, в конечных концентрациях, буфер 20 мМ ΗΕΡΕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1,% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из άΝΓΡ, 30 Е РНКазы Н Е. той и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Затем реакционные смеси помещают в термоциклер Т11егша1 Сус1ег Ρе^κοηа1, установленный на 55°С, и инкубируют при указанной температуре в течение б0 мин. В качестве контроля с использованием термоциклера Тйетта1 Сус1ег Ρе^κοηа1 проводят ПЦР с использованием набора для типирования О-157 Туршд 8е1 (Такага 81ιιιζο) согласно руководству. ПЦР осуществляют следующим образом: 35 циклов - 94°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Для такой реакции требуется примерно 4 мин на цикл, и общее время составляет примерно 145 мин. Ожидаемый размер продукта амплификации примерно 404 п.о. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% геле №81еуе-агарозе, 3:1. Результаты приводятся на фиг. 28 А. Фиг. 28 А иллюстрирует результаты электрофореза по детекции гена веротоксина ΙΙ энтерогеморрагической ЕксйепсЫа той О-157 с использованием методов ΙΡΆΝ или ПЦР. Полоса Μ1: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса М2: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса Ν: отрицательный контроль; полоса 1: матрица, соответствующая 1 клетке; полоса 2: матрица, соответствующая 10
- 49 005739 клеткам; полоса 3: матрица, соответствующая 102 клеток; полоса 4: матрица, соответствующая 103 клеток; и полоса 5: матрица, соответствующая 104 клеток. Кроме того, в табл. 7 приводятся результаты сравнения уровней амплификации, достигнутых методами [САИ и ПЦР для 1 клетки или для 10 клеток.
Таблица 7
Число клеток Е. соИ 0-157
1 10
ΙΟΑΝ - + +++
ПЦР-+4-4- : амплификация отсутствует; от 4- до 4-4-4- указывает степень амплификации по 3-бальной шкале.
Как видно из фиг. 28А и табл. 7, представляющие интерес продукты амплификации образуются в случае реакционных систем с использованием вытяжки горячей водой, соответствующей 1 клетке, согласно способу детекции как настоящего изобретения, так и ПЦР. Также методом дот-блоттинга осуществляют гибридизацию продукта амплификации, полученного по способу ГОАИ, с использованием в качестве зонда олигонуклеотида УТ2 с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕО ГО Ио 73, меченного биотином по 5'-концу. Гибридизацию осуществляют следующим образом. Коротко, 1 мкл реакционной смеси денатурируют при 98°С в течение 5 мин, быстро охлаждают на льду и наносят каплями на мембрану НуЬопб-И® (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй). После воздействия УФ мембрану помещают в гибридизационный мешок. Добавляют в него 10 мл раствора для гибридизации, содержащего 0,5 М двухзамещенный фосфат натрия (рН 7,2), 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту и 7% лаурилсульфат натрия. Затем осуществляют предварительную гибридизацию при 42°С в течение 30 мин. Денатурируют нагреванием тепла 10 мкл раствора зонда УТ2 с концентрацией 100 нг/мкл и добавляют к реакционной системе предварительной гибридизации. После гибридизации при 42°С в течение 60 мин мембрану дважды промывают при комнатной температуре в течение 5 мин в растворе, содержащем 66,6 мМ хлорид натрия, 66,6 мМ цитрат натрия и 0,1% лаурилсульфат натрия, инкубируют при 42°С в течение 12 мин в 6 мл буфера для промывки (0,3 М хлорид натрия, 17,3 мМ двухзамещенный фосфат натрия двухводный, 2,5 мМ ЭДТА, 0,1 % лаурилсульфат натрия), к которому добавляют 2 мкл конъюгата пероксидазы из хрена и стрептавидина (РГЕВСЕ) с концентрацией 5 мг/мл, и затем дважды промывают в буфере для промывки при комнатной температуре. Затем мембрану промывают в 10 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 5,0) при комнатной температуре и дают реагировать со смесью 5 мл 0,1 М цитратного буфера, 5 мкл 3% пероксида водорода и 250 мкл раствора 2 мг/мл тетраметилбензидина (ТМВ, Иаса1а1 Тексще) в этаноле в темноте в течение примерно 10 мин. После появления окраски реакцию обрывают деионизованной водой. Результаты показаны на фиг. 28В. Фиг. 28В показывает результаты гибридизации методом дотблоттинга для детекции гена веротоксина II из энтерогеморрагической ЕксйепсЫа сой О-157 способом ГОАИ. Результаты совпадают с результатами, полученными в случае описанного выше электрофореза. Таким образом, чувствительность детекции способа настоящего изобретения эквивалента чувствительности ПЦР. Общее время, необходимое для реакции амплификации с использованием способа ГОАИ настоящего изобретения, составляет 1/2 или меньше по сравнению со временем, требуемым для ПЦР. Таким образом, подтверждается, что способ ГОАИ настоящего изобретения эффективен как способ детекции патогена и т. п.
Пример 10.
(1). Проверяют сочетание обратно-транскриптазной реакции и способа настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы РНК из культивированных клеток. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, клетки ВА^264.7 (АТСС ТГО 71) суспендируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Вю ХУйШакег, 12-604Е), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (С1Ьсо), в концентрации 1,5 х 105 клеток/мл. В каждую лунку 6-луночного микротитровального планшета добавляют по 5 мл суспензии, и планшет инкубируют при 37°С в течение ночи в присутствии 5% СО2. В лунки добавляют 50 мкл раствора 100 мкг/мл липополисахарида (ЬРЗ, З1дта) в воде и 50 мкл раствора 1000 Е/мкл интерферона-γ ЦЕИ-γ, Сепхуте Тесйпе) в воде. Планшет инкубируют еще в течение 4 ч. Затем из клеток получают РНК с использованием набора Впеаку М1ш Кй (01адеп) согласно инструкциям, приложенным к набору. В качестве отрицательного контроля используют группу, в которую ЬРЗ или ГОИ-γ не добавляют.
Получают кДНК, инкубируя, с использованием термоциклера (СепАтр РСВ Зук1ет 9600, Аррйеб Вюкук1етк), 60 мкл смеси, содержащей 3 мкг полученной таким образом РНК, 10 мМ Трисгидрохлоридный буфер (рН 8,3), 50 мМ КС1, 5 мМ МдС12, по 1 мМ каждого бИТР, 150 пмоль случайного 6-мерного праймера, 60 Е ингибитора рибонуклеазы (Такага Зйнхо) и 15 Е обратной транскриптазы ХЬ
- 50 005739 (АМУ) (Такага ЗЕихо, 2620А), при З0°С в течение 10 мин, при 42°С в течение 1 ч и затем при 99°С в течение 5 мин, для инактивации фермента.
Праймеры с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕЦ ΙΌ № 74 и 75, синтезируют на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой ΝΟ-синтазы (1ΝΟ8) (СеηеΒаηк, инвентарный № ΝΜ-010927). В качестве контроля также синтезируют праймеры для РСВ, представленные ЗЕЦ ΙΌ № 76 и 77.
Готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 2 мкл водного раствора пропилендиамина в концентрации 0,05%, 1 мкл кДНК как матрицы (соответствует 50 нг РНК) и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин, охлаждают до 55°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин в термоциклере для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из άΝΊ'Ρ, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 15 Е РНКазы Н Е. сой и 11 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют при 55°С в течение 1 ч в термоциклере. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С. В качестве контроля проводят ПЦР следующим образом. Коротко, 50 мкл реакционной смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, 1 мкл кДНК (соответствует 50 нг РНК), 5 мкл 10-кратного Ех Тад-буфера (Такага ЗЕихо), 1,25 Е ТаКаВа Ех Тад-полимеразы (Такага ЗЕихо) и 0,2 мМ каждого из бКТР, дают реагировать в термоциклере. Программа следующая: 1 цикл - 94°С в течение 2 мин; З0 циклов - 94°С в течение З0 с, 55°С в течение З0 с и 72°С в течение З0 с; и 1 цикл - 72°С в течение 5 мин. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 10. Фиг. 10 иллюстрирует результаты электрофореза, показывающие сравнение между способами ВΤ-IСАN (А) и ОТ-ПЦР (В). Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: группа отрицательного контроля; и полоса З: группа, обработанная ЬРЗ и ΙΡΝ-д
Как видно на фиг. 10, образование продуктов амплификации отмечают как в случае способа настоящего изобретения, так и ПЦР только тогда, когда в качестве матрицы используют кДНК, полученную из клеток, обработанных ЬРЗ и ΙΡΝ-γ. Таким образом, подтверждается, что так как для способа настоящего изобретения требуется более короткий промежуток времени для реакции по сравнению с ПЦР, способ настоящего изобретения более эффективен как способ амплификации ДНК после обратной транскрипции.
Пример 11.
РНКаза Н Е. сой, для которой оптимальной температурой является З7°С, может подвергаться инактивации во время реакции амплификации по настоящему изобретению. Поэтому проверяют влияние добавления РНКазы Н Е. сой в реакционную смесь во время реакции амплификации. В качестве матричной ДНК используют амплифицированный фрагмент (1071 п.о.), полученный ПЦР с использованием праймеров СМО-РСВ-Ρ и СМО-РСВ-В, представленных ЗЕЦ ΙΌ № 78 и 79, и геномной ДНК, экстрагированной из рекомбинантных бобов сои, в которую введен промотор З5З вируса мозаики цветной капусты и ген ЕРЗРЗ. Кроме того, используют праймеры СМО-З1, З2, А1 и А2 с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕЦ ΙΌ Ν 80-8З. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%, от 1 пг до 10 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильную воду. Смесь денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и охлаждают до 55°С для отжига.
После отжига к смеси добавляют, в конечных концентрациях, 500 мкМ каждого из бКТР, буфер З4 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,7), 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% ВЗА, 1% ДМСО, З0 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси инкубируют в термоциклере при 55°С в течение 25 мин. Через 25 мин после начала реакции в смесь добавляют еще З0 Е РНКазы Н Е. сой. Смесь инкубируют при 55°С в течение З0 мин. В качестве контроля проводят реакцию, инкубируя смесь при 55°С в течение 55 мин. После реакции по З мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З% агарозе. В результате подтверждается, что эффективность амплификации улучшается за счет добавления РНКазы Н Е. сой во время реакции, независимо от концентрации матричной ДНК, для любого сочетания праймеров З1/А1, З1/А2, З2/А1 и З2/А2.
Пример 12.
Проверяют сочетание способа амплификации или дупликации нуклеиновой кислоты для использования в качестве матрицы в настоящем изобретении и способа настоящего изобретения. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, проводят транскрипцию ίη \'Его с использованием в качестве матрицы плазмиды, содержащей ген вироида хризантемы, полученной так, как описывается в примере 5(З), которую дуплицируют в ЕкЕепсШа сой, и Т7-РНК-полимеразы (Такага ЗЕихо) для получения фрагмента, дуплицированного с РНК. Синтезируют кДНК с использованием праймеров с нуклеотидными последовательностями, представленными ЗЕЦ ΙΌ № 57 и 58, и набора для синтеза кДНК (Такага ЗЕихо). Реакцию амплификации осуществляют так, как описывается в примере 5(З), с использованием в качестве матрицы фрагмента кДНК или дуплицированной плазмиды. В результате подтверждается, что в способе
- 51 005739 настоящего изобретения можно использовать в качестве матрицы как нуклеиновую кислоту, дуплицированную в форме плазмиды, так и нуклеиновую кислоту в форме кДНК, дуплицированной с РНК с использованием РНК-полимеразы.
Пример 1З.
(1) . Синтез праймеров.
Олигонуклеотидные праймеры N81 и N82, представленные 8Е0 ΙΌ N 86 и 87, синтезируют на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой NО-синтазы (ЙНО8).
(2) . Амплификация фрагмента ДНК способом IСΑN с использованием в качестве матрицы продукта ПЦР.
Смесь (10 мкл), содержащую 50 пмоль каждого синтетического олигонуклеотидного праймера, 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина и от 10 фг до 10 пг матрицы, с использованием термоциклера (СепеАтр РСК 8уз1ет 9600, Аррйеб 8уз1етз) нагревают при 98°С в течение 2 мин и затем для отжига праймеров к матрице при 60°С в течение 2 мин. кДНК ЙНО8 (741 п.о.), амплифицированную с использованием праймеров №-РСК1 и №-РСК2, представленных 8ЕО ΙΌ № 1З2 и 1ЗЗ, и затем очищенную с использованием 8иргес02 (Такага 8йи/о), используют в качестве матрицы. В прогретый раствор добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из бЭТР, буфер 40 мМ НЕРЕ8гидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% В8А, 1,25% ДМСО, 0,0156 мкг Р£ц РНКазы Н и 0,66 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т. Смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. По 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в З,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 11. Фиг. 11 представляет результаты IСΑN с использованием Р£ц РНКазы Н. Полоса 1: маркер молекулярной массы (100 п.о.); полоса 2: 10 фг матрицы; полоса З: 100 фг матрицы; полоса 4: 1 пг матрицы; и полоса 5: 10 пг матрицы.
Как видно на фиг. 11, образование продукта амплификации, представляющего интерес, отмечают при использовании 100 фг матрицы.
Пример 14.
(1). Получение ДНК.
Клетки КΑV264.7 (АТСС ТЙВ 71) суспендируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Вю Vй^ΐΐаке^), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (С1Ъсо), в концентрации 1,5 х 105 клеток/мл. В каждую лунку 6-луночного микротитровального планшета добавляют по 5 мл суспензии, и планшет инкубируют при З7°С в течение ночи в присутствии 5% СО2. В лунки добавляют 50 мкл раствора 100 мкг/мл липополисахарида (ЬР8, 81дта) в воде и 50 мкл раствора 1000 Е/мкл интерферона-γ (ΙΕΝ-γ, Сепхуше Тесйпе) в воде. Планшет инкубируют еще в течение 4 ч. Затем из клеток получают РНК с использованием набора КЫеазу М1ш Кй (Ойадеп, 74104) согласно инструкциям, приложенным к набору. В качестве отрицательного контроля используют группу, в которую ЬР8 или ΙΕΝ-γ не добавляют.
Получают кДНК, инкубируя, с использованием термоциклера (СепАтр РСК 8уз1ет 9600, Аррйеб ВюзузТетз), 60 мкл смеси, содержащей З мкг полученной таким образом РНК, 10 мМ Трисгидрохлоридный буфер (рН 8,З), 50 мМ КС1, 5 мМ МдС12, по 1 мМ каждого бЭТР, 150 пмоль случайного 6-мерного праймера, 60 Е ингибитора рибонуклеазы (Такага 8йи/о) и 15 Е обратной транскриптазы ХЬ (АМУ) (Такага 8йихо, 2620А), при З0°С в течение 10 мин, при 42°С в течение 1 ч и затем при 99°С в течение 5 мин для инактивации фермента.
Праймеры Ν85 и Ν86 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 92 и 9З, синтезируют на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой NОсинтазы (ЙНО8). Кроме того, также синтезируют праймеры для ПЦР №З и Ν84, представленные 8ЕО ΙΌ Ν 88 и 89.
Смесь (50 мкл), содержащую 50 пмоль каждого из праймеров Ν85 и Ν86, в качестве матрицы 1 мкл раствора кДНК, синтезированной так, как описывается выше (соответствует 50 нг РНК), или его 10-, 100-, 1000- или 10000-кратного разведения водой, 0,5 мМ каждого из бЭТР, буфер З2 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8А, 1% ДМСО, 0,0156 мкг Р£и РНКазы Н и 0,66 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С.
С другой стороны, проводят ПЦР в качестве контроля. С использованием термоциклера проводят реакцию в 50 мкл реакционной системы, содержащей 50 пмоль каждого из праймеров №З и Ν84, 1 мкл раствора кДНК (соответствует 50 нг РНК) или его 10-, 100-, 1000- или 10000-кратного разведения водой, 5 мкл 10-кратного Ех Тад-буфера (Такага 8йихо), 1,25 Е ТаКаКа Ех Тад-полимеразы (Такага 8йнхо) и 0,2 мМ каждого из бКТР. Программа следующая: 1 цикл - 94°С в течение 2 мин; З5 циклов - 94°С в течение З0 с, 55°С в течение З0 с и 72°С в течение З0 с; и 1 цикл - 72°С в течение 5 мин. Прореагировавшие образцы хранят до анализа замороженными при -20°С.
По 5 мкл каждой реакционной смеси (IСΑN или ПЦР) анализируют методом электрофореза в З,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 12. Фиг. 12 показывает результаты детекции гена ЙНО8 способом IСΑN с использованием РНКазы Н или ПЦР. Полоса 1: ступенчатый маркер ДНК с шагом 100 п.о.; полоса 2: 10000-кратное разведение кДНК отрицательного контроля; полоса З: 1000-кратное разве
- 52 005739 дение кДНК отрицательного контроля; полоса 4: 100-кратное разведение кДНК отрицательного контроля; полоса 5: 10-кратное разведение кДНК отрицательного контроля; полоса 6: исходный раствор кДНК отрицательного контроля; полоса 7: 10000-кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬРБ и ГОЛ-γ; полоса 8: 1000-кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬРБ и ГОЛ-γ; полоса 9: 100кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬРБ и ГОЛ-γ; полоса 10: 10-кратное разведение кДНК из группы с добавлением ЬРБ и ЙЕЛ-γ; и полоса 11: исходный раствор кДНК из группы с добавлением ЬРБ и ГОЛ-γ.
Как видно на фиг. 12, продукты амплификации отмечают в случае как ГОАЛ, так и ПЦР только тогда, когда в качестве матрицы используют кДНК, полученную из клеток, обработанных ЬРБ и ГЕЛ-γ. В случае ГОАЛ образование продукта амплификации отмечают с использованием 1000-кратного разведения кДНК. В случае ПЦР образование продукта амплификации отмечают с использованием 100-кратного разведения кДНК.
Пример 15.
(1) . Синтезируют олигонуклеотидные праймеры 4 и 5, представленные БЕО ГО Ло 90 и 91, на основе нуклеотидной последовательности λ ДНК. Олигонуклеотидный праймер 4 является смысловым праймером с 75% содержанием ОС. Олигонуклеотидный праймер 5 является антисмысловым праймером с 80% содержанием ОС.
Реакционную систему (10 мкл), содержащую по 120 пмоль каждого из праймеров 4 и 5, 2 мкл 0,05% раствора пропилендиамина и 10 нг матрицы денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице. В качестве матрицы используют продукт ПЦР (1005 п.о.), очищенный с использованием Биргес02 так, как описывается в примере 2.
(2) . После отжига к смеси добавляют 40 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из йЛТР, буфер 42,5 мМ Бицин-гидроксид калия (рН 8,3), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% ВБА, 1,25% ДМСО, 0,5 мкл РНКазы НН ТйегшоЮда тагйта (0,58 мкг/мл) и 2,2 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ, и осуществляют ГОАЛ при 60, 65 или 70°С в течение 1 ч. После ГОАЛ по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 13. Фиг. 13 показывает результаты ГОАЛ с использованием РНКазы НН ТйегшоЮда тагйта. Полоса 1: маркер молекулярной массы (100 п.о.); полоса 2: температура реакции 60°С; полоса 3: температура реакции 65°С; и полоса 4: температура реакции 70°С.
Как видно на фиг. 13, образование продуктов амплификации, представляющих интерес, отмечают в случае соответствующих температур реакции.
Пример 16.
(1). Проверяют амплификацию фрагмента ДНК способом ГО АЛ с использованием в качестве матрицы продукта ПЦР (денатурированного под действием щелочи). Смешивают 1 мкл раствора, содержащего от 10 фг до 10 пг матрицы, и 1 мкл 0,4Л раствора ЛаОН. Смесь инкубируют при 37°С в течение 5 мин для денатурации матрицы. В качестве матрицы используют ПЦР-амплифицированную кДНК 1ЛОБ (741 п.о.), очищенную с использованием Биргес02 (Такага Бйихо), как описано в примере 13. Каждую из денатурированных матриц нейтрализуют с использованием 1 мкл 0,4Л НС1. Добавляют 47 мкл реакционной смеси, содержащей по 50 пмоль каждого из праймеров ЛБ1 и ЛБ2, 0,5 мМ каждого из йЛТР, буфер 32 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% ВБА, 1,0% ДМСО, 0,0156 мкг РГц РНКазы Н и 0,66 Е ДНК-полимеразы ВсаЭЕБТ. Смесь инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. Анализируют по 5 мкл каждой реакционной смеси методом электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 14. Фиг. 14 показывает результаты ГОАЛ с использованием матрицы, денатурированной под действием щелочи. Полоса 1: маркер молекулярной массы (100 п.о.); полоса 2: 10 фг матрицы; полоса 3: 100 фг матрицы; полоса 4: 1 пг матрицы; и полоса 5: 10 пг матрицы.
Как видно на фиг. 14, образование продукта амплификации отчетливо наблюдается при использовании 1 пг матрицы.
Пример 17.
(1). Проверяют амплификацию фрагмента ДНК способом ГОАЛ без денатурации матрицы. В качестве праймеров используют праймеры ЛБ5 и ЛБ6, представленные БЕО ГО Ло 92 и 93. В качестве ДНКматрицы используют матрицу, полученную в примере 13.
Реакционную смесь (50 мкл), содержащую от 10 фг до 100 пг матрицы или воды в случае отрицательного контроля, по 50 пмоль каждого из праймеров ЛБ5 и ЛБ6, 0,5 мМ каждого из йЛТР, буфер 32 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% ВБА, 1,0% ДМСО, 0,0156 мкг РГц РНКазы Н и 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕБТ (Такага Бйихо), инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты электрофореза приводятся на фиг. 15. Фиг. 15 иллюстрирует результаты электрофореза для способа амплификации настоящего изобретения без денатурации матрицы. Полоса 1: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль (вода); полоса 3: 10 фг матрицы; полоса 4: 100 фг матрицы; полоса 5: 1 пг матрицы; полоса 6: 10 пг матри
- 53 005739 цы; и полоса 7: 100 пг матрицы.
Как видно на фиг. 15, образование продукта амплификации, представляющего интерес, отмечают при использовании 1 пг матрицы.
Пример 18.
(1) . Синтезируют праймеры рЭОН-АМ и рООН-АЮ, представленные 8Е0 ГО Νο 94 и 95, на основе нуклеотидной последовательности ДНК области упаковки векторной плазмиды рООК-А! (Такага 8йи/о).
(2) . Амплификация фрагмента ДНК способом IСΑN без денатурации матрицы.
Реакционную смесь (50 мкл), содержащую 1 мкл раствора, содержащего от 10 фг до 1 нг ДНК р^ΟN-ΑI или воды в качестве отрицательного контроля, 50 пмоль каждого праймера, 0,5 мМ каждого из б№ГР, буфер 32 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8А, 1,0% ДМСО, 0,0156 мкг РГи РНКазы Н, полученной так, как в ссылочном примере 4, и 1 Е ДНКполимер азы ВсаВЕ8Т, инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. По 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты электрофореза приводятся на фиг. 16. Фиг. 16 иллюстрирует результаты электрофореза для способа настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы кольцевой двухцепочечной ДНК без денатурации. Полоса 1: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль (вода); полоса 3: 10 фг матрицы; полоса 4: 100 фг матрицы; полоса 5: 1 пг матрицы; полоса 6: 10 пг матрицы; полоса 7: 100 пг матрицы; и полоса 8: 1 нг матрицы.
Как видно на фиг. 16, подтверждается, что продукт амплификации, представляющий интерес, получают при использовании 10 фг матрицы.
Пример 19.
Проверяют детекцию гена вируса 16 папилломы человека с использованием способа настоящего изобретения. В качестве матрицы используют ДНК из клеток, инфицированных вирусом 16 папилломы человека (клетки Са8к1 ГОайирроп Рйагтасеийса1), содержат 500 копий вируса 16 папилломы человека на клетку). В качестве праймеров для детекции НРУ16 используют праймеры НРУ16 83 и НРУ16 А2 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ГО Νο 96 и 97. Ожидаемый размер продукта амплификации, полученного с использованием пары праймеров, составляет примерно 120 п.о.
Реакцию осуществляют следующим образом.
Готовят 10 мкл смеси, содержащей 1 пг, 3 пг, 30 пг, 100 пг, 300 пг, 1 нг, 3 нг или 10 нг матричной ДНК, 50 пмоль каждого из праймеров НРУ16 83 и НРУ16 А2 и пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%. Смеси инкубируют при 98°С в течение 2 мин и при 55°С в течение 1 мин в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регкопа1, и затем помещают на лед. К смеси добавляют в конечных концентрациях буфер 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1,0% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из б№ТР, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, и доводят конечный объем до 50 мкл. Реакционные смеси помещают в термоциклер, установленный на 55°С, и проводят реакцию в течение 60 мин. В качестве контроля осуществляют ПЦР в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 с использованием праймеров вируса папилломы человека НРУр16 (прямого, обратного) (Такага 8йи/о) согласно руководству. Ожидаемый размер продукта амплификации 140 п.о.
После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле М18|еуеагароза 3:1. Фиг. 17А показывает результаты обнаружения гена НРУ16 с использованием IСΑN и ПЦР. Полоса М1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п. о.); полоса М2: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса 1: без матрицы; полоса 2: 1 пг матрицы; полоса 3: 3 пг матрицы; полоса 4: 30 пг матрицы; полоса 5: 100 пг матрицы; полоса 6: 300 пг матрицы; полоса 7: 1 нг матрицы; полоса 8: 3 нг матрицы; и полоса 9: 10 нг матрицы.
Как видно на фиг. 17А, подтверждается, что продукты амплификации, представляющие интерес, получают при использовании 3 пг матричной ДНК в случае IСΑN и 1 пг матричной ДНК в случае ПЦР, соответственно.
Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов реакции методом дот-блоттинга с использованием олигонуклеотидного зонда НРУ16 с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕО ГО Νο 98. Гибридизацию осуществляют так, как описывается в примере 9. Результаты приводятся на фиг. 17В. Фиг. 17В показывает результаты детекции гена НРУ16 гибридизацией методом дот-блоттинга после проведения ПЦР и Κ.ΆΝ. Полоса 1: без матрицы; полоса 2: 1 пг матрицы; полоса 3: 3 пг матрицы; полоса 4: 30 пг матрицы; полоса 5: 100 пг матрицы; полоса 6: 300 пг матрицы; полоса 7: 1 нг матрицы; полоса 8: 3 нг матрицы; и полоса 9: 10 нг матрицы.
Как видно из фиг. 17В, чувствительность детекции с использованием методов IСΑN и ПЦР почти одинаковая. Таким образом, подтверждается, что указанные способы эффективны для обнаружения вирусов и т.п.
Пример 20.
Проверяют детекцию гена вируса 16 папилломы человека в клиническом образце ДНК. В качестве матриц используют ДНК, полученные обычным способом из 6 клинических образцов, полученных с информированного согласия пациентов. Типы инфицирующих НРУ в пробах, полученных из клинических
- 54 005739 образцов, были предварительно подтверждены ПЦР. В качестве праймеров для детекции НРV16 используют праймеры №ν16 83 и №ν16 А2, описанные в примере 19. Концентрации образцов ДНК из клинических образцов, используемых в качестве матриц, доводят до 100 нг/мкл с помощью ТЕ-буфера. Используют те же состав реакционной смеси и условия реакции, как в примере 19, за исключением количества матрицы. Кроме того, осуществляют подобные реакции с использованием реакционной смеси без добавления матричной ДНК в качестве отрицательного контроля и реакционной смеси, содержащей 500 пг ДНК из клеток Са8к1, инфицированных НРУ 16, в качестве положительного контроля. После реакции 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле М.18|еуе-агароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 18 А. Фиг. 18А показывает результаты детекции гена НРV16 в клинических образцах. Полоса М: маркер молекулярной массы; полосы 1-6: клинические образцы; полоса 7: отрицательный контроль; и полоса 8: положительный контроль.
Как видно из фиг. 18 А, отмечают образование продуктов амплификации по способу IСАN длиной около 120 п.о. в случае образцов, где инфицирование №ν16 было доказано обычной ПЦР. Амплификацию не наблюдают в случае образцов, инфицированных другими типами НРV, или неинфицированных образцов.
Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов амплификации методом дот-блоттинга, как описывается в примере 9. Результаты приводятся на фиг. 18В. Фиг. 18В показывает результаты детекции гена НРУ 16 в клинических образцах гибридизацией методом дот-блоттинга. Полосы 1-6: клинические образцы; полоса 7: отрицательный контроль; и полоса 8: положительный контроль.
Как видно на фиг. 18В, получают результаты, совпадающие с результатами, полученными электрофорезом, что подтверждает, что результаты, схожие с результатами ПЦР, можно получить с использованием электрофореза, а также гибридизации методом дот-блоттинга. Таким образом, подтверждается, что НРУ 16 можно обнаружить в реальных клинических образцах согласно способу настоящего изобретения, и что способ эффективен для детекции вируса и т.п.
_______________________________________________________________ Таблица 8
Образец Типирование методом ПЦР IСΑΝ-амплификация с использованием праймера для детекции НРУ16
№ 3 не инфицирован -
№ 4 не инфицирован -
№ 6 тип 18 -
№ 7 тип 16 +
№ 8 тип 67 -
№ 9 тип 16 +
Без матрицы * Полож. контроль_______*___________________________+________________
- : нет амплификации; + : амплификация отмечается.
Пример 21.
Проверяют детекцию НСV в клинических образцах. Образцы получают из 300 мкл каждой из 5 сывороток от пациентов с НСV, полученных с информационного согласия пациентов, с использованием реагента ТКПо1 (Ьйе Тесйпо1од1е5), согласно инструкциям, приложенным к реагенту, и, наконец, растворяют в 6 мкл воды для инъекций (ОЦика Рйаттасеийса1), получая образцы РНК. РНК, экстрагированную подобным же образом из 300 мкл сыворотки здорового индивидуума, используют в качестве отрицательного контроля. Сначала, с использованием набора КИА РСК кй (ΆΜ^), ует. 2.1 (Такага 8йто), готовят 4 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции, содержащей 1-кратный буфера КНА. РСК, 5 мМ МдС12, 1 мМ бЭТР, 1 Е обратной транскриптаза ХЬ АΜV, по 10 пмоль каждого праймера НСV-Р и НСУ-К, представленных 8ЕЦ ΙΌ № 99 и 100, и 2 мкл одного из образцов РНК. Смеси нагревают при 30°С в течение 10 мин и затем проводят реакцию при 50°С в течение 30 мин. После обратной транскрипции осуществляют Ιί.ΆΝ. Для IСАN используют праймеры НСV-Р2 и НСУ-К1 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕЦ ΙΌ Ыо 101 и 102.
Реакцию осуществляют следующим образом.
Готовят 10 мкл смеси, содержащей по 50 пмоль каждого праймера, 3 мкл одной из реакционных смесей для обратной транскрипции и пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%. В качестве контроля используют 3 мкл стерильной воды. Смеси в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Рег5опа1 нагревают при 98°С в течение 2 мин, быстро охлаждают до 60°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин
- 55 005739 и переносят на лед.
После отжига к смеси добавляют, в конечных концентрациях буфер 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 10 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, по 500 мкМ каждого бХТР, 30 Е РНКазы Н Е. со11 и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег МР, установленный на 60°С, и проводят реакцию в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №.18|еуе-агароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 19А. Фиг. 19А показывает результаты детекции НСУ в клинических образцах. Полоса В: стерильная вода в качестве матрицы; полоса 1: образец от здорового индивидуума; полосы 2-6: образцы от пациентов с НСУ; и полоса М: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.).
Как видно на фиг. 19А, продукты амплификации размером около 107 п.о., ожидаемым на основании нуклеотидной последовательности генома НСУ, отмечают только в образцах РНК от пациентов с НСУ, в то время как такого продукта амплификации не наблюдают в случае сыворотки здорового индивидуума и контроля. Кроме того, методом дот-блоттинга осуществляют гибридизацию ГОАКамплифицированных продуктов, как описано в примере 9, с использованием зонда для НСУ, представленного 8ЕО ГО № 103, биотинилированного по 5'-концу. Результаты приводятся на фиг. 19В. Полосы для образцов на фиг. 19В соответствуют указанным для электрофореза.
Как видно на фиг. 19, подтверждается, что результаты электрофореза соответствуют результатам гибридизации дот-блоттингом. Такие результаты подтверждают, что способ настоящего изобретения можно использовать для детекции НСУ в реальных клинических образцах, и он эффективен для детекции вируса и т. п.
Пример 22. Проверяют способ детекции аденовируса.
Праймеры для амплификации Е1 А (опухолевый ген) - Е1 А-1 (смысловой), Е1 А-2 (антисмысловой) и Е1А-3 (антисмысловой), представленные 8ЕО ГО № 104-106, конструируют на основе нуклеотидной последовательности аденовируса (беиеВаик, инвентарный № Ю1917). Используют аденовирус (АТСС, инвентарный № ΥΚ.-5). Матрицу готовят следующим образом. Инкубируют 100 мкл раствора, содержащего аденовирус в концентрации 8,73 х 1010 бляшкообразующих единиц/мл (бое/мл), в присутствии 8Ό8 в конечной концентрации 0,1% и протеиназы К в конечной концентрации 0,2 мг/мл при 37°С в течение 1 ч. ДНК очищают адсорбцией на силикагеле. Используют аденовирусные ДНК, соответствующие по количеству 103, 104, 105 или 106 бое, полученные разведением очищенной ДНК стерильной водой. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл реакционной системы, содержащей по 60 пмоль каждого из праймеров Е1А-1 и Е1А-2 (длина амплифицируемой цепи 112 п.о.) или Е1А-1 и Е1А-3 (длина амплифицируемой цепи 91 п.о.), 2 мкл 0,05% раствора пропилендиамина и матрицу, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 4 0 мкл смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из бКТР, буфер 42,5 мМ Трицин-гидроксид калия (рН 8,5), 5,0 мМ ацетат магния, 0,0125% В8А, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. со11 и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят конечный объем до 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч. В качестве контроля осуществляют детекцию методом ПЦР с использованием той же матрицы, описанной выше, и праймеров, сконструированных для ПЦРамплификации Е1А (опухолевый ген) - Е1А-1Р (смысловой), Е1А-2Р (антисмысловой) и Е1А-3Р (антисмысловой), с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ГО Ν 107, 108 и 142. ПЦР осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 50 мкл раствора для ПЦР, содержащего по 60 пмоль каждого из праймеров Е1А-1Р и Е1А-2Р (длина амплифицируемой цепи 112 п.о.) или Е1А-1Р и Е1А-3Р (длина амплифицируемой цепи 91 п.о.), 5 мкл 10-кратного Ех Тац-буфера (Такага Шш/о), 1,25 Е ТаКаРа Ех Тац-ДНК-полимеразы (Такага Шшхо) и 0,2 мМ каждого из бЭТР. Условия РСР следующие: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с.
После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси IСАN и ПЦР подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 20 и в табл. 9. Фиг. 20 показывает результаты детекции вирусного гена Е1А из аденовирусных частиц. Полосы 1-10 показывают результаты, полученные с использованием комбинации праймеров Е1 А-1 и Е1 А-2. Полосы 11-20 показывают результаты, полученные с использованием комбинации праймеров Е1А-1 и Е1А-3. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 106 бое; полоса 3: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 105 бое; полоса 4: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 104 бое; полоса 5: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 103 бое; полоса 6: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 7: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 106 бое; полоса 8: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 105 бое; полоса 9: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 104 бое; полоса 10: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 103 бое. Кроме того, полоса 11: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 12: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 106 бое; полоса 13: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 105 бое; полоса 14: IСАN с использованием ДНК, соответствующей 104 бое; полоса 15: ΚΆΝ с использованием ДНК, соответствующей 103 бое; полоса 16: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 17: ПЦР с использованием
- 56 005739
ДНК, соответствующей 106 бое; полоса 18: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 105 бое; полоса 19: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 104 бое; и полоса 20: ПЦР с использованием ДНК, соответствующей 103 бое.
Таблица 9
Размер амплифицируемого фрагмента (п.о.) _____Предел детекции____
1САИ ПЦР
112 ΙΟ4 104
104 104
Как видно из фиг. 20 и табл. 9, подтверждается, что чувствительность детекции в случае детекции гена Е1А аденовируса методом IСАN эквивалента чувствительности ПЦР.
Пример 23.
Проверяют детекцию интегрированного вирусного гена в клетках, инфицированных ретровирусным вектором. Клетки, инфицированные ретровирусом, и геномную ДНК получают следующим образом. Коротко, векторную плазмиду р^ОN-АI (Такага 8йихо) вводят в упаковывающие клетки СРЕ+86 кальций-фосфатным способом. Из культурального супернатанта трансфицированных клеток получают экотропный вектор. Клетки, инфицированные вирусным вектором, получают путем инфицирования клеток МН/3Т3 экотропным вектором и культивирования инфицированных клеток в течение 14 суток в среде, содержащей 0418. Из 4 х 104 клеток, инфицированных ретровирусом, обычным способом получают 27 мкг геномной ДНК. В качестве праймеров используют праймеры рОО№АЕ1 и рОО№АЕ2, описанные в примере 18(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, 10 мкл реакционной системы, содержащей 60 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,25% водного раствора пропилендиамина и от 0,1 до 1000 нг геномной ДНК в качестве матрицы, нагревают в термоциклере (Такага 8йихо) при 98°С в течение 2 мин и затем при 60°С для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из бЭТР, буфер 40 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 5 мМ ацетат магния, 0,0125% В8А, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят конечный объем до 50 мкл. Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч в термоциклере. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Кроме того, для сравнения чувствительности детекции ДНК методом IСАN и ПЦР проводят ПЦР с использованием праймеров рОО№АЕ3 и рОО^АМ, представленных 8ЕО ΙΌ № 111 и 112. ПЦР осуществляют следующим образом. Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей от 0,1 до 100 нг матрицы, 60 пмоль каждого праймера, 5 мкл 10-кратного Ех Тадбуфера, 1,25 Е ТаКаКа Ех Тад-ДНК-полимеразы и 0,2 мМ каждого из б№ТР. В смесях проводят реакцию с использованием термоциклера Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 в следующих условиях: 35 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 21. Фиг. 21 показывает результаты детекции методом Κ'.ΆΝ и ПЦР гена интегрированного вируса гена в клетках, инфицированных ретровирусным вектором. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: 1000 нг матрицы; полоса 3: 100 нг матрицы; полоса 4: 10 нг матрицы; полоса 5: 1 нг матрицы; и полоса 6: 0,1 нг матрицы.
Как видно из фиг. 21, продукты амплификации, представляющие интерес, отмечают в случае Κ'.ΆΝ с использованием 1 нг матричной ДНК и в случае ПЦР из 35 циклов - с использованием 1 нг матрицы.
Пример 24.
Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, при котором комбинируют способ амплификации настоящего изобретения и способ гибридизации, проверяют на детекции гена веротоксина Ι Ексйепсййа сой О-157. Ген веротоксина Ι из энтерогеморрагической ЕксйепсЫа сой О-157 выбирают в качестве матрицы. Матричную ДНК получают так, как описывается в примере 8(1). В качестве участка для амплификации выбирают участок длиной около 80 п.о. с содержанием ОС примерно 40%. В качестве праймеров используют праймеры УТ1-ГЕ4 и УТ 1-ΙΚ1 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 113 и 114. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 5 мкл смеси, содержащей по 60 пмоль каждого из праймеров УТ1-ГЕ4 и УТЫКТ, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01%, одну из вытяжек горячей водой, соответствующих 0-105 клеткам, и стерилизованную воду. Смеси в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Регкоиа1 денатурируют при 98°С в течение 2 мин, быстро охлаждают до 55°С и инкубируют при такой температуре в течение 1 мин и затем помещают на лед для отжига.
После отжига к смеси добавляют, в конечной концентрации, буфер 20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 500 мкМ каждого из б№ТР, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 15 Е РНКазы Н Е. сой и 2,75 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ, и доводят конечный объем до 25 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Регкоиа1, установленный на 55°С, и инкубируют при указанной температуре в течение 60 мин. В качестве контроля в термоциклере
- 57 005739
Т11егша1 Сус1ег Ρе^8οηа1 проводят ПЦР с вытяжками горячей водой с использованием набора О-157 Туртд 8е1 (Такага 81ιιιζο) согласно инструкции. ПЦР осуществляют следующим образом: 35 циклов - 94°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Общее время, необходимое для реакции, составляет примерно 145 мин. Ожидаемый размер амплифицированного продукта 349 п.о. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №81еуе-агароза 3:1. Результаты для ΚΑΝ приводятся на фиг. 22. Фиг. 21 показывает результаты детекции гена веротоксина Ι Е. той 0-157. Полоса М: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса Ν: в качестве матрицы стерильная вода; полоса 1: матрица соответствует 1 клетке; полоса 2: матрица соответствует 10 клеткам; полоса 3: матрица соответствует 102 клеткам; полоса 4: матрица соответствует 103 клеткам. Кроме того, результаты детекции методами ΚΑΝ и ПЦР приводятся в табл. 10.
Таблица 10 Число клеток Е. со11 0-157
1 10
1САЫ - + ++ +
ПЦР-+++
- : амплификация отсутствует; от + до +++ указывает степень амплификации по трехбалльной шкале.
Как видно из табл. 10, продукты амплификации, представляющие интерес, получают в случае реакционной системы, когда как для ΚΑΝ, так и для ПЦР используют вытяжку горячей водой, соответствующую 1 клетке. Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов амплификации методом дотблоттинга с использованием олигонуклеотидного зонда УТ1 с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕР ΙΌ Νο 115, меченного биотином по 5'-концу. Гибридизацию осуществляют так, как описывается в примере 19. Результаты совпадают с результатами, полученными электрофорезом. Таким образом, подтверждается, что чувствительность детекции при ΚΑΝ и ПЦР эквивалентна. Кроме того, общее время, требуемое для реакции амплификации с использованием ΚΑΝ настоящего изобретения, составляет 1/2 или меньше по сравнению со временем, требуемым для ПЦР. Таким образом, подтверждается, что ΚΑΝ настоящего изобретения эффективен как способ детекции патогенных бактерий и т.п.
Пример 25.
Проверяют способ детекции гена ботулинического токсина типа А. В качестве матрицы используют ДНК, полученную из штамма ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит, тип А-190, выделенного при случае пищевого отравления. Указанный штамм хранится в Эераг1теп1 ο£ Нуд1епе, Кадара Νπΐτίΐίοη Ишуегайу. В качестве праймеров для детекции синтезируют праймеры ВοΐΑ 82 и ВοΐΑ Α2 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕР ΙΌ Νο 116 и 117. Размер продукта амплификации, полученного с использованием пары праймеров, составляет примерно 150 п.о. Получают растворы, содержащие 100 фг, 1 пг, 10 пг или 100 пг ДНК из продуцирующей токсин типа Α ΟοδΙπάίιιιη Ьοΐи1^ηит в 1 мкл стерильной воды, для использования в качестве матриц. Реакцию осуществляют следующим образом.
Готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и 1 мкл одного из растворов ДНК в качестве матрицы. Смеси подвергают ΚΑΝ с использованием состава реакционной смеси и условий реакции, описанных в примере 19. В качестве контроля осуществляют ПЦР в термоциклере Тйегта1 Сус1ег Ρе^8οηа1 с использованием набора праймеров для детекции гена ботулинического токсина типа Α ВΑ8-1 и ВΑ8-2 (Такага δΐιιιζο) согласно инструкции. Ожидаемый размер продукта амплификации 284 п.о.
После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле М18|еуеагароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 23 А. Фиг. 23 А показывает результаты детекции гена ботулинического токсина типа А способами ΚΑΝ и ПЦР. Полоса М1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса М2: маркер молекулярной массы (50-2000 п.о.); полоса 1: без матрицы; полоса 2: 100 фг матрицы; полоса 3: 10 пг матрицы; и полоса 4: 100 пг матрицы.
Как видно из фиг. 23 А, продукт амплификации способом ΚΑΝ, представляющий интерес, отмечают в реакции, в которой используют 100 фг матричной ДНК. С другой стороны, продукт амплификации способом ПЦР, представляющий интерес, в реакции с использованием 100 фг матричной ДНК не отмечают. Кроме того, осуществляют гибридизацию продуктов реакции методом дот-блоттинга с использованием зонда ВοΐΑ с нуклеотидной последовательностью, представленной 8 Ер ΙΌ Νο 118. Гибридизацию дот-блоттингом осуществляют так, как описывается в примере 9. Результаты приводятся на фиг. 23В. Как видно на фиг. 23В, сигналы наблюдают, когда используют 100 фг матрицы в случае ΚΑΝ и когда используют 10 пг матрицы в случае ПЦР, соответственно. Такие результаты согласуются с результатами электрофореза.
Пример 26.
Проверяют детекцию вироида хризантемы. Готовят 10-кратные серийные разведения низкомолекулярной РНК, полученной по способу экстрагирования низкомолекулярных РНК из вироида карликовости хризантемы (С8\Д), описанному в примере 1 в ΙΡ-Α 9-140383. Реакцию обратной транскрипции осуще
- 58 005739 ствляют с использованием набора КХА РСК кй (АМ^) уат. 2.1 (Такага 8йихо). Конкретно, готовят 20 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции, содержащей 1-кратный буфер КИА РСК, 5 мМ МдС12, 1 мМ каждого из бИТР, 10 Е ингибитора РНКазы, 5 Е обратной транскриптазы ХЬ АМУ, 50 пмоль случайного 9-мера, 1 мкл одного из серийных разведений РНК. Смеси нагревают при 30°С в течение 10 мин, проводят реакцию при 55°С в течение 30 мин, и затем смеси нагревают при 99°С в течение 5 мин для инактивации обратной транскриптазы. После охлаждения проводят Ιί'ΆΝ. Используют 1 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции в качестве матрицы для ГОАК В данном примере в качестве праймеров используют праймеры С8УО-Е4 и С8УЭ-К3 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ Νο 119 и 120. Реакцию осуществляют так, как описывается в примере 19, за исключением того, что температура реакции составляет 60°С и используют термоциклер Тйегта1 Сус1ег МР. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле М^етеагароза 3:1.
С другой стороны, проводят ПЦР-амплификацию в реакционной системе объемом 50-мкл с использованием в качестве матрицы 1 мкл той же самой реакционной смеси для обратной транскрипции. В качестве праймеров используют праймеры Е94 и К264, представленные 8ЕО ΙΌ Νο 109 и 110. Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят реакционную смесь с использованием набора ТаКаКа РСК АтрШлсайоп кй согласно протоколу. Добавляют к смеси по 10 пмоль каждого праймера и 1 мкл одной из реакционных смесей для обратной транскрипции, и доводят общий объем до 50 мкл. Реакцию амплификации осуществляют с использованием термоциклера Тйегта1 Сус1ег МР. Реакцию осуществляют следующим образом: 30 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле №.18|еуеагароза 3:1. Результаты приводятся в табл. 11.
Таблица 11 Степень разведения х 102 х 10э
РНК как матрицы
КТ-ТСАЙ ++ +
ОТ-ПЦР__________________________+_____________________-_________
- : нет амплификации; + : есть амплификация; ++ : хорошая амплификация.
Как видно из табл. 11, продукт амплификации способом IСΑN отмечают реакции, в которой в качестве матрицы используют образец РНК 103-кратного разведения. С другой стороны, продукт амплификации способом ПЦР отмечают в реакции, в которой в качестве матрицы используют образец РНК 102кратного разведения.
Кроме того, гибридизацией дот-блоттингом подтверждают, что IСΑN-амплифицированные продукты и ПЦР-амплифицированные продукты являются продуктами, представляющими интерес. Гибридизацию дот-блоттингом осуществляют с использованием зонда С8Уб с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕО ΙΌ Νο 121, меченного биотином по 5'-концу. Гибридизацию осуществляют так, как описывается в примере 9. Результаты согласуются с результатами электрофореза. Сигналы наблюдают при использованием образца РНК 103-кратного разведения в случае IСΑN и при использовании образца 102-кратного разведения в случае ПЦР, соответственно, что показывает, что IСΑN более чувствителен, чем ПЦР.
Пример 27.
Проверяют детекцию гена вироида в хризантеме, инфицированной вироидом карликовости хризантемы (С8Уб), с использованием РГи РНКазы Н. Смесь (60 мкл), содержащую 3 мкл одного из 10-кратных серийных разведений РНК, полученных в примере 26, 10 мМ Трис-гидрохлоридный буфер (рН 8,3), 50 мМ хлорид калия, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ каждого из бNТΡ, 150 пмоль случайного 6-мера, 60 Е ингибитора РНКазы (Такага 8йихо) и 15 Е обратной транскриптазы ХЬ (АМУ), инкубируют с целью получения кДНК с использованием термоциклера (СепеАтр РСК 8уз!ет 9600, АррНеб Вюзуз!етз) при 30°С в течение 10 мин и при 42°С в течение 1 ч и затем нагревают при 99°С в течение 5 мин для инактивации фермента. Синтезируют праймеры Уб1, Уб2, Уб3 и Уб4, представленные 8ЕО ΙΌ Νο 122-125, на основе нуклеотидной последовательности мРНК вироида.
Смесь (50 мкл), содержащую по 50 пмоль каждого из праймеров Уб1 и Уб2, в качестве матрицы - 1 мкл раствора кДНК, синтезированной так, как описано выше, его 10-, 100-, 1000- или 10000-кратного разведения водой или воды в случае отрицательного контроля, 0,5 мМ каждого из бNТΡ, буфер 32 мМ ΗΕΡΕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8А, 1% ДМСО, 0,0156 мкг РГи РНКазы Н и 1 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, инкубируют при 57°С в течение 1 ч в термоциклере. Прореагировавшие образцы до анализа хранят замороженными при -20°С.
В качестве контроля осуществляют ПЦР. Коротко, в 50 мкл реакционной системы, содержащей по 50 пмоль каждого из праймеров Уб3 и Уб4, 1 мкл раствора кДНК или его 10-, 100-, 1000- или 10000кратного разведения водой или воды в случае отрицательного контроля, 5 мкл 10-кратного Ех Тас.|
- 59 005739 буфера, 1,25 Е ТаКаКа Ех Тад-полимеразы и 0,2мМ каждого из бЭТР, проводят реакцию в термоциклере. Программа следующая: 1 цикл - 94°С в течение 2 мин; 35 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; и 1 цикл - 72°С в течение 5 мин. Прореагировавшие образцы до анализа хранят замороженными при -20°С.
По 5 мкл каждой реакционной смеси IСАN и ПЦР подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 24. Фиг. 24 показывает результаты детекции вироида способом IСАN с использованием Р£ц РНКазы Н и способом ПЦР. Полоса 1: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль; полоса 3: 10000-кратное разведение кДНК; полоса 4: 1000-кратное разведение кДНК; полоса 5: 100-кратное разведение кДНК; полоса 6: 10-кратное разведение кДНК; и полоса 7: исходный раствор ДНК.
Как видно из фиг. 24, продукты амплификации, представляющие интерес, наблюдают при использовании 100-кратного разведения кДНК как в случае ΙΕΆΝ, так и в случае ПЦР.
Пример 28.
Проверяют детекцию гена К-гак.
(1) . Обнаружение в геномной ДНК.
Конструируют праймеры с-К1-гак-1 и с-К1-гак-2, представленные 8ЕО ΙΌ № 126 и 127, на основе нуклеотидной последовательности с-К1-гак человека.
Готовят 10 мкл смеси, содержащей 60 пмоль каждого праймера, 2 мкл 0,25% водного раствора пропилендиамина и от 1 до 100 нг геномной ДНК человека (С1оп1ес11) в качестве матрицы. Смеси в термоциклере ТНегта1 Сус1ег Регкопа1 нагревают при 98°С в течение 2 мин и затем при 53°С для отжига праймеров к матрице.
После отжига к смеси добавляют 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,625 мМ каждого из бЭТР, буфер 40 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 125 мМ ацетат калия, 5 мМ ацетат магния, 0,0125% В8А, 1,25% ДМСО, 30 Е РНКазы Н Е. сой и 5,5 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т, и доводят конечный объем до 50 мкл.
Реакционные смеси инкубируют при 53°С в течение 1 ч. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле.
С другой стороны, в качестве контроля проводят ПЦР. В качестве праймеров используют праймеры с-К1-гак-3 и с-К1-гак-4, представленных 8ЕО ΙΌ № 128 и 129. Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей 60 пмоль каждого праймера, от 0,1 до 100 нг матрицы, 5 мкл 10-кратного Ех Тад-буфера, 1,25 Е ТаКаКа Ех Тад-ДНК-полимеразы и 0,2 мМ каждого из бЭТР. В смеси проводят реакцию с использованием термоциклера Тйегта1 Сус1ег Регкопа1 в следующих условиях: 30 или 35 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 25. Фиг. 25 показывает результаты детекции гена с-К1-гак способами IСАN и ПЦР. Для ΙΕΆΝ: полоса 1: маркер молекулярной массы; полоса 2: 100 нг матрицы; полоса 3: 10 нг матрицы; полоса 4: 1 нг матрицы; и полоса 5: без матрицы. Для ПЦР: полоса 1: 100 нг матрицы; полоса 2: 10 нг матрицы; полоса 3: 1 нг матрицы; и полоса 4: без матрицы.
Как видно из фиг. 25, продукты амплификации, представляющие интерес, отмечают при использовании 1 нг матрицы в случае IСАN и при использовании 10 нг матрицы в случае ПЦР из 30 циклов. Результаты сравнения количеств амплифицированных продуктов, полученных способами IСАN и ПЦР с использованием от 1 нг до 100 нг матрицы, приводятся на фиг. 30. На данной фигуре заштрихованные столбцы представляют результаты ПЦР из 30 циклов, темные в белую крапинку столбцы представляют результаты ПЦР из 35 циклов и сплошные черные столбцы представляют результаты ΙΕΆΝ, соответственно. Как видно из фиг. 30, подтверждается, что количество амплифицированного продукта, полученного методом ΙΕΆΝ, больше, чем количество, полученное ПЦР.
(2) . Детекция в образцах крови.
Получают геномные ДНК с использованием набора Όγ. СепТЬЕ™ (для цельной крови) (Такага 81шхо) из 100 мкл каждого образца крови, взятого у здорового индивидуума, с использованием цитрата натрия или гепарина в качестве антикоагулянта. Осуществляют детекцию гена с-К1-гак методом IСАN так, как описывается выше в (1), с использованием полученной ДНК, соответствующей 0,04-5 мкл крови. Кроме того, осуществляют детекцию с использованием ДНК из 0,04-5 мкл образцов крови, так, как описывается выше в (1), для того, чтобы сравнить чувствительность детекции ДНК методами IСАN и ПЦР. Результаты приводятся на фиг. 26. Фиг. 26 показывает результаты детекции гена с-К1-гак в образцах крови методами IСАN и ПЦР. Для ΙΕΆΝ: полоса 1: маркер молекулярной массы; полоса 2: 5 мкл цитратной крови; полоса 3: 1 мкл цитратной крови; полоса 4: 0,2 мкл цитратной крови; полоса 5: 0,04 мкл цитратной крови; полоса 6: 5 мкл гепаринизированной крови; полоса 7: 1 мкл гепаринизированной крови; полоса 8: 0,2 мкл гепаринизированной крови; и полоса 9: 0,04 мкл гепаринизированной крови. Для ПЦР: полоса 1: маркер молекулярной массы; полоса 2: 5 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 3: 1 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 4: 0,2 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 5: 0,04 мкл цитратной крови, 30 циклов; полоса 6: 5 мкл цитратной крови, 35 циклов; полоса 7: 1 мкл цитратной крови, 35 циклов; полоса 8: 0,2 мкл цитратной крови, 35 циклов; полоса 9: 0,04 мкл цитратной крови, 35 циклов; поло
- 60 005739 са 10: 5 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 11: 1 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 12: 0,2 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 13: 0,04 мкл гепаринизированной крови, 30 циклов; полоса 14: 5 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов; полоса 15: 1 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов; полоса 16: 0,2 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов; и полоса 17: 0,04 мкл гепаринизированной крови, 35 циклов.
Как видно из фиг. 26, продукты амплификации, представляющие интерес, отмечают при использовании геномной ДНК, соответствующей 0,2 мкл любого образца крови в случае IСАN и геномной ДНК, соответствующей 0,2 мкл любого образца крови (цитратной или гепаринизированной) в случае ПЦР из 30 циклов, соответственно.
Пример 29.
Проверяют детекцию гена веротоксина 2 (УТ-2) ЕксЕепсЫа сой О-157 с использованием Вса РНКазы НШ.
Энтерогеморрагическую ЕксЕепсЫа со11 О-157 культивируют в среде тЕС, содержащей новобиоцин, при 42°С в течение 18 ч и затем прогревают при 95°С в течение 10 мин. Готовят разведения в стерильной воде, соответствующие 0, 1, 10, 102 или 103 клеткам и используют в качестве матриц. В качестве праймеров для детекции синтезируют праймеры УТ2-ГЕ4 и УТ2-ГКЗ с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 130 и 131. Размер амплифицированного продукта, полученного с использованием такой пары праймеров, составляет 146 п.о.
Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл смеси, содержащей 50 пмоль каждого праймера, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и одну из вытяжек горячей водой. Смеси в термоциклере ТЕегта1 Сус1ег Регкопа1 прогревают при 98°С в течение 2 мин и инкубируют при 55°С в течение 1 мин и затем помещают на лед. К смеси добавляют в конечных концентрациях буфер 34 мМ Трицинового (рН 8,7), 10 мМ хлорид калия, 10 мМ сульфат аммония, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бКТР, 32 Е Вса РНКазы НШ, полученной так, как в ссылочном примере 3(5), и 5,5 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т, и доводят до конечного объема 50 мкл. Реакционные смеси помещают в термоциклер, установленный на 55°С, и проводят реакцию при указанной температуре в течение 60 мин. После реакции по 3 мл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 4% геле №.18|еуе-агароза 3:1. Результаты приводятся на фиг. 27. Фиг. 27 показывает результаты детекции гена веротоксина ΙΙ (УТ2) ЕксНепсЫа сой О-157 с использованием Вса РНКазы НШ. Полоса М: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п. о.); полоса Ν: стерилизованная вода в качестве матрицы; полоса 1: матрица, соответствующая 1 клетке; полоса 2: матрица, соответствующая 10 клеткам; полоса 3: матрица, соответствующая 102 клеткам; и полоса 4: матрица, соответствующая 103 клеткам.
Как видно из фиг. 27, ген УТ2 обнаруживают способом IСАN с использованием вытяжки горячей водой, соответствующей 1 клетке. Такие результаты равнозначны результатам реакций детекции способом IСАN с использованием РНКазы Н Е. сой и ПЦР, полученным в примере 9. Таким образом, подтверждается, что IСАN с использованием термостойкой РНКазы Н, Вса РНКазы НШ, также эффективен при обнаружении вирусов, бактерий и т. п.
Пример 30.
Проверяют детекцию гена энтеротоксина А 81арЕу1ососсик аигеик. На основе нуклеотидной последовательности области гена энтеротоксина А 81арЕу1ососсик аигеик синтезируют праймеры 8ЕА-1 и 8ЕА2, представленные 8ЕО ΙΌ Ν 136 и 137. Реакционную смесь (50 мкл), содержащую 1 мкл раствора, содержащего 115 пг или 1,15 нг геномной ДНК 81арЕу1ососсик аигеик (АТСТ, инвентарный № 13565) или 1 мкл воды в случае отрицательного контроля, 50 пмоль каждого праймера, 0,5 мМ каждого из бЫТР, буфер 32 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% В8А, 1% ДМСО, 0,0156 мкг Р£ц РНКазы Н и 1 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т, инкубируют при 58°С в течение 1 ч в термоциклере. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 29. Фиг. 29 показывает результаты электрофореза при детекции гена энтеротоксина А 81арЕу1ососсик аигеик. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: отрицательный контроль (стерильная вода); полоса 3: 115 пг матрицы; и полоса 4: 1,15 нг матрицы.
Как видно из фиг. 29, продукт амплификации, представляющий интерес, отмечают при использовании примерно 1,15 нг матрицы.
Пример 31.
Проверяют детекцию вируса гепатита С (НСУ). На основе нуклеотидной последовательности НСУ синтезируют праймеры НСУ-Е3 и НСУ-Я1 с нуклеотидными последовательностями, представленными 8ЕО ΙΌ № 138 и 139. Матричную ДНК получают следующим образом. Коротко, с использованием термоциклера (Сепе Атр РСЯ 8ук1ет 9600, АррНеб Вюкук1етк), 4 мкл смеси, содержащей РНК, полученную из 100 мкл сыворотки здорового индивидуума или пациента, инфицированного НСУ, так, как описывается в примере 21, 10 мМ Трис-гидрохлоридный буфер (рН 8,3), 5 мМ МдС12, 1 мМ каждого из бЫТР, 10 пмоль случайного 6-мера и 10 Е обратной транскриптазы ХЬ (Такага 8Еи7о), инкубируют при 30°С в течение 10 мин и при 42°С в течение 1 ч, и затем прогревают при 99°С для инактивации фермента для получения кДНК.
- 61 005739
Осуществляют IСΑN при 55°С в течение 1 ч, как описывается в примере 13, за исключением того, что используют 1 мкл реакционной смеси, в которой проводился синтез кДНК, и по 100 пмоль каждого из праймеров НСУ-Е3 и НСУ-К1. После реакции по 2,5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 31. Фиг. 31 показывает результаты электрофореза при обнаружении вируса гепатита С. Полоса 1: маркер молекулярной массы (ступенчатый маркер с шагом 100 п.о.); полоса 2: матрица, полученная из сыворотки здорового индивидуума; и полосы 3-6: матрицы, полученные из сыворотки пациентов, инфицированных НСУ.
Как видно из фиг. 31, подтверждается, что НСУ можно специфически обнаруживать в образцах сыворотки пациентов, инфицированных НСУ.
Пример 32.
Проверяют способ амплификации настоящего изобретения.
(1) . Осуществляют ПЦР с использованием плазмидной ДНК рИС19-150, полученной так, как описывается в примере 2(2), в качестве матрицы и праймеров МСБ-Е и МСБ-К, представленных БЕЦ ΙΌ № 35 и 36. ПЦР-амплифицированный фрагмент длиной 534 п.о. получают путем очистки реакционной смеси с использованием Мюгосоп-100 (Мййроге). Готовят реакционную смесь, содержащую 15 нг ПЦРфрагмента и 30 пмоль праймера МК2 с нуклеотидной последовательностью, представленной БЕЦ ΙΌ № 140, меченного [у-32Р]АТР по 5'-концу путем фосфорилирования, и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и реакционную смесь, также содержащую 30 пмоль праймера МК1 с нуклеотидной последовательностью, представленной БЕЦ ΙΌ № 141. Реакционные смеси денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С. К реакционной смеси добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ Трицин-буфер (рН 8,7), 12,5 мМ хлорид калия, 12,5 мМ сульфат аммония, 0,0125% ВБА, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из й№ГР), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕБТ. В полученной реакционной смеси проводят реакцию при 55°С в течение 15 мин. После реакции к 5 мкл реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для остановки реакции (95% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромофеноловый синий, 0,5% ксиленцианол). Смесь денатурируют нагреванием при 94°С в течение 3 мин. По 1,6 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 6% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину, и регистрируют сигналы с использованием ВАБ2000 (Еицх) для обнаружения продуктов, достроенных с праймера МК1. Результаты приводятся на фиг. 32 А. Ступенчатую последовательность полос на фиг. 32А получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М13тр18 (Такага Бйихо) с использованием праймера МЕ2, меченного [у-32Р]АТР путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: комбинация праймеров МР2 и МК1; и полоса 2: МК1.
Как видно из фиг. 32А, фрагмент длиной 448 п.о., достроенный с праймера МК1 до конца матрицы, обнаруживается, когда реакцию достраивания осуществляют путем добавления к матрице только праймера МК1. С другой стороны, при добавлении также МР2, кроме вышеуказанной полосы, отмечают фрагмент длиной 373 п.о., ограниченный праймерами МК1 и МР2. Таким образом, доказывается, что достраивание с праймера МК1 с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента в качестве матрицы под действием ДНК-полимеразы Вса ВЕБТ переключается, из-за переключения матрицы, на достраивание с использованием в качестве матрицы цепи, достроенной с праймера МР2. Кроме того, переключение матрицы отмечают, когда в сходных условиях в качестве мезофильной ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи используют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы. С другой стороны, переключения матрицы не отмечают, когда используют ТаКаКа Тад ДНК-полимеразу (Такага Бйихо) или ДНК-полимеразу РугоВЕБТ (Такага Бйихо) без активности замещения цепи.
(2) . Проверяют реакцию переключения матрицы с использованием цепи матричной ДНК с отожженным к ней праймером. Фрагменты ДНК, к которым могут отжигаться праймеры МР2 и МК1, получают следующим образом. Проводят ПЦР с использованием плазмиды рИС19 в качестве матрицы и праймеров МСБЕ и КУ (Такага Бйихо) или праймеров М4 (Такага Бйихо) и МСБК. Реакционные смеси очищают с использованием Мюгосоп-100 для получения ПЦР-амплифицированных фрагментов МСБЕКУ (236 п.о.) и М4-МСБК (271 п.о.). Участок, ограниченный праймерами М4 и КУ, как правило присутствует в обоих ПЦР-амплифицированных фрагментах.
Затем следующим образом готовят комплекс матрица-праймер (1), в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, не отжигаются одна с другой, и комплекс матрица-праймер (2), в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, отжигаются одна с другой.
(1) . Реакционную смесь, содержащую 30 нг фрагмента МСБЕ-КУ, 40 пмоль праймера МЕ2, меченного [у-32Р]АТР по 5'-концу путем фосфорилирования, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и смесь, содержащую 30 нг фрагмента М4-МСБК, 40 пмоль праймера МК1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, по отдельности денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С. По 2,5 мкл реакционных смесей смешивают вместе, получая комплекс матрица-праймер.
(2) . Реакционную смесь, содержащую 15 нг фрагмента МСБЕ-КУ, 15 нг фрагмента М4-МСБК, 20 пмоль праймера МЕ2, меченного [у-32Р]АТР по 5'-концу путем фосфорилирования, 20 пмоль праймера
- 62 005739
МВ1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, денатурируют нагреванием при 98°С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55°С, получая комплекс матрица-праймер.
К 5 мкл реакционной смеси для получения комплекса матрица-праймер добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ Трицин-буфер (рН 8,7), 12,5 мМ хлорид калия, 12,5 мМ сульфат аммония, 0,0125% ВЗА, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетат магния, 0,625 мМ каждого из бИТР), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕЗТ. В полученной смеси проводят реакцию при 55°С в течение 15 мин. После реакции к 5 мкл реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для остановки реакции (95% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромофеноловый синий, 0,5% ксиленцианол). Смесь денатурируют нагреванием при 94°С в течение 3 мин. По 1,6 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 6% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину, и регистрируют сигналы с использованием ВАЗ2000 (Еццх) для обнаружения продуктов, достроенных с праймера МЕ2. Результаты приводятся на фиг. 32В. Ступенчатую последовательность полос на фиг. 32В получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М13тр18 с использованием праймера МВ1, меченного [у-32Р]АТР путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: цепи матричной ДНК не отожжены одна с другой; и полоса 2: цепи матричной ДНК отожжены одна с другой.
Как видно из фиг. 32В, только фрагмент длиной 161 п.о., достроенных с праймера МЕ2 до конца матрицы, обнаруживается в случае комплекса матрица-праймер, в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами не отжигаются одна с другой. С другой стороны, в случае комплекса матрица-праймер, в котором цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, отжигаются одна с другой, кроме вышеуказанного фрагмента отмечают фрагмент длиной 223 п.о., ограниченный праймерами МЕ2 и МВ1. Таким образом, доказывается, что реакция переключения цепи происходит, если цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами, отжигаются одна с другой.
Пример 33.
(1) . Проверяют детекцию МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к с использованием РНКазы Н, полученной из Агсйаеод1оЬик Еи1д1бик (А£ц), описанной в примере 7. На основе нуклеотидной последовательности генома МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к, зарегистрированной в СепеВапк под инвентарным № АЫ23456, синтезируют праймеры МПЗ2Е (ЗЕО ГО Ио 155) и МГОЗ2В (ЗЕО ГО Ио 156). Длина фрагмента, ограниченного парой праймеров, включая сами праймерные участки, составляет 103 п.о. Геномную ДНК МусоЬас1егшт 1цЬегси1ок1к для использования как матрицы экстрагируют из сухой вакцины БЦЖ (И1рроп ВСС Зе1/о) обычным способом. Готовят растворы, содержащие 100 пг, 10 пг, 1пг, 100 фг, 10 фг или 1 фг геномной ДНК на мкл стерильной воды. Реакции проводят следующим образом. Коротко, смешивают, в конечных концентрациях, буфер 32 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ВЗА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бИТР, 50 пмоль каждого из праймеров МПЗ2Е и МГОЗ2В, 8,75 Е РНКазы Н из А£ц и 8 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ и 1 мкл одной из матриц, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Регкопа1, установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле.
С другой стороны, в качестве контроля проводят ПЦР. В качестве праймеров используют праймеры МПЗ РСВ-Е и МПЗ РСВ-В, описанные в Вшкйо Вуоп (Т1е 1арапеке 1оита1 о£ С11шса1 Ра1йо1оду), 43(9):941-947 (1995). С использованием этой пары праймеров получают продукт амплификации размером 276 п.о. Реакционную смесь (50 мкл) готовят, используя 10 пмоль каждого праймера согласно руководству, прилагаемому к Ех Тад ДНК-полимеразе (Такага З1шхо). Реакционную смесь помещают в термоциклер и проводят реакцию, состоящую из 4 0 циклов, включающих 94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле.
В результате образования продуктов амплификации, представляющих интерес, наблюдают в обоих случаях с использованием 100 фг матрицы.
(2) . Проверяют детекцию С11ат1б1а 1гасйотайк с использованием РНКазы Н из А£ц или РНКазы Н из Ругососсик йопкокйй (Р1о). На основании нуклеотидной последовательности плазмиды С11ат1б1а 1гасйотайк, зарегистрированной в СепеВапк под инвентарным № Х06707, синтезируют праймеры СТ2Е (ЗЕО ГО Ио 157) и СТ2В (ЗЕО ГО Ио 158). Длина фрагмента, ограниченного парой праймеров, включая собственно праймерные участки, составляет 109 п.о. Образцы матричной ДНК получают, подвергая полученный с информационного согласия пациента, клинический образец обработке фенолом и хлороформом и осаждению этанолом. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, смешивают, в конечных концентрациях, буфер 32 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ВЗА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бИТР, 50 пмоль каждого из праймеров СТ2Е и СТ2В, 46,4 Е РНКазы Н из Р1о или 8,75 Е РНКазы Н из А£ц, 8 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕЗТ и 1 мкл образца, и доводят конечный объем до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Т11егша1 Сус1ег Регкопа1, установленный на 55°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате получают продукты амплификации, представляющие интерес. Полученные результаты показывают, что
- 63 005739
СЪ1ат1б1а ΐ^асйοтаΐ^κ можно обнаружить с использованием РНКазы Н из А1и или ΡΙιο способом настоящего изобретения.
(3). Кроме того, проверяют детекцию с использованием магнитных бус при помощи коммерчески доступного детектирующего устройства. Коротко, осуществляют реакцию амплификации так, как описывается выше в (1), с использованием праймера ΜΉ82Κ, используемого выше в (1), меченного биотином по его 5'-концу, в качестве праймера и 100 нг геномной ДНК Му^Ьа^егшт ШЬетси^щк в качестве матрицы. Полученный амплифицированный фрагмент разводят 30-кратно, 300-кратно или 3000-кратно и подвергают детекции с использованием магнитных бус, покрытых стрептавидином (Шегсе), в автоматическом детектирующем устройстве Ьит1р1ик (РццгеЬю).
Магнитные бусы с иммобилизованным стрептавидином, способные связывать 100 пмоль биотина, вводят в реакцию с биотинилированным амплифицированным фрагментом в течение 5 мин на первом слое кюветы. Затем добавляют 0,1Ν раствор №ОИ Гибридизацию с зондом МП8ВР, меченным ИТС, осуществляют в течение 5 мин. После промывки добавляют антитела против РНС, меченные БОЭ. После взаимодействия в течение 5 мин и промывки добавляют люминесцентный субстрат. В результате демонстрируется, что в обычном автоматизированном детектирующем устройстве с использованием магнитных бус можно полуколичественно осуществить детекцию за короткий промежуток времени (20 мин). Детекцию осуществляют, измеряя уровень люминесценции методом счета фотонов. Результаты приводятся в табл. 12.
Таблица 12
Отношение сигнал/шум 1иЬегси1<>к1к
Ампликон Мус<>Ьас1епит
Число фотонов
х 30 3,55 X 107 29, 6
х 300 1,21 X ю7 10, 0
х 3000 0,21 X ю7 1,75
0 0,12 X ю7 -
Результаты в табл. 12 показывают, что можно осуществить детекцию с чувствительностью, равной чувствительности обычного метода измерения люминесценции в планшетах.
(4). Проверяют метод гибридной хроматографии как способ детекции вышеуказанного амплифицированного фрагмента.
Стрептавидин (№са1а1 Текдие) иммобилизуют на нитроцеллюлозной мембране. Соединяют с ней водопоглощающую прокладку для получения полоски для гибридной хроматографии. Такую полоску используют для детекции амплифицированного фрагмента, используемого выше в (3), согласно способу гибридной хроматографии. Детекцию осуществляют, проявляя окраску с использованием 1-стадийного ТМВ-блоттинга (Г|егсе). Конкретно, реакционную смесь, содержащую амплифицированный фрагмент, хроматографируют на нитроцеллюлозной мембране. Затем осуществляют хроматографию с использованием раствора 0,1Ν МЮН меченного РИС зонда, раствора для промывки и раствора для проявления окраски в указанном порядке. В результате обнаруживают синюю полосу в случае амплифицированного фрагмента, полученного из образца, положительного на Му^Ьа^етшт ШЬетсиШак. Это показывает, что данный способ полезен в качестве быстрого способа анализа генов, поскольку применяя его за 5-10 мин способом настоящего изобретения получают результаты, видимые невооруженным глазом.
Пример 34.
(1) . Анализ методом гибридизации по Саузерну амплифицированных продуктов, содержащих мультимерные фрагменты.
В некоторых случаях при способе амплификации настоящего изобретения кроме трех фрагментов, представляющих интерес, можно обнаружить несколько других высокомолекулярных мультимерных фрагментов. Проверяют мультимерные фрагменты. В качестве мишени выбирают энтерогеморрагическую Е. той О-157. Матричная ДНК, химерные праймеры и условия реакций для Ιί,ΆΝ такие же, какие описаны в примере 9. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% геле Ш^ете-агароза, 3:1. Результаты приводятся на фиг. 37. На фиг. 37 полосы представляют результаты для следующего: полоса М: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 1: отрицательный контроль; полоса 2: прогретый экстракт, соответствующий 1 клетке; полоса 3: прогретый экстракт, соответствующий 10 клеткам; полоса 4: прогретый экстракт, соответствующий 102 клеткам; полоса 5: прогретый экстракт, соответствующий 103 клеткам; полоса б: прогретый экстракт, соответствующий 104 клеткам; и полоса 7: прогретый экстракт, соответствующий 105 клеткам. Наблюдаются мультимерные фрагменты, как видно на фиг. 37.
(2) . Анализ мультимерных амплифицированных фрагментов.
Анализируют нуклеотидные последовательности мультимерных фрагментов, полученных выше в (1). Коротко, 50 мкл реакционной смеси, полученной в (1), подвергают электрофорезу в 3% агарозном геле. После электрофореза мультимерные полосы вырезают из геля. Затем из геля извлекают амплифицированные фрагменты ДНК с использованием ЕАЗУТКАГ ует.2 (Такага δΐιι,ιζο). У извлеченных ампли-
- б4 005739 фицированных фрагментов тупят концы с использованием набора ΌΝΑ В1ипйшд кН (Такага 8йихо).
Фрагменты ДНК с затупленными концами лигируют с вектором рСЕМ-32 (Ргошеда), расщепленным рестриктазой НйпсП (Такага 8йи/о), с использованием набора ΌΝΑ йдаййоп кйй (Такага 8йихо). Лигазные смеси используют для трансформации компетентных клеток ΙΜ109 (Такага 8йихо). После трансформации клетки культивируют при 37°С в течение ночи на чашках с ЬВ-агаром, содержащим 0,1 мМ ампициллин, 1 мМ РТС и 0,02% Х-да1.
После культивирования с чашек отбирают несколько колоний белого цвета. Осуществляют ПЦР колоний с использованием праймеров М13-М4 и М13-КУ (оба от Такага 8йихо) для определения присутствия вставки. Колонии, содержащие вставки культивируют при встряхивании в жидкой среде ЬВ, содержащей 0,1 мМ ампициллина, при 37°С в течение ночи. После культивирования плазмиды очищают из клеток с использованием набора ΟΙΑΟΡΝ р1азшйб шйпй К1й (Ойадеп). Последовательности фрагментов, клонированных в НйпсП сайтах плазмид, анализируют в обоих направлениях с использованием праймеров М13-М4 и М13-КУ обычным способом.
В результате демонстрируется, что мультимерный фрагмент, полученный способом настоящего изобретения, имеет структуру, в которой повторяется амплифицируемый участок. Кроме того, доказывается, что повтор имеет место в одном и том же направлении от 5' к 3'.
(3). Кроме трех представляющих интерес амплифицированных фрагментов проверяют другие мультимерные амплифицированные фрагменты, образовавшиеся при осуществлении способа настоящего изобретения в случае детекции МусоЬасйегшш йиЬегси1оз1з, НСТ или Сй1ашубйа йгасйошабз. ИСТ детектируют в условиях, описанных в примере 31. МусоЬасйегшш йиЬегси1озйз или СЫашубйа йгасйошайз детектируют в условиях, описанных в примере 33. Полученные мультимерные амплифицированные фрагменты субклонируют и секвенируют так, как описывается выше в (2). В результате демонстрируется, что мультимерный фрагмент, полученный способом настоящего изобретения, имеет структуру, в которой повторяется амплифицируемый участок. Кроме того, доказывается, что повтор имеет место в одном и том же направлении от 5' к 3'.
Пример 35.
(1) . Проверяют способ детекции настоящего изобретения для МусоЬасйегшш йиЬегси1оз1з. Сначала синтезируют праймеры К-Е-1033(60) (8ЕЦ ΙΌ № 159) и К-Е-1133(62) (8ЕЦ ΙΌ № 160) для амплификации участка в геноме МусоЬасйегшш йиЬегси1озйз с относительно низким содержанием ОС. В качестве матриц используют серийные разведения, содержащие от 100 фг до 10 пг геномной ДНК МусоЬасйегшш йиЬегси1оз1з, как описано в примере 33(1). Реакцию осуществляют следующим образом. Коротко, смешивают, в конечных концентрациях, буфер 32 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% Β8Α, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бNТР, 50 пмоль каждого из праймеров К-Е-1033(60) и К-Е-1133(62), 9,375 Е РНКазы Н из РГи или 4,375 Е РНКазы Н из ΑΓύ, 2,75 Е ДНКполимеразы Вса ВЕ8Т и 1 мкл одной из матриц, и доводят конечный объем до 25 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегша1 Сус1ег Регзопа1, установленный на 62°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате демонстрируется, что продукты амплификации можно обнаружить с использованием от 100 фг до 10 пг геномной ДНК в качестве матрицы и любой из использованных РНКаз Н.
(2) . Способ, описанный выше в (1), проверяют с использованием праймеров с более высокими величинами Тш. Сначала синтезируют праймеры К-Е-1033(68) (8ЕЦ ΙΌ № 161) и К-Е-1133(68) (8ЕЦ ΙΌ Ν 162). Реакцию амплификации осуществляют в тех же условиях, какие описаны выше в (1), за исключением того, что температура реакции составляет 63°С. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. Результаты приводятся на фиг. 38. Фиг. 38 иллюстрирует результаты электрофореза фрагмента генома МусоЬасйегшш йиЬегси1оз1з, амплифицированного с использованием РНКазы Н из РГи или РНКазы Н из ΑΓιι. Полосы 1-4 представляют результаты, полученные с использованием РНКазы НШ из РГи и следующих количеств матричной ДНК: полоса 1: 10 пг; полоса 2: 1 пг; полоса 3: 100 фг; и полоса 4: отрицательный контроль. Полосы 5-8 представляют результаты, полученные с использованием РНКазыНШ из ΑΓυ и следующих количеств матричной ДНК: полоса 5: 10 пг; полоса 6: 1 пг; полоса 7: 100 фг; и полоса 8: отрицательный контроль. Полоса М представляет ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п. о.
Как видно из фиг. 38, показано, что амплифицированный фрагмент, представляющий интерес, можно обнаружить с использованием 100 фг матричной ДНК и любой из РНКаз. Видно, что больше амплифицированного продукта получают при использовании РНКазы Н из ΑΓυ. Кроме того, показано, что более устойчивая чувствительность детекции достигается при использовании РНКазы Н из ΑΓυ.
(3) . Проверяют амплификацию с использованием комбинации праймеров К-Е-1033(68) и К-Е1133(68) и в качестве матрицы плазмиды, содержащей амплифицируемый участок. Сначала, для того, чтобы получить плазмиду, содержащую амплифицируемый участок, синтезируют праймеры Е26 (8ЕЦ ΙΌ Ν 163) и К1310 (8ЕЦ ΙΌ Ν 164). РСК осуществляют с использованием указанных праймеров и штамма вакцины БЦЖ. Затем полученный продукт амплификации вводят в вектор рТ7-В1ие-Т (Такага 8йихо) для получения плазмиды. Состав реакционной смеси такой, какой описывается выше в (2), за исключением
- 65 005739 того, что используют 4 Е Вса ДНК-полимеразы. В результате подтверждается, что можно осуществить детекцию с использованием 1 фг матрицы.
(4). Сравнивают чувствительность детекции, достигаемой с использованием комбинации праймеров МТ!82Е и МТ!82К, приводящей к образованию мультимерных амплифицированных фрагментов, содержащих три амплифицированных фрагмента, представляющих интерес, и чувствительностью, достигаемой с использованием комбинации праймеров К-Е-10ЗЗ(68) и К-Е-11ЗЗ(68), приводящей к образованию трех амплифицированных фрагментов, представляющих интерес. В качестве мишени выбирают МусоЪас!егшт ШйегсЫозйз. Реакции осуществляют так, как описывается в примере ЗЗ(2), когда используют сочетание праймеров МТЙ82Е и МТ!82К, или выше в (2), когда используют сочетание праймеров К-Е10ЗЗ(68) и К-Е-11ЗЗ (68). В результате в обоих случаях отмечают одинаковую чувствительность детекции.
Пример З6.
Проверяют способ амплификации настоящего изобретения, не включающий денатурацию геномной ДНК как матрицы.
(1) . Синтезируют праймеры рООН-А[-68-1 (8Е0 ΙΌ Ν 165) и рООН-А[-68-2 (8Е0 ΙΌ № 166) в соответствии с нуклеотидной последовательностью упаковывающего участка плазмиды р^ОN-ΑI (Такага 8йц/о).
(2) . Готовят реакционную смесь общим объемом 50 мкл, содержащую 1 мкл раствора, содержащего от 10 фг до 1 пг рЭОН-АЕ 1 мкл раствора, содержащего 1 нг, 10 нг или 100 нг геномной ДНК, полученной из клеток МН/ЗТЗ, содержащих встроенную рООк-АЕ полученную в примере 2З, или 1 мкл воды в качестве отрицательного контроля, 50 пмоль каждого из праймеров, описанных выше в (1), 0,5 мМ каждого из бNΤΡ, буфер З2 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4 мМ ацетат магния, 0,01% В8А, 1% ДМСО, 18,5 Е РНКазы Н из Р£ц и 4 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т. Реакционные смеси помещают в термоциклер и инкубируют при 64°С в течение 1 ч. После реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в З% агарозном геле с целью обнаружения продуктов амплификации. Результаты приводятся на фиг. З9. На фиг. З9 полосы представляют результаты для следующих матриц: полоса М: ступенчатый ДНК-маркер с шагом 100 п.о.; полоса 1: отрицательный контроль; полоса 2: 1 нг геномной ДНК, содержащей встроенную рООк-АЕ полоса З: 10 нг геномной ДНК, содержащей встроенную рЭОХ-АЕ полоса 4: 100 нг геномной ДНК, содержащей встроенную рООк-АЕ полоса 5: 10 фг ДНК рЭОХ-АЕ и полоса 6: 1 пг ДНК рООк-АЕ
Как видно из фиг. З9, амплификацию специфических фрагментов ДНК отмечают как в случае рООк-АЕ так и геномной ДНК, содержащей встроенную рООк-АЕ Таким образом, доказывается, что фрагмент ДНК, представляющий интерес, можно амплифицировать без денатурации ДНК как матрицы перед реакцией, даже если в качестве матрицы используют геномную ДНК.
Пример З7.
Сравнивают надежность (точность) настоящего изобретения с точностью ПЦР с использованием ЬА-технологии, при которой используют ТаКаКа Ех Тад-полимеразу (Такага 8йнхо). Сначала получают плазмиду для использования в качестве матрицы следующим образом.
Конкретно, методом ПЦР амплифицируют фрагменты, состоящие каждый из З00 п.о., представленные 8ЕО ΙΌ № 167-170, из гена протоонкогена человека νπί-53 (СепеВапк, инвентарный № Ь20861), гена рибосомного белка 85 (СепеВапк, инвентарный № ХМ_009З71), гена диафоразы человека (СепеВапк, инвентарный № ХМ 00090З) и гена протокадгерина 4З человека (СепеВапк, инвентарный № АИ077З47). В данном случае ПЦР осуществляют с использованием специфических праймеров, каждый из которых на 5'-конце содержит сайт для рестриктазы 8ΠΙ. После реакции амплифицированные фрагменты расщепляют рестриктазой 8Γ1Ι (Такага 8йнхо). рИС19 (Такага 8йнхо) расщепляют рестриктазами АПШ (ЖВ) и NбеI (Такага 8йнхо) и подвергают электрофорезу в агарозном геле. Из геля вырезают фрагмент размером около 2 т.п.о. и извлекают с использованием ЕА8УТКАР (Такага 8йнхо). С использованием синтезатора ДНК синтезируют ДНК с последовательностью 8ЕО ΙΌ № 171 и комплементарную ей ДНК. Полученные ДНК денатурируют под действием тепла и затем отжигают одну с другой с образованием двухцепочечной ДНК. Такая двухцепочечная ДНК на своих концах имеет липкие концы для ферментов АПШ и ШеЕ Двухцепочечную синтетическую ДНК с использованием набора ЭКА ЫдаПоп кй, уег. 2 (Такага 8йнхо) встраивают в фрагмент, полученный расщеплением рИС19 рестрикционными ферментами. Полученную плазмиду обозначают рК','62. рК','62 содержит последовательности, к которым отжигаются праймеры ΟΝ2 (8ЕО ΙΌ Ν 172) и Κ.ΆΝ6 (8ЕО ΙΌ № 17З), а также сайт для рестриктазы 8ΠΙ. Вышеуказанный ПЦР-амплифицированный фрагмент, расщепленный рестриктазой 8ΠΙ, лигируют с плазмидой с использованием набора ЫдаПоп кй, уег. 2 (Такага 8йнхо). Лигазную смесь используют для трансформации Езсйепсййа сой ДМ 109 (Такага 8йнхо). Полученные транформанты культивируют, выделяют плазмиды со встроенными ДНК длиной около З00 п.о., и определяют последовательности встроенных участков ДНК. Затем плазмиды используют в данном примере в качестве матриц.
(2). Продукты IСΑN-амплификации получают следующим образом. Коротко, готовят 10 мкл раствора, содержащего 10 нг одной из плазмид в качестве матрицы, по 50 пмоль каждого из химерных праймеров ΟΝ2 (8ЕО ΙΌ № 172) и Κ.ΆΝ6 (8ЕО ΙΌ № 17З) и 0,01% пропилендиамина. Раствор дена
- 66 005739 турируют при 98°С в течение 2 мин и инкубируют при 60°С в течение 1 мин в термоциклере ТЕегта1 Сус1ег Регкоиа1 и затем переносят на лед. Затем к раствору добавляют в конечных концентрациях буфер 20 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ВЗА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из бКТР, З0 Е РНКазы Н из Е. соЕ и 5,5 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕЗТ, и доводят до конечного объема 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер ТЕегта1 Сус1ег РегкоиаЕ установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции реакционные смеси подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле ЗеаКет СТС (Такага ЗЕихо). После электрофореза полосы с продуктами амплификации, представляющими интерес, извлекают из агарозного геля путем вырезания, выделяют продукты с использованием ЗИРВЕС-01 (Такага ЗЕихо), обрабатывают фенолом и хлороформом и осаждают этанолом.
(3) . Продукты ПЦР-амплификации получают с использованием ТаКаВа Ех Тад ДНК-полимеразы следующим образом. Коротко, готовят реакционную смесь с использованием 10 нг вышеуказанной плазмиды в качестве матрицы, а также 10 пмоль каждого из ДНК-праймеров Ι0ΆΝ2 (ЗЕЦ ΙΌ № 174) и ЮА^ (ЗЕЦ ΙΌ № 175), согласно руководству, прилагаемому к ТаКаВа Ех Тад ДНК-полимеразе (Такага ЗЕихо). Реакционную смесь помещают в термоциклер и проводят реакцию из З0 циклов, причем каждый цикл включает инкубацию при 94°С в течение З0 с, 55°С в течение З0 с и 72°С в течение З0 с. После реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в агарозном геле, как описывается выше в (2). Продукты амплификации, представляющие интерес, извлекают с использованием Мюгосоп-100 (Такага ЗЕихо), обрабатывают фенолом и хлороформом и осаждают этанолом.
(4) . Продукты амплификации, полученные выше в (2) и (З), субклонируют следующим образом. Коротко, продукты ГСА^амплификации и продукты ПЦР-амплификации встраивают в вектор рТ7 В1ие (Такага ЗЕихо) с использованием набора РегГесИу ВЕпИ Оошпд кЕ (Такага ЗЕихо) согласно руководству. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток NονаΒ1ие ЗЕЩек (Такага ЗЕихо). Для каждой конструкции отбирают 10 колоний полученных трансформантов и культивируют для получения плазмиды, каждая из которых содержит ДНК-вставку размером примерно в 0,4 т.п.о. Фрагменты, встроенные в плазмиды, секвенируют с использованием праймера к Т7 промотору (Такага ЗЕихо) и праймера МЗ (Такага ЗЕихо).
Методом секвенирования, как описано выше, анализируют в целом примерно 16000 оснований. В результате обнаруживают одну мутацию на примерно 2500 оснований как в случае фрагментов, амплифицированных способом настоящего изобретения, так и в случае фрагментов, амплифицированных методом ПЦР с использованием ТаКаВа Ех Тад ДНК-полимеразы. Таким образом, доказывается, что надежность (точность) способа настоящего изобретения эквивалента точности ЬА-РСВ, которая высока.
Пример З8.
(1) . Получение матрицы для ГСА^реакции методом ПЦР.
Получают двухцепочечную кДНК из полиА РНК, полученной из мышиного головного мозга (ОпСеηе), с использованием набора для синтеза кДНК (Такага ЗЕихо). ПЦР-фрагменты амплифицируют с использованием двухцепочечной кДНК в качестве матрицы и комбинаций праймеров с нуклеотидными последовательностями ЗЕЦ ΙΌ № 176-189. Фрагменты вводят в вектор рТ7 В1ие Т (Такага ЗЕихо) методом ТА-клонирования для получения плазмидных клонов. Реакционную смесь общим объемом 50 мкл, содержащую 1 мкл (1 нг) одного из плазмидных клонов, 10 пмоль каждого из праймеров МСЗ-Ρ (ЗЕЦ ΙΌ № 190) и МСЗ-В (ЗЕЦ ΙΌ № 191), 1,25 Е Ех Тад (Такага ЗЕихо), 5 мкл 10-кратного Ех Тад-буфера (Такага ЗЕихо) и 0,2 каждого из бКТР, подвергают описанной далее реакции с использованием термоциклера ТаКаВа РСВ ТЕегта1 Сус1ег Регкошй (Такага ЗЕихо): 94°С в течение 2 мин, З0 циклов при 94°С в течение З0 с, 55°С в течение З0 с и 72°С в течение 1 мин. Полученный амплифицированный фрагмент ДНК используют в качестве матрицы для ГСА^реакции.
(2) . Амплификация фрагмента ДНК методом IСАN с использованием в качестве матрицы продукта ПЦР.
Реакцию IСАN осуществляют с использованием аминоаллил-бИТР (З1дта) с целью введения аминогруппы в продукт ГСА^амплификации. Относительное включение аминогруппы в продукт Ιί,'ΛΝамплификации изучают путем варьирования отношения количества бТТР к количеству аминоаллилбИТР при ГСА^реакции, как указано далее: 10:0, 9:1, 8:2, 7:З и 6:4. Реакцию осуществляют следующим образом.
Сначала раствор общим объемом 10 мкл, содержащий 1 мкл реакционной смеси ПЦР, полученной выше в (1), по 50 пмоль каждого из праймеров МЕ2№(24) (ЗЕЦ ΙΌ № 192) и МВШЗ(24) (ЗЕЦ ΙΌ Ν 19З) и 2 мкл 0,05% водного раствора пропилендиамина, в термоциклере ТаКаВа РСВ ТЕегта1 Сус1ег Регкопз1 нагревают при 98°С в течение 2 мин, затем при 65°С в течение З0 с и быстро охлаждают на льду для отжига праймеров к матрице. К прогретому раствору добавляют реакционную смесь общим объемом 40 мкл, содержащую 0,625 мМ каждого из бАТР, бСТР и бСТР, 0,625 мМ смеси бТТР+аминоаллилбИТР, буфер З2 мМ НЕРЕЗ-гидроксид калия (рН 7,8), 5,0 мМ ацетат магния, 0,6 Е РНКазы Н из Е. соЕ (Такага ЗЕихо) и 2,75 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ. Полученную смесь инкубируют в термоциклере при 65°С в течение 1 ч.
К 50 мкл реакционной смеси добавляют 50 мкл изопропанола и 5 мкл З М раствора ацетата натрия
- 67 005739 (рН 5,2). Полученную смесь охлаждают при -80°С в течение 20 мин и затем центрифугируют для удаления супернатанта. К осадку добавляют 200 мкл 70% этанола. Супернатант удаляют центрифугированием. Осадок сушат на воздухе. Полученную ДНК перерастворяют в воде. Для определения количества продукта измеряют ОИ260/280.
(3) . Подтверждение включения аминоаллил-йИТР в продукт ГОАЛ-амплификации.
Включение аминогруппы в продукт ГОАЛ подтверждают с помощью флуоресцентного мечения аминогруппы в продукте ГОАЛ с использованием 5-карбоксифлуоресцеинсукцинимидного эфира (Мо1еси1аг РгоЬе). Вышеописанный раствор ДНК разводят для получения концентрации 2 мкг/50 мкл. Добавляют 20 мкл 1 М натрий-карбонатного буфера (рН 9,0). Затем добавляют еще 4 мкл раствора ЕЕГС (Ласа1а1 Тезсще) в Л,Л-диметилформамиде с концентрацией 10 мМ. В полученной смеси проводят реакцию при 20°С в течение 16 ч. После удаления избытка ПТС с использованием коммерчески доступной центрифужной колонки 10 мкл реакционной смеси вносят в 2,0% агарозный гель и подвергают электрофорезу. После электрофореза детектируют флуоресцентный краситель с использованием ЕМ-ВЮ. Кроме того, детектируют ГОАЛ-амплифицированный продукт с помощью окрашивания Е!Вг. В результате подтверждается, что аминогруппу можно ввести в продукт ГОАЛ-амплификации путем проведения ГОАЛ с использованием аминоаллил-йИТР. Также подтверждается, что чувствительность детекции можно еще более повысить, используя в сочетании модифицированный нуклеотид, несущий функциональную группу, и флуоресцентную метку для продукта амплификации.
(4) . Способ амплификации настоящего изобретения проверяют с использованием дезокси-ИТР. В качестве мишени выбирают МусоЬас!егшт !иЬегси1оз1з. Сначала синтезируют праймеры МТК2Е-16 (БЕР ГО Ло 194) и МТК2К-АСС (БЕР ГО Ло 195) в соответствии с нуклеотидной последовательностью генома МусоЬас!егшт !иЬегси1оз1з, зарегистрированного в ОепеВапк под инвентарным № АЫ23456. Длина фрагмента, амплифицируемого с использованием указанной пары праймеров, включая праймерные части, составляет 98 п.о. Матрицу получают следующим образом. Коротко, продукт, полученный ПЦР-амплификацией генома МусоЬас!егшт !иЬегси1оз1з с использованием праймеров МТ[Б-РСК-Е-2 (БЕР ГО Ло 196) и МТК-РСК-К-2 (БЕР ГО Ло 197), встраивают в рТ7-В1ие-Т-вектор (Такага Бйихо) с использованием набора ИЛА Ыдайоп к11 уег.2. Лигированную плазмиду используют для трансформации ЕзйейсЫа сой 1М109. Полученные трансформанты культивируют для получения плазмиды с встроенной ДНК размером около 400 п.о. Раствор, содержащий 103 копий плазмиды на мкл, получают, исходя из концентрации, определяемой путем измерения ОЭ260.
Смешивают, в конечных концентрациях, буфер 32 мМ НЕРЕБ-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% ВБА, 4 мМ ацетат магния, 500 мкМ каждого из йАТР, йСТР и йОТР, смеси йТТР/йИТР (500/0, 400/100, 300/200, 200/300, 100/400 или 500/0 мкл), по 50 мкмоль каждого из праймеров МТК 2Е-16 и МТК 2К-ААС, 8,75 Е РНКазы Н из АЕи, 8 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕБТ и 1 мкл матрицы (103 копий) , и конечный объем доводят до 50 мкл стерильной водой. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Регзопа1, установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% агарозном геле.
В результате отмечают образование продукта амплификации, представляющего интерес, при всех соотношениях йТТР/йИТР. На основании таких результатов можно утверждать, что модифицированный нуклеотид можно использовать в качестве субстрата в способе настоящего изобретения.
Пример 39.
Проверяют применение способа настоящего изобретения в одностадийном способе амплификации. В качестве мишени выбирают НСУ.
(1) . Получение транскрибированной РНК.
Получают транскрибированную РНК как матрицу. Ее получают из 300 мкл сыворотки, полученной с информированного согласия пациента с вирусом гепатита С, с использованием реагента ТШхо1 (ЫГе Тесйпо1оДез) согласно инструкциям, прилагаемым к реагенту, с последующим конечным разведением в 20 мкл воды для инъекций (О1хика Рйагтасеийса1). ОТ-ПЦР осуществляют с использованием описанного выше образца РНК в качестве матрицы. Реакцию осуществляют следующим образом. Готовят 50 мкл реакционной смеси с использованием 2 мкл образца РНК и 20 пмоль каждого из праймеров БР6-НСУ-Е (БЕр ГО Ло 198) и Т7-НСУ-К (БЕр ГО Ло 199), согласно руководству, прилагаемому к набору Опе-Б!ер КЛА РСК кй (Такага Бйихо). Реакционную смесь помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Регзопа1 и подвергают реакции в следующем режиме: 50°С в течение 15 мин; 94°С в течение 2 мин; и 40 циклов 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. После реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле БеаР1ас.|ие ОТО. Из геля вырезают продукт амплификации размером 350 п.о., представляющий интерес. Затем выделяют ДНК с использованием ЕАБУТКАР, Уег.2, согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Транскрибированную РНК синтезируют с использованием выделенной из геля ДНК в качестве матрицы и набора Сотреййуе КЛА Тгапзсйрйоп кй (Такага Бйихо), согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Транскрибированную РНК используют в качестве матрицы для исследования одностадийной КТИСАЛ.
(2) . Исследование одностадийной КТИСАЛ.
- 68 005739
Концентрацию транскрибированной РНК, полученной выше в (1), определяют на основании величины ОЭ260, и готовят разведения, содержащие 104, 105, 106 или 107 копий на мкл. Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей, в конечных концентрациях, буфер 32 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 1% ДМСО, 0,01% В8А, 4 мМ ацетат магния, по 500 мкМ каждого б№ТР, по 50 пмоль каждого праймера НСУ-А 8 (8ЕО ГО Νο 200) и НСУ-А А (8ЕО ГО Νο 201), 30 Е РНКазы Н из РГи, 8 Е ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т, 20 Е ингибитора РНКазы, 0, 1, 2,5, 3 или 5 Е ревертазы ХЬ АМУ (Тайага 8йихо) и 1 мкл одного из разведений, содержащих различное число копий транскрибированной РНК. Реакционные смеси помещают в термоциклер Тйегта1 Сус1ег Регкопа1, установленный на 60°С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 2 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% агарозном геле.
В результате образования продукта амплификации, представляющего интерес, при использовании любого разведения матрицы без добавления ревертазы АМУ не отмечают. С другой стороны, образование продукта амплификации, представляющего интерес, отмечают при использовании разведения, содержащего 107 копий (добавлена 1 Е ревертазы ХЬ АМУ), 106 копий (добавлены 2,5 Е ревертазы ХЬ АМУ), 106 копий (добавлены 3 Е ревертазы ХЬ АМУ) или 106 копий (добавлены 5 Е ревертазы ХЬ АМУ). Когда реакцию осуществляют при температуре 57°С, продукт амплификации, представляющий интерес, отмечают при использовании разведения, содержащего 105 копий, и 2,5 Е ревертазы ХЬ АМУ. Кроме того, когда используют 1 Е ДНК-полимеразы Вса ВЕ8Т и 10 Е РНКазы Н из РГи, продукт амплификации, представляющий интерес, отмечают при использовании разведения, содержащего 106 копий, даже если ревертазу АМУ не добавляют.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение предусматривает способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, включающий амплификацию участка нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, подходящего для специфической амплификации, посредством реакции синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера. Настоящее изобретение также предусматривает способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающий детекцию фрагмента, амплифицированного из нуклеиновой кислоты-мишени, полученного способом амплификации нуклеиновой кислоты-мишени. Кроме того, способ амплификации настоящего изобретения можно использовать в качестве эффективного способа получения нуклеиновой кислоты путем сочетания его с другим способом амплификации нуклеиновой кислоты или способом дупликации нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также предусматривает способ детекции нуклеиновой кислоты для специфической детекции и количественного определения с высокой чувствительностью микроорганизмов, в частности, патогенных микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии, грибы, дрожжи или подобные, а также химерный олигонуклеотидный праймер для способа. Настоящее изобретение также предусматривает систему для амплификации и детекции нуклеиновой кислоты, которая является автоматизированной, применимой к малым количествам и высокоинтегрированной.
Свободный текст к Перечню последовательностей
8ЕО ГО Νο 1: ПЦР-праймер ВкиП-3 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 2: ПЦР-праймер ВкиИ-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 3: ПЦР-праймер ΚΝΠ-81 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 4: ПЦР-праймер ΚΝΠ-82 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 5: ПЦР-праймер КЫИ-85 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 6: ПЦР-праймер КЫИ-86 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 7: ПЦР-праймер ΚΝΠ-Ν6ο для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 8: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОКЕ) в гене РНКазы НИ из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 9: аминокислотная последовательность РНКазы НИ из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 10: ПЦР-праймер ВкиШ-1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 11: ПЦР-праймер ВкиШ-3 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 12: ПЦР-праймер ВкиШ-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕО ГО Νο 13: ПЦР-праймер ВкиШ-8 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо!епах.
- 69 005739
8ЕР ΙΌ Ν 14: ПЦР-праймер ΚΝΙΙΙ-83 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо!епах.
8ЕР ΙΌ № 15: ПЦР-праймер ВсаКNIII-3 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо1епах.
8ЕР Ш Ν 16: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОКЕ) в РНКазе НШ из ВасШик са1бо1епах.
8ЕР ΙΌ Ν 17: аминокислотная последовательность РНКазы НШ из ВасШик са1бо1епах.
8ЕР ΙΌ № 18: ПЦР-праймер ВсаКМШМбе для амплификации гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо1епах.
8ЕР ΙΌ № 19: нуклеотидная последовательность, являющаяся консервативной для РН1650 и части геномной последовательности Ругососсик Гигйокик.
8ЕР ΙΌ Ν 20: ПЦР-праймер 1650Nбе для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсик Гипокик.
8ЕР ΙΌ Ν 21: ПЦР-праймер 1650Ват для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсик Гипокик.
8ЕР Ш № 22: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОКЕ) в РНКазе НИ из Ругососсик Гипокик.
8ЕР ΙΌ Ν 23: аминокислотная последовательность РНКазы НИ из Ругососсик Гипокик.
Ер ΙΌ № 24: ПЦР-праймер 915-Е1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегшоЮда тагШта.
8ЕР ΙΌ № 25: ПЦР-праймер 915-Е2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегшоЮда тагШта.
8ЕР Ш Ν 26: ПЦР-праймер 915-К1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегшоЮда тагШта.
8ЕР Ш Ν 27: ПЦР-праймер 915-К2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТйегшоЮда тагШта.
8ЕР ΙΌ № 28: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 иррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды рИС19. Нуклеотиды 24-25 являются рибонуклеотидами, другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕР Ш Ν 29: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Μβ1Ν3, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды рИС19. Нуклеотиды 28-30 являются рибонуклеотидами, другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕР ΙΌ Ν 30: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный М13М4.
8ЕР ΙΌ № 31: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕкйепсШа со11 О-157. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами, другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ № 32: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕкйепсШа со11 О-157. Нуклеотиды 15-17 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ № 33: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсШа со11 О-157. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ № 34: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсШа со11 О-157. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Ν 35: олигонуклеотидный праймер, названный ΜΡ^Ρ, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.
8Ер Ш № 36: олигонуклеотидный праймер, названный Μί^.-^ сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.
8Ер Ш Ν 37: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΡ2Ν3(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Ν 38: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ^1^(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК. Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ № 39: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента
ДНК фага λ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
- 70 005739
8Е0 ГО № 40: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага λ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ГО № 41: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага λ.
8ЕО ГО № 42: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага λ.
8ЕО ГО № 43: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Г1ауоЬас!егшт креаек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ГО № 44: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Г1ауоЬас!егшт креаек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ГО № 45: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Г1ауоЬас!егшт креаек.
8ЕО ГО № 46: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Г1ауоЬас!егшт креаек.
8ЕО ГО № 47: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ГО № 48: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ГО Ν 49: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157.
8Е0 ГО Ν 50: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157.
8Е0 ГО № 51: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ГО № 52: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ГО № 53: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ГО Ν 54: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157.
8Е0 ГО Ν 55: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕкйепсЫа сой 0-157.
8Е0 ГО № 56: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага λ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ГО № 57: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.
8Е0 ГО № 58: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.
8Е0 ГО № 59: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ГО № 60: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ГО № 61: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Г1ауоЬас!егшт креаек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
- 71 005739
Ер ΙΌ Νο 62: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ΗηνοΕκΕπιιιη вреаек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 63: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ΗηνοΕκΕπιιιη вреаек. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 64: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 18 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 65: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 66: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 67: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 68: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 69: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 15 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 70: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 9-11 и 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 71: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 8-10 и 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 72: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа той 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 73: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа той 0-157.
8Ер ΙΌ Νο 74: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 75: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 76: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши.
8Ер ΙΌ Νο 77: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей 1Ν08 мыши.
8Ер ΙΌ Νο 78: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ΟΜ0-Ρ0Ρ-Ρ, 20-мер.
8Ер ΙΌ Νο 79: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ΟΜ0-Ρ0Ρ-Ρ, 20-мер.
8Ер ΙΌ Νο 80: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный 0М0-81, 20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Ер ΙΌ Νο 81: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный 0М0-82, 20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонук- 72 005739 леотидами.
8Е0 ΙΌ № 82: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-А1, 20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 83: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный СМО-А2, 20-мер. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 84: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа со11 О-157. Нуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 85: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕксйепсЫа со11 О-157. Нуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 86: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 87: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ N 88: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши.
8ЕО ΙΌ N 89: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши.
8ЕО ΙΌ № 90: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага λ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 91: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага λ. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 92: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 93: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ШО8 мыши. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 94: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК рОО№А! Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 95: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК рОО№А! Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 96: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 97: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 98: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате ампликафиции части ДНК НРУ.
8ЕО ΙΌ № 99: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.
8ЕО ΙΌ N 100: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.
8ЕО ΙΌ № 101: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 102: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
- 73 005739
8Е0 ΙΌ Νο 103: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации фрагмента генома №У.
8ЕО ΙΌ Νο 104: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 105: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 106: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 107: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.
8ЕО ΙΌ Νο 108: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.
8ЕО ΙΌ Νο 109: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.
8ЕО ΙΌ Νο 110: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.
8ЕО ΙΌ Νο 111: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК рВОМ-АТ.
8ЕО ΙΌ Νο 112: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК р^ΟN-ΑI
8ЕО ΙΌ Νο 113: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 114: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин-1 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой О-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 115: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин-1 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой О-157.
8ЕО ΙΌ Νο 116: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1оз1пбй.пп Ьо!и11пит. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 117: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1оз1пбй.пп Ьо!и11пит. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 118: олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1оз!пбшт Ьо!и1тцт.
8ЕО ΙΌ Νο 119: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 120: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 121: олигонуклеотидный зонд сконструированный, для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части генома вироида С8Уб.
8ЕО ΙΌ Νο 122: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 123: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 124: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.
8ЕО ΙΌ Νο 125: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.
8ЕО ΙΌ Νο 126: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации
- 74 005739 фрагмента онкогена с-к1-гак. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 127: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-к1-гак. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Ν 128: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-к1-гак.
8ЕО ΙΌ Ν 129: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-к1-гак.
8ЕО ΙΌ № 130: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕксйепсЫа со11 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ № 131: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕксйепсЫа со11 0-157. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ Ν 132: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝ08 мыши.
8Е0 ΙΌ Ν 133: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝ08 мыши.
8Е0 ΙΌ № 134: олигонуклеотидный праймер, названный риС19 иррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды риС19.
8Е0 ΙΌ № 135: олигонуклеотидный праймер, названный риС19 1о\\'ег, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды риС19.
8Е0 ΙΌ № 136: химерный олигонуклеотидный праймер, названный 8ЕА-1, сконструированный для амплификации фрагмента генома 8!арйу1ососсик аигеик. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ № 137: химерный олигонуклеотидный праймер, названный 8ЕА-2, сконструированный для амплификации фрагмента генома 81арНу1ососсик аигеик. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ № 138: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-Е3, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ № 139: химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-К1, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ № 140: олигонуклеотидный праймер, названный МЕ2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды риС19.
8Е0 ΙΌ № 141: олигонуклеотидный праймер, названный МК1, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды риС19.
8Е0 ΙΌ Ν 142: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.
8Е0 ΙΌ № 143: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОКЕ) в гене РНКазы НИ из ТНегто1ода тапйта.
8Е0 ΙΌ № 144: аминокислотная последовательность РНКазы НИ из ТНегшоЮда тагШта.
8Е0 ΙΌ № 145: нуклеотидная последовательность РШ650 из Ругососсик 1юпкок1ик
8Е0 ΙΌ № 146: ПЦР-праймер РНо^е для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсик йопкокЫк
8Е0 ΙΌ № 147: ПЦР-праймер РйоВат для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсик йопкокЫк
8Е0 ΙΌ № 148: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОКЕ) в гене РНКазы НИ из Ругососсик йопкокЫк
8Е0 ΙΌ № 149: аминокислотная последовательность РНКазы НИ из Ругососсик йопкокЫк
8Е0 ΙΌ № 150: нуклеотидная последовательность АЕ0621 из Агсйаеод1оЬик Ги1д1бик.
8Е0 ΙΌ № 151: ПЦР-праймер Ай^бе для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Агсйаеод1оЬик Ги1д1бик.
8Е0 ΙΌ № 152: ПЦР-праймер АГиВат для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Агсйаеод1оЬик Ги1щбик.
8Е0 ΙΌ № 153: нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ОКЕ) в гене РНКазы НИ из Агсйаеод1оЬик ГиЩбик.
8Е0 ΙΌ № 154: аминокислотная последовательность РНКазы НИ из Агсйаеод1оЬик Ги1д1бик.
- 75 005739
8Е0 ΙΌ № 155: химерный олигонуклеотидный праймер, названный М’И82Е, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ № 156: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МТЕ2Я сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к. Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Е0 ΙΌ № 157: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2Е, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК критической плазмиды СЕ1атуб1а (гасйотайк. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 158: химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2Я, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК критической плазмиды СЕ1атуб1а кгасЕотаЕк. Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 159: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Е-1033(60), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к. Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 160: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Я-1133(62), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 161: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Е-1033(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 162: химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Я-1133(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 163: олигонуклеотидный праймер, названный Е26, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к.
8ЕО ΙΌ № 164: олигонуклеотидный праймер, названный Я1310, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к.
8ЕО ΙΌ № 165: химерный олигонуклеотидный праймер, названный рООН-ЛЬР^-к сконструированный для амплификации фрагмента рООХ-АЕ Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 166: химерный олигонуклеотидный праймер, названный р^ОN-ЛI-68-2, сконструированный для амплификации фрагмента рООк-АЕ Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 167: протоонкоген \Уп1-5а из Ното кар1епк.
8ЕО ΙΌ № 168: рибосомальный белок 85 из Ното кар1епк.
8ЕО ΙΌ № 169: диафораза из Ното кар1епк.
8ЕО ΙΌ № 170: протокадгерин человека.
8ЕО ΙΌ № 171: олигонуклеотид, сконструированный для получения рК','62.
8ЕО ΙΌ № 172: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОШ. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 173: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ГСА^. Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ № 174: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер ОШ.
8ЕО ΙΌ № 175: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер ГСА^.
8ЕО ΙΌ Ν 176: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей рибосомный белок 818 мыши.
8ЕО ΙΌ Ν 177: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей рибосомный белок 818 мыши.
8ЕО ΙΌ Ν 178: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕЯ) мыши.
8ЕО ΙΌ Ν 179: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕЯ) мыши.
8ЕО ΙΌ Ν 180: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (86Г4).
8ЕО ΙΌ Ν 181: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (86Г4).
8ЕО ΙΌ Ν 182: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей цитоплазматический β-актин мыши.
8ЕО ΙΌ Ν 183: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента
- 76 005739 последовательности, кодирующей цитоплазматический β-актин мыши.
8Еф ΙΌ Νο 184: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.
8Еф ΙΌ Νο 185: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.
8Еф ΙΌ Νο 18б: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (ΗΡΚ-Т) мыши.
8Еф ΙΌ Νο 187: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (ΗΡΚ-Т) мыши.
8Еф ΙΌ Νο 188: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей тирозин-3-монооксигеназу мыши.
8Еф ΙΌ Νο 189: олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей тирозин-3-монооксигеназу мыши.
8Еф ΙΌ Νο 190: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МС8-Р.
8ЕО ΙΌ Νο 191: сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МС8-К.
8ЕО ΙΌ Νο 192: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΕ2Ν3(24). Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 193: сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΚ1Ν3(24). Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 194: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜТIδ2Р-1б, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Му^Ьа^егшт ΐиЬе^си1οκ^κ. Нуклеотиды 14-1б являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 195: химерный олигонуклеотидный праймер, названный МТ!82К-АСС, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Му^Ьа^егшт ΐиЬе^си1οκ^κ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8ЕО ΙΌ Νο 19б: олигонуклеотидный праймер, названный МПб-ГСК-Р-З, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Му^Ьа^егшт Ш^гси^^к.
8ЕО ΙΌ Νο 197: олигонуклеотидный праймер, названный ΜΉδ-ΡΟΚ-Κ-Σ, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Му^Ьа^егшт Ш^гси^^к.
8Еф ΙΌ Νο 198: олигонуклеотидный праймер, названный δΡб-ΗСV-Р, сконструированный для амплификации фрагмента генома Ηί,'ν.
8Еф ΙΌ Νο 199: олигонуклеотидный праймер, названный δΡб-ΗСV-Κ, сконструированный для амплификации фрагмента генома Ηί,'ν.
8Еф ΙΌ Νο 200: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΗСV-Α δ, сконструированный для амплификации фрагмента генома Η СУ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
8Еф ΙΌ Νο 201: химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΗСV-Α А, сконструированный для амплификации фрагмента генома Η СУ. Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
- 77 005739
Список последовательностей <110> Такага бЬиго Со., Ый.
<120> Способ амплификации нуклеиновых кислот <130 662757 <150 Л» 2000-251981 <151> 2000-08-23 <150>Л> 2000-284419 <151> 2000-09-19 <150>Л> 2000-288750 <151> 2000-09-22 <150> Л* 2001-104191 <151> 2001-04-03 <160> 201 <210> 1 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВвиП-З для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ВааПиз са1йо1епах <400> 1 дЩдссадсд са£1паЙ1у( 20 <210>2 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВзиП-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из Вас1Ииз са1йо1епах <400> 2 сдд1ссс1сд (сасуппдс 20 <210> 3 <211 >20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность
- 78 005739 <220>
<223> ПЦР-праймер ΚΝΠ-81 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НН, из ВасШиа са14о1елах <400>3 сдсдсййс сддс^садс 20 <210>4 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>ПЦР-праймер ΚΝΠ-82 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из ВасШиз сайо1епах <400>4 ас£$с@сас£ сНсааОД 20 <210> 5 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ΚΝΠ-85 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из ВасШиз саИоХепах <400> 5 асдссШП кссйййясй 20 <210>6 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ΚΝΠ-56 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из ВасШиз са1бо1епах <400> 6 а1£асс£ас£ са£С££сда1 20 <210>7 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ΚΝΠ-Νάβ для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из ВасШиз са!до1епах
- 79 005739 <400> 7
1а£аа£а£££ а£а££са1а1 £аа£С££1а( ас££1£ааа 39 <210 8 <211>780 <212>ДНК <213> ВисШиз саИоГепах <400 8 а!§аадсдд! а1асд£1даа адасапдаа £С£С1£СКС сдаадсПдд сдсддасдас 60 СС£С£С1£££ а&а1£С1£С£ £са££а(£а£ С£ааааа£С£ 1£са££С£С1 (сКдсссд! 120
Шдаааддс адааадсдсд ссддсасдсс а1с£а£са£с ££{£££аа£а а<Лаа!дсд1 180 гаЩакааск аасшасдс С£С1££С£11 а£ас££а1с£ ссддсапда !да§дссд§£ 240 с£с££ссс£с 1££сс£§ссс ££(с£1с£сс £сс£С££1са 1спдсс§аа а£ас£сс1а! 300
Й£сс££££с Й£ас£ас1с £аа£С££с1£ ас£сс££ааа а£С£С£а££с ай£1й£С£ 360 сааай£аа£ с£1£с£сс£( 0£сса1с££с аГсддсаТсд 1еа£С£С££с удадаКда! 420 £ааа££ааи Шасдаадс дасааддсаа £С£а1££С£а аа£С££1£аа сдсссМсс 480
СС£СС£СС1£ ааСаШ£Сг 1£Й£а(£С£ а1££С££1£С С£1£СССас1 £СС£Сааса£ 540 с£сс1са1аа аа££а£ас£с сааса£С£с! 1саа1с£сс£ С(£С£1С££1 са(с£ссааа 600 £1£ас£С£С£ асс££1££а! £ааа£аас1£ £а1С£СС£с! а!ссасаа1а С£££ЙС£С£ 660 с£сса1а1££ £с1ас££аас £сс§§ааса! пс£а££С£а 1сс£сс£с1а с££С£йас£ 720
СС1£а£СаСС £1С£ПС£Й с§сасс££!§ а£££а££1£С 1£аа££С£а£ С£а£Са£С1С 780 <210> 9 <211> 260 <212> Белок <213> ВисШиз са1<1о1епах <400 9
Ме1 Ьуз Аг£ Туг ТЬг Уа1 Ьуз Аар Не С1и А1а Ьеи Ьеи Рго Ьу»
1015
Ьеи СНу А1а Азр Аар Рго Аг£ Тгр О1и Ме( Ьеи Аг£ О1п Аар &1и
2530
Аг£ Ьуз Зег Уа) О1п А1а Ьеи Ьеи А1а Аг£ РЬе С1и Дг£ (31п Ьуа
4045
А1а Аг£ Аг£ ΗΪ5 А1а Не 61и О1п Аг£ Тгр С1и 61и Ьеи Ме( Аг£
5560
Туг О1и Аг£ Ст1и Ьеи Туг А1а А1а О1у Уа1 Дг£ Аг£ Пе А1а О1у
7075
Пе Азр С1и А1а С1у Аг£ О1у Рго Ьеи А1а С1у Рго Уа1 Уа1 А1а
8590
А1а А1а Уа1 Не Ьеи Рго Ьу» Аар А1а Туг Ьеи Рго С1у Ьеи Азр
100105
Аар Зег Ьуз Дг£ Ьеи ТЬг Рго С1и Ьуз Дг£ О1и А1а Ьеи РЬе А1а
110 115120 <Э1п Пе О1и А1а Суз А1а Уа1 А1а Пе О1у Пе О1у Пе Уа1 Зег
125 130135
А1а А1а О1и Пе Азр О1и Аг£ Азп Пе Туг О1и А1а ТЪг Аг£ О1п
140 145150
А1а Ме1 А1а Ьуз А1а Уа1 Азп А1а Ьеи Зег Рго Рго Рго С1и Ηΐβ
- 80 005739
155 160165
Ьеи Ьеи Уа1 Азр А1а Ме1 А1а Уа1 Рго Суз Рго Ьеи Рго СИп О1п
170 175180
Аг§ Ьеи Не Ьуз <31у Азр А1а Азп Зег А1а Зег Пе А1а А1а А1а
185 190195
Зег Уа1 Пе А1а Ьуз Уа1 ТЬг Аг§ Азр Аг$ Тгр Ме1 Ьуз О1и Ьеи
200 205210
Азр Агд Аг$ Туг Рго С1п Туг О1у РЬе А1а Аг$ Ηϊ$ Ме1 О1у Туг
215 220225
О1у ТЬг Рго О1и Из РЬе О1и А1а Пе Аг$ Ага Туг О1у Аа1 ТЬг
230 235240
Рго О1и ΗΪ5 Агд Аг® Зег РЬе А1а Рго Уа1 Агд О1и Уа1 Ьеи Ьуз
245 250255
А1а Зег О1и О1п Ьеи
260 <2Ю> 10 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВзиШ-1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз саМоГепах <400> 10
881аа881с118Иусагвв 20 <210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВзиШ-3 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз саЫоГепах <400> 11 (у^аассйва® аНауЦу^ё 20 <210> 12 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВзиШ-6 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы ШП, из ВасШиз саШоСепах <400> 12 а^аПдааз са§сп§спас 20
- 81 005739 <210> 13 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВялШ-8 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз са1бо1епах <400> 13 £Тай££с§а ааТдпагуП 20 <210> 14 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ΚΝΙ1Ι-83 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз саИоТепах <400> 14
ССС£а(С£(С 81С8СС£СС£ 20 <210> 15 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВсаКМП-З для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШик са1бо(епах <400> 15
8а1ас£1££а састпссдс 20 <210> 16 <211> 915 <212>ДНК <213> ВисШиз саШотепах <400> 16 £1£аНсаа£ ссдассааса дстдспдас £ССН£С£С£ сссастасса адасдсспа 60
1сс£асс££с Т1сС££сТ££ а£С£й£ПТ £сс£(саа£с £ссс££а{£( с£Тса1сасс 120 £сс1асс£с1 са§£сааа£1 дс1£йтсаа £££ааа£С££ с^дадсаада адсадсдааа 180
Т££а1аТса£ £££С£Э£С£С с(сааас£аа аса£ст§асс асса£сс£(с с£СПТ££са 240 дсЮаТсаас 1С£$£1с1с1 йссдссаТс ££йсс£а1д аад(с££сас сддсдайа! 300
Псддсссда ТсдТсдТсдс сдссдсс1ас £1д§а1с££с с£са1аТс£с саааа^сдсд 360 £С£СН££С£ 1£ааа§аПс дааасаапд аас£а1£а££ саатсааасд датсдссссс 420 £сса1са1££ ааасс£Т§сс дсащсцдтс асс£(£Н££ асаатдссда атасаассдс 480
- 82 005739 (ддсадсдаа дсддса!дсс дсадасдааа а!дааадсдс (сспсасаа ссддасдс!с 540 д!дааас!сд йдасдсса! сдсдсссдсс даассадаад саа!са!са! сдасдаай! 600
Каааасаае аПсд!а!Н есдйассп !ссда!даад а!сдсаПа1 седсдадсдд 660 д!дсас!дсс нсссааддс ддааад!д(с сасд!а!сад !сдссдссдс с!сда!са!с 720 £ССС£СОД 1£(Ша£а ££а£а1££^ СаШМССС £Ο£ΟΟ£ίΟ££ СС1СС(£СЙ 780 ссааааддсд ссддсдсса!!д!сда!даа дссдсддсса аса!са!ссд сдсдсддддд 840 дсддаадсдс Пдадаса!д сдссаадс» саШсдсса аисаааааа ддсдс!ддас 900 акдссааас дссдд 915 <210> 17 <211> 305 <212> Белок <213> ВисИ1ий саЫоСепах <400> 17
Ме! Не СИп А1а Азр С1п СИп Ьеи Ьеи Аар А1а Ьеи Агд А1а Из
1015
Туг О1п Аар А1а Ьеи 8ег Азр Аг® Ьеи Рго А1а СИу А1а Ьеи РЬе
2530
А1а Уа1 Ьуа Агд Рго Аар Уа1 Уа1 Не ТЬг А1а Туг Агд Зег С1у
4045
Ьуа Уа! Ьеи РЬе СИп СИу Ьуа А1а А1а О1и О1п О1и А1а А1а Ьуа
5560
Тгр Пе Зег СИу А1а Зег А1а Зег Азп СИи ТЬг А1а Аар Из СИп
7075
Рго Зег А1а Ьеи А1а А1а Из СИп Ьеи О1у Зег Ьеи Зег А1а Пе
8590
СИу Зег Азр СИи Уа1 (Пу ТЬг СИу Азр Туг РЬе СИу Рго Пе Уа1
100105
Уа1 А1а А1а А1а Туг Уа1 Азр Агд Рго На Пе А1а Ьуз Пе А1а
110 115120
А1а Ьеи СИу Уа1 Ьуа Азр Зег Ьуа СИп Ьеи Азп Аар СИи А1а Пе
125 130135
Ьуз Агд Пе А1а Рго А1а Пе Ме! СИи ТЬг Уа1 Рго Из А1а Уа1
140 145150
ТЬг Уа1 Ьеи Азр Азп А1а СИи Туг Азп Агд Тгр СИп Агд Зег СИу
155 160165
Ме1 Рго СИп ТЬг Ьуз Ме1 Ьуз А1а Ьеи Ьеи Из Азп Агд ТЬг Ьеи
170 175180
Уа1 Ьуз Ьеи Уа1 Азр А1а Пе А1а Рго А1а О1и Рго (Ли А1а Пе
185 190195
Пе Пе Азр СИи РЬе Ьеи Ьуз Агд Азр Зег Туг РЬе Агд Туг Ьеи
200 205210
Зег Азр СИи Азр Агд Пе Не Агд СИи Агд Уа! Из Суз Ьеи Рго
215 220225
Ьуз А1а СИи Зег Уа1 Из Уа1 Зег Уа1 А1а А1а А1а Зег Пе Пе
230 235240
А1а Агд Туг Уа1 РЬе Ьеи СИи СИи Ме! СИи СИп Ьеи Зег Агд А1а
245 250255
Уа1 СИу Ьеи Ьеи Ьеи Рго Ьуз СИу А1а СИу А1а Пе Уа1 Азр (Ии
260 265270
- 83 005739
А1а А1а А1а Азп Не Не Лтд А1а Аг§ (Ну А1а (Ии А1а Ьеи (Ни
275 280 285
Тйг Суз А1а Ьуз Ьеи Ηϊβ РЬе А1а Азп ТЬг Суз Ьуз А1а Ьеи Азр
290 295 300
Не А1а Ьуз Ατς Агд
305 <210> 18 <211> 39 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер ВсаКМШИйе для амплификации гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НШ, из ВасШиз саМоГепах <400> 18 с£аас#й£1 сааассаса! £аисаа£сс £ассааса$ 39 <210> 19 <211>663 <212> ДНК <213> Ругососсиз Ьопкозкй <400> 19 а(&аа££К£ сцщадйва (£аа£С££££ ащэдигсдаа; 1ааП££ссс £Оа£1ааИ 60 ££а£1а£сс£ мма£а1£а ваааааиа £а£а££Нас ОДасайзв ££Нааа£ас 120 (ссааасааг (аас£с«££ всаасодаа ааасгаша £саааПаа( а^ашссга 180
ВасцайаП аг^пснй сдйассссс аа$£ааа1а£ а^ававеса 1саПсОД 240 аа1£аас1а£ аадОДаваа айс£И£1а вссиваай сйСаавва! саа@сс£са£ 300 аацаШа^ 1ввас1с1£с с$а1£1а£а1 сс1аа£а££1 й£с1ав<с1 аМаааввс! 360
В&ОДааа! а1даа£ссас в£Па1с@сс £а$са1ааа£ сс£а1£сааа выдавай 420 £1а(с££са£ сагсаайаС (£сааа££1с асгаввдаи давадаида даадиааад 480 саааадШд дддаатдд йс1двс1а( ссда^дагс сдадаайаа вдад^дсй 540 даадаа(ай асааасааГа (додаст сс1ссаа(а£ иадвадаас йдддааасс 600 дсйддаада (ададдааад дШадаааа аа1садс(аа сдсндагаа айссйаад 660 (да 663 <210> 20 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер 1650Νάβ для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из Ругососсиз (йпозиз <400> 20 садваддада даса1а1даа аа1адвв88а 811 33
- 84 005739 <210> 21 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер 1650Ват для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсиз йтпозиз <400> 21 §аа88й$18 даГссасШ сГаад^Шс ка 33 <210>22 <211>672 <212>ДНК <213> Ругососсиз Йипозиз <400> 22
АТОААААТАО ОСООААТТОА СОААОСАООА АОАССАССАО СОАТАОООСС АТТАОТАОТА 60
ССТАСТОТСО ТССТТСАТСА ОАААААСАТТ САОААОСТСА ОАААСАТТОО АОТААААОАС 120
ТССАААСААС ТААСАССССА ТОАААООААО ААТТГАТТТТ СССАОАТААС СТСААТАОСС 180
ОАТОАТТАСА АААТАОТОАТ АОТАТССССА ОААОАААТСО АСААТАОАТС АООААСААТО 240
ААСОАСТТАО АООТАОАСАА ОТТТССТСТС 6ССТТАААТТ СОСТТС АОАТ ААААССАОСТ 300
СТТАТАТАСО СТОАТОСАОС ООАТОТАОАТ ОССААТАОАТ ТТССААССТТ
ОАТАОАОАОА 360
АОАСТСААТТ АТААССССАА ОАТТАТТОСС ОААСАСААОС ССОАТОСААА СТАТССАСТА 420
ОТТТСАОС АО СТТСААТАСТ ТССАААООТТ ОТТАОСОАТО АООАААТТОА ААААТТАААА 480
ЛАОСААТАТО ОАОАСТТТОО СТСТООСТАТ ССААОТОАТС САААААССАА ОАААТОССТТ 540
ОААОАОТАСТ АСААААААСА СААСТСТГГС ССТССААТАО ТСАОАСОААС СТОООАААСТ 600
ОТААОААААА ТАОАООАААО САТТАААССС ААААААТССС АОСТААСОСТ ТОАТАААТТС 660
ТТТААОАААС СТ 672 <210 23 <211>224 <212> Белок <213> Ругососсиз {ипозиз <400 23
Ме1 Ьуз Пе О1у О1у Не Азр О1и А1а О1у Аг§ О1у Рго А1а Не
10 15
О1у Рго Ьеи Уа1 Уа1 А1а ТЬг Уа1 Уа1 Уа1 Азр С1и Ьуз Азп Пе
- 85 005739
2530
СИи Ьуз Ьеи Агд Азп Не СИу Уа1 Ьуз Азр Зег Ьуз О1п Ьеи ТЬг
4045
Рго Из О1и Аг® Ьуз Азп Ьеи РЬе Зег С1п Не ТЬг Зег Не А1а
5560
Азр Азр Туг Ьуз Не Уа1 Не Уа1 Зег Рго О1и СИи Не Азр Азп
7075
Агд Зег О1у ТЬг Ме1 Азп О1и Ьеи СИи Уа101и Ьуз РЬе А1а Ьеи
8590
А1а Ьеи Азп Зег Ьеи О1п Не Ьуз Рго А1а Ьеи Не Туг А1а Азр
100105
А1а А1а Азр Уа1 Азр А1а Азп Агд РЬе А1а Зег Ьеи Не С1и Агд
110 115120
Агд Ьеи Азп Туг Ьуз А1а Ьуз Не Не А1а СИи Из Ьуз А1а Азр
125 130135
А1а Ьуз Туг Рго Уа1 Уа1 Зег А1а А1а Зег Не Ьеи А1а Ьуз Уа1
140 145150
Уа1 Агд Азр С1и О1и Не О1и Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз (31п Туг (Ну Азр
155 160165
РЬе СИу Зег О1у Туг Рго Зег Азр Рго Ьуз ТЬг Ьуз Ьуз Тгр Ьеи
170 175180
СИи С1и Туг Туг Ьуз Ьуз Йз Азп Зег РЬе Рго Рго Не Уа1 Агд
185 190195
Агд ТЬг Тгр С1и ТЬг Уа1 Агд Ьуз Не СИи СИи Зег Не Ьуз А1а
200 205210
Ьуз Ьуз Зег СНп Ьеи ТЬг Ьеи Азр Ьуз РЬе РЬе Ьуз Ьуз Рго
215220 <210> 24 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер 915-Р1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТЬегтоЮда тапйта <400> 24 ааааадсНд ддаа1адаед адстас 28 <210> 25 <211> 26 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер 915-Р2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТЬегтоЮда тапбта <400> 25 ааасса!ддд аа(ада(дад сН1ас 26
- 86 005739 <210> 26 <211>29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер 915-Й1 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из ТЬегп1о1о$а тапбта <400> 26 ааа1си£а1 сс1сааст £1с$а1£1£ 29 <210>27 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> ПЦР-праймер 915-К2 для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из ТЪегпюЮда тагшта <400> 27 ааСс1а$а11 аааааававв додоПаОД 30 <210>28 <211> 25 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный рИС19 иррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды риС19. “Нуклеотиды 24-
25 являются рибонуклеотидами дезоксирибонуклеотидами” * другие нуклеотиды являются
<400> 28 88181сас£с £1аи£ 25
<210> 29 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΚ.1Ν3, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды рИС19 ‘Щуклеотиды 28-30 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 29
ЩасасШ а(£сксс££ Дс^аС^ии 30
- 87 005739 <210> 30 <211> 17 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный М13М4 <400> 30
8Ийссса§ Касиас 17 <210 31 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсЬепсМа соИ 0-157. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400>31
181сайс£с {с^саатав вча 23 <210> 32 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсКепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 32 сассадасаа 1£1аасс£с1 $ии 23 <210> 33 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”
- 88 005739 <400 33
1ас188§СП Нсйс££11а 20 <210> 34 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой 0-157. ‘Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами,” <400> 34 а!а$аса1са а£ссс(с£иа 20 <210 35 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный МСК-Р, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.
<400 35 ссаНса§£с 1§с£саас1£ η 22 <210 36 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный МСК-К, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК, <400 36
1£§сас£аса ££Шссс£а с1 22 <210 37 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΡ2Ν3(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК. “Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”
- 89 005739 <400> 37 ёсфсаавёс §айаа§йв вала 24 <210> 38 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидным праймер, названный ΜΒ.1Ν3(24), сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК ‘Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 38 сШа1£сй сс£§с(с£Га Ιβίιιι 24 <210> 39 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 39
ССШС1С1£ ШЛ£(СС£ 20 <210>40 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 40 аавсасс(са НасссШ^с 20 <210> 41 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда.
- 90 005739 <400> 41
888С88С8асс1свС888Нисв 24 <210>42 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда.
<400> 42
8с18СИа1§ с1с1а1ааае 1а$£ 24 <210> 43 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Р1ауоЬас1епит ареаез. ‘Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами
- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 43 а^вааЮП атассаи® 20 <210>44 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Е1ауоЪас(епит зресйез. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами
- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 44
18§18Шаа асйай£С£ 20 <210> 45 <211>24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НауоЬайепит зреаез.
<400> 45
- 91 005739 сса1са£>с1а 1ааасасааа саде 24 <210 46 <211> 24 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Е1ауоЬас1епит зрес^ез.
<400 46
1£йН£асс аааса1а®1а а(ус 24 <210>47 <211>21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223-· Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕасЬепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 47
1с£нааа1а §и1ас£@ас а 21 <210> 48 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 48
1£С1саа1аа 1са£ас£аа£ 20 <210>49 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой ΟΙ 57.
- 92 005739 <400> 49 ааа1£££#1а с^йсс!®! 1ай 24 <210>50 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой О157.
<400> 50 с1СТд1а1с18сй§аа^с§ 1аа§ 24 <210> 51 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬейсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 51 (асс1££&П (Пенсии а 20 <210> 52 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕасЬепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 52 а1а£ас1т сдасссааса 20 <210> 53 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 93 005739 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа соП 0-157. ‘Цуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 53 а1а£аса(са аёссас^иа <210> 54 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой О157.
<400> 54
ТсцПааай ^наис^ас а <210> 55 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой О157.
<400> 55 ага£аса<са а^ссйс^а 20 <210> 56 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. ‘Цуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 56
8аасаа1£8а а^саасааа <210>57 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 94 005739 <220>
<223* Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Ус1 <400> 57 <210> 58 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб.
<400> 58 а1асиа££11ссаац£8с1 20 <210> 59 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У4 ‘Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 59
Зуааассг^й а^ааеис. 18 <210 60 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У6. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 60 ^аааассс С£Жа££аи 20 <210 61 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность
- 95 005739 <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК Г1ауоЪас1ег1ит зресйез. ‘Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами
- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 61 асс1а§аш аа$с1с1аса 20 <210>62 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ПауоЬассегшт зресйеа. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами
- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 62 ааа(а£а1£1 спа£са£а$ 20 <210>63 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК РЩоЬас1ег1ит зресйез. ‘Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами
- другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами,” <40О> 63 а1а£а1аааа аааасЮсас 20 <210> 64 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 18 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 64 (с£С1ааа1а £1аСас£1ас а 21 <210> 65 <211> 21 <212> ДНК
- 96 005739 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсКепсЫа соН 0-157, “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами- нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 65
1с$1ааа1а дшасщас а 21 <210 66 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 66
1с£йааа1а £1а1а1£&ас а 21 <210> 67 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 17 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 67
1£с1саасаа тсазасйаад 20 <210>68 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической Е$сйег1сЫа соН 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 16 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 68
- 97 005739
Г£с1саа1аа гсадайваав 20 <210>69 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕасйепсМа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - нуклеотид 15 представляет собой инозин - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 69
1£с1саа1аа 1са£1С£аа£ 20 <210 70 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕасЙепсЫа сой 0-157. ‘Цуклеотиды 9-11 и 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 70
1асс1£в£ии иМсйсвди а 21 <210 71 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. Нуклеотиды 8-10 и 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 71 а!а§асаиса а§ссс1с§иа 20 <210> 72 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации
- 98 005739 фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа со11 0-157 “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 72 дСссссТдад аТаТаТдиис 20 <210> 73 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсМа сой 0-157.
<400> 73 ссаасааад! СаТдСОсП сдПаааТад 30 <210>74 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΪΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 74 атдссаттда дпсагсаас 20 <210> 75 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΪΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 75 (сйддхддс ааадаГдад 19 <210> 76 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность
- 99 005739 <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмент: последовательности, кодирующей 1ΝΟ8 мыши.
<400> 76 а^ссай^я §Нса1саас 20 <210> 77 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΪΝΌ8 мыши.
<400> 77 ааава(ёа8 19 <210> 78 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-РСК-Р 20мер.
<400> 78 а1с£Н£аа£ Щ£сс1с1£с 20 <21О>79 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ОМО-РСК-К 20мер.
<400> 79
1сс§1а(8а1 сдсдсдгса! 20 <210> 80 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный СМО5! 20-мер. “Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды
- 100 005739 являются дезоксирибонуклеотидами?’ <400> 80
Ш^а^адд асасдс1§ас 20 <210> 81 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный СМО82 20-мер. “Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 81
ЙКасас8с*8 асаа£с1£ас 20 <210> 82 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ОМОА1 20-мер. ‘Чуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 82 ££<Я£1а£сс ас1£а1£си£ 20 <210 83 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный СМОА1 20-мер. “Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 83
Нсс§дааа§ £сса£а££а11 20 <210>84 <211>21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации
- 101 005739 фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсЬепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 84
1ас188£Н тсис££и а 20 <210> 85 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзсйепсЫа сой 0-157. Шуклеотиды 18-20 являются (альфа-тио)рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 85 а(а£аса!са а£ссс1с£иа 20 <210> 86 <211>22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΓΝΟ5 мыши. ‘Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 86
ЮаТ^ссаИ £а£йса1са ас 22 <210>87 <211>22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 87
1££1а££й£ С1£Ц£ШС иа 22 <210>88 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность
- 102 005739 <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши.
<400> 88 (сасдссап дадкса1са ас 22 <210> 89 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΓΝΟ8 мыши.
<400> 89 {ддгаддйс с1д«@Гйс Га 22 <210> 90 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 90 стдсдаддсд ^ддсааддд 20 <210> 91 <21]> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК фага лямбда. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 91
ЛдссСсдс! ддссдфссд с 21 <210>92 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 103 005739 <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ5 мыши. “Нуклеотиды 21-23 являют» рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 92 с1са1£сса( сдознсмс аас 23 <210> 93 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши. ‘Нуклеотиды 20-22 являют» рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 93 £с1££1а$£11сс1£ОД1и ис 22 <210>94 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ρϋΟΝ-ΑΙ, “Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 94 а£с1с1£1а1 с1д§с££ас 19 <210>95 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ρϋΟΝ-ΑΙ. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 95 ®а1с£££ай Прайса £ 21 <210>9б <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность
- 104 005739 <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ типа 16. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 96 саааа^адаа с(§саа(8ии и 21 <210 97 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК НРУ типа 16. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 97 йй^сН^са £1асасасаи и 21 <210>98 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части ДНК НРУ.
<400 98 ёавзасссас а£&а£С{>асс са&ааа£ 27 <210> 99 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.
<400> 99 сас1ссасса 1цаа£сас1с 20 <210> 100 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 105 005739 <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.
<400>100 £ОДсас££1 стасдадасс 20 <210> 101 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами ” <400> 101 с1£1£а£даа с1ас!§1сии с 21 <210> 102 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 102
Зсадассасг а(8$сиси 18 <210> 103 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации фрагмента генома ДНК НРУ.
<400> 103 £1а1ва£1£1 с£1£са$сс1 сса^асссс 30 <210> 104 <211>21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 106 005739 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 104
18аваса1а11а(с1^ссас $ 21 <210> 105 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 105 ааа1889*а8 заввфвааз а 21 <210> 106 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 106
ПаТсадсса £1асс1с(ис в 21 <210> 107 <2Н>21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.
<400> 107
1вадаса1а1ШОДссас в 21 <210> 108 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 107 005739 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.
<400> 108 ааа1£#с1а§ £а££1££аа£ а 21 <210> 109 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У<1.
<400> 109
88§£ааасс1 ^а^аадТс 20 <210> 110 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У<1.
<400110
С88£1а£1а£ ссааа§£аа& 20 <210111 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ρϋΟΝ-ΑΙ <400 111 а£с!с1£(а1 с1£§с££ас 19 <210> 112 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК ρϋΟΝ-ΑΙ
- 108 005739 <400 112 ва(с£В83П Й1ввас1са в 21 <210> 113 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕасйепсЫа сой 0-157. 'Цуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 113
ВВ88а1аап (§щдсави 20 <210> 114 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕасйепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 114 (сдНсааса атаадссдиа 20 <210> 115 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей веротоксин 1 из геморрагической ЕзсйейсЫа сой 0-157.
<400> 115 с§сссПсс1 с1£$а1с1ас сссмдаса 30 <210> 116 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации
- 109 005739 фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1о$1п<1шт ЬошНпит. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.
<400116 сасса$аа§с аааасаадии с 21 <210> 117 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1о$1псйшп ЬошНпит “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 117 с1а(!£а1д1 (аасаасаН сии 23 <210> 118 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части последовательности, кодирующей ботулинический токсин А из С1ояпс1шт ЬошНпит.
<400> 118
ЙЗда^йаса ааайаОД ада^ааГНа 30 <210> 119 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СБУй. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 119 сассснсс! На^тсси и 21 <210 120 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность
- 110 005739 <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУб. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 120 сдЦдаадс! ГсадНдиии 20 <210> 121 <211 >30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный зонд сконструированный, для детекции фрагмента ДНК, получающегося в результате амплификации части генома вироида СЗУд.
<400> 121 ссШхШс йддададд! сйсГдссс! 30 <210> 122 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8Уб. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 122 сасссйсс! НадЩсси и 21 <210> 123 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида СЗУй. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 123 сдйдаадс! ГсадНдШи с 21 <210 124 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 111 005739 <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У<1.
<400> 124 сассснса Падшее! ( 21 <210>125 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома вироида С8У6.
<400> 125 сдпдаадс! !садпдш с 21 <210> 126 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-кьгаа. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 126 дасЯдааТа! ааасПдидд 20 <210> 127 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-кьгаа. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 127 сТаПдКдд а1са1а!ис§ 20 <210> 128 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 112 005739 <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-кьгаз.
<400> 128 @ас1£аа1а1 ааа<ОД>1£§ 20 <210> 129 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента онкогена с-кьгаз.
<400> 129 с1аНдй§да1са1аИсд 20 <210> 130 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзЬепсЫа сой 0-157. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400>130 $ас(Шсда сссаасааад 20 <210> 131 <211 >20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей веротоксин 2 из геморрагической ЕзйепсЫа соП 0-157. ‘Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 131 а1а!ссаса£ саааа(ааси 20 <210> 132 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 113 005739 <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей ΙΝΟ8 мыши <400> 132 сасааввсса саТсвдаШ с 21 <210> 133 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмент: последовательности, кодирующей N08 мьппи <400> 133
Гдсагассас псаассс^а 8 <210> 134 <211> 25 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный р11С19 иррег 150, сконструированный для амплификации фрагмента плазмиды ρϋ€19.
<400> 134
88181сас8с1С81свЛ1вв1а<8 25 ' <210> 135 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> ' <223> Олигонуклеотидный праймер, названный риС19 Ιοννοτ для амплификации фрагмента плазмиды ρϋΟ19.
, сконструированный <400> 135
Защасасте сдассаасй асис 25 <210> 136 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
Химепный олигонуклеотидный праймер, названный 8ЕА-1, сконструированный
- 114 005739 для амплификации фрагмента генома 81арЬу1ососсиз аигеиз. ‘Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 136
181а181а»8 8188181аас § 21 <210>137 <2Н>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный 8ЕА-1, сконструированный для амплификации фрагмента генома 8гарЬу1ососсиз аигеиз. “Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 137
Гаасс^тс сааа^аси § 21 <210> 138 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-РЗ, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400 138
8С$Сс1а£Сс аГ^всдииа 19 <210> 139 <211> 18 <212> Д НК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-К.1, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 139
8са§ассасг аГ^сиси 18 <210> 140 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 115 005739 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный МР2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды ρϋΟΙΟ.
<400> 140 дда!д1дс!д сааддсдай аадй§дд(а 30 <210> 141 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МВ.1, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК плазмиды риС19.
<400> 141
ШасасГй аСдсйссдд с1сд1а(дй 30 <210> 142 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента генома аденовируса.
<400> 142 йа1садсса д!асс1сйс д 21 <210> 143 <211> 714 <212> ДНК <213> ТйегтоЮда тапбта <400> 143 а1дддаа(ад а1дадсй4а саааааадад Й1ддаа1сд Гадсадд!д1 дда!даадсд 60 ддаададдд! дсс1сдсадд 1сссдйд1д дсддссдсСд 1сдйс1дда аааадаааСа 120 дааддаа(аа асдайсааа асадсСйсс сйдсдаада дддааадас! тадасдаа 180 агамддада аддсадсадГ {дддйадда айдсдСйс сададдааа! ада(с(с1ас 240 аасагайса агдссасааа асйдсшд аа!сдадсас (ддадаасс! д1с1д1дааа 300 ссаСсаГйд 1ас1сдйда сдддааадда аГсдадйда дсдйсссдд (асасдсйа 360 дсдаадддад ассадаааад сааайдага ддадсадсй ссайдйдс даадд1сйс 420 ададагада! 1да1дадсда дйгсасадд а1д1аГссас адййссй ссасааасас 480 аааддйасд ссасаааада асаШдаас дааа!садаа адаасддад! Й1ассаа1с 540 сассддссда дййдаасс Гдййадаа систдассд аГдаМдй дадддадйс 600 йсдааааад дсйсаййс сдаааа(сда йсдаасдаа |айдаа1с11с1дддддсд 660 адааааад(д (ддййссд дааадааада асааасса1а а1с!ссс1с1 ш 714 <210> 144 <211> 238
- 116 005739 <212> Белок <213> ТЬегпюГода шапйта <400> 144
Мег01у Пе Азр О1и Ьеи Туг Ьуз Ьуз С1и РЬе О1у Не Уа1 А1а
1015
О1у Уа1 Азр О1и А1а О1у Аг§ О1у Суз Ьеи А1а О1у Рго Уа1 Уа1
2530
А1а А1а А1а Уа1 Уа1 Ьеи С1и Ьуз 61и Пе О1и О1у Пе Азп Азр
4045
Бег Ьуз О1г> Ьеи Бег Рго А1а Ьуз Агд О1и Агд Ьеи Ьеи Азр (Ни
5560
Пе Мег (Ли Ьуз А1а А1а Уа1 С1у Ьеи С1у Пе А1а Бег Рго 61и
7075 (Ли Пе Азр Ьеи Туг Азп Пе РЬе Азп А1а ТЬг Ьуз Ьеи А1а Мег
8590
Азп Агд А1а Ьеи (Ни Азп Ьеи Бег Уа1 Ьуз Рго Бег РЬе Уа1 Ьеи
100105
Уа1 Азр (Ну Ьуз О1у Пе О1и Ьеи Бег Уа1 Рго (Ну ТЬг Суз Ьеи
110 115120
Уа1 Ьуз О1у Азр С1п Ьуз Бег Ьуз Ьеи Не (Ну А1а А1а Бег Пе
125 130135
Уа1 А1а Ьуз Уа1 РЬе Аг£ Азр Аг£ Ьеи МеГ Бег (Ли РЬе Н1з Агд
140 145150
Мег Туг Рго 61η РЬе Бег РЬе ΗΪ3 Ьуз Н1з Ьуз С1у Туг А1а ТЬг
155 160165
Ьуз О1и ΗΪ3 Ьеи Азп (Ли Пе Аг£ Ьуз Азп О1у Уа1 Ьеи Рго Пе
170 175180
ΗΪ3 Агд Ьеи Бег РЬе О1и Рго Уа1 Ьеи 61и Ьеи Ьеи ТЬг Азр Азр
185 190195
Ьеи Ьеи Аге 61и РЬе РЬе О1и Ьуз 61у Ьеи Пе Бег (Ни Азп Аге
200 205210
РЬе О1и Агд Пе Ьеи Азп Ьеи Ьеи О1у А1а Аг® Ьуз Бег Уа! Уа1
215 220225
РЬе Ατβ Ьуз О1и Ατβ ТЬг Азп Нк Азп Ьеи Рго Ьеи РЬе
230235 <210> 145 <211> 663 <212>ДНК <213> Ругососсиз ЬопкозЬП <400> 145 агдааееов сг^агПеа г^аа^с^^ а^ддессдд гаап^ссс дйадгааи 60 ддадгадссв ГГаГадагда дааааагагг дададдпас д1§асаи§£ ддпааадас 120 [ссааасааГ Гаас1сс(££ дсаас§1§аа ааасГаГНа £сааа1Гаа( а^аГаГссГа 180 дасдаИа» аТдГГсПсг сдНассссс ааддааагад аГ£а£а££са ГсаНсГаГд 240 ааг^аасгад аадсгдадаа аПсдПдГа дссйдааи сШааддаГ саадссдсад 300 аа§а1аГа1£ гддасГсГдс сдаГдГадаГ ссГаа§а§§Г ГГ£с(а§1сГ ааГаааддсГ 360 8§§и§ааа1 агдаадссас £§кагс£сс да§сагааа§ ссдагдсааа £ГаГ£а£а(а 420 £Га1с££са£ саГсааГааГ Гцсааадрс асГадддаГа дададаГада даадсГааад 480
- 117 005739 саааад1а!д дддаашдд йсхддйа! ссдад1да1с сдадааааа ддад!ддсй 540 даадааш асааасаа(а гдд!дасШ сс1ссаа1ад Паддадаас йдддааасс 600 дс!аддаада 1ададдааад дшадаааа аа1садс(аа сдсйда1аа айссйаад 660 1§а 663 <210> 146 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер РЬоЬМе для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсиз ЬопкозИй.
<400> 146 аддаддаааа 1са1а1даад дйдс1ддад 30 <210> 147 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер РкоВат для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из Ругососсиз ЬопкозЬй.
<400> 147 йаса1даад да!ссаада( сасйаадда 30 <210> 148 <211>663 <212> ДНК <213> Ругососсиз ЬопкозЬй <400> 148 ащааддйд щддадйда {даадсдддд адддддссдд {ааНддссс дйадгаай 60 ддадйдссд йа1адагда дааааайй дададдйас д1дасайдд ддйааадас 120 юсааасаа! 1аас1сйдд дсаасд1даа ааас1аша дсааайаа! ада!а1сс1а 180 дасдайай а1дйсйс1 сдйассссс ааддааа1ад а1дададдса Гсайс1а1д 240 аа1даасеад аадстдадаа айсдйд(а дссйдаай сй1аадда1 саадссдсад 300 аадаша(д (ддасШдс сда1д(ада! сс!аададд1 (1дс1ад1й аа1аааддс1 360 дддйдааа! а1даадссас ддйа(сдсс дадса1ааад ссда1дсааа дШдадаса 420 дШсддсад са(саа1аа1 гдсаааддгс ас1аддда!а дададМада даадсйаад 480 саааадШд дддаатПдд йс1ддйа1 ссдад(да(с сдадаайаа ддадеддсП 540 даадаа1ай асааасажа 1дд(дасй1 сс(ссаа1ад йаддадаас йдддааасс 600 дсСаддаада 1ададдааад дШадаааа аа1садс1аа сдсйда1аа айссйаад 660
1да1сйдда 1сс 663 <210> 149 <211> 220 <212> Белок
- 118 005739 <213> Ругососсиз ЬопкозЬН <400> 149
Ме1 Ьуз Уа1 А1а СНу Уа1 Аар (Ии А1а (Иу Аг§ О1у Рго Уа1 Не 15 1015
СНу Рго Ьеи Уа1 Не С1у Уа1 А1а Уа1 Не Аар О1и Ьуз Азп Не
2530
С1и Аг§ Ьеи Аг§ Аар Не О1у Уа1 Ьуз Азр Зег Ьуз СНп Ьеи ТЬг
4045
Рго СНу О1п Аг£ СНи Ьуз Ьеи РЬе 8ег Ьуз Ьеи Не Азр Не Ьеи
5560
Азр Азр Туг Туг Уа1 Ьеи Ьеи Уа1 ТЬг Рго Ьуз О1и Не Азр (Ли
7075
Αγ£ ΗΪ5 Н18 Зег Ме1 Азп СНи Ьеи СНи А1а СНи Ьуз РЬе Уа1 Уа1
8590
А1а Ьеи Азп Зег Ьеи Ατβ 11е Ьуз Рго СНп Ьуз Не Туг Уа1 Азр
100105
Зег А1а Азр Уа1 Азр Рго Ьуз Аг§ РЬе А1а Зег Ьеи Не Ьуз А1а
110 115120
С1у Ьеи Ьуз Туг О1и А1а ТЬг Уа1 Не А1а СНи Ηί« Ьуз А1а Азр
125 130135
А1а Ьуз Туг СНи Не Уа1 Зег А1а А1а Зег Не Не А1а Ьуз Уа1
140 145150
ТЬг Аг§ Азр Аг£ СНи Не С1и Ьуз Ьеи Ьуз О1п Ьуз Туг СНу СНи
155 160165
РЬе СНу Зег <31у Туг Рго Зег Азр Рго Аг§ ТЬг Ьуз СНи Тгр Ьеи
170 175180
СНи СНи Туг Туг Ьуз СНп Туг СНу Азр РЬе Рго Рго Не Уа1 Аг§
185 190195
Аг§ ТЬг Тгр О1и ТЬг А1а Аг$ Ьуз Не О1и СНи Аг# РЬе Аг§ Ьуз
200 205210
Азп О1п Ьеи ТЬг Ьеи Азр Ьуз РЬе Ьеи Ьуз
215220 <210> 150 <211>626 <212>ДНК <213> АгсЬаео£1оЬиз 1и1£1<1из <40О> 150 а1£аа£8са8 £са1сда18а зваввааае £§с1£С81са 1с8£сссас( 88«§п§са 60 ёвагодгсп £са£С£а1£а ^таздод адваадсп® £1§1£ааа£а с1ссааааа£ 120 с1аа§1са8£ §£а££а£ава ззаас&зсс 8а88ааа1аа зваааакЛв са^аас^а^ 180 ^ик^ааа^ Шсхссс^а аааГЛсзас £ааа£ва<£§ с1§с1аааас са1ааас£а$ 240 аГШ^аав# а£С§с1ас8С (дааагаай с1са£8с1£а а§сс8£ааа1 (£сНа1£П 300 §аса£1ссГ£ а^даНсс с^ададасй ОДад^азс Н£а£§а£а11асд8ё£й£ 360 а£а£Н:§18£ сс£а§сасаа ^с^ас^ад аа&1а1сссс ^сисаатс 420 а1с&сааа$81£&ааа$£8а §с§§£а£а11 да^а^сща ааваааааН сщщзаГПс 480 8£Са£С£§с( а1£С£а8с§а 1сс§а8§аса ададаа^Гдс 1£аа£§а£С8 §а1адспса 540 8£са4»ааис с£а£с1£С£1 ^а^аа^с^с 1££аа£ас£8 1£1сааа1с( ^а^са^аав 600 ас£сН£ас£ аН1с1ааас £ааасс 626
- 119 005739 <210> 151 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер Α&Νύβ для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НП, из АгсЬаео^оЬиз <400> 151 аадсХд^дП (са^даад £с১са1с8 30 <210> 152 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер А&Ваш для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из АгсЬаео^ЬЬиз &1£ίΛΐ8.
<400> 152
1§£1аа1аас ££а1сс£1Е1 авааакдЩ 30 <210> 153 <211>638 <212>ДНК <213> Агсйаео£1оЬи5 <400> 153 са1а1£аа££ са£§са1с£а 1£Э££С1££а аа£££с1£С£ 1са1с££ссс ай££й£П 60 £с১а£1££ сН£са£С£а 1§а§£а1а££ с(£а£ааа£с П££1£1£аа адасГссааа 120 аа§с1аав1с аввввавкав а£а££аас1а £сс$а££ааа 1аа£$аааа1 с1$са£аас£ 180 аа£й1с(сс с£аааа1с1с £ас£ааа££а 1££с1&с1аа аассатааас 240 £а£а(П1£а а££а£1£С1а с£с(£ааа1а айс1сац£с (£аа£СС££а аай£сйа1 300 £й£аса£1с οίβ»ΐ£(£αί (ссс^а^ада сй1с£а£££ а^сп^а^а £аШс££££ 360
П£а£а£й£ 1££сс£а£са саа££с££ас дадаадшс ссст^а^с 1£Сй8сПса 420 а1сатс§саа а££1£§ааа£ ££а£С£££а£ ап@а£а££с (£ааа£аааа айс££££а1 480 йс££са£С£ £с1а1£С8а§ с£а1сс£3££ зсаа£з§аз£ 1£с1£аа££а £(££а1а£с1 540
1сад£садаа иссваДОв С£1£а£аа1£ сдсгддаа^а с§§1£1сааа 1с(£а£§са§ 600 аа£ас£сй£ ас£а(Пс1а аас££а1ссс с£££(асс 638 <210> 154 <211> 205 <212>Белок <213> АгсЬаео£1оЬи51и1£к1из <400> 154
Ме1 Ьуз А1а О1у Не Аар Сг1и А1а О1у Ьуз (Ну Суз Уа1 Не О1у
10 15
- 120 005739
Рго Ьеи Уа1 Уа1 А1а О1у Уа1 А1а Суз Зег Азр СИи Азр Агу Ьеи
2530
Агу Ьуз Ьеи О1у Уа1 Ьуз Азр 8ег Ьуз Ьуз Ьеи 8ег О1п О1у Агу
4045
Агу С1и <31и Ьеи А1а СИи О1и Не Агу Ьуз Не Суз Агу ТЬг СИи
5560
Уа1 Ьеи Ьуз Уа1 Зег Рго СИи Азп Ьеи Азр СИи Агу Ме1 А1а А1а
7075
Ьуз ТЬг Не Азп О1и Не Ьеи Ьуз О1и Суз Туг А1а О1и Не Не
8590
Ьеи Агу Ьеи Ьуз Рго С1и Не А1а Туг Уа1 Азр Зег Рго Азр Уа1
100105
Г1е Рго С1и Агу Ьеи 8ег Агу С1и Ьеи СИи б1и Не ТЬг О1у Ьеи
110 115120
Агу Уа1 Уа1 А1а С1и НтзЬуз А1а Азр СИи Ьуз Туг Рго Ьеи Уа1
125 130135
А1а А1а А1а 8ет Не Не А1а Ьуз Уа101и Агу О1и Агу СИи Не
140 145150
С1и Агу Ьеи Ьуз СИи Ьуз РЬе СЛу Азр РЬе С1у Зег С1у Тут А1а
155 160165
Зег Азр Рго Агу ТЬг Агу О1и Уа1 Ьеи Ьуз СИи Тгр Не А1а Зег
170 175180
СИу Агу Не Рго Зег Суз Уа1 Агу Ме1 Ату Тгр Ьуз ТЬг Уа1 Зет
185 190195
Азп Ьеи Агу (Лп Ьуз ТЬг Ьеи Азр Азр РЬе
200205 <210> 155 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤΙ32Γ, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬайепит 1иЬетси1оз13. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 155
1с1су1ссау суссусии 18 <210> 156 <211> 21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный МТ182К, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬастепит 1иЪегси1оз18.
“Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”
- 121 005739 <400> 156
Васааавзсс асШвв^ а 21 <210> 157 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2Г, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК критической плазмиды СЫатусйа иасйотабз “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 157 с1в§аН1а1 сзвааассии 20 <210 158 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный СТ2К, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК критической плазмиды СЫатуЛа ИасЬотабз. “Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 158 аз£сс1с1ва аасдасии 18 <210> 159 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Р-1ОЗЗ(бО), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1егшт 1иЪегси1о$1$. “Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 159 сасаюдаСс сззйсавс 19 <210> 160 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 122 005739 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К-1133(62), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬасгегшт 1иЬегси1оз1з, Щуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 160 (£агс£1с1с §£с1а£1£са 20 <210> 161 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-Р-1033(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епиш 1иЬегси1оз15. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 161 £1асаса1с£ а1сс££йса £с 22 <210> 162 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный К-К.-1133(68), сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас(епит 1иЬегси1озЙ8. “Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 162 £й£а1с£1с 1с££с1а£1£ са 22 <210>163 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный Р26, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епиш шЬегсЫомз.
<400> 163 сс££й£ас1с садйсйдд 20 <210> 164 <211 >20 <212>ДНК
- 123 005739 <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, названный К.1310, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епшл 1иЬегси1оз1$.
<400> 164
81с1с1в§с8 НдадсдТад 20 <210> 165 <211>22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ρϋΟΝ-ΑΙ-68-Ι, сконструированный для амплификации фрагмента ρΟΟΝ-ΑΙ. ‘Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 165 ас(адс!с(д (аТОддсдд ас 22 <210>166 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный ρϋΟΝ-ΑΙ-68-2, сконструированный для амплификации фрагмента ρϋΟΝ-ΑΙ. “Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 166 асдатсддда йШддай сад 23 <210>167 <211> 300 <212>ДНК <213> Протоонкоген \Уп(-5а из Ното зар^епз <400>167 сас1адаТй (ПдШддд даддйддсТ ТдаасаТааа ТдаааТаТсс ТдСаМсТ 60
ТадддаТас! тддйадСаа айа1аа1ад 1адаааТааТ асат§аа(сс сайсасадд 120 йййсадсс саадсаасаа ддТааПдсд [дссайсад саадсасса дадсадасаа 180 ссТайТдад дааааасад! дааатссасс йссЮйса сас(дадссс «ЛсТдайс 240 с1ссд1дйд 1дагд1дасд с1ддссасд( йссааасдд садс1ссас! дддюсссн 300 <210> 168 <211> 300 <212> ДНК <213> Рибосомальный белок 55 из Ното зар1еп$
- 124 005739 <400>168 сцссдащца са^асди саввст## ЮсавваГй ассдарздв адасавсадс 60 ассадсддСз дсададассс са§аса1саа дс1сШвеа аа^ддадса ссдаСдздр 120 §са§а(саа1 дасаШссс сдсаддаиа сапдсадсд ааддадаадс а1дссаа$1а 180 сс1ссс1сас а£1£са£8@с ддШдссдс ааасдсШс с$сааа£С1с аддассса! 240
1£1££а8С£с с(сас1аас1 сса<$а1£а1 £сас£8сс§с аасаасддса а$аа$с1са1 300 <210> 169 <211>300 <212>ДНК <213> Диафораза из Ното зар1епз <400>169 (ссаСасааа Ойсадаад дпаипс! иагсапдс Гааас1§а1§ асПасса1@ 60
8821888810 са01ссса18 ассНйаИЯ асаайдсаа асйададн йа1саасО 120
С0818ааса8 терема ага^саап 1с(аскс(8 $аад1са1с1 сапссаод 180
И££1аНа1 а!ааПсаа£ дадааШда 1аааасас1д сссКОДрз ^дсаКдаа 240 адаададагд адаааС^аСд аааа£$Н£с «дааааасд дазасадсс кжасндс 300 <210 170 <211>300 <212>ДНК <213> Прогокадгерин человека <400> 170 а£1с1сИ8£ £Шсссс1аа сса£адссн Ш£сса1а£ £$с1£сасас 1££1сааа1с 60 а£1ас1дссе рссацКха ауасасада! (сасссаддс адасШсас §01сН0агс 120 ааа£асаа1£ £££адссас дсклссасс ас1{>с1ассс 1сас1£1§сс а^аассца^ 180
8ас1йсс1£ аавсссвадс сдадйсссс ίΛβ^οίσιρ сссссс^да £са£аааааа 240 ааКЯсасс! Й1а1с1ас[ (сГйссйа ШссСддШ сЦавдвкЛ: (дОДрсаса 300 <210> 171 <211> 80 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид, сконструированный для получения р1С62.
<400> 171 са(£1аса1с аеа£1а$1С£ псаса£££1 тссддсса (ааодссп (ссододс 60 (рдйасавс ирсарса 80 <210> 172 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный 1САЫ2.
- 125 005739 ‘Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 172 ас1£ас1а@с 1£(а8сасас 20 <210>173 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, названный ΙΟΑΝ6. ‘Нуклеотиды 19-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400>173 аса1саса£1 а£1с$Нсас 20 <210> 174 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер Ι0ΑΝ2.
<400> 174 ас1£ас1а$с 1&1а£сасас 20 <210> 175 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ДНК-праймер 1САЫ6.
<400> 175 аса(саса£1 а^с^Исас 20 <210> 176 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей рибосомный белок 818 мыши.
- 126 005739 <400> 176 а1ссс1§а£а ββΐ 23 <210> 177 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей рибосомный белок 818 мыши.
<400> 177
1£§а1асасс сасадпсвв ссс 23 <210> 178 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕК.) мыши.
<400> 178 ссвсвс1сс§ асаа§1а£а1 вва 23 <210>179 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей трансферриновый рецептор (ТЕК) мыши.
<400> 179 ссааава§1в саав£1с1£с СТс 23 <210> 180 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (8άί4).
<400> 180 (с1£а(в§аГ всаассдсга вас 23
- 127 005739 <210>181 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента мышиной последовательности, кодирующей фактор 4 клеток стромы (8й£4).
<400> 181
ЗаасСсйса (£сас£Г1§с 23 <210> 182 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей цитоплазматический бега-актин мыши.
<400> 182
1еа1йй1ййй аашшсаа аав 23 <210> 183 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей цитоплазматический бега-актин мыши.
<400>183 айааёсасн есде^сасв ащ 23 <210> 184 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.
<400> 184 £а1£ааа&1с $сса$а£сас асе 23 <210> 185 <211> 23
- 128 005739 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.
<400 185
П8а1сс1а§ са^аа^саса 88е 23 <210> 186 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей орнитиндекарбоксилазу мыши.
<400 186
8§аса88ас18ааа§ас118 0,0 23 <210> 187 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазу (НБелок) мыши.
<400> 187
8<с188сс18 1а1ссаасас Ис 23 <210 188 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрагмента последовательности, кодирующей гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазу (НБелок) мыши.
<400> 188 аТдазЛйй18^8^8800 23 <210 189 <211> 23 <212> ДНК
- 129 005739 <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации фрап последовательности, кодирующей тирозин-3-монооксигеназу мыши.
<400 189
Псссйсс! ТС1СС1£СЙ с1§ 23 <210> 190 <211>21 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МС8-Г.
<400> 190 ссайсаздс 1§с£саа1£11 21 <210 191 <211> 22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный МС8-В.
<400> 191
1££сасваса ££тссс£а ст 22 <210 192 <2Н>24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированный олигонуклеотидный праймер, названный ΜΓ2Ν3(24). “Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 192
8с(§саав8с даПаадПз вдиа 24 <210> 193 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Сконструированныйолигонуклеотидный праймер, названный МВ 1Ν3 (24).
- 1З0 005739 “Нуклеотиды 22-24 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибо ну клеотидами ” <400> 193 сШафсй сс£8с(с£1а Т^ии 24 <210> 194 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный ΜΤΙ82Ρ-16, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬастепит 1иЬегси1оыз. “Нуклеотиды 14-16 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами,” <400>194
1с£»сса8С8 сессии 16 <210> 195 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МТ182В.-АСС, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епит ТиЪетси1омз. ‘Ъуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 195 сааа§£ссас £1а££С£>аас 20 <210> 196 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МТ18-РСК-Р-2, сконструированный для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епшп гиЬегси1оз!з <400>196 сдасс^саю аасс£££а£с 20 <210> 197 <211>20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный МТ18-РСК-В.-2, сконструированный
- 131 005739 для амплификации фрагмента ДНК МусоЬас1епиш 1иЬегси1о$1$.
<400> 197 ссса£ва1сс с§свавс§1а 20 <210> 198 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный 8Р6-НСУ-Т, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ.
<400> 198 ссашаддг васас1а(ав аа1ас1§а1в В888с8асас 1ссас 45 <210> 199 <211> 45 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, названный 8Р6-НСУ-К, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ <400> 199 а&с1с1аа1а свас1сас1а ТавввСсвса авсассс!а1 саввс 45 <210 200 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А 8, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.” <400> 200
В881сс«1с Нвва1саас 20 <210> 201 <211>20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Химерный олигонуклеотидный праймер, названный НСУ-А А, сконструированный для амплификации фрагмента генома НСУ. “Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.”

Claims (120)

1. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) получение реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
2. Способ по п.1, где реакционная смесь также содержит химерный олигонуклеотидный праймер с последовательностью, существенно гомологичной нуклеотидной последовательности нуклеиновой ки
- 132 005739 слоты, служащей матрицей.
3. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной матрице, и синтеза двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы, обладающей активностью замещения цепи, в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и (c) повторное использование на стадии (Ь) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), в качестве матрицы.
4. Способ амплификации нуклеиновой кислоты с использованием по меньшей мере двух праймеров, включающий (a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной матрице, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы, обладающей активностью замещения цепи, в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты;
(c) повторное использование на стадии (Ь) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (Ь), в качестве матрицы;
(б) обработку замещенной цепи, полученной на стадии (Ь), в качестве матрицы по меньшей мере одним праймером, отличающимся от праймера, используемого на стадии (а), и ДНК-полимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной замещенной цепи, где праймер, отличающийся от праймера, используемого на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности замещенной цепи, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(е) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы, обладающей активностью замещения цепи, в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и (Г) повторное использование на стадии (е) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), в качестве матрицы.
5. Способ по п.3 или 4, где ДНК-полимераза представляет собой по меньшей мере одну ДНКполимеразу, обладающую активностью замещения цепи.
6. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой, обладающей активностью замещения цепи, для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и (c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеино
- 133 005739 вой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи.
7. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой, обладающей активностью замещения цепи, для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и (c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой.
8. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой, обладающей активностью замещения цепи, для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;
(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отожженных одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);
(б) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера, полученной на стадии (с), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отожженных одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а); и (е) повторное использование на стадии (б) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера, полученной на стадии (б).
9. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (а) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой, обладающей активностью замещения цепи, для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;
(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;
(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных
- 134 005739 участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (Ь), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отожженных одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);
(б) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера, полученной на стадии (с), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи;
(е) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи, полученной на стадии (б), по сайту, содержащему рибонуклеотид; и (Г) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, с 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенная с праймера цепь расщеплена, полученного на стадии (е), для синтеза замещенной цепи.
10. Способ по любому из пп.6-9, где эндонуклеаза представляет собой эндорибонуклеазу.
11. Способ по п.10, где эндорибонуклеаза представляет собой РНКазу Н.
12. Способ по любому из пп.1-5 и 11, где РНКазу Н выбирают из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксйепсЫа сой, РНКазы Н из бактерии рода ТйегшоЮда, РНКазы Н из бактерии рода Тйегтик, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик, РНКазы Н из бактерии рода Агсйаеод1оЬик и РНКазы Н из бактерии рода ВасШик.
13. Способ по любому из пп.1-12, где длина амплифицируемого фрагмента нуклеиновой кислоты составляет 200 п.о. или менее.
14. Способ по любому из пп.1-13, где используют химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже:
общая формула: 5'-6Νη-ΝΒ-6Νο-3' (а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; 6Ν: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из 6Ν в б№1 могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).
15. Способ по п.14, где с равно 0.
16. Способ по п.14 или 15, где нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (α-8)рибонуклеотид.
17. Способ по любому из пп.14-16, где реакцию достраивания ДНК проводят при температуре реакции достраивания ДНК, подходящей для химерного олигонуклеотидного праймера по любому из пп.1416.
18. Способ по любому из пп.1-17, включающий отжиг нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, с химерным олигонуклеотидным праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, в растворе для отжига, содержащем вещество, которое усиливает отжиг нуклеиновой кислоты с праймером.
19. Способ по п.18, где раствор для отжига содержит спермидин и/или пропилендиамин.
20. Способ по п.18 или 19, где отжиг проводят путем инкубации раствора для отжига, содержащего нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, и химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, при 90° или выше, и последующего охлаждения раствора до температуры, при которой проводят реакцию амплификации, или до более низкой температуры.
21. Способ по любому из пп.1-20, где реакцию амплификации проводят в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из Бицина и НЕРЕ8.
22. Способ по любому из пп.1-21, где ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, выбирают из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы Ι из ЕксйепсЫа сой, Вк1 ДНКполимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к1еаго1йегторйПик и Вса ДНКполимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах.
23. Способ по любому из пп.1-5 и 11-22, где ДНК-полимераза, обладающая активностью замещения цепи, представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах, и РНКазу Н выбирают из группы, состоящей из РНКазы Н из Ексйепсййа сой, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик и РНКазы Н из бактерии рода Агсйаеод1оЬик.
24. Способ по п.23, где РНКаза Н представляет собой РНКазу Н типа Ι из Ексйепсййа сой или РНКазу Н типа ΙΙ из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Агсйаеод1оЬик.
- 135 005739
25. Способ по любому из пп.1-24, где используют ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью.
26. Способ по п.25, где ДНК-полимераза представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бοΐеηаx, и Вса ДНК-полимеразу используют в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы.
27. Способ по п.26, где вещество, дающее возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы, представляет собой ион марганца.
28. Способ по любому из пп.1-27, где реакцию амплификации проводят в присутствии вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы.
29. Способ по п.28, где вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы, представляет собой фосфономуравьиную кислоту.
30. Способ по любому из пп.1-29, где нуклеиновая кислота, служащая матрицей, представляет собой одноцепочечную ДНК или двухцепочечную ДНК.
31. Способ по п.З0, который осуществляют после превращения двухцепочечной ДНК, служащей матрицей, в одноцепочечные ДНК.
32. Способ по п.З0 или З1, где нуклеиновая кислота, служащая матрицей, представляет собой кДНК, полученную реакцией обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК.
33. Способ по п.З2, который осуществляют после синтеза кДНК реакцией обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК.
34. Способ по п.З2 или ЗЗ, где в качестве обратной транскриптазы используют ДНК-полимеразу, обладающую обратно-транскриптазной активностью.
35. Способ по любому из пп.З1-З4, где реакцию обратной транскрипции и синтез достроенной цепи, комплементарной матрице, проводят с использованием лишь одной ДНК-полимеразы, обладающей как обратно-транскриптазной активностью, так и активностью замещения цепи.
36. Способ по п.З5, где ДНК-полимераза представляет собой Вк1 ДНК-полимеразу, лишенную 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШик к!еагоШегторЕ11ик или Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бοΐеηаx.
37. Способ по любому из пп.1-З6, где реакцию амплификации нуклеиновой кислоты проводят в изотермических условиях.
38. Способ по любому из пп.1-З7, который осуществляют в присутствии аналога дезоксирибонуклеозидтрифосфата.
39. Способ по п.З8, где аналог дезоксирибонуклеозидтрифосфата представляет собой дезоксиуридинтрифосфат или его производное.
40. Композиция для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащая (a) по меньшей мере один праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;
(b) эндонуклеазу; и (c) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи.
41. Композиция для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащая (a) по меньшей мере два праймера, существенно комплементарные нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера;
(b) эндонуклеазу; и (c) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи.
42. Композиция для амплификации нуклеиновой кислоты, полученная путем смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и эндонуклеазы, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или в З'-концевой области праймера.
43. Композиция для амплификации нуклеиновой кислоты, полученная путем смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, по меньшей мере двух праймеров и эндонуклеазы, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотид-
- 1З6 005739 ной последовательности каждой цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера.
44. Композиция по любому из пп.40-43, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже:
общая формула: 5'-άΝπ-№-ά№-3' (а: целое число 11 или большее; Ь: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее; άΝ: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; Ν: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из άΝ в άΝη могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).
45. Композиция по п.44, где с равно 0.
46. Композиция по п.44 или 45, где нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (а-8)-рибонуклеотид.
47. Композиция по любому из пп.40-46, содержащая буферный компонент, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
48. Композиция по п.47, содержащая буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из Бицина и НΕΡΕ8.
49. Композиция по любому из пп.40-48, где в качестве ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, используют ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы Ι из ЕксНепсЫа тоЕ Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик кΐеа^οίЬе^тοрЬ^1ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1άοΐеηаx.
50. Композиция по любому из пп.40-49, где эндонуклеаза представляет собой эндорибонуклеазу.
51. Композиция по п.50, где эндорибонуклеаза представляет собой РНКазу Н.
52. Композиция по п.51, где РНКазу Н выбирают из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксНепсЫа тоЕ РНКазы Н из бактерии рода ΤΗе^тοιοда. РНКазы Н из бактерии рода ТЬегтик, РНКазы Н из бактерии рода ΡνΐΌ^^ιΐδ, РНКазы Н из бактерии рода Α^сΗаеοд1οЬик и РНКазы Н из бактерии рода ВасШик.
53. Композиция по любому из пп.40-52, где ДНК-полимераза, обладающая активностью замещения цепи, представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1άοΐеηаx, и эндонуклеаза представляет собой РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксНепсЫа отЕ РНКазы Н из бактерии рода Ρу^οсοссик и РНКазы Н из бактерии рода Α^сΗаеοд1οЬик.
54. Композиция по п.53, где РНКаза Н представляет собой РНКазу Н типа Ι из ЕксНепсЫа отИ или РНКазу Н типа ΙΙ из бактерии рода ΡνΐΌ^^ιικ или бактерии рода Α^сЬаеοд1οЬик.
55. Композиция по любому из пп.40-54, где используют ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью.
56. Композиция по п.55, где ДНК-полимераза представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1άοΐеηаx, причем композиция содержит вещество, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы.
57. Композиция по п.56, где вещество, дающее возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы, представляет собой ион марганца.
58. Композиция по любому из пп.40-57, содержащая вещество, ингибирующее обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы.
59. Композиция по п.58, где вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы, представляет собой фосфономуравьиную кислоту.
60. Композиция по любому из пп.40-59, содержащая аналог дезоксирибонуклеозидтрифосфата.
61. Композиция по п.60, где аналог дезоксирибонуклеозидтрифосфата представляет собой дезоксиуридинтрифосфат или его производное.
62. Композиция для амплификации нуклеиновой кислоты, используемая в способе амплификации нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, содержащая (a) РНКазу Н и (b) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи.
63. Композиция для амплификации нуклеиновой кислоты, используемая в способе амплификации нуклеиновой кислоты по любому из пп.6-9, содержащая (a) эндонуклеазу и (b) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи.
64. Композиция по п.63, где эндонуклеаза представляет собой эндорибонуклеазу.
65. Композиция по п.64, где эндорибонуклеаза представляет собой РНКазу Н.
66. Композиция по п.62 или 65, где РНКазу Н выбирают из группы, состоящей из РНКазы Н из Ек
- 137 005739 сНепсЫа со11, РНКазы Н из бактерии рода ТНегто1ода, РНКазы Н из бактерии рода ТИегтик, бактерии рода Ругососсик, РНКазы Н из бактерии рода АгсНаеод1оЬик и РНКазы Н из бактерии рода ВасШик.
67. Композиция по любому из пп.62-66, содержащая буферный компонент, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
68. Композиция по п.67, содержащая буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из Бицина и НЕРЕ8.
69. Композиция по любому из пп.62-68, где в качестве ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, используют ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы Ι из ЕксНепсЫа со11, Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к1еагоШегторЫ1ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах.
70. Композиция по п.62, где ДНК-полимераза, обладающая активностью замещения цепи, представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах, и РНКаза Н представляет собой РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксНепсЫа со11, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик и РНКазы Н из бактерии рода АгсНаеод1оЬик.
71. Композиция по п.63, где ДНК-полимераза, обладающая активностью замещения цепи, представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах, и эндонуклеаза представляет собой РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксНепсЫа со11, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик и РНКазы Н из бактерии рода АгсНаеод1оЬик.
72. Композиция по любому из пп.62-71, где используют ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью.
73. Композиция по п.72, где ДНК-полимераза представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах, причем композиция содержит вещество, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы.
74. Композиция по п.73, где вещество, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы, представляет собой ион марганца.
75. Композиция по любому из пп.62-74, содержащая вещество, ингибирующее обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы.
76. Композиция по п.75, где вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы, представляет собой фосфономуравьиную кислоту.
77. Композиция по любому из пп.62-76, содержащая аналог дезоксинуклеозидтрифосфата.
78. Композиция по п.77, где аналог дезоксинуклеозидтрифосфата представляет собой дезоксиуридинтрифосфат или его производное.
79. Набор для амплификации нуклеиновой кислоты, используемый в способе амплификации нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, содержащий (a) РНКазу Н и (b) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи.
80. Набор для амплификации нуклеиновой кислоты, используемый в способе амплификации нуклеиновой кислоты по любому из пп.6-9, содержащий (a) эндонуклеазу и (b) ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи.
81. Набор по п.80, где эндонуклеаза представляет собой эндорибонуклеазу.
82. Набор по п.81, где эндорибонуклеаза представляет собой РНКазу Н.
83. Набор по п.79 или 82, где РНКазу Н выбирают из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕксНепсЫа со11, РНКазы Н из бактерии рода ТИегтоЮда, РНКазы Н из бактерии рода ТНегтик, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсик, РНКазы Н из бактерии рода АгсНаеод1оЬик и РНКазы Н из бактерии рода ВасШик.
84. Набор по любому из пп.79-83, содержащий буфер, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
85. Набор по п.84, содержащий буфер для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащий буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из Бицина и НЕРЕ8.
86. Набор по любому из пп.79-85, содержащий раствор для отжига, содержащий вещество, усиливающее отжиг нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, с праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты.
87. Набор по п.86, где раствор для отжига содержит спермидин и/или пропилендиамин.
88. Набор по любому из пп.79-87, где в качестве ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, используют ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы Ι из ЕксНепсЫа со11, Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик к1еагоШегторЫ1ик и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах.
89. Набор по п.79, где ДНК-полимераза, обладающая активностью замещения цепи, представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1бо1епах, и
- 138 005739
РНКаза Н представляет собой РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕзсйепсЫа сой, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсиз и РНКазы Н из бактерии рода Агсйаеод1оЪиз.
90. Набор по п.80, где ДНК-полимераза, обладающая активностью замещения цепи, представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШиз са1бо!епах, и эндонуклеаза представляет собой РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из ЕзсйепсЫа сой, РНКазы Н из бактерии рода Ругососсиз и РНКазы Н из бактерии рода Агсйаеод1оЪиз.
91. Набор по любому из п.89 или 90, где РНКаза Н представляет собой РНКазу Н типа Ι из Езсйег1сй1а сой или РНКазу Н типа ΙΙ из бактерии рода Ругососсиз или бактерии рода Агсйаеод1оЪиз.
92. Набор по любому из пп.79-91, где используют ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью.
93. Набор по п.92, где ДНК-полимераза представляет собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'^З' экзонуклеазной активности, из ВасШиз са1бо!епах, причем набор содержит вещество, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы.
94. Набор по п.9З, где вещество, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы, представляет собой ион марганца.
95. Набор по любому из пп.79-94, содержащий вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы.
96. Набор по п.95, где вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы, представляет собой фосфономуравьиную кислоту.
97. Набор по любому из пп.79-96, содержащий аналог дезоксинуклеозидтрифосфата.
98. Набор по п.97, где аналог дезоксинуклеозидтрифосфата представляет собой дезоксиуридинтрифосфат или его производное.
99. Набор по п.79, характеризующийся тем, что он находится в упаковке и содержит инструкции по применению ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, и РНКазы Н.
100. Набор по п.80, характеризующийся тем, что он находится в упаковке и содержит инструкции по применению ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, и эндонуклеазы.
101. Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени в образце, включающий (a) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-З9; и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (а).
102. Способ по п.101, включающий детекцию амплифицированной нуклеиновой кислоты с использованием зонда для детекции.
103. Способ по п.102, где зонд для детекции представляет собой зонд, меченный веществом-меткой.
104. Способ по п.10З, где зонд представляет собой РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, пространственно разнесенных, что приводит к состоянию тушения.
105. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции энтерогеморрагической ЕзсйепсЫа сой, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕР ΙΌ № З1-З4, 47, 48, 51-5З, 64-72, 84, 85, 11З, 114, 1З0 и 1З1, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислотымишени по любому из пп.101-104.
106. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вироида, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕР ΙΌ Ν 59, 60, 119, 120, 122 и 12З, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104.
107. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции С1оз1пбшт ЪоШ1тцт, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕР ΙΌ № 116 или 117, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104.
108. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса папилломы, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную 8 Ер ΙΌ № 96 или 97, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104.
109. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции вируса гепатита С, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Ер ΙΌ № 101, 102, 1З8, 1З9, 200 и 201, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104.
110. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции 81арйу1ососсиз аигеиз, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную 8Ер ΙΌ № 1З6 или 1З7, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104.
111. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции МусоЬасЮпиш 1нЪегси1оз1з, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Ер ΙΌ № 155, 156, 159-162, 194 и 195, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104.
112. Химерный олигонуклеотидный праймер для детекции Сй1атуб1а, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную 8Ер ΙΌ Ν 157 или 158, применяемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104.
113. Набор для амплификации нуклеиновой кислоты, используемый в способе амплификации нук-
- 1З9 005739 леиновой кислоты по любому из пп.1-39, содержащий химерный олигонуклеотидный праймер по любому из пп.105-112.
114. Набор для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, используемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по любому из пп.101-104, содержащий химерный олигонуклеотидный праймер по любому из пп.105-112.
115. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий использование ДНК-полимеразы, обладающей активностью замещения цепи, для осуществления реакции переключения матрицы.
116. Способ по п.115, где ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, выбирают из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы Ι из ЕксйепсЫа отИ Вк1 ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик κΐеа^οШе^тοрЫ1иκ и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'^3' экзонуклеазной активности, из ВасШик са1άοΐеηаx.
117. Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, включающий (a) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-39 и (b) сбор нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а).
118. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (a) дупликацию ДНК или РНК, содержащей амплифицируемую последовательность, для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и (b) амплификацию нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), способом амплификации нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-39.
119. Способ получения одноцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий получение одноцепочечной нуклеиновой кислоты с использованием способа по любому из пп.1-39.
120. Способ по п.119, где используют по меньшей мере два праймера в различных концентрациях.
EA200300284A 2000-08-23 2001-08-21 Способ амплификации нуклеиновых кислот EA005739B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000251981 2000-08-23
JP2000284419 2000-09-19
JP2000288750 2000-09-22
JP2001104191 2001-04-03
PCT/JP2001/007139 WO2002016639A1 (fr) 2000-08-23 2001-08-21 Procede d'amplification d'acide nucleique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300284A1 EA200300284A1 (ru) 2003-08-28
EA005739B1 true EA005739B1 (ru) 2005-06-30

Family

ID=27481553

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300284A EA005739B1 (ru) 2000-08-23 2001-08-21 Способ амплификации нуклеиновых кислот
EA200401354A EA007414B1 (ru) 2000-08-23 2001-08-21 Химерный олигонуклеотидный праймер для способа амплификации нуклеиновой кислоты; продукт для амплификации нуклеиновой кислоты; зонд для способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени; материал с иммобилизованной амплифицированной нуклеиновой кислотой и способ его получения; способ определения нуклеотидной последовательности

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401354A EA007414B1 (ru) 2000-08-23 2001-08-21 Химерный олигонуклеотидный праймер для способа амплификации нуклеиновой кислоты; продукт для амплификации нуклеиновой кислоты; зонд для способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени; материал с иммобилизованной амплифицированной нуклеиновой кислотой и способ его получения; способ определения нуклеотидной последовательности

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1312682A4 (ru)
JP (1) JP4128074B2 (ru)
KR (1) KR100735131B1 (ru)
CN (2) CN1254548C (ru)
AU (2) AU7878301A (ru)
CA (1) CA2417798A1 (ru)
EA (2) EA005739B1 (ru)
TW (1) TWI249577B (ru)
WO (1) WO2002016639A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
RU2699522C2 (ru) * 2017-11-30 2019-09-05 Общество с ограниченной ответственностью "ИБМХ-ЭкоБиоФарм" (ООО "ИБМХ-ЭкоБиоФарм") Способ ферментативного получения модифицированных ДНК для создания реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US20040236094A1 (en) * 2000-09-19 2004-11-25 Hiroaki Sagawa Method of forming complex
DE60142709D1 (de) 2000-12-13 2010-09-09 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur generierung einer vielzahl von kopien von nukleinsäuresequenzen und methoden zur detektion derselben
WO2002062993A1 (fr) * 2001-02-06 2002-08-15 Takara Bio Inc. Acides nucleiques amplifies et produits immobilises de ces derniers
BR0205268A (pt) 2001-03-09 2004-11-30 Nugen Technologies Inc Processos e composições para a mplificação de sequências de rna
US8137911B2 (en) 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US7838270B2 (en) 2001-05-22 2010-11-23 The University Of Chicago Target-dependent transcription using deletion mutants of N4 RNA polymerase
EA006679B1 (ru) * 2001-06-12 2006-02-24 Такара Био Инк. Способ стабилизации реагента для амплификации или детекции нуклеиновой кислоты и способ хранения
US7056671B2 (en) 2001-08-20 2006-06-06 Takara Bio Inc. Isothermal chimeric primer nucleic acid amplification methods using blocking oglionucleotide
AU2003211421A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-16 Takara Bio Inc. Method of detecting base substitution
EP1553172B1 (en) 2002-08-30 2009-06-03 Takara Bio Inc. Thermostable ribonuclease h
EP1564301A4 (en) * 2002-10-29 2007-07-11 Riken METHOD FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID
AU2003294447A1 (en) 2002-11-21 2004-06-18 Epicentre Technologies Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US7402386B2 (en) 2003-04-14 2008-07-22 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using random priming by a composite primer
KR100841128B1 (ko) * 2003-05-16 2008-06-24 하우스 쇼쿠힝 가부시키가이샤 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속의 정량적 ｐｃｒ검출법
ATE496141T1 (de) * 2003-12-06 2011-02-15 Abbott Lab Verfahren und system zum analysieren von reaktionen unter verwendung eines informationssystems
JP4249186B2 (ja) * 2003-12-10 2009-04-02 タカラバイオ株式会社 核酸の増幅方法
US8206902B2 (en) 2003-12-25 2012-06-26 Riken Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same
DE102005019112A1 (de) 2005-04-25 2006-10-26 Siemens Ag Kombinationsantrieb mit Hybridreluktanzmotor
EP1883707B1 (en) 2005-05-26 2014-04-09 Human Genetic Signatures PTY Ltd Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base
US7939258B2 (en) 2005-09-07 2011-05-10 Nugen Technologies, Inc. Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers
JP4918409B2 (ja) 2006-07-26 2012-04-18 西川ゴム工業株式会社 核酸配列の増幅方法
CA2622649C (en) 2007-03-09 2018-04-24 Riken Nucleic acid amplification method using primer exhibiting exciton effect
WO2009042291A2 (en) 2007-08-03 2009-04-02 Igor Kutyavin Accelerated cascade amplification (aca) of nucleic acids comprising strand and sequence specific dna nicking
US11041215B2 (en) * 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
US7846666B2 (en) 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
JP5652843B2 (ja) * 2008-10-17 2015-01-14 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 Ｄｎａ増幅法
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
DK2376517T3 (da) 2008-10-24 2013-02-11 Epict Technologies Corp Transposon-ende-sammensætninger og fremgangsmåder til at modificere nukleinsyrer
FR2940805B1 (fr) * 2009-01-05 2015-10-16 Biomerieux Sa Procede d'amplification et/ou de detection d'acides nucleiques, kits et utilisations de ce procede
US8206929B2 (en) * 2009-01-07 2012-06-26 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants
JP5616584B2 (ja) * 2009-01-09 2014-10-29 富士フイルム株式会社 核酸配列の複製方法
US20120100545A1 (en) * 2009-07-03 2012-04-26 Tan Tock Seng Hospital Method and/or primers for the detection of mycobacterium tuberculosis
WO2011037802A2 (en) 2009-09-28 2011-03-31 Igor Kutyavin Methods and compositions for detection of nucleic acids based on stabilized oligonucleotide probe complexes
US8618253B2 (en) * 2010-05-25 2013-12-31 Samsung Techwin Co., Ltd. Modified RNAse H and detection of nucleic acid amplification
CN101921846B (zh) * 2010-07-20 2012-11-14 重庆大学 一种多重基因表达的分析方法
WO2012013734A1 (en) * 2010-07-29 2012-02-02 F. Hoffmann - La Roche Ag Control nucleic acids for multiple parameters
JP5711234B2 (ja) 2010-07-29 2015-04-30 タカラバイオ株式会社 標的塩基検出用ｒｎａ含有プローブの製造方法
EP2418286A1 (en) * 2010-08-10 2012-02-15 QIAGEN GmbH Improved method for isothermal amplification of nucleic acids
JP6126381B2 (ja) 2010-12-10 2017-05-10 国立大学法人東京工業大学 標的核酸の検出方法及びキット
CN102181547A (zh) * 2011-04-13 2011-09-14 北京三元食品股份有限公司 金黄色葡萄球菌肠毒素a、b基因pcr同步检测试剂盒
GB201112140D0 (en) * 2011-07-14 2011-08-31 Dna Electronics Nucleic acid amplification
JP5299981B1 (ja) 2011-09-08 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法
CA2936157C (en) 2014-01-15 2021-08-24 Tokyo Institute Of Technology Covered sequence conversion dna and detection methods
EA037029B1 (ru) 2014-03-31 2021-01-28 КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ Флуоресцентно меченная одноцепочечная нуклеиновая кислота и ее применение
AU2015277059B2 (en) 2014-06-18 2021-06-17 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, and devices for rapid analysis of biological markers
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
WO2016011280A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Tangen Biosciences, Inc. Isothermal methods for amplifying nucleic acid samples
EP3183356A4 (en) * 2014-08-18 2018-04-11 Molecular Assemblies Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids
EP3207159B1 (en) * 2014-10-14 2019-11-20 Abbott Laboratories Sequence conversion and signal amplifier dna having poly dna spacer sequences and detection methods using same
ES2706531T3 (es) 2014-11-11 2019-03-29 Illumina Inc Amplificación de polinucleótidos empleando sistemas CRISPR-Cas
US10604790B2 (en) 2014-12-24 2020-03-31 Abbott Laboratories Sequence conversion and signal amplifier DNA cascade reactions and detection methods using same
CN104531696A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 深圳华大基因研究院 引物组合物及其用途
EP3337909B1 (en) * 2015-09-24 2020-03-18 Sigma Aldrich Co. LLC Methods and reagents for molecular proximity detection using rna-guided nucleic acid binding proteins
US11046939B2 (en) 2015-11-27 2021-06-29 Kyushu University, National University Corporation DNA polymerase variant
WO2017106790A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, kits and devices for rapid analysis of biological markers
KR101804655B1 (ko) 2016-01-21 2018-01-10 연세대학교 산학협력단 생물학적 서열의 유사매듭 구조 판단 장치 및 방법
EP3455372B1 (en) 2016-05-11 2019-10-30 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems
GB201612011D0 (en) * 2016-07-11 2016-08-24 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel processes for the production of oligonucleotides
CN113151423A (zh) * 2016-08-05 2021-07-23 生物辐射实验室股份有限公司 第二链引导
WO2018129368A2 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
US10914729B2 (en) 2017-05-22 2021-02-09 The Trustees Of Princeton University Methods for detecting protein binding sequences and tagging nucleic acids
CN111989408A (zh) 2018-04-20 2020-11-24 株式会社艾匹基乃龙 检测靶核酸区域内的与参考序列的差异的方法
CN108588050B (zh) * 2018-05-14 2021-06-25 北京艾克伦医疗科技有限公司 Dna聚合酶以及核酸检测方法和试剂盒
CN108642144B (zh) * 2018-05-18 2020-06-09 贠红岩 一种恒温链置换扩增技术及试剂盒
CN108841919B (zh) * 2018-06-12 2021-07-06 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 一种嵌合式sda法制备探针
CN109022550A (zh) * 2018-07-09 2018-12-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 检测a型肉毒梭菌的实时荧光定量pcr核酸序列以及试剂盒
CN108913736B (zh) * 2018-07-10 2021-08-24 中国海洋大学 单链寡核苷酸的制备方法
CN109402268A (zh) * 2018-10-29 2019-03-01 湖南健基生物技术有限公司 一种检测人cyp3a4基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用
SG11202107921SA (en) * 2019-02-12 2021-08-30 Dna Script Efficient product cleavage in template-free enzymatic synthesis of polynucleotides.
CN113528624A (zh) * 2020-04-17 2021-10-22 青岛大学 扩增和检测核酸的方法及试剂盒
AU2022234741A1 (en) 2021-03-09 2023-09-14 Illumina Cambridge Limited Genomic library preparation and targeted epigenetic assays using cas-grna ribonucleoproteins
AU2022232600A1 (en) 2021-03-09 2023-09-14 Illumina, Inc. Analyzing expression of protein-coding variants in cells
AU2022328378A1 (en) 2021-08-11 2024-01-18 Illumina, Inc. Detection of analytes using targeted epigenetic assays, proximity-induced tagmentation, strand invasion, restriction, or ligation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
JPH11513881A (ja) * 1995-06-07 1999-11-30 ジェン−プロープ・インコーポレーテッド テンプレートおよびプライマーに基づく酵素的に切断可能なオリゴヌクレオチドの合成
FR2737223B1 (fr) * 1995-07-24 1997-09-12 Bio Merieux Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres
WO2000056877A1 (fr) * 1999-03-19 2000-09-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede d'amplification d'une sequence d'acide nucleique
WO2002062993A1 (fr) * 2001-02-06 2002-08-15 Takara Bio Inc. Acides nucleiques amplifies et produits immobilises de ces derniers

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
US9803232B2 (en) 2008-09-30 2017-10-31 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
US10689685B2 (en) 2008-09-30 2020-06-23 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
RU2699522C2 (ru) * 2017-11-30 2019-09-05 Общество с ограниченной ответственностью "ИБМХ-ЭкоБиоФарм" (ООО "ИБМХ-ЭкоБиоФарм") Способ ферментативного получения модифицированных ДНК для создания реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений

Also Published As

Publication number Publication date
TWI249577B (en) 2006-02-21
KR20030036707A (ko) 2003-05-09
EP1312682A4 (en) 2005-03-09
CN1854309A (zh) 2006-11-01
EA200401354A1 (ru) 2005-02-24
KR100735131B1 (ko) 2007-07-03
CN1254548C (zh) 2006-05-03
AU2001278783B2 (en) 2006-04-27
CA2417798A1 (en) 2003-01-30
EP1312682A1 (en) 2003-05-21
EA007414B1 (ru) 2006-10-27
JP4128074B2 (ja) 2008-07-30
WO2002016639A1 (fr) 2002-02-28
EA200300284A1 (ru) 2003-08-28
AU7878301A (en) 2002-03-04
CN1471588A (zh) 2004-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA005739B1 (ru) Способ амплификации нуклеиновых кислот
CN105722850B (zh) 核苷酸类似物
EP1452593B1 (en) Dna synthesis promoters, dna polymerase-associated factors and utilization thereof
EA006066B1 (ru) Способы амплификации нуклеиновых кислот
EA005577B1 (ru) Продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, полученный способом с участием химерного олигонуклеотидного праймера, днк-полимеразы и эндонуклеазы
JPH0630796A (ja) マイコバクテリアプローブ
JPH02501532A (ja) 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅
JPH08505535A (ja) 一本鎖ｄｎａ分子の生成方法
JP2008501679A (ja) ２’−ニトロベンジル改変型リボヌクレオチド
EA006679B1 (ru) Способ стабилизации реагента для амплификации или детекции нуклеиновой кислоты и способ хранения
JP6029636B2 (ja) Ｒｎａの検出方法
JP2016136968A (ja) デングウイルスアッセイ
KR20030071854A (ko) 증폭 핵산 및 그의 고정화물
CN104350159A (zh) 制备在利用核酸聚合酶来检测核酸时使用的高精度核酸的方法
US6225062B1 (en) Method and kit for direct isothermal sequencing of nucleic acids
JP4196236B2 (ja) 核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法
US5972607A (en) Methods for nucleic acid amplification with thermostable ribonuclease H
Boege et al. In vitro transcription of viroid RNA into full-length copies by RNA-dependent RNA polymerase from healthy tomato leaf tissue
KR20030045124A (ko) 핵산 염기서열의 결정방법
EP2468880B1 (en) Cold shock protein compositions and methods and kits for the use thereof
EP4112743A1 (en) Method for detecting single-stranded rna virus
JPWO2017217444A1 (ja) 二本鎖ｄｎａ末端の加工方法
JP2007000040A (ja) Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法
JP2632317B2 (ja) ホップ矮化ウイロイド類の分別検出法
JP7426032B2 (ja) ヌクレオチド配列の増幅方法及び配列決定方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU