WO2002016639A1 - Procede d'amplification d'acide nucleique - Google Patents

Procede d'amplification d'acide nucleique Download PDF

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WO2002016639A1
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primer
dna polymerase
dna
amplifying
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PCT/JP2001/007139
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Hiroaki Sagawa
Takashi Uemori
Hiroyuki Mukai
Junko Yamamoto
Jun Tomono
Eiji Kobayashi
Tatsuji Enoki
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Bio Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid useful in the clinical field and a method for synthesizing a DNA useful in the field of genetic engineering, including a method for amplifying a type III nucleic acid and a method for amplifying a target nucleic acid amplified by the method. It relates to the detection method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT_PCR method reverse transcription PCR method
  • These DNA synthesis methods include, for example, dissociation (denaturation) of double-stranded ⁇ type DNA into a single strand, annealing of a primer to single-stranded ⁇ type DNA, and amplification of a target DNA region.
  • dissociation denaturation
  • a primer to single-stranded ⁇ type DNA
  • amplification of a target DNA region By a reaction consisting of three steps of complementary strand synthesis (extension) from primers, or by using "Châtonore PCR” ("The Forefront of PCR", “Protein Nucleic Acid Enzyme", Vol. 41, No. 5, p. 425) 428 (1996)), which is a two-step reaction in which the steps of annealing and extending the primer are performed at the same temperature among the three-step reactions described above.
  • LCR ligase chain reaction
  • TAS transcript ion-basea amplification system
  • the above method requires the use of an expensive thermal cycler that can perform strict temperature adjustment over a wide temperature range with time.
  • the time required to reach the set temperature is required, and the loss time increases in proportion to the number of cycles.
  • a nucleic acid amplification method that can be carried out in an isothermal state has been developed to solve the above problems.
  • SDA strand displacement amplification
  • ⁇ ⁇ . ⁇ (3SR; self-sustained sequence replication) method Japanese patent number
  • NA SBA nucleic acid sequence based amplification
  • primer elongation In these isothermal nucleic acid amplification or oligonucleotide synthesis reactions, primer elongation, annealing of primers to single-stranded elongation products (or the original target sequence), and subsequent primer elongation are constant. It occurs simultaneously in the reaction mixture, which is kept warm at the temperature.
  • the SDA method uses a target nucleic acid sequence in a sample by displacing a double strand through a DNA polymerase and a restriction endonuclease. And its phase capture), which requires four primers to be used for amplification, two of which are restriction primers. It must be constructed to include a recognition site for nuclease. Further, in this method, a modified deoxyribonucleotide triphosphate, for example, an oxygen atom of a phosphate group at the ⁇ -position was substituted with a sulfur atom (S) as a substrate for DNA synthesis.
  • S sulfur atom
  • the improved SDA method described in U.S. Pat. No. 5,824,517 discloses a DNA amplification method using a chimeric primer composed of RNA and DNA, and having at least a structure in which DNA is located at the three ends. Is the way. Also, the improved SDA method described in WO99 / 09211 pamphlet requires 3, a restriction enzyme that generates a protruding end. Also, the modified SDA method described in WO 95/25180 pamphlet requires at least two primer pairs. Furthermore, the improved SDA method described in WO 99/49081 pamphlet requires at least two sets of primers and at least one modified deoxyribonucleotide triphosphate. On the other hand, U.S. Pat. No.
  • 5,916,777 discloses that in order to synthesize oligonucleotides, a DNA is synthesized using a primer having a ribonucleotide at the 3rd terminus, and the primer is extended with an end nuclease after completion of the reaction. A nick is inserted between the primer and the extended strand in the strand to separate them, the template is digested, and the primer is recovered and reused. In this method, when reusing the primer, it is necessary to isolate the primer from the reaction system and then to reanneal Form II.
  • the LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) method described in WO 00/28082 pamphlet requires four types of primers for amplification, and the amplified product repeats the region targeted for amplification. This is a fixed-size DNA.
  • a main object of the present invention is to provide a method for amplifying a target nucleic acid in which a target nucleic acid in a sample is highly sensitive and specifically amplified by a DNA synthesis reaction using a chimeric oligonucleotide primer, and a method for detecting an amplified fragment obtained by the method. It is an object of the present invention to provide a method, a method for producing a target nucleic acid using the amplification method, and a chimeric oligonucleotide primer used in these methods.
  • the present inventors have found that the ribonucleotide is located at the 3 'or 3' terminus, a chimeric oligonucleotide primer, an endoliponuclease, or a DNA of the target region in the presence of DNA polymerase.
  • a method for amplifying NA constructed an excellent gene amplification reaction system, and completed the present invention.
  • the method is a nucleic acid amplification method using a chimeric oligonucleotide primer, and is referred to as an AN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method in the present specification.
  • the first invention of the present invention relates to a method for amplifying a target nucleic acid
  • the primer is substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid to be type III, and contains at least one selected from deoxyliponucleotides and nucleotides and ribonucleotides.
  • the nucleotide is a chimeric oligonucleotide primer located at the 3 'or 3, terminal end of the primer;
  • a reaction mixture containing a chimeric oligonucleotide primer having a sequence substantially homologous to the base sequence of the nucleic acid to be type III can be used.
  • a second invention of the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid
  • the double-stranded nucleic acid obtained in the above step is converted into type I, and a nucleic acid sequence complementary to type I is extended by a DNA polymerase having a strand displacement activity Performing strand displacement to synthesize a displaced strand and a double-stranded nucleic acid;
  • step (c) a step in which the double-stranded nucleic acid obtained in step (b) is reused in step (b) as type I;
  • a third invention of the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid using at least two kinds of primers
  • the primer is a chimeric oligonucleotide primer containing at least one selected from deoxyliponucleotides or nucleotide analogs and a ribonucleotide, wherein the liponucleotide is at the 3, terminal or 3, terminal side of the primer. Placed in;
  • step (c) a step in which the double-stranded nucleic acid obtained in step (b) is reused in step (b) as type I;
  • step (d) Using the displaced strand obtained in step (b) as type III, treatment with at least one primer different from the primer used in step (a) and DNA polymerase to extend the primer complementary to the displaced strand A step of synthesizing a strand; wherein the primer different from the primer used in the step (a) is substantially complementary to the base sequence of the substituted strand and is selected from at least deoxyribonucleotides and nucleotide analogs.
  • a chimeric oligonucleotide primer comprising: and a ribonucleotide, wherein the liponucleotide is located at the 3, terminal or 3 'end of the primer;
  • the double-stranded nucleic acid obtained in the above step is converted into a type II, and a nucleic acid sequence complementary to the type II is extended by a DNA polymerase having a strand displacement activity to perform strand displacement. Synthesizing a substituted strand and a double-stranded nucleic acid;
  • step (f) the step of reusing the disulfide nucleic acid obtained in step (e) in step (e) as type I;
  • a DNA polymerase having a strand displacement activity can be used as the DNA polymerase.
  • a fourth invention of the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid
  • primers substantially complementary to the base sequences of the respective strands of the double-stranded nucleic acid to be type III and primers complementary to the type II after treatment with a DNA polymerase having strand displacement activity A step of synthesizing an extended strand and obtaining a double-stranded nucleic acid comprising annealing the synthesized primer extended strand; wherein the primer is selected from at least a dexiliponucleotide and a nucleotide analog, and a liponutatide.
  • a chimeric oligonucleotide primer comprising: wherein the ribonucleotide is located at the 3 ′ end or the 3, terminal side of the primer;
  • step (b) a step of cleaving a double-stranded nucleic acid comprising a primer-extended strand obtained in the step (a) with a liponucleotide-containing site with an endonuclease;
  • step (c) Complementary to type III from the 3 and the end of each primer part of the double-stranded nucleic acid in which the extended primer strand obtained in step (b) has been cleaved by DNA polymerase having strand displacement activity Strand displacement by extending a unique nucleic acid sequence, ⁇ and primer extension Obtaining a double-stranded nucleic acid comprising a strand;
  • a fifth invention of the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid
  • step (b) a step of cleaving a ribonucleotide-containing site of the double-stranded nucleic acid comprising a primer-extended strand obtained in the step (a) with an endonuclease;
  • step (c) The double-stranded nucleic acid obtained by the step (b), from which the extended strand has been cleaved, is phase-trapped by the DNA polymerase having strand displacement activity from the 3 'and 3' ends of each primer. Elongating a basic nucleic acid sequence to perform strand displacement to obtain a double-stranded nucleic acid in which the primer-extended strand has been annealed;
  • a sixth invention of the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid
  • a chimeric oligonucleotide primer comprising: and a ribonucleotide, wherein the ribonucleotide is located at the 3, terminus or 3, terminus of the braid,
  • step (b) a step of cleaving the double-stranded nucleic acid comprising the extended primer strand obtained in the step (a) with a liponucleotide-containing site with an endonuclease;
  • step (c) From the 3 'end of each primer part of the double-stranded nucleic acid in which the extended primer strand obtained in step (b) has been cleaved, DNA polymerase having strand displacement activity is Therefore, a nucleic acid sequence complementary to type I is extended to perform strand displacement, and a double-stranded nucleic acid in which primer extended strands are annealed to each other, and a double-stranded nucleic acid in which type II is annealed to each other.
  • strand displacement is performed by elongating a nucleic acid sequence complementary to type I with DNA polymerase having strand displacement activity 'I "!
  • a seventh invention of the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid
  • primers substantially complementary to the base sequence of each strand of a double-stranded nucleic acid to be type III and complementary to the type II by treatment with a DNA polymerase having strand displacement activity Synthesizing a novel extended primer chain to obtain a double-stranded nucleic acid comprising annealing the synthesized extended primer chain; wherein the primer is at least selected from deoxyribonucleotides and nucleotide analogs and ribonucleotides.
  • a chimeric oligonucleotide primer comprising: wherein the ribonucleotide is located at the 3, terminus or 3, terminus of the primer;
  • step (b) a step of cleaving the double-stranded nucleic acid consisting of the extended Braimer strand obtained in the step (a) with a liponucleotide-containing site with an endonuclease;
  • step (c) Complementary to type III from the 3 and the end of each primer part of the double-stranded nucleic acid in which the extended primer strand obtained in step (b) has been cleaved by DNA polymerase having strand displacement activity
  • Two types of primers in step (a) were annealed to a double-stranded nucleic acid in which the primer extended strands were annealed, and a double-stranded nucleic acid in which the type I primers were annealed. Obtaining a strand nucleic acid;
  • step (d) A DNA polymerase having strand displacement activity from the 3 and the end of each primer portion of the double-stranded nucleic acid annealed by the two primers obtained in step (c) Elongating a nucleic acid sequence complementary to type I with a polymerase to carry out strand displacement to obtain a double-stranded nucleic acid consisting of type III and a primer-extended chain;
  • step (f) Extend the nucleic acid sequence complementary to type III from the 3'-end of the primer portion of the double-stranded nucleic acid in which the extended primer strand obtained in step (e) has been cleaved by DNA polymerase with strand displacement activity Synthesizing a substituted chain by;
  • an endoliponuclease for example, an endoliponuclease such as RNaseH can be used.
  • RNase H derived from bacteria such as Escherichia coli, Thermotoga, Sirmas, Pyrococcus, Anoreca eoglobus, and Bacillus is used. Can be used.
  • the region suitable for specific amplification in the base sequence of the target nucleic acid is a region having a chain length of 200 bp or less.
  • a chimeric oligonucleotide primer represented by the following general formula can be used.
  • dN deoxyribonucleotide and / or nucleotide analog
  • N unmodified ribonucleotide and Z or modified Ribonucleotides
  • dN in part of the dNa site may be substituted with N, and the nucleotide at the 3 'end is modified so that DNA polymerase does not extend from the 3' end. May be
  • Examples of the chimeric oligonucleotide primer include a primer in which c is 0, a primer in which deoxyribouracil nucleotides are used, and a modified ribonucleotide is —S) liponucleotide. Furthermore, when using these chimeric oligonucleotide primers, a DNA extension suitable for the primer is used. The DNA extension reaction is performed at a long reaction temperature.
  • the amplification method comprises the steps of: (a) increasing the annealing between the nucleic acid and the chimeric oligonucleotide primer substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid; Annealing in an annealing solution containing the substance to be treated.
  • annealing solution examples include those containing perimidine and Z or propylenediamine.
  • an annealing solution containing a type III nucleic acid and a chimeric oligonucleotide primer substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid is kept at 90 ° C or higher, and then the amplification reaction is performed. It can be carried out by cooling to a temperature below the required temperature.
  • the amplification reaction of the first to seventh inventions can be carried out in a buffer containing a buffer component selected from bicine and mouse.
  • the DNA polymerase having a strand displacement activity includes, for example, a Klenow fragment of DNA polymerase I derived from Escherichia coli, or Bacillus stearothermophyllus.
  • DN selected from the group consisting of 5, ⁇ 3, exonuclease deficient B st DNA polymerase and 5, ⁇ 3 ′ exonuclease deficient B ca DNA polymerase derived from bacilluscar do tenax A polymerase can be used.
  • the first to seventh inventions as a DNA polymerase having a strand displacement activity, 5, ⁇ 3, exonuclease-deficient BcaDNA polymerase derived from Batinores cardotenax, and an endonuclease derived from Otsuki bacterium as an endonuclease
  • an embodiment using RNaseH derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus or a bacterium belonging to the genus Alcaeoglobus examples include type I RNaseH derived from Escherichia coli, and type I RNaseH derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus or genus Alcaeoglopus.
  • a DNA polymerase having an endonuclease activity can be used.
  • the DNA polymerase Bca DNA polymerase deficient in 5, ⁇ 3 ′ exonuclease derived from Bacillus rhodotenax can be used.
  • the amplification reaction can be performed in the presence.
  • a manganese ion is exemplified as a substance that expresses the endonuclease activity of Bea DNA polymerase.
  • the method for amplifying a target nucleic acid according to the first to seventh inventions can be carried out in the presence of a substance that inhibits the reverse transcription activity of DNA polymerase.
  • a substance that inhibits the reverse transcription activity of DNA polymerase include phosphonoformic acid.
  • the first to seventh inventions of the present invention can be carried out by using single-stranded or double-stranded DNA as type III, and when the type III nucleic acid is double-stranded DNA, An amplification reaction can be performed after the step of preparing the present DNA.
  • the above-mentioned type III nucleic acid may be cDNA obtained by reverse transcription reaction using RNA as type II, and after the step of synthesizing cDNA by RNA-type reverse transcription reaction, An embodiment in which an amplification reaction is performed is exemplified.
  • a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity can be used for the reverse transcription reaction.
  • the reverse transcription reaction and the synthesis of an extended strand complementary to the type II are compared with the reverse transcriptase activity and the strand displacement activity.
  • DNA polymerase having Such DNA polymerases include 5, ⁇ 3, exonuclease-deficient B st DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus or 5, ⁇ 3 ′ exonuclease deficient B ca D derived from Bacillus cardotenax. NA polymerase is exemplified.
  • the amplification reaction can be performed under isothermal conditions, and can be performed in the presence of ananucleotide of deoxynucleotide triphosphate such as deoxyperidine triphosphate or a derivative thereof. be able to.
  • An eighth invention of the present invention is a composition for nucleic acid amplification
  • primer at least one kind of primer that substantially complements the nucleic acid of type I with the base sequence of the nucleic acid; wherein the primer is at least one selected from deoxyribonucleotides and nucleotide analogs;
  • a primer comprising a nucleotide, wherein the ribonucleotide is located at the 3, terminal or 3, terminal of the primer.
  • composition for nucleic acid amplification comprising:
  • a ninth invention of the present invention is a composition for nucleic acid amplification
  • primers are selected from at least deoxyribonucleotides and nucleotide analogs And a ribonucleotide, wherein the ribonucleotide is located at the 3, terminal or 3, terminal end of the primer;
  • the present invention relates to a composition for amplifying nucleic acid, comprising:
  • the nucleic acid as a ⁇ , de O carboxymethyl lipoic nucleotide triphosphate, DNA polymerase having strand displacement activity 1 production, obtained by mixing at least one primer, and E endonuclease A nucleic acid amplification composition, wherein the primer is substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid to be type III, and at least one selected from deoxyliponucleotides and nucleotide analogs, and ribonucleotides.
  • the ribonucleotide relates to a chimeric oligonucleotide primer which is a chimeric oligonucleotide primer located at the 3, terminal or 3, terminal end of the primer.
  • the eleventh invention of the present invention relates to a nucleic acid amplification obtained by mixing a nucleic acid to be type III, a deoxyliponucleotide triphosphate, a DNA polymerase having a strand displacement activity, at least two kinds of primers, and an endonuclease.
  • a primer wherein the primer is substantially complementary to the base sequence of each strand of the double-stranded nucleic acid to be ⁇ , and is selected from at least deoxyliponucleotides and nucleotide analogs.
  • a ribonucleotide wherein the ribonucleotide is a chimeric oligonucleotide primer which is located at the 3 'end or 3, terminal side of the primer.
  • Examples of the primer contained in the composition of the eighth to eleventh aspects of the present invention include a chimeric oligonucleotide primer represented by the following general formula. General formula: 5, -dNa-Nb-dNc-3 '
  • dN De O carboxymethyl ribonucleotides and / or nucleotide analogs
  • N unmodified Ribonu Kureochido ⁇ Pi Z or modified lipoic nucleotides
  • d N a part of d N sites may be substituted with N, 3, (The terminal nucleotide may have a modification such that extension from the terminal by DNA polymerase does not occur.)
  • Examples of the chimeric oligonucleotide primer include a primer in which c is 0, and a primer in which the nucleotide analog is a deoxyriboinosin nucleotide or a deoxyperinucleotide and the modified liponucleotide is (a-S) ribonucleotide. .
  • compositions according to the eighth to eleventh aspects can contain a buffer component suitable for a nucleic acid amplification reaction.
  • the composition can contain a buffer component selected from bicine and mouse. it can.
  • the above-mentioned eighth to eleventh inventions include, as D ⁇ polymerase having a strand displacement activity, a Tarenow fragment of DNA polymerase I derived from Escherichia coli, and a 5, ⁇ 3, exonuclease-deficient Bs derived from Bacillus stearosa monomorphus
  • a composition comprising a tDNA polymerase and a DNA polymerase selected from the group consisting of 5, ⁇ 3 ′ exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus cardotenax.
  • an endoliponuclease for example, an endoribonuclease such as RNaseH can be used.
  • RNa s eH examples include Escherichia coli (Escherichiaco 1i), genus Thermotoga, genus Thermas, genus Pyrococcus (Pyrococcus), and anoreca globus (Ar Chaeoglobus) and those derived from species such as Bacillus are exemplified.
  • composition of the invention according to the invention is a DNA polymerase having a strand displacement activity of 5, ⁇ 3, exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus caldetenax, and Escherichia coli as an endonuclease.
  • exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus caldetenax
  • Escherichia coli as an endonuclease.
  • RNaseH derived from bacteria of the genus Pyrococcus or bacterium of the genus Alcaeoglobus.
  • examples of the RNase H include Escherichia coli type I RNase H, Pyrococcus genus bacteria or Alkaeoglobus bacterium type II RN as eH is exemplified.
  • the composition of the eighth to eleventh inventions may contain a DNA polymerase having an endonuclease activity.
  • a DNA polymerase having an endonuclease activity As the DNA polymerase, a 5'- ⁇ 3 'exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus caldotenax can be used, and a substance capable of expressing the endonuclease activity of the DNA polymerase can be used together.
  • Manganese ion is exemplified as a substance that expresses the endonuclease activity of Bca DNA polymerase.
  • compositions of the eighth to eleventh inventions may contain a substance that inhibits the reverse transcription activity of DNA polymerase.
  • a substance that inhibits the reverse transcription activity of DNA polymerase is phosphonoformic acid.
  • the composition can include an analog of a deoxynucleotide triphosphate, such as deoxyperidine triphosphate or a derivative thereof.
  • a twelfth invention of the present invention is a composition for nucleic acid amplification used in the method for amplifying nucleic acids of the first to third inventions,
  • the present invention relates to a composition for amplifying nucleic acid, comprising:
  • a thirteenth invention of the present invention is a nucleic acid amplification composition used in the nucleic acid amplification method of the fourth to seventh inventions,
  • the present invention relates to a composition for amplifying nucleic acid, comprising:
  • the endonuclease used in the composition of the thirteenth invention can be an endoribonuclease, for example, RNaseH.
  • compositions of the twelfth and thirteenth inventions containing RNaseH include, as RNaseH, RNaseH derived from Escherichia coli, RNaseH derived from Thermotoga bacteria, RNaseH derived from Thermos bacteria, and Pyrococcus derived bacteria.
  • RNaseH selected from RNaseH, RNaseH derived from the genus Argyeoglobus, and RNaseH derived from the bacterium belonging to the genus Bacillus can be used.
  • the compositions of the twelfth and thirteenth inventions can further contain a buffer component suitable for a nucleic acid amplification reaction, for example, those containing a buffer component selected from bicine and mouse.
  • an endoliponuclease for example, an endoliponuclease such as RNaseH can be used.
  • RNaseH include RNaseH derived from bacteria of the genus Otsuki, Thermotoga, and Sirmas, and those derived from bacteria such as Pyrococcus, Alcaeoglobus, and Bacillus.
  • a 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus caldotenax is used as a DNA polymerase having a strand displacement activity
  • Escherichia coli is used as an endonuclease.
  • Those containing RNaseH derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus or a bacterium belonging to the genus Alcaeoglobus can be mentioned.
  • the RNa s E. coli type I as eH RNa s e H, Pyrococcus bacterium-derived or alk E O Glo bus bacteria from type II R Na s eH are exemplified.
  • compositions of the twelfth and thirteenth inventions may contain a DNA polymerase having an endonuclease activity.
  • a DNA polymerase having an endonuclease activity.
  • a DNA polymerase a 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus caltotenax can be used, and a substance capable of expressing the endonuclease activity of the DNA polymerase can be used together.
  • a manganese ion is exemplified as a substance that expresses the endonuclease activity of BcaDNA polymerase.
  • compositions of the twelfth and thirteenth inventions can contain a substance that inhibits the reverse transcription activity of DNA polymerase.
  • the substance that inhibits the reverse transcription activity of DNA polymerase include phosphonoformic acid.
  • the fibrous material is deoxyperidine 3
  • An analog of a deoxynucleotide triphosphate such as phosphate or a derivative thereof can be included.
  • a fourteenth invention of the present invention is a nucleic acid amplification kit used for the nucleic acid amplification method of the first to third inventions of the present invention
  • the present invention relates to a kit for nucleic acid amplification, comprising:
  • a fifteenth invention of the present invention is a nucleic acid amplification kit used for the nucleic acid amplification method of the fourth to seventh inventions of the present invention.
  • the present invention relates to a kit for nucleic acid amplification, comprising:
  • an endoribonuclease can be used as the endonuclease, and examples include RNaseH.
  • kits of the fourteenth and fifteenth inventions containing RNaseH include RNaseH derived from Escherichia coli, RNaseH derived from Thermotoga bacteria, RNaseH derived from Sirmas bacteria, RNaseH derived from Pyrococcus bacteria, Examples include a kit containing RNase H selected from RNaseH derived from the genus Alcayoglobus and RNaseH derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus.
  • kits of the fourteenth and fifteenth inventions may further contain a buffer suitable for a nucleic acid amplification reaction, and for example, may contain a buffer component selected from bicine and mouse. Further, it may be a substance containing an annealing solution containing a substance that enhances the annealing of a nucleic acid to be type III and a primer substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid, and the annealing solution includes spermidine and And / or those containing propylenediamine.
  • Examples of the DNA polymerase having strand displacement activity contained in the kits of the fourteenth and fifteenth aspects of the present invention include: Exonuclease-deficient B st tDNA polymerase and Bacillus / redotenax derived 5, ⁇ 3,
  • An example is a DNA polymerase selected from the group consisting of exonuclease deficient Bca DNA polymerase.
  • kits of the fourteenth and fifteenth inventions include a 5 ' ⁇ 3' exonuclease-deficient BcaDNA polymerase derived from Bacillus cardotenax and Escherichia coli, Pyrococcus bacterium, or Alcayoglobus RNase derived from genus bacteria
  • a kit containing H is exemplified.
  • the RNaseH include type I RNaseH derived from Escherichia coli, and type I RNaseH derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus or bacterium belonging to the genus Alcaeoglobus.
  • kits of the fourteenth and fifteenth inventions of the present invention may contain a DNA polymerase having an endonuclease activity.
  • a DNA polymerase Bacillus ssenenax-derived 5, ⁇ 3, exonuclease-deficient Bca DNA polymerase can be used, and a substance that expresses the endonuclease activity of the DNA polymerase can be contained.
  • a manganese ion is exemplified as a substance that expresses the endonuclease activity of Bea DNA polymerase.
  • the kits of the fourteenth and fifteenth inventions can contain a substance that inhibits the reverse transcription activity of DNA polymerase.
  • kits include an analog of deoxynucleotide triphosphate such as deoxyperidine triphosphate or a derivative thereof. Can be taken.
  • a sixteenth invention of the present invention is a kit for nucleic acid amplification used in the nucleic acid amplification method of the first to third inventions of the present invention, wherein the DNA polymerase having a strand displacement activity in a packaged form is provided.
  • a kit for nucleic acid amplification which comprises an instruction sheet instructing the use of RNase H.
  • a seventeenth invention of the present invention is a kit used in the nucleic acid amplification method of the fourth to seventh inventions of the present invention, which comprises a DNA polymerase and a DNA polymerase having a strand displacement activity in a packaged form.
  • the present invention relates to a kit for nucleic acid amplification, which comprises an instruction for using a nuclease.
  • An eighteenth invention of the present invention is a product comprising a packaging material and a nucleic acid amplification reagent enclosed in the packaging material, wherein the nucleic acid amplification reagent has a strand displacement activity. And / or RNaseH, and the label attached to the packaging material or the instruction attached to the packaging material indicates that the nucleic acid amplification reagent can be used for isothermal nucleic acid amplification.
  • the present invention relates to a manufactured product of an amplification reagent.
  • a nineteenth invention of the present invention is a manufactured article comprising a packaging material and a nucleic acid amplification reagent enclosed in the packaging material, wherein the nucleic acid amplification reagent has a strand displacement activity, DNA polymerase and Z or E.
  • a twentieth invention of the present invention is a method for detecting a target nucleic acid in a sample, comprising: (a) a step of amplifying a nucleic acid by the nucleic acid amplification method of the first to seventh inventions of the present invention; and
  • step (b) detecting the target nucleic acid amplified by the step (a);
  • the detection method according to the twentieth aspect of the present invention can include a step of detecting the obtained amplified nucleic acid using a detection probe.
  • the probe may be a probe that has been labeled with a labeling substance in advance.
  • a labeling substance for example, an RNA probe labeled with two or more fluorescent substances that are arranged at a distance so as to be in a quenched state can be used. .
  • the twenty-first invention of the present invention relates to the chimeric oligonucleotide primer used in the twentieth invention.
  • the chimeric oligonucleotide primer includes, for example, a chimeric oligonucleotide primer represented by the following general formula.
  • dN deoxyribonucleotide and Z or nucleotide analog
  • N unmodified ribonucleotide and / or modified ribonucleotide
  • Nucleotides, dN at a part of the dNa site may be substituted with N, and 3, the terminal nucleotide has a modification such that DNA polymerase does not extend from the terminal. May be
  • the nucleotide analog is deoxyriboinosine nucleotide or deoxyribonucleic acid nucleotide, and the modified ribonucleotide is (HIS) liponucleotide.
  • Examples of the primer of the twenty-first aspect of the present invention include primers for detecting pathogenic microorganisms and for detecting disease-related genes, and include enterohemorrhagic Escherichia coli, botulinum, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia, and papilloma virus. Chimeric oligonucleotide primers for detecting pathogenic microorganisms such as hepatitis C virus and viroid are also included in the present invention.
  • a twenty-second invention of the present invention provides a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOS: 31 to 34, 47, 48, 51 to 53, 64 to 72, 84, 85, 113, 114, 130, 131 in the sequence listing, respectively. And a chimeric oligonucleotide primer for detecting enterohemorrhagic Escherichia coli.
  • the twenty-third invention of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for detecting viroid having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 59, 60, 119, 120, 122, 123 in the sequence listing.
  • the twenty-fourth invention of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for detecting Clostridium botulinum having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 116 or 117 in the sequence listing.
  • the twenty-fifth invention of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for detecting papilloma virus having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 96 and 97 in the sequence listing.
  • a twenty-sixth aspect of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for detecting hepatitis C virus having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 101 to 102, 138 to 139, 200 to 201, or 205 to 206 in the sequence listing. .
  • the 27th invention of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for detecting Staphylococcus aureus having a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 136 or 137 in the sequence listing.
  • a twenty-eighth invention of the present invention provides a chimeric oligo for detecting Mycobacterium tuberculosis having a nucleic acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 155 to 156, 159 to 162, and 194 to 195 in the sequence listing.
  • SEQ ID NOs: 155 to 156, 159 to 162, and 194 to 195 in the sequence listing.
  • the twentieth invention of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for detecting chlamydia having a nucleic acid sequence represented by each of SEQ ID NOs: 157 to 158 and 203 to 204 in the sequence listing.
  • a 30th invention of the present invention is a kit used in the nucleic acid amplification method of the 1st to 5th invention of the present invention, wherein the chimeric oligonucleotide primer of the 21st to 29th invention is provided.
  • the present invention relates to a kit for nucleic acid amplification characterized by comprising:
  • the thirty-first invention of the present invention is a kit used for the method for detecting a target nucleic acid of the twenty-third invention of the present invention, comprising the chimeric oligonucleotide primer of the twenty-first to twenty-ninth inventions. And a kit for detecting a target nucleic acid.
  • the 32nd invention of the present invention relates to a probe used in the method for detecting a target nucleic acid of the 20th invention of the present invention.
  • the 33rd invention of the present invention relates to a probe which hybridizes to the nucleic acid amplified by the nucleic acid amplification method of the 1st to 7th inventions of the present invention.
  • a thirty-fourth invention of the present invention relates to a probe which hybridizes to a region amplified by a primer selected from the chimeric oligonucleotides primers of the twenty-first to twenty-ninth inventions of the present invention.
  • the probes of the thirty-second to thirty-fourth inventions may be probes that have been labeled with a labeling substance in advance, for example, labeled with two or more fluorescent substances arranged at a distance so as to be in an extinction state. It can be an RNA probe.
  • a thirty-fifth invention of the present invention is a kit used for the method for detecting a target nucleic acid of the twenty-third invention of the present invention, comprising the probe of the thirty-second to thirty-fourth invention of the present invention. It is characterized by the following.
  • the 36th invention of the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid, which comprises a step of performing a mirror exchange reaction using a DNA polymerase having a strand displacement activity.
  • Examples of the DNA polymerase having strand displacement activity used in the thirty-sixth invention of the present invention include a Tarenow fragment of DNA polymerase I derived from Escherichia coli and a 5, ⁇ 3, exonuclease deficient strain derived from Bacillus stearosa morphophilus.
  • B st DNA polymerase and 5, ⁇ 3 'exonuclease from Bacillus cardotenax An example is the B-ca DNA polymerase deficient in protease.
  • a thirty-seventh aspect of the present invention is a method for producing a nucleic acid fixed article in which nucleic acids are aligned in a predetermined region
  • step (b) aligning and amplifying the nucleic acid amplified in the step (a) in a predetermined region, and fixing the nucleic acid.
  • a thirty-eighth aspect of the present invention relates to a fixed nucleic acid product prepared by the method of the thirty-seventh aspect, wherein the nucleic acid is aligned in a predetermined region.
  • a thirty-ninth aspect of the present invention is a method for producing a nucleic acid in large quantities
  • a method for mass-producing a nucleic acid comprising: collecting the nucleic acid amplified in the step (a);
  • a fortieth invention of the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid, comprising:
  • a forty-first invention of the present invention is a method for determining a nucleotide sequence of a nucleic acid, which comprises a step of expanding a nucleic acid in the method of the first to seventh, thirty-ninth, and forty-seventh inventions. And a method for determining the base sequence of the nucleic acid.
  • FIG. 1 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 2 Agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 3 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 4 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 5 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 6 shows an agarose electrophoresis pattern of a wide DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 7 shows an agarose electrophoresis pattern of a wide DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 8 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 9 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 10 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • A ICA method
  • B PCR method.
  • FIG. 11 shows an agarose electrophoresis pattern of a wide DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 12 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 13 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 14 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 15 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 16 shows an agarose electrophoresis pattern of a wide DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 17 Agarose electrophoresis of amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention Indicates a pattern.
  • FIG. 18 Agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 19 shows the agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 20 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 21 shows an agarose electrophoresis pattern of an amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 22 shows an agarose electrophoresis pattern of a wide DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 23 shows an agarose electrophoresis pattern of a wide DNA fragment widened by the method of the present invention. ⁇ . "
  • FIG. 24 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 25 shows an agarose electrophoresis pattern of a wide DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 26 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 27 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 28 shows agarose electrophoresis and doctohybrid pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 29 Agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 30 Comparison graph of the amount of amplification product amplified by the method of the present invention and the PCR method.
  • FIG. 31 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 3 shows a polyacrylamide electrophoresis pattern of a wide DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 33 shows one embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • FIG. 34 is a diagram showing one embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • FIG. 35 A drawing showing one embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • FIG. 36 A drawing showing one embodiment of the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • Figure 37 Shows the agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 38 Agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention.
  • FIG. 39 shows an agarose electrophoresis pattern of the amplified DNA fragment amplified by the method of the present invention. Detailed description of the invention
  • doxyliponucleotide also referred to as dN in the present specification
  • dN a nucleotide having a sugar moiety composed of D-2-dexoxylipose. , Cytosine, ginseng, and thymine.
  • deoxyliponucleotides having modified bases such as 7-deazaguanosine and the like are also included in the above-mentioned deoxyribonucleotides, such as deoxyliponucleotides.
  • a ribonucleotide refers to a nucleotide having a sugar moiety composed of D-ribose and having adenine, cytosine, guayun, and peracyl in the base moiety. Is mentioned.
  • the ribonucleotide includes a modified liponucleotide, for example, a modified ribonucleotide in which the oxygen atom of the phosphate group at the position is replaced with a sulfur atom [( ⁇ -S) liponucleotide, ( ⁇ -S) N And other derivatives.
  • a chimeric oligonucleotide primer refers to a primer containing a deoxyliponucleotide and a ribonucleotide.
  • the primer contains nucleotide analogs and / or modified nucleotides. Oh good.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the present invention comprises a ribonucleotide arranged at the 3, terminus or 3, terminus side of the primer, the nucleic acid chain can be extended in the method of the present invention, can be cleaved by endonuclease, and the strand displacement reaction can be performed. Any of these can be included in the chimeric oligonucleotide primer of the present invention.
  • the term “3′-terminal side” refers to a nucleic acid, for example, a portion of a primer from the center to the 3, terminal.
  • the 5 'end refers to a portion of the nucleic acid from the center to the 5' end.
  • an endonuclease refers to a double-stranded DNA produced by elongating DNA from the chimeric oligonucleotide primer annealed to type ⁇ nucleic acid and specifically acting on the ribonucleotide portion of the primer. If it's cut, then.
  • the DNA polymerase refers to an enzyme that synthesizes a new DNA chain by using the DNA chain as a ⁇ type, and includes, in addition to a natural type DNA polymerase, a mutant enzyme having the above activity.
  • the enzyme include a DNA polymerase having a strand displacement activity, 5, ⁇ 3, a DNA polymerase having no exonuclease activity, and a DNA polymerase having both a reverse transcriptase activity and a endonuclease activity.
  • ⁇ strand displacement activity '' refers to, when performing DNA replication in accordance with a mirror-type nucleic acid sequence, proceeding while displacing a DNA strand, and releasing a phase capture strand that has been annealed to the ⁇ -type strand. That is, it refers to the activity that can perform strand displacement.
  • a DNA chain released from a nucleic acid sequence that becomes a type II by strand displacement is referred to as a “substituted strand”.
  • the primer used in the method of the present invention is a chimeric oligonucleotide primer comprising at least one selected from deoxyribonucleotides and nucleotide analogs and a liponucleotide.
  • the primer has unmodified Oligoliponucleotide primers containing modified ribonucleotides and / or modified ribonucleotides are also included.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention has a nucleotide sequence substantially complementary to a part of the nucleotide sequence of the cyclized nucleic acid, and under the conditions used, elongation of the DNA chain. And a chimeric oligonucleotide primer having a liponucleotide at its 3 'end or at the 3' end.
  • the primer is usually designed to be complementary to the upstream of the region to be amplified, that is, to the 3'-side portion of the nucleotide sequence corresponding to the region to be amplified on the type III nucleic acid.
  • the “substantially complementary nucleotide sequence” means a nucleotide sequence that can anneal to DNA that becomes type II under the reaction conditions used.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention may contain one or more modified liponucleotides. That is, in the present specification, a ribonucleotide is located at the 3, terminus or at the 3, terminus of a chimeric oligonucleotide primer, and if it is recognized or cleaved by an endonuclease, unmodified ribonucleotide and Z or modified It may be any of ribonucleotides, including both such unmodified or modified liponucleotides.
  • unmodified ribonucleotides and modified liponucleotides can be used as long as the function of the primer is not lost, and these can be used in combination.
  • modified ribonucleotides include, but are not limited to, (a-S) ribonucleotides in which an oxygen atom bonded to a phosphate group is replaced with a sulfur atom, and a hydroxyl group at the 2-position of ribose. Is substituted with a methoxy group.
  • a chimeric oligonucleotide primer containing such a modified liponucleotide was prepared, for example, by a method using a sulfuration reaction reagent (manufactured by Glen Research) described in US Pat. No. 5,003,097. It can be prepared using (a-S) ribonucleotide triphosphate or 2-OMe-RNA-CE phosphoramidite reagent (Glen Research).
  • chimeric oligonucleotides containing a modified ribonucleotide having a property of imparting resistance to cleavage by an endonuclease and which can be used in the amplification method of the present invention.
  • a primer may be designed, and such a primer is useful in that it can control a cleavage position of an endonuclease in an amplification reaction step.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention can use one or two types depending on whether the amplified DNA fragment is to be obtained in a single-stranded or double-stranded form. . That is, one type of chimeric oligonucleotide primer is used when single-stranded DNA is desired, and two types of primers are used when double-stranded DNA is desired.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention is not particularly limited, but preferably has a length of about 12 nucleotides to about 100 nucleotides. More preferably, it is a primer having a length of about 15 nucleotides to about 40 nucleotides.
  • the base sequence is preferably a sequence substantially complementary to the type III nucleic acid, so that the nucleotide sequence will react with the type III nucleic acid under the reaction conditions used.
  • the primer contains a sequence recognized by an endonuclease used in a step described later at the 3 ′ end or at the 3, terminal side.
  • an oligonucleotide having a structure represented by the following general formula can be used as a primer in the DNA synthesis method of the present invention.
  • dN deoxyribonucleotide and / or nucleotide analog
  • N unmodified liponucleotide and Z or modified Liponucleotides
  • dNa at a part of dNa site may be substituted with N, and the nucleotide at the 3 ′ end has a modification such that extension from the end by DNA polymerase does not occur. May be
  • b l
  • c 0, a chimeric oligonucleotide primer
  • c 0 chimeric oligonucleotide primers
  • the length of the 3′-terminal or 3′-terminal liponucleotide of the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention is preferably Is lmer to 15mer, more preferably lmer to: L Omer, particularly preferably lmer to 5mer.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the present invention has a structure in which a ribonucleotide-containing site contained in a DNA strand (primer extension strand) extended by DNA polymerase from the primer is recognized or cleaved by endonuclease. And the liponucleotide is located at the 3 ′ end or 3 ′ end thereof.
  • RNase is added to double-stranded DNA generated by performing DNA extension from a chimeric oligonucleotide primer represented by the above general formula, which has been annealed to a type I nucleic acid.
  • the liponucleotide portion of the chimeric oligonucleotide primer is cleaved, resulting in double-stranded DNA having an ec between the oligonucleotide primer and the DNA strand synthesized by extension. Further, a strand displacement reaction occurs from the site containing the ec by DNA polymerase. Therefore, all chimeric oligonucleotide primers that can extend the nucleic acid strand from the 3 'end of the primer, can be cleaved by endonuclease, and undergo a strand displacement reaction by DNA polymerase can be used in the method of the present invention. Can be used.
  • the 3 'end of the chimeric oligonucleotide primer of the present invention is modified so that it cannot be extended by DNA polymerase, so that DNA extension from the 3' end caused by cleavage by end nuclease is prevented. What is done is included.
  • the 5 'end of the chimeric oligonucleotide primer may contain an RNA polymerase promoter sequence.
  • the RNA polymerase include T7 RNA polymerase and SP6 RNA polymerase.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in the method of the present invention may contain a nucleotide analog or other substance. That is, the chimeric oligonucleotide primer of the present invention has a function of causing a polymerase extension reaction from its 3 ′ end by a DNA polymerase without losing the function of the primer.
  • One or more nucleotide analogs can be contained within a desired range, and the nucleotide analogs can be used in combination of a plurality of types.
  • nucleotide analogs examples include, but are not limited to, nucleotide analogs having a modified base such as deoxyinosine nucleotide, deoxyperacyl nucleotide or 7-dazaguayun, and nucleotide analogs having a ribose derivative. Can be used.
  • the chimera oligonucleotide primer used in the present invention contains various modifications, for example, a deoxynucleotide, a ribonucleotide, and a nucleotide analog to which a labeling compound or the like has been added as long as the above function is maintained. May be.
  • a nucleotide analog into a primer is also effective from the viewpoint of suppressing the formation of a higher-order structure of the primer itself and stabilizing the formation of annealing with the ⁇ type.
  • ribonucleotides may be introduced into the primer for the same purpose.
  • a modified liponucleotide such as ( ⁇ -S) liponucleotide can be suitably used. .
  • chimeric oligonucleotide primers are synthesized to have an arbitrary nucleic acid sequence by the phosphoramidite method using, for example, a DNA synthesizer type 394 of Applied Biosystems Inc. (Applied Biosystems Inc.). Can be achieved.
  • a DNA synthesizer type 394 of Applied Biosystems Inc. Applied Biosystems Inc.
  • a phosphoric triester method an H-phosphonate method, a thiophosphonate method and the like, but any method may be used.
  • the endonuclease used in the present invention refers to a double-stranded DNA produced by elongating DNA from the chimeric oligonucleotide primer described in (1) above, which has been bound to type I nucleic acid. It is sufficient if the extended strand can be cleaved so that a strand displacement reaction occurs. That is, it is an enzyme capable of generating a nick at a part of the chimeric oligonucleotide primer in the double-stranded DNA.
  • liponuclease can be used in the present invention, and in particular, endliponuclease H (RNase) which acts on the RNA portion of the double-stranded nucleic acid formed from DNA and RNA H) can be suitably used.
  • RNase endliponuclease H
  • the ribonuclease includes the above Any of liponucleases having a normal temperature to a thermostability can be suitably used in the present invention as long as they have an action. For example, as shown in the Examples below, in a reaction at about 50 ° C. to about 70 ° C., RNaseH derived from Escherichia coli (E. coli) can be used in the method of the present invention.
  • thermostable ribonuclease can also be suitably used.
  • the heat-resistant 4 ribonuclease is not particularly limited.
  • any of a natural form and a mutant form can be suitably used.
  • the enzyme unit of RNaseH described in the specification of the present application is a numerical value displayed based on the enzyme unit measuring method shown in the reference example in the examples.
  • the RNaseH is not particularly limited as long as it can be used in the method of the present invention, and may be any of various viruses, phages, prokaryotes, and eukaryotes. Furthermore, it may be either cellular RNaseH or viral RNaseH.
  • Escherichia coli RNaseHI is an example of the cellular RNaseH
  • HIV-1 is an example of a viral RNaseH.
  • RNaseH can be any of type I, type II, and type III.
  • RNaseHI derived from O. moonshine RNaseHI derived from Pyrococcus genus bacteria
  • RNaseHIHI derived from Alcaeoglobus bacterium are suitable.
  • the efficiency of the cleavage reaction of endonucleases used in the method of the present invention depends on the base sequence near the 3 ′ end of the primer, and may affect the amplification efficiency of the desired DNA. Therefore, it is natural to design the optimal primer for the RNase H to be used.
  • nick refers to cutting within one strand of a double-stranded nucleic acid.
  • RNaseH acts on a hybrid double-stranded nucleic acid of DNA and DNA containing liponucleotides, and selectively cleaves the ribonucleotide portion of the double-stranded strand containing ribonucleotides, thereby reducing the Add two strands to hybrid double-stranded nucleic acid You.
  • DNA polymerase having a strand displacement activity of DNA can be used.
  • those having substantially no 5 ′ ⁇ 3, exonuclease activity can be particularly preferably used.
  • strand displacement activity means that when performing DNA replication in accordance with a nucleic acid sequence of type ⁇ , the DNA strand proceeds while replacing the DNA strand and releases a complementary strand that has been annealed to the type ⁇ ⁇ strand.
  • An activity that can be displaced is referred to as a “substituted strand”.
  • the DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned strand displacement activity.
  • Bacillus caldotenax hereinafter, referred to as B.ca
  • B. st Bacillus stearothermophilus
  • E.co1i E.co1i
  • Large fragment (Klenow fragment) of DNA polymerase I derived from the same.
  • any of those having a normal temperature to a heat resistance can be suitably used.
  • B. ca is a thermophilic bacterium whose optimal growth temperature is about 70 ° C.
  • Bea DNA polymerase derived from this bacterium has DNA-dependent DNA polymerase activity, RNA-dependent DNA polymerase activity (reverse transcription activity), 5 ' ⁇ 3, E exonuclease activity, 3, ⁇ 5' are known to have a Ekisonukurea zero active I 1 production.
  • the above-mentioned enzymes may be either those obtained by purifying from their original sources or recombinant proteins produced by genetic engineering.
  • the enzyme may be modified by substitution, deletion, addition, insertion or the like by genetic engineering or other techniques. Examples of such an enzyme include 5, ⁇ 3, Bca BESTDNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), which is a Bea DNA polymerase lacking exonuclease activity, and the like. .
  • DNA polymerase having an RNaseH activity I is known.
  • a DNA polymerase having an RNaseH activity I is known.
  • the DNA polymerase is expressed in an RNaseH activity.
  • an embodiment is used in the presence of Mn 2+
  • the method of the present invention can be carried out without adding the above-mentioned RNaseH. Revealed for the first time that the Bea DNA polymerase exhibits RNaseH activity in a buffer containing Mn2 +, and the nucleic acid of the present invention in a reaction solution containing no enzyme other than Bca DNA polymerase.
  • the above-mentioned embodiment is not limited to Bea DNA polymerase, but is a known DNA polymerase known to have both RNaseH activity, for example, Thermos thermophilus (Thermus thermophilus) can also be used in the present invention.
  • the reaction buffer used in the present invention one containing a buffer component, a magnesium salt or other metal salt, and dNTP is used.
  • the type and concentration of the salt are optimized according to the metal requirements of the enzyme to be used.
  • the buffer component is not particularly limited, for example, bicine, tricine, mouse, tris, phosphate (sodium phosphate, potassium phosphate, etc.) can be suitably used.
  • a buffer containing bicine, tricine, mouse, or phosphate as a buffer component is suitable for the present invention.
  • the optimal buffer solution can be selected depending on the reaction temperature, end nuclease used, DNA polymerase, and the like.
  • the final concentration of the buffer component is between 5 mM and: L 0 OmM, particularly preferably in the range of 2 OmM to 5 OmM, and ⁇ 6.0-9.5, particularly preferably ⁇ 7.0-9.2. Ranges are used.
  • a buffer of pH 7.5 to 9.2 containing 22 mM to 46 mM of tricine or a buffer of pH 7.0 to 8.0 containing 25 mM to 5 OmM of potassium phosphate can be suitably used.
  • the magnesium salt is not particularly limited, for example, It is possible to suitably use magnesium salt, magnesium acetate or magnesium sulfate, and its concentration is in the range of 1 mM to 20 mM, particularly preferably 2 mM to 10 mM in final concentration.
  • dNTPs (a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) serving as a substrate for the DNA elongation reaction are each in a final concentration of 0.2 lmM to 3.0 OmM, and particularly preferably in the range of 0.2 mM to 1.2 mM. It is.
  • the amount of the primer to be used is in the range of lpmol to 50 ⁇ l of the reaction solution volume: LOO Opmol, and particularly preferably in the range of 10 pmol to 150 pmol.
  • additives for the purpose of stabilizing the amplification reaction can be added to the reaction solution.
  • the final concentration of the serum is 0.1% or less, and the serum albumin (BSA) is 10% or less.
  • propylenediamine 01% or less may be added.
  • it may contain ⁇ (1-methyl-2-yl-pyrrolidinone), glycerol, polyethylene glycol, dimethinole sulfoxide and / or formamide, and the addition of these organic solvents may cause non-specific annealing of the oligonucleotide primer. It is expected to be reduced.
  • the method of the present invention may be carried out by adding a substance that inhibits the reverse transcription activity possessed by DNA polymerase, for example, phosphonoformic acid (PFA, Phosphonoformic acid).
  • a substance that inhibits reverse transcription activity is added, amplification of nonspecific products other than the target nucleic acid is reduced.
  • the nucleic acid to be used in the present invention is used in the present invention prior to the amplification reaction. It is effective to anneal the chimeric oligonucleotide primers.
  • the treatment is preferably carried out using an annealing solution containing a substance that enhances the aring, for example, polyamines such as spermine and spermidine, propylene diamine.
  • a solution containing a salt can be suitably used, and there is no particular limitation.
  • an annealing solution containing the primer and the nucleic acid to be a type II is usually maintained at a temperature at which the double-stranded nucleic acid is denatured, for example, 90 ° C. or higher, and then used in the method of the present invention.
  • the reaction is performed by cooling to a reaction temperature or lower.
  • the range of 3 to 200 U is preferable per 50 ⁇ l of the reaction solution, and the range of 15 U to 60 U is particularly preferable.
  • the range is 3 to 20 OU, more preferably 4 to 4 OU, per 50 ⁇ l of the reaction solution.
  • the DNA polymerase is, for example, ⁇ ca BEST DNA polymerase (Takara Shuzo), preferably in the range of 0.5 U to 100 U, particularly preferably in the range of 1 U to 22 U per 50 ⁇ l of reaction solution.
  • the method of the present invention uses at least one kind of the oligonucleotide primer shown in the above (1), further comprises the endonuclease shown in the above (2) and the DNA polymerase shown in the above (3). Can be implemented in combination.
  • a DNA polymerase having an RNaseH activity can be used under such conditions that the RNaseH activity is expressed.
  • the PCR method or the like is used as nucleotide triphosphate as a substrate for the extension reaction.
  • DNTPs used in the above-mentioned method that is, a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP can be preferably used.
  • DUTP may be used as a substrate.
  • the dNTP can serve as a substrate for the DNA polymerase to be used, it can be used as an analog of dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), for example, a 3-phosphate of 7-daza-dGTP and dITP. It may contain acid, etc.
  • a derivative of dNTP or a derivative of a dNTP analog may be used, and a derivative having a functional group, for example, dUTP having an amino group may be included.
  • a chimeric oligonucleotide primer is used.
  • the primer can be prepared, for example, using a DNA synthesizer or the like in the same manner as in a usual synthesis method.
  • the above-mentioned chimeric oligonucleotide primer can be used in combination with a conventional oligonucleotide primer.
  • the enzyme when the activity of the enzyme used is likely to decrease during the reaction, the enzyme can be further added during the reaction.
  • the RNaseH may be further added during the reaction using RNaseH derived from Escherichia coli.
  • the enzyme to be added may be the same as the enzyme contained in the reaction solution at the start of the reaction, or may be a different type of enzyme having the same action. That is, as long as the effect of improving the detection sensitivity or increasing the amount of amplification product can be obtained by adding during the reaction, the type of the enzyme to be added and the properties of the enzyme are not limited at all.
  • the nucleic acid to be type II may be prepared or isolated from any sample that may contain the nucleic acid. Further, the sample may be directly used for the nucleic acid amplification reaction of the present invention.
  • the sample containing such a nucleic acid is not particularly limited, but includes, for example, whole blood, serum, buffy coat, urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissue (eg, cancer tissue, lymph node, etc.), Biological samples such as cell cultures (eg, mammalian cell cultures and bacterial cultures), viroids, viruses, bacteria, molds, yeasts, nucleic acid-containing samples such as plants and animals, viruses or bacteria Samples that may be contaminated or infected with other microorganisms (food, biological products, etc.) or samples that may contain organisms such as soil and wastewater. Further, by treating the sample or the like by a known method, It may be a nucleic acid-containing preparation obtained by the above method.
  • a cell fragment or a sample obtained by fractionating the cell fragment, a nucleic acid in the sample, or a specific nucleic acid molecule group for example, a sample enriched in mRNA
  • a nucleic acid such as DNA or RNA obtained by amplifying a nucleic acid contained in the above-described sample by a known method can also be suitably used.
  • the preparation of a nucleic acid-containing preparation from these materials is not particularly limited, and can be performed by, for example, dissolution treatment with a surfactant, ultrasonic treatment, shaking and stirring using glass beads, use of French press, and the like.
  • it may be advantageous to purify the nucleic acid with further manipulations eg, when endogenous nucleases are present.
  • the nucleic acid is purified by known methods such as phenol extraction, chromatography, ion exchange, gel electrophoresis or density gradient centrifugation.
  • the method of the present invention may be carried out using cDNA as a type II cDNA synthesized by a reverse transcription reaction using the type RNA as a type II.
  • the RNA that can be applied to the method of the present invention is not particularly limited as long as a primer used for the reverse transcription reaction can be prepared.
  • mRNA, tRNA , r RNA, etc. or specific RNA molecular species.
  • the primer used in the above reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it anneals to type I RNA under the reaction conditions used.
  • the primers include a primer having a nucleotide sequence complementary to a specific type I RNA (specific primer), an oligo dT (deoxythymine) primer, and a primer having a random sequence (random primer). May be.
  • the length of the reverse transcription primer is preferably at least 6 nucleotides, more preferably at least 9 nucleotides, from the viewpoint of performing specific annealing, and is preferably at most 100 nucleotides, from the viewpoint of oligonucleotide synthesis. And more preferably 30 nucleotides or less.
  • a chimeric oligonucleotide primer that can be used as a primer for a strand displacement reaction when performing the nucleic acid amplification method of the present invention using the reversely transcribed cDNA as the ⁇ type is used as a reverse transcription primer.
  • the primer is not particularly limited as long as it has the properties described in the above (1) and can be used for the reverse transcription reaction from RNA.
  • the enzyme used in the above reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing RNA into type III cDNA.
  • reverse transcriptase derived from avian myeloblastosis virus (AMV RTase)
  • Reverse transcriptases derived from Moro-mouse leukemia virus MMLV RTase
  • Rousse-related virus 2 reverse transcriptase Rousse-related virus 2 reverse transcriptase
  • a DNA polymerase having a reverse transcription activity can also be used.
  • an enzyme having a reverse transcription activity at a high temperature is suitable.
  • Examples thereof include a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the genus Thermus (such as Tth DNA polymerase) and a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the thermophilic bacillus genus. Can be used. Although not particularly limited, for example, a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium is preferable, a B. st-derived DNA polymerase (Bst DNA polymerase), and a Bea DNA polymerase are more preferable. For example, Bea DNA polymerase does not require manganese ions for the reverse transcription reaction, and can synthesize cDNA under high temperature conditions while suppressing secondary structure formation of type II RNA.
  • a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the genus Thermus such as Tth DNA polymerase
  • a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the thermophilic bacillus genus can be used.
  • a DNA or RNA containing a base sequence to be amplified may be previously replicated and then used as a nucleic acid to be a type II of the method of the present invention.
  • the method for the replication is not particularly limited, but after transforming a suitable host with a vector into which a nucleic acid fragment containing the nucleotide sequence to be amplified is inserted, culturing the resulting transformant, An example is a method of extracting and using a vector into which a nucleic acid fragment containing a base sequence to be amplified is inserted.
  • the vector is not particularly limited as long as it is stably replicated in the host.
  • any of pUC, pB1escript, pGEM, cosmid, and phage systems can be suitably used.
  • the host is not particularly limited as long as it can hold the vector to be used, and examples thereof include Escherichia coli which can be easily cultured.
  • a nucleic acid fragment containing the nucleotide sequence to be amplified is transformed into a type II and RNA having the nucleotide sequence is transcribed with an RNA polymerase. After that, the RNA may be used as it is or as a cDNA in a reverse transcription reaction in the type II of the method of the present invention.
  • the nucleic acid fragment containing the base sequence to be amplified is not particularly limited as long as it has an RNA polymerase promoter sequence.
  • RNA polymerase promoter sequence may be ligated to an adapter or cassette having an RNA polymerase promoter sequence at its end, or may be a primer having an RNA polymerase promoter sequence. It may be synthesized enzymatically using the appropriate type III. That is, the nucleic acid fragment containing the base sequence to be amplified can be replicated and amplified in the form of RNA using the RNA polymerase promoter sequence arranged as described above.
  • the vector is not particularly limited as long as it has an RNA polymerase open mouth rooster S row.For example, any of pUC, pB1uescript, pGEM, cosmid, and phage are suitable. Can be used.
  • RNA polymerase used in the above-mentioned replication and amplification methods is not particularly limited.
  • SP6 RNA polymerase SP6 RNA polymerase, T
  • RNA polymerase or T3 RNA polymerase can be suitably used.
  • double-stranded DNA such as genomic DNA and PCR fragments isolated by the above method
  • single-stranded DNA such as cDNA prepared by reverse transcription from total RNA or mRNA
  • type I DNA DNA
  • those having undergone the step of denaturing single-stranded DNA (denaturia) and those not having undergone the step of denaturing single-stranded DNA can be suitably used for their deviation and deviation.
  • the position where the primer used in the method of the present invention anneals is set to about 50 bases inward from the end of the DNA.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention can be performed without performing the above-described denaturing step.
  • the purpose is to amplify a nucleic acid having an RNA-derived sequence
  • RNA-cDNA double-stranded nucleic acid obtained by reverse transcription reaction using More inventions
  • the RNA reaction can be decomposed into single-stranded cDNA, and the amplification reaction can be started.
  • RNA is ⁇ -type and cDNA generated by the reaction are performed.
  • a reverse transcription reaction in which RNA is ⁇ -type and cDNA generated by the reaction are performed.
  • the length of type III above is such that the force of the target sequence to be completely contained in the fragment or the presence of at least a sufficient portion of the target sequence in the fragment to provide sufficient binding of the primer sequence Things are good.
  • the mirror-type DNA when it is a double-stranded DNA, it is denatured into a single-stranded DNA so that the primer to the ⁇ -type DNA chain becomes Coupling can be allowed. Maintaining the temperature at which the double-stranded DNA denatures, for example, about 95 ° C, is a preferred denaturation method. Other methods involve increasing the pH, but the binding of the oligonucleotide primer to the target requires a reduction in the pH during the amplification reaction.
  • the nucleic acid is continuously amplified.
  • “continuously” means that the reaction is proceeding without changing the reaction temperature and the composition of the reaction solution.
  • “isothermal” means a substantially constant temperature condition under which an enzyme and a nucleic acid chain function in each of the above steps.
  • the nucleic acid amplification reaction of the present invention can be carried out at room temperature (for example, at 37 ° C.) by using a room temperature DNA polymerase such as tarenow fragment, for example.
  • a room temperature DNA polymerase such as tarenow fragment
  • enzymes having heat resistance enzymes having heat resistance
  • the reaction can be carried out at an elevated temperature, for example, at 50 ° C. or higher, for example, at 60 ° C. or higher using a polymerase.
  • non-specific annealing of primers is suppressed, the specificity of DNA amplification is improved, and the elongation of DNA polymerase is improved by eliminating the secondary structure of type I DNA.
  • a single-stranded ⁇ -type DNA is first annealed with a chimeric oligonucleotide primer complementary to the DNA.
  • DNA primer extension strand
  • DNA primer extension strand
  • the endonuclease acts on the double-stranded DNA to initiate extension of new DNA from the primer portion of the primer extension strand.
  • the endonuclease acts as a nicking enzyme that nicks the double-stranded DNA, or alters the double-stranded DNA structure of the chimeric oligonucleotide primer and the type I DNA.
  • a DNA polymerase having strand displacement activity re-extends the DNA strand from the nick 3 and the end of the nicked double-stranded DNA to generate a new primer extension strand, and at the same time the nick 3 and the end 3 To release downstream DNA.
  • the previously synthesized extended primer chain is replaced with a new extended primer chain.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention can be carried out using two types of primers, a chimeric oligonucleotide primer complementary to the type III nucleic acid and another chimeric oligonucleotide primer complementary to the substituted strand. It can.
  • one of the primers binds to the mirror-shaped DNA chain to cause a strand displacement reaction
  • the other primer binds to the displaced strand released by the above strand displacement reaction to form a new strand. Initiate the substitution reaction.
  • each reaction product can function as type II for the other primer. As the amount of type I increases in this way, amplification products increase non-linearly.
  • both strands can be used for amplification reaction. It can be shaped as ⁇ .
  • chimeric oligonucleotide primers four deoxyliponucleotide triphosphates (dNTP), DNA polymerase and end Add nuclease to the reaction.
  • dNTP deoxyliponucleotide triphosphates
  • each primer from each primer during the extension reaction is used.
  • Type II exchange may occur between the type I extended chain intermediates, and the synthesized primer extended chains may produce a double-stranded nucleic acid in which the synthesized primer extended chains have annealed.
  • This double-stranded nucleic acid has chimeric oligonucleotide primers at both ends, and the complementary strand extension reaction by strand displacement can be started again from both ends.
  • an amplification product having a primer sequence at one end is generated.
  • type I exchange occurs during this reaction, a double-stranded nucleic acid similar to that of the previous self is generated again.
  • a method for amplifying a nucleic acid comprising a step of performing a type I exchange reaction using a DNA polymerase having a strand displacement activity.
  • a type I exchange reaction a type II double-stranded nucleic acid, two types of chimeric oligonucleotide primers substantially complementary to the base sequence of each strand, and a DNA polymerase having strand displacement activity are used.
  • two types of primer extension strands complementary to the type III are synthesized.
  • exchange of the ⁇ type from each ⁇ type of the extended primer chain to the other extended primer chain occurs.
  • the type I exchange reaction means that when a complementary strand is synthesized by strand displacement reactions from both sides of a double-stranded nucleic acid, the DNA polymerase exchanges its type II, and the other DNA polymerase is newly added.
  • the synthesized complementary strands are each designated as ⁇ type and the subsequent complementary strand synthesis is performed.
  • the type II double-stranded nucleic acid is treated with the respective DNA primers and DNA polymerase having strand displacement activity, and the extended strand is synthesized in a reaction to generate an extended strand complementary to the type II.
  • the reaction in which DNA polymerase actively switches the type III primer from the initial type II to the other type of primer extended strand is not particularly limited, but can be confirmed, for example, by the method described in Example 32 described below.
  • the present invention relates to a DNA vector having the ability to carry out the type I exchange reaction during the strand displacement reaction.
  • Limerase can be preferably used, and for example, a mutant enzyme of Bca DNA polymerase lacking 5 ′ ⁇ 3, exonuclease activity is particularly preferably used.
  • the enzyme is commercially available as Bca BESTD NA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and Escherichia coli HB101 / pUI205 (FERM BP-37 2 0) (From May 10, 1991 (Hara Deposit Date) 1-5-1, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref. (Deposited at the Patent Organism Depositary) and can be prepared by the method described in Japanese Patent No. 2978001.
  • reaction mode of the nucleic acid amplification method of the present invention is considered as follows, for example.
  • a double-stranded nucleic acid that is a type II is combined with two types of chimeric oligonucleotide primers that are substantially complementary to the base sequence of each strand in the presence of RNase H.
  • the ribonucleotide-containing site of the double-stranded nucleic acid in which the primer-extended strands have annealed to each other is cleaved by RNase H, and DNA polymerases having strand displacement activity are released from the 3 and the end of each primer portion of the double-stranded nucleic acid.
  • Strand displacement is performed by elongating a nucleic acid sequence complementary to the type, and a double-stranded nucleic acid in which primer extended strands anneal to each other and a double-stranded nucleic acid in which types are annealed are subjected to type exchange reaction. It is possible to obtain a double-stranded nucleic acid in which two kinds of primers have been annealed. When the mirror exchange reaction does not occur, two types of double-stranded nucleic acids consisting of type III and the extended primer strand can be obtained.
  • Strand displacement is performed by extending a nucleic acid sequence complementary to a quink type from a 3,3 end of each primer part of the double-stranded nucleic acid annealed by the above two primers by a DNA polymerase having strand displacement activity, ⁇ A double-stranded nucleic acid in which the extended primer strands anneal to each other and a ⁇ It is possible to obtain a double-stranded nucleic acid in which the two primers have been annealed to the single-stranded nucleic acid, and the double-stranded nucleic acid in which the two primers have been annealed is reused as a base. When type I exchange reaction does not occur, two types of double-stranded nucleic acids consisting of type II and a primer extension chain can be obtained.
  • the ribonucleotide-containing sites of these two types of double-stranded nucleic acids are cleaved with RNase H, and the ⁇ -type DNA polymerase having strand displacement activity is released from the 3 and the ends of the respective primer portions of the double-stranded nucleic acids.
  • the complementary nucleic acid sequence is extended to perform strand displacement.
  • a double-stranded nucleic acid that is a type II is obtained by combining two types of chimeric oligonucleotide primers substantially complementary to the base sequence of each strand in the presence of RNase H.
  • a primer extension strand complementary to the type I is synthesized by treatment with a DNA polymerase having a strand displacement activity and the type I exchange reaction does not occur, two types of the type II and the primer extension strand are used.
  • a single-stranded nucleic acid is obtained.
  • the liponucleotide-containing site of the chimeric oligonucleotide primer-extended chain when the liponucleotide-containing site of the chimeric oligonucleotide primer-extended chain is cleaved, the fragment (primer portion) on the 5 ′ side generated by the cleavage is cleaved so as not to contain ribonucleotides. In some cases.
  • the primer extension strand extended from the primer portion thus generated is no longer cleaved by the endonuclease, and as a result, an amplification product having a primer sequence at the end is generated.
  • a product having a primer sequence at one or both ends may be generated in addition to an amplification product not containing a primer sequence. These products are also included in the amplification product of the present invention.
  • FIGS. 33 to 36 are diagrams showing examples of nucleic acid amplification in the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • DNA a pair of chimeric oligonucleotide primers synthesized based on the base sequence information of the type I DNA (the chimeric oligonucleotide primer in the figure has three ribonucleotides at its 3 ′ end.
  • ribonucleotides are indicated by open circles
  • DNA-RNA hybrid sound an example of nucleic acid amplification in the presence of RNase H, a ribonuclease that cleaves at position 5, and dNTP, a substrate that is incorporated into the extended strand, is shown.
  • a pair of chimeric oligonucleotide primers synthesized based on the nucleotide sequence information of type I DNA anneal to a specific portion of the cyclized DNA, and undergo strand displacement as shown in step 1.
  • the reaction extends the DNA strand from the 3 'end of each chimeric oligonucleotide primer.
  • the primer extension strands extending from the upstream side and the downstream side are separated from the original type II at a certain ratio by the type II exchange reaction shown in step 2, and the part 3
  • the primer extended strands anneal with each other.
  • the annealed extended strands further extend complementary strands of each other, and the extended primer strands form a double-stranded DNA which is eluated.
  • a double-stranded DNA in which the pair of chimeric oligonucleotide primers has been annealed is generated in the double-stranded DNA in which the substituted strands have been annealed. This is used as the starting material in FIG.
  • the double-stranded DNA of FIG. 34 forms the DNA / RNA hybrid portion of the double-stranded DNA by the action of RNase H.
  • RNase H the double-stranded DNA
  • a strand displacement reaction occurs from the break in the double-stranded DNA, and the DNA elongates.
  • a type I exchange reaction occurs at a certain ratio in the same manner as in step 2 of Fig. 34, and a double-stranded DNA in which the primer extension strands, which are amplification products, are annealed is generated.
  • a double-stranded DNA in which the above-mentioned pair of chimeric oligonucleotide primers anneals to the double-stranded DNA in which the substituted strands are annealed is generated.
  • step 2 in the double-stranded DNA in which the pair of chimeric oligonucleotide primers was annealed to the double-stranded DNA in which the displaced strands shown in FIG.
  • the reaction extends the DNA strand from the 3 'end of each chimeric oligonucleotide primer.
  • step 2 and step 5 A similar type I exchange reaction occurs at a certain rate, and double-stranded DNA in which the extended primer strands are annealed is generated.
  • the double-stranded DNA returns to step 3 in FIG. 35, and the reaction after step 3 is started again.
  • a double-stranded DNA in which the pair of chimeric oligonucleotide primers has been annealed to a double-stranded DNA in which the displaced strands have annealed to each other is generated, and is used as a starting material in FIG.
  • a chain reaction in which the production of these double-stranded nucleic acids is repeated occurs, and the region flanked by the pair of chimeric oligonucleotide primers is specifically amplified and produced.
  • a polymer having a series of amplified regions may be produced.
  • Such a polymer has a plurality of amplification regions, all of which are connected in the same direction, and is identified as a ladder-like band in the analysis of amplification products by electrophoresis. It is considered that the production of the polymer is affected by the region to be amplified, the size of the region, the adjacent region, the base sequence of the chimeric oligonucleotide primer used, the reaction conditions, and the like.
  • the above polymer contains a plurality of amplification regions.
  • the polymer hybridizes with a large number of probes by, for example, hybridization with an appropriate probe, and the polymer generates a strong signal, which is useful for the purpose of detecting a nucleic acid containing an amplification region. It is. Also, by combining restriction enzyme digestion and the like, an amplified region or a part thereof can be obtained as a monomer from a polymer.
  • DNA polymerase used in the present invention, it is necessary to replace the previously extended DNA strand with the synthesis of the extended strand downstream from the 3, terminal of the primer portion. Importantly, it does not show 5 'to 3' exonuclease activity, which can degrade the displaced strand.
  • DNA polymerases for example, a Klenow fragment, which is an exonuclease-deficient mutant of DNA polymerase I derived from Escherichia coli, a similar fragment derived from Bst DNA polymerase (manufactured by New England Biolabs), and a fragment derived from B.ca Bea BESTD NA polymerase (Takara Shuzo) is useful.
  • Sequenase 1.0 and Sequenace 2.0 (U.S.A. Biochemical) ⁇
  • the T5 DNA polymerase and ⁇ 29 DNA polymerase described in Gene, Vol. 97, pages 13 to 19 (1991) are also available. Can be used. Normally 5, ⁇ 3, exonuclease ⁇ Even polymerases with "ze" activity If the activity of can be inhibited by adding an appropriate inhibitor, it can be used in the DNA synthesis method of the present invention.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention may be performed at a variable temperature or at an isothermal temperature.
  • the variable temperature means that the reaction temperature of each step is changed within a range that does not hinder the reaction of each step. That is, for example, the case where the temperature is changed to a temperature suitable for each of the annealing of the primer, the synthesis reaction of the negative strand, the nicking of the phase capture strand, and the substitution reaction.
  • isothermal means that each step is performed at a substantially constant temperature without changing the reaction temperature of each step. In any case, it is natural that the temperature is set so as to obtain the optimum reaction conditions.
  • nucleic acid amplification method of the present invention provides a method for synthesizing a nucleic acid at an isothermal temperature.
  • Many conventional nucleic acid amplification methods require that the target be dissociated from the synthesized strand by raising or lowering the temperature, and require a special reaction device such as a thermorecycler. Can be performed only with a device that can maintain a constant temperature. Thus, the method of this effort can be performed at a single temperature.
  • the reaction is performed by setting the reaction temperature and the level of stringency so that the non-specific annealing of the primer is reduced and the primer specifically anneals to the nucleic acid that becomes the type.
  • the method of the present invention can be performed under high temperature conditions using a thermostable enzyme as described above.
  • the method of the present invention is performed at an appropriate temperature at which the activity of the enzyme to be used is sufficiently maintained. Therefore, depending on the enzyme used, a preferred reaction temperature is about 20 ° C to about 80 ° C, more preferably about 30 ° C to about 75 ° C, and particularly preferably about 50 ° C. ⁇ 70 ° C.
  • a primer having a longer chain length than when performing the reaction at room temperature when performing the reaction under high temperature conditions, it is preferable to use a primer having a longer chain length than when performing the reaction at room temperature.
  • the set of sequences ⁇ Pi length of primers suitable for each reaction temperature may be the Tm value reference, or a commercially available primer design software, for example, OL I GO TM P r ime r Ana lysissof twa re (Takara Shuzo) may be used.
  • the method of the present invention When the reaction temperature is set at 55 ° C to 60 ° C or 65 ° C, the length of the primer used in the method is not particularly limited, but is, for example, a length of 12 nucleotides to 100 nucleotides.
  • a primer having a length of 14 to 50 nucleotides, more preferably a length of 15 to 40 nucleotides can be used.
  • the effect of increasing the reaction temperature in this way is that the secondary structure of type III DNA can be eliminated, and even when a type III nucleic acid having a high GC content is used, the desired nucleic acid is amplified.
  • the same effect can be obtained when a region having a long chain length is amplified.
  • the effect is seen in the range from about 60 bp to about 20 kbp, more particularly in the range from about 110 bp to about 4.3 kb, especially in the range from about 130 bp to about 1500 b.
  • the amplification temperature can be improved by adjusting the reaction temperature according to the GC content of the type III nucleic acid.
  • the amplification reaction of the present invention may be performed at 50 to 55 ° C, depending on the length of the chain to be amplified and the Tm value of the primer. it can.
  • RNA-derived nucleic acid including a step of preparing cDNA from RNA (reverse transcription reaction) can be easily carried out.
  • the step of preparing cDNA from RNA can be performed independently, and the product (cDNA) can be used as type I DNA in the method of the present invention.
  • an appropriate method such as deactivating the enzyme or lowering the reaction temperature to stop the reaction, or whether one of the substrates is exhausted is used. It is repeated until either.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention can be used for various experimental procedures utilizing nucleic acid amplification, for example, detection of nucleic acid, labeling, and determination of a base sequence.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention can be used as an in situ nucleic acid amplification method, a nucleic acid amplification method on a solid support such as a DNA chip, or a multiplex nucleic acid amplification method for simultaneously amplifying various types of regions. it can.
  • One of the features of the nucleic acid amplification method of the present invention is that a single-stranded DNA is prepared. Is possible. For this purpose, not only a method using one chimeric oligonucleotide primer but also a method using two chimeric oligonucleotide primers can be used. For example, when two oligonucleotide primers are used, the amplification reaction is carried out by increasing the amount of one oligonucleotide primer relative to the amount of the other, and the method employed in the so-called asymmetric metric (non-symmetric) PCR method. Can be performed using the same primer ratio.
  • the primer ratio is not particularly limited, it can be suitably used in the range of 1:10 to 1: 500, and particularly preferably in the range of 1:10 to 1: 10000. As a result, the amount of the product displacing one strand becomes excessive compared to the amount of the product displacing the other strand.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention it is possible to prepare a single-stranded DNA substantially containing no complementary strand.
  • a single-stranded DNA for preparing a nucleic acid-immobilized product such as a DNA chip can be prepared.
  • NAs, single-stranded DNA probes for detecting target nucleic acids, or megaprimers for long-chain PCR can be easily and quickly prepared.
  • the present invention is also useful as a method for producing a nucleic acid having a sense sequence or an antisense sequence.
  • the method of the present invention can amplify a desired nucleic acid sequence region even from a small amount of nucleic acid that becomes type I by performing the method in a bicine, tricine, mouse, phosphate, or Tris buffer.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention does not require the use of a reaction device capable of adjusting the temperature over time, so that the amplification reaction can be performed using a large volume of the reaction solution. Therefore, for example, industrial mass production of nucleic acids used for medical applications and the like is possible.
  • the utilization efficiency of the primer used in the nucleic acid amplification method of the present invention is approximately 100%, which can be 5 to 10 times higher than the utilization efficiency of the conventional method, for example, the PCR method.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention provides an amplification product Can be generated.
  • the frequency of DNA synthesis errors in the method of the present invention was confirmed by analyzing the nucleotide sequence of the obtained long-range product.
  • the frequency of errors found in the amplification products obtained with each of the methods of the invention was comparable. That is, the method of the present invention has fidelity comparable to the LA-PCR method.
  • a target nucleic acid in a sample can be detected.
  • the detection method is
  • the reverse transcription reaction and the nucleic acid amplification reaction may be performed in one step.
  • the combination of the reverse transcriptase and the strand displacement type DNA polymerase for example, AMV RTase, MMLV RTase or RAV-2 RTase and Bea DNA polymerase can be suitably used.
  • the above method can be used for detection and quantification of a specific gene present in a sample. That is, a specific gene can be detected and quantified from any sample that may contain a nucleic acid such as DNA or RNA.
  • a sample include, but are not limited to, whole blood, serum, buffy coat, urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissue (eg, cancer tissue, lymph node, etc.), cell culture (Eg, mammalian cell cultures and bacterial cultures), viroids, viruses, bacteria, molds, yeasts, nucleic acid-containing specimens such as plants and animals, and viruses or bacteria.
  • RNA or DNA can be suitably used as the nucleic acid used as type I for the above detection method.
  • the difference of the base sequence on the target nucleic acid can be determined by the method for detecting a target nucleic acid of the present invention.
  • the 3 ′ terminal portion of the chimeric oligonucleotide primer to be used is located near a specific base to be discriminated in the base sequence to be targeted, for example, the base and the primer 'The primer is designed so that the terminal group forms a hydrogen bond.
  • an amplification reaction is carried out using such a chimeric oligonucleotide primer, if there is a mismatch between the base sequence at the 3rd end of the primer and the base sequence of type III, amplification from the target nucleic acid will not occur. Does not occur and no amplification product is seen.
  • this method it is possible to obtain information on a specific base on a gene, such as point mutation and single nucleotide substitution (Single nucleotide polymorphysm, SNP).
  • the method for detecting a target nucleic acid of the present invention can be carried out by directly amplifying the target nucleic acid from a sample containing the nucleic acid.
  • the chain length of the target nucleic acid to be amplified is not particularly limited, but from the viewpoint of detecting the target nucleic acid with high sensitivity, for example, a region of 200 bp or less, more preferably 150 bp or less is effective. It is.
  • the chimeric oligonucleotide primer of the present invention so as to have the amplified chain length, a target nucleic acid in a sample can be detected with high sensitivity.
  • a reaction buffer containing a bicine, trisine, mouse, phosphate or tris buffer component, and spermidine or propylenediamine as exemplified in the above (4) are used.
  • a target nucleic acid can be detected with higher sensitivity even from a small amount of a nucleic acid sample.
  • the endonuclease and DNA polymerase to be used are not particularly limited. The combination is preferred.
  • both the endonuclease and DNA polymerase The number of units that can be suitably used is expected to differ depending on the type, but in that case, the composition of the buffer and the amount of enzyme added should be determined based on the improvement in detection sensitivity or increase in the amount of amplification product. You can adjust it.
  • dUTP can be incorporated as a substrate during amplification of a target nucleic acid. Therefore, when dUTP is used as a substrate, amplification products can be degraded using ⁇ lacinole N-glycosidase (uracil N-glycosidase: UNG), and carryover of amplification products can be prevented. .
  • ⁇ lacinole N-glycosidase uracil N-glycosidase: UNG
  • a known nucleic acid detection method for example, a method of detecting a reaction product of a specific size by electrophoresis, detection by hybridization with a probe, and the like can be used. Further, a detection method using a combination of magnetic beads or the like can be suitably used.
  • a fluorescent substance such as ethidium bromide is usually used, but hybridization with a probe may be used in combination.
  • a probe labeled with a non-radioactive substance such as biotin or a fluorescent substance can be used.
  • step (a) by using a labeled nucleotide in the step (a), it is possible to incorporate the labeled nucleotide into the amplification product to facilitate detection, and to enhance a detection signal using the label. Detection using fluorescence polarization, fluorescence energy transfer, etc., is also possible. Furthermore, by constructing an appropriate detection system, it is possible to automatically detect a target nucleic acid or to quantify the target nucleic acid. Further, a naked eye detection method using a hybrid mouth mat method can also be suitably used.
  • RNA probes labeled with two or more types of fluorescent substances arranged at a distance so as to be in a quenched state can be used in the detection method of the present invention.
  • the probe does not fluoresce, RNaseH degrades the probe when it anneals to amplified DNA from the target nucleic acid that is complementary to it.
  • the distance between the fluorescent substances on the probe is increased to emit fluorescence, and it is possible to know the presence of the target nucleic acid.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is carried out using RNaseH, the target nucleic acid can be detected only by adding the above-described probe to the reaction solution.
  • the fluorescent substance used for labeling the probe For example, a combination of 6-FAM (6-carboxyfluorescein) and TAMRA (N, N, N ', N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) can be suitably used.
  • the present invention provides a probe used in the above-described method for detecting a target nucleic acid.
  • the probe of the present invention is not particularly limited as long as it can hybridize to the target nucleic acid under ordinary hybridization conditions for the nucleic acid amplified by the nucleic acid amplification method of the present invention. From the viewpoint of specifically detecting an amplification product, for example, those that hybridize under conditions known to those skilled in the art as strict conditions are preferable.
  • the strict hybridization conditions are described, for example, in 1989 by Cold Spring Harbor Laboratory, edited by T. Maniatis et al. 1 ar Cloning: described in A La boratory Manu al 2nded.). Specific strict conditions include, for example, the following conditions.
  • the isothermal amplification method of the nucleic acid amplification method of the present invention does not require a device such as a thermal cycler. Further, in the amplification method of the present invention, one or two types of primers can be used, which is smaller than that of the conventional method. Since a reagent such as dNTP can be used for PCR or the like, the running cost can be reduced as compared with the conventional method. Therefore, it can be suitably used in fields such as genetic testing by performing routine work. Furthermore, since the method of the present invention can obtain more amplification products in a shorter time than the PCR method, it can be used as a simple, rapid, and highly sensitive gene detection method.
  • ⁇ In gene analysis of ⁇ , a reaction was performed to analyze a large Attempts have been made to miniaturize the system and further increase the degree of integration.
  • One of the means is to use the most advanced ultra-fine processing technology to apply the basic processes of genomic analysis, such as DNA extraction from cells, DNA amplification reaction, electrophoresis, hybridization, target DNA, etc.
  • a process has been developed that integrates processes such as detection on a microchip that is several cm square to the size of a fingertip.
  • the system is called a microchip or nanochip.
  • the PCR method is currently considered as a gene amplification reaction in such a system.However, this method requires a means for temperature control that repeats a temperature rise and fall over time, which makes the system complicated. Becomes On the other hand, the method of the present invention, which can amplify a nucleic acid under isothermal conditions, can simplify the system and is very suitable for use in the above integrated system. Further, it is possible to construct a system with a higher degree of integration and a higher degree of integration using the technology of the present invention.
  • the present invention provides a kit used for the above-described nucleic acid amplification method of the present invention or the nucleic acid detection method of the present invention.
  • the kit in packaged form, comprises instructions for use of a DNA polymerase and an endonuclease in a strand displacement reaction.
  • a kit containing a DNA polymerase having strand displacement activity, an endonuclease, and a buffer for strand displacement reaction is suitably used in the method of the present invention.
  • a commercially available DNA polymerase and / or endonuclease having strand displacement activity may be selected and used according to instructions. Further, it may include a reagent for a reverse transcription reaction when RNA is type II.
  • the DNA polymerase can be selected from the DNA polymerases used in the present invention described in (3) above.
  • the endonuclease can be selected from the endonucleases described in (2) above.
  • the buffer for the strand displacement reaction one having the reaction buffer composition described in the above (4) can be suitably used.
  • kits are printed materials that describe how to use the kit, for example, how to prepare the reagent solution for strand displacement reaction, and recommended reaction conditions.
  • the label attached to the kit the kit Includes what is written on the package etc. It also includes information disclosed and provided through electronic media such as the Internet.
  • the kit of the present invention may contain a reaction buffer containing a bicine, tricine, mouse, phosphate, or Tris buffer component, and an aering solution as exemplified in the above (4). Good. Further, DNA polymerase RNaseH having a strand displacement ability may be contained. Further, it may contain a modified deoxyribonucleotide or an analog of deoxynucleotide triphosphate.
  • the kit used for the method for detecting a target nucleic acid includes, in addition to the instructions described above, reagents for an amplification reaction, a chimeric oligonucleotide primer suitable for amplifying the target nucleic acid, and the amplified target nucleic acid
  • reagents for an amplification reaction include, in addition to the instructions described above, a chimeric oligonucleotide primer suitable for amplifying the target nucleic acid, and the amplified target nucleic acid
  • the amplified target nucleic acid may include a probe or the like.
  • the kit of the present invention also includes a kit containing the chimeric oligonucleotide primers and Z used in the above-described present invention or the probe of the present invention.
  • the present invention provides a composition used in the above-described nucleic acid amplification method of the present invention or the nucleic acid detection method of the present invention.
  • the composition include those containing the endonuclease described in (2) and the DNA polymerase described in (3).
  • a buffer component such as magnesium salt, dNTP, or the like may be contained. Further, it may contain a modified deoxyliponucleotide or an analog of deoxynucleotide triphosphate.
  • the buffer component and other additives those described in the above (4) can be used.
  • composition suitable for the nucleic acid amplification method of the present invention and containing the various components described above.
  • the composition comprises a suitable type III and chimeric oligonucleotide primer.
  • the amplification reaction can be carried out only by adding. Further, if the amplification target is already known, the amplification target is increased.
  • compositions containing the mer are preferred.
  • An immobilized nucleic acid having the nucleic acid of the present invention aligned in a predetermined region and a method for producing the same A DNA chip is a nucleic acid immobilized product in which a number of different genes or DNA fragments are aligned and fixed in a predetermined region or a predetermined position on a solid support such as a slide glass. Array).
  • the DNA chip is brought into contact with a nucleic acid sample prepared from the sample, preferably a labeled nucleic acid sample, and subjected to hybridization, so that the DNA chip present on the DNA chip is It is used for the purpose of examining the presence of a nucleic acid having a sequence complementary to the immobilized DNA by aligning with the region.
  • a DNA chip is very useful as a means to dramatically accelerate gene expression analysis, mutation or polymorphism analysis.
  • a DNA chip in which double-stranded nucleic acids are aligned and fixed in a predetermined region is used for the hybridization step after appropriate denaturation, but a single-stranded DNA complementary to the target nucleic acid to be detected is used.
  • a DNA chip in which DNAs are aligned and fixed in a predetermined region is particularly suitable for detecting a target nucleic acid.
  • the desired DNA can be amplified in a single-stranded state by the method of the present invention.
  • the method for purifying the amplified product is not limited, but purification by isopropanol precipitation is preferred.
  • the DNA thus obtained particularly preferably a single-stranded DNA substantially containing no complementary strand, can be suitably used as a DNA fragment to be immobilized on a DNA chip. That is, the method of the present invention can be suitably used as a method of preparing DNA to be fixed and fixed in a predetermined region in the preparation of a DNA chip.
  • the carrier for aligning and fixing the DNA thus obtained in a predetermined region is not particularly limited as long as it is insoluble.
  • a nitrocellulose or nylon membrane is used.
  • Carrier is preferably used.
  • known nucleic acid immobilizing methods can be used.
  • the above-mentioned DNA may be directly immobilized on a carrier, or may be immobilized via an appropriate linker or after ligation of a plurality of molecules of DNA.
  • the modified nucleic acid can be incorporated into the amplified nucleic acid, so that the nucleic acid-immobilized product can be produced using the modified group. .
  • a nucleic acid immobilized product in which DNA amplified by the method of the present invention is aligned and immobilized in a predetermined region for example, a DNA chip may contain a target nucleic acid prepared from a sample. By bringing the nucleic acid into contact with a certain nucleic acid sample and performing hybridization, the target nucleic acid hybridized with the nucleic acid on the immobilized nucleic acid can be detected and quantified.
  • a DNA chip obtained by aligning single-stranded DNA amplified by the method of the present invention in a predetermined region and immobilizing the DNA is simpler, more powerful, more sensitive, and more reproducible. Enables the detection of the target nucleic acid.
  • one embodiment of the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid that can be performed isothermally.
  • a desired nucleic acid can be produced by mixing various components necessary for the reaction in addition to the nucleic acid that becomes the type II of the nucleic acid to be amplified and reacting the mixture under isothermal conditions.
  • the PCR method it is necessary to change the temperature of the reaction mixture over time, so that the scale of the reaction is limited to a temperature-controllable capacity (usually less than 2001), and scale-up is difficult.
  • the method does not have such a limitation, and it is possible to produce a large amount of nucleic acid by increasing the volume of the reaction mixture.
  • an amount exceeding 200 I is suitable, preferably 3001 or more, particularly preferably 50 ⁇ m1 or more.
  • a large number of complementary chain molecules are synthesized from one molecule of type II, and it is also possible to synthesize nucleic acids with these complementary chain molecules as type II. By doing so, the desired nucleic acid can be efficiently produced in large quantities.
  • the fact that the method does not require a special device such as the PCR method and frequent temperature changes is advantageous in terms of equipment and energy costs, and is an industrial method for mass production of nucleic acids. Is also excellent.
  • a target nucleic acid sequence can be amplified and produced even from a small amount of type I nucleic acid.
  • the endonuclease and the DNA polymerase to be used are not particularly limited.
  • a combination of RNase H and Bea BESTD NA polymerase derived from O. faecalis is preferable.
  • the number of cuts that can be suitably used for both the above-mentioned endonuclease and DNA polymerase may differ depending on the type. Adjust the composition and the amount of enzyme to be added.
  • the method of the present invention is useful as a method for supplying a large amount of various types of DNA fragments such as the DNA fragments to be immobilized on the DNA chip. That is, in one embodiment, a large number of DNA fragments can be obtained in a simple reaction step, and in another embodiment, a very large number of DNA fragments can be obtained using a limited number of primers. Obtainable. The latter can be carried out by combining a step of previously amplifying a nucleic acid to be a type II of the method of the present invention by a known nucleic acid amplification method, for example, a PCR method or the like.
  • Oligonucleotide-Primed PCR can be used to amplify all types of ⁇ -type nucleic acids using limited types of primers. Furthermore, if the primers used in the nucleic acid amplification method of the present invention are designed in accordance with the tag sequence added to the above-mentioned random primer or degenerate primer, any of the small nucleic acids created in the above steps can be used. Alternatively, the nucleic acid amplification reaction of the present invention can be carried out using several types of primers. As described above, by combining an appropriate type III nucleic acid preparation step and the method of the present invention, it is possible to supply a large amount of various types of DNA fragments at a lower cost than before.
  • Drugs containing nucleic acids include double-stranded DNA for expressing useful polypeptides in cells, and single-stranded antisense DNA for suppressing the expression of a target gene. It is administered to a living body using a means, for example, a carrier for gene transfer such as ribosome.
  • the method for producing a nucleic acid of the present invention is suitable as a method for producing a large amount of single-stranded or double-stranded nucleic acid for pharmaceutical use as described above.
  • it is also easy to produce a nucleic acid containing an analog of dNTP that suppresses degradation in a living body.
  • the DNA fragment amplified in the present invention is composed of ordinary nucleotides, for example, the amplified DNA can be subcloned into an appropriate vector using a restriction enzyme site therein. And restriction enzymes like RF LP It can be used without any problems, and can be widely used in the field of genetic testing. Also, if the promoter sequence of the RNA polymerase is inserted into the amplified fragment, RNA can be synthesized using the amplified fragment as type II, and, for example, the synthesized RNA can be used as a prop. Naturally, by performing the nucleic acid amplification method of the present invention using fluorescently labeled dNTP instead of ordinary dNTP, a fluorescently labeled DNA probe can be produced.
  • a large amount of nucleic acid can be amplified from a small amount of type II. When two primers are used, the amplification product increases quadratically.
  • reaction volume can be easily scaled up.
  • Amplification reactions are usually performed with one or two chimeric oligonucleotide primers and two enzymes (DNA polymerase and endonuclease).
  • the amount of primer does not limit the amount of amplification product. Furthermore, the primer usage efficiency is about 100%, which is extremely high compared to the PCR method.
  • Single-stranded and double-stranded DNA can be selectively amplified according to the purpose.
  • dNTP analog such as (HiS) dNTP is not required for amplification reaction. Further, it is possible to obtain a natural nucleic acid containing no dNTP analog.
  • the detection method of the present invention has detection sensitivity equal to or higher than that of the conventional method. Furthermore, if the same detection sensitivity is used, detection can be performed in a shorter time than the conventional method.
  • This method is suitable for automating and minimizing nucleic acid amplification and detection on microchips and nanochips, and for high integration.
  • the method of the present invention is a method suitable for both gene detection and nucleic acid production on an industrial scale.
  • Reference Example 1 Preparation of RNase eH derived from thermophilic bacterium Bacillus cardotenax Medium containing 0.2% tryptone (manufactured by Diff Laboratories) and 1.5% yeast extract (manufactured by Diffco Laboratories) (pH 6.5) 1 Inoculate 00 ml with Bacillus caldotenax YT-G strain (Bucillus caldotenax YT-G, purchased from Chezamrunk von Microorga-Sumen, Germany: DSM406), shake culture at 60 ° C for 140 minutes, and culture this culture solution. was used as a pre-culture solution.
  • 3 ml of a medium having the same composition was inoculated with 30 ml of the pre-culture liquid, and cultured at an aeration rate of 2.5 liters Z, stirring at 250 rpm, and a temperature of 60 ° C for 5 hours.
  • the culture was centrifuged (5000 X g, 15 minutes) and collected.
  • a wet cell weight of 402 g was suspended in 100 Om1 of 5 OmM Tris-HC1 buffer (pH 7.5) containing 10 mM mercaptoethanol, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, and 20 ⁇ PAPMSF.
  • MI NI—Lab AP V GAUL IN / RAN
  • the buffer was washed with 42 Om1 of the buffer used for equilibration, and the washed fraction was collected.
  • the non-adsorbed fraction and the washed fraction from DE52 column chromatography were mixed, and 2 OmM Tris-HC1 containing 10 mM mercaptoethanol, 0. ImM EDTA, 5 OmM NaCl, and 10% glycerol was added.
  • the sample was loaded on a 240 ml P-11 column (Whatman) equilibrated with a buffer solution (pH 7.5). Thereafter, elution was carried out with an equilibration buffer containing 0 to 0.5 MNaCl.
  • the obtained active fraction was put into a dialysis tube, placed on a solid polyethylene dalicol 20,000, and dehydrated and concentrated at 4 ° C. Next, a 30 Om 1 Superdex G-200 column equilibrated with 25 mM Tris-HC1 buffer (pH 7.5) containing 5 mM mercaptoethanol, 0.5 mM EDTA, 3 OmM NaCl, and 50% glycerol (Amersham Pharmacia Biotech) was loaded with this enzyme concentrate. The active fraction was obtained by elution with the buffer used for Equilibrium Dani.
  • the obtained active fraction was equilibrated with 2 OmM Tris-HC1 buffer (pH 7.5) containing 1 OmM mercaptoethanol, 0. ImM EDTA, 5 OmM NaCl, and 10% glycerol (pH 7.5).
  • the mixture was loaded on a column (Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with an equilibration buffer containing 0.5 to 0.5 M NaCl.
  • the obtained active fraction was again equilibrated with 25 mM Tris-HC1 buffer (pH 7.5) containing 5 mM mercaptoethanol, 0.5 mM EDTA, 3 OmM NaCl, and 50% glycerol.
  • the heat resistance RNaSeH activity was measured by the following method.
  • a poly (dT) solution having a concentration of 30 g / ml was added, reacted at 37 ° C for 10 minutes, and cooled to 4 ° C to prepare a poly (rA) -poly (dT) solution.
  • Add 1 ⁇ l of enzyme solution to 100 ⁇ l of poly (rA) -poly (dT) solution react at 40 ° C for 10 minutes, stop the reaction by adding 10 ⁇ l of 0.5 M EDTA, Was measured for absorbance.
  • 10 ⁇ l of 0.5 M EDTA was added to the above reaction solution, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 10 minutes, and the absorbance was measured.
  • a value (absorbance difference) was obtained by subtracting the absorbance of the control from the absorbance determined by reacting in the absence of EDTA. That is, the concentration of nucleotides released from the poly (rA) -poly (dT) hybrid by the enzymatic reaction was determined from the difference in absorbance.
  • concentration of nucleotides released from the poly (rA) -poly (dT) hybrid by the enzymatic reaction was determined from the difference in absorbance.
  • One unit of RNase H is equivalent to the release of 1 nmol of ribonucleotide A 26 .
  • Unit (unit) [absorbance difference X reaction volume (ml)] 0.02
  • Bacillus canoledotenax YT-G strain (DSM406) was inoculated into 60 ml of LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaC1, H7.2) and 65 ° C. C, and cultured for 20 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged to collect the bacteria. The obtained cells were cultured in 2 ml of 25% sucrose, 5 OmM Tris-HCl (pH 8.
  • Oligonucleotide BsuII-3 and oligonucleotide BsuII-6 described in 2 above were synthesized.
  • the PCR was performed using Takara Tack Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached protocol, and the PCR was carried out for 50 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 45 ° C, and 1 minute at 72. Was. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to phenol treatment and ethanol precipitation to purify DNA. After the obtained DNA was blunt-ended with T4 DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), agarose gel electrophoresis was performed, and an amplified DNA fragment of about 0.4 kb was recovered from the gel.
  • Takara Tack Polymerase Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the obtained 0.4 kb DNA fragment was ligated to PUC119 (Takara Shuzo) digested with Sma I (Takara Shuzo) using T4 DNA ligase (Takara Shuzo) to transform Escherichia coli JM109.
  • the transformant was cultured to obtain a plasmid 21-12 into which about 0.4 kb of DNA was inserted.
  • nucleotide sequence of the approximately 0.4 kb insert fragment of plasmid 21-12 obtained in Reference Example 2- (2) above was determined, and the oligonucleotides described in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing were determined based on the nucleotide sequence.
  • Leotide RNII-S1 and oligonucleotide RNII-S2 were synthesized.
  • Reference Example 2 Bacillus cardotenax genomic DNA prepared in (1) was digested with BamHI (Takara Shuzo), and the resulting BamHI digest and S au 3 AI force set (Takara Shuzo) Ligated with T4 DNA ligase and used as type I, RNII-S2 as a primer for primary PCR, and RNI I-S1 as a primer for secondary PCR ⁇ ", using TAKARA LA PCR In vitro Cloning Kit ( The procedure was performed according to the protocol attached to Takara Shuzo Co., Ltd. The DNA was purified from the secondary PCR solution by phenol treatment and ethanol precipitation, the ends of the DNA were blunted using T4 DNA polymerase, and then agarose gel was used.
  • the amplified DNA fragment of about 1.5 kb was recovered from the gel.
  • the obtained DNA fragment of about 1.5 k was ligated to pUC119 digested with SmaI using T4 DNA ligase to transform Escherichia coli JM109.
  • This transformant was cultured to obtain plasmid B25N16 into which about 1.5 kb of DNA had been inserted.
  • PCR was performed using plasmid 21-12 prepared in Reference Example 2- (2) as a type II and RNI I-S5 and RNII-S6 as primers.
  • the DNA polymerase used in the PCR was Takara EX Tack Polymerase (Takara Shuzo) according to the attached protocol, and the PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds. As one cycle, 25 cycles were performed.
  • agarose gel electrophoresis was performed, and the amplified DNA fragment of about 0.3 kb was recovered from the gel.
  • the obtained DNA fragment of about 0.3 kb was labeled with digoxigenin using dig high prime (manufactured by Roche Diagnostics). '
  • the Bacillus cardotenax genomic DNA prepared in Reference Example 2- (1) was digested with Hind III (Takara Shuzo) and Sac I (Takara Shuzo), and Perform double digestion of Sacl, and perform Southern hybridization with the resulting digest.
  • Hybridization and detection were performed using a DIG luminescent detection kit (manufactured by Roche Diagnostics) according to the attached protocol.
  • a DIG luminescent detection kit manufactured by Roche Diagnostics
  • Bacillus cardotenax genomic DNA was digested with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis, and DNA of about 4.5 kb was recovered from the gel.
  • the obtained DNA fragment was erased with SacI, agarose gel electrophoresis was performed, and about 1.3 kb of DNA was recovered from the gel.
  • This DNA was ligated to pUC19 (manufactured by Takara Shuzo) digested with HindIII and SacI using T4 DNA ligase to transform E. coli HB101.
  • the oligonucleotide RNII-Nde described in 7 was synthesized, and the plasmid prepared from the transformant obtained above was used as type III, and PCR was performed using RNI I-Nde and RNI I-S6 as primers. .
  • a plasmid capable of amplifying a DNA fragment of about 0.7 kb was selected, and this plasmid was designated as pRHB11.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the thus obtained plasmid pRHBll was determined. Analysis of the results revealed an open reading frame thought to encode RNaseHII. This nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of RNase HII deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • Escherichia coli HB101 transformed with RHB11 or pRHB1 was inoculated into 5 ml LB medium containing 100 S / ml ampicillin, and cultured at 37 with shaking at 37 ° C. After completion of the culture, the cells collected by centrifugation were suspended in 0.5 ml of TE buffer and sonicated, and a supernatant was obtained by centrifugation to obtain a crude cell extract.
  • Reference Example 2 The E. coli HB101 transformed with pRHB11 obtained in (4) was inoculated into 1 liter of LB medium containing 100 g / ml of ampicillin. For 16 hours. After completion of the culture, collect the cells collected by centrifugation.
  • the suspension was suspended in 3 ml of a sodium carbonate buffer [50 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 2 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride] and subjected to ultrasonic lithotripsy.
  • This cleaving solution was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to a heat treatment at 60 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged again at 12000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a heat-treated supernatant of 50.Om1.
  • an RNase II fraction eluted at about 24 OmM NaC1 was obtained.
  • the RNase II fraction (3.0 ml) was divided into two portions, applied to a PD-10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer C containing 50 mM NaC1, and obtained.
  • Om1 was applied to a Hi Trap—heparin column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer C containing 5 OmM NaCl, and 50 to 550 mM Na using an F PLC system.
  • the RNase II fraction eluted at about 310 mM NaCl was eluted with a C1 linear concentration gradient.
  • this RNa se II fraction 4. 4 ml concentrated by ultrafiltration using Centricon -10 (Amicon), containing 2 80 mu 1 of the concentrate 10 Omm Na C l, the 0. 1 mM EDTA M Tris-I was applied to a Superdex 200 gel filtration column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with HCl (pH 8.0), and eluted with the same buffer. It was eluted at a position corresponding to the molecular weight of Dalton. This molecular weight corresponds to the case where RNase HII exists as a monomer. The RNase HII eluted in this manner is converted to B ca RNase H
  • the enzymatic activity was measured by the following method using the BeaRNaseHII preparation obtained above.
  • Reaction solution (20 mM potassium potassium monoxide ( ⁇ 7.8), 0.01% bovine serum albumin (Takara Shuzo), pre-incubated in 1 ⁇ l of B ca RN as eH II standard at 40 ° C, 1% dimethyl sulfoxide, 10 mM Shiojiri manganese, 20 ⁇ g / m 1 poly (dT) (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), 30 ⁇ g / m 1 poly (rA) (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) After adding ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and reacting at 40 ° C for 10 minutes, the reaction was stopped with 0.5 M EDTA (pH 8.0) at 10 ⁇ l and the absorbance at 260 nm was measured. . As a result, RNaseH activity was observed in the BcaRNaseHII preparation.
  • Reference Example 3 Cloning of Bacillus cardotenax RNaseHIII gene
  • the amino acid sequence of Bacillus subtilis RNase HIII [Biochemistry: Biochemistry, Vol. 38, pp. 60-608 (199)] was compared with the amino acid sequence of RNa sell I derived from other organisms. A homologue is examined, and a primer B s II 1-described in SEQ ID NOS: 10 to 13 of the sequence listing for searching for a gene encoding RNase HIII from the amino acid sequence of a region well conserved between them. 1, BsuIII-3, BsuIII-6, and BsuIII-8 were synthesized.
  • Reference Example 2 200 ng of the Bacillus cardotenax genomic DNA prepared in 1 (1) was transformed into type II, and Bsu III-1 of lOOpmol and BsuIII-8 of 100 pmo1 were used as primers. Perform the first PCR with a volume of 50 ⁇ l Was. Further, using the reaction solution 1 IX 1 as a type II, a second PCR was carried out at a volume of 100 1 using B sul II-3 of lOO pmo 1 and B sul II-6 of lOO pmol as primers. Takara Tack polymerase (Takara Shuzo) was used as the DNA polymerase for the two PCRs according to the attached protocol. The first PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds, at 45 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C. One minute was defined as one cycle, and 25 cycles were performed. The second cycle was performed for 30 cycles.
  • the amplified DNA fragment of about 450 bp was blunt-ended using T4 DNA polymerase (Takara Shuzo), followed by agarose gel electrophoresis, and the increased DNA fragment of about 450 bp was recovered. .
  • the obtained DNA fragment of about 450 bp was digested with Smal (Takara Shuzo) into pUC119 (Takara Shuzo) and T4D.
  • Ligation was performed using NA ligase (Takara Shuzo) to transform Escherichia coli JMl09.
  • the transformant was cultured, and plasmid pB into which a DNA fragment of about 450 bp was inserted.
  • Reference Example 3 The nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into pBCA3204 obtained in (1) was determined, and based on the obtained sequence, primers RNIII—SEQ ID NOs: 14 and 15 in the sequence listing were used. S3 and BcaRNIII-13 were synthesized. Using the primers RNIII-S3 and BcaRNIII-3, pBCA3204 was made into type III, and PCR was performed in a volume of 1001. The DNA polymerase used in the PCR was Takara Z Tack (Takara Shuzo: fcM) according to the attached protocol.PCR was performed at 98 ° C for 0 second, 55 ° C for 0 second, and 72 ° C for 20 seconds as one cycle. 30 cycles were performed.
  • PCR was carried out in a volume of 50 ⁇ l to select colonies that were thought to have the RNaseHIII gene.
  • PCR was performed using Takara Z Tack (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached protocol. PCR was performed at 98 ° C for 0 second, 55 ° C for 0 second, and 72 ° C for 20 seconds, and 30 cycles were performed. went. As a result, No.
  • a plasmid was prepared from the No. 88 colony, and this was converted into a type I primer RN-N (Takara Shuzo) and BcaRN II 1-3 or primer M4. (Takara Shuzo Co., Ltd.) and PCR was performed using RNI II-S3 to check whether the full length of the RNaseHI II gene was included. As a result, it was found that the entire length of RNaseHI II was included, and this plasmid was designated as pBCA3P88.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of the plasmid pBCA3P88 obtained in Reference Example 3 (2) was determined by the dideoxy method.
  • the plasmid pBCA3P88 described in Reference Example 3_ (2) was transformed into a ⁇ type, and the Bca described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing was set with reference to the sequence around the RNaseHI II open reading frame obtained above.
  • RN III Nde and M13 primer M4 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • PCR was carried out in a volume of 1001.
  • the DNA polymerase used in the PCR was Pyropest DNA polymerase (Takara Shuzo) according to the attached protocol.
  • the PCR was carried out at 94 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and 72. ⁇ 30 cycle KoTsuta 3 minutes as 1 cycle at Flip.
  • the amplified DNA fragment of about 4 kb was digested with NdeI (Takara Shuzo), agarose electrophoresis was performed, and an about 1.4 kb NdeI fragment was recovered from the gel.
  • the obtained DNA fragment of about 1.4 kb was digested with NdeI and then dephosphorylated with alkaline phosphatase (Takara Shuzo).
  • PTV119Nd (NcoI site of pTVl19N was converted to NdeI site). Ligation was performed to transform Escherichia coli JM109.
  • 2 colony was a plasmid in which the RNase HIII gene in the NdeI fragment was connected to the downstream of the 1 ac promoter of the pTV119 Nd vector, and this plasmid was designated as pBCA3Nd2.
  • Escherichia coli JM109 transformed with the plasmid pBCA3Nd2 was named and displayed as Escherichia coli JM109 / pBCA3Nd2, and was filed on September 5, 2000 (Hara Deposit Date), east 1 1-chome 1
  • Reference Example 3 Escherichia coli JM109 transformed with pBCA3Nd2 obtained in (4) was inoculated into 2 liters of LB medium containing 100 / g / m1 ampicillin.
  • the cells were cultured with shaking at 7 ° C for 16 hours. After completion of the culture, the cells collected by centrifugation were transferred to 39.6 ml of a sonication buffer [5 OmM Tris-HC 1 (pH 8.
  • the heat-treated supernatant was applied to a RE SOUR SEQ column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) prepared with buffer A [5 OmM Tris_HC1 (pH 8.0), ImM EDTA], and the F PLC system (Amersham Pharmacia Biotech) was used. Chromatography. as a result, RNase HIII passed through the RE SOUR SEQ column.
  • the filtered RNase HIII fraction (7.5 ml) was concentrated by ultrafiltration using Centricon 10 (Amicone «), and 190 ⁇ l of the concentrated solution was added to 10 OmM NaCl, 0.
  • the solution was applied to a Superdex 200 gel filtration column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 50 mM Tris-HC1 (pH 7.0) containing EDTA, and eluted with the same buffer. It was eluted at a position corresponding to the molecular weight of kilodalton. This molecular weight corresponds to the case where RNaseHIII is present as a monomer.
  • the eluted RNase HII I was used as a Bca RNase HII I standard.
  • the enzymatic activity was measured by the following method using the BcaRNase HIIII standard obtained above.
  • the obtained cells were suspended in 4 ml of 25% sucrose, 50 mM Tris-HC1 (pH 8.0), and 0.4 ml of a 10 mg / ml salted lysozyme (manufactured by Nacalai Tesque) was added. Was added and reacted at 20 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, 24 ml of 15 OmM NaCl, 1 mM EDTA, 2 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 0.2 ml of 20 mg / m1 Proteinase K (manufactured by Takara Shuzo) were added to the reaction solution. ⁇ ⁇ Add 2 ml of 10% aqueous sodium lauryl sulfate solution. Incubated at C for 1 hour. After the completion of the reaction, phenol monochloroform extraction was performed, followed by ethanol precipitation to prepare about lmg of genomic DNA.
  • the PHI 650 gene is homologous with Pyrococcus furiosus's Kenom roster, which has been partially disclosed (University of Utah, Utah Genome Center website: http: // www. Genome. Utah, edu / sequence. Html). Search done. As a result, a sequence with a very high homology was found. Based on the obtained sequence, primers 1650 Nde (SEQ ID NO: 20) and 1650 Bam (SEQ ID NO: 21) were synthesized.
  • Reference Example 4 The Pyrococcus fryosas genome DNA obtained in (1), 200 ⁇ g, was subjected to PCR in a volume of 100 ⁇ 1 using 200 ⁇ g of ⁇ as a primer and 20 pmol of 1650 Nde and 20 pmol of 1650 Bam as primers. went.
  • DNA polymerase in PCR use Takara Ex tack (Takara Shuzo) according to the attached protocol, and perform PCR for 1 cycle at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. And performed 30 cycles.
  • the amplified DNA fragment of about 0.7 kb was digested with NdeI and BamHI (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and the obtained DNA fragment was treated with N of the plasmid vector pET3a (Novagene:).
  • NdeI and BamHI both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • N of the plasmid vector pET3a Novagene:
  • a plasmid pPFU220 integrated between deI and BamHI was prepared.
  • Reference Example 4 The nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pPFU220 obtained in (2) was determined by the didoxy method.
  • the sample was applied to a RE SOUR SEQU column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with [ImM EDTA], and chromatographed using an F PLC system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). As a result, RNase HII passed through the RE SOUR SE Q column.
  • the eHI I fraction was obtained.
  • the RNase HII fraction 2.Om1 was concentrated by ultrafiltration using Centricon-1 10 (manufactured by Amicon), and the concentrated solution of 2501 was concentrated to 50 mM Tris-HC containing 10 OmM NaC1, 0. ImM EDTA.
  • the sample was applied to a Superde X 200 gel filtration column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 1 (pH 8.0) and eluted with the same buffer. Eluted at This molecular weight is This corresponds to the case where RNase HII exists as a monomer.
  • the RNaseHII eluted in this manner was used as a PfuRNaseHII standard.
  • the enzyme activity was measured by the method described in Reference Example 3— (5). As a result, the Pfu RNase HII sample was Was observed.
  • thermotoga maritima (Thermotoga maritima) Purchased from Tsenorecnoletren GmbH: DSM3109) 85 C, static culture for 16 hours.
  • 915-F1 and 915-R1, 915-F1 and 915-R2, 915-F2 and 915-R1, or PCR was performed using 915-F2 and 915-R2 as primer pairs, respectively.
  • the DNA polymerase in the PCR was used according to the protocol provided with Takara Ex tack, and the PCR was performed at 95 ° C for 0.5 minutes, 55 ° C for 0.5 minutes, and 72 ° C for 1.5 minutes as one cycle. Performed 25 cycles.
  • each PCR reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified DNA fragment of about 0.7 kb was extracted and purified.
  • DNA amplified with the primer pairs 915—F1 and 915—R1 and 915—F1 and 915—R2 was digested with 11111 (1111, 13 & 1 (both manufactured by Takara Shuzo) and Hind.
  • Escherichia coli JM109 was transformed by ligating to pUC19 digested with III and XbaI using T4 DNA ligase, and the transformant was cultured to prepare a plasmid DNA into which about 0.7 kb of DNA had been inserted.
  • DNA amplified from 915-F1 and 915-R1 was inserted, and DNA amplified from 915-F1 and 915-R2 were inserted.
  • the plasmids No. 3 and No. 4 were obtained.
  • the ply of 915—F2 and 915—R1 and 915—F2 and 915—R2 The DNA amplified by the mer pair was double-digested with NcoI (Takara Shuzo) and XbaI, and double-digested with NcoI and XbaI to pTV111 N (Takara Shuzo). 4 Ligation was performed using DNA ligase, and E. coli JM109 was transformed.
  • This transformant was cultured to prepare a plasmid DNA into which about 0.7 kb of DNA had been inserted.
  • DNA amplified from 915-F2 and 915-R1 was amplified from plasmid Nos. 5 and 6, 6 and 915-F2 and 915-R2.
  • the plasmid No. 7 into which the DNA was inserted was obtained.
  • isopropyl-1-j8-D-thiogalatatopyranoside was added so that the final concentration became ImM, and the cells were further cultured under 1B with shaking. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, suspended in 1 ml of TE buffer, and sonicated.
  • RNase activity was expressed in E. coli.
  • the nucleotide sequence of a part of the DNA fragment inserted into the sumid was determined.
  • an open reading frame thought to encode RNaseHII was found.
  • the nucleotide sequence of this open reading frame is shown as SEQ ID NO: 143 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of RNase HII deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 144 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 144 the amino acid sequence of RNase HII deduced from the nucleotide sequence.
  • Reference Example 5 The pTM-RNH obtained in (2) was transformed into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli JM109 containing pTM-RNH was converted to 1 liter containing 100 g / m1 ampicillin.
  • the cells were inoculated into LB medium and cultured at 37 with shaking for 16 hours. After completion of the culture, the cells collected by centrifugation were collected in a 31.Oml sonication buffer (5 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 2 mM 2_mercaptoethanol, 10% glycerol, 2 mM phenyl). Methanesulfonyl fluoride] and sonicated.
  • This crushed liquid was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to a heat treatment at 70 ° C. for 15 minutes. Thereafter, centrifugation was again performed at 12000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a heat-treated supernatant of 32. Om1.
  • the solution was applied to a RE SOURSE Q column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 2 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol], and chromatographed using an F PLC system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • RNaseH II passed through the RE SOURSE Q column.
  • 32.5 ml of the passed RNaseH II fraction was applied to a RE SOURSE S column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with Buffer C, and a linear concentration gradient of 0 to 50 OmM NaCl was obtained using an FPLC system.
  • RNase II fraction eluted at about 240 mM NaCl was obtained.
  • This RNase II fraction 2.Om 1 to 5 OmM Na C It was applied to a PD-10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with Buffer C containing 1 and 3.5 ml of the obtained eluate was equilibrated with Buffer C containing 50 mM NaCl.
  • the sample was applied to a heparin column (Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with a linear gradient of 50 to 550 mM NaCl using an FP LC system.
  • an RNase II fraction eluted at about 295 mM NaCl was obtained.
  • the RNaseHII eluted in this manner was used as Tma RNaseHII standard.
  • the obtained cells were suspended in 4 ml of 25% sucrose, 50 mM Tris-HC1 (H 8.0), and 0.4 ml of 1 OmgZml lysozyme chloride (manufactured by Nacalai Tesque) was added. The reaction was performed at 20 ° C for 1 hour. After the reaction is complete, Was added with 24 ml of 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 0.2 ml of 2 Omg / m1 proteinase K (manufactured by Takara Shuzo) and 2 ml of 10% sodium lauryl sulfate aqueous solution. 1 dish at 37 ° C for 1 hour
  • Reference Example 6 Pirococcus horikoshii genomic DNA (10 Ong) obtained in (1) was converted into type III, and PCR was performed using a primer of 20 pmol of PhoNdeNde and 20 pmo of PhoBam as a primer. went.
  • Takara Ex tack (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used according to the attached protocol, and PCR was performed for 1 cycle at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. And performed 40 cycles.
  • the amplified DNA fragment of about 0.7 kb was digested with NdeI and BamHI (both from Takara Shuzo), and the obtained DNA fragment was digested with plasmid vector pET3a (Novagen).
  • plasmid vector pET3a Novagen
  • a plasmid pPHO238 integrated between NdeI and BamHI was prepared.
  • Reference Example 6 The nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pPHO238 obtained in (2) was determined by the dideoxy method.
  • the RNase HII fraction 35.Oml passed through was dialyzed twice for 2 hours using 2 L of buffer B [5 OmM Tris-HC1 (pH 7.0), ImM EDTA] as an external solution.
  • the dialyzed enzyme solution (34.5 ml) was applied to a RESOURSE S column (Pharmacia Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer B, and eluted with a linear gradient of 0 to 50 OmM NaCl using an FPLC system.
  • RN as eHI I fraction eluted at approximately 155 mM NaC 1 I got
  • Buffer B was added to this fraction 4. Oml so that the NaC1 concentration became 50 mM, and a Hi Trap- heparin column (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer B containing 5 OmM NaC1 ) And eluted with a 50-55 OmM NaCl linear gradient using an FP LC system. As a result, an RNAseHII fraction eluted at about 16 OmM NaCl was obtained.
  • This RNaseHI fraction 6.9 ml was concentrated by ultrafiltration using Centricon 10 (manufactured by Amicon), and the concentrated solution of 250 1 was divided into two portions to obtain 10 OmM NaCl, 0. ImM
  • the solution was applied to a Superose 6 gel filtration column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) containing EDTA, and eluted with the same buffer.As a result, RNaseHI was found to be 24. It was eluted at a position corresponding to a molecular weight of 5 kilodaltons. This molecular weight corresponds to the case where RNaseHII exists as a monomer.
  • the RNa sesHI I eluted in this manner was used as a PhRonase HI I standard.
  • the PhRNaSeHII sample obtained above and measuring the enzyme activity according to the method described in Reference Example 3- (5) the PhRNaSeHII sample showed that the RNaseH activity was Admitted.
  • primers AfuNde (SEQ ID NO: 151) and AfuBam (SEQ ID NO: 152) were synthesized based on the sequence of the AF0621 gene (SEQ ID NO: 150).
  • Reference Example 7 Alkaeoglobus fulgidas genomic DNA 30 ng obtained in (1) was transformed into type III, and AfuNde of 20 pmo1 and AfuBam of 20 pmo1 were used as primers. PCR was performed with the following volume. DN in PCR
  • pi-Vest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used according to the attached protocol. PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute as one cycle. Cycled.
  • the amplified DNA fragment of about 0.6 kb was digested with NdeI and BamHI (both from Takara Shuzo Co., Ltd.), and the obtained DNA fragment was treated with a plasmid vector pTVl19Nd (NcoI site of pTVl19N at NdI
  • the plasmid pAFU204 which was inserted between NdeI and BamHI of (converted to eI site) was prepared.
  • Reference Example 7 The nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pAFU204 obtained in (2) was determined by the didoxy method.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with pAFU204 obtained in Reference Example 7- (2), and the obtained Escherichia coli JM109 containing pAFU204 was transformed into 2 liter LB medium containing 100 ⁇ g / m1 ampicillin.
  • the cells were inoculated and cultured with shaking at 37 for 16 hours. After completion of the culture, the cells collected by centrifugation were separated by 37.lm1 sonication buffer (5 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride). And sonicated.
  • This crushed liquid was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to a heat treatment at 70 ° C for 15 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged again at 12000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a heat-treated supernatant of 40.3 ml.
  • the heat-treated supernatant was applied to a RES OUR SEQ column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer A [50 mM Tris-HC1 (pH 8.0), ImM EDTA], and the F PLC system (Amersham Bulmasia Biotech) was used. Chromatography). As a result, RNaseHI I passed through the RESOURSE Q column.
  • RNAseHI I passed through the RESOURSE S column.
  • the eluted RNaseHII was used as an AfuRNaseSeHI standard. Using the AfuRNase HI eI sample obtained above, the enzyme activity was measured by the method described in Reference Example 3- (5). f raw was recognized.
  • the cut number of Escherichia coli-derived RNaseH used in the method of the present invention was measured by the following method.
  • Reaction solutions for titration Final concentrations of 40 mM Tris-HCl (pH 7.7, 37 ° C), 4 mM magnesium chloride, 1 mM DTT, 0.003% BSA, 4% glycerol, 24 ⁇ poly (dT) It was prepared with sterile water.
  • Poly [8- 3 H] adenylic acid solution was dissolved in 370 kBq of poly [8- 3 H] Adeyuru acid solution 200 1 of sterile water.
  • Polyadenylic acid solution Polyadelic acid was diluted to 3 mM with sterile ultrapure water.
  • Enzyme diluent 25 mM Tris-HCl (pH 7.5, 3)
  • Calf thymus DNA 20 Omg It was suspended in 100 ml and swollen. The absorbance of the solution at UV 260 nm was measured and diluted with sterile ultrapure water to a concentration of lmg / ml. Next, the solution was heated at 100 ° C. for 10 minutes and quenched in a water bath.
  • reaction solution for total CIII and 501 of the blank were prepared by adding 1 ⁇ 1 of an enzyme diluent instead of the enzyme solution.
  • the unit number of each enzyme was calculated by the following formula.
  • Unit / ml ⁇ (Measured CPM—Planck CPM) X I. 2 * X 20X 1000 X Dilution rate) ⁇ 200 ⁇ ⁇ ⁇ ) / (Total CPMXY min X 50 ( ⁇ 1) X 9 **)
  • Enterohemorrhagic Escherichia coli O-157 was detected using the method of the present invention.
  • the primers used in this example are shown in SEQ ID NOs: 31 to 34 in the sequence listing.
  • the combination of SEQ ID NOs: 31 and 32 detects the sequence encoding O-157 vesicular toxin (VT, vero-toxin) 1
  • the combination of SEQ ID NOs: 33 and 34 detects the sequence encoding Vero toxin 2.
  • Type ⁇ is obtained by collecting a culture of enterohemorrhagic Escherichia coli O-157 (ATCC registration number 43895), suspending it in an appropriate number of cells with sterile water, and treating the extract at 98 ° C for 10 minutes. used. The composition of the reaction solution is shown below.
  • the type of buffer was changed and examined.
  • a primer used in this example a primer for DNA amplification having a sequence described in SEQ ID NOS: 39 and 40 in the sequence listing was used.
  • the reaction was performed as follows. That is, a mixture of 10 ⁇ of each of the above primers at 120 pm ⁇ 1 and a 0.01% propylenediamine aqueous solution, 10 ng or 1 ng of type I DNA was heat-denatured at 98 ° C for 2 minutes. Thereafter, the mixture was cooled in ice, and the primer was annealed to the type I DNA.
  • the type II was LDNA (Takara Shuzo Ne: L) and the amplified product (1005 bp) obtained by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 41 and 42 in the Sequence Listing was converted to Suprec 02 (Takara Shuzo). The product was used.
  • pUC 19 plasmid DNA A CR reaction was performed. The obtained amplified fragment was purified with Microcon 100, blunt-ended using DNAblintngkit (Takara Shuzo), and subcloned into the HincII site of pUC19 plasmid. Escherichia coli JM109 was transformed using the plasmid into which the amplified fragment was inserted. The transformant was cultured, and the DNA-inserted plasmid was purified from the cells using QIAGENplasmidminikit (manufactured by QIAGEN). This DNA insertion plasmid was used as type I.
  • the pUC19-150 plasmid DNA prepared by the above method was used as type I, and PCR-amplified with MCS-F and MCS-R primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 35 and 36 in the sequence listing.
  • the DNA fragment was type II.
  • the chimeric oligonucleotide primers include the MF2N3 (24) primer and the MR1N3 (24) primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 37 and 38 in the sequence listing. It was used. The combination of the primers gave an amplified fragment strength of about 350 bp.
  • a potassium monohydrate buffer system was selected, and a potassium phosphate buffer system and a tricine buffer system were used as controls.
  • the composition of the reaction solution is shown below.
  • Reaction solution A 10 ng of the above PCR amplified fragment, 50 pmol of each MF 2N3
  • Reaction solution ⁇ The following three types were prepared.
  • Potassium phosphate buffer system final concentration 35 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 1.2% DMSO, 0.0125% BSA, 5 mM magnesium acetate, 0.625 mM dNTP mixture each, 60 U
  • a reaction solution 401 containing E. coli RNase H and 5.5 U of Bea BEST DNA polymerase was prepared.
  • Tricine buffer system Final concentration 42.5 mM Tricine buffer (pH 8.7), 12.5 mM potassium chloride, 12.5 mM ammonium sulfate, 1.2
  • the above reaction mixture 98 was heat-denatured at 98 ° (for 2 minutes, cooled to 60 ° C or 65 ° C, and then allowed to stand on ice. Each of the above reaction mixtures was added to reaction solution A placed on ice. B was added and mixed to obtain a reaction solution of 501. The reaction solution was incubated for 1 hour at 60 ° C. or 65 ° C. After completion of the reaction, the mixture was cooled to 4 ° C., and 1/10 volume was reduced. The reaction was stopped by the addition of 0.5 M EDTA, and 3 ⁇ l of the reaction mixture was subjected to 3% nucleic acid 3: 1 agarose gel electrophoresis. The target amplified fragment was confirmed in the system. In particular, in the present example, it was confirmed that the mouse monohydric power and the real buffer system had the largest amount of amplification product and high reactivity.
  • Flavobacterium sp. SA-0082 (Japan 305-856 6 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 1-1-1-1, Chuo-No.6, Independent Administrative Institution, International Publication No. Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Center for Patent Biological Deposits, March 1995 (1995) as 295 FERM P-14872, and at 1-1-1, Tsukuba East, Ibaraki, 305-8566, Japan. 6. Deposited with the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) as FERM BP-5402 [Request for transfer to international deposit: February 15, 1996].
  • a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 or 44 in the sequence listing was used.
  • the genomic DNA derived from Flavobacterium sp. SA-0082 was designated as type III, and the PCR amplification product (573 bp) obtained by combining the primers described in SEQ ID NOs: 45 and 46 in the Sequence Listing was replaced with Suprec. Purified by O 2 (Takara Shuzo) was used as type I DNA. The reaction was performed as follows.
  • each of the two annealing solutions 50 OmM potassium chloride and 8 ⁇ m spermidin or 0.05% propylenediamine
  • a mixed solution containing 10 ng of the final solution containing 1 ng of the PCR amplified fragment was heat-denatured at 98 for 2 minutes. After denaturation, the primer was annealed to form ⁇ by quenching in ice.
  • Lane 1 is a molecular weight marker (100 bp ladder, manufactured by Takara Shuzo), and Lane 2 is propylene diamine / tricine ( Lane 3 is propylene diamine / hose (type l Ong), lane 4 is propylene diamine / hose (type 1 ng), lane 5 is propylene diamine Minnovicin (type 10 ng), lane 6 is propylenediamine Z bicin (type lng), lane 7 is 500 mM chloride and 8 aM spermidine Z bicine (type 10 ng), lane 7 Lane 8 is 50 OmM salted potassium and 8 ⁇ spermidine novicin (type I ng), lane 9 is a molecular weight marker (100 bp ladder), lane 10 is propylenediamine Z tricine (type lng), lane 11 Is 500 mM potassium chloride and ⁇ 8 / zM Spermidine / Tricine (translated lng), lane 12 is propylene
  • an annealing solution containing 50 OmM salted potassium + 8 spermidine was used to anneal the primer and type I DNA in any of the above three types of buffers.
  • the combination of the annealing solution containing 50 OmM potassium chloride + 8-spermidine and the bicine monohydric buffer solution was good.
  • Lane 1 is a marker (100 bp ladder)
  • lane 2 is 1 ng of type III and tricine / Combination of 50 OmM potassium chloride and 8 ⁇ spermidine
  • lane 3 is 1 ng of type III, 500 mM tricinnochloride rim and combination of 8 M spermidine
  • lane 4 is 10 ng of type 2 bicine /
  • Lane 5 is 1 ng of a combination of 500 mM chloride and 8 ⁇ spermidine
  • lane 5 is a combination of 50 ⁇ m spermidine and 50 ⁇ m spermidine
  • lane 6 is 10 ng of type 10 50 OmM potassium salt and 8 Ai M spermidine combination
  • lane 7 is lng type 1 ng / 500 mM chloride and 8 ⁇ m spermidine
  • lane 8 is molecular weight marker (100 b p ladder)
  • lane 9 is a combination of tricine / propylenediamine at 10 ng type II
  • lane 10 is a combination of tricine / propylenediamine at 1 ng type II
  • lane 11 is a combination of bicine / propylenediamine at 10 ng type II.
  • lane 12 is 1 ng type I and a combination of bicine / propylenediamine
  • lane 13 is 10 ng type II and is a combination of mouse and propylenediamine
  • lane 14 Is ⁇ type lng
  • Lane 15 is a molecular weight marker (100 bp ladder)
  • lane 16 is a 10 ng type III tricine / water combination
  • lane 17 is a mirror type 1 ng tricine / water combination.
  • lane 1 8 Is 10 ng of ⁇ type, combined with bicine Z water
  • lane 19 is 1 ng of ⁇ type, combined with bicine Z water
  • lane 20 is a mirror type
  • lane 21 is ⁇ Type 1 n is a combination of space / water.
  • the desired amplified fragment could be obtained in any of the combinations of the above three kinds of buffers and the above three kinds of annealing solutions regardless of the amount of type III DNA.
  • a larger number of amplified fragments could be obtained in the combination of the bicine buffer and the annealing solution containing 500 mM salt and 8 ⁇ m spermidine.
  • RTase reverse transcriptase
  • PFA Phosphonoformic acid
  • SEQ ID NOs: 47 and 48 in the sequence listing were used.
  • type I DNA the genomic DNA of E. coli O-157 was used as the type I DNA, and the PCR amplification product (57) was obtained using the primers described in SEQ ID NOs: 49 and 50 in the sequence listing. (6 bp) purified by Superrec 02 (Takara Shuzo) was used. The reaction was performed as follows.
  • each of the treatment liquids contained 0.625 mM dNTP mixture, 42.5 mM tricine potassium monohydroxide buffer (pH 8.5), 5.OmM magnesium acetate, 0.0125%
  • BSA peroxidase albumin
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 30 U E. coli RNase H 30 U E. coli RNase H
  • 11 U B ca BEST DNA polymerase To a concentration of 500 ⁇ g / ml or 50 ⁇ g / ml: PFA was added to bring the final volume to 501. The reaction was kept at 55 ° C for 1 hour. As a control, a system to which PFA was not added was similarly prepared.
  • Figure 3 shows the results.
  • Figure 3 shows reverse transcriptase activity. The results of the electrophoresis showing the effect of the sex inhibitor are shown, lane 1 is a molecular weight marker (100 bp ladder), lane 2 is without PFA, lane 3 is with 500 g / m1 PFA, lane 4 is This is the result of adding 50 ⁇ g / m 1 of PFA.
  • the relationship between the amplified fragment length and the detection sensitivity was examined.
  • a primer for amplifying O-157 verotoxin of the large S bacterium described in SEQ ID NOs: 51 to 53 in the sequence listing was synthesized. Furthermore, the chimeric oligonucleotide primer used in Example 4 was also used. The combination of the above primers and the amplified fragment length were 247 bp for the combination of SEQ ID Nos. 51 and 48 in the sequence listing, 168 bp for the combination of 52 and 53, 206 bp for the combination of 52 and 48, and 47 bp for the combination of 47 and 53. It is 173 bp in the combination of 135 bp and 47 and 48.
  • a purified 576 bp amplified PCR fragment prepared in Example 4 was used as type I DNA.
  • the reaction was performed as follows. That is, a mixture of the above primers of 60 pm o 1 and a 2 / ⁇ 1 0.05% propylenediamine aqueous solution, 10 fg to: After heat denaturation at 98 with a thermal cycler personal (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) for 2 minutes, the mixture was cooled to 55 ° C., and primers were annealed to form ⁇ .
  • the PCR conditions were 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, and 25 or 30 cycles. After completion of the reaction, 1 ⁇ l of the reaction mixture was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis in the case of the ICAN method and 5 ⁇ l in the case of the PCR method. See Table 1.
  • FIG. 135 10 fg Figure 4 shows the results of electrophoresis showing the detection limit for an amplified chain length of 135 bp in the ICAN method (migrating 150 volumes of the reaction solution) and the PCR method (migrating 10 volumes of the reaction solution).
  • lane 1 is a molecular weight marker (100 bp ladder)
  • lane 2 is 1 pg type II by the ICAN method
  • lane 3 is 100 fg type I by the CAN method
  • lane 4 is IC Lane 5 at 25 cycles of PCR, type 5 at 25 fgs, Lane 6 at 25 cycles of PCR, type 7 at 25 fgs, Lane 7 at 25 cycles
  • lane 8 is for 30 cycles of PCR and for 1 pg of type II
  • lane 9 is for 30 cycles of PCR
  • lane 10 is for 30 cycles of PCR. It is the case of type ⁇ 10 fg.
  • the reaction time of the method of the present invention was 70 minutes compared to the reaction time of about 80 minutes of the PCR method, and it was confirmed that the time required could be reduced.
  • Example 2 It has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39, 40 or 56 in the sequence listing; a primer for LDNA amplification was synthesized. The combination of the primers and the length of the amplified fragment are 151 bp for SEQ ID Nos. 39 and 40 in the sequence listing, and 125 bp for 56 and 40.
  • type II DNA prepared in Example 2 (1) was used. The reaction was performed as follows. That is, each 120 pmo 1 of the primer 2 1 of annealing solution (500 mM potassium chloride ⁇ Pi 8 W M spermidine), 1 f g ⁇ : a ⁇ of L ng was added, the total liquid volume with sterile water 10 It was set to ⁇ 1. The solution was heat-denatured at 98 ° C. for 2 minutes, and then rapidly cooled in ice to anneal the primer into a ⁇ form.
  • annealing solution 500 mM potassium chloride ⁇ Pi 8 W M spermidine
  • a primer for amplifying a chrysanthemum viroid gene having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 57 or 58 in the sequence listing was synthesized, and RNA derived from a viroid-infected chrysanthemum was prepared as type III by the method described in Japanese Patent Application No. 9-140383. Amplified fragment (total length 340 bp) It was prepared by insertion into Smid T 7 Blue T vector (Takara Shuzo). Escherichia coli JM109 competent cells (Takara Shuzo) were transformed with this, and cultured at 37 ° C for 16 hours in 5 ml of LB medium.
  • the cells were collected, and the plasmid was purified using QIAGEN P1 asmid Mini Kit (manufactured by QIAGEN) according to the manual. Perform concentration measurement Beckman DU 600 (manufactured by Beckman), prepared in sterilized water 1 mu 1 per plasmid concentrations 0, 1 f g, 10 fg , 100 fg, 1 pg, in 10p g, 100 pgl ng did.
  • the above prepared plasmid solution 11 was used as type I.
  • the primer used was a CSVD-F2 primer and a CSVD-R6 primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 59 and 60 in the sequence listing.
  • the reaction was performed as follows. That is, a mixed solution having a total volume of 101 containing the above-mentioned primers (50 pmo 1 each), each prepared plasmid solution (1 ⁇ l), and a final concentration of 0.01% propylenediamine was prepared. The mixture was heat-treated at 98 ° C for 2 minutes using a Thermal Cycler Personal (manufactured by Takara Shuzo), cooled to 60 ° C, kept for 1 minute, and stored on ice.
  • a Thermal Cycler Personal manufactured by Takara Shuzo
  • the above mixture was added to a final concentration of 20 mM in aqueous monobasic potassium buffer (pH 7.8), 10 OmM potassium acetate, l% DMSO, 0.01% BSA, 4 mM magnesium acetate, 500 M each
  • the dNTP mixture 3011 of £. RNaseH, 5.511; 6 ca BEST DNA polymerase was added and the final volume was made up to 501 with sterile water.
  • the reaction solution was set in a thermal cycler personal set at 60 ° C. in advance and reacted for 60 minutes. After the completion of the reaction, each reaction solution 3 ⁇ 1 was subjected to 3% agarose 3: 1 agarose electrophoresis.
  • the target amplification product (about 90 bp, about 70 bp, about 50 bp) could be confirmed up to a concentration of 10 fg type II.
  • the primers used in the method of the present invention were studied.
  • amplification primer was synthesized.
  • the primer was constructed to amplify a region of less than 160 bp with a GC content of about 20%.
  • the combination of the primer and the length of the amplified fragment are 126 bp for SEQ ID Nos. 43 and 62 in the sequence listing, 158 bp for 43 and 63, and 61 In the case of 91 bp, 61 and 63, it is 123 bp.
  • the type III DNA used was the PCR amplification product prepared in Example 3 (1). The reaction was performed as follows.
  • each of the above-mentioned primers of 120 pmo 1 the three kinds of the above-mentioned 21 kinds of eluent solutions (50 OmM potassium chloride and 8 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ spermidine, 0.05% propylene diamine or water) and 1 fg to 1 fg
  • eluent solutions 50 OmM potassium chloride and 8 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ spermidine, 0.05% propylene diamine or water
  • 1 fg to 1 fg A mixed solution having a total amount of 10 j1 containing 0 ng of type I was prepared.
  • the mixture was heat-denatured at 98 ° C. for 2 minutes, and then cooled on ice to anneal the primer to the ⁇ -form. After annealing treatment, add 0.65 mM dNTP mixture to each of the above mixed solutions.
  • the target amplified fragment was confirmed when the reaction temperature was 52 ° C.
  • more amplified fragments of interest were obtained in a combination of an annealing solution containing 500 mM chloride and 8 ⁇ m spermidine and a tricine or bicine buffer.
  • FIG. 5 and Table 3 show the Bramer pair, the amplified fragment length and the detection sensitivity at a reaction temperature of 52 ° C.
  • Fig. 5 shows the results of electrophoresis showing the relationship between the amplified fragment length and the amount of mold DNA when amplifying the AT-rich region.
  • Lane 1 shows the molecular weight marker (100 bp ladder 1) and lane 2 Is the amplified fragment length of 91 bp and type 1 g, lane 3 is the amplified fragment length of 91 bp and type 100 fg, lane 4 is the amplified fragment length of 91 bp and type 10 fg
  • lane 5 has an amplified fragment length of 91 bp and type 1 fg, lane 6 has an amplified fragment length of 123 bp and type 1 pg, and lane 7 has an amplified fragment length of 23 bp.
  • lane 8 has an amplified fragment length of 123 bp and for type 10 fg, lane 9 for an amplified fragment length of 126 bp and type 1 g, lane 10 has been amplified In the case of fragment length 1 26 b and type 1 100 fg, lane 11 is amplified fragment length 1 26 bp and type 10 fg, lane 1 2 is amplified fragment length 1 58 bp and mirror type In the case of 1 pg, lane 13 has an amplified fragment length of 158 bp and type I 100 f In the case of g, lane 14 is the case of type ⁇ ⁇ 10 fg with an amplified fragment length of 158 bp.
  • a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 47 in the sequence listing a primer having the base sequence of SEQ ID NOS: 64 to 66, and further a fourth base, a fifth base and a sixth base from the 3 ′ end 12014, 12215 and 122I6 primers whose bases are inosine deoxynucleotides respectively, a primer having a base sequence described in SEQ ID NO: 104 in the sequence listing, SEQ ID NOs: 67 to 69
  • 125 I6 primers were used.
  • the type I DNA prepared in Example 4 was used.
  • the reaction was performed as follows. That is, each of the 5 Opmo 1 primers, 2 ⁇ l of a 0.05% aqueous propylenediamine solution, 1 ng ⁇ ; A mixed solution of 10 ⁇ 1 in total volume containing L 0 ng of type I DNA and sterile distilled water was mixed at 98 ° C using a thermal cycler (Gene Amp PCR System 9600, manufactured by Applied Biosystems). C for 2 minutes, followed by cooling to 55 ° C and holding for 1 minute.
  • a thermal cycler Gene Amp PCR System 9600, manufactured by Applied Biosystems
  • FIG. 6 shows the results of electrophoresis showing the effect of the chimeric oligonucleotide primer containing inosine syndoxynucleotide when E. coli RNase H ⁇ t ⁇ Tth RNaseH was used. ⁇ Lane 9 ', E. c
  • Lane 1 is the molecular weight marker (100 bp ladder); Lane 2 is the primer pair described in SEQ ID NOs: 47 and 48;
  • type 1 ng for the I 4 and 123 I 4 primer pairs, type 1 ng, lane 4 is for the 121 15 and 124 15 primer pairs, type I lug, and lane 5 for the 12216 and 122 15
  • lane 6 is the primer pair described in SEQ ID Nos. 47 and 48 of the sequence listing and in the case of 10 ng of type II, lane 7 is a pair of 120 I4 and 123 I4
  • lane 8 is 10 ng of type II with 12115 and 1241 5 primer pairs
  • lane 9 is 1 ng type of primer for 12216 and 12525 primer pair.
  • lane 11 is for the 120 14 and 123 I 4 primer pairs
  • lane 12 is for the 121 I 5 and 124 I 5 primer pairs
  • lane 13 shows the sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, in the case of 1 ng of type II of the primer pair of 12216 and 12516 primers.
  • 10 ng of type I For the primer pair described in 7 and 48, 10 ng of type I, lane 15 is 120 14 and 12 3
  • 10 ng of type II For the pair of 4 primers, 10 ng of type II, lane 16 is 1 2
  • lane 17 is the case of 10 ng of type II with the pair of 122, 16 and 125, 16 primers.
  • the primer is a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 84 and 85 in the sequence listing, and further having three bases at the 3 'end (a-S or alpha-thio) ribonucleotide, that is, Oligonucleotide primers 1S and 4S, whose RNA portions have 5,1 phosphothioate linkages, were synthesized. Further, in the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 70 or 71 in the sequence listing, the 3 bases at the 3 ′ end and part of the sequence of the deoxyribonucleotide portion of the primer are ribonucleotides.
  • oligonucleotide primers 1N3N3 and 4N3N3 in which the 11th to 13th bases from the 3 'end of the primer were ribonucleotides were synthesized.
  • the DNA that was used as type ⁇ was prepared in Example 4.
  • the reaction was performed as follows. That is, a mixture of a total of 101 containing 50 pmo 1 of each primer, 2 ⁇ l of a 0.05% aqueous propylene diamine solution, 10 ng of type I DNA and sterilized water was subjected to thermal cycler. After heat treatment at 98 ° C. for 2 minutes, the mixture was transferred to ice and cooled.
  • the method of the present invention using a DNA polymerase having an E.co1iRNaseH activity in the presence of a specific metal ion was examined.
  • the chimeric oligonucleotide primer used in Example 2 (1) was annealed with 120 pmo of each, 2 ⁇ l of an annealing solution containing 500 mM chloride and 8 ⁇ spermidine, and 1 ng used in Example 2 (1). After heat-denaturing a mixed solution containing 10 ⁇ l of the type III DNA and sterile water in a total volume of 10 ⁇ l at 98 for 2 minutes, the primer was annealed to the type II by quenching in ice.
  • the mixture was added to each mixture with 0.625 mM dNTP mixture, 42.5 mM tricine monohydroxide potassium buffer (pH 8.5), 5.0 mM magnesium acetate, 0.0125% BSA, 1.
  • Figure 7 shows the results of the electrophoresis showing the results of the ICAN method using the RNase H activity of BcaBEST DNA polymerase. / E. co 1 i RNa se
  • lane 3 does not contain manganese chloride.
  • lane 4 shows 0.5 mM manganese chloride.In the case of ZE. In the case of adding ZE.
  • Coli R Nase H without addition of 5 mM manganese chloride
  • lane 6 was added with 5.0 mM manganese chloride / E.co1i
  • lane 7 was added with 10.0 mM chloride Shown is the case where manganese is added / E. Coli RNase H is not added.
  • the method of the present invention was studied on actual biological samples.
  • PCR amplification was also performed using the same type I under the conditions described in Example 5 (1). After completion of the reaction, the reaction solution 1 ⁇ 1 in the ICAN method and the reaction solution 51 in the PCR method were subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis. The results are shown in Table 4 and FIG. Table 4
  • Lane 8 shows the results of electrophoresis dynamic showing the ICAN method and PCR method Yore was Otsuki detection ⁇ O 157, the amplification chain length is 135 bp.
  • Lane 1 is the molecular weight marker (1 O Ob p ladder), cell 1 O 4 or Lane 2 in I CAN method, lane 3 10 3 cells I CAN method, lane 4 10 2 cells with IC AN method, lane 5 of 25 cycles 10 4 cells in PCR, lane 6 10 3 cells in 25 cycles of PCR method, lane 7 10 2 cells at 25 cycles of PCR, lane 8 10 4 cells in 30 cycles P CR, lanes 9 Is the case of 10 3 cells with 30 cycles of PCR, and Lane 10 is the case of 10 2 cells with 30 cycles of PCR.
  • the detection method of the present invention has a detection sensitivity equivalent to that of the PCR method and can be detected in a shorter time than the PCR method.
  • LDNA was detected using the primers of SEQ ID Nos. 40 and 56 in the sequence listings used in Examples 2 and 4.
  • the reaction was performed as follows. That is, an annealing solution containing each of the above-mentioned 120 pmo 1 primer, 21 500111] ⁇ potassium salt and 8 ⁇ permidine, 10 fg ⁇ : L ng; IDNA (manufactured by Takara Shuzo) and sterilized water A mixed solution having a total volume of 10 1 was prepared, subjected to thermal denaturation at 98 ° C for 2 minutes, and then rapidly cooled in ice to anneal the primer to the ⁇ type.
  • genomic DNA of the flavobacterium spp. (Flavobacterium sp. SA-0082) was used as type I, and it was used in Example 6 (1). Detection was performed using an image.
  • type I genomic DNA was prepared from flavopacterium bacteria cultured by the method described in WO 97/32010 pamphlet by a conventional method. The reaction was performed as follows.
  • Figure 9 shows the results of the electrophoresis showing the detection of the bacteria belonging to the genus Flavobacterium
  • lane 1 is a molecular weight marker (100 bp ladder)
  • lane 2 is a cyclinq
  • lane 3 is a ⁇ 10 pg
  • lane 4 is type I lpg
  • lane 5 is type 100 fg
  • lane 6 is type I 10 fg.
  • a method for detecting a target nucleic acid by a combination of the amplification method and the hybridization method of the present invention was studied.
  • Enterohemorrhagic E. coli O-157 was selected as a target.
  • Type I DNA was prepared by the method described in Example 8 (1).
  • For the amplified fragment length select a region of about 100 bp at a GC content of about 40%, and use the sequence number in the sequence listing as a primer. Nos. 51 and 72, VT2-IF20 and VT2-IR20-2 primers were used.
  • the reaction was performed as follows. That is, Aniringu solution, 0-10 4 cells correspond each cell number heat comprising each 50 pmo 1 VT2- I?
  • the above mixture was added to a final concentration of 20 mM in aqueous monobasic realm buffer (pH 7.8), 100 mM potassium acetate, 1% DMSO, 0.01% BSA, 4 mM acetic acid.
  • aqueous monobasic realm buffer pH 7.8
  • 100 mM potassium acetate 100 mM potassium acetate
  • 1% DMSO 1% DMSO
  • BSA 4 mM acetic acid.
  • Magnesium, each 500 ⁇ M dNTP mixture, 30 U of E. coli RNaseH and 5.5 U of BcaBEST DNA polymerase were added, and the final volume was adjusted to 50 ⁇ l with sterile water.
  • the reaction solution was set in a thermal cycler personal set at 55 ° C. in advance and held for 60 minutes.
  • PCR was performed using a thermal cycler personal along the manual street. PCR conditions were performed at 35 cycles, each cycle consisting of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. The time required for the reaction is about 4 minutes for one cycle, and the total time is about 145 minutes. At this time, the expected amplification product is 404 bp. After the completion of the reaction, each reaction solution 31 was subjected to 3% agarose 3: 1 agarose electrophoresis. The results are shown in Figure 28A.
  • Figure 28A shows the results of electrophoresis of enterohemorrhagic Escherichia coli ⁇ 157 verotoxin type II gene detection by the ICAN method and the PCR method.
  • Lane M1 shows the molecular weight marker (50-2000 bp) and lane M2 molecular weight markers (l OOB p Rada I)
  • lane N is negative control Honoré
  • lane 1 is 1 Senore equivalent
  • lane 3 10 2 cell corresponds
  • lane 5 is the case of 10 4 cells equivalent ⁇ .
  • Table 7 shows the results of comparison of the amplification amounts of the ICAN method and the PCR method in 1 and 10 cells. Table 7
  • PCR method 1 + + + 1 No amplification + ⁇ + + +: The degree of amplification is indicated in three stages. As shown in FIG. 28A and Table 7, both the detection method and the PCR method of the present invention were able to obtain an expected amplification product up to a reaction system using a hot water extract equivalent to one cell. Furthermore, the amplification product obtained by the ICAN method was subjected to dot hybridization using a VT2 oligonucleotide probe labeled with biotin at the 5 'end shown in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73 in the sequence listing. The zation was performed. Hybridization was performed under the following conditions.
  • the ICAN method of the present invention can be performed in 1/2 or less time for PCR when comparing the total time required for the amplification reaction. It was confirmed that the method was effective as a method for detecting pathogenic bacteria.
  • RNA derived from cultured cells as type III.
  • the reaction was performed as follows. Specifically, 1.5% of RAW264.7 cells (ATCC TIB 71) were added to Dulbecco's modified Eagle medium (12-604F) containing 10% fetal calf serum (manufactured by Gibco) in Dulbecco's modified Eagle medium (Bio-Wita Corporation).
  • X 10 5 / m 1 was suspended in the wells of a 6-well microtiter plate, and the cells were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. 50 ⁇ l of 100 ⁇ g / m 1 lipopolysaccharide (LPS, Sigma) aqueous solution and 50 a1 of 100 1 interferon- ⁇ aqueous solution (IFN- ⁇ , Genzaim Techne) After 4 hours of incubation, add RN easy Mini
  • RNA was prepared using Kit (Qiagen) according to the instructions of the kit.
  • Kit Qiagen
  • a category without addition of LPS and IFN- ⁇ was set.
  • RNA A mixture of 3 g of the RNA prepared above and 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 5 OmM KC1, 5 mM MgCl or 1 mM dNTP, 150 pmo1 random 6 mers primer, 60 U ribonuclease Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.), 15 U of Reverse Transcriptase XL (AMV) (Takara Shuzo Co., Ltd., 262 OA), a total volume of 60 ⁇ l was applied to the Thermo Recycler (Gene Amp PCR System 9600, Applied Dubai) After incubation at 30 ° C for 10 minutes and then at 42 ° C for 1 hour, cDNA was prepared by heating at 99 ° C for 5 minutes to inactivate the enzyme.
  • Tris-HCl buffer pH 8.3
  • 5 OmM KC1 5 mM MgCl or 1 mM dNTP
  • nucleotide sequence of the mouse inducible NO synthase (iNOS) mRNA GeneBank accession No. NM-010927
  • primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 74 and 75 in the sequence listing were synthesized.
  • primers of SEQ ID NOs: 76 and 77 in the sequence listing were also synthesized.
  • Control PCR was performed as follows. That is, 10 XEx Taq buffer (Takara Shuzo) containing 50 pmo 1 of primer and 1 ⁇ l of cDNA (equivalent to 50 ng of RNA) 5 ⁇ l, 1.25 U Takara
  • Ex-Tac DNA polymerase (Takara Shuzo), 0.2 mM dNTP mixture, 50 ⁇ l total reaction volume using a thermal cycler, 1 cycle of 94 ° C for 2 minutes, then 94 ° C for 30 seconds
  • the reaction was carried out using a 30-cycle program with 30 seconds at 55 ° C and 30 seconds at 72 ° C, and a 1-cycle program at 5 minutes at 72 ° C.
  • the sample was frozen and stored at 120 ° C until analysis.
  • 5 ⁇ l of each reaction solution was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis.
  • Figure 10 shows the results.
  • Figure 10 shows the results of electrophoresis showing the comparison between the RT-ICAN method ( ⁇ ) and the RT-PCR method ( ⁇ ).
  • Lane 1 shows the molecular weight marker (100 bp ladder), and Lane 2 shows the negative control.
  • Lane 3 is the LPS, IFN- ⁇ treatment section.
  • E.co 1 iRNase H Since the optimal temperature of E.co 1 iRNase H was 37 ° C, it was considered that it was inactivated during the amplification reaction of the present invention. Therefore, the c ⁇ -type DNA, whose influence on the amplification reaction by further adding E.co1iRNaseH during the amplification reaction, was examined, was inserted into the cauliflower mosaic virus 35S promoter and the EP SPS gene.
  • GMO-S1, S2, Al, and A2 primers having the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 80 to 83 in the sequence listing were used.
  • the reaction was performed as follows. That is, a mixed solution having a total volume of 10 ⁇ l was prepared using 50 pmo 1 of each of the above primers, a final concentration of 0.01% propylenediamine, lpg to 10 ng of type III DNA, and sterile water. The mixture was heat-denatured at 98 ° C. for 2 minutes, cooled to 55 ° C., and annealed.
  • the above mixed solution was added to the above mixture at a final concentration of 500 ⁇ dNTP mixture, 34 mM tricine monohydroxide potassium buffer (pH 8.7), 4.OmM magnesium acetate, 0.01% BSA, 1% DMSO, 30 U E E. coli RN as eH, 5.5 U Bea BEST DNA polymerase was added, and the final volume was adjusted to 50 ⁇ l with sterile water.
  • the reaction solution was kept at 55 ° C for 25 minutes in a thermal cycler. Twenty-five minutes after the start of the reaction, 3011 of £. RNaseH was further added, and the mixture was kept at 55 ° C for 30 minutes.
  • a sample kept at 55 ° C for 55 minutes was also prepared. After completion of the reaction, 3 ⁇ l of the reaction solution was subjected to 3% agarose electrophoresis. As a result, at any concentration of type I DNA, any combination of primers, S 1 / A1, S 1 / A2, S 2 / Al, and S 2ZA2 was able to react E. coli RNaseH during the reaction. It was confirmed that the amplification improved the amplification efficiency.
  • the combination of the method of the present invention for amplifying or replicating the nucleic acid to be type III and the method of the present invention was examined.
  • the reaction was performed as follows. That is, a plasmid containing the chrysanthemum viroid gene prepared in Example 5 (3) and replicated in E. coli Then, in vitro transcription was performed using T7 RNA polymerase (Takara Shuzo) to obtain an RNA replication fragment.
  • CDNA was synthesized using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 57 and 58 in the Sequence Listing and a cDNA synthesis kit (Takara Shuzo).
  • the amplification reaction was performed by the method described in Example 5 (3) using the cDNA fragment and the above-mentioned replication plasmid as mirror-type. As a result, it was confirmed that the method of the present invention can be used even when the nucleic acid to be type III is replicated in the form of a plasmid, and when the RNA is replicated into RNA by replication using RNA polymerase.
  • Oligonucleotide primers NS 1 and NS 2 described in SEQ ID NOs: 86 to 87 in the sequence listing were synthesized according to the nucleotide sequence of the mouse inducible NO synthase (iNOS) mRNA.
  • iNOS mouse inducible NO synthase
  • the target amplification product could be confirmed up to the amount of type 100 fg.
  • RAW264.7 cells ATCC TIB 71
  • Dulbecco's modified Eagle's medium manufactured by Bioweicha
  • 10% fetal serum manufactured by Gibco. 5 ml was added to each well of a 6-well microtiter plate, and the cells were subcultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide at 37 ° C. 5 for each cell
  • RNA was prepared using Kit (Qiagen, 74104) according to the kit instructions.
  • Kit Qiagen, 74104
  • a category without addition of LPS and IFN- ⁇ was set.
  • RNA 3 ⁇ g of RNA prepared as above and 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 5 OmM KC 1, 5 mM MgCl 1 mM dNTP mixed solution, 15 O pmol Random 6me rs, 60 U R ibo nuclease I nh ibitor (Takara Shuzo Ne Ring), 15U Reverse Trans anscr
  • each CDNA solution 1 1 (50 ng of RNA) or 10 ⁇ l, 100 ⁇ , 1000 ⁇ , 10000 ⁇ diluted with water 1 ⁇ l, and a mixture of 0.5 mM dNTP, 32 mM potassium hydroxide buffer solution (pH7. 8), 10 OmM potassium acetate, 4. magnesium Omm acetate, 0. 01% BSA, 1 0 /0 DMSO, 0. 0156 of P fu RNa s eH, of 0. 66U B ca
  • a total volume of 501 containing BEST DNA polymerase was kept in a thermal cycler at 60 ° C for 1 hour. Samples after the reaction were stored frozen at 20 ° C until analysis.
  • PCR was performed as a control. 50 pmo 1 each of primers NS 3 and NS 4 and cDNA solution ⁇ ⁇ ⁇ (for 50 ng of RNA) or 10 times with water
  • FIG. 12 shows the results. That is, FIG. 12 shows the results of the detection of the iNOS gene by the ICAN method and the PC method using PfuRNase H. Lane 1 shows the lO Obp DNA ladder marker, and lane 2 shows the 10000 negative control cDNA.
  • Double-dilution sample lane 3 is 1000-fold diluted sample of negative control cDNA, lane 4 is 100-fold diluted sample of negative control cDNA, lane 5 is 10-fold diluted sample of negative control cDNA, and lane 6 is negative control cDNA
  • Lane 7 LPS and IFN- ⁇ -division cDNA 1000-fold diluted sample
  • Lane 8 LPS and IFN-1000-diluted cDNA-digested cDNA sample
  • Lane 9 LPS and IFN — 100-fold diluted sample of Y-category cDNA
  • lane 10 is LPS and IFN — 10-fold diluted sample of ⁇ -category cDNA
  • lane 11 is the undiluted sample of LPS and IFN10 / category cDNA.
  • Oligonucleotide primer 4 and oligonucleotide primer 15 described in SEQ ID NOs: 90 to 91 in the sequence listing were synthesized according to the base sequence of (1).
  • Oligonucleotide primer 4 is a primer in the sense direction with a GC content of 75%
  • oligonucleotide primer 5 is an antisense primer with an GC content of 80%.
  • Figure 13 shows the results.
  • Figure 13 shows the results of the ICAN method using Thermo toga ma riti ma RNase HII.
  • Lane 1 shows the molecular weight marker (100 bp)
  • lanes 1 and 2 show the reaction temperature of 60 ° C. C
  • lane 3 shows the reaction temperature of 65 ° C
  • lane 4 shows the reaction temperature of 70 ° C.
  • Type I 11 of L 0 pg and 0.4N NaOH 1 / zl were mixed and incubated at 37 ° C for 5 minutes to denature Type I.
  • the type used here was iNOS cDNA obtained by purifying a PCR-amplified fragment (74 1 bp) described in Example 13 with Suprec 02 (Takara Shuzo).
  • each of the denatured forms was neutralized with 0.4N HC111, and subsequently, each of the above 50 pmo1 NS1 and NS2 primers, 0.5 mM dNTP mixed solution, and 32 mM were added.
  • Potassium monohydroxide buffer solution pH 7.8
  • lO OmM potassium acetate 4.OmM magnesium acetate
  • BSA 1.0% DMSO
  • Figure 14 shows the results.
  • Fig. 14 shows the results of the ICAN method using the denatured type II, lane 1 was a molecular weight marker (100 bp), lane 2 was type 10 fg, lane 3 Is for type II 100 fg, lane 4 is for type I lpg, and lane 5 is for type I 10 pg.
  • FIG. 15 shows the results of the electrophoresis.
  • FIG. 15 shows the results of electrophoresis of the amplification method of the present invention in the absence of the type II DN denaturation step.
  • Lane 1 is a 100 bp DNA ladder marker
  • Lane 2 is a negative control (water)
  • 3 for 10 fg ⁇
  • lane 4 for 100 fg ⁇
  • lane 5 for 1 pg ⁇
  • lane 6 for 10 pg ⁇
  • lane 7 for 100 pg ⁇ . .
  • the target amplification product could be confirmed up to the amount of type 1 of 1 pg.
  • FIG. 16 shows the results.
  • FIG. 16 shows the results of electrophoresis of the method of the present invention when the circular double-stranded DNA was changed to type I without denaturation treatment.
  • Lane 1 was a 100 bp DNA ladder marker, and lane 2 was a negative control (water ), Lane 3 is 10 fg type II, lane 4 is 100 fg type II, lane 5 is type I lpg, lane 6 is type 10 pg, lane 7 is type 100 pg, and lane 8 is type II This is the case for Ing.
  • Example 19 The detection of the human papillomavirus type 16 gene using the method of the present invention was examined.
  • type ⁇ CaSkicell, a cell infected with human papillomavirus type 16 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., has 500 copies of human papillomavirus type 16 per ce11) DNA was used.
  • the primer for detecting HP VI6 an HPV 16 S3 primer and an HPV 16 A2 primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 96 to 97 in the sequence listing were used.
  • the amplification product obtained from the primer pair is about 120 bp. The reaction was performed as follows.
  • the above type I DNA is lpg, 3 pg, 30 pg, 100 pg, 300 pg, Ing, 3 ng, 10 ng, 50 pmo 1 each of HPV16 S3 primer and HPV16 A2 primer,
  • a mixed solution 10 I containing a final concentration of 0.01% propylenediamine was prepared. This mixture was kept at 98 ° C for 2 minutes and 55 ° C for 1 minute in a thermal cycler personal, and then placed on ice. The mixture was added to a final concentration of 2 OmM potassium potassium hydroxide buffer (pH 7.8), lO OmM potassium acetate, l% DMSO, 0.01% BSA, 4 mM magnesium acetate, 5 mM each.
  • each reaction solution 31 was subjected to 4% nucleic acid 3: 1 agarose electrophoresis.
  • the results are shown in Figure 17A. That is, Fig. 17 shows the results of detection of the HPV16 gene using the 1 CAN method and the PCR method.
  • Lane M1 shows the molecular weight marker (100 bp ladder)
  • Lane M2 shows the molecular weight marker (50-2000 bp)
  • Lane 1 has no type II
  • lane 2 has type Ipg
  • lane 3 has type III 3 pg
  • lane 4 has type III 30 pg
  • lane 5 has type II 100 pg
  • lane 6 has type III 300 pg
  • lane 8 is type 3 ng
  • lane 8 is type 3 ng
  • lane 9 is type I This is the case of 10 ng.
  • reaction products were subjected to dot hybridization using an oligonucleotide HPV16 probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 98 in the sequence listing. Hybridization was performed under the conditions described in Example 9. The results are shown in Figure 17B. That is, Fig. 17B shows the results of dot hybridization detection of the HPV 16 gene by the PCR method and the ICAN method. Lane 1 has no ⁇ , lane 2 has l lpg, and lane 3 has ⁇ .
  • Type DNA DNA prepared by a conventional method from 6 clinical specimens with informed consent was used. Samples prepared from this clinical specimen are those for which the type of infected HPV has been determined by PCR.
  • the detection primer the HPV 16 S3 primer and the HPV 16 A2 primer described in Example 19 were used.
  • a DNA sample from a type II clinical specimen was prepared using TE buffer so as to be lOOng per ⁇ m. Except for the amount of the mold, the reaction was performed under the reaction solution composition and reaction conditions described in Example 19. In addition, the negative control does not contain type I DNA, and the positive control is HP V
  • Fig. 18A shows the results of detection of the HPV 16 gene from a clinical sample
  • Lane M shows the molecular weight marker
  • Lanes 1-6 are for clinical specimens
  • Lane 7 is for negative control
  • Lane 8 is for positive control.
  • Fig. 18B shows the results of dot hybridization detection of the HPV16 gene from the clinical sample. Lanes 1 to 6 show the clinical sample, Lane 7 shows the negative control, and Lane 8 shows the positive control. It is the case.
  • RNA PGR kit AMV
  • a mixed solution containing 50 pmo1 of each of the above primers, each reverse transcription reaction solution 31 and a final concentration of 0.01% propylenediamine in a total volume of 11 was prepared.
  • Sterile water 31 was used as a blank.
  • the mixture was heat-treated at 98 ° C for 2 minutes with a thermal cycler personal, rapidly cooled to 60 ° C, held for 1 minute, and stored on ice.
  • the above mixture was mixed with the final concentration of 20 mM overnight at room temperature with a monobasic hydroxide buffer (pH 7.8), 10 OmM potassium acetate, l% DMSO, 0.01% BSA, 4 mM magnesium acetate, and 500 mM each. / zM dNTPs, 3 OU of E. coli-derived RNase H and 5.5 U of Bea BEST DNA polymerase were added, and the final volume was adjusted to 50 ⁇ l with sterile water.
  • the reaction solution was set on a thermal cycler MP set at 60 ° C. in advance and reacted for 60 minutes.
  • Fig. 19A shows the results of HCV detection from clinical specimens.
  • Lane B was sterilized water type III
  • lane 1 was a healthy sample
  • lanes 2 to 6 were HCV patients.
  • Sample, lane M is a molecular weight marker (50-2000 bp).
  • RNA sample derived from an HCV patient can obtain an amplification product of about 107 bp expected from the nucleotide sequence of the HCV genome. I could't get it. Further conditions described in Example 9 Then, dot hybridization was carried out on the ICAN amplification product using an HCV probe having a 5 ′ end biotinylated as described in SEQ ID NO: 103 in the sequence listing. The results are shown in FIG. 19B. In FIG. 19B, the samples in each lane are the same as in the case of electric swimming.
  • the method of detecting adenovirus was examined.
  • E1A tumor gene
  • E1A-2 antisense direction
  • E1A-3 antisense direction
  • Form ⁇ was prepared as follows. 8.Incubate 100 ⁇ l of 73 X 1 O 10 PFU / m1 adenovirus solution with a final concentration of 0.1% SDS-0.2 mg Zm1 proteinase K solution at 37 ° C for 1 hour, then remove the DNA using silica gel. Adsorbed and purified.
  • E1A-1 and E1A-2 primers amplified chain length of 12 bp
  • E1A-1 and E1A-3 primers amplified chain length of 91 pmo1 each
  • E1A moon lunar ulcer gene
  • Primers for amplification of E1A having the same type I as described above and the base sequences of SEQ ID NOs: 107 to 108 and 142 in the sequence listing E1A-1P (sense direction); 1A-2P (antisense direction) and E1A-3P (antisense direction) were constructed. Detection by PCR was performed using primers. PCR was performed as follows.
  • E1A-1P and E1A_2P primers (amplified chain length of 112 bp) or ElA-IP primers and E1A-3P primers (amplified chain length of 91 bp) for each 60 pmo1 )
  • 10 XEx Taq buffer (Takara Shuzo) 5 ⁇ l, 1.25 U Takara Ex Taq DNA polymerase (Takara Shuzo)
  • 0.2 mM dNTP s total volume of 501 PCR solution was prepared.
  • PCR conditions are 94 ° C, 30 seconds, 55 ° C, 3
  • FIG. 20 shows the results of detection of the virus ⁇ 1 ⁇ gene from adenovirus particles.
  • Lanes 1 to 10 show the results for the combination of the primers E1A-1 and E1A-2.
  • Lanes 11-20 show the results for the combination of primers E1A-1 and E1A-13.
  • Lane 1 is molecular weight markers (10 OBP ladder)
  • lane 2 is 10 6 I CAN method (PFU equivalent DNA)
  • lane 3 10 5 IC AN method
  • lane 4 10 4 I CAN method
  • lane 5 10 3 by ICAN method
  • lane 6 is molecular weight marker (10 Obp ladder)
  • lane 7 is 10 6 by PCR method
  • lane 8 is the case of 10 5 by PCR
  • lane 9 is the case of 10 by PCR
  • lane 10 is the case of 10 3 by PCR.
  • Lane 11 Molecular weight markers (10 OBP ladder), lane 12 10 6 I CAN method (PFU equivalent D NA), lane 13 5 10 I CAN method, Lane 14 10 4 IC AN method, Les over down 15 I cAN method at 10 3, lane 16 molecular weight markers (10 OBP Rada I), 10 6 in lane 17 the PCR method (PFU equivalent DNA), lane 18 10 5 PC R method, lane 19 PCR method in 10 4, lane 20 is the case of 10 3 by PCR. 9
  • retrovirus-infected cells The detection of the integrated virus gene from retrovirus vector-infected cells was examined.
  • Preparation of retrovirus-infected cells and genomic DNA preparation were performed as follows. That is, the vector plasmid pDON-AI (Takara Shuzo) was introduced into the packaging cells GPE + 86 by the calcium phosphate method, and an ecotropic vector was prepared from the culture supernatant of the introduced cells.
  • the NIHZ3T3 cells were infected with a histopathic vector and cultured for 14 days in a medium containing G418 to prepare virus vector-infected cells. From 4 ⁇ 10 4 retrovirus-infected cells thus prepared, genomic DNA 21 IX ⁇ of retrovirus-infected cells was obtained by a conventional method.
  • the primers pDON-AI-11 and pDON-AI-2 described in Example 18 (1) were used as the primers.
  • the reaction was performed as follows. In other words, the thermal cycler was performed in a reaction system containing 10 ng of the above-mentioned primers, 2 ⁇ 1 of a 0.25% propylene diamine aqueous solution of 2 ⁇ 1, and 1000 ng to 0.1 ng of type I genomic DNA in a total volume of 10 ⁇ l. After one minute (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) at 98 ° C for 2 minutes, the primer was annealed to type I by heat treatment at 60 ° C.
  • the reaction was kept in a thermal cycler at 60 for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction solution (5-1) was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis.
  • SEQ ID NO: 111 to: L1 PCR was performed using the pDON-AI-13 and pDON-AI-14 primers described in 2.
  • PCR contains 100 ng to 0.1 ng of the above type II, 60 pmol of each of the above primers, 5 ⁇ l of 10 XE xT aq buffer, 1.25 U of Takara Ex tack polymer, 0.2 mM dNTPs
  • a total of 50 ⁇ l of the reaction solution was prepared, and the reaction was performed using a Thermal Cycler Personal for one cycle consisting of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.
  • FIG. 21 shows the results. That is, FIG. 21 shows the results of detection of the integrated viral gene from one infected cell of the retrovirus vector by the ICAN method and the PCR method.
  • Lane 1 shows the molecular weight marker (100 bp ladder)
  • Lane 2 is for 1000 ng type II
  • lane 3 is for 100 ng type II
  • lane 4 is for 10 ng type II
  • lane 5 is for type I lng
  • lane 6 is for type I 0.1ng.
  • the desired amplification product was confirmed up to In type I DNA by the ICAN method and up to 1 ng type II in 35 cycles by the PCR method.
  • E. coli O-157 verotoxin type I gene a method for detecting a target nucleic acid by a combination of the amplification method and the hybridization method of the present invention was examined.
  • a target enterohemorrhagic Escherichia coli O-157 verotoxin type I gene was selected.
  • Type I DNA was prepared by the method described in Example 8 (1).
  • As the amplification region a region of about 80 bp with a GC content of about 40% was selected.
  • primers VT 1 -IF 4 and VT 1 -IV 4 represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 113 and 114 in the sequence listing were used.
  • An IR 1 primer was used.
  • the reaction was performed as follows. That is, each 6 O p mo 1 of VT 1 - IF 4 and VT 1-IR 1 primers, final concentration 0.0 1% propylene Jiamin from 0 1 0 5 cells correspond each cell numbers thermal extract ⁇ Pi sterile water was used to prepare a mixed solution having a total volume of 5 ⁇ l.
  • the mixture was heat-denatured at 98 ° C. for 2 minutes in a Thermal Cycler Personal, rapidly cooled to 55 ° C., kept for 1 minute, placed on ice, and subjected to an annealing treatment.
  • the above mixture was added to a final concentration of 20 mM in aqueous monobasic realm buffer (pH 7.8), lO OmM potassium acetate, l% DMSO, 0.0 Add 1% BSA, 4 mM magnesium acetate, 500 ⁇ M dNTPs each, 15 U of Escherichia coli RNaseH and 2.75 U of Bea BEST DNA polymerase, and bring the final volume to 25 ⁇ 1 with sterile water. did.
  • the reaction solution was set in a Thermal Cycler Personal set at 55 ° C. in advance and held for 60 minutes.
  • PCR was performed on the above-mentioned heat extract using a Thermal Cycler Personal as described in the manual using O-157 Tying Set (Takara Shuzo). PCR conditions were performed at 35 cycles, each cycle consisting of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. The reaction takes about 145 minutes. At this time, the expected amplification product is 349 bp. After the reaction was completed, 3/1 of each reaction solution was subjected to 3% nucleic acid 3: 1 agarose electrophoresis.
  • Figure 22 shows the results of the ICAN method.
  • Fig. 22 shows the results of detection of the O-157 verotoxin type I gene.
  • Lane M is a molecular weight marker (50-2 OO Ob p)
  • Lane N is 1 when sterilized water is type II
  • lane 1 is 1 cell considerable ⁇
  • lane 2 10 cells equivalent ⁇ is 1 cell considerable ⁇
  • lane 3 10 2 cell Le corresponding mirror type is for the 10 3 cells equivalent ⁇ .
  • Table 10 shows the detection results of the ICAN method and the PCR method.
  • Amplification amount is shown in three stages. As shown in Table 10, thermal amplification of 1 cell equivalent amount of amplification products that are expected in both the ICAN method and the PCR method A reaction system using the liquid was obtained. Further, the amplification product was subjected to dot hybridization using a VT1 oligonucleotide probe having a 5, terminal end labeled with biotin represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 115 in the sequence listing. Hybridization was performed under the conditions described in Example 19. The results were the same as the above electrophoresis results. That is, it was confirmed that the detection sensitivities of the ICAN method and the PCR method were equivalent. Furthermore, comparing the total time required for the amplification reaction, the ICAN method of the present invention can be performed in less than 1/2 It was confirmed that it was effective as a method for detecting bacteria and the like.
  • botulinum type A toxin gene was examined.
  • type I DNA prepared from Clostridium botulinum (Clostriudiumbotiilinum, a food poisoning case strain, typeA-190) was used.
  • the strain is a strain that is stored in the Women's Nutrition University School of Hygiene.
  • detection primers the BotAS2 primer and the BotAA2 primer represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 116 to 117 in the sequence listing were synthesized.
  • An amplification product of about 150 bp is obtained with the primer pair.
  • the type A toxin-producing Clostridium botulinum DNA, which is type II, was prepared in sterile water at 100 fg, 1 pg, 10 pg, and 100 pg per ⁇ l. The reaction was performed as follows.
  • PCR was performed with Thermonor Recycler Personal Inc. using a set of primers for detecting botulinum type A toxin gene BAS-1and BAS-2 (manufactured by Takara Shuzo) according to the method described in the manual. At this time, the expected amplification product is 284 bp.
  • FIG. 23A shows the results of detection of the Porulinus type A toxin gene by the ICAN method and the PCR method.
  • Lane M1 shows the molecular weight marker (100 bp ladder), and lane M2 shows the molecular weight marker (50 20200 O bp marker), lane 1 is without type II, lane 2 is with 100 fg type II, lane 3 is with 10 pg type II, and lane 4 is with 100 pg type II.
  • the expected amplification product was obtained up to the reaction using 100 fg of type I DNA in the ICAN method, but expected in the reaction using 100 fg of type II DNA in the PCR method. No amplification product was obtained. Furthermore, these products were subjected to dot hybridization using a Boot A probe represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 118 in the sequence listing. Dot high pri It carried out similarly to the conditions of Example 9. The result is shown in FIG. 23B. As shown in FIG. 23B, a signal was confirmed up to 100 fg in type I in the ICAN reaction, and up to 10 Pg in type II in the PCR reaction, which was confirmed to be consistent with the above electrophoresis results.
  • chrysanthemum viroid A 10-fold dilution series of low-molecular-weight RNA obtained according to the method of extracting low-molecular-weight RNA from chrysanthemum viroid (CSVd) -infected chrysanthemum described in Example 1 was prepared.
  • the reverse transcription reaction was performed using RNA PCR kit (AMV) ver 2.1 (Takara Shuzo). That is, as a reverse transcription reaction solution, 1 X RNA PCR Buffer, 5 mM MgCl 2 , ImM dNTPs, 20 U RNase Inh ibitor,
  • the primer used was a CSVD-F4 primer and a CSVD-R3 primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 119 and 120 in the sequence listing.
  • the reaction was carried out under the same conditions as in Example 19 except that the reaction temperature was 60 ° C. and the thermal cycler MP was used. After completion of the reaction, each reaction solution 31 was subjected to 3% nucleic acid 3: 1 agarose electrophoresis.
  • PCR amplification was performed in a 50 IX 1 reaction system using 1 ⁇ l of the same reverse transcription reaction solution as type II.
  • the primers used at this time were F94 and R264 primers described in SEQ ID NOS: 109 and 110 in the sequence listing.
  • the reaction was performed as follows. That is, a reaction solution was prepared using TaKaRa PCR Amification Kit according to the protocol, and each reverse transcription reaction solution 1 ⁇ 1 was added to each primer using 1 Opmo 1 to make a total volume of 50 ⁇ 1, and the thermal cycler was prepared.
  • the amplification reaction was carried out according to ⁇ .
  • the reaction conditions were 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. After completion of the reaction, each reaction solution 5At1 was subjected to 3% absorptive 3: 1 agarose electrophoresis. Table 1 shows the results. Shown in 1. Table 11 ⁇ ⁇
  • I CAN amplification products and PCR amplification products were confirmed to be the target products by dot hybridization.
  • Dot hybridization was carried out using a C SV d probe having the base sequence described in SEQ ID NO: 121 in the sequence listing and labeled with biotin at the end. The hybridization was performed under the conditions described in Example 9. The results are consistent with the results above electrophoresis, signals were obtained until RNA sample IC AN in 1 0 3 fold dilutions, signals were obtained up to R NA samples PCR in 10 doubling dilutions. The results showed that ICAN was more sensitive than PCR.
  • chrysanthemum viroid (CSVd) -infected chrysanthemum using PfuRNaseH A 10-fold dilution of the RNA prepared in Example 26, 3 ⁇ l and 1 OmM Tris-hydrochloride buffer (pH 8.3), 5 OmM sodium chloride, 5 mM magnesium chloride, ImM dNTP mixed solution, 15 O pmol
  • a total of 60 ⁇ l containing Radon om 6 me rs, 60 U of Ribo nuclease Inhibitor (Takara Shuzo Ne Ring), and 15 U of Reverse Transcriptase XL (AMV) (Takara Shuzo) was added to a thermal cycler (Ge ne Amp PCR System 9600 (manufactured by Applied Biosystems) at 30 ° C for 10 minutes, then at 42 ° C for 1 hour, and then heated at 99 ° C for 5 minutes to inactivate the enzyme.
  • cDNA was prepared.
  • SEQ ID NOs: 122 to 125 in the sequence listing The primers Vd1, Vd2, Vd3, and Vd4 of ⁇ were synthesized.
  • Fig. 24 shows the results of detection of viroids by the ICAN method and the PCR method using PfuRNaseH.
  • Lane 1 is a 100 bp DNA ladder marker
  • lane 2 is a negative control
  • lane 2. 3 is a 10,000-fold diluted sample of cDNA
  • Lane 4 is a 1000-fold diluted sample of cDNA
  • Lane 5 is a 100-fold diluted sample of cDNA
  • Lane 6 is a 10-fold diluted sample of cDNA
  • Lane 7 is a stock solution of cDNA. This is the case for the sample.
  • the target amplification product could be confirmed up to 100-fold diluted cDNA.
  • c-Ki-ras According to the nucleotide sequence of human c-Ki-ras, c-Ki-ras-1 and c-Ki-ras-2 primers described in SEQ ID NOs: 126 and 127 in the sequence listing were constructed. Prepare a 10 ⁇ l total mixture containing the above 60 pmo 1 primer, 21 0.25% propylene diamine aqueous solution, human genomic DNA (Clontech) 100 ng-lng type II did. The mixture was treated with a thermal cycler personal at 98 ° C. for 2 minutes, and then heat-treated at 53 ° C. to anneal the primer to the ⁇ type.
  • a total of 40 ⁇ l of the reaction solution containing & 86 37 DNA polymerase was added to a final volume of 50 ⁇ l. The reaction was held at 53 for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction solution 51 was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis.
  • PCR was performed as a control.
  • primers c-Ki-ras-3 and c-Ki-ras-4 primers described in SEQ ID NOs: 128 and 129 in the sequence listing were used.
  • Primer 60 pmo 1 Type II 100 ng ⁇ 0.1 lng, 10 XE x Tack buffer 5 ⁇ l, 1.25 U Takara Ex tack polymerase — 50 ⁇ l total solution containing 0.2 mM dNTP was prepared and subjected to 30 or 35 cycles of reaction at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds using a thermal cycler personal.
  • FIG. 25 shows the results. That is, FIG. 25 shows the results of detection of the c-Ki-ras gene from human genomic DNA by the ICAN method and the PCR method.
  • lane 1 is a molecular weight marker and lane 2 is Lane 100 is for Type I 10 ng
  • Lane 4 is for Type I 1 ng
  • Lane 5 is for Type I without.
  • lane 1 is 100 ng of type II
  • lane 2 is 10 ng of type II
  • lane 3 is I ng of type II
  • lane 4 is the case without type II.
  • Fig. 30 shows the results of comparison of the amounts of amplification products between the ICAN method and the PCR method when the type III was 1 ng to 100 ng.
  • the hatched bars represent the results of the 30-cycle PCR method
  • the dotted bars represent the results of the 35-cycle PCR method
  • the black bars represent the results of the ICAN method.
  • Genomic DNA was prepared from Gentol- kun (for blood) (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) from ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , respectively, from blood samples collected from healthy individuals using sodium taenoate and heparin as anticoagulants.
  • the c-Ki-ras gene was detected by the ICAN reaction from the DNA of 5 ⁇ l to 0.04 ⁇ m in terms of the prepared blood under the same conditions as in the above (1).
  • detection was performed from 5 ⁇ l to 0.041 of the DNA derived from the blood sample under the same conditions as in (1) above.
  • Figure 26 shows the results. That is, Fig. 26 shows the results of detection of the c_K i — ras gene from a blood sample by the ICAN method and the PCR method.
  • lane 1 is a molecular weight marker
  • lane 2 is quenched blood 5 1
  • lane 3 is citrate blood 1 ⁇ 1
  • lane 4 is citrate blood 0.2
  • lane 5 is citrate blood 0.041
  • lane 6 is heparin blood 5 IX 1
  • lane 7 is heparin Blood 1 ⁇ l
  • lane 8 is heparin blood 0.21
  • lane 1 is a molecular weight marker
  • lane 2 is quenched blood 5
  • lane 3 is citrate blood 1 ⁇ 1
  • lane 4 is citrate blood 0.2
  • lane 5 is citrate blood 0.041
  • lane 6 is heparin blood 5
  • lane 7 is heparin Blood 1 ⁇ l
  • lane 8 is heparin blood 0.21
  • lane 9 is the case of heparin blood 0.04 ⁇ 1.
  • lane 1 was a molecular weight marker
  • lane 2 was 30 cycles of citrate blood 5 ⁇ 1
  • 30 cycles of lane 3 was 30 cycles of citrate blood 11
  • lane 4 was 0.21 of citrate blood.
  • the target amplification product was confirmed to be equivalent to 0.2 ⁇ 1 in 30 cycles and to 0.2 ⁇ 1 in heparin blood in 30 cycles.
  • O-157 an enterohemorrhagic Escherichia coli
  • mEC medium supplemented with novopiosin
  • heat-treated at 95 ° C for 10 minutes. This in sterile water 0, 1, 10, 10 were prepared in 2, 10 3 corresponding cell numbers liquid, was used as ⁇ .
  • detection primers As detection primers, VT-2IF4 primers and VT-2IR3 primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 130 to 131 in the sequence listing were synthesized. The amplification product obtained with the primer pair is about 146 bp.
  • the reaction was performed as follows. That is, the above primer at 50 pmol each, the final concentration of 0.01% propylenediamine, and the above-mentioned hot extract of the number of cells were added to adjust the volume to 1 ⁇ m. This mixture was heat-treated at 98 ° C for 2 minutes in a Thermal Cycler Personal, kept at 55 ° C for 1 minute, and then placed on ice. A final concentration of 34 mM Tricine buffer (pH 8.7), 1 OmM potassium chloride,
  • Lane M shows the molecular weight marker (100 bp ladder) and Lane N When using sterilized water as Over down 1 1 cell equivalent, lane 2 1 0 cell corresponds, lane 3 1 0 2 cell corresponds, lanes 4 is the case of the 1 0 3 equivalent ⁇ .
  • the VT2 gene could be detected from the heat extract corresponding to one cell by the ICAN method.
  • This result is equivalent to the detection reaction by the ICAN method and PCR when Escherichia coli RNase H shown in Example 9 was used, and Bca RNase HIII which is a heat-resistant RNase H was used. It was confirmed that the ICAN method was also effective as a method for detecting viruses, bacteria, and the like.
  • primers SEA-1 and SEA-2 of SEQ ID NOs: 136 and 137 in the sequence listing were synthesized according to the nucleotide sequence of the S. aureus enterotoxin A gene region.
  • Figure 29 shows the results.
  • Fig. 29 shows the results of electrophoresis for detection of the Staphylococcus aureus enterotoxin ⁇ gene.
  • Lane 1 is a molecular weight marker (1 OO bp ladder)
  • lane 2 is a negative control (sterilized water)
  • lane 3 is type ⁇ 115 pg.
  • Lane 4 shows the case of type 1 ⁇ 1 ⁇ 15 ng.
  • the increase of the target amplification product was confirmed up to about 1.15 ng of type III.
  • HCV Hepatitis CVirus
  • the ICAN reaction was performed at 55 ° C for 1 hour under the same conditions as in Example 13, except that 1 ⁇ l of the above cDNA reaction solution and the above HCV-F3 and HCV-R1 primers of 100 pmo 1 were used. I went. After the completion of the reaction, 2.5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis. The result is shown in FIG. Figure 31 shows the results of electrophoresis for detection of hepatitis C virus. Lane 1 is the molecular weight marker (lO Ob p), lane 2 is a healthy subject, and lanes 3 to 6 are from the sera of HCV-infected patients. In this case, the prepared type I was used.
  • Lane 1 is the molecular weight marker (lO Ob p)
  • lane 2 is a healthy subject
  • lanes 3 to 6 are from the sera of HCV-infected patients. In this case, the prepared type I was used.
  • HCV can be specifically detected from serum samples of HCV-infected patients.
  • the amplification method of the present invention was studied.
  • Example 2 (1) The pUC 19-150 plasmid DNA prepared in Example 2 (2) was transformed into type I, and PCR was performed using the MCS-F and MCS-R primers described in SEQ ID NOS: 35 and 36 in the sequence listing. Thereafter, the product was purified using Microcon 100 (Millipore ring) to obtain a PCR amplified fragment of 534 bp.
  • FIG. 32A The sequence ladder in 2A shows the sequence of Ml 3m 18 sing 1 estrand DNA (Takara Shuzo) using the MF2 primer labeled with [ ⁇ -32 ⁇ ] ATP and elongation. Used to determine product length. Further, lane 1 shows the combination of MF2 and MR1 primers, and lane 2 shows the case of using MR1.
  • a DNA fragment to which the MF2 primer and the MR1 primer can be annealed was prepared as follows. Plasmid pUC19 was transformed into type I MC SF primer and RV primer (Takara Shuzo) and M4 primer (Takara Shuzo) PCR was carried out using MCSR primers and purified with Microcomputer 100 to obtain 236 bp and 271 bp PCR amplified fragments, MSCF-RV fragment and M4-MCSR fragment. The region between the M4 and RV primers in the two PCR fragments is a common sequence.
  • the type-primer (1) in which the type A DNA strands with the primers annealed are not annealed
  • the type-primer in which the mirror DNA strands with the primers annealed, are annealed.
  • Reaction solution and M 4-MCSR fragment were added to a final concentration of 0.01% by adding 40 pmo 1 of MR 1 primer and propylene diamine to 30 ng.
  • the reaction solutions were adjusted to 5 ⁇ l with sterile distilled water, heat denatured separately at 98 ° C for 2 minutes, cooled to 55 ° C, and mixed with 2.5 ⁇ l of each reaction solution. Then, type I-primer was prepared.
  • the reaction mixture was adjusted to 1% and adjusted to 5 ⁇ l with sterile distilled water.
  • the reaction solution was subjected to thermal modification at 98 ° C for 2 minutes, and then cooled to 55 ° C to prepare a type I primer.
  • a reaction solution containing 1 U of BcaBEST DNA polymerase (42.5 mM tricine buffer (pH 8.7), 12.5 mM potassium chloride, 12.5 mM ammonium sulfate, 0 0.125% BSA, 1.25% DMSO, 5 mM magnesium acetate, 0.625 mM dNTP) 201 were added, and the mixture was reacted at 55 ° C. for 15 minutes. After the reaction is completed, add 2.5 ⁇ l of stop solution (95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05 ° / 0 promophenol blue, 0.5% xylene cyanol) to 5 ⁇ l of the reaction solution.
  • stop solution 95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05 ° / 0 promophenol blue, 0.5% xylene cyanol
  • the type DN primer in which the primers are annealed, the type DN DNA strands are not annealed, the 161 bp band extended from the MF2 primer to the type ⁇ end Only primers were detected, but the primers were annealed.
  • the MF2 primer and the MR1 primer were used. A 223 bp band flanked by primers was detected. Therefore, it was confirmed that when the type I DNA strands with which the primers were aerating were aerating, a type I exchange reaction occurred.
  • the genome was prepared in sterile water at a concentration of 100 pg, 10 pg, lpg, 100 fg, 10 fg, and lfg, respectively.
  • the reaction was performed as follows.
  • the reaction solution was set in a thermal cycler personal set at 60 ° C. in advance and held for 60 minutes. After completion of the reaction, 3 ⁇ l of the reaction solution was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis. On the other hand, PCR was performed as a control. Primers to be used are as described in Clinical Pathology, Vol. 43, No. 9, pp. 941-947 (1 995).
  • F primer, MT I S PCR—R primer were used.
  • An amplification product of 276 bp is obtained with the primer pair.
  • a reaction solution having a volume of 501 was prepared according to the manual for using ExTaq DNA polymerase (Takara Shuzo). The sample was set in a thermal cycler, and a reaction cycle was performed at 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. After the completion of the reaction, the reaction solution 3-1 was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis. As a result, in each case, the target amplification product could be confirmed up to the case of a 100 fg cyclized amount.
  • a phenol-clonal form treated with a phenol-clonal form and then ethanoprecipitated and collected from a clinical specimen provided by a patient with informed consent was used as a sample.
  • the reaction was performed as follows.
  • final concentration 32 mM potassium hydroxide monobasic buffer (pH 7.8), lO OmM potassium acetate, l% DMSO, 0.01% BSA 4 mM magnesium acetate, 500 / zM dNTPs, 50 pmol each CT2F and CT2R primers, 46.4 U of RNaseH derived from Pho or 8.75 U of RNaseH derived from Afu, 8 U B caBEST DNA polymerase, 1 ⁇ l of sample and sterile water To bring the final volume to 501.
  • the reaction solution was prepared at 55 ° C in advance. It was set on one Marcycla Personal and held for 60 minutes.
  • the reaction solution 31 was subjected to 3. ⁇ % agarose gel electrophoresis. As a result, the target amplification product was confirmed. From this, it was confirmed that Chlamydia trachoma could be detected by the method of the present invention using Aiu-derived or Pho-derived RNaseH.
  • Streptavidin solid phase magnetic beads equivalent to 100 pmo 1 in a biotin-conjugated diet were allowed to react with the biotinylated amplified fragment in the first layer of the cuvette for 5 minutes, followed by the addition of 0. IN NaOH and the FITC labeled probe MT I SBF and 5 After hybridization, POD-labeled anti-FITC antibody was added. After washing for 5 minutes, luminescence substrate was added. As a result, it was shown that semi-quantitative analysis was possible in as short as 20 minutes using magnetic beads with the existing automated detection device. Detection was measured by photocounting the amount of luminescence. Table 12 shows the results. Table 12
  • a hybrid chromatography method was examined. That is, streptavidin (manufactured by Nacalai Tester) was immobilized on a nitrocellulose membrane, and a water-absorbing pad was connected to prepare a high-purity chromatographic strip. This was used to detect the amplified fragment used in the above (3) by the hybrid chromatography method. Detection was performed by color development using 1-step TMB-B lotting (Pierce). That is, a reaction solution containing the amplified fragment was developed on a nitrocellulose membrane, and thereafter, a 0.1 N NaOH solution, a FITC-labeled probe, a washing solution, and a coloring solution were developed in that order.
  • lane M 1 00 bp DNA ladder marker lane 1 is the negative control
  • lane 2 cell heat extract 1 cell equivalent lane 3 10 cell corresponds
  • lane 4 10 2 cells phase equivalent Lane 5 10 3 cells equivalent
  • lane 6 10 4 cells equivalent Lane 7 shows the case of a corresponding 10 5 cells.
  • a ladder band was confirmed as shown in FIG.
  • the base sequence of the ladder band obtained in the above (1) was analyzed. That is, the reaction solution 501 prepared in (1) was subjected to 3% agarose electrophoresis, and after the electrophoresis, a ladder band was cut out from the gel. Next, the amplified DNA fragment was recovered from the gel using EASYTRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). After recovery, the amplified fragment was subjected to blunt-end treatment with DNA Blint ingkit (Takara Shuzo).
  • Colony PCR was performed using 13-RV primers (both from Takara Shuzo) to confirm the presence or absence of inserts.
  • the colony in which the insert was confirmed was cultured with shaking at 37 ° C in LB liquid medium containing 0. ImM ampicillin.
  • Plasmids were purified from the cells after the cultivation using QIAGENplasmidminiKit (manufactured by Qiagen). The fragment cloned into the HincII site in the plasmid was subjected to sequence analysis from both directions using Ml3-M4 and Ml3-RV primers by a conventional method.
  • the ladder fragment obtained by the method of the present invention had a repeating structure of the target amplification region. This repetition was confirmed to be parallel in the same direction from 5 'to 3'.
  • the detection method of the present invention for Mycobacterium tuberculosis was examined. First, a region having a relatively low GC content in the M. tuberculosis genome is designated as a target amplification region, and K-F-1033 (60) and K-F- 1 133 (62) primers were each synthesized.
  • the type M. tuberculosis genome used is the one described in Example 33 (1). Diluted. The reaction was performed as follows. That is, 32 mM final concentration
  • Potassium monohydrate buffer pH 7.8
  • lO OmM potassium acetate 1% DMSO, 0.01% BSA
  • 4 mM magnesium acetate 500 M dN TPs each, 50 pmo 1 K-F-1033 (60) and K_F—1133 (62) combination of primers, 9.375 U of Rfu from Pfu or 4.NaU of 4.375 U of Afu, 2.75 U of BcaBEST D NA polymerase and each type I amount of 1 ⁇ 1 were added, and the final volume was adjusted to 251 with sterile water.
  • the reaction solution was set in a Thermal Cycler Personal set at 62 ° C. in advance and held for 60 minutes.
  • primers K—F—1033 (68) and K—F—133 (68) having the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 161 to 162 in the sequence listing were synthesized.
  • the amplification reaction was performed under the same conditions as in (1) above, except that the reaction temperature was 63 ° C.
  • the reaction solution 31 was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis.
  • Figure 38 shows the results.
  • FIG. 38 shows the results of electrophoresis of the M. tuberculosis genome using Pfu-derived RNaseH and Afu-derived RNaseH, and lanes 1 to 4 show Pfu-derived RNaseH II.
  • Lane 1 is type II DN
  • A is 10 pg
  • lane 2 is l pg
  • lane 3 is 100 fg
  • lane 4 is for the negative control.
  • lanes 5 to 8 are the results when Afu-derived Rase HII was used, lane 5 was 10 pg of type III DNA, lane 6 was lpg, lane 7 was 100 fg, lane 8 was a negative control, lane M Indicates a 100 bp DNA ladder marker.
  • the target amplified fragment could be detected up to the case where 100 fg of type I DNA was used in any case using RNaseH.
  • RNaseH the use of Afu-derived RNaseH increased the amount of amplification product.
  • stable detection sensitivity can be obtained by using Afu-derived RNaseH. And confirmed.
  • K-F-1033 (68) and K_F_1133 (68) The case where primers were combined was examined when the plasmid containing the target amplification region was type III.
  • an F26 primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 163 to 164 in the sequence listing and an R131
  • the amplification method of the present invention without denaturation of the type III genome DNA was examined.
  • lane ⁇ is a 100 b pDNA ladder marker
  • lane 1 is a negative control
  • lane 2 is 1 ng of genomic DNA incorporating pDON-AI
  • lane 3 is genomic DNA incorporating pDON-AI.
  • lane 4 is for pDON—AI genomic DN AlO
  • lane 5 is for pDON—AI DNA 10 fg
  • lane 6 is for pDON—AI DNA 1 pg Is shown.
  • the fidelity (accuracy) of the present invention was compared with the PCR by Takara EXTaq polymerase (manufactured by Takara Shuzo) using LA technology.
  • type ⁇ ⁇ brassmid was performed as follows.
  • the amplified fragment was treated with Sfi I restriction enzyme (Takara Shuzo).
  • pUCl9 manufactured by Takara Shuzo
  • Af1III restriction enzyme manufactured by NEB
  • NdeI restriction enzyme manufactured by Takara
  • the DNA described in SEQ ID NO: 171 in the sequence listing was synthesized using a DNA synthesizer. DNA complementary to this sequence was also synthesized. These DNAs were denatured by heat and then annealed to form double-stranded DNAs.
  • Double-stranded synthetic DNA was introduced into the above-mentioned pUC19 restriction enzyme-treated fragment using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo).
  • This plasmid was designated as pIC62.
  • This pIC62 has a sequence where an ICAN2 primer (SEQ ID NO: 172) and an ICAN6 primer (SEQ ID NO: 173) anneal, and further has a SfiI restriction enzyme site.
  • This pIC62 plasmid was treated with SfiI restriction enzyme to prepare it.
  • the PCR-amplified ZS fi I restriction enzyme digested fragment was ligated using a ligation kit ver.
  • ICAN amplification product was prepared as follows. That is, a 101 solution containing 0.01% of the above-mentioned type I plasmid, 50 pmo 1 each containing the ICAN2 and ICAN6 chimeric primers described in SEQ ID NOs: 172 and 173 in the sequence listing and propylenediamine 0.01% was prepared. After denaturing at 98 ° C for 2 minutes in a Thermal Cycler Personal, the mixture was kept at 60 ° C for 1 minute and then transferred to ice.
  • the band of the target amplification product was cut out from the agarose gel, collected with SUPREC-01 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and then subjected to phenol / cu-form-form processing, followed by eta precipitation collection.
  • reaction solution is subjected to agarose electrophoresis in the same manner as in (2) above, and the desired amplified product is recovered with Microcon-100 (manufactured by Takara Shuzo), and treated with phenol / cloth form to form ethanol. The precipitate was recovered.
  • the amplification products obtained in (2) and (3) above were subcloned by the following method. That is, the ICAN amplification product and the PCR amplification product were introduced into the pT771 ue vector (Takara) using the Perfectly Blint Cloning kit (Takara Shuzo) according to the manual. ue Singles Competent Cell (Takara Shuzo) was transformed. After selecting 10 colonies for each clone, the transformant was cultured to obtain a plasmid into which about 0.4 kb of DNA had been inserted, and the sequence of the inserted fragment in the plasmid was determined using T7 promoter r (Takara Shuzo) and M3 primer (Takara Shuzo).
  • a double-stranded cDNA was prepared using a cDNA synthesis kit (Takara Shuzo).
  • a cDNA synthesis kit (Takara Shuzo)
  • each PCR fragment amplified with a combination of primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 176 to 189 in the sequence listing was subjected to pT7BlueT-vector (Takara Shuzo) by TA cloning to obtain a plasmid clone.
  • MCS-F and MCS-R primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 190 to 91 in the sequence listing of each prepared plasmid clone (1 ng) 1 ⁇ 1 and each 10 pmo1, 1. 25 ⁇ l Ex Taq (Takara Shuzo), 51 1 O XE x tack buffer (Takara Shuzo: h ⁇ ) and 0.2 mM dNTP compound. a PGR Thermal Cyclic Personal (Takara Shuzo) at 94 ° C for 2 minutes, followed by 94 at 30 seconds, 55. The reaction was repeated 30 times for 1 second at 72 ° C. for 30 seconds, and the amplified DNA fragment was used as a type I ICAN reaction.
  • an ICAN reaction was performed using Amino a11y1 dUTP (manufactured by Sigma). At this time, the ratio of (1 lower part? Amount and 111]: 11 oa 1 1 y 1 dUTP amount is changed to 10: 0, 9: 1, 8: 2, 7: 3, 6: 4 and the I CAN reaction is performed. The reaction was carried out in the following manner.
  • the primers MF 2N 3 (24) and MR 1N having the base sequences described in SEQ ID NOs: 192 and 193 of the PCR reaction mixture ( ⁇ ) prepared in (1) above and the 3 Transfer the total volume of 10 ⁇ l containing the 0.5% propylenediamine aqueous solution of (24) and 21 into 98 ° C using TaKaRa PCR Thermal Cycler Persona 1. For 2 minutes, followed by rapid cooling on ice at 65 ° C. for 30 seconds to allow the primer to anneal to type I. Next, each of the heat-treated solutions was added to each of 0.62 5111] ⁇ (1 eight-cho ?, dCTP, dGTP mixture, 0.62
  • tuberculosis genome with the MTIS-PCR-F-2 primer and the MTIS-PCR-R-2 primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 196 and 197 in the sequence listing is pT7B Lue TVector (Takara Shuzo) was introduced using DNA Ligation kit Ver. 2, and Escherichia coli JM109 was transformed using the plasmid. This transformant is cultured, and the plasmid into which 400 bp DNA has been introduced is introduced. Get the plasmid, computational at OD260, to prepare a solution which contained 1 0 3 copies in 1 ⁇ 1.
  • the target amplification product was confirmed at any ratio of the dTTPZdUTP mixture. From the above, it was confirmed that modified nucleotides can be used as substrates in the method of the present effort.
  • transcript RNA to be type III was prepared. Prepare 300 ⁇ l of serum from a hepatitis C patient with informed consent using Trizol reagent (manufactured by Lifetec) according to the instructions attached to the reagent, and finally prepare water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) 20 ⁇ l .
  • This RNA sample was subjected to RT-PCR using type II. The reaction was performed as follows. On e-Step RNA using 2 ⁇ l of the above RNA sample and 20 pmo 1 of each of SP 6—HCV—F primer and ⁇ 7—HCV—R primer described in SEQ ID NOs: 198 and 199 of the Sequence Listing.

Description

明 細 書 核酸の増幅方法 技術分野
本発明は、 臨床分野において有用な標的核酸の検出方法及び遺伝子工学分野に おいて有用な DN Aの合成方法に関し、 铸型となる核酸の増幅方法おょぴ該方法 で増幅された標的核酸の検出方法に関する。 背景技術
遺伝子工学分野の研究において DN Aの合成は種々の目的に使用される。 この- うちオリゴヌクレオチドのような短鎖の DN Aの合成を除けば、 そのほとんどは DNAポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。 例えば、 ポリ メラーゼ連鎖反応法 （PCR法） があるが、 それは米国特許第 4， 683, 19 5号、 第 4， 683， 202号おょぴ第 4， 800， 159号に詳細に記述され ている。 もう一つの例としては、 トレンズ イン バイオテクノロジー (Trends in Biotechnology) 第 10卷、 146〜 152頁 （1992) に記載の当該方法 と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写 P C R法 （R T _ P C R法） が挙げられる。 上記の方法の開発により、 DNAから、 若しくは RN Aから目的とする領域を増 幅することが可能になった。
これらの D N A合成方法は、 目的とする D N A領域を増幅させるために例えば、 二本鎖錶型 DN Aの一本鎖への解離 （変性） 、 一本鎖鎊型 DN Aへのプライマー のアニーリング、 プライマーからの相補鎖合成 （伸長） の 3つのステップからな る反応により、 もしくは、 " シャトノレ PCR" (『PCR法最前線』、 「蛋白質 核酸 酵素」 別冊、 第 41卷、 第 5号、 425頁〜 428頁 （1996) ) と呼 ばれる、 前述の 3ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のス テップを同一温度で行なう 2ステツプ反応により実施される。
さらに、 別法としては、 1989年 6月 14日に公開された欧州特許出願第 3 20, 308号に記述されているリガーゼ連鎖反応 （LCR； ligase chain reaction) 法、 あるいは P C R プロトコーノレズ (PCR Protocols, Academic Press. Inc. , 1990) 2 4 5〜2 5 2頁に記述されている転写増幅システム （T A S ； transcript ion-basea amplification system) fe力 s挙げ、りれる。 上 B己 4法 fま、 次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、 高温から低温の反 応を何回も繰り返す必要がある。 このように温度によって反応が制約されるため、 反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。
従って、 上記の方法には広い温度範囲で、 かつ、 厳密な温度調整を経時的に行 なうことのできる高価なサーマルサイクラ一を使用することが必要となる。 また、 該反応は、 2種類〜 3種類の温度条件で行なうため設定温度にするために要する 時間が必要であり、 そのロス時間はサイクル数に比例して増大していく。
そこで、 上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発され た。 例えば、 特公平 7— 1 1 4 7 1 8号に記載の鎖置換型増幅 （S D A； strand displacement amplification) fe、 § ί∑.^ ( 3 S R； self一 sustained sequence replication) 法、 日本国特許番号第 2 6 5 0 1 5 9号に記載の核酸配 歹 IJ増幅 (NA S B A； nucleic acid sequence based amplification) fe、 TM
A (transcription-mediated amplification) 法、 日本国特許番号第 2 7 1 0 1 5 9号に記載の Q ]3レプリカーゼ法、 さらに米国特許番号第 5 , 8 2 4 , 5 1 7 号、 国際公開第 9 9 / 0 9 2 1 1号パンフレツト、 国際公開第 9 5 / 2 5 1 8 0 号パンフレツトあるいは、 国際公開第 9 9 / 4 9 0 8 1号パンフレツト等に記載 の種々の改良 S D A法が挙げられる。 米国特許番号第 5 , 9 1 6 , 7 7 7号には 等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。 これらの 等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、 プライマー の伸長や、 一本鎖伸長生成物 （または元の標的配列） へのプライマーのァニーリ ングや、 それに続くプライマーの伸長は、 一定温度で保温された反応混合物中で 同時に起こる。
これらの等温核酸増幅法のうち最終的に D NAが増幅される系、 例えば、 S D A法は、 D NAポリメラーゼと制限ェンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置換に よる、 試料中の標的核酸配列 （およびその相捕鎖） の増幅法であるが、 該方法で は、 増幅に使用するプライマーは 4種類必要であり、 その内の 2種類は、 制限ェ ンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。 また、 該方法で は、 DNA合成のための基質として、 修飾されたデォキシリボヌクレオチド 3リ ン酸、 例えば α位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子 （S) に置換された （ひ— S) デォキシリボヌクレオチド 3リン酸を大量に用いる必要があり、 ルーチンヮ 一クで反応を行なう遺伝子検査等においては、 そのランニングコストが深刻な問 題となってくる。 さらに該方法では、 増幅された DN Α断片中に上記の修飾ヌク レオチド、 たとえば （α— S) デォキシリボヌクレオチドが含まれるため、 例え ば、 増幅後の DN Α断片を制限酵素長多型 (RFLP ； restriction enzyme fragment length polymorphism) 解析に供しょうとする場合に、 該断片が制限酵 素で切断できないことがある。
また、 米国特許番号第 5， 824, 517号記載の改良 SD A法は、 RNAと DNAから構成され、 少なくとも 3， 末端に DNAが配置された構造を必須要件 とするキメラプライマーを使用する DNA増幅方法である。 また、 国際公開第 9 9/09211号パンフレツトに記載の改良 SDA法は、 3，突出末端を生じさ せる制限酵素が必要である。 また、 国際公開第 95/25180号パンフレツト に記載の改良 SDA法は、 少なくとも 2組のプライマー対を必要とする。 さらに、 国際公開第 99/49081号パンフレツトに記載の改良 SD A法は、 少なくと も 2組のプライマーと少なくとも 1種類の修飾デォキシリボヌクレオチド 3リン 酸を必要とする。 一方、 米国特許番号第 5， 916, 777号は、 オリゴヌタレ ォチドを合成するために、 3， 末端にリボヌクレオチドを有するプライマーを使 用して DNAを合成し、 反応終了後にェンドヌクレアーゼによりプライマー伸長 鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて分離させ、 テンプレートを消化 し、 さらにプライマーを回収して再利用するというものである。 該方法では、 プ ライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単離したうえで铸型を再度 アニーリングさせる必要がある。 また、 国際公開第 00/28082号パンフレ ットに記載の LAMP (Loop- mediated Isothermal Amplification)法は増幅に 4 種類のプライマーを必要とし、 また、 増幅産物は増幅の標的とされた領域が繰り 返された、 サイズの一定しない DN Aである。
上記のように従来の等温核酸増幅法はまだまだ種々の問題をかかえており、 低 ランニングコストで、 力つ結果的に得られた D N A斬片をさらに遺伝子工学的な 処理に使用することが可能な核酸の増幅方法が求められていた。 発明の目的
本発明の主な目的は、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する D N A 合成反応により試料中の標的核酸の高感度、 特異的に増幅する標的核酸の増幅方 法、 該方法によって得られた増幅断片の検出方法、 該増幅方法を用いた標的核酸 の製造方法及びこれらの方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを提 供することにある。 発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、 リボヌクレオチドが 3， 末端又は 3， 末端側に 配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマー、 エンドリポヌクレアーゼ、 お ょぴ D NAポリメラーゼの存在下に目的とする領域の D NAを増幅する方法を見 出し、 優れた遺伝子増幅反応系を構築し、 本発明を完成するに至った。 該方法は、 キメラオリゴヌクレオチドプライマ一を用いる核酸増幅方法であり、 本願明細書 では I し AN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) 法と称する。
本発明の第 1の発明は、 標的核酸を増幅する方法において、
( a ) 铸型となる核酸、 デォキシリポヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有す る D NAポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 および R N a s e Hを 混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、 铸型となる核酸の 塩基配列に実質的に相補的であり、 少なくともデォキシリポヌクレオチド及びヌ クレオチドアナ口グから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、 該リポ ヌクレオチドは該プライマーの 3 ' 末端又は 3， 末端側に配置されたキメラオリ ゴヌクレオチドプライマ一であり ；および、
( b ) 反応産物を生成するのに充分な時間、 反応混合物をインキュベートするェ 程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。 本発明の第 1の発明においては、 さらに鎵型となる核酸の塩基配列に実質的に 相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を含有する反応混合物 を使用することができる。
本発明の第 2の発明は、 核酸を増幅する方法において、
( a ) 錶型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも 1種類 のプライマ一と D N Aポリメラーゼにより処理して該鎳型に相捕的なプライマー 伸長鎖を合成し、 二本鎖核酸を合成する工程；ここで該プライマーは、 少なくと もデォキシリポヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリ ポヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該 リポヌクレオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、
(b) RNa s eHの存在下、 前記工程で得られる二本鎖核酸を鎵型とし、 鎖置 換活' I·生を有する DN Aポリメラーゼによって铸型に相補的な核酸配列を伸長して 鎖置換を行い、 置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；および、
(c) (b) 工程で得られる二本鎖核酸が铸型として （b) 工程に再利用される 工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第 3の発明は、 少なくとも 2種類のプライマーを使用する、 核酸を増 幅する方法において、
(a) 鎳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも 1種類 のプライマーと DNAポリメラーゼにより処理して該铸型に相補的なプライマー 伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキシリポヌクレ ォチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを 含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一であって、 該リポヌクレオチドは 該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され；
(b) RNa s e Hの存在下、 前記工程で得られる二本鎖核酸を醒とし、 鎖置 換活性を有する DNAポリメラ ゼによって鎳型に相補的な核酸配列を伸長して 鎖置換を行い、 置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；
(c) (b) 工程で得られる二本鎖核酸が鎵型として （b) 工程に再度利用され る工程； (d) (b) 工程で得られる置換鎖を铸型として （a) 工程で使用されたプライ マーとは異なる少なくとも 1種のプライマーと DNAポリメラーゼにより処理し て、 置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該 （a) 工程で 使用されたプライマーとは異なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補 的で、 少なくともデォキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択 されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ 一であって、 該リポヌクレオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3' 末端側に配 置され；
(e) RNa s e Hの存在下、 前記工程で得られる二本鎖核酸を铸型とし、 鎖置 換活性を有する DNAポリメラーゼによって铸型に相補的な核酸配列を伸長して 鎖置換を行レヽ、 置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；および、
(f ) (e) 工程で得られるニ本鎮核酸が铸型として （e) 工程に再度利用され る工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第 2、 3の発明においては、 DN Aポリメラーゼとして鎖置換活性を 有する D N Aポリメラーゼを使用することができる。
本発明の第 4の発明は、 核酸を増幅する方法において、
( a ) 铸型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2種 類のプライマーと鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼにより処理して該铸型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァニーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリポヌクレオチド及ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリポヌタレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであつて、 該リボヌク レオチドは該プライマーの 3' 末端又は 3， 末端側に配置され、
(b) (a) 工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリポヌタレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
(c) (b) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼに よって铸型に相捕的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 鎳型とプライマー伸長 鎖より成る二本鎖核酸を得る工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
本発明の第 5の発明は、 核酸を増幅する方法において、
(a) 鏡型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2種 類のプライマーと鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼにより処理して該錶型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァニーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリボヌクレオチド及ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリポヌクレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該リボヌク レオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、
(b) (a) 工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
(c) (b) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼに よつて铸型に相捕的な核酸配列を伸長して鎖置換を行レ、、 プライマー伸長鎖がァ ニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
本発明の第 6の発明は、 核酸を増幅する方法において、
(a) 錶型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2種 類のプライマーと鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼにより処理して該錶型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァ-ーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリボヌクレオチド及ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌタレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一であって、 該リボヌク レオチドは該ブラ.イマ一の 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、
(b) (a) 工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリポヌタレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；
(c) (b) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼに よって鍀型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 プライマー伸長鎖同士 がアニーリングした二本鎖核酸、 及び錶型同士がアニーリングした二本鎖核酸に
(a) 工程の 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程； (d) (c) 工程で得られる 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸の それぞれのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活' I"生を有する DN Aポリメラ ーゼによつて铸型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行！/、、 プライマー伸長 鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、 及ぴ铸型同士がアニーリングした二本鎖 核酸に （a) 工程の 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得るェ 程；および、
(e) (d) 工程で得られる 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸が
(d) 工程で再利用される工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
本発明の第 7の発明は、 核酸を増幅する方法において、
( a ) 铸型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相捕的な 2種 類のプライマーと鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼにより処理して該鎵型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァニーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一であって、 該リボヌク レオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、
(b) (a) 工程で得られるブラィマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリポヌタレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；
(c) (b) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼに よって铸型に相捕的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 プライマー伸長鎖同士 がァニーリングした二本鎖核酸、 及び铸型同士がアニーリングした二本鎖核酸に (a) 工程の 2種のプライマーがァニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
(d) (c) 工程で得られる 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸の それぞれのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DNAポリメラ ーゼによつて铸型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行レ、、 铸型とプライマ 一伸長鎖よりなる二本鎖核酸を得る工程；
(e) (d) 工程で得られる铸型とプライマー伸長鎖よりなる二本鎖核酸のリポ ヌクレオチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
(f ) (e) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプライ マー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼによって錶型 に相補的な核酸配列を伸長して置換鎖を合成する工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
第 4〜 7の発明に使用されるエンドヌクレアーゼとしては、 エンドリポヌクレ ァーゼ、 例えば RNa s e Hのようなエンドリポヌクレアーゼを使用することが できる。
RN a s e Hを使用する上記の第 1〜 7の発明においては、 大腸菌、 サーモト ガ属、 サーマス属、 ピロコッカス属、 ァノレカェォグロバス属、 バチルス属等の細 菌に由来する RN a s e Hが使用されることができる。
上記の第 1〜第 7の発明において、 標的核酸の塩基配列中の特異的増幅に適し た領域としては 200 b p以下の鎖長の領域が例示される。
本努明の第 1〜第 7の発明には、 下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一を用いることができる。
一般式： 5 ' - d Na-Nb- dNc- 3 '
(a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及ぴ /又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及ぴ Z又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよく、 3' 末端のヌクレオチドは当該末端からの DNA ポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、 cが 0であるプライマー、 デォキシリボウラシルヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが — S) リポヌクレオチドであるプライマーが例示される。 さらにこれらのキメラオリゴ ヌクレオチドプライマ一を使用する場合には、 当該プライマーに適した DNA伸 長反応温度で D N A伸長反応が実施される。
上記の第 1〜第 7の発明の増幅方法は、 铸型となる核酸と該核酸の塩基配列に 実質的に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を、 当該核酸と当該ブラ イマ一のアニーリングを増強する物質を含有するアニーリング溶液中でァニーリ ングさせる工程を包含することができる。 上記のアニーリング溶液としてはスぺ ルミジン及ぴ Z又はプロピレンジァミンを含有するものが例示される。 当該ァニ 一リング処理は、 錶型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相補的なキメラ オリゴヌクレオチドプライマ一を含有するアニーリング溶液を 90°C以上で保温 した後、 増幅反応が実施される温度以下に冷却して行うことができる。
第 1〜第 7の発明の増幅反応は、 ビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成 分を含有する緩衝液中で実施することができる。
上記の第 1〜第 7の発明においては、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼ として、 例えば、 大腸菌由来の DNAポリメラーゼ Iのクレノゥ断片、 バチルス ステアロサーモフィラス （Ba c i l l u s s t e a r o t h e rmo ph i 1 u s) 由来の 5，→3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B s t DNAポリメラーゼ、 およびバチノレス カノレドテナックス （Ba c i l l u s c a r do t e n a x) 由来の 5，→3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼからな る群から選択される DN Aポリメラーゼを使用できる。
第 1〜第 7の発明の一態様として、 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼと してバチノレス カルドテナックス由来の 5，→3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DN Aポリメラーゼ、 エンドヌクレアーゼとして大月昜菌由来、 ピロコッカス属 細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 RNa s eHを使用する態様が 挙げられる。 該 RNa s eHとしては大腸菌由来 I型 RNa s e H、 ピロコッカ ス属細菌由来あるいはアルカェォグロパス属細菌由来 I I型 RNa s eHが例示 される。
第 1〜第 7の発明にはェンドヌクレアーゼ活性を有する DN Aポリメラーゼを 使用することができる。 当該 DN Aポリメラーゼとしてはバチルス 力ルドテナ ックス由来の 5， →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DN Aポリメラーゼが使 用でき、 該 DNAポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質の存 在下に増幅反応を実施することができる。 B e a D N Aポリメラーゼのエンドヌ クレアーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンイオンが例示される。
第 1〜第 7の発明の標的核酸の増幅方法は、 DNAポリメラーゼの逆転写活性 を阻害する物質の存在下で実施することができる。 D NAポリメラーゼの逆転写 活性を阻害する物質としてはホスホノギ酸が例示される。
本発明の第 1〜第 7の発明は、 一本鎖または二本鎖の DNAを錡型として実施 することができ、 铸型となる核酸が二本鎖 D N Aである場合には、 これを一本鎮 DN Aにする工程の後に増幅反応を実施することができる。
上記の铸型となる核酸は R N Aを铸型とした逆転写反応によって得られた c D NAであってもよく、 RNAを鎳型とした逆転写反応によって c D NAを合成す る工程の後に増幅反応を実施する態様が例示される。 当該逆転写反応には逆転写 酵素活性を有する DNAポリメラーゼを使用することができ、 例えば、 逆転写反 応と鍚型に相補的な伸長鎖の合成とを、 逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有する 1種の D N Aポリメラーゼにより実施することができる。 このような DN Aポリ メラーゼとしては、 バチルス ステアロサーモフィラス由来の 5， →3， ェキソ ヌクレアーゼ欠損 B s t DNAポリメラーゼ、 もしくは、 バチルス カルドテナ ックス由来の 5， →3 ' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a D NAポリメラーゼが 例示される。
上記の第 1〜第 7の発明において、 その増幅反応は等温条件下に行なうことが でき、 また、 デォキシゥリジン 3リン酸またはその誘導体のようなデォキシヌク レオチド 3リン酸のアナ口グの存在下に行うことができる。
本発明の第 8の発明は、 核酸増幅用組成物であって、
( a ) 铸型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも 1種類 のプライマー；ここで該プライマーは、 少なくともデォキシリボヌクレオチド及 ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキ メラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該リボヌクレオチドは該プライマ 一の 3， 末端又は 3， 末端側に配置されている、
( b ) エンドヌクレアーゼ；および、
( c ) 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼ； を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物、 に関する。
本発明の第 9の発明は、 核酸増幅用組成物であって、
( a ) 錶型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な少な くとも 2種類のプライマー；ここで該プライマーは、 少なくともデォキシリボヌ クレオチド及ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドと を含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一であって、 該リボヌクレオチド は該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され；
( b ) ェンドヌクレアーゼ；および、
( c ) 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物に関する。
本発明の第 1 0の発明は、 铸型となる核酸、 デォキシリポヌクレオチド 3リン 酸、 鎖置換活1生を有する D N Aポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 およびェンドヌクレアーゼを混合して得られる核酸増幅用組成物であって、 該プ ライマーが鐯型となる核酸の塩基配列に実質的に相捕的であり、 少なくともデォ キシリポヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌク レオチドとを含有し、 該リボヌクレオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末 端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマ一である糸且成物に関する。 本発明の第 1 1の発明は、 铸型となる核酸、 デォキシリポヌクレオチド 3リン 酸、 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼ、 少なくとも 2種類のプライマー、 およびエンドヌクレアーゼを混合して得られる核酸増幅用組成物であって、 該プ ラィマーが鍚型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的で あり、 少なくともデォキシリポヌクレオチド及ぴヌクレオチドアナログから選択 されるものとリボヌクレオチドとを含有し、 該リボヌクレオチドは該プライマー の 3 ' 末端又は 3， 末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマ一で ある糸且成物に関する。
上記の本発明の第 8〜 1 1の発明の組成物に含有されるプライマーとしては、 下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一が挙げられる。 一般式： 5， - d N a - N b - d N c - 3 '
( a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 d N： デォキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及ぴ Z又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよく、 3， 末端のヌクレオチドは当該末端からの DN A ポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、 cが 0であるプライマー、 ならびにヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシ ゥラシ ヌクレオチドであり、 修飾リポヌクレオチドが （a— S) リボヌクレオ チドであるプライマーが例示される。
上記の第 8〜第 11の発明の組成物は核酸の増幅反応に適した緩衝成分を含有 ·Τることができ、 例えば、 ビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成分を含有 することができる。
上記の第 8〜 1 1の発明としては、 鎖置換活性を有する D ΝΑポリメラーゼと して大腸菌由来の DNAポリメラーゼ Iのタレノウ断片、 バチルス ステアロサ 一モフィラス由来の 5，→3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B s tDNAポリメラー ゼ、 およびバチルス カルドテナックス由来の 5，→3' ェキソヌクレアーゼ欠 損 B c a DNAポリメラーゼからなる群から選択される DNAポリメラーゼを含 有する組成物が挙げられる。 また、 ェンドヌクレア一ゼとしては、 エンドリポヌ クレアーゼ、 例えば RNa s eHのようなエンドリボヌクレアーゼを使用するこ とができる。 上記 RNa s eHとしては大腸菌 .(E s ch e r i c h i a c o 1 i ) 、 サーモトガ （Th e rmo t o g a) 属、 サーマス （The r ma s) 属、 ピロコッカス （P y r o c o c c u s ) 属、 ァノレカェォグロバス （Ar c h a e o g l o b u s) 属、 バチルス （B a c i l l u s) 等の細囷.に由来のも のが例示される。
第 8〜： 1 1の発明の組成物の一態様としては、 鎖置換活性を有する D N Aポリ メラーゼとしてバチルス カルドテナックス由来の 5，→3， ェキソヌクレア一 ゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼ、 ェンドヌクレアーゼとして大腸菌由来、 ピロ コッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 RNa s eHを含有 するするものが挙げられる。 該 RNa s eHとしては大腸菌由来 I型 RNa s e H、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 I I型 RN a s eHが例示される。
第 8〜 11の発明の組成物はェンドヌクレアーゼ活性を有する DN Aポリメラ ーゼを含有するものであってもよレ、。 当該 DNAポリメラーゼとしてはバチルス カルドテナックス由来の 5' -→3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメ ラーゼが使用でき、 該 DNAポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させ る物質を共存させることができる。 B c a DNAポリメラーゼのエンドヌクレア ーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンィオンが例示される。
第 8〜； 11の発明の組成物は、 DN Aポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物 質を含有することができる。 D N Aポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質と してはホスホノギ酸が例示される。 さらに、 当該組成物はデォキシゥリジン 3リ ン酸またはその誘導体のようなデォキシヌクレオチド 3リン酸のアナ口グを含む ことができる。
本発明の第 12の発明は、 上記の第 1〜 3の発明の核酸の増幅方法に使用する 核酸増幅用,組成物であって、
(a) RN a s e H；および、
(b) 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物に関する。
また、 本発明の第 13の発明は、 上記の第 4〜 7の発明の核酸の増幅方法に使 用する核酸増幅用組成物であって、
(a) エンドヌクレアーゼ；および、
(b) 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物に関する。
第 13の発明の組成物に使用されるェンドヌクレアーゼはェンドリボヌクレア ーゼであることができ、 例えば、 RNa s eHが例示される。
RNa s eHを含有する第 12、 13の発明の組成物には、 RN a s e Hとし て大腸菌由来 RNa s eH、 サーモトガ属細菌由来 RN a s e H、 サーマス属細 菌由来 RNa s eH、 ピロコッカス属細菌由来 RN a s e H、 アル力ェォグロバ ス属由来 RNa s eH、 及びバチルス属細菌由来 RN a s eHから選択される R Na s eHを使用することができる。 第 12、 13の発明の組成物は、 さらに核酸増幅反応に適した緩衝成分を含有 することができ、 例えば、 ビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成分を含有 するものが例示される。
上記の第 12、 13の発明としては、 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼ として大腸菌由来の DNAポリメラーゼ Iのクレノウ断片、 バチルス ステア口 サーモフィラス由来の 5' →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B s tDNAポリメラ ーゼ、 およびバチルス カルドテナツクス由来の 5 ' →3' ェキソヌクレアーゼ 欠損 B c a DNAポリメラーゼからなる群から選択される DNAポリメラーゼを 含有する組成物が挙げられる。 また、 エンドヌクレアーゼとしては、 エンドリポ ヌクレアーゼ、 例えば RNa s eHのようなエンドリポヌクレアーゼを使用する ことができる。 上記 RNa s eHとしては大月昜菌、 サーモトガ属、 サーマス属細 菌由来 RNa s eH、 ピロコッカス属、 アルカェォグロバス属、 バチルス属等の 細菌に由来のものが例示される。
第 12、 13の発明の組成物の一態様としては、 鎖置換活性を有する DNAポ リメラーゼとしてバチルス カルドテナックス由来の 5 ' →3' ェキソヌクレア ーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼ、 ェンドヌクレアーゼとして大腸菌由来、 ピ ロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 RNa s eHを含 有するするものが挙げられる。 該 RNa s eHとしては大腸菌由来 I型 RNa s eH、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 I I型 R Na s eHが例示される。
第 12、 13の発明の組成物はェンドヌクレアーゼ活性を有する DN Aポリメ ラーゼを含有するものであってもよい。 当該 DNAポリメラーゼとしてはバチル ス カルドテナックス由来の 5 ' →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポ リメラーゼが使用でき、 該 DNAポリメラーゼのェンドヌクレアーゼ活性を発現 させる物質を共存させることができる。 B c aDNAポリメラーゼのエンドヌク レアーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンイオンが例示される。
第 12、 13の発明の組成物は、 DNAポリメラーゼの逆転写活性を阻害する 物質を含有することができる。 DNAポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質 としてはホスホノギ酸が例示される。 さらに、 当該糸且成物はデォキシゥリジン 3 リン酸またはその誘導体のようなデォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログを含 むことができる。
本発明の第 14の発明は、 本発明の第 1〜 3の発明の核酸の増幅方法に使用す る核酸増幅用キットであって、
(a) RNa s eH；および、
( b ) 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第 15の発明は、 本発明の第 4〜 7の発明の核酸の増幅方法に使用す る核酸増幅用キットであって、
(a) エンドヌクレアーゼ；および、
(b) 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
第 15の発明のキットにおいては、 エンドヌクレアーゼとしてエンドリボヌク レアーゼを使用することができ、 例えば RNa s eHが例示される。
RNa s eHを含有する上記の第 14、 15の発明のキットとしては、 大腸菌 由来 RNa s eH、 サーモトガ属細菌由来 RN a s e H、 サーマス属細菌由来 R Na s eH、 ピロコッカス属細菌由来 RN a s e H、 アルカェォグロバス属由来 RNa s eH, 及ぴバチルス属細菌由来 RN a s eHから選択される RNa s e Hを含有するキットが例示される。
第 14、 15の発明のキットは、 さらに核酸増幅反応に適した緩衝液を含有し てもよく、 例えばビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成分を含有すること ができる。 また、 鎳型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相補的なプライ マーのアニーリングを増強する物質を含有するアニーリング溶液を含有する物で あってもよく、 当該アニーリング溶液としてはスペルミジン及び/又はプロピレ ンジァミンを含有するものが例示される。
本発明の第 14、 15の発明のキットに含有される鎖置換活性を有する DNA ポリメラーゼとしては、 大腸菌由来の DNAポリメラーゼ Iのタレノウ断片、 ノ チルス ステアロサーモフィラス由来の 5， →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B s tDNAポリメラーゼ、 およびバチルス 力/レドテナックス由来の 5， →3， ェ キソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼからなる群から選択される DN Aポリメラーゼが例示される。
第 1 4、 1 5の発明のキットのー態様としては、 バチルス カルドテナックス 由来の 5 ' →3 ' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DN Aポリメラーゼと大腸菌由 来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 R N a s e
Hとを含有するキットが例示される。 該 RN a s e Hとしては大腸菌由来 I型 R N a s e H、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 I I型 RN a s e Hが挙げられる。
本発明の第 1 4、 1 5の発明のキットはェンドヌクレアーゼ活性を有する D N Aポリメラーゼを含有するものであってもよい。 当該 D NAポリメラーゼとして はバチルス カルドテナックス由来の 5， →3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a D NAポリメラーゼが使用でき、 該 D NAポリメラーゼのェンドヌクレアーゼ活 性を発現させる物質を含有させることができる。 B e a DNAポリメラーゼのェ ンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンイオンが例示される。 第 1 4、 1 5の発明のキットは、 D N Aポリメラーゼの逆転写活性を阻害する 物質を含有することができる。 D NAポリメラーゼの逆転写活' I"生を阻害する物質 としてはホスホノギ酸が例示される。 さらに、 当該キットはデォキシゥリジン 3 リン酸またはその誘導体のようなデォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログを含 むことができる。
本発明の第 1 6の発明は、 本発明の第 1〜 3の発明の核酸の増幅方法に使用す る核酸増幅用キットであって、 パッケージされた形態において、 鎖置換活性を有 する D N Aポリメラーゼ及び RN a s e Hの使用を指示した指示書を含むことを 特徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第 1 7の発明は、 本発明の第 4〜 7の発明の核酸の増幅方法に使用さ れるキットであって、 パッケージされた形態において、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼ及ぴェンドヌクレアーゼの使用を指示した指示書を含むことを特 徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第 1 8の発明は、 包装材と該包装材に封入された核酸増幅用試薬から なる製造品であって、 該核酸増幅用試薬が鎖置換活性を有する D N Aポリメラー ゼ及び/又は RN a s eHを含有し、 該包装材に賦されたラベル又は該包装材に 添付された指示書に前記核酸増幅用試薬が等温での核酸増幅に使用できることが 表示してなる核酸増幅用試薬の製造品に関する。
本発明の第 1 9の発明は、 包装材と該包装材に封入された核酸増幅用試薬から なる製造品であって、 該核酸増幅用試薬が鎖置換活性を有する DNAポリメラー ゼ及び Z又はェンドヌクレアーゼを含有し、 該包装材に賦されたラベル又は該包 装材に添付された指示書に前記核酸増幅用試薬が等温での核酸増幅に使用できる ことが表示してなる、 核酸増幅用試薬の製造品に関する。
本発明の第 20の発明は、 試料中の標的核酸を検出するための方法であって、 (a) 本発明の第 1〜 7の発明の核酸の増幅方法により核酸を増幅する工程；及 び
(b) (a) 工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法に関する。
本発明の第 20の発明の検出方法においては、 得られる増幅核酸を検出用プロ —プを用いて検出する工程を包含することができる。 当該プローブはあらかじめ 標識物質により標識されているプローブであってもよく、 例えば、 消光状態にな るような距離で配置された 2種類以上の蛍光物質で標識された RNAプローブを 使用することができる。
本発明の第 2 1の発明は、 上記の第 20の発明に使用されるキメラオリゴヌク レオチドプライマ一に関する。 当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとして は、 例えば下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一が挙げら れる。
一般式： 5' - d Na-Nb- d Nc-3'
(a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及ぴ /又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよく、 3， 末端のヌクレオチドは当該末端からの DNA ポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、 cが 0であるプライマー、 ならぴにヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 あるいは デォキシリボウラシ_レヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが （ひ一 S ) リポヌクレオチドであるプライマーが例示される。
本発明の第 21の発明のプライマーとしては、 病原微生物検出用、 疾病関連遺 伝子検出用のプライマーが挙げられ、 腸管出血性大腸菌、 ボツリヌス菌、 黄色プ ドウ球菌、 結核菌、 クラミジァ、 パピローマウィルス、 C型肝炎ウィルス、 ウイ ロイド等の病原性微生物検出用のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一も本発明 に包含される。
本発明の第 22の発明は、 配列表の配列番号 31〜34、 47、 48、 51〜 53、 64〜72、 84、 85、 113、 1 14、 130、 131でそれぞれ表 される核酸配列を有する腸管出血性大腸菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプラ イマ一に関する。
本発明の第 23の発明は、 配列表の配列番号 59、 60、 1 19、 120、 1 22, 123でそれぞれ表される核酸配列を有するウイロイド検出用キメラオリ ゴヌクレオチドプライマ一に関する。
本発明の第 24の発明は、 配列表の配列番号 1 16、 1 17でそれぞれ表され る核酸配列を有するボツリヌス菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一に 関する。
本発明の第 25の発明は、 配列表の配列番号 96、 97でそれぞれ表される核 酸配列を有するパピローマウィルス検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一 に関する。
本発明の第 26の発明は、 配列表の配列番号 101〜 102、 138〜 139、 200〜 201、 205〜 206でそれぞれ表される核酸配列を有する C型肝炎 ウィルス検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一に関する。
本発明の第 27の発明は、 配列表の配列番号 136、 137でそれぞれ表され る核酸配列を有する黄色ブドウ球菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一 に関する。
本発明の第 28の発明は、 配列表の配列番号 155〜 156、 159〜 162、 194〜195でそれぞれ表される核酸配列を有する結核菌検出用キメラオリゴ ヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第 2 9の発明は、 配列表の配列番号 1 5 7〜 1 5 8、 2 0 3〜 2 0 4 でそれぞれ表される核酸配列を有するクラミジァ検出用キメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一に関する。
本発明の第 3 0の発明は、 上記の本発明の第 1〜 5の発明の核酸の増幅方法に 使用されるキットであって、 第 2 1〜2 9の発明のキメラオリゴヌクレオチドプ ライマーを含有することを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第 3 1の発明は、 上記の本発明の第 2 0の発明の標的核酸の検出方法 に使用されるキットであって、 第 2 1〜2 9の発明のキメラオリゴヌクレオチド プライマーを含有することを特徴とする標的核酸の検出用キットに関する。 本発明の第 3 2の発明は、 本発明の第 2 0の発明の標的核酸の検出方法に使用 されるプローブに関する。
本発明の第 3 3の発明は、 本発明の第 1〜 7の発明の核酸の増幅方法により増 幅された核酸にハイプリダイズするプローブに関する。
本発明の第 3 4の発明は、 本発明の第 2 1〜2 9の発明のキメラオリゴヌタレ ォチドプラィマーから選択されるプライマーで増幅される領域にハイプリダイズ するプローブに関する。
第 3 2〜3 4の発明のプローブはあらかじめ標識物質により標識されているプ ローブであってもよく、 例えば、 消光状態になるような距離で配置された 2種類 以上の蛍光物質で標識された R N Aプローブであることができる。
本発明の第 3 5の発明は、 本楽明の第 2 0の発明の標的核酸の検出方法に使用 されるキットであって、 本発明の第 3 2〜3 4の発明のプローブを含有すること を特徴とする。
本発明の第 3 6の発明は、 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼを使用し、 鏡型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法に関する。
本発明の第 3 6の発明に使用される、 鎖置換活性を有する D NAポリメラーゼ としては、 大腸菌由来の DNAポリメラーゼ Iのタレノウ断片、 バチルス ステ ァロサ一モフィラス由来の 5， →3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B s t D NAポリ メラーゼ、 およびバチルス カルドテナックス由来の 5， →3 ' ェキソヌクレア ーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼが例示される。
本発明の第 37の発明は、 核酸を所定の領域に整列させた核酸固定物を作製す るための方法であって、
(a) 上記の本発明の第 1〜 7の発明の核酸の増幅方法によって固定化すべき核 酸を増幅する工程；および、
(b) (a) 工程で増幅された核酸を所定の領域に整列させて固定化する工程； を包含することを特徴とする核酸固定物の作製方法に関する。
本発明の第 38の発明は、 上記の第 37の発明の方法で作製された、 核酸を所 定の領域に整列させた核酸固定物に関する。
本発明の第 39の発明は、 核酸を大量に製造する方法であって、
( a ) 上記の本発明の第 1〜 7の発明の核酸の増幅方法によって核酸を増幅する 工程；及び、 .
(b) (a) 工程で増幅され'た核酸を採取する工程; ■ —— を包含することを特徴とする核酸の大量製造方法に関する。
本発明の第 40の発明は、 核酸を増幅するための方法であって、 ' ·
(a) 増幅しょうとする配列 含む DNAあるいは RNAを複製し、 铸型となる' 核酸を調製する工程；及び、
( b ) (a) で得られた歸型となる核酸を第 1〜 7の発明の核酸の增幅方法で増 幅する工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第 41の発明は、 核酸の塩基配列を決定するための方法であって、 第 1〜第 7、 39、 40の発明の方法の、 核酸を增幅する工程を包含することを特 徴とする核酸の塩基配列の決定方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1 ：本発明の方法により増幅された増幅 DN A断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。
図 2 ：本宪明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。 図 3 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。
図 4 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。
図 5 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。
図 6 ：本発明の方法により増幅された增幅 DNA断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。
図 7 ：本発明の方法により増幅された增幅 DN A断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。
図 8 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動パ ターンを示す。
図 9 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動パ タ ンを示す。
図 10 ：本発明の方法により増幅された増幅 DN A断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。 A： I CA 法； B ： PCR法。
図 11 ：本発明の方法により増幅された增幅 DNA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 12 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 13 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 14 ··本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 15 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 16 ：本発明の方法により増幅された增幅 DNA断片のァガロース電気泳動 ノ ターンを示す。
図 17 ：本発明の方法により増幅された増幅 DNA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 1 8 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 ノ ターンを示す。
図 1 9 ：本発明の方法により増幅された増幅 D N A断片のァガ口 ス電気泳動 パターンを示す。
図 2 0 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガ口 ス電気泳動 パターンを示す。
図 2 1 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロ^"ス電気泳動 パターンを示す。
図 2 2 ：本発明の方法により増幅された增幅 D NA断片のァガロース電気泳動 ノ ターンを示す。
図 2 3 ：本発明の方法により增幅された增幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。 ■ . " '· ·
図 2 4 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 2 5 ：本発明の方法により増幅された增幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 2 6 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 2 7 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 ノ ターンを示す。
図 2 8 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 及びドクトハイプリパターンを示す。
図 2 9 ：本楽明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 3 0 ：本発明の方法及び P C R法により増幅された増幅産物量の比較グラフ である。
図 3 1 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。 図 3 2本発明の方法により増幅された增幅 D NA断片のポリアクリルアミド電 気泳動パターンを示す。
図 3 3 ：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図 3 4：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図 3 5 ：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図 3 6 ：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図 3 7：本宪明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 3 8 ：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。
図 3 9：本発明の方法により増幅された増幅 D NA断片のァガロース電気泳動 パターンを示す。 発明の詳細な説明
本明細書においてデォキシリポヌクレオチド （本明細書中では d Nとも記載す る） とは、 糖部分が D— 2—デォキシリポースで構成されたヌクレオチドのこと' をいい、 例えば、 塩基部分にアデニン、 シトシン、 グ了ニソ、 チミンを有するも のが挙げられる。 さらに、 7—デァザグアノシン等の修飾塩基を有するデォキシ リポヌクレオチドゃデォキシィノシンヌクレオチドのようなデォキシリポヌタレ ォチドアナ口グも上記のデォキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチド （本明細書中では Nとも記載する） とは、 糖部分が D—リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、 塩基部分にアデ ニン、 シトシン、 グァユン、 ゥラシルを有するものが挙げられる。 さらに、 当該 リボヌクレオチドには修飾リポヌクレオチドが包含され、 例えばひ位のリン酸基 の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド [ ( α— S ) リポヌク レオチド、 ( α - S ) Nとも記載する] やこの他の誘導体等も含まれる。
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、 デォキシリポヌ クレオチドおよぴリボヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。 該プラ イマ一はヌクレオチドアナログおよび/または修飾ヌクレオチドを含有していて あよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、 該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側にリボヌクレオチドを配置し、 本発明の方法において核 酸鎖が伸長でき、 エンドヌクレアーゼで切断でき、 鎖置換反応を行うことができ るものであれば、 いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包 含される。
本明細書において 3 ' 末端側とは、 核酸、 例えば、 プライマーにおいてその中 央より 3， 末端にかけての部分を指す。 同様に 5 ' 末端側とは、 核酸においてそ の中央より 5 ' 末端にかけての部分を指す。
本明細書においてエンドヌクレアーゼとは、 铸型核酸にアニーリングした上記 キメラオリゴヌクレオチドプライマ一より D N Aの伸長を行って生成した二本鎖 D NAに作用して、 該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するも のであればよレ、。
本明細書において D NAポリメラーゼとは、 D NA鎖を铸型として新たな D N A鎖を合成する酵素のことを言い、 天然型の D NAポリメラーゼの他、 前記活性 を有する変異体酵素も包含される。 当該酵素としては、 例えば鎖置換 (Strand displacement)活性を有する D NAポリメラーゼ、 5， →3， ェキソヌクレア一 ゼ活性を有していない D N Aポリメラーゼ、 逆転写酵素活性ゃェンドヌクレア一 ゼ活性を併せ持つ D N Aポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において 「鎖置換活性」 とは、 鏡型となる核酸配列に従って D N A複 製を行う際、 D NA鎖を置き換えながら進行し、 铸型鎖にアニーリングしている 相捕鎖を遊離させる、 即ち鎖置換 （strand displacement) することができる活 性のことをいう。 また、 本明細書においては、 鎖置換により錶型となる核酸配列 から遊離した D NA鎖のことを 「置換鎖」 と称する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
( 1 ) 本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法において使用されるプライマーは、 少なくともデォキシリボヌク レオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリポヌクレオチドを含 有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。 該プライマーには未修飾リ ボヌクレオチドぉよぴ /または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリポヌク レオチドプライマ一も含まれる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一は、 鐃 型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、 使用される条件に おいて、 D NA鎖の伸長に寄与することができ、 さらに、 その 3 ' 末端又は 3， 末端側にリポヌクレオチドが酉 S置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマ一で ある。 当該プライマーは通常、 増幅しょうとする領域の上流、 すなわち錶型核酸 上の増幅しょうとする領域に対応する塩基配列の 3 ' 側部分に相補的に設計され る。 なお、 ここで 「実質的に相補的な塩基配列」 とは、 使用される反応条件にお いて鎳型となる D NAにァニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一は 1以 上の修飾リポヌクレオチドを含有するものであってもよい。 即ち、 本明細書にお いてリボヌクレオチドは、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、 エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるもの であれば、 未修飾リボヌクレオチドおよび Zまたは修飾リボヌクレオチドのいず れであってもよく、 そのような未修飾あるいは修飾リポヌクレオチドのいずれも が包含される。 すなわち、 本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、 当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、 修飾リポヌク レオチドを使用することができ、 さらにこれらを組合せて使用することができる。 このような修飾リボヌクレオチドとしては、 特に限定するものではないが、 たと えば、 リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された （a— S ) リボヌク レオチドゃ、 リボースの 2位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチ ドが挙げられる。 このような修飾リポヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌク レオチドプライマーは、 例えば、 米国特許第 5 , 0 0 3， 0 9 7号記載の硫化反 応試薬 （グレンリサーチ社製） を用いた方法で調製した （a— S ) リボヌクレオ チド 3リン酸、 あるいは 2— OM e— R NA— C E ホスホアミダイド試薬 （グ レンリサーチ ） を用いて作製することができる。
また、 ェンドヌクレアーゼによる切断に耐性を付与するような性質の修飾リボ ヌクレオチドを含有し、 本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一を設計してもよく、 この様なプライマーは、 増幅反応工程における ェンドヌクレアーゼの切断位置を制御し得る点において有用である。
本発明の方法で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一は、 増幅後の D NA断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによつて 1種類もし くは 2種類を使い分けることができる。 すなわち、 一本鎖 D N Aが望まれる場合 には 1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、 また、 二本鎖が望まれる 場合には 2種類のプライマーが使用される。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、 特 に限定するものではないが、 約 1 2ヌクレオチドから約 1 0 0ヌクレオチドの長 さのものが好ましい。 さらに好ましくは、 約 1 5ヌクレオチドから約 4 0ヌクレ ォチドの長さのプライマーである。 その塩基配列は使用される反応条件において 鍀型核酸にァエーリングするように、 実質的に铸型核酸に相補的な配列であるこ とが好ましい。 該プライマーは、 後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼ により認識される配列を 3 ' 末端又は 3， 末端側に含む。
本発明を何ら限定するものではないが、 例えば、 下記一般式で表す構造をもつ オリゴヌクレオチドを本発明の D N A合成方法にプライマーとして使用すること ができる。
一般式： 5 ' - d N a - N b - d N c - 3 '
( a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 d N ： デォキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及ぴ Z又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよく、 3 ' 末端のヌクレオチドは当該末端からの D NA ポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
例えば、 上記一般式において a = 1 1以上の任意の整数で、 b = l、 c = 0の キメラオリゴヌクレオチドプライマ一、 b = 2、 c = 0のキメラオリゴヌクレ才 チドプライマ一、 b == 3〜5、 c = 0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、 さらに b = 2、 c = 0〜5のキメラオリゴヌクレオチドプライマー等がいずれも 本発明に好適に使用できる。 即ち、 本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオ チドプライマーの 3 '末端又は 3 '末端側のリポヌクレオチドの長さは、 好ましく は lme r〜15me r、 さらに好ましくは、 lme r〜： L Ome r、 特に好ま しくは lme r〜5me rである。 また、 上記一般式中の cの数は、 特に限定は なく、 本発明の方法に使用できる数を選択すればよいが、 通常 5以下が好適であ り、 4、 3、 2、 1、 の順に反応結果が良く、 特に c = 0の場合が最も反応効率 がよい。
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、 該プライマーよ り DNAポリメラーゼで伸長された DNA鎖 （プライマー伸長鎖） に含まれるリ ボヌクレオチド含有部位がェンドヌクレアーゼで認識あるいは切断されるような 構造を有しており、 当該リポヌクレオチドはその 3' 末端又は 3' 末端側に配置 されている。 本発明を特に限定するものではないが、 例えば、 铸型核酸にァニー リングした、 上記の一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一より DNAの伸長を行って生成した二本鎖 DNAに RNa s eHを作用させた場合に は、 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマ一のリポヌクレオチド部分が切断さ れ、 上記オリゴヌクレオチドプライマーと伸長により合成された DNA鎖の間に エックの入った二本鎖 DNAが生じる。 さらに、 該エックの入った部位がら DN Aポリメラーゼにより鎖置換反応がおこる。 従って、 プライマーの 3' 末端から 核酸鎖を伸長させることができ、 エンドヌクレアーゼにより切断されることがで き、 そして DN Aポリメラーゼにより鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一は全て本発明の方法に使用することができる。 さらに、 本発明の キメラオリゴヌクレオチドプライマーには、 その 3' 末端が DNAポリメラーゼ による伸長が不可能な形に修飾されており、 ェンドヌクレアーゼによる切断によ つて生じた 3， 末端から DNAの伸長が行われるものが包含される。
また、 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの 5' 末端側には RNAポリ メラーゼのプロモータ一配列を含んでいてもよレ、。 該 R N Aポリメラーゼとして は、 T7 RNAポリメラーゼ、 SP6 RNAポリメラーゼが例示される。 さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー はヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよレ、。 即ち、 本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、 DNAポリメラーゼによつ てその 3' 末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、 プライマーの機能を失わな い範囲で 1以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、 さらに、 当該 ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを,袓合せて使用することができる。 該 ヌクレオチドアナログとしては、 特に限定はされないが、 例えば、 デォキシイノ シンヌクレオチド、 デォキシゥラシルヌクレオチドあるいは 7—デァザグァユン のような修飾塩基を有するヌクレオチドアナ口グ、 リボースの誘導体を有するヌ クレオチドアナログ等を使用することができる。 また、 本発明に使用されるキメ ラオリゴヌクレオチドプライマ一は、 上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、 例えば標識化合物等の付加がなされたデォキシヌクレオチド、 リボヌクレオチド、 ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、 プライマー自身の高次構造形 成の抑制、 铸型とのアニーリング形成の安定ィ匕の観点からも有効である。 さらに、 同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導入しても良レ、。 特に限定するも のではないが、 非特異的なエンドヌクレアーゼ （RN a s e ) によるプライマー の分解を防ぐ観点からは、 例えば、 （α— S ) リポヌクレオチドのような修飾リ ポヌクレオチドが好適に使用できる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマ一は、 任意の核酸配列を持つよう に、 例えばアプライド バイオシステムズ社 (AB I社、 Applied Biosystems Inc. ) の D NAシンセサイザー 3 9 4型を用いて、 ホスホアミダイト法により合 成できる。 また、 別法としてリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、 チォ ホスホネート法等があるが、 いかなる方法で合成されたものであっても良い。 ( 2 ) 本発明に使用されるエンドヌクレアーゼ
本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、 錶型核酸にァ -ーリングした上 記 （1 ) に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーより DN Aの伸長を行つ て生成した二本鎖 DN Aに作用して、 鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断し うるものであればよい。 即ち、 上記の二本鎖 DNAのうちのキメラオリゴヌタレ ォチドプライマ一部分にニックを生成しうる酵素である。 特に限定されるもので はないが、 例えば、 本発明にはリポヌクレアーゼが使用でき、 特に D NAと R N Aとから形成された二本鎖核酸の RNA部分に作用するェンドリポヌクレアーゼ H (RN a s e H) が好適に使用できる。 また、 該リボヌクレアーゼには、 上記 作用を有するものであれば、 常温性から耐熱性のリポヌクレアーゼのいずれもが 好適に本発明に使用できる。 例えば、 下記実施例に示すように、 約 50°C〜約 7 0°Cでの反応では大腸菌 （E. c o 1 i ) 由来の RNa s eHが本発明の方法に 使用することができる。 また、 本発明の方法においては、 耐熱性のリボヌクレア ーゼも好適に使用できる。 該耐熱4リボヌクレアーゼとしては、 特に限定はされ ないが、 例えば市販の Hy b r i d a s eT M Th e rmo s t a b l e R Na s eH (ェピセンターテクノロジーズ社製） の他、 好熱性バチルス属細菌、 サーマス属細菌、 ピロコッカス属細菌、 サーモトガ属細菌、 アルカェォグロバス 属細菌等由来の RNa s eH等も好適に使用できる。 さらに、 該リボヌクレア一 ゼは、 天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。 なお、 本願明細書に 記載されている RNa s eHの酵素単位は、 実施例中の参考例に示した酵素単位 測定方法に基づいて表示された数値である。
また、 上記 RNa s eHは、 本発明の方法に使用できるものであれば特に限定 はなく、 例えば、 種々のウィルス、 ファージ、 原核、 真核生物由来のいずれであ つてもよレヽ。 さらに、 細胞性 RNa s eHあるいはウィルス性 RNa s e Hのい ずれであってもよい。 例えば、 上記細胞性 RNa s eHとしては大腸菌 RNa s eHI力 ウィルス性 RNa s eHとしては HI V—lが例示される。 本発明の 方法において RNa s eHは、 I型、 I I型、 I I I型のいずれもが使用できる。 特に限定はされないが、 例えば大月 菌由来 RNa s eHI、 ピロコッカス属細菌 由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 RN a s eH I Iが好適である。 また、 本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、 例えば、 RNa s eHの 切断反応の効率は上記プライマーの 3' 末端近傍の塩基配列に左右され、 所望の DNAの増幅効率に影響することが考えられるので、 使用する RNa s e Hに最 適なプライマーをデザィンすることは当然のことである。
本明細書において使用されている 「ニックを入れる」 もしくは 「ニッキング」 という語は、 二本鎖核酸の一方の鎖の内部を切断することを意味する。 たとえば、 RNa s eHは DNAとリポヌクレオチドを含む DNAとのハイブリッド二本鎖 核酸に作用し、 二本鎖のうちのリボヌクレオチドを含む鎖のリボヌクレオチド部 分を選択的に切断することにより、 当該ハイブリッドニ本鎖核酸に二ックを入れ る。
( 3 ) 本発明に使用される D N Aポリメラーゼ
本発明には、 DNAの鎖置換 (strand displacement) 活性を有する D N Aポ リメラーゼを使用することができる。 また、 実質的に 5 ' →3， ェキソヌクレア ーゼ活性を有しないものが特に好適に使用することができる。
本発明において、 「鎖置換活性」 とは、 錶型となる核酸配列に従って DNA複 製を行う際、 DNA鎖を置き換えながら進行し、 鍚型鎖にアニーリングしている 相補鎖を遊離させる、 即ち鎖置換 （strand displacement) することができる活 性のことをいう。 また、 本明細書においては、 鎖置換により铸型となる核酸配列 力 遊離した D NA鎖のこと 「置換鎖」 と称する。
本発明に使用される DNAポリメラーゼは、 上記の鎖置換活性を有するもので あれば特に限定はなく、 例えば、 バチルス カルドテナックス （Bacillus caldotenax, 以下、 B . c aと称す） ゃバチノレス ステアロサーモフィラス
(Bacillus stearothermophilus, 以下 B . s tと称す） 等の好熱性バチルス属 細菌由来 DNAポリメラーゼの 5， →3， ェキソヌクレアーゼ活·生を欠失した変 異体や、 大腸菌 （以下、 E . c o 1 iと称す） 由来の DNAポリメラーゼ Iのラ ージ フラグメント （クレノウ断片） 等が挙げられる。 また、 本発明に使用でき る D NAポリメラーゼは、 常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
B . c aは生育至適温度が約 7 0 °Cである好熱性細菌であり、 この細菌由来の B e a DNAポリメラーゼは、 D N A依存 D N Aポリメラーゼ活性、 RNA依 存 D N Aポリメラーゼ活性 （逆転写活性） 、 5 ' →3， ェキソヌクレアーゼ活性、 3，→5 ' ェキソヌクレア ゼ活 I1生を持つことが知られている。 上記の酵素は、 その本来の起源より精製して取得されたもの、 あるいは遺伝子工学的に生産され た組み換え蛋白質の何れであっても良レ、。 また、 該酵素は、 遺伝子工学的あるい はその他の手法によって置換、 欠失、 付加、 挿入等の改変を加えたものであって も良く、 このような酵素の例として、 5， →3， ェキソヌクレアーゼ活性を欠損 させた B e a DNAポリメラーゼである B c a B E S T D NAポリメラーゼ (宝酒造社製） 等が挙げられる。 .
なお、 D NAポリメラーゼの中には、 特定の条件でェンドヌクレアーゼ活性、 例えば、 RNa s eH活 I"生を有するものが知られている。 このような DNAポリ メラーゼを本発明の方法に用いることができる。 すなわち、 該 DNAポリメラー ゼを RNa s eH活性が発現されるような条件下、 例えば Mn2 +の存在下で使用 する態様が挙げられる。 該態様においては、 上記 RNa s eHを添加することな く本発明の方法を実施することができる。 本発明者らは、 Mn2+を含有する緩衝 液中で上記の B e a DNAポリメラーゼが RNa s eH活性を示すことを初め て明らかにし、 B c a DNAポリメラーゼ以外の酵素を含有しない反応液中で 本発明の核酸増幅法が実施できることを実証した。 なお、 上記の態様は B e a DNAポリメラーゼに限定されるものではなく、 RNa s eH活性を併せ持つこ とが知られている公知の DN Aポリメラーゼ、 例えばサーマス サーモフィラス (Thermus thermophilus)由来の T t h DNAポリメラーゼも本発明に使用する ことができる。
(4) 本発明に使用される反応バッファーの組成
本発明に使用される反応バッファーには、 緩衝成分、 マグネシウム塩やその他 の金属塩、 d NT Pを含有するものが使用される。 また、 使用する酵素の金属要 求性等に応じて塩の種類及び濃度を最適ィ匕するのは当然のことである。 緩衝成分 は、 特に限定はないが、 例えば、 ビシン、 トリシン、 へぺス、 トリス、 リン酸塩 (リン酸ナトリウム、 リン酸カリウム等） が好適に使用できる。 特にビシン、 ト リシン、 へぺス、 あるいはリン酸塩を緩衝成分として含有するバッファーが本発 明に好適である。 特に限定はされないが、 例えば、 反応温度が高い場合は、 温度 変化による pHの変化が少ないビシン緩衝液が好ましく、 また使用する RNa s eHの種類によってはへぺス緩衝液が好ましい場合がある。 従って、 反応温度、 使用するェンドヌクレアーゼあるいは DN Aポリメラーゼ等によって、 最適な緩 衝液を選択すればよレ、。 該緩衝成分の最終濃度は 5mM〜： L 0 OmMの範囲、 特 に好ましくは 2 OmM〜5 OmMの範囲であり、 また ρΗ6· 0〜9. 5、 特に 好ましくは ρΗ7. 0〜9. 2の範囲のものが使用される。 例えば、 22mM〜 46mMのトリシンを含有する pH7. 5〜9. 2のバッファー、 あるいは 25 mM〜5 OmMのリン酸カリウムを含有する pH7. 0〜8. 0のバッファーが 好適に使用できる。 また、 マグネシウム塩としては、 特に限定はないが、 例えば、 塩ィ匕マグネシゥム、 酢酸マグネシゥムあるいは硫酸マグネシゥムが好適に使用で き、 その濃度は、 最終濃度で 1 mM〜 20 mM、 特に好ましくは 2 mM〜 10 m Mの範囲である。 また、 DNA伸長反応の基質となる dNTP s (dATP、 d CTP、 dGTP、 dTTP混合物） は、 最終濃度で、 それぞれ 0. lmM〜3. OmM、 特に好ましくは 0. 2mM〜l. 2 mMの範囲である。 使用するプライ マーの量は、 反応液量 50μ 1当たり l pmo l〜： L O O Opmo lの範囲であ り、 特に 10pmo l〜150pmo lの範囲が好ましレ、。 さらに、 反応液中に は増幅反応の安定化等を目的とした添加物を共存させることができ、 それぞれ最 終濃度として 0. 1 %以下のゥシ血清アルブミン （ B S A) 、 10 %以下のジメ チルスルホキシド （DM SO) 、 4 mM以下のプトレスシン 2塩酸塩あるいは 0·
01%以下のプロピレンジァミンを添加してもよい。 この他、 ΝΜΡ (1—メチ ノレ一 2—ピロロリジノン) 、 グリセロール、 ポリエチレングリコール、 ジメチノレ スルホキシドおよび/またはホルムァミドを含んでもよく、 これらの有機溶媒の 添加により、 オリゴヌクレオチドプライマ一の非特異的なアニーリングが軽減さ れることが期待される。
さらに、 DNAポリメラーゼが有している逆転写活性を阻害するような物質、 例えばホスホノギ酸 （PFA、 Phosphonoformic acid) を添加して本発明の方法 を実施してもよい。 逆転写活性を阻害する物質を添加した場合には、 標的核酸以 外の非特異的な産物の増幅が低減される。
さらにオリゴヌクレオチドプライマーの非特異的なアニーリングを軽減させる 別の態様としては、 本発明の検出方法、 増幅方法あるいは製造方法において、 増 幅反応に先立って、 铸型となる核酸と本発明で使用されるキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一のアニーリング処理を行うことが効果的である。 該処理はァ-一 リングを増強する物質、 例えばスペルミン、 スペルミジン等のポリアミン類ゃプ ロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液を使用して実施することが好まし レ、。 上記のポリアミン類を含有するアニーリング溶液としては塩を含有するもの が好適に使用でき、 特に限定するものではないが、 例えば、 塩ィ匕ナトリウム、 塩 化カリウム、 酢酸カリウム、 酢酸ナトリウム等とポリアミン類とを含有するァニ 一リング溶液が挙げられる。 アニーリング処理は、 通常、 プライマー、 铸型となる核酸を含有する上記のァ' ニーリング溶液を、 2本鎖核酸が変性する温度、 例えば、 90°C以上で保持した 後、 本発明の方法に使用される反応温度以下まで冷却して実施される。
アニーリング処理の工程の後、 上記混合液にさらに必要な他の成分、 例えば D NAポリメラーゼ、 RNa s eH、 d NT P等を添加して本発明の核酸増幅反応 が開始される。
エンドヌクレアーゼは、 例えば、 大腸菌由来の RN a s eHならば、 反応液量 50μ 1当たり 3〜200 Uの範囲が好ましく、 特に 15 U〜 60 Uの範囲が好 適である。 同様に、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌 由来 RNa s eHならば、 反応液量 50 μ 1あたり 3〜20 OUの範囲、 さらに 好ましくは 4〜4 OUの範囲である。 また、 DNAポリメラーゼは、 例えば、 Β c a BEST D N Aポリメラーゼ （宝酒造機） ならば、 反応液量 50 μ 1当 たり 0. 5 U〜 100 Uの範囲、 特に 1 U〜 22 Uの範囲が好ましい。
本発明の方法においてェンドヌクレアーゼと DN Aポリメラーゼを組み合わせ る場合、 特に限定はされないが、 例えば大腸菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あ るいはアルカェォグロバス属細菌由来の RN a s eH及び B e a BE ST DN Aポリメラーゼの組み合わせが好適である。 さらに、 上記エンドヌクレアーゼ及 ぴ DNAポリメラーゼはいずれもその種類によって好適に使用できるュ-ット数 が異なる場合が予想される。 その際には、 検出感度の向上あるいは増幅産物量を 指標にして、 使用されるバッファーの組成ならぴに酵素の添加量を調整すればよ レ、。 いずれの場合においても、 使用する酵素の種類にあわせて反応バッファーの 組成等を至適化するのは当然のことである。
(5) 本発明の核酸の増幅方法
本発明の方法は、 上記 (1) に示されたオリゴヌクレオチドプライマーを少な くとも 1種類使用し、 さらに上記 (2) に示されたエンドヌクレアーゼおよび上 記 （3) に示された DN Aポリメラーゼを組合わせて実施することができる。 ま た、 上記のように RN a s eH活性を有する DNAポリメラーゼを RN a s eH 活性が発現するような条件で使用することができる。
当該方法では、 伸長反応の基質となるヌクレオチド 3リン酸として PC R法等 に使われる dNTP、 すなわち d ATP、 dCTP、 dGTP、 dTTPの混合 物が好適に使用できる。 また、 dUTPを基質として用いてもよい。 さらに、 当 該 dNTPは、 使用される DNAポリメラーゼの基質となる限りにおいては、 d NTP (デォキシリボヌクレオチド 3リン酸） のアナ口グ、 たとえば 7—デァザ 一 dGTP、 d I TPの 3リン酸等を含んでいてもよレ、。 また、 dNTPあるい は dNTPアナログの誘導体を使用してもよく、 官能基を有する誘導体、 例えば アミノ基を有する dUTPを含んでいてもよレ、。 当該方法では、 キメラオリゴヌ クレオチドプライマ一を使用するが、 当該プライマーは、 例えば、 DNA合成機 等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。 さらに、 本発明の方 法においては、 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと通常のオリゴヌタレ ォチドプライマ一を組み合わせて使用することもできる。
本発明の方法においては、 使用される酵素の活性が反応中に低下するおそれの ある場合には、 反応の途中で当該酵素をさらに添加することができる。 特に限定 するものではないが、 例えば、 大腸菌由来の RN a s eHを使用する反応の途中 で該 RNa s eHをさらに添加してもよい。 添加する酵素は、 反応開始時に反応 液中に含まれる酵素と同じものでもよいし、 同じ作用を示す異なる種類の酵素で あってもよレ、。 すなわち、 反応途中で添加することにより、 検出感度の向上ある いは増幅産物量の増大等の効果が得られるならば、 添加する酵素の種類及ぴ該酵 素の性質には何ら限定はない。
本発明の方法において鏺型となる核酸、 すなわち DNAまたは RNAは、 当該 核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、 あるいは単離したものでもよい。 さらに、 上記試料を直接、 本発明の核酸増幅反応に使用してもよレヽ。 このような 核酸を含む試料には特に限定はないが、 例えば、 全血、 血清、 バフィ一コート、 尿、 糞便、 脳脊髄液、 精液、 唾液、 組織 （例えば、 癌組織、 リンパ節等） 、 細胞 培養物 （例えば、 哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等） のような生体由来試料、 ウイロイド、 ウィルス、 細菌、 カビ、 酵母、 植物及ぴ動物のような核酸含有試料、 ウィルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料 (食品、 生物学的製剤等） 、 あるいは土壌、 排水のような生物を含有する可能性 のある試料が挙げられる。 また、 前記試料等を公知の方法で処理することによつ て得られる核酸含有調製物であっても良い。 該調製物としては、 例えば細胞破枠 物やそれを分画して得られる試料、 該試料中の核酸、 あるいは特定の核酸分子群、 例えば、 mRNAを富化した試料等が本発明に使用できる。 さらに上記試料中に 含まれる核酸が公知方法で増幅された D NAあるいは RNA等の核酸等も好適に 使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、 例えば、 界面活 性剤による溶解処理、 超音波処理、 ガラスビーズを用いた振盪撹拌、 フレンチプ レスの使用等により行うことができる。 幾つかの例においては、 さらに操作を加 えて核酸を精製することが有利である （例えば、 内在性ヌクレアーゼが存在する とき） 。 これらの例において、 核酸の精製はフエノール抽出、 クロマトグラフィ 一、 イオン交換、 ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施 される。
RNA由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、 当該 R NAを铸型とし た逆転写反応によって合成された c D NAを鎳型として本発明の方法を実施すれ ばよレ、。 本発明の方法に適用することができる R NAには、 逆転写反応に使用ざ れるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、 試料中の全 R NAの 他、 mR NA、 t RNA, r RNA等の RNA分子群、 あるいは特定の RNA分 子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、 使用される反応条件において錄 型 RNAにァニールするものであれば特に限定されるものではなレ、。 該プライマ 一は、 特定の铸型 RNAに相補的な塩基配列を有するプライマー （特異的プライ マー） の他、 オリゴ d T (デォキシチミン) プライマーやランダムな配列を有す るプライマー （ランダムプライマー） であっても良い。 逆転写用プライマーの長 さは、 特異的なアニーリングを行う観点から、 好ましくは 6ヌクレオチド以上で あり、 更に好ましくは 9ヌクレオチド以上であり、 オリゴヌクレオチドの合成の 観点から、 好ましくは 1 0 0ヌクレオチド以下であり、 更に好ましくは 3 0ヌク レオチド以下である。 さらに、 逆転写用プライマーとして、 逆転写後の c DNA を铸型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとし て使用可能なキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を使用することができる。 こ のようなプライマーは、 上記 (1) に記載された性質を有し、 かつ RNAからの 逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はない。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、 RNAを鎵型とした cDNA合 成活性を有するものであれば特に限定はなく、 例えばトリ骨髄芽球症ウィルス由 来逆転写酵素 （AMV RT a s e) 、 モロ-一ネズミ白血病ウィルス由来逆転 写酵素 （MMLV RT a s e) 、 ラウス関連ウィルス 2逆転写酵素 （RAV— 2 RTa s e) 等、 種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。 このほか、 逆転写 活性を併せ持つ DNAポリメラーゼを使用することもできる。 また、 本発明の目 的のためには、 高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、 例えばサーマス属 細菌由来 DNAポリメラーゼ （T th DNAポリメラーゼ等） 、 好熱性パチル ス属細菌由来 DNAポリメラーゼ等を使用できる。 特に限定はないが、 例えば、 好熱性バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼが好ましく、 B. s t由来 DNA ポリメラーゼ （B s t DNAポリメラーゼ） 、 さらに B e a DNAポリメラ ーゼが好ましい。 例えば、 B e a DNAポリメラーゼは、 逆転写反応にマンガ ンイオンを必要とせず、 また、 高温条件下で铸型 RN Aの二次構造形成を抑制し ながら cDNAを合成することができる。 上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、 当該活性を有している範囲において天然体、 変異体のいずれもが使用できる。 また、 別の態様としては、 増幅しょうとする塩基配列を含む DNAあるいは R NAをあらかじめ複製した後、 本発明の方法の錶型となる核酸として用いてもよ レ、。 該複製の方法としては、 特に限定はされないが、 増幅しょうとする塩基配列 を含む核酸断片を挿入したベクターで適当な宿主を形質転換させた後、 得られた 形質転換体を培養して、 上記増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入し たベクターを抽出して使用する方法が例示される。 該ベクターは、 宿主内で安定 して複製されるものであれば特に限定はなく、 例えば、 pUC系、 pB 1 u e s c r i p t系、 pGEM系、 コスミド系、 ファージ系のいずれもが好適に使用で きる。 また、 宿主は、 使用されるベクターを保持することができるものであれば 特に限定はなく、 例えば、 培養が容易な大腸菌等が例示される。
さらに、 上記複製の方法の別の態様としては、 増幅しょうとする塩基配列を含 む核酸断片を錡型として RN Aポリメラーゼで該塩基配列を有する RN Aを転写 した後、 該 RNAをそのまま、 あるいは逆転写反応により cDN Aとして本発明 の方法の铸型に用いてもよい。 上記の増幅しょうとする塩基配列を含む核酸断片 は RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に限定はなく、 RN
Aポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに揷入されたものでもよい し、 末端に RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプターあるいは カセットをライゲーションさせたものでもよいし、 RNAポリメラーゼのプロモ 一ター配列を有するプライマーと適切な錄型を用いて酵素的に合成したものであ つてもよい。 すなわち、 上記の増幅しょうとする塩基配列を含む核酸断片を、 上 記のように配置された RNAポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、 RNA の形で複製、 増幅することができる。 上記ベクターは、 RN Aポリメラーゼのプ 口モーター酉 S列を有するものであれば特に限定はなく、 例えば、 pUC系、 pB 1 ue s c r i p t系、 pGEM系、 コスミド系、 ファージ系のいずれもが好適 に使用できる。 また、 該ベクターは、 環状のままあるいは直鎖状に処理したもの のいずれもが好適に使用できる。 さらに、 上記の複製、 増幅方法に用いられる R NAポリメラーゼは特に限定はなく、 例えば、 SP 6 RNAポリメラーゼ、 T
7 RNAポリメラーゼあるいは T3 RNAポリメラーゼ等が好適に使用でき る。
上記方法により単離したゲノム DNAや PCRフラグメントのような二本鎖 D NA、 および全 RNA若しくは mRNAから逆転写反応で調製された cDNAの ような一本鎖 DN Aのいずれもが本努明において铸型 DNAとして好適に使用で きる。 上記二本鎖 DNAの場合は、 一本鎖 DNAに変性する工程 （デネーチヤ 一） を施したもの及ぴ一本鎖 D N Aに変性する工程を施さないもののレ、ずれもが 好適に使用できる。
また、 鍀型が PCR増幅産物のような直鎖状 2本鎖 DNAにおいては、 本発明 の方法に用いるプライマーがアニーリングする位置を、 該 DNAの末端から約 5 0塩基程度内側に設定することにより、 前述のデネーチヤ一の工程を行わなくて も本発明の核酸の増幅方法を行うことができる場合がある。 RN A由来の配列を 有する核酸の増幅を目的とする場合には、 RNAを铸型とした逆転写反応によつ て得られた RNA— cDNA二本鎖核酸を、 RNa s eHを含有する本発明の増 幅用反応液にカ卩えることにより、 R N A鎮を分解して一本鎖 c D N Aとし増幅反 応を開始することができる。 さらに、 本発明の D N Aの合成方法に逆転写酵素活 性と鎖置換活性とを有する D N Aポリメラーゼを使用することにより、 RNAを 錶型とした逆転写反応と、 当該反応によつて生成した c D N Aを錡型にした D N A増幅反応とを 1種類の D NAポリメラーゼで行なうことができる。
上記铸型の長さは、 標的配列がその断片中に完全に含まれる力 または標的配 列の十分な部分が少なくとも断片中に存在することにより、 プライマー配列の十 分な結合を提供するようなものがよい。
本発明の方法では、 特に限定するものではないが、 鏡型 D NAが二本鎖 D NA の場合にはそれらを変性して一本鎖にすることにより鎳型 DN A鎖へのプライマ 一の結合を可能にさせることができる。 二本鎖 D NAが変性する温度、 例えば約 9 5 °Cで保持することは好ましい変性法である。 他の方法は p Hの上昇を含むが、 オリゴヌクレオチドプライマ一を標的物に結合させるためには、 増幅反応時に p Hを低下させる必要がある。 上記のような二本鎖を一本鎖 D N Aに変性する工程、 もしくは、 铸型が RNAの場合、 逆転写反応により c D NA (—本鎖 D NA) を 調製する工程の後、 等温条件下において、 連続的に核酸が増幅される。
ここで、 「連続的に」 とは、 反応温度、 反応液組成の変更を伴わずに反応が進 行していることを意味する。 また、 本明細書において 「等温」 とは、 酵素および 核酸鎖が上記各工程において機能する、 実質的に一定の温度条件のことを意味す る。
本発明の核酸増幅反応は、 例えば、 タレノウ断片のような常温性 D NAポリメ ラーゼを使用することにより常温 （例えば 3 7 °C) でも実施できるが、 耐熱性を 有する酵素 (エンドヌクレアーゼ、 D NAポリメラーゼ） を使用して高温、 例え ば 5 0 °C以上で、 さらに例えば 6 0 °C以上で実施することができる。 この場合、 プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、 D N A増幅の特異性が向上し、 また鍚型 D NAの二次構造が解消されることにより D NAポリメラーゼの伸長性 も向上する。 さらに該方法においては、 逆転写反応および核酸の増幅を連続して 行なう態様も可能であり、 上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、 あるいは逆転 写活性を有する D N Aポリメラーゼを使用して、 R N A由来の配列を有する D N Aを増幅することができる。
本発明を特に限定するものではないが、 本発明の各態様において、 好ましくは、 まず一本鎖の錄型 D N Aに該 D N Aに相捕的なキメラオリゴヌクレオチドプライ マーをアニーリングさせる。 次に DNAポリメラーゼの作用により、 当該プライ マーの 3 ' 末端より铸型 DNAの残りの配列に沿って铸型 D NAに相捕的な DN A (プライマー伸長鎖） を伸長させて二本鎖 DNAを合成する。 エンドヌクレア ーゼは当該二本鎖 DNAに作用してプライマー伸長鎖のプライマー部分からの新 たな D NAの伸長を開始させる。 本発明の一つの態様においては、 エンドヌクレ ァーゼは上記の二本鎖 D N Aにニックを入れるニッキング酵素として作用するか、 あるいはキメラオリゴヌクレオチドプライマーと铸型 D N Aの二本鎖 D N A構造 を変化させるが、 本願発明は理論によって限定はされない。 さらに、 鎖置換活性 を有する D NAポリメラーゼがニックの入った二本鎖 DNAのニックの 3， 末端 から D N A鎖を再伸長して新たなプライマー伸長鎖を生成し、 同時に二ックの 3， 末端から下流の D NAを遊離させる。 こうして先に合成されたプライマー伸 長鎖が新たなプライマー伸長鎖に置換される。
本発明の核酸増幅方法は、 鎳型核酸に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプラ イマ一と、 置換鎖に相補的なもう 1種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの 2種のプライマーを使用して実施することができる。 この場合、 一方のプライマ 一は鏡型となる D NA鎖に結合して鎖置換反応を起し、 そして他方のプライマー は上記の鎖置換反応によつて遊離した置換鎖に結合し、 新たな鎖置換反応を開始 する。 この態様を使用すると、 各反応産物が他のプライマーのための鎳型として 機能できることは明らかである。 このように鎳型量が増加することにより、 非直 線的に増幅産物が増加していく。
二本鎖 D NAを鍚型に用いて本発明の核酸増幅方法を実施する場合には、 二本 鎖のそれぞれにアニーリングするキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用す ることにより、 両方の鎖を増幅反応の铸型とすることができる。 二本鎖 D NAを 変性した後に反応を開始する場合には、 変性する前または後に、 キメラオリゴヌ クレオチドプライマ一、 4種のデォキシリポヌクレオチド 3リン酸 （d NT P) 、 DNAポリメラーゼおよびェンドヌクレアーゼを反応液に添加する。 熱処理によ り二本鎖 D NAを変性し、 力 耐熱性の酵素を使用しない場合には、 変性後に酵 素を添;!]口することが好ましい。
二本鎖の铸型 D NAと 2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する 本発明の核酸増幅方法の態様においては、 反応の条件等にもよるが、 各プライマ 一から伸長反応中のそれぞれの鎵型一伸長鎖中間体の間で铸型の交換が起こり、 合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成すること がある。 この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有して おり、 次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することがで きる。 この反応の結果、 一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。 さらに、 この反応中に鐯型の交換が起こった場合には前己と同様な二本鎖核酸が 再度生成される。
本発明により、 鎖置換活性を有する D NAポリメラーゼを使用し、 铸型交換反 応を行う工程を包含する核酸の増幅方法が提供される。 当該錶型交換反応におい ては、 铸型となる二本鎖核酸と、 それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2 種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、 鎖置換活性を有する D N Aポリメ ラーゼの存在下に、 該錶型に相補的な 2種のプライマー伸長鎖が合成される。 該 プライマー伸長鎖の合成の途中において、 プライマー伸長鎖のそれぞれの鎵型か ら他方のプライマー伸長鎖への铸型の交換が起こる。
ここで、 錄型交換反応とは、 2本鎖核酸の両側からの鎖置換反応による相補鎖 の合成が行われる際に、 DNAポリメラーゼがその铸型を交換し、 他方の D NA ポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞれ鎳型として、 以降の相補鎖 合成を行うことを言う。 言い換えれば、 鎵型となる 2本鎖核酸をそれぞれのブラ イマ一及び鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼで処理し、 該鏺型に相補的な 伸長鎖を生成せしめる反応において、 該伸長鎖を合成中に、 D NAポリメラーゼ がプライマー伸長鎖を、 当初の鍚型から、 他方のプライマー伸長鎖へと能動的に 錡型をスィツチングせしめる反応を言う。 DNAポリメラーゼが铸型交換反応を 行う能力を有することは、 特に限定するものではないが、 例えば後述の実施例 3 2に記載の方法によって確認することができる。
本発明には、 鎖置換反応中に上記の铸型交換反応を行う能力を有する D N Aポ リメラーゼが好適に使用でき、 例えば、 5 ' →3， ェキソヌクレアーゼ活性を欠 失した B c a D NAポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。 当該 酵素は B c a B E S T D NAポリメラーゼ （宝酒造社製） として市販されてお り、 また、 該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、 Escherichia coli H B 1 0 1 / p U I 2 0 5 (F E RM B P— 3 7 2 0 ) (平成 3年 5月 1 0日 （原寄託 日） より日本国〒 3 0 5— 8 5 6 6茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託） より日本特許第 2 9 7 8 0 0 1号に記載の方法によって調製することもできる。
本発明を特に限定するものではないが、 本発明の核酸の増幅方法の反応様式は、 例えば以下のように考察される。
本発明の核酸を増幅する方法においては、 鋅型となる二本鎖核酸を、 RN a s e Hの存在下、 それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2種類のキメラオリ ゴヌクレオチドプライマ一と鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼにより処理 して該铸型に相補的なプライマー伸長鎖が合成され、 鎳型交換反応により、 合成 されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングして成る二本鎖核酸、 及ぴ鍚型同士 がアニーリングした二本鎖核酸に前記 2種のプライマーがアニーリングした二本 鎖核酸を得ることができ、 後者の二本鎖核酸は錶型として再利用される。
プライマー伸長鎖同士がァニーリングした二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有 部位は RN a s e Hで切断され、 当該二本鎖核酸のそれぞれのプライマ 部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する D NAポリメラーゼによって铸型に相補的な 核酸配列を伸長して鎖置換が行われ、 錶型交換反応により、 プライマー伸長鎖同 士がァニーリングした二本鎖核酸、 及ぴ錶型同士がァニーリングした二本鎖核酸 に前記 2種のプライマーがァニーリングした二本鎖核酸を得ることができる。 また鏡型交換反応が起こらない場合は錶型とプライマー伸長鎖から成る 2種の 二本鎖核酸を得ることができる。
上記の 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸のそれぞれのプライマ 一部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼによって鐃型に 相補的な核酸配列を伸長して鎖置換が行われ、 铸型交換反応により、 プライマー 伸長鎖同士がァユーリングした二本鎖核酸、 及び錄型同士がァニーリングした二 本鎖核酸に前記 2種のプライマーがァニーリングした二本鎖核酸を得ることがで き、 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸は歸型として再利用される。 また铸型交換反応が起こらない場合は铸型とプライマー伸長鎖から成る 2種の 二本鎖核酸を得ることができる。
この 2種の二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位は R N a s e Hで切断され、 当該二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有す る D NAポリメラーゼによって铸型に相捕的な核酸配列が伸長され鎖置換が行わ れる。
また本宪明の核酸を増幅する方法においては、 鎳型となる二本鎖核酸を、 R N a s e Hの存在下、 それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2種類のキメラ オリゴヌクレオチドプライマ一と鎖置換活性を有する D NAポリメラーゼにより 処理して該铸型に相補的なプライマー伸長鎖が合成され、 铸型交換反応が起こら ない場合は、 鍚型とプライマー伸長鎖よりなる 2種の二本鎖核酸が得られる。 また、 本発明の増幅方法において、 キメラオリゴヌクレオチドプライマー伸長 鎖のリポヌクレオチド含有部位が切断される際に、 当該切断によって生じる 5 ' 側の断片 (プライマー部分) がリボヌクレオチドを含有しないように切断される 場合がある。 こうして生じたプライマー部分から伸長されたプライマー伸長鎖は もはやエンドヌクレアーゼにより切断されず、 この結果、 末端にプライマーの配 列を有する増幅産物が生成される。
上記のように、 本発明の核酸増幅方法においてはプライマーの配列を含まない 増幅産物の他、 一端、 もしくは両端にプライマーの配列を有する産物が生成しう る。 これらの産物も本発明にいう増幅産物に包含される。
本発明の核酸の増幅方法の一例を図 3 3〜 3 6に示す。 すなわち図 3 3〜図 3 6は本宪明の核酸の増幅方法における核酸の増幅の例を示す図である。
図 3 3〜図 3 6で示される核酸の増幅の例においては、 二本鎖核酸である鎳型
D NA、 当該鍚型 DNAの塩基配列の情報に基づいて合成された一対のキメラオ リゴヌクレオチドプライマー (図中キメラオリゴヌクレオチドプライマ一は、 そ の 3 ' 末端に 3個のリボヌクレオチドを有している。 図中リボヌクレオチドを白 丸で示す） 、 鎖置換活性を有する鎖置換型 D N A合成酵素 （D N Aポリメラー ゼ） 、 D N A— R NAハイブリッド音 (5位を切断するリボヌクレアーゼである R N a s e H、 および伸長鎖に取り込まれる基質である d NT Pの存在下での核酸の 増幅の例が示されている。
図 3 3に示すように、 鎊型 DN Aの塩基配列の情報に基づいて合成された一対 のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一は鐃型 D N Aの特定部分にァニーリング し、 ステップ 1に示すように、 鎖置換反応により各キメラオリゴヌクレオチドプ ライマーの 3， 末端から D N A鎖が伸長する。
次に、 図 3 4に示すように、 上流側と下流側から伸長してきたプライマー伸長 鎖は、 ステップ 2に示す铸型交換反応により、 ある割合で元の鎳型から離れ、 そ の 3， 部分でプライマー伸長鎖同士がアニーリングする。 このアニーリングした 伸長鎖同士がさらに互いの相補鎖を伸長し、 プライマー伸長鎖同士がァユーリン グした二本鎖 D N Aを形成する。 また、 置換鎖同士がアニーリングした二本鎖 D NAに、 前出一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングした二 本鎖 D NAが生成する。 これは図 3 4の出発物質として利用される。
図 3 4に示した、 プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖 DNAは、 図 3 5のステップ 3に示すように、 R N a s e Hの作用によって当該二本鎖 D N Aの D NA/RNAハイブリッド部分の、 キメラオリゴヌクレオチドプライマ一 に由来する R NAを含む片方の鎖のみが切断され、 二本鎖 D NAに切れ目 （ニッ ク） が導入される。
引き続き図 3 5のステップ 4に示すように、 二本鎖 D N Aの切れ目の部分から 鎖置換反応が起こり、 DNAが伸長する。 次いで図 3 5のステップ 5に示すよう に、 ある割合で図 3 4のステップ 2と同様に錶型交換反応がおこり， 増幅生成物 であるプライマー伸長鎖同士がァニーリングした二本鎖 D N Aが生成する。 また、 置換鎖同士がァニ"リングした二本鎖 D NAに前出一対のキメラオリゴ ヌクレオチドプライマ一がァニーリングした二本鎖 D N Aが生成する。
次に、 図 3 6に示すように、 図 3 5に示した置換鎖同士がアニーリングした二 本鎖 D NAに、 前出一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一がァニーリング した二本鎖 D N Aでは、 鎖置換反応により各キメラオリゴヌクレオチドプライマ 一の 3， 末端から DNA鎖が伸長する。 ついでステップ 2、 およびステップ 5と 同様な錶型交換反応がある割合で起こり、 プライマー伸長鎖同士がアニーリング した二本鎖 DNAが生成する。 当該二本鎖 D NAは図 3 5のステップ 3に戻り、 再度ステップ 3以降の反応が開始される。 また、 置換鎖同士がアニーリングした 二本鎖 D NAに前出一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリング した二本鎖 D NAが生成し、 図 3 6の出発物質として利用される。 これらの結果、 これらの二本鎖核酸の生成が繰り返される連鎖反応が生じ、 一対のキメラオリゴ ヌクレオチドプライマ一によつて挟まれた領域が特異的に増幅産生される。
キメラオリゴヌクレオチドを使用する本発明の核酸増幅方法においては、 増幅 領域が連なった重合体を生成する場合がある。 このような重合体は増幅領域が複 数個、 いずれも同じ向きに連なったものであり、 電気泳動による増幅産物の解析 ではラダー状のバンドとして確認される。 当該重合体の生成は、 増幅される領域、 該領域のサイズ、 その隣接領域、 使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマ 一の塩基配列あるいは反応の条件等により影響を受けることが考えられている。 上記の重合体は、 増幅領域を複数個含むものである。 当該重合体は、 例えば適 切なプローブとのハイプリダイゼーションによって多数のプローブとハイプリダ ィズし、 当該重合体が強いシグナルを発生することから、 増幅領域を含む核酸の 検出を目的とする場合に有用である。 また、 制限酵素消化等を組み合わせて、 重 合体より増幅領域、 またはその一部をモノマーとして得ることもできる。
本発明に使用される DNAポリメラーゼは、 プライマー部分の 3， 末端から下 流への伸長鎖合成に伴い、 先に伸長された D N A鎖の置換を行う必要がある。 そ して重要なことは置換鎖を分解する可能性のある 5 ' →3 ' ェキソヌクレアーゼ 活性を示さないことである。 このような DN Aポリメラーゼ、 例えば大腸菌由来 の DNAポリメラーゼ Iのェキソヌクレアーゼ欠損変異体であるクレノゥ断片、 B s t D NAポリメラーゼ由来の同様の断片 （ニューイングランドパイオラブス 社製） 、 B . c a由来の B e a B E S T D NAポリメラーゼ （宝酒造社製） が 有用である。 シークエネース 1 . 0およびシークエネース 2 . 0 (米国バイオケ ミカル社） ゝ ジーン （Gene) 第 9 7巻、 1 3〜 1 9頁 （1 9 9 1 ) 記載の T 5 DNAポリメラーゼおよび φ 2 9 DNAポリメラーゼも使用することができる。 通常は 5， →3， ェキソヌクレア^ "ゼ活"生を有するポリメラーゼであっても、 そ の活性が適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合は、 本発明の DN A合成方法に使用できる。
'本発明の核酸の増幅方法は、 変温で行ってもよく、 又は等温で行ってもよい。 ここで変温とは、 各工程の反応を妨げない範囲で各工程の反応温度を変化させる ことを意味する。 すなわち、 例えば、 プライマーのアニーリング、 相ネ慮鎖の合成 反応、 相捕鎖のニッキング、 そして置換反応のそれぞれに適した温度に変化させ る場合のことをいう。
次に等温とは、 各工程の反応温度を変化させず、 各工程が実質的に一定の温度 で行われることを意味する。 いずれの場合においても、 最適の反応条件となるよ うに温度を設定するのは当然である。
本発明の核酸の増幅方法の 1つの特徴としては、 核酸の合成方法において温度 を上げ下げする必要がないことにある。 即ち、 本発明は等温での核酸の合成方法 を提供する。 従来の多くの核酸増幅法は、 温度を上下することにより合成鎖から 標的物を解離する必要があり、 例えばサーマノレサィクラーのような特別な反応装 置を必要とするが、 本発明の方法においては一定温度を保持できる装置のみでも 実施することができる。 このように、 本努明の方法は、 単一の温度で実施するこ とができる。 好ましくは、 プライマーの非特異的なアニーリングが低減され、 か っ铸型となる核酸にプライマーが特異的にアニーリングするように反応温度、 ス トリンジエンシーのレベルを設定して実施される。 特に限定するものではないが、 上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の方法を高温条件下で行う事ができる。 さらに、 反応の効率を高く保つ観点から、 本発明の方法は使用する酵素の活性が 十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。 従って、 使用する酵素にも よるが、 好ましい反応温度は、 約 20 °C〜約 80 °Cであり、 さらに好ましくは約 30°C〜約 75°Cであり、 特に好ましくは、 約 50°C〜約 70°Cである。 特に高 温条件下で反応を行う場合には、 常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライ マーを使用することが好ましい。 各反応温度に適したプライマーの配列及ぴ長さ の設定については、 例えば、 その Tm値を参考にしてもよく、 あるいは市販のプ ライマー設計ソフト、 例えば、 OL I GOTM P r ime r Ana l y s i s s o f twa r e (宝酒造社製） を使用してもよい。 例えば、 本発明の方法にお いて反応温度を 55°Cから 60°Cあるいは 65°Cに設定した場合、 該方法に使用 するプライマーの長さとしては、 特に限定するものではないが、 例えば 12ヌク レオチド〜 100ヌクレオチドの長さ、 好ましくは 14ヌクレオチド〜 50ヌク レオチドの長さ、 さらに好ましくは 15ヌクレオチド〜 40ヌクレオチドの長さ のプライマーが使用できる。 このように反応温度を上げることの効果としては、 鎳型 D N Aの二次構造を解消できることが挙げられ、 G C含量の高い錶型核酸を 使用した場合にも所望の核酸が増幅される。 また、 長鎖長の領域を増幅する場合 においても同様の効果がある。 該効果は、 約 60 b p〜約 20 k b pの範囲で、 さらに約 110 b p〜約 4. 3 k b の範囲で、 特に約 130b p〜約 1500 b の範囲で認められる。
さらに、 铸型となる核酸の GC含量に応じて反応温度を調節し、 増幅効率を向 上させることができる。 例えば、 鎊型となる核酸として GC含量の低いものを使 用する場合には、 増幅する鎖長やプライマーの Tm値にもよるが、 50〜55°C で本発明の増幅反応を行うことができる。
また、 本 明の方法において、 逆転写酵素活性を持つ DN Aポリメラーゼ、 例 えば、 B c aBEST DNAポリメラーゼを使用した場合、 RNAから cDN Aを調製する工程 （逆転写反応） を含む RNA由来の核酸の増幅を簡便に実施す ることができる。 また、 RNAから cDNAを調製する工程を独立させて行い、 その生成物 （cDNA) を本発明の方法に鎳型 DNAとして使用することもでき る。
いずれの場合においても、 本発明の方法においては、 適当な方法、 例えば酵素 を失活させたり反応温度を低下させて反応を停止させるか、 または基質のうちの いずれ力一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰り返される。
本発明の核酸の増幅方法は、 核酸の増幅を利用した種々の実験操作、 例えば核 酸の検出、 標識、 塩基配列の決定に使用することができる。
また、 本発明の核酸の増幅方法は、 i n s i t u核酸増幅方法、 DNAチッ プのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは多種類の領域を同時に増幅する マルチプレツクス核酸増幅方法として使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法の特徴の一つとして、 一本鎖の DN Aを調製すること が可能なことが挙げられる。 この目的のためには、 1種のキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一を使用する方法のみならず、 2種のキメラオリゴヌクレオチドプ ライマーを使用する方法を使用することもできる。 例えば、 2つのオリゴヌタレ ォチドプライマ一を用いる場合は、 一方のオリゴヌクレオチドプライマー量を他 方の量に対して過剰にして増幅反応を行なう、 いわゆるァシンメ トリック （非対 称） 一P C R法において採用される方法と同様のプライマー比率によって行なう ことができる。 当該プライマー比率は、 特に限定されるものではないが、 1 ： 1 0〜1 ： 5 0 0の範囲で好適に使用でき、 特に好ましくは 1 ： 1 0〜1 : 1 0 0 の範囲である。 この結果、 一方の鎖を置換した産物の量が、 他方の鎖を置換した 産物の量に比べて過剰になる。
本発明の核酸の増幅方法によれば実質的にその相補鎖を含有しない一本鎖の D N Aを調製することができ、 例えば、 D N Aチップのような核酸固定化物を作製 するための一本鎖 D NA、 標的核酸検出のための一本鎖 D NAプローブ、 または 長鎖 P C R法のためのメガブライマーを容易にしかも短時間に作製することがで きる。 また、 本発明の方法を使用することにより、 センス配列のみ、 あるいはァ ンチセンス配列のみを選択して増幅させることが可能である。 従って、 本発明は センス配列あるいはアンチセンス配列を有する核酸の製造方法としても有用であ る。
また、 本発明の方法は、 ビシン、 トリシン、 へぺス、 リン酸塩あるいはトリス 緩衝液中で行うことにより微量の铸型となる核酸からでも所望の核酸配列領域を 増幅することができる。
さらに、 本発明の核酸の増幅方法には経時的な温度調節が可能な反応装置を使 用する必要がないため、 大容量の反応液を使用して増幅反応を実施することがで きる。 したがって、 例えば医薬用途等に使用される核酸の工業的大量製造が可能 である。
本発明の核酸の増幅方法において使用するプライマーの利用効率は、 ほぼ 1 0 0 %であり、 従来の方法、 例えば P C R法の利用効率に比べて 5倍〜 1 0倍高く することができる。
また、 本発明の核酸増幅方法は、 鏡型となる核酸の塩基配列に忠実に増幅産物 を生成することができる。 本発明の方法における DN A合成の誤りの頻度を得ら れた增幅産物の塩基配列を解析することによって確認したところ、 高い忠実度で 核酸を増幅できることが知られている LA— PC R法と本発明の方法のそれぞれ で得られた増幅産物中に見出された誤りの頻度は同程度であった。 すなわち、 本 発明の方法は L A— PCR法に匹敵する忠実度を有している。
(6) 本発明の標的核酸の検出方法おょぴ該方法のためのキット
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、 試料中の標的核酸の検出を行 うことができる。 当該検出方法は、
(a) 上記の本発明の核酸の増幅方法により、 標的核酸を増幅する工程；および、 (b) 上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
を包含する。
上記 （a) 行程において、 RNAを铸型とする場合は、 逆転写反応と核酸増幅 反応を 1段階で行つてもよい。 特に限定はされないが、 逆転写酵素と鎖置換型 D NAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、 AMV RTa s e、 MMLV RT a s eあるいは RAV— 2 RTa s eと B e a DNAポリメラーゼの糸且 み合わせが好適に使用できる。
上記方法は試料中に存在する特定の遺伝子の検出、 定量に利用することができ る。 すなわち DNAまたは RNA等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から 特定の遺伝子を検出、 定量することができる。 前述の試料としては、 特に限定は ないが、 例えば、 全血、 血清、 バフィ一コート、 尿、 糞便、 脳脊髄液、 精液、 唾 液、 組織 （例えば、 癌組織、 リンパ節等） 、 細胞培養物 （例えば、 哺乳動物細胞 培養物及び細菌培養物等） のような生体由来試料、 ウイロイド、 ウィルス、 細菌、 カビ、 酵母、 植物及び動物のような核酸含有試科、 ウィルス又は細菌のような微 生物が混入もしくは感染している可能性のある試料 （食品、 生物学的製剤等） 、 あるいは土壌、 排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の遺伝子 を検出、 定量することができる。 さらに例えば、 ウイロイド、 ウィルス、 カビ、 細菌あるいはその他の微生物等由来の特定の遺伝子をターゲットとすることによ り、 該遺伝子の存在の有無によって上記の微生物の存在を検出、 定量等に利用す ることができる。 特に、 病原性の微生物の検出方法は衛生、 環境分野で有用であ る。 さらに、 生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現状態を調べるために本発明の 方法を使用することもできる。 特に疾病関連遺伝子、 例えば細胞の癌化に関連す る遺伝子等の検出、 発現状態の確認は医療分野において有用である。 上記検出法 のための鍀型として使用される核酸は、 R NAあるいは DNAのいずれもが好適 に使用できる。
さらに、 本発明の標的核酸の検出方法により、 標的核酸上の塩基配列の違いを 判別することができる。 この態様においては、 使用されるキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一の 3 ' 末端部分が、 標的とされる塩基配列の判別しょうとする特 定の塩基付近に位置するように、 たとえば、 該塩基とプライマーの 3 ' 末端の塩 基とが水素結合を形成するようにプライマーが設計される。 このようなキメラォ リゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅反応を実施した場合、 プライマーの 3， 末端部分の塩基配列と铸型の塩基配列との間にミスマツチが存在する場合に は標的核酸からの増幅が起こらず、 増幅産物の生成が見られない。 当該方法によ り、 点突然変異、 一塩基置換 (Single nucleotide polymorphysm, S N P) のよ うな遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。
本発明の標的核酸の検出方法は、 核酸を含有する試料より直接、 標的核酸を増 幅することにより実施することができる。 この場合、 増幅される標的核酸の鎖長 には、 特に限定はないが、 感度よく標的核酸を検出する観点からは、 例えば 2 0 0 b p以下、 さらに好ましくは 1 5 0 b p以下の領域が有効である。 該増幅鎖長 となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を設定することによ り、 高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、 本発明の検出方法では、 前述の （4 ) で例示したような、 ビシン、 ト リシン、 へぺス、 リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、 及びスペルミジンやプロピレンジァミンを含有するァニーリング溶液の使用によ り、 微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。 こ の場合、 使用するェンドヌクレアーゼと DN Aポリメラーゼは特に限定はされな いが、 例えば大腸菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロパス 属細菌由来の RN a s e H及び B e a B E S T D N Aポリメラーゼの糸且み合わ せが好ましレ、。 特に、 上記エンドヌクレア一ゼ及ぴ D NAポリメラーゼはともに その種類によって好適に使用できるュニット数が異なる場合が予想されるが、 そ の際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、 該バッファー の組成およぴ酵素の添加量を調整すればよレ、。
本発明の検出方法においては、 標的核酸の増幅の際に、 dUTPを基質として 取り込ませることができる。 したがって、 dUTPを基質に用いた場合には、 ゥ ラシノレ N—グリコシダーゼ (u r a c i l N— g l yc o s i d a s e ： U NG) を利用して増幅産物を分解し、 増幅産物のキャリーオーバーを防止するこ とができる。
上記 （b) 工程には公知の核酸検出方法、 例えば電気泳動により特定のサイズ の反応産物を検出する方法や、 プローブとのハイブリダィゼーシヨンによる検出 等を使用することができる。 さらに、 磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好 適に使用できる。 上記電気泳動による検出には、 通常、 ェチジゥムブロマイド等 の蛍光物質が使用されるが、 プローブとのハイブリダィゼーションを組み合わせ てもよい。 また、 プローブは放射性同位元素による標識の他、 ピオチンや蛍光物 質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。 この他、 上記 (a) 工程 において標識ヌクレオチドを使用することにより、 増幅産物に標識ヌクレオチド を取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強 を行うことができ、 さらに蛍光偏光法、 蛍光エネルギー転移等を利用した検出を 行うことも可能である。 さらに、 適切な検出系を構築することにより、 標的核酸 を自動的に検出することや、 あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。 また、 ハイプリッドク口マト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された 2種類以上の蛍光物質で標識されたリ ボヌクレオチド （RNA) プローブを本発明の検出方法に使用することができる。 当該プローブは蛍光を発することはないが、 これに相補的な標的核酸由来の増幅 DNAにアニーリングした場合、 RNa s eHは該プローブを分解する。 この結 果、 プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、 標 的核酸の存在を知ることができる。 RNa s eHを使用して本発明の核酸の増幅 方法が実施された場合には、 その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標 的核酸を検出することができる。 当該プローブの標識に使用される蛍光物質とし ては、 例えば、 6— F AM (6-carboxyf luorescein)と T AMR A (N, N, N' , N' - tetramethyl - 6 - carboxyrhodamine)との組み合わせが好適に使用できる。
さらに、 本発明は前記の標的核酸の検出方法に使用されるプローブを提供する。 本発明のプローブは、 上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通 常のハイブリダイゼーションの条件にぉレ、て標的核酸にハイブリダイズし得るも のであれば特に限定はないが、 増幅産物を特異的に検出する観点からは、 例えば 厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダィズするものが好まし レヽ。 前記、 厳密なハイプリダイゼーシヨン条件は、 例えば 1989年、 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、 T. マニアテイス （T. Ma n i a t i s) ら編集、 モレキュラー クローユング：ァ ラボラトリー マ二ユア ノレ第 2版 (M o 1 e c 1 a r C l o n i n g ： A La b o r a t o r y Ma nu a l 2n d e d . ) に記載されている。 具体的な厳密な条件と しては、 例えば以下の条件を挙げることができる。 すなわち、 0. 5%SDS、 5 Xデンハルツ [De nh a r d t' s、 0. 1 %ゥシ血淸アルブミン （B S A) 、 0. 1 %ポリビエルピロリ ドン、 0. 1%フイコール 400] 及ぴ 100 g/m 1サケ精子 DNAを含む 6 X S S C (1 33。は0. 15M N a C l、 0. 015M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0) 中で、 使用するプロ一 ブの T m値より約 25 °C低レ、温度で 4時間〜一晚保温を行う条件を言う。 前記プ ローブは、 標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたもの を使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法の等温下における増幅方法においては、 サーマルサイ クラ一のような装置を必要としない。 また本発明の増幅方法では、 使用するブラ イマ一を 1種類もしくは 2種類と従来法よりも少なくすることができる。 d N T Pのような試薬も PCR等で用いられるものを流用できるため、 ランニングコス トを従来法よりも低くすることができる。 そのため、 ルーチンワークを行なって V、る遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。 さらに、 本発明の方法は P C R法 よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、 簡便、 迅速、 高感度な 遺伝子検出方法として利用することができる。
レの遺伝子解析においては、 大量の塩基配列を解析するために反応 系を微量化し、 さらに集積度を高める試みがなされている。 その手段の一つとし て、 最先端の超微細加工技術を駆使して、 ゲノム解析の基本プロセス、 例えば、 D NAの細胞からの抽出、 D NA増幅反応、 電気泳動、 ハイブリダイゼ一シヨン、 目的 D N Aの検出等のプロセスを数 c m角〜指先大のマイクロチップ上に集積化 したものが開発されている。 該システムはマイクロチップ、 あるいはナノチップ と呼ばれている。
このようなシステムにおける遺伝子増幅反応として現在は P C R法が考えられ ているが、 該方法は経時的に温度の上昇、 下降を繰り返す温度制御のための手段 を必要とするため、 システムが複雑なものとなる。 これに対し、 等温条件下で核 酸を増幅できる本発明の方法はシステムの単純化が可能であり、 上記のような集 積ィ匕されたシステムでの利用に非常に好適である。 さらに、 本発明の技術を利用 してさらに高レ、集積度のシステムの構築が可能となる。
( 7 ) 本発明のキット
本発明は、 前述の本発明の核酸の増幅方法、 または本発明の核酸の検出方法に 使用されるキットを提供する。 1つの実施態様において、 該キットは、 パッケ一 ジされた形態において、 鎖置換反応における DNAポリメラーゼおよぴェンドヌ クレアーゼの使用のための指示書を含むことを特徴とする。 さらに、 鎖置換活性 を有する D N Aポリメラーゼ、 ェンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液 を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。 あるいは、 市販の鎖置換活性 を有する DNAポリメラーゼぉよび/またはェンドヌクレアーゼを指示書に従つ て選択し、 使用してもよい。 さらに、 RNAを铸型とする場合の逆転写反応用試 薬を含んでもよい。 D NAポリメラーゼは、 上記 ( 3 ) 記載の本発明に使用され る D NAポリメラーゼから選択することができる。 また、 エンドヌクレアーゼは、 上記 ( 2 ) 記載のエンドヌクレアーゼから選択することができる。 さらに、 該鎖 置換反応用緩衝液は、 上記 ( 4 ) 記載の反応バッファー組成を有するものが好適 に使用できる。
上記 「指示書」 とは、 当該キットの使用方法、 例えば鎖置換反応用試薬液の調 製方法、 推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、 パンフレットまたはリ 一フレット形式の取り扱い説明書のほか、 キットに添付されたラベル、 キットが 納められたパッケージ等に記載されたものを含む。 さらに、 インターネットのよ うな電子媒体を通し、 開示、 提供された情報も含まれる。
さらに、 本発明のキットにおいては、 前述の （4 ) で例示したような、 ビシン、 トリシン、 へぺス、 リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、 及びァエーリング溶液が含まれていてもよい。 また、 鎖置換能を有する DNAポ リメラーゼゃ R N a s e Hが含まれていてもよい。 さらに、 修飾されたデォキシ リボヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログを含有して いてもよい。
さらに、 標的核酸の検出方法に使用されるキットは、 上記の指示書、 増幅反応 のための試薬類の他、 標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライ マー、 増幅された標的核酸を検出するための試薬、 例えばプローブ等を含むもの であってもよい。
また、 本発明のキットは、 上記の本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一及び Z又は本発明のプローブを含有するキットも包含する。
( 8 ) 本発明の組成物
本発明は、 前述の本発明の核酸の増幅方法、 または本発明の核酸の検出方法に 使用される組成物を提供する。 該組成物としては、 例えば、 上記 ( 2 ) に記載の エンドヌクレアーゼならびに上記 （3 ) に記載の DNAポリメラーゼを含有する ものが挙げられる。 さらに、 増幅反応を行うための成分として、 緩衝成分ゃマグ ネシゥム塩、 d NT P等を含んでいてもよい。 さらに、 修飾されたデォキシリポ ヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログを含有していて もよい。 緩衝成分やその他の添加物としては上記の （4 ) に記載されたものを使 用することができる。
特に好適な態様としては、 本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成 分が含有された組成物を挙げることができ、 該組成物は適切な铸型とキメラオリ ゴヌクレオチドプライマ一を添加するのみで増幅反応を実施することができる。 さらに、 増幅対象があらかじめ明らかである場合には、 当該増幅対象の増
マーを含有する組成物が好適である。
( 9 ) 本発明の核酸を所定の領域に整列させた核酸固定化物とその製造方法 D NAチップは、 多数の異なる遺伝子あるいは D N Aの断片をスライドグラス 等の固相担体上の所定の領域あるいは所定の位置に整列させて固定ィヒした核酸固 定化物であり、 D N Aマイクロアレイ （D NAアレイ） とも呼ばれる。 D NAチ ップは、 試料より調製した核酸試料、 好ましくは標識された核酸試料と接触させ てハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、 核酸試料中に存在する、 D NAチ ップ上の所定の領域に整列させて固定化された D N Aと相補的な配列を有する核 酸の存在を調べる目的で使用される。 試料中の多数の核酸を一度の操作で検出、 定量できることから、 D N Aチップは遺伝子の発現解析や変異あるいは多型解析 を飛躍的に加速させる手段として非常に有用である。 二本鎖核酸が所定の領域に 整列させて固定ィヒされた D N Aチップは適切な変性処理の後にハイブリダィゼー ション工程に使用されるが、 検出しようとする標的核酸に相補的な一本鎖 D NA が所定の領域に整列させて固定ィ匕された D N Aチップは、 標的核酸の検出に特に 好適である。
上記のように、 本発明の方法により所望の D N Aを一本鎖の状態で増幅するこ とができる。 増幅物の精製方法に限定はないが、 イソプロパノール沈殿による精 製が好ましい。 こうして得られた D NA、 特に好ましくは実質的にその相補鎖を 含有しない一本鎖の D NAは、 D NAチップ上に固定する D NA断片として好適 に使用できる。 即ち、 本宪明の方法は、 D N Aチップ作製において所定の領域に 整列させて固定ィヒする D NAを調製する方法として好適に使用できる。 こうして 得られた D N Aを所定の領域に整列させて固定する担体は不溶性のものであれば 特に限定はなく、 ガラス、 プラスチック等で作製された板状の担体の他、 ニトロ セルロースやナイロン製の膜状の担体が好適に使用される。 また、 その固定化に あたっては公知の核酸固定化方法が使用できる。 上記の D NAはそのまま担体に 固定化を行う他、 適当なリンカ一を介して、 または複数分子の D NAをライゲー シヨンさせたうえで固定ィヒしてもよい。 さらに、 本発明の製造方法においては、 増幅された核酸に修飾されたデォキシリポヌクレオチドを取り込ませることがで きるため、 該修飾基を用いて当該核酸固定ィ匕物を作製することができる。
本発明の方法により増幅された D NAを所定の領域に整列させて固定化した核 酸固定化物、 例えば D NAチップを試料より調製された標的核酸を含む可能性の ある核酸試料と接触させ、 ハイブリダィゼーシヨンを実施することにより、 当該 核酸固定化物上の核酸とハイブリダイズした標的核酸を検出、 定量することがで きる。 特に、 本発明の方法により増幅された一本鎖の D NAを所定の領域に整列 させて固定ィ匕した D NAチップは、 従来よりも簡便な操作で、 力つ、 高感度、 高 再現性での標的核酸の検出を可能とする。
( 1 0 ) 本発明の核酸の大量製造方法
上記のように、 本発明の一態様により等温で実施可能な核酸の増幅方法が提供 される。 該方法は、 増幅しょうとする核酸の鎳型となる核酸の他、 反応に必要な 各種成分を混合して等温条件下で反応させることにより、 所望の核酸を製造する ことができる。 P C R法では反応混合物の温度を経時的に変化させる必要がある ため、 反応のスケールは温度制御が可能な容量 （通常、 2 0 0 1以下） に限ら れ、 スケールアップは困難である。 一方、 当該方法にはこのような制約はなく、 反応混合物の容量を増加させることにより大量の核酸を製造することが可能であ る。 本発明の方法においては、 特に限定はされないが、 例えば 2 0 0 Iを越え る量が好適であり、 好ましくは 3 0 0 1以上、 特に好ましくは 5 0 Ο μ 1以上 である。 当該方法は 1分子の铸型から多数の相補鎖分子が合成され、 さらにこれ らの相捕鎖分子を鍀型とした核酸の合成も可能であることから、 铸型ならびにプ ライマーを適切に設定することにより、 所望の核酸を効率よく、 大量に製造する ことができる。 さらにまた、 当該方法が P C R法のような特殊な装置、 頻繁な温 度変ィ匕を必要としないことは設備、 エネルギーのコスト面からも有利であり、 ェ 業的な核酸の大量製造方法としても優れている。
さらに、 本発明の製造方法では、 前述の （4 ) で例示したような反応バッファ 一及ぴァニーリング溶液の使用により、 微量の铸型核酸からも目的とする核酸配 列を増幅し、 製造することができる。 この場合、 使用するエンドヌクレアーゼと D NAポリメラーゼは特に限定はされないが、 例えば大月昜菌由来の R N a s e H 及ぴ B e a B E S T D NAポリメラーゼの組み合わせが好ましい。 さらに、 上 記ェンドヌクレアーゼ及び D N Aポリメラーゼはともにその種類によって好適に 使用できるュ-ット数が異なる場合が予想されるが、 その際には増幅産物量の最 大を指標にして、 該バッファ一の組成およぴ酵素の添加量を調整すればよレ、。 また、 本発明の方法は、 上記の DNAチップに固定化するための DNA断片の ような多種類、 かつ大量の DNA断片を供給する方法として有用である。 すなわ ち、 1つの態様としては、 単純な反応工程で DN A断片を大量に得ることができ、 別の態様としては限られた種類のプライマーを使用して非常に多種類の DNA断 片を得ることができる。 後者は、 本発明の方法の铸型となる核酸を公知の核酸増 幅方法、 例えば P C R法等であらかじめ増幅する工程を組み合わせて実施するこ とができる。 例えば、 ヌクレイック ァシッズ リサーチ （Nucleic Acids Research) 第 24卷、 19号、 3778〜 3783頁 （1996) に記載のタグ 配列を有するランダムプライマーを使用して核酸を増幅する方法あるいは、 ジェ ノミックス （Genomics) 第 13巻、 718〜 725頁 （1992) に記載の縮重 プフづマー (Degenerate primer) を用レヽた DOP— PCR (Degenerate
Oligonucleotide- Primed PCR) 法に基づき、 限られた種類のプライマーを使用し てあらゆる種類の铸型核酸を増幅することができる。 さらに、 前述のランダムプ ライマーや縮重プライマーに付加されたタグ配列にあわせて本発明の核酸の増幅 方法に使用されるプライマーを設計すれば、 上記の工程で作成されたあらゆる铸 型核酸について 1もしくは数種類のプライマーで本発明の核酸増幅反応を実施す ることができる。 このように、 適切な铸型核酸の調製工程と本発明の方法を組み 合わせれば、 多種類の DNA断片を従来よりも安価で、 大量に供給することがで さる。
核酸を含有する医薬としては、 細胞内において有用なポリペプチドを発現させ るための二本鎖 D N A、 目的の遺伝子の発現を抑制するための一本鎖ァンチセン ス DNA等があり、 これらは適切な手段、 例えばリボソーム等の遺伝子導入用担 体を使用して生体に投与される。 本発明の核酸の製造方法は、 上記のような医薬 用途等の一本鎖、 もしくは二本鎖の核酸を大量に製造するための方法として好適 である。 さらに、 本発明の方法では、 例えば生体内での分解を抑制するような d NTPのアナ口グを含有する核酸を製造することも容易である。
本発明において増幅された DNA断片は通常のヌクレオチドにより構成される ため、 例えば、 増幅された DNAはその内部の制限酵素部位を用いて適当なベタ ターにサブクローニングすることができる。 さらに RF LPのような制限酵素を 用いた処理をすることも問題なくでき、 遺伝子検査の分野においても広く利用で きる。 また、 増幅断片中に RNAポリメラーゼのプロモーター配列を糸且込んでお けば、 増幅断片を錄型として RN Aを合成し、 例えば、 合成された RNAをプロ ープとして使用可能である。 当然ながら、 通常の d NT Pの代わりに蛍光標識さ れた d NT Pを使用して本発明の核酸増幅方法を実施することにより、 蛍光標識 された DN Aプローブを作製することができる。
本発明の核酸の増幅方法の特徴を以下に列挙する。
1. 少ない铸型量より、 大量の核酸を増幅することができる。 2種のプライマ 一を使用した場合には増幅産物は 2次関数的に増加する。
2. 等温でも実施でき、 その場合サーマ サイクラ一のような装置を必要とし ない。 このため、 容易に反応容量をスケールアップすることができる。
3. 通常、 増幅反応は 1または 2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーと 2種の酵素 （DNAポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼ） で実施される。
4. 1分子のプライマーより多数の DNA鎖が合成されるため、 プライマー量 が増幅産物量を制限することがない。 さらに、 プライマー使用効率が約 100% と P C R法に比べて極めて高い。
5. 一本鎖、 二本鎖の DN Αを目的に応じ選択的に増幅することができる。
6. 増幅反応に （ひ一 S) d NT Pのような d NT Pアナログを必要としない ため、 試薬コストが安価である。 また、 dNTPアナログを含有しない、 天然型 の核酸を取得することが可能である。
7. 核酸複製方法と組み合わせることにより、 安価で大量の DN A増幅断片を 供給することができる。
8. 本発明の検出方法は、 従来法と比較して同等以上の検出感度を有する。 さ らに、 同じ検出感度であれば、 従来法よりも短時間で検出することができる。
9. マイクロチップ、 ナノチップにおける核酸の増幅、 検出の自動化、 微量化、 高集積ィ匕に適した方法である。
以上のように、 本発明の方法は遺伝子の検出、 工業的スケールでの核酸製造の いずれにも適した方法である。 実施例
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明は、 これらの実施例 によって限定されるものではない。
参考例 1 好熱菌バチルス カルドテナックス由来の RN a s eHの調製 トリプトン （ディフコラボラトリーズ社製） 0. 2%、 酵母エキス （ディフコ ラボラトリーズ社製） 1. 5 %を含む培地 （pH6. 5) 1 00m lにバチルス カルドテナックス YT— G株 （Bucillus caldotenax YT - G、 ドイツチェ ザムル ンク フォン ミクロオルガ-スメンより購入： DSM406) を植菌し、 6 0°Cで 140分間振とう培養し、 この培養液を前培養液とした。 ついで、 同組成 の培地 3リツトルに前培養液 30m lを接種し、 通気量 2. 5リツトル Z分、 攪 拌数 250回転/分、 温度 60°Cで 5時間培養した。
培養液を遠心分離 （5000 X g、 1 5分） し、 集菌した。 湿菌重量 402 gの菌体を 1 0mM メルカプトエタノール、 0. 5M Na C l、 1 mM E DTA、 20 Μ PAPMSFを含む 5 OmMトリスー HC 1緩衝液 （pH7. 5) 1 00 Om 1に懸濁し、 MI N I— L a b (AP V GAUL I N/RAN
N I E社製） にて菌体を破枠後、 遠心分離で細胞残渣を除き、 上清を回収した。 得られた上清液に終濃度が 0. 1 %となるようにポリエチレンィミン溶液を加 え、 攪拌後、 1時間放置し、 遠心分離にて上清を回収した。 この上清液に 50% 飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを加え、 遠心分離で得られた沈殿を 1 OmM メルカプトエタノール、 0. ImM EDTA、 5 OmM Na C I、 1 0%グ リセロールを含む 2 OmM トリス一 HC 1緩衝液 (pH7. 5) に溶解し、 同 緩衝液に対して透析した。 同緩衝液で平衡化した 280m lの DE 52カラム (ワットマン社製） に透析試料を負荷し、 非吸着画分を集めた。
さらに平衡ィ匕に用いた緩衝液 42 Om 1で洗浄し、 洗浄画分を集めた。 DE 5 2カラムクロマトグラフィ一での非吸着画分と洗浄画分を混合し、 10 mM メ ルカプトエタノール、 0. ImM EDTA、 5 OmM Na C l、 10%グリ セロールを含む 2 OmM トリス一 HC 1緩衝液 （pH7. 5) で平衡化した 2 40m lの P— 1 1カラム （ワットマン社製） に負荷した。 その後、 0〜0. 5 M N a C 1を含む平衡化緩衝液で溶出させた。 得られた活性画分を透析チューブに入れ、 固体のポリエチレンダリコール 20 000上に置き、 4°Cで脱水濃縮した。 次に、 5mM メルカプトエタノール、 0. 5mM EDTA、 3 OmM NaC l、 50 %グリセロールを含む 25 m M トリス一HC 1緩衝液 （pH7. 5) で平衡化した 30 Om 1の S u p e r d e x G— 200カラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に、 この酵素濃縮液を負荷した。 平衡ィ匕に用いた緩衝液で溶出させ、 活性画分を得た。 1 OmM メルカプトエタノール、 0. ImM EDTA、 5 OmM Na C l、 10%グリセロールを含む 2 OmM トリスー HC 1緩衝液 （pH7. 5) で平 衡化した 15mlの H e p a r i n_S e ph a r o s eカラム (アマシャム フアルマシア バイオテクネ； h ) に活性画分を負荷し、 0〜0. 5M Na C 1 を含む平衡化緩衝液で溶出させた。
得られた活性画分を 1 OmM メルカプトエタノール、 0. ImM EDTA、 5 OmM NaC l、 10%グリセロールを含む 2 OmM トリスー HC 1緩衝 液 （pH7. 5) で平衡ィ匕した 5mlの H i t r a p— SPカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に負荷し、 0〜0. 5M Na C lを含む平衡 化緩衝液で溶出させた。 得られた活性画分を、 再度 5 mMメルカプトェタノール、 0. 5mM EDTA、 3 OmM NaC l、 50 %グリセロールを含む 25 m M トリスー HC 1緩衝液 （pH7. 5) で平衡化した 30 Om 1の S u p e r d e x G— 200カラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に負 荷し、 得られた活性画分を RN a s eH標品 （酵素液） とした。
耐熱性 R Na s e H活性は、 次の方法により測定した。
ポリ (r A) 及びポリ (d T) (ともにアマシャム フアルマシア バイオテ ク製） lmgをそれぞれ ImM £0丁 を含む40111^1 トリスー HC 1 (p H7. 7) 1mlに溶解し、 ポリ （rA) 溶液及びポリ （dT) 溶液を調製した。 次に、 4mM MgC l2、 ImM DTT、 0. 003%BSA、 4%グリ セロールを含む 40mM トリスー HC 1 (pH7. 7) に、 終濃度 20 μ gZ mlとなるポリ （r A) 溶液、 終濃度 30 g/mlとなるポリ （dT) 溶液を 加え、 37°Cで 10分間反応後、 4°Cに冷却し、 ポリ （rA) —ポリ （dT) 溶 液を調製した。 ポリ （rA) —ポリ （dT) 溶液 100 μ 1に酵素液 1 μ 1を加え、 40°Cで 10分間反応させ、 0. 5M EDTA 10 μ 1を加えて反応を停止させた後、 260 nmの吸光度を測定した。 対照として、 上記反応液に 0. 5M EDTA 10 μ 1を加えた後、 40°Cで 10分間反応させ、 吸光度を測定した。 その後、 EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値 （吸光度 差） を求めた。 すなわち、 酵素反応によってポリ （rA) —ポリ （dT) ハイプ リッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。 RN a s e Hの 1単位は、 l nmo 1のリボヌクレオチドが遊離したのに相当する A26。を 10 分間に増加させる酵素量とし、 下記の式に従って算出した。 なお、 酵素液を希釈 した場合は、 下記式の値を希釈率で補正した。
単位 (unit) = 〔吸光度差 X反応液量 （ml) 〕 ノ 0. 0152
参考例 2 バチルス カルドテナツタス RNa s eHI I遺伝子のク口一二 ング
(1) バチルス カルドテナックス ゲノム DN Aの調製
バチルス カノレドテナックス YT— G株 （DSM406) を 60 m 1の L B 培地 （ 1 %トリプトン、 0. 5 %酵母エキス、 0. 5 %N a C 1、 H7. 2) に植菌し、 65°C、 20時間培養した。 培養終了後、 培養液を遠心分離し集菌し た。 得られた菌体を 2m 1の 25%ショ糖、 5 OmM トリス一HC l (pH8.
0) に懸濁し、 0. 2mlの 1 Omg/ml塩ィ匕リゾチーム （ナカライテスタ社 製） 水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この反応液に 1
2mlの 150mM Na C l、 1 mM EDTA, 2 OmM トリス一 HC l (pH8. 0) 、 0. lm 1の 2 Omg/m 1プロティナーゼ K (宝酒造社製） 及び 1mlの 10%ラウリノレ硫酸ナトリゥム水溶液を加え、 37でで 1時間保温 した。
次いで 2. 1mlの 5M N a C 1と 2 m 1の C T AB— N a C 1溶液 〔 1
0%セチルトリメチルアンモニゥムプロミド （ナカライテスタ社製） 、 0. 7M N a C 1〕 を加えてよく混合し、 65 °Cで 1◦分間保温した。 これに等量のク口 ロホノレム/イソアミノレアクレコーノレ昆合液 （24 ： 1、 v/v) を力 Dえて 10分間 緩やかに混合した後、 10分間遠心 （10000 X g) を行った。 遠心終了後、 得られた上清に等量の 10 OmM トリス一HC l (pH8. 0) 飽和フエノー ル /クロ口ホルム Zイソアミルアルコール混合液 (25 : 24 : 1、 v/v) を 加えて 10分間緩やかに混合した後、 更に 10分間遠心 （l O O O OX g) を 行った。 遠心終了後、 得られた上清に 0. 6容の 2—プロパノールを加え、 生じ た糸状の沈殿をガラス棒で巻き取った。 これを 70%エタノール水溶液で洗浄し、 風乾した後に 0. 5mlの T E緩衝液に溶解してゲノム DNA溶液を得た。
(2) RNa s eHI I遺伝子中央部のクローニング
様々な生物由来の RN a s e H I Iのアミノ酸配列間で保存されている部分の うち、 モチーフ Iとモチーフ I I I 〔バイオケミストリー（Biochemistry), 第 3 8巻、 第 605— 608頁 （1999) 〕 をもとにして配列表の配列番号 1及び
2記载のォリゴヌクレオチド B s u I I— 3とオリゴヌクレオチド B s u I I - 6を合成した。
上記参考例 2 _ (1) で調製したバチルス カルドテナックス ゲノム DNA 溶液 1 μ 1を铸型にして、 100 pmo 1の B s u I I— 3及ぴ 100 pmo 1 の B s u I I—6をプライマーに用レヽ、 100 μ 1の容量で PCRを行った。 Ρ
CRでの DNAポリメラーゼはタカラ タック ポリメラーゼ （宝酒造社製） を 添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 45°Cで 30秒、 72でで 1分を 1サイクルとして、 50サイクル行った。 反応終了後、 反応液に フエノール処理とエタノール沈殿を行って DNAを精製した。 得られた DNAを T4 DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） を用いて DNAの末端を平滑化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 増幅された約 0. 4 k bの DNA断片をゲルか ら回収した。 得られた約 0. 4kb DNA断片を、 Sma I (宝酒造社製） で 消化した PUC119 (宝酒造社製） に T4 DNAリガーゼ （宝酒造社製） を 用いて連結し、 大腸菌 JM109を形質転換した。 この形質転換体を培養し、 約 0. 4 k bの DNAが挿入されたプラスミド 21— 1 2を得た。
(3) RNa s e I I遺伝子上流部分のクローニング
上記参考例 2- (2) で得たプラスミ ド 21— 12の約 0. 4 k bの揷入断片 の塩基配列を決定し、 それをもとに配列表の配列番号 3及ぴ 4記載のォリゴヌク レオチド RN I I -S 1とオリゴヌクレオチド RN I I— S 2を合成した。 参考例 2— (1) で調製したバチルス カルドテナックス ゲノム DNAを B a mH I (宝酒造社製） で消化し、 得られた B a mH I消化物と S a u 3 A I力 セット （宝酒造社製） を T4 DNAリガーゼで連結し、 これを鎳型、 RN I I —S 2を 1次 PCRのプライマー、 RNI I— S 1を 2次 PCRのプライマ^"と して、 タカラ LA PCR イン ビトロ クローユング キット （宝酒造社 製） に添付のプロトコールに従って操作を行った。 フエノール処理とエタノ^"ル 沈殿によって 2次 PCR液から DNAを精製し、 T4 DNAポリメラーゼを用 いてこの DNAの末端を平滑化し、 その後、 ァガロースゲル電気泳動を行レ、、 増 幅した約 1. 5 k bの DNA断片をゲルから回収した。 得られた約 1. 5 kわの DNA断片を、 Sma Iで消化した pUC 1 19に T4 DNAリガーゼを用い て連結し、 大腸菌 JM109を形質転換した。
この形質転換体を培養し、 約 1. 5 k bの DNAが揷入されたプラスミ B 2 5N16を得た。
(4) RNa s e I I遺伝子全域のクローニング
参考例 2- (3) で決定したプラスミ ド 21— 12の約 0. 4 k bの挿入断片 の塩基配列をもとに配列表の配列番号 5及ぴ 6記載のオリゴヌクレオチド R N I I— S 5とオリゴヌクレオチド RN I I— S 6を合成した。
参考例 2— (2) で調製したプラスミド 21—12を鐯型に、 RNI I—S 5 と RN I I— S 6をプライマーとして PCRを行った。 PCRでの DNAポリメ ラーゼはタカラ EXタック ポリメラーゼ （宝酒造社製） を添付のプロトコ一 ルに従つて用い、 P C Rは 94 °Cで 30秒、 55 °Cで 30秒、 72 °Cで 30秒を 1サイクルとして、 25サイクル行った。 反応終了後、 ァガロースゲル電気泳動 を行い、 増幅した約 0. 3 k bの DNA断片をゲルから回収した。 得られた約 0. 3 k bの DNA断片を D I Gハイプライム (ロシュ ダイァグノスティックス社 製） でジゴキシゲニン標識した。 '
上記のジゴキシゲニン標識 DNAをプローブとして、 参考例 2— (1) で調製 したバチルス カルドテナックス ゲノム DNAを H i n d I I I (宝酒造社 製） 、 S a c I (宝酒造社製） による消化、 及ぴ H i n d l l lと S a c lの 2 重消化をそれぞれ行レ、、 得られた消化物とサザンハイブリダイゼーションを行つ た。 ハイブリダイゼーシヨンと検出は D I Gルミネッセント デテクシヨンキッ ト （ロシュ ダイァグノスティックス社製） を添付のプロトコールに従って用い た。 その結果、 H i n d I I I消化では約 4. 5 k b断片、 S a c I消化では約 5. 8 k b、 ： H i n d I I Iと S a c Iの 2重消化では約 1. 31∑13の0 断 片がプローブとハイプリダイズした。
上記結果に基づき、 バチルス カルドテナックス ゲノム DNAを H i n d I I I消化してァガロースゲル電気泳動を行い、 約 4. 5kb付近の DNAをゲル から回収した。 得られた DNA断片を S a c Iで消ィ匕し、 ァガロースゲル電気泳 動を行い、 1. 3 k b付近の DNAをゲルから回収した。 この DNAを、 H i n d I I Iと S a c Iで消化した p UC 19 (宝酒造社製） に T 4 DNAリガー ゼを用いて連結し、 大腸菌 HB 101を形質転換した。
得られた形質転換体をハイポンド Ντ M (アマシャム ファノレマシア バイオ テク社製） にレプリカし、 上記のジゴキシゲニン標識プローブを用いて、 常法に 従ってコロニーハイブリダィゼーシヨンを行った。 こうして得られた陽性クロー ンからプラスミド pRHB 1を調製した。
次に、 pRHB 1に挿入された DNAの塩基配列を決定し、 それから予想され るアミノ酸配列を枯草菌の RN a s eHI Iのアミノ酸配列と比較したところ、 p RHB 1中の DNAは開始コドンから約 40 b pを欠いていることが予想され た。 そこで以下のようにして完全長の RN a s eH遺伝子を構築した。
参考例 2- (3) で調製した B 25N16を Hi n d i I Iで消化し、 ァガロ ースゲル電気泳動を行った後、 約 160 b pの DNA断片をゲルから回収した。 得られた約 160 b pの DNA断片を、 上記で調製した p RHB 1の H i n d I I I消化物に T 4 DNAリガーゼを用いて連結し、 大腸菌 HB 101を形質転 換した。 得られた形質転換体からプラスミドを調製した。
次に、 予想される開始コドン周辺の塩基配列をもとにして、 配列表の配列番号
7記載のオリゴヌクレオチド RN I I -Nd eを合成し、 上記で得られた形質転 換体から調製したプラスミドを铸型とし、 RNI I— Nd eと RNI I— S 6を プライマーとして、 PCRを行った。 この時に約 0. 7kbのDNA断片が増幅 するプラスミドを選択し、 このプラスミドを pRHB 11とした。 こうして得られたプラスミド pRHB l lに挿入された DN A断片の塩基配列 を決定した。 その結果を解析したところ、 RNa s eH I Iをコードすると考え られるオープンリーディングフレームが見出された。 この塩基配列を配列表の配 列番号 8に示す。 また、 該塩基配列から推定される RN a s e H I Iのアミノ酸 配列を配列表の配列番号 9に示す。
なお、 プラスミド p RHB l lで形質転換された大腸菌 HB 1 01は、
Escherichia coli JM109/pRHBllと命名、 表示され、 平成 1 2年 9月 5日 （原寄 託日） より日本国〒 305— 856 6茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F ERM B P— 7655として寄託されている。
(5) バチルス カルドテナックス RNa s e H I I遺伝子の発現
RHB 1 1又は p RHB 1で形質転換された大腸菌 HB 10 1を 1 00 S /m 1のアンピシリンを含む 5 m 1の L B培地に植菌し、 37でで 1晚振盪培養 した。 培養終了後、 遠心分離によって集めた菌体を 0. 5m lの TE緩衝液に懸 濁して超音波破砕し、 遠心分離によって上清を得、 これを菌体粗抽出液とした。
1 OmM トリス— HC 1 (pH8. 0) 、 1 mM ジチォスレイトール （ナ 力ライテスタ社製） 、 0. 003 %ゥシ血清アルブミン (フラクション V、 シグ マ觀) 、 4%グリセロール、 20 μ g / 1ポリ (dT) (アマシャム ファ ルマシア バイオテク社製) 、 30 μ g/m 1ポリ (r A) (アマシャム ファ ルマシア バイオテク社製） を混合し、 37°Cで 10分間保温した。 これを RN a s eH活性を測定するための基質液として使用した。
100 ,u 1の基質液に 1 ^ 1の 1M MnC 12を加えて 40°Cで保温し、 こ れに 1 0 1の 1 0倍希釈した菌体粗抽出液を加えて反応を開始した。 40°Cで 30分間反応を行った後、 1 0 1の0. 5M EDT Aを加えて反応を停止し、 260 nmにおける吸光度を測定した。 その結果、 p RHB 1を保持する大腸菌
HB 1 0 1から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに比べて、 pRHB 1 1 を保持する大腸菌 HB 101から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに明ら かに 260 nmにおける吸光度の値が高かった。 よって、 pRHB l lは RNa s e H遺伝子を含んでおり、 この pRHB l lを保持する大腸菌で RN a s e H 活性を発現することが明らかになった。
(6) 精製 RNa s eHI I標品の調製
参考例 2— (4) で得られた pRHB 11で形質転換された大腸菌 HB 101 を 100 g/m 1のアンピシリンを含む 1リットルの LB培地に植菌し、 3 7。じで 16時間振盪培養した。 培養終了後、 遠心分離によつて集めた菌体を 52.
3m 1のソエケーシヨンバッファー 〔50mM トリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 2mM 2—メルカプトエタノーノレ、 10%グリセロール、 2mM フエニルメ タンスルフォ-ルフルオライド〕 に懸濁し、 超音波破石 にかけた。 この破枠液 を 12000 r pmで 10分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 60°C、 15 分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 12000 r pmで 10分間の遠心分離を 行い、 上清を集め、 50. Om 1の熱処理上清液を得た。
この溶液をバッファー C [5 OmM トリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 2mM 2—メルカプトエタノール、 10%グリセロール〕 で平衡ィ匕した RE SOURS E Qカラム (アマシャム フアルマシア バイオテク社製) に供し、 FPLC システム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラ フィ を行なった。 その結果、 RNa s eHI Iは RESOURSE Qカラム を素通りした。 素通りした RNa s eH I I画分 5 lmlをバッファー Cで平衡 化した RE SOURSE Sカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社 製） に供し、 F PLCシステムを用いて 0〜 50 OmM N a C 1直線濃度勾配 により溶出し、 約 24 OmM N a C 1のところに溶出された RN a s e I I画 分を得た。 この RNa s e I I画分 3. 0 m 1を 2回に分けて 50 mM N a C 1を含むバッファー Cで平衡ィ匕した PD— 10カラム （アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） に供し、 得られた溶出液 7. Om 1を 5 OmM NaC l を含むバッファー Cで平衡ィ匕した H i T r a p— h e p a r i nカラム （アマシ ャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステムを用いて 50 〜 550 mM Na C 1直線濃度勾配により溶出し、 約 310 mM N a C 1の ところに溶出された RNa s e I I画分を得た。 この RNa s e I I画分 4. 4 mlをセントリコンー 10 (アミコン社製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 2 80 μ 1の濃縮液を 10 OmM Na C l、 0. 1 mM EDTAを含む 50m M トリス一HC l (pH8. 0) で平衡化した S u p e r d e x 200ゲルろ 過カラム (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 同じバッファ 一で溶出を行った結果、 RN a s eH I Iは、 3 5キロダルトンの分子量に相当 する位置に溶出された。 この分子量は、 RN a s e H I Iが 1量体として存在す る場合に相当する。 こうして溶出された RNa s e H I Iを B c a RNa s e H
I I標品とした。
上記で得られた B e a RN a s eH I I標品を用いて、 以下の方法により酵素 活性を測定した。
B c a RN a s eH I I標品 1 μ 1に 40°Cであらかじめインキュベーション した反応液 〔20mM へぺス一水酸化カリウム （ρΗ7· 8) 、 0. 0 1 %牛 血清アルブミン （宝酒造社製） 、 1%ジメチルスルホキシド、 1 0mM 塩ィ匕マ ンガン、 20 μ g /m 1ポリ (d T) (アマシャム フアルマシア バイオテク 社製） 、 30 μ g /m 1ポリ (r A) (アマシャム フアルマシア バイオテク 社製） 〕 Ι Ο Ο μ Ιを添加し、 40°Cで 1 0分間反応さた後、 0. 5M EDT A (pH8. 0) 1 0 μ 1で反応を停止し、 26 0 nmの吸収を測定した。 その結果、 B c a RNa s e H I I標品に RN a s e H活性が認められた。 参考例 3 バチルス カルドテナックス RNa s eH I I I遺伝子のクロー ニング
(1) RNa s e H I I I遺伝子断片のクローエング
バチルス サブチリスの RN a s e H I I Iのアミノ酸配列 〔バイオケミスト リー： Biochemistry, 第 38卷、 第 6 0 5— 6 08頁 （1 9 9 9) 〕 について、 他の生物由来の RNa s e l l Iのアミノ酸配列とのホモロジ一を調べ、 これら の間でよく保存されている領域のアミノ酸配列から RN a s e H I I Iをコード する遺伝子を探索するための配列表の配列番号 1 0〜1 3記載のプライマ一 B s I I 1 - 1, B s u I I I — 3、 B s u I I I— 6、 B s u I I I -8を合成 した。
参考例 2一 (1) で調製したバチルス カルドテナックス ゲノム DNA 2 0 0 n gを鎳型にし、 l O O pmo lの B s u I I I— 1及び 1 00 p m o 1の B s u I I I— 8をプライマーにして、 50 μ 1の容量で 1回目の P CRを行つ た。 更にその反応液 1 IX 1を铸型として l O O pmo 1の B s u l I I—3及び l O O pmo lの B s u l I I— 6をプライマーに用いて 100 1の容量で 2 回目の PCRを行った。 この 2回の PCRでの DNAポリメラーゼには、 タカラ タック ポリメラーゼ （宝酒造社製） を添付のプロトコールに従って用い、 1回 目の PCRは 94°Cで 30秒、 45°Cで 30秒、 72 °Cで 1分を 1サイクルとし て、 25サイクル行い、 2回目は 30サイクル行なった。
増幅して得られた約 450 b pの DNA断片を T4 DNAポリメラーゼ （宝 酒造社製） を用いて末端を平滑化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 増 された約 450 b pの DNA断片を回収した。 得られた約 450 b pの DNA断 片を、 Sma l (宝酒造社製） で消化した p U C 119 (宝酒造社製）に T 4 D
NAリガーゼ （宝酒造社製） を用いて連結し、 大腸菌 J Ml 09を形質転換した。 該形質転換体を培養し、 約 450 b pの DNA断片が挿入されたプラスミド p B
CA3204を得た。
(2) サザンハイブリダィゼーシヨン法による RN a s eHI I I遺伝子のクロ 一ユング
参考例 3—（1)で得られた pBCA3204に挿入された DN A断片の塩基配 列を決定し、 得られた配列もとに、 配列表の配列番号 14及び 15記載のプライ マー RN I I I— S 3及ぴ B c a RN I I I一 3を合成した。 このプライマー R N I I I— S 3及ぴ B c a RN I I I— 3を用いて、 p BCA3204を铸型に し、 100 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DNAポリメラーゼはタ カラ Zタック （宝酒造ネ: fcM) を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 9 8°Cで 0秒、 55°Cで 0秒、 72°Cで 20秒を 1サイクルとして、 30サイクル 行った。 反応終了後、 フエノールークロロホルム抽出、 続いてエタノール沈殿を 行った。 そして、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 約 0. 41∑ 1)の]^ 断片を ゲノレから回収した。 得られた約 0. 4 k bの DNA断片を D I G DNA標識キ ット （ベーリンガー マンハイム社製） で標識し、 プローブを調製した。
参考例 2—（1)で調製したバチルス カルドテナックス ゲノム DNA 20 gを B amHI、 E c oR I、 H i n d i I I、 P s t l、 Xb a I (すべて 宝酒造社製)で、 それぞれ完全消化した後、 その半分量をァガロース電気泳動し た。 ァガロースゲルから DNAを 0.4N 水酸ィ匕ナトリウムをもちいてナイ口 ンメンブレンにトランスファーした後、 120°Cで 30分間固定した。 次に、 メ ンプレンを 3 Om 1ハイブリダィゼーシヨンバッファー 〔43. 4 g/リットノレ 塩ィ匕ナトリウム、 17. 6 g/リットル クェン酸ナトリウム、 1%ブロッキン グ剤 （ベーリンガー マンハイム社製） 、 0. 1%N—ラウロイルサルコシン、
0. 02%ラウリル硫酸ナトリウム （SDS) 〕 の入ったシーノレドバック中で、 60°C、 4時間プレインキュベーションした後、 プローブを含むハイブリダィゼ ーションバッファー 5 m 1の入つたシーノレドバック中で、 60 °C、 16時間ィン キュベーションした。
次に、 メンブランを 5 Om 1の 0. 1%SDSをふくむ 2 X S SC (17.
5 g/リットル Na C l、 8. 8 g/リットル クェン酸ナトリウム） 中、 室 温で 2回、 50mlの 0. 1%SDSを含む 0. 5 X S S C (4. 3 gZリツ トル 塩化ナトリウム、 1. 9 gZリットノレ クェン酸ナトリウム） 中、 45°C で 2回洗浄した後、 D I G核酸検出キット （ベーリンガーマンハイム社製） を用 いて、 プローブと相補的な配列を持った約 8 k bの E c o R I断片、 約 4. 5 k bの P s t I断片、 約 1 k bの H i n d I I I断片を検出した。
P s t Iで完全消化したバチルス カルドテナックス ゲノム DNAの残り半 分量をァガロース電気泳動し、 約 4. 5 kbの P s t I断片をゲルから回収した。 次に、 この DNA断片と、 P s t I消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒 造社製）を用いて脱リン酸ィ匕したプラスミドベクター p TV 119 Nとをライゲ ーシヨンし、 大腸菌 JM109を形質転換した。
プライマー RNI I I一 S 3及び B e a RN I I I _ 3を用いて、 コロニーを 铸型にし、 50 μ 1の容量で PCRを行ない、 RNa s eHI I I遺伝子を持つ と考えられるコロニーを選択した。 この PC Rには、 タカラ Zタック （宝酒造 社製） を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 98°Cで 0秒、 55°Cで 0 秒、 72°Cで 20秒を 1サイクルとして、 30サイクル行った。 この結果、 No.
88のコロニーに目的の遺伝子が含まれていることがわかつた。
次に、 この No.88のコロニーからプラスミ ドを調製し、 これを鎳型にプラ イマ一 RN— N (宝酒造社製） および B c aRN I I 1—3又はプライマー M4 (宝酒造社製） 及ぴ RNI I I—S 3を用いて PCRを行い、 RNa s eHI I I遺伝子の全長が含まれているかどうかを調べた。 その結果、 RNa s eHI I Iの全長が含まれていることが分かり、 このプラスミドを p BCA3 P 88とし た。
(3) RNa s eHI I I遺伝子を含む DN A断片の塩基配列の決定
参考例 3— (2) で得られたプラスミド p BCA3 P 88の挿入 DNA断片の 塩基配列をジデォキシ法によつて決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI I Iの N末端アミ ノ酸配列を有するオープンリーディングフレームが見出された。 このオープンリ 一ディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 16に、 また、 該塩基配列か ら推定される RNa s eHI I Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 17にそれ ぞれ示す。
(4) RNa s eH I I Iを発現させるためのプラスミドの構築
参考例 3_ (2) に記載のプラスミド pBCA3P88を铸型にし、 上記得ら れた RNa s eHI I Iのオープンリーディングフレームの周辺の配列を参考と して設定した配列表の配列番号 18記載の B c a RN I I I Nd e及ぴ Ml 3プ ライマー M4 (宝酒造社製） を用いて、 100 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DNAポリメラーゼはパイロペスト DNAポリメラーゼ （宝酒造社 製） を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 3 0秒、 72。じで 3分を 1サイクルとして Λ 30サイクル行つた。 この結果増幅し た約 4 k bの DNA断片を Nd e I (宝酒造欄） で消化し、 ァガロース電気泳 動を行い、 約, 1. 4 k bの Nd e I断片をゲルから回収した。 得られた約 1. 4 kbのDNA断片を、 Nd e I消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社 製）を用いて脱リン酸化した P TV 119Nd (pTVl 19NのNc o Iサイ トを Nd e Iサイトに変換したもの） とライゲーシヨンを行い、 大腸菌 J M 10 9を形質転換した。
次に、 Nd e I断片中の RNa s eHI I I遺伝子が p TV 119Ndベクタ 一の 1 a cプロモーター下流につながったプラスミドをスクリーニングするため コロニーを鎵型にし、 プライマー RN— N (宝酒造社製） および B c aRNI I Iー3を用いて、 50 1の容量で PCRを行ない、 RNa s eHI I I遺伝子 を持つと考えられるコロニーを選択した。 PCRでの DNAポリメラーゼはタカ ラ Zタック （宝酒造社製） を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 98°C で 0秒、 55 °Cで 0秒、 72 °Cで 20秒を 1サイクルとして、 30サイクル行つ た。 この結果、 No. 2のコロニーが N d e I断片中の RN a s e H I I I遺伝 子が pTVl 19 Ndベクターの 1 a cプロモーター下流につながったプラスミ ドであることが分かり、 このプラスミドを p BCA3Nd 2とした。
さらに該プラスミド中の挿入 D N A断片の塩基配列をジデォキシ法で確認した ところ、 開始コドンを GTGから ATGに変換したこと以外、 PCRに起因する 変異のないことを確認した。
なお、 プラスミド pBCA3Nd 2で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli JM109/pBCA3Nd2と命名、 表示され、 平成 12年 9月 5日 （原 寄託日） より日本国〒 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第
6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM B P— 7653として寄託されている。
(5) 精製 RNa s eHI I I標品の調製
参考例 3—（ 4 )で得られた p B C A 3 N d 2で形質転換された大腸菌 JM10 9を 100 / g/m 1のアンピシリンを含む 2リットルの LB培地に植菌し、 3
7 °Cで 16時間振盪培養した。 培養終了後、 遠心分離によって集めた菌体を 39. 6mリットルのソニケーシヨンバッファー 〔5 OmM トリス— HC 1 (p H8.
0) 、 ImM EDTA、 2mM フエニルメタンスルフォニルフルオライド〕 に懸濁し、 超音波破砕機にかけた。 この破碎液を 12000 r pmで 10分間の 遠心分離を行い、 得られた上清を 60°C、 15分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 12000 r p mで 10分間の遠心分離を行い、 上清を集め、 39. 8ml の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmM トリス _HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA〕 で 化した RE S OUR S E Qカラム （アマシャム フ アルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム （アマシャム フアル マシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RNa s e H I I Iは RE SOUR S E Qカラムを素通りした。
素通りした RNa s e H I I I画分 4 5m 1をバッファー B 〔50mM トリ ス一 HC 1 (pH7. 0) 、 I mM EDTA] 2リツトルを外液として、 2時 間の透析を 3回行なつた。 透析後の酵素液 5 5. 8 m 1をバッファー Bで平衡化 した RE SOUR S E Sカラム (ファノレマシア フアルマシア バイオテク社 製） に供し、 F P LCシステムを用いて 0〜50 OmM N a C 1直線濃度勾配 により溶出し、 約 1 0 5mM N a C 1のところに溶出された RN a s e H I I I画分を得た。
この画分 7. Om 1に Na C 1濃度が 1 5 OmMになるように 1M Na C 1 を含むバッファー Bを添加し、 1 50 mM Na C 1を含むバッファー Bで平衡 ィ匕した H i T r a p— h e p a r i nカラム （アマシャム ファノレマシア バイ ォテク社製） に供した。 その結果、 RNa s e H I I Iは H i T r a p— h e p a r i nカラムを素通りした。
素通りした RNa s e H I I I画分 7. 5 m 1をセントリコンー 1 0 (アミコ ンネ «) を用いた限外ろ過により濃縮し、 1 90 μ 1の濃縮液を 1 0 OmM N a C l、 0. ImM EDTAを含む 50mM トリスー HC 1 (p H7. 0) で平衡化した S u p e r d e x 2 00ゲルろ過カラム (アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s e H I I Iは、 33キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分子 量は、 RN a s e H I I Iが 1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出された RNa s e H I I Iを B c a RN a s e H I I I標品と した〇
上記で得られた B c a RN a s e H I I I標品を用いて、 以下の方法により 酵素活性を測定した。
B c a RNa s e H I I I檩品 1 μ 1に 40°Cであらかじめインキュべ シ ヨンした反応液 〔2 OmM へぺス一水酸ィ匕カリウム （pH 7. 8) 、 0. 0 1 %牛血清アルブミン （宝酒造ネ: h ) 、 1 %ジメチルスルホキシド、 4mM 酢酸マグネシウム、 S O ^ g/m lポリ （d T) (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） 、 30 μ g m 1ポリ (r A) (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） 〕 Ι Ο Ομ Ιを添加し、 40°Cで 10分間反応さた後、 Ι Ομ 1 0. 5Μ EDTA (ρΗ8. 0) で反応を停止し、 260 nmの吸収を測定 した。 その結果、 B c a RNa s eHI I I標品に RNa s eH活性が認めら れた。
参考例 4 ピロコッカス フリオサスの RNa s eHI I遺伝子のクローニン グ
(1) ピロコッカス フリオサス ゲノム DN Aの調製
トリプトン （ディフコラポラトリーズ社製） 1%、 酵母エキス （ディフコラボ ラトリーズ社製） 0. 5%、 可溶性でんぷん （ナカライテスタ社製） 1%、 ジャ マリン S ·ソリッド （ジャマリンラボラトリー社製） 3. 5 %、 ジャマリン S · リキッド （ジャマリンラボラトリーネ環） 0. 5%、 Mg S04 0. 00
3 %、 N a C 1 0. 001 %、 F e S 04 · 7 H2 O 0. 0001 %、 C o S
04 0. 0001 %、 C a C 12 · 7 H2 O 0. 0001 %、 Z n S 04 0.
0001%、 Cu S04 · 5H20 0. 1 p pm、 KA 1 (S 04)2 0. 1 p pm、 H3 B04 0. 1 p pm、 Na2MoO4 ' 2H2O 0. 1 p pm N i C l2 - 6
H2 O 0.25 p p mの組成の培地 2リツトルを 2リツトル容のメジュゥムボト ルにいれ、 120°C、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込み、 溶存酸素を除 去し、 これにピロコッカス フリオサス （Pyrococcus furiosus、 ドイツチェ ザ ムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入： DSM3638) を接種し て、 95°C、 16時間静置培養した後、 遠心分離によって菌体を得た。
次に、 得られた菌体を 4m 1の 25%ショ糖、 50mM トリス— HC 1 (p H8. 0) に懸濁し、 0. 4mlの 10mg/ml塩ィ匕リゾチーム （ナカラィテ スク社製） 水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この反応 液に 24mlの 15 OmM Na C l、 1 mM EDTA, 2 OmM トリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 0. 2m 1の 20m g/m 1プロティナーゼ K (宝酒造 社製） 及ぴ 2 m 1の 10 %ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 37。Cで 1時 間保温した。 反応終了後、 フエノール一クロ口ホルム抽出、 続いてエタノール沈 殿を行い、 約 lmgのゲノム DNAを調製した。
(2) RNa s eH I I遺伝子のクローニング ピロコッカス ホリコシ （Pyrococcus horikoshii) の全ゲノム配列が公開さ れており 〔DNA リサーチ (DNA Reseaich), 第 5卷、 第 55— 76頁 （199 8) 〕 、 RNa s eH I Iのホモログをコードする遺伝子 （PH1650) が 1 つ存在することが明らかになつている （配列表の配列番号 19、 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ： http:〃而 w. nite. go. jp/) 。
そこで、 この PHI 650遺伝子と一部公開されているピロコッカス フリオ サスのケノム酉己歹 U (University of Utah, Utah Genome Centerホームページ： http://www. genome. Utah, edu/sequence. html) でホモロジー検索 おこなった。 その結果、 非常にホモロジ一の高い配列が見つかった。 得られた配列をもとにプ ライマー 1650 N d e (配列番号 20 ) 及ぴ 1650 B a m (配列番号 21 ) を合成した。
参考例 4— ( 1 ) で得たピロコッカス フリォサス ゲノム D NA 200 η gを铸型にして、 20 pmo lの 1650Nd e及び 20 pmo lの 1650B amをプライマーに用い、 100 ^ 1の容量で PCRを行った。 PCRでの DN Aポリメラーゼはタカラ Exタック （宝酒造ネ± ) を添付のプロトコールに従つ て用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72 °Cで 1分を 1サイクル とし、 30サイクル行った。 増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を Nd e I及ぴ B a mH I (ともに宝酒造社製）で消化し、 得られた D N A断片をブラスミドべク ター p E T 3 a (ノバジェンネ: ) の N d e I及ぴ B a mH I間に組込んだプラ スミド p PFU220を作製した。
(3) RNa s eHI I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
参考例 4— (2) で得られた p P F U 220の挿入 D N A断片の塩基配列をジ デォキシ法によつて決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると 考えられるオープンリーディングフレームが見出された。 このオープンリーディ ングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 22に示す。 また、 該塩基配列から 推定される RN a s e H I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 23に示す。 なお、 プラスミド PPFU220で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli JM109ZpPFU220と命名、 表示され、 平成 12年 9月 5日 （原 寄託日） より日本国〒 305— 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM BP— 7654として寄託されている。
(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製
参考例 4一 （2) で得られた p PFU220で大腸菌 HMS 174 (DE 3)
(ノバジェンネ： h#) を形質転換し、 得られた p P FU 220を含む大腸菌 HMS 174 (DE3) を 100 μ g/m 1のアンピシリンを含む 2 Lの LB培地に植 菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。 培養終了後、 遠心分離によって集めた菌 体を 66. Om 1のソニケーシヨンバッファー 〔50mM トリスー HC 1 (p H8. 0) 、 ImM EDTA、 2mM フエニルメタンスルフォニルフルオラ ィド〕 に懸濁し、 超音波破石權にかけた。 この破碎液を 12000 r pmで 10 分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 60°C、 15分間の熱処理にかけた。 そ の後、 再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行い、 上清を集め、 61. 5 m 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A [5 OmM トリス一 HC 1 (pH8. 0) 、
ImM EDTA] で平衡化した RE S OUR S E Qカラム （アマシャム フ アルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム (アマシャム フアル マシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RNa s e H I Iは RE SOUR SE Qカラムを素通りした。
素通りした RN a s e H I I画分 60. Om 1をバッファー Aで平衡ィ匕した R
E SOUR S E Sカラム (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供 し、 F P LCシステムを用いて 0〜50 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶 出し、 約 15 OmM Na C 1のところに溶出された RN a s eHI I画分を得 た。 この RN a s e H I I画分 2. Om 1をセントリコン一 10 (アミコン社 製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 250 1の濃縮液を 10 OmM Na C 1、 0. ImM EDTAを含む 50mM トリスー HC 1 (pH8. 0) で平 衡化した S u p e r d e X 200ゲルろ過カラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eHI Iは、 17キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分子量は、 RN a s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出された RN a s eHI Iを P f u RNa s eHI I標品とした。 上記で得られた P f u RNa s eH I I標品を用いて、 参考例 3— （5) に 記載の方法により酵素活性を測定した結果、 P f u RN a s e H I I標品に R Na s e H †生が認められた。
参考例 5 サーモトガ マリティマ RNa s e H I I遺伝子のクローニング (1) サーモトガ マリティマ ゲノム DNAの調製
トリプトン 1 %、 酵母エキス 0. 5 %、 可溶性でんぷん 1 %、 ジャマリン
5 · ソリッド 3. 5 %、 ジャマリン S · リキッド 0. 5 %、 M g S 04 0. 0 03 %、 N a C 1 0. 001%、 F e S 04 - 7 H2 O 0. 0001%、 C o S
04 0. 0001%、 C a C 12 · 7 H2 O 0. 0001%、 Z n S 04 0. 0 001%、 Cu S04 · 5H20 0. 1 p pm、 KA 1 (S〇4) 2 0. 1 p pm、 H3 B03 0. l p ms Na2Mo04 - 2H20 0. 1 p p m, N i C 12 · 6 H20 0. 25 p p mの組成の培地 2リツトルを 2リツトル容のメディゥムポト ルにいれ、 120°C、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込み、 溶存酸素を除 去し、 これにサーモトガ マリティマ (Thermotoga maritima, ドイツチェ ザ ムルンク フォン ミクロオルガニスメン ゥント ツエノレクノレツレン GmbH より購入： DSM3109) を接種して、 85。C、 16時間静置培養した。
次に、 遠心分離によって培地 300ml相当分の菌体を集め、 3m 1の TE緩 衝液 〔10mM トリスー HC 1 (pH7. 5) 、 1 mM EDTA] に懸濁し、 150μ 1の 10%ラウリル硫酸ナトリウム （ナカライテスタ社製） 水溶液及び 15μ 1の 20mg /m 1プロティナーゼ K (宝酒造社製） を加えて 37 °Cで 1 時間保温した。 反応終了後、 0. 5 m 1の 5 M N a C 1を加えてよく混合した 後、 0. 4m 1の CTAB—Na C 1溶液 〔10%セチルトリメチルアンモニゥ ムプロミド （ナカライテスク社製） 、 0. 7M Na C l〕 を加えてよく混合し、
65 °Cで 10分間保温した。 これに 1. 5m lのクロ口ホルムノィソアミルアル コール混合液 (24 ： 1、 v/v) を加えて 10分間緩やかに混合した後、 5分 間遠心 (20000 X g) を行った。 遠心終了後、 得られた上清に等量の 10 OmMトリス一 HC 1 (pH8. 0 ) 飽和フエノール/クロ口ホルムノイソアミ ルアルコール混合液 （25 ： 24 ： 1、 v/v) を加えて 10分間緩やかに混合 した後、 更に 5分間遠心 （20000 X g) を行った。 遠心終了後、 得られた 上清に 0. 6容の 2—プロパノールを加え、 で 5分間遠心 （l O OO OXg) して得られた沈殿を、 70 %エタノール水溶液で洗浄し、 風乾した後に 200 1の T Eに溶解してゲノム D N A溶液を得た。
(2) RNa s e H I I遺伝子のクローニング
サーモトガ マリティマ ゲノム DNAを錶型とした PCRを行うことにより RNa s eH遺伝子を含む増幅 DNA断片を得るため、 サーモトガ マリティマ ゲノム D N Aの塩基配列
(http： //www. tigr. org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage. html) のうち R N a s eH I I遺伝子と同定されている部分の塩基配列をもとにして、 配列表の配列番 号 24〜27記載のオリゴヌクレオチド 915—F 1、 915— F2、 915- R 1及ぴ 915— R 2を合成した。
上記参考例 5 _ (1) で調製したサーモトガ マリティマ ゲノム DNAを鎵 型として、 915—F 1と 915— R 1、 915— F 1と 915— R 2、 915 一 F 2と 915—R 1又は 915— F2と 915— R 2をプライマー対とし、 そ れぞれ PCRを行つた。 P C Rでの D N Aポリメラーゼはタカラ E xタックを添 付のプロトコールに従って用い、 PCRは 95°Cで 0. 5分、 55°Cで 0. 5分、 72°Cで 1. 5分を 1サイクルとして、 25サイクル行った。 反応終了後、 各 P CR反応物をァガロースゲル電気泳動に供し、 約 0. 7kbの増幅された DNA 断片を抽出精製した。 915— F 1と 915— R 1及び 915— F 1と 915— R 2のプライマー対で増幅した DNAは、 11111 (11 1 1と 13 & 1 (ともに宝 酒造社製） で消化し、 H i n d I I Iと Xb a Iで消化した pUC 19に T4 DNAリガーゼを用いて連結し、 大腸菌 JM109を形質転換した。 この形質転 換体を培養し、 約 0. 7 k bの DNAが挿入されたプラスミド DNAを調製した。 その結果、 915— F 1と 915— R 1から増幅した DNAが揷入されたプラス ミド No. 1と No. 2、 915— F 1と 915— R2から増幅した DNAが揷 入されたプラスミド No. 3と No. 4を得た。
また、 915— F2と 915—R1及ぴ 915— F 2と 915— R 2のプライ マー対で増幅した DNAを Nc o I (宝酒造社製） と Xb a Iで 2重消化し、 N c o Iと X b a Iで 2重消化した p T V 1 1 9 N (宝酒造社製） に T 4 DNA リガーゼを用いて連結し、 大腸菌 JM109に形質転換した。
この形質転換体を培養し、 約 0. .7 k bの DNAが挿入されたプラスミド DN Aを調製した。 その結果、 9 1 5— F 2と 9 1 5— R 1から増幅した DNAが挿 入されたプラスミド No. 5と No. 6、 9 1 5— F 2と 9 1 5— R 2から増幅 した DNAが挿入されたプラスミド No. 7を得た。
なお、 プラスミド N o . 7で形質転換された大腸菌 J M 109は、
Escherichia coli JM109/pTM - RNHと命名、 表示され、 平成 1 2年 9月 5日 （原 寄託日） より日本国〒 305— 8 5 66茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM B P— 76 52として寄託されている。
(3) サーモトガ マリティマ RNa s eH I I遺伝子の発現
プラスミド No. 1〜7又は 11じ 1 9で形質転換された大腸菌 J Ml 09を 1 00 μ g/m 1のアンピシリンを含む 5m 1の LB培地 （トリプトン 1 0 g ノリットノレ、 酵母エキス 5 g /リットル、 Na C l 5 g/リットル、 pH7. 2) に植菌し、 37°Cで振盪培養した。 660 nmにおける吸光度が 0. 5にな つたときに終濃度が ImMになるようにイソプロピル一 j8—D—チォガラタトピ ラノシドを加え、 更に 1B免振盪培養した。 培養終了後、 遠心分離によって菌体を 集め、 1m lの TE緩衝液に懸濁し、 超音波破砕した。 これを 80°Cで 10分間 熱処理し、 遠心によって得た上清を菌体粗抽出液とした。 得られた菌体粗抽出液 を用いて、 参考例 2— (5) に記載の方法で、 吸光度を測定した。 その結果、 UC 1 9を保持する大腸菌 J M 1 09から調製した粗抽出液で反応させたときに 比べて、 プラスミド No. 3、 5、 6及び 7を保持する大腸菌 JM1 09から調 製した菌体粗抽出液は、 MnC 12存在下で反応させたとき、 明ら力に 260 n mにおける吸光度の値が高かった。 よって、 プラスミド No. 3、 5、 6及び 7 は RNa s eH遺伝子を含んでおり、 これらのプラスミドを保持する大腸菌で R Na s eH活性を発現することが明らかになった。
こうして大腸菌内で RNa s e活性の発現していることが明らかとなったブラ スミドに挿入された DNA断片の一部の塩基配列を決定した。 得られた塩基配列 の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると考えられるオープン リ一ディングフレームが見出された。 このオープンリーディングフレームの塩基 配列を配列表の配列番号 143に示す。 また、 該塩基配列から推定される RNa s e H I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 144に示す。 このプラスミド N o. 7に挿入された DNA断片の一部の塩基配列に P CR時に生じたと思われる 塩基置換が 1箇所認められ、 その箇所のァミノ酸残基が変化していることが分か つた。
(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製
参考例 5— ( 2 )で得られた p TM— R NHを大腸菌 JM109に形質転換し、 得られた p TM— RNHを含む大腸菌 JM109を 100 .g/m 1のアンピシ リンを含む 1リツトルの L B培地に植菌し、 37でで 16時間振盪培養した。 培 養終了後、 遠心分離によって集めた菌体を 31. Omlのソニケーシヨンバッフ ァー 〔5 OmM トリス一 HC 1 (pH8. 0) 、 2mM 2_メルカプトエタ ノール、 10%グリセロール、 2mM フエニルメタンスルフォニルフルオラィ ド〕 に懸濁し、 超音波破砕機にかけた。 この破砕液を 12000 r pmで 10分 間の遠心分離を行い、 得られた上清を 70°C、 15分間の熱処理にかけた。 その 後、 再度 12000 r pm、 10分の遠心分離を行い、 上清を集め、 32. Om 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー C 〔5 OmM トリスー HC 1 (pH8. 0) 、
2mM 2—メルカプトエタノール、 10%グリセロール〕 で平衡化した RE S OURSE Qカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） を用いてクロ マトグラフィーを行なった。 その結果、 RNa s eH I Iは RE SOURSE Qカラムを素通りした。 素通りした RNa s eH I I画分 32. 5mlをパッフ ァー Cで平衡ィ匕した RE SOURSE Sカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 FPLCシステムを用いて 0〜50 OmM Na C l 直線濃度勾配により溶出し、 約 240 mM N a C 1のところに溶出された R N a s e I I画分を得た。 この RNa s e I I画分 2. Om 1を 5 OmM Na C 1を含むバッファー Cで平衡化した PD— 10カラム （アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） に供し、 得られた溶出液 3. 5mlを 50mM NaC l を含むバッファー Cで平衡ィ匕した H i T r a p— h e p a r i nカラム （アマシ ャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 F P LCシステムを用いて 50 〜550mM NaC l直線濃度勾配により溶出した。 その結果、 約 295 mM Na C 1のところに溶出された RNa s e I I画分を得た。 このようにして溶出 された RNa s eH I Iを Tma RNa s eH I I標品とした。
上記で得られた Tin a RNa s eH I I標品を用いて、 参考例 2— （6) に 記載の方法で酵素活性を測定した結果、 Tma R N a s e H I I標品に R N a s eH活性が認められた。
参考例 6 ピロコッカス ホリコシィの RNa s eHI I遺伝子のクローニン グ
(1) ピロコッカス ホリコシィ ゲノム DNAの調製
トリプトン （ディフコラボラトリーズ社製） 1%、 酵母エキス （ディフコラボ ラトリーズネ ±$¾ 0. 5%、 可溶性でんぷん （ナカライテスタ社製） 1%、 ジャ マリン S 'ソリッド （ジャマリンラボラトリー社製） 3. 5%、 ジャマリン S . リキッド （ジャマリンラボラトリー社製） 0. 5%、 Mg S04 0. 003%、 NaC l 0. 001 %、 F e S 04 · 7 H2 O 0. 0001 %、 C o S 04 0. 0001 %、 C a C 12 · 7 H2 O 0. 0001 %、 Z n S 04 0. 00 01%、 Cu S〇4 · 5H20 0.1 p pm、 KA 1 (S 04)2 0.1 p pm、 H
3 B04 0. l p pm, Na2Mo04 - 2H20 O. l p m, N i C l2 - 6H 2O 0.25 p p mの組成の培地 2リツトルを 2リツトル容のメジュゥムボトル にいれ、 120°C、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込み、 溶存酸素を除去 し、 これにピロコッカス ホリコシィ OT3 (Pyrococcus horikoshii、 理ィ匕 学研究所より購入： J CM9974) を接種して、 95°C、 16時間静置培養し た後、 遠心分離によって菌体を得た。
次に、 得られた菌体を 4m 1の 25%ショ糖、 50mMトリスー HC 1 ( H 8. 0) に懸濁し、 0. 4mlの 1 OmgZml塩化リゾチーム （ナカライテス ク社製） 水溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この反応液 に 24mlの 150mM NaC l、 1 mM EDTA、 20mMトリス一HC 1 (pH8. 0) 、 0. 2m 1の 2 Omg/m 1プロティナーゼ K (宝酒造社 製） 及び 2mlの 10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 37°Cで 1時間 呆1皿しプし c
反応終了後、 フエノールークロロホルム抽出、 続いてエタノール沈殿を行い、 約 lmgのゲノム DNAを調製した。
(2) RNa s eHI I遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシィ （Pyrococcus horikoshii) は全ゲノム配列が公開 されており 〔DNA リサーチ （DNA Research) 、 第 5卷、 第 55— 76頁 (1998) 〕 、 RNa s eHI Iのホモログをコードする遺伝子 （PH165
0) が 1つ存在することが明らかになつている （配列番号 145、 独立行政法人 製品評価センター ホームページ： http://w w. nite. go. jp/) 。
そこで、 この PHI 650遺伝子 （配列番号 145) の配列をもとにプライマ 一 P h o N d e (配列番号 146) 及び P h o B a m (配列番号 147) を合成 した。
参考例 6— (1) で得たピロコッカス ホリコシィ ゲノム DNA 10 On gを铸型にして、 20pmo lの PhoNd eNd e及び 20 pmo 1の Pho B amをプライマーに用い、 100 μ 1の容量で P CR行った。 PCRでの DN Αポリメラーゼはタカラ Exタック （宝酒造社製） を添付のプロトコールに従つ て用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクル とし、 40サイクル行った。 増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を Nd e I及ぴ B amH I (ともに宝酒造社製）で消化し、 得られた DN A断片をプラスミドべク ター p ET 3 a (ノバジェン社製） の N d e I及ぴ B amH I間に組込んだプラ スミ ド p PHO 238を作製した。
(3) RNa s eHI I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
参考例 6— ( 2 ) で得られた p P HO 238の挿入 DN A断片の塩基配列をジ デォキシ法によつて決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると 考えられるオープンリ一ディングフレームが見出された。 このオープンリ一ディ ングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 148に示す。 また、 該塩基配列か ら推定される RNa s eHI Iのアミノ酸配列を配列表の配列番号 149に示す。 なお、 プラスミド P PHO238で形質転換された大腸菌 JM 109は、 Escherichia coli JM109/pPH0238と命名、 表示され、 平成 13年 2月 22日 (原寄託日） より日本国〒 305— 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中 央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM BP— 7692として寄託されている。
(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製
参考例 6— (2) で得られた p PHO 238で大腸菌 HMS 174 (DE 3) (ノバジェン社製） を形質転換し、 得られた p PHO 238を含む大腸菌 HMS
174 (DE3) を 100 μ g/m 1のアンピシリンを含む 1リットルの LB培 地に植菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。 培養終了後、 遠心分離によって集 めた菌体を 34. 3m 1のソニケーシヨンバッファー [5 OmMトリス一 HC 1 (p H 8. 0) 、 ImM EDTA、 2 mMフエニルメタンスルフォニルフルォ ライド〕 に懸濁し、 超音波破石權にかけた。 この破砕液を 12000 r 111で1 0分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 80°C、 15分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を行い、 上清を集め、 33. 5 m 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmMトリス _HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡化した RE S OUR S E Qカラム （アマシャム フ アルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム (アマシャム フアル マシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RNa s eHI Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。
素通りした RNa s eH I I画分 35. Omlををバッファー B 〔5 OmMト リス一 HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDTA] 2 Lを外液として、 2時間の 透析を 3回行なった。 透析後の酵素液 34. 5 m 1をバッファー Bで平衡化した RESOURSE Sカラム (フアルマシア フアルマシア バイオテク社製） に供し、 FPLCシステムを用いて 0〜50 OmM NaC l直線濃度勾配によ り溶出し、 約 155mM NaC 1のところに溶出された RN a s eHI I画分 を得た。
この画分 4. Omlに NaC 1濃度が 50 mMになるようにバッファー Bを添 加し、 5 OmM Na C 1を含むバッファー Bで平衡化した H i T r a p— h e p a r i nカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 F P LCシステムを用いて 50〜 55 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。 その結果、 約 16 OmM Na C 1のところに溶出された RN a s eH I I画分 を得た。
この RNa s eHI I画分 6. 9 m 1をセントリコンー 10 (アミコン社製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 250 1の濃縮液を 2回に分けて 10 OmM Na C l、 0. ImM EDTAを含む 50mMトリス一HC l (pH7. 0) で平衡化した S u p e r o s e 6ゲルろ過カラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s eHI Iは、 24. 5キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分子量 は、 RNa s eHI Iが 1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出された RNa s eHI Iを Ph oRNa s eHI I標品とした。 上記で得られた Ph o RNa s eHI I標品を用いて、 参考例 3— (5) に記 載の方法により酵素活性を測定した結果、 Ph oRNa s eHI I標品に RN a s e H活性が認められた。
参考例 7 アルカェォグロバス フルギダスの RNa s eHI I遺伝子のクロ 一ユング
(1) アルカェォグロバス フルギダス ゲノム DNAの調製
ァノレカェ才グロバス フノレギダス （Archaeoglobus fulgidus、 ドイツチェ ザムノレンク フォン ミクロオノレガニスメン ゥント ツエノレクルツレン Gmb Hより購入： DSM4139) 8 m 1相当分の菌体を集め、 100 1の 25 % ショ糖、 50mMトリス— HC l (pH8. 0) に懸濁し、 20 1の 0. 5M
EDTA、 10 1の 10mg/ml塩化リゾチーム （ナカライテスタ社製） 水 溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この反応液に 800 μ 1の 150mM NaC l、 ImM EDTA, 20mMトリス一 HC l (pH 8. 0) 、 10 i 1の 2 Omg/m 1プロティナーゼ K (宝酒造社製） 及ぴ 50 1の 10 %ラウリル硫酸ナトリゥム水溶液を加え、 37°Cで 1時間保温した。 反応終了後、 フエノール一クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿、 風乾した後に 5 0 μ 1の Τ Εに溶解してゲノム D Ν Α溶液を得た。
(2) RNa s eH I I遺伝子のクローニング
ァノレカェォグロバス フルギダス （Archaeoglobus fulgidus) は全ゲノム配列 が公開されており 〔ネイチヤー （Nature) 、 第 390卷、 第 364— 370頁 (1997) 〕 、 RNa s eH I Iのホモログをコードする遺伝子 （AF 062 1) 力 Uつ存在することが明らかになつている （配列番号 150、
http： //www. tigr. org/ tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage. html) 。
そこで、 この AF0621遺伝子 （配列番号 150) の配列をもとにプライマ 一 A f uNd e (配列番号 151) 及ぴ A f u B a m (配列番号 152) を合成 した。
参考例 7— (1) で得たアルカェォグロバス フルギダス ゲノム DNA30 n gを鎵型にして、 20 p m o 1の A f uN d e及び 20 p m o 1の A f uB a mをプライマーに用い、 100 μ 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DN
Aポリメラーゼはパイ口べスト DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） を添付のプロ トコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1 分を 1サイクルとし、 40サイクル行った。 増幅した約 0. 6kbの DNA断片 を N d e I及ぴ B a mH I (ともに宝酒造社製）で消化し、 得られた DNA斬片を プラスミドベクター pTVl 19Nd (pTVl 19Nの Nc o Iサイトを Nd e Iサイトに変換したもの） の N d e I及び B a mH I間に組込んだプラスミド p AFU204を作製した。
(3) RNa s eH I I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
参考例 7— ( 2) で得られた p AFU 204の挿入 DN A断片の塩基配列をジ デォキシ法によつて決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eH I Iをコードすると 考えられるオープンリ一ディングフレームが見出された。 このオープンリ一ディ ングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 153に示す。 また、 該塩基配列か ら推定される RN a s e H I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 154に示す。 なお、 プラスミ ド pAFU204で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli JM109ZpAFU204と命名、 表示され、 平成 13年 2月 22日
(原寄託日） より日本国〒 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中 央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F E RM BP— 7691として寄託されている。
(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製
参考例 7- (2) で得られた p A F U 204で大腸菌 J M 109を形質転換し、 得られた p AFU204を含む大腸菌 JM109を 100 μ g/m 1のアンピシ リンを含む 2リツトルの L B培地に植菌し、 37 で 16時間振盪培養した。 培 養終了後、 遠心分離によって集めた菌体を 37. lm 1のソニケーシヨンパッフ ァー 〔5 OmMトリス一 HC 1 (p H8. 0) 、 1 mM EDTA、 2mMフエ ニルメタンスルフォニルフルオライド〕 に懸濁し、 超音波破 幾にかけた。 この 破碎液を 12000 r pmで 10分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 70°C、 15分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 12000 r pmで 10分の遠心分離 を行い、 上清を集め、 40. 3 m 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A 〔50mMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA] で平衡化した R E S OUR S E Qカラム （アマシャム フ アルマシア バイオテク社製) に供し、 F PLCシステム (アマシャム ブアル マシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RNa s eHI Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。
バッファー Aで平衡化した RESOURSE Sカラム （アマシャム フアル マシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム （アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RN a s eHI Iは RESOURSE Sカラムを素通りした。
素通りした RNa s eHI I画分 40. 0mlを 50mM N a C 1を含むバ ッファー B 〔50mMトリスー HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDTA] 2 L を外液として、 2時間の透析を 3回行なった。 透析後の酵素液 40. 2 m 1を 5 OmM N a C 1を含むバッファー Bで平衡化した H i Tr a p-h e p a r i nカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシス テムを用いて 50〜55 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶出した。 その結 果、 約 24 OmM Na C 1のところに溶出された RN a s e H I I画分を得た。 この RNa s eHI I画分 7. 8 m 1をセントリコン一 10 (アミコン社製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 約 600 1の濃縮液を 4回に分けて 10 Om M Na C l、 0. 1 mM EDTAを含む 5 OmMトリス一 HC 1 (pH7.
0) で平衡化した Sup e r o s e 6ゲノレろ過カラム （アマシャム ファノレマシ ァ バイオテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s e HI Iは、 30. 0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分 子量は、 RN a s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出された RNa s eHI Iを Af uRNa s eHI I標品とした。 上記で得られた A f uRNa s eHI I標品を用いて、 参考例 3— (5) に記 載の方法により酵素活性を測定した結果、 A f u RN a s e H I I標品に RN a s eH活' f生が認められた。
参考例 8
本発明の方法に使用される大腸菌由来 RNa s eHのュ-ット数は、 以下の方 法で測定した。
(1) 使用する試薬液の調製
力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ 40 mM トリス—塩酸 (pH7. 7、 37°C) 、 4mM 塩化マグネシウム、 1 mM DTT、 0. 003% BSA、 4%グリセロール、 24μΜ ポリ （dT) になるように滅菌水で調製した。 ポリ [8—3H] アデニル酸溶液： 370 kBqのポリ [8— 3H] ァデュル酸 溶液を 200 1の滅菌水に溶解した。
ポリアデ-ル酸溶液：ポリアデエル酸を 3 mMになるように滅菌超純水で希釈 した。
酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ 25 mM トリス一塩酸 （ p H 7. 5、 3
7°C) 、 5mM 2—メルカプトエタノール、 0. 5mM EDTA (pH7. 5、 37°C) 、 3 OmM 塩ィ匕ナトリウム、 50 %グリセロールになるように滅 菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺 DNAの調製：子牛胸腺 DNA 20 Omg 100m lに懸濁し、 膨潤させた。 該溶液の UV 260 nmの吸光度を測定し、 lmg/m lの濃度に滅菌超純水で希釈した。 次に、 該溶液を 1 00°Cで 10分 間加熱後、 水浴中で急冷した。
(2) 活性測定方法
上記 （1) で調製した力価測定用反応液 985 w 1にポリ [8—3H] アデ二 ル酸溶液 7 μ 1を加え 37°Cで 1 0分間保持した。 次にポリアデエル酸を最終濃 度が 24 μΜになるように 8 μ 1加え、 さらに 37°Cで 5分間保持した。 このよ うにしてポリ [8—3 H] r A—ポリ dT反応液 1000 μ 1を調製した。 次に、 該反応液 200 μ 1を分取し、 30°Cで 5分間保持した後、 任意の希釈系列で希 釈した酵素液 1 μ 1を加え、 これらの反応液を経時的に 50 μ 1ずつサンプリン グして、 後の測定に用いた。 酵素添加からサンプリングまでの間の時間を Υ分と した。 また、 全 C ΡΜ用反応液 50 μ 1およびブランク用反応液 50 1は、 酵 素液の代わりに酵素希釈液を 1 β 1加えて調製した。 該サンプリング溶液に 10 OmMピロリン酸ナトリウム 1 00 μ 1、 熱変性子牛胸腺 DN Α溶液 50 μ 1お よび 10 %トリクロ口齚酸 300 μ 1 (全 C ΡΜ測定の場合は、 超鈍水 300 μ 1 ) を加え、 0°Cで 5分間保持後、 1 0000 r {)111で1 0分間遠心した。 遠心 後、 得られた上淸 250 μ 1をバイアルに入れ、 アクアゾルー 2 (ΝΕΝライフ サイエンスプロダクツ社製） 1 Om lを加え、 液体シンチレーションカウンタ 一で CP Mを測定した。
(3) ュニット計算
各酵素のユニット （Unit) 数は、 以下の計算式で算出した。
Unit/ ml ={ (測定した C PM—プランク C PM) X I. 2* X 20X 1000 X希釈率） χ 200 \ι \) / (全 CPMXY分 X 50 (μ 1) X 9**)
1. 2* ：全 CPM中に含まれるポリ [8—3 H] r A—ポリ dTの 50 μ 1当 たりの nmo 1数
9**：補正係数
実施例 1
本発明の方法を用いて腸管出血性大腸菌 O— 1 5 7の検出を行った。
本実施例において使用するプライマ を配列表の配列番号 31〜34に示した。 また、 配列番号 31と 32の組み合わせは、 O— 157のべ口毒素 （VT、 vero-toxin) 1をコードする配列を、 配列番号 33と 34の組み合わせは、 ベロ 毒素 2をコードする配列を検出するように構築した。 鍚型は、 ATCC登録番号 43895の腸管出血性大腸菌 O— 157を培養したものを集菌し、 適当な細胞 数に滅菌水で懸濁した後、 98 °Cで 10分間処理した熱抽出物を使用した。 以下 に反応液組成を示す。
27mM リン酸バッファー （pH7. 3) 、 0. 01% B SA (牛血清アル ブミン） 、 5% DMSO (ジメチルスルホキシド） 、 各 ImM dNTP混合物、 8mM酢酸マグネシウム、 それぞれ 60 pmo 1の上記のプライマー対、 104 〜： L 06細胞数に相当する錶型 DNA (熱水抽出物） 、 および滅菌蒸留水で反応 液容量を 48 μ 1にした。 上記反応液を 98°C、 1分間熱変性処理後、 55でに 冷却した。 次に、 5. 5 Uの B e a BEST DNAポリメラーゼ、 60UのE. c o 1 i RNa s eHを添加し、 55°C、 60分間保持した。 その後、 90°C、 2分間加熱して酵素を失活させた。 各反応液 3 μ 1を 4% ヌシーブ 3 ： 1ァガ ロース （宝酒造社製） ゲノレにて電気泳動を行なった。 その結果、 いずれのプライ マー対でも 104細胞数相当の DNAを鍚型として、 Ο— 157ベロ毒素 1およ ぴ 2を検出することができ、 本発明の方法が、 病毒性細菌の検出方法として利用 できることを確認した。 '
実施例 2
(1) 本発明の方法においてバッファーの種類を変えて検討した。 本実施例にお いて使用するプライマーは、 配列表の配列番号 39及び 40記載の配列を有する DNA増幅用のプライマーを用いた。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 各 120 p m ο 1の上記プライマー、 0 · 01 %プロピレンジァミン水溶液、 1 0 n gまたは 1 n gの錶型 DNAの混合液 10〃 1を 98°Cで 2分間、 熱変性さ せた後、 氷中で冷却し、 プライマーを鋅型 DNAにァニールさせた。 なお、 該铸 型は、 LDNA (宝酒造ネ: L ) を铸型とし、 配列表の配列番号 41及び 42記載 のプライマーを使用した PCRによって得られた増幅産物 （1005 bp) を S u p r e c 02 (宝酒造社製） で精製したものを用いた。
ァ -ーリング処理後、 上記混合液に各 0. 625 mM dNTP混合物、 5. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 0 1 2 5% B SA (ゥシ血清アルブミン） 、 1. 2 5% DMSO (ジメチルスルホキシド） 、 3 0Uの E. c o l i RN a s eH及ぴ 1 1 Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼを含む 3種類の反応用 緩衝液 （4 2. 5 mM トリシン一水酸化力リゥム緩衝液 (pH8. 5) 、 4 2. 5mM ビシン一水酸化カリウム緩衝液 （p H8. 3) 及び 42. 5mM へぺ ス一水酸化力リゥム緩衝液 (pH7. 8) ) 40 μΐを添加し、 最終容量を 5 0 β 1にした。 該反応液は、 60°Cで 1時間保持した。 反応終了後、 反応液 3 μ1 を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動で確認したところ、 いずれの鍚型量において も目的の増幅断片が確認できた。 特に、 ビシン一水酸化カリウム緩衝液 (ρ Η8. 5) を用いた反応系でより多くの増幅産物が得られた。
(2) さらに、 へぺスー τΚ酸ィ匕カリウムバッファーによる反応 i1生の向上について 検討した。 鎵型は、 pUC l 9プラスミド DN Aのマルチクローユングサイトに 約 1 50 b pの DNA断片を挿入したものを用いた。 該錶型は、 以下のようにし て調製した。
配列表の配列番号 1 34および 1 3 5記載の配列を有する pUC 1 9 u p p e r 1 50 PCRプライマー、 pUC 1 9 l owe r PCRプライマーを 使用し、 pUC 1 9プラスミド DNA 1 00 p gを錄型として P CR反応を行つ た。 得られた増幅断片は、 マイクロコン一 1 00で精製後、 DNA b l u n t i n g k i t (宝酒造ネ： h ) を用いて平滑末端化し、 pUC 1 9プラスミ ドの H i n c I Iサイトにサブクローニングした。 上記増幅断片の挿入されたプラス ミドを用いて、 大腸菌 JM1 0 9を形質転換した。 該形質転換体を培養し、 その 菌体よ Q I AGEN p l a s m i d m i n i k i t (キアゲン社製) を用 いて DNA挿入プラスミドを精製した。 この DNA挿入プラスミドを錡型として 使用した。
上記の方法で調製した p U C 1 9— 1 50プラスミド D N Aを鎵型とし、 配列 表の配列番号 3 5及び 3 6記載の塩基配列を有する MC S— Fおよび MC S— R プライマーにより PCR増幅した DNA断片を錄型とした。 また、 キメラオリゴ ヌクレオチドプライマ一としては、 配列表の配列番号 3 7及び 3 8記載の塩基配 列を有する MF 2N3 (24) プライマーおよび MR 1 N 3 (24) プライマー を使用した。 該プライマーの組合せにより約 3 50 b pの増幅断片力得られた。 検討するバッファ一は、 へぺス一水酸ィ匕カリウムバッファ一系を選択し、 対照 としてリン酸カリウムバッファ一系、 トリシンバッファ一系を使用した。 以下に 反応液組成を示す。
反応液 A；上記 P C R増幅断片 1 0 n g、 各 5 0 pmo lずつの MF 2N3
(24) プライマーおょぴ MR 1 N 3 (24) プライマー、 0. 0 1 %プロピレ ンジァミン水溶液、 および滅菌蒸留水で反応液量を 1 0 μ 1とした。
反応液 Β ；以下の 3種類を調製した。
リン酸カリゥムバッファ一系：最終濃度 3 5mM リン酸カリゥムバッファ (pH7. 5) 、 1. 2 5% DMSO、 0. 0 1 2 5% B S A, 5 mM 酢酸 マグネシウム、 各 0. 6 2 5mM dNTP混合物、 60Uの E. c o l i R N a s e Hおよび 5. 5 Uの B e a B E ST DNAポリメラーゼを含有する反 応液 40 1を調製した。
トリシンバッファ一系：最終濃度 4 2. 5mM トリシンバッファー （pH8. 7) 、 1 2. 5mM 塩化カリウム、 1 2. 5mM 硫酸アンモニゥム、 1. 2
5%DMSO、 0. 0 1 2 5%B SA、 5mM 酢酸マグネシウム、 各 0. 6 2 5mM dNTP混合物、 30Uの E. c o l i RNa s e Hおよび 5. 5U の B e aB E ST DN Aポリメラーゼを含有する反応液 40 μ 1を調製した。 へぺス一 7_R酸化力リゥムバッファ一系：最終濃度 2 5 mM へぺス一水酸化力 リウムバッファー （pH7. 8) 、 1 2 5mM 酢酸カリウム、 1. 2 5%DM SO、 0. 0 1 2 5%B SA、 5 mM 酢酸マグネシウム、 各 0. 6 2 5mM dNTP混合物、 30UのE. c o l i RNa s e Hおよび 5. 5 Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼを含有する反応液 40 μ 1を調製した。
上記反応液 Αを 98° (、 2分間熱変性処理した後、 6 0°Cまたは 6 5°Cに冷却 したのち氷上に静置した。 氷上に置いておいた反応液 Aに上記各反応液 Bを加え て混合し、 反応液を 50 1とした。 該反応液を 60 °Cまたは 6 5 °Cで 1時間ィ ンキュペートした。 反応終了後 4°Cに冷却し、 1/1 0容量の 0. 5M EDT Aを加えて反応を停止させた。 この反応液 3 μ 1を 3%ヌシーブ 3 ： 1ァガロー スゲル電気泳動に供した。 その結果、 反応温度に関わらず、 3種類 C 系で目的の増幅断片が確認できた。 特に本実施例においては、 へぺス一水酸化力 リゥムバッファ一系が最も増幅産物量が多く、 反応性が高いことが確認できた。 実施例 3
(1) 本発明の方法について、 プライマーと铸型のアニーリング条件について検 討した。 国際公開第 9 7/320 10号パンフレツト記載のフラボパクテリゥム 属細菌、 Flavobacterium sp. SA-0082 (日本国〒 305— 856 6茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1中央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ ンターに平成 7年 （1 995年） 3月 295 FERM P— 14872とし て寄託され、 また前記日本国〒 305— 8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに FERM BP— 5402 [国際寄託への移管請求日 ：平成 8年 （1 996年） 2月 1 5日] として寄託されている。 ） の部分塩基配列に従って、 配列表の配列番号 43及ぴ 44記載の塩基配列を有するプライマーを使用した。 また、 本実施例においては、 Flavobacterium sp. SA-0082 由来のゲノム DNAを鎳型とし、 配列表の配列番 号 45及ぴ 46記載のプライマーの組み合わせによる PCR増幅産物 （57 3 b p) を S u p r e c O 2 (宝酒造社製） で精製したものを錶型 DNAとして用い た。 反応は以下のように行った。 すなわち、 各 1 20 pmo 1の上記プライマー に 2種類のアニーリング溶液 (50 OmM塩化カリウム及ぴ 8 μΜ スペルミジ ン、 あるいは 0. 05%プロピレンジァミン) をそれぞれ 2 μ 1添加し、 さらに 1 0 n gまたは 1 n gの上記 P C R増幅断片を含む最終液量 1 0 μ 1の混合液を 98 で 2分間、 熱変性させた。 変性後、 氷中で急冷することによりプライマー を鎳型にァニールさせた。
上記ァニーリング処理後、 該混合液に各 0. 625 mM dNTP混合物、 5. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 0 1 25%B SA (ゥシ血清アルブミン） 、 1. 25%DMSO (ジメチルスルホキシド） 、 30Uの E. c o l i RNa s e
H及び 1 1 Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼを含む 3種類の緩衝液 （4 2. 5 mM トリシン一水酸化力リゥム緩衝液 (pH8. 5) 緩衝液、 42. 5 mM ビシン一水酸化カリウム緩衝液 （pH8. 3) 、 及ぴ 42. 5mM へぺ スー水酸化カリウム緩衝液 (pH7. 8) ) のそれぞれを 40 ^ 1添加し、 最終 容量を 50 1にした。 該反応液は、 52 °Cで 1時間保持した。 反応終了後、 反 応液 3 ^ 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図 1に示す。 図 1は、 アニーリング溶液と緩衝液のそれぞれの組み合わせについての反応後の 電気泳動の結果を示し、 レーン 1は分子量マーカー （100 b pラダー、 宝酒造 社製） 、 レーン 2はプロピレンジァミン/トリシン （铸型 l On g) 、 レーン 3 はプロピレンジァミン/へぺス （铸型 l On g) 、 レーン 4はプロピレンジアミ ン /へぺス（铸型 1 n g )、 レーン 5はプロピレンジァミンノビシン (铸型 10 n g) 、 レーン 6は、 プロピレンジァミン Zビシン （铸型 l n g) 、 レーン 7は 500 mM塩化力リゥム及び 8 a Mスペルミジン Zビシン （铸型 10 n g ) 、 レ ーン 8は 50 OmM塩ィ匕カリウム及ぴ 8 μΜスペルミジンノビシン （铸型 I n g) 、 レーン 9は分子量マーカー （100 b pラダー） 、 レーン 10はプロピレ ンジァミン Zトリシン （铸型 l n g) , レーン 1 1は 500 mM塩化力リウム及 ぴ 8 /zMスペルミジン/トリシン (翻 l n g) 、 レーン 12はプロピレンジァ ミンノへぺス （铸型 l n g) 、 レーン 13は 50 OmM塩ィ匕カリウム及び 8 Μ スペルミジンノへぺス （鏡型 l n g) 、 レーン 14はプロピレンジァミン/ビシ ン （鏡型 l n g) 、 レーン 15は 50 OmM塩ィ匕カリウム及ぴ 8 μΜスペルミジ ン ビシン (铸型 1 n g) である。
図 1に示したように、 錶型 DNA量に関わらず、 上記 3種類のいずれの緩衝液 においてもプライマーと铸型 DNAのアニーリングに 50 OmM 塩ィ匕カリゥム + 8 スペルミジンを含むアニーリング溶液を使用したものがより多くの目 的と増幅産物が得られた。 特に本実施例においては、 50 OmM 塩化カリウム + 8 Μ スペルミジンを含むァニーリング溶液とビシン一水酸化力リゥム緩衝 液との組み合わせが良好であった。
(2) λ D Ν Αの P C R増幅断片を鍚型とした場合のァニーリング溶液の効果に ついて検討した。 本実施例において、 実施例 2 (1) 記載のキメラオリゴヌクレ ォチドプライマ一を使用した。 鏡型 DNAは、 実施例 2 (1) で調製した PCR 増幅断片及び； IDNAを用いた。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 各 1 20 pmo 1の上記プライマーに 3種類のアニーリング溶液溶液 (50 OmM 塩化カリウム及ぴ 8AiM スペルミジン、 0. 05%プロピレンジァミンまたは 滅菌水） をそれぞれ 2 μ 1加え、 さらに l O n gまたは l n gの PC R増幅断片 を含む全液量 10 μ 1の混合液を調製した。 該混合液を 98°Cで 2分間、 熱変性 させた後、 氷中で急冷することによりプライマーを铸型にァニールさせた。
アニーリング処理後に各 0. 6 25mM dNTP混合物、 5. OmM 酢酸 マグネシウム、 0. 0 1 25%B SA、 1. 25%DMSO、 3011の£. c o
1 i RN a s e H及ぴ 1 1 Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼを含む 3 種類の緩衝液 (42. 5mM トリシン一水酸化力リゥム緩衝液 （ p H 8. 5) 、
42. 5 mM ビシン一水酸化力リゥム緩衝液 （ p H 8. 3 ) 、 及ぴ 42. 5m M へぺス一水酸化力リゥム緩衝液 (pH7. 8) ) をそれぞれ 40 μ 1添加し、 最終容量を 50 ^ 1にした。 該反応液を 60 °Cで 1時間保持した。 反応終了後、 該反応液 3 / lを 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図 2に 示す。 図 2は、 铸型量と反応緩衝液とァニーリング溶液の組み合わせについて検 討した電気泳動の結果を示し、 レーン 1はマーカー （1 00 b pラダー） 、 レー ン 2は鍀型 1 O n gでトリシン /50 OmM 塩化カリゥム及び 8 μΜスペルミ ジンの組み合わせ、 レーン 3は铸型 1 n gでトリシンノ 500 mM 塩化力リゥ ム及ぴ 8 M スペルミジンの組み合わせ、 レーン 4は铸型 10 n gでビシン/
500 mM塩化力リゥム及び 8 μ Μスペルミジンの組み合わせ、 レーン 5は鎳型 1 n gでビシン Ζ50 OmM 塩ィ匕カリゥム及び 8 μΜ スペルミジンの組み合 わせ、 レーン 6は铸型 1 0 n gでへぺス /50 OmM 塩ィヒカリウム及び 8 Ai M スペルミジンの組み合わせ、 レーン 7は铸型 l n gでへぺス/ 500 mM 塩化 力リゥム及ぴ 8 μ Μ スペルミジンの組み合わせ、 レーン 8は分子量マーカー (100 b ρラダー） 、 レーン 9は、 錡型 1 0 n gでトリシン/プロピレンジァ ミンの組み合わせ、 レーン 10は铸型 1 n gでトリシン/プロピレンジァミンの 組み合わせ、 レーン 1 1は铸型 10 n gでビシン/プロピレンジァミンの組み合 わせ、 レーン 1 2は铸型 1 n gでビシン/プロピレンジァミンの組み合わせ、 レ ーン 1 3は鎳型 1 0 n gでへぺス /プロピレンジァミンの糸且み合わせ、 レーン 1 4は鎳型 l n gでへぺス /プロピレンジァミンの組み合わせ、 レーン 1 5は分子 量マーカー （ 100 b pラダー） 、 レーン 1 6は錶型 10 n gでトリシン 水の 組み合わせ、 レーン 1 7は鏡型 1 n gでトリシン/水の組み合わせ、 レーン 1 8 は錡型 1 0 n gでビシン Z水の組み合わせ、 レーン 1 9は铸型 1 n gでビシン Z 水の組み合わせ、 レーン 20は鏡型 1 0 n gでへぺス Z水の組み合わせ、 レーン 2 1は铸型 1 n でへぺス /水の組み合わせである。
図 2に示したように、 铸型 DNA量に関わらず、 上記 3種類の緩衝液と上記 3 種類のァニーリング溶液の組み合わせのいずれにおいても目的の増幅断片が得ら れることが確認できた。 特に、 ビシン緩衝液と 5 00 mM 塩ィ匕カリゥム及ぴ 8 μΜ スペルミジンを含むアニーリング溶液との組み合わせにおいて、 より多く の増幅断片が得られることが確認できた。
実施例 4
逆転写酵素 （RT a s e) 阻害剤存在下での本発明の方法について検討した。 上記 RT a s eP且害剤としてホスホノギ酸 （PFA ： Phosphonoformic acid) を 用いた。 本実施例においてプライマーは、 配列表の配列番号 4 7及び 48記載の ものを使用した。 また、 铸型 DNAとしては、 月昜管出血性大腸菌 O— 1 5 7のゲ ノム DNAを鎊型とし、 配列表の配列番号 4 9及ぴ 5 0記載のプライマーによる PC R増幅産物 （5 7 6 b p) を S u p r e c 0 2 (宝酒造社製） で精製したも のを用いた。 反応は以下のように行った。 すなわち、 各 1 2 0 pmo 1の上記プ ライマーと 2 ilの 50 OmM 塩化カリウム及ぴ 8 M スペルミジンを含む 了ニーリング溶?夜に 1 n gの P C R増幅断片を添加した全液量 1 0 μ 1の混合液 を、 9 8でで 2分間、 熱変性させた後、 氷中で急冷することによりプライマーを 鎵型にァニールさせた。
上記アニーリング処理後、 該処理液に各 0. 6 2 5mM dNTP混合物、 4 2. 5mM トリシン一水酸化カリウム緩衝液 (p H8. 5) 、 5. OmM 酢 酸マグネシウム、 0. 0 1 2 5% B SA (ゥシ血清アルブミン） 、 1. 2 5% DMSO (ジメチルスルホキシド） 、 30Uの E. c o l i RN a s e H、 1 1 Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼを含む 40 1を添カ卩し、 さらに 5 00 μ g/m 1あるいは 50 μ g/m 1の濃度になるように： P FAを加え、 最終 容量を 50 1にした。 該反応液は、 5 5 °Cで 1時間保持した。 対照として、 P F Aを添加しない系も同様に調製した。 反応終了後の反応液 9 1を 3. 0 %ァ ガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図 3に示す。 図 3は、 逆転写酵素活 性阻害剤の効果を示す電気泳動の結果を示し、 レーン 1は分子量マーカー （10 0 b pラダー） 、 レーン 2は PF A無添加、 レーン 3は 500 g/m 1の PF A添加、 レーン 4は 50 μ g/m 1の P FA添加結果である。
図 3に示したように、 P F Aを添加することにより非特異的な増幅が抑制され、 さらに目的の増幅断片が確認できた。 特に 500 g /m 1になるように添加し た系では、 添加していない系で見られる非特異的な増幅産物が見られず、 目的の 増幅断片が明瞭に増幅されていることが確認できた。
実施例 5
本発明の方法について増幅断片長と検出感度の関係について検討した。
( 1 ) 配列表の配列番号 51〜 53記載の大 S 菌 O— 157ベロ毒素増幅用プラ イマ一を合成した。 さらに、 実施例 4で使用したキメラオリゴヌクレオチドプラ イマ一も使用した。 上記プライマーの組み合わせと増幅断片長は、 配列表の配列 番号 51及び 48の組み合わせで 247 b p、 52及び 53の組み合わせで 16 8 b p、 52及び 48の組み合わせで 206 b p、 47及ぴ 53の組み合わせで 135 b p、 47及ぴ 48の組み合わせで 173 b pである。 本実施例において 錶型 DNAは、 実施例 4で調製した 576 b pの P C R増幅断片精製物を用いた。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 上記各 60 pm o 1のプライマーと 2 /^ 1の0. 05%プロピレンジァミン水溶液、 10 f g〜： L 0 n gの上記 PCR 増幅断片を含む全液量 10 μ 1の混合液をサーマルサイクラ一パーソナル （宝酒 造社製） で 98でで 2分間熱変性後、 55 °Cに冷却し、 铸型にプライマーをァニ 一リングさせた。
上記ァニーリング処理した混合液に 0. 625 mM dNTP混合物、 42. 5mM トリシン一水酸ィ匕カリウム緩衝液 （pH8. 5) 、 5. OmM 酢酸マ グネシゥム、 0. 0125%BSA (ゥシ血清アルブミン） 、 1. 25%DMS O (ジメチルスルホキシド) 、 30Uの E. c o l i RNa s eH、 5. 5U の B c aBEST DNAポリメラーゼ、 及び滅菌水を含む全液量 40 μ 1の反 応液を添力 Πし、 最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液は、 55でで1時間保持し た。 反応終了後、 該反応液 5^ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 対照として、 配列表の配列番号 54及ぴ 55記載のプライマーを用いて、 上記 ρ CR増幅断片 1 p g〜l 0 f gの検出を行った。 上記プライマーの組み合わせに より、 135 b pの増幅断片が得られる。 すなわち、 各 60 pmo 1のプライマ 一、 Ι ΟΧΕχ T a qバッファー （宝酒造社製） 5 ^ 1、 1. 25Uのタ カラ ExTa q DNAポリメラーゼ （宝酒造ネ ±$¾ 、 0. 2 mM dNTP 混合物を含む全量 50 1の P C R溶液を調製した。 P C R条件は、 94 °C 3 0秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクル （所要時間は、 2分 38 秒） とした 25または 30サイクルで行つた。 反応終了後、 I C AN法の場合は 1 μ 1、 PC R法の場合は、 5 μ 1の反応液を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動 に供した。 その結果を図 4及ぴ表 1に示す。
増幅サイズ (bp) 検出限界
I CAN法； （全所要時間、 70分）
247 100 p g
168 100 f g
206 100 p g
135 10 f g
173 100 f g
PCR法 (25サイクル： ：全所要時間、 約 66分）
135 100 f g
PCR法 （30サイクル: ：全所要時間、 約 80分）
135 10 f g 図 4は、 I C AN法 （反応液の 1 50量を泳動） 及び P C R法 （反応液の 1 0量を泳動） での増幅鎖長 135 b pの場合の検出限界を示す電気泳動の結 果を示し、 レーン 1は分子量マーカー （100b pラダー） 、 レーン 2は I CA N法で錶型 1 p gの場合、 レーン 3は I CAN法で錄型 100 f gの場合、 レー ン 4は I C AN法で铸型 10 f gの場合、 レーン 5は 25サイクルの P C R法で 錶型 1 gの場合、 レーン 6は 25サイクルの P C R法で铸型 100 f gの場合、 レーン 7は 25サイクルの P C R法で鍀型 10 f gの場合、 レーン 8は 30サイ クルの P C R法で铸型 1 p gの場合、 レーン 9は 30サイクルの P C R法で铸型 100 f gの場合、 レーン 10は 30サイクルの P C R法で錄型 10 f gの場合 である。 表 1に示したように P C R法とほぼ同等の検出感度が得られることを確認した。 さらに、 同じ検出感度の場合、 PCR法の反応所要時間約 80分に比べ、 本発明 の方法の反応所要時間は 70分となり、 所要時間の短縮ができることを確認した。
( 2 ) 配列表の配列番号 39、 40及び 56記載の塩基配列を有する； L D N A増 幅用のプライマーを合成した。 該プライマーの組み合わせと増幅断片長は、 配列 表の配列番号 39及ぴ 40の場合は 151 b p、 56及び 40の場合は 125 b pである。 また、 本実施例において鎳型 DN Aは、 実施例 2 (1) で調製したも のを使用した。 反応は以下のように行った。 すなわち、 各 120 pmo 1の上記 プライマーに 2 1のアニーリング溶液 ( 500 mM 塩化カリウム及ぴ 8 WM スペルミジン） と、 1 f g〜： L n gの鎳型を加え、 滅菌水で全液量を 10 μ 1に した。 該液を 98 °Cで 2分間、 熱変性させた後、 氷中で急冷することによりプラ イマーを铸型にアニーリングさせた。
ァニーリング処理後、 上記混合液に各 0. 625 mM dNTP混合物、 42. 5 mM トリシン一水酸化力リゥム緩衝液 ( p H 8. 5) 、 5. 0 mM 酢酸マ グネシゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 3011の£. c o l i RNa s eH、 1 111の；60 &：6£3丁 DN Aポリメラーゼを含む 40 1を添加し、 滅菌水で最終容量を 50 1にした。 該反応液は、 60°Cで 1時間 保持した。 反応終了後、 該反応液 3 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供 した。 その結果を表 2に示した。
増幅サイズ （b p) 検出限界
125 10 f g
151 100 f g 表 2に示したように Aを铸型にした場合においても、 最適な領域を検討 することにより、 検出感度を 10 f gまで下げることができることを確認した。
(3) 配列表の配列番号 57及ぴ 58記載の塩基配列を有する菊ウイロイド遺伝 子増幅用プライマーを合成し、 ウイロイド感染菊由来 RNAを铸型として特願平 9—140383公報記載の方法で調製した増幅断片 （全長 340 b p) をブラ スミド T 7ブルー Tベクター （宝酒造製） に挿入して調製した。 これで大腸菌 J M 109コンビテントセル （宝酒造製） を形質転換し、 L B培地 5 m 1にて 3 7°C 16時間培養した。 菌体を回収し、 Q I AGEN P 1 a s m i d Mi n i Ki t (キアゲン社製） を用いてマニュアルに従い、 プラスミドの精製を おこなった。 ベックマン DU— 600 (ベックマン製） にて濃度測定を行い、 滅 菌水にて 1 μ 1あたりプラスミ ド濃度 0、 1 f g、 10 f g、 100 f g、 1 p g、 10p g、 100 p g l ngに調製した。 I CAN反応系 50 1におい て上記調製プラスミド溶液 1 1を铸型として用いた。 本実施例においてプライ マーは、 配列表の配列番号 59及び 60記載の塩基配列を有する CSVD— F 2 プライマー及び CSVD— R 6プライマーを使用した。 反応は、 以下のように行 つた。 すなわち、 上記プライマ一各 50 pmo 1、 各調製プラスミド溶液 1 μ 1 及び最終濃度 0. 01 %プロピレンジァミンを含む全液量 10 1の混合液を調 製した。 該混合液をサーマルサイクラ一パーソナル （宝酒造製） にて 98°C、 2 分間熱処理後、 60°Cまで冷却し、 1分間保持後、 氷上に保存した。
アニーリング処理後、 上記混合液に最終濃度 20 mM へぺス一水酸化力リウ ムバッファ一 （pH7. 8) 、 10 OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500 M dNTP混合物、 3 011の£. c o l i RNa s eH、 5. 511の；6 c a BE ST DNAポリメ ラーゼを添加し、 滅菌水で最終容量を 50 1にした。 該反応液をあらかじめ、 60°Cに設定したサーマルサイクラ一パーソナルにセットし 60分間反応させた。 反応終了後、 各反応液 3^ 1を 3%ヌシーブ 3： 1ァガロース電気泳動に供した。 その結果、 目的とする増幅産物 （約 90b p、 約 70b p、 約 50b p) につい て、 10 f gの铸型濃度の場合まで確認できた。
実施例 6
本発明の方法で使用するプライマーについて検討した。
(1) プライマーの Tm値と反応温度について検討した。 配列表の配列番号 43 及び 61〜 63記載の塩基配列を有する、 フラボパクテリゥム属
(Flavobacterium sp. SA-0082) 増幅用プライマーを合成した。 さらに該プライ マーは、 160 b p以下で G C含量が約 20 %の領域を増幅するように構築した。 該プライマーの組み合わせと増幅断片長は、 配列表の配列番号 4 3及び 6 2の場 合は 1 26 b p、 4 3及ぴ 6 3の場合は 1 5 8 b p、 6 1及び 6 2の場合は 9 1 b p、 6 1及び 6 3の場合は 1 2 3 b pである。 なお、 本実施例において錡型と なる DNAは、 実施例 3 (1) で調製した PCR増幅産物を用いた。 反応は以下 のように行った。 すなわち、 各 1 20 pmo 1の上記プライマー、 2 1の 3種 類のァユーリング溶液 （5 0 OmM 塩化カリウム及び 8 μΜ スペルミジン、 0. 0 5%プロピレンジァミン、 または水） 及び、 1 f g〜l 0 n gの铸型を含 む全液量 1 0 j 1の混合液を調製した。 該混合液を 9 8 °Cで 2分間、 熱変性させ た後、 氷中で冷却することによりプライマーを铸型にアニーリングさせた。 ァニーリング処理後、 上記混合液に各 0. 6 2 5 mM dNTP混合物、 5.
OmM 酢酸マグネシウム、 0. 0 1 2 5% B SA (ゥシ血清アルブミン） 、 1. 2 5% DMSO (ジメチルスルホキシド） 、 3 011の£. c o l i RN a s e H及び 1 1 Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼを含む 3種類の緩衝液 ( 1 7 mM トリシン一水酸化力リゥム緩衝液 (p H8. 5) 、 1 7 mM ビシ ン—水酸化カリウム緩衝液 (pH8. 3) 、 及び 2 OmM へぺス一水酸化カリ ゥム緩衝液 (pH 7. 8) ) を 40 μ 1を添加し、 最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液を 5 2 °C、 5 5 °Cまたは 6 0でで 1時間保持した。 反応終了後、 反応液 3 μ 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果、 反応温度が 5 2 °Cの場合に目的の増幅断片が確認できた。 特に、 5 00 mM塩化力リゥム及ぴ 8 μ Μスペルミジンを含むァニーリング溶液とトリシン、 あるいはビシン緩衝液 の組み合わせにおいてより多くの目的とする増幅断片が得られた。 反応温度が 5 2 °Cにおけるブラィマー対、 増幅断片長及び検出感度にっレヽて図 5及び表 3に示 す。
増幅サイズ （b p) 検出限界
1 26 1 0 0 f g
1 58 1 P g
9 1 1 f g
1 23 1 0 0 f g 図 5は、 A Tリツチな領域を増幅する場合の増幅断片長と鑄型 D NA量の関係 を示した電気泳動の結果を示し、 レーン 1は分子量マーカー （ 1 0 0 b pラダ 一） 、 レーン 2は増幅断片長 9 1 b pで铸型 1 gの場合、 レーン 3は増幅断片 長 9 1 b pで鎳型 1 0 0 f gの場合、 レーン 4は増幅断片長 9 1 b pで鍀型 1 0 f gの場合、 レーン 5は増幅断片長 9 1 b pで鐯型 1 f gの場合、 レーン 6は増 幅断片長 1 2 3 b pで鐯型 1 p gの場合、 レーン 7は増幅断片長 1 2 3 b pで铸 型 1 0 0 f gの場合、 レーン 8は増幅断片長 1 2 3 b pで錶型 1 0 f gの場合、 レーン 9は増幅断片長 1 2 6 b pで鎵型 1 gの場合、 レーン 1 0は増幅断片長 1 2 6 b で铸型 1 0 0 f gの場合、 レーン 1 1は増幅断片長 1 2 6 b pで铸型 1 0 f gの場合、 レーン 1 2は増幅断片長 1 5 8 b pで鏡型 1 p gの場合、 レ一 ン 1 3は増幅断片長 1 5 8 b pで铸型 1 0 0 f gの場合、 レーン 1 4は増幅断片 長 1 5 8 b pで铸型 1 0 f gの場合である。
図 5及び表 3に示したように、 A Tリッチな鍀型に対し、 ATリッチなプライ マーセッ トで本発明の方法を行う場合は、 プライマーの Tm値にあわせて、 反応 温度を下げると良いことが明らかになった。
( 2 ) 本発明の方法においてプライマーの高次構造が反応性に影響を与えること が考えられた。 従って、 プライマ一の高次構造を回避し、 プライマーが本来の鍚 型にアニーリングしやすくするためのプライマーの修飾を検討した。 プライマー は、 配列表の配列番号 4 7〜4 8及ぴ 6 4〜6 9記載のそれぞれのプライマーを 使用した。 すなわち、 配列表の配列番号 4 7記載の塩基配列を有するプライマー、 配列番号 6 4〜 6 6記載の塩基配列を有するプラィマーで、 さらに 3 '末端より 4塩基目、 5塩基目、 6塩基目の塩基がそれぞれイノシンデォキシヌクレオチド である 1 2 0 1 4、 1 2 1 1 5及び 1 2 2 I 6プライマー、 配列表の配列番号 1 0 4記載の塩基配列を有するプライマー、 配列番号 6 7〜6 9記載の塩基配列を 有するプライマーで、 さらに 3 '末端より 4塩基目、 5塩基目、 6塩基目の塩基 がそれぞれィノシンデォキシヌクレオチドである 1 2 3 1 4、 1 2 4 1 5及び 1 2 5 I 6プライマーを使用した。 本実施例において铸型 D N Aは、 実施例 4で調 製したものを使用した。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 前記各 5 O p m o 1のプライマー、 2 μ 1の 0 . 0 5 % プロピレンジァミン水溶液、 1 n g 〜； L 0 n gの铸型 DN A及び滅菌蒸留水を含む全液量 10^ 1の混合液をサーマ ルサイクラ一 （Ge n e Amp PCR S y s t e m 9600、 アプライドバ ィォシステムズ社製） を用いて、 98 °Cで 2分間、 続いて 55 °Cまで冷却し、 1 分間保持した。
アニーリング処理後、 該混合液に 0. 625mM dNTP混合物、 42. 5 mM トリシン一 zk酸化カリウム緩衝液 (pH8. 5) 、 5. OmM 酢酸マグ ネシゥム、 0. 01250/0BSA、 1. 25%DMSO、 30Uの E. c o l i RNa s e Hあるいは 5Uのサーマス サーモフィラス （T t h) 由来耐熱性 R Na s eH (東洋紡社製、 以下 T t h RNa s eHと記載する。 ） 及び 5· 5 Uの B c a BEST DNAポリメラーゼを添加し、 滅菌水で最終容量を 50 μ
1にした。 該反応液は、 55 °Cで 1時間保持した。 反応終了後、 反応液 5μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図 6に示す。
図 6は、 E. c o l i RNa s e H^t^T t h RNa s eHを使用した場 合のィノシンデォキシヌクレオチド含有キメラオリゴヌクレオチドプライマ一の 効果について示した電気泳動の結果を示し、 レーン 2〜レーン 9まで'は、 E. c
0 1 1 RNa s eH、 レーン 10〜17は、 T t h RNa s eHを使用した 場合である。 レーン 1は分子量マーカー （ 100 b pラダー) 、 レーン 2は配列 番号 47及び 48記載のプライマー対で鎵型 1 n gの場合、 レーン 3は、 120
I 4及び 123 I 4プライマー対で铸型 1 n gの場合、 レーン 4は、 121 1 5 及び 124 1 5プライマー対で铸型 l u gの場合、 レーン 5は、 1221 6及び
125 1 6プライマー対で鎳型 1 n gの場合、 レーン 6は配列表の配列番号 47 及び 48記載のプライマー対で鐯型 10 n gの場合、 レーン 7は、 120 I 4及 ぴ 123 I 4プライマー対で鏡型 10 n gの場合、 レーン 8は、 121 1 5及ぴ 1241 5プライマー対で鎊型 10 n gの場合、 レーン 9は、 122 1 6及ぴ 1 25 1 6プライマー対で錶型 1 n gの場合、 レーン 10は、 配列表の配列番号 4
7及び 48記載のプライマー対で铸型 1 n gの場合、 レーン 1 1は、 120 14 及び 123 I 4プライマー対で鎵型 1 n gの場合、 レーン 12は、 121 I 5及 び 124 I 5プライマー対で鑤型 1 n gの場合、 レーン 13は、 1221 6及ぴ 1251 6プライマー対で鎊型 1 n gの場合、 レーン 14は配列表の配列番号 4 7及び 48記載のプライマー対で铸型 1 0 n gの場合、 レーン 1 5は、 1 20 1 4及ぴ 1 2 3 I 4プライマー対で铸型 1 0 n gの場合、 レーン 1 6は、 1 2 1 1 5及ぴ 1 24 I 5プライマー対で錄型 1 0 n gの場合、 レーン 1 7は、 1 2 2 1 6及び 1 2 5 1 6プライマー対で鍀型 1 0 n gの場合である。
図 6に示したように、 鎳型量に関わらず、 また、 大腸菌由来 RN a s e Hある いはサーマス サーモフィラス由来耐熱性 RN a s e Hのいずれを用いた場合に おいてもプライマーの 3'末端より 4塩基目あるいは 5塩基目にイノシンを導入 したプライマーにおいて目的の増幅産物の増加が確認できた。 このことより、 ィ ノシンを適当な位置に入れることにより、 I CANの反応性が向上することが明 らかになつた。
(3) 上記 （2) と同様の目的でプライマーの検討を行った。 プライマーは、 配 列表の配列番号 84及び 8 5記載の塩基配列の塩基配列を有するプライマーで、 さらに 3 ' 末端の 3塩基が （a— S、 あるいは alpha- thio) リボヌクレオチドで あるもの、 すなわち、 RNA部分が 5， 一ホスホチォエート結合を持つオリゴヌ クレオチドプライマ一 1 Sおよび 4 Sを合成した。 また、 配列表の配列番号 70 及ぴ 7 1記載の塩基配列を有するプライマーで、 さらに 3'末端の 3塩基と該プ ライマーのデォキシリボヌクレオチド部分の配列の一部がリボヌクレオチドであ る、 すなわち、 該プライマーの 3'末端より 1 1塩基目から 1 3塩基目までがリ ボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドプライマ一 1 N 3N 3および 4 N3N 3を合成した。 铸型となる DNAは、 実施例 4で調製したものを使用した。 反応 は、 以下のように行った。 すなわち、 前記各 50 pmo 1のプライマー、 2 μ 1 の 0. 0 5 %プロピレンジアミン水溶液、 1 0 n gの鎳型 DN A及び滅菌水を含 む全液量 1 0 1の混合液をサーマルサイクラ一を用いて、 9 8 °Cで 2分間加熱 処理を行ったのち、 氷中に移し冷却した。
ァニーリング処理後、 上記混合液に 0. 6 25 mM dNTP混合物、 4 2.
5mM トリシン一水酸ィ匕カリウム緩衝液 （pH8. 5) 、 5. OmM 酢酸マ グネシゥム、 0. 0 1 25%B SA、 1. 2 5%DMSO、 3011の£. c o l i RNa s e Hあるいは 5Uの T t h RNa s e H及び 5. 5Uの B c a B E S T DNAポリメラーゼを含む全液量 40 μ 1を加え、 滅菌水で最終容量を 50μ 1にした。 該反応液を、 サーマルサイクラ一で 55 °Cで 1時間保持した。 反応終了後、 反応液 5 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 その 結果、 いずれの RN a s eHを用いた場合においても、 1 Sと 4 Sのプライマー の組み合わせおよび 1N3N3と 4N3N3のプライマーの組み合わせにおいて 目的の位置に明らかな増幅産物が確認できた。 このことから、 プライマーの 3' 末端部分の 5'—ホスホチォエートイ匕は、 本発明の方法において有効であること を確認した。 さらに、 プライマーの 3' 末端に加え、 内部の適当な位置をリボヌ クレオチドに置き換えた場合でも本発明の方法の反応性の向上に有効であること を確認した。
実施例 7
特定の金属イオン存在下で E. c o 1 i RNa s eH活性を有する DNAポ リメラーゼを用いた本発明の方法について検討した。 実施例 2 (1) で使用した キメラオリゴヌクレオチドプライマ一を各 120 pmo 1、 2 μ 1の 500 mM 塩化力リゥム及び 8 μ Μスペルミジンを含むァニーリング溶液、 実施例 2 (1) で用いた 1 n gの铸型 D N A及び滅菌水含む全液量 10 μ 1の混合液を 98でで 2分間、 熱変性させた後、 氷中で急冷することによりプライマーを鎳型にァニー リングさせた。 ァニーリング処理後、 該混合液に各 0. 625 mM d N T P混 合物、 42. 5mM トリシン一水酸ィ匕カリウム緩衝液 (pH8. 5) 、 5. 0 mM 酢酸マグネシウム、 0. 0125%BSA、 1. 0%DMSO、 11Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼを含む 40 μ 1を添加し、 さらに塩化マン ガン （ナカライテスタ社製） を 0. 5mM、 2. 5mM、 5. OmM、 10 mM の濃度になるように加え、 滅菌水で最終容量を 50 1にした。 該反応液は、 6 0°Cで 1時間保持した。 さらに、 対照として塩化マンガンを添加しないもの、 及 び 30Uの E. c o 1 i RNa s eHを添カϋし、 塩ィ匕マンガンを添加しないも のも調製した。 反応終了後、 反応液 3 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に 供した。 その結果を図 7に示す。
図 7は、 B c aBEST DNAポリメラーゼの RN a s e H活性を利用した 場合の I CAN法の結果を示す電気泳動を示し、 レーン 1は分子量マーカー （ 1 00b pラダー） 、 レーン 2は塩ィヒマンガン無添加/ E. c o 1 i RNa s e H添加の場合、 レーン 3は塩化マンガン無添加 ZE. c o l i RNa s eH無 添加の場合、 レーン 4は 0. 5mM塩化マンガン添加 ZE. c o l i RNa s eH無添カ卩の場合、 レーン 5は 2. 5mM塩ィ匕マンガン添加 ZE. c o l i R Na s e H無添加の場合、 レーン 6は 5. 0 mM塩化マンガン添加/ E . c o 1 i RNa s eH無添加の場合、 レーン 7は 10. 0 mM塩化マンガン添加/ E. c o l i RNa s e H無添加の場合を示す。
図 7に示したように E. c o l i RNa s e H非存在下において、 塩化マン ガンを 2. 5 mMになるように添加した反応系で、 目的の増幅産物が確認された。 実施例 8
本発明の方法について、 実際の生体試料で検討した。
( 1 ) ATC C登録番号 43895の腸管出血性大腸菌 O— 157を培養後、 熱 水抽出した物を铸型として検出を行った。 腸管出血性大腸菌 0_ 157をノボビ オシン加 m EC培地にて 42 °C、 18時間培養後、 95°C、 10分間熱処理を行 つた。 これを滅菌水にて 0、 1、 10、 102、 10 104、 105セルに相当 する 0—157熱水抽出物を調製した。 この O— 157熱水抽出物を用い、 実施 例 5 (1) と同様の条件で、 ベロ毒素 2型 （VT2) 遺伝子の増幅を行った。 ま た、 対照として、 同じ鍀型を用いて実施例 5 (1) 記載の条件で PCR増幅も行 つた。 反応終了後、 I CAN法では反応液 1 ^ 1、 PCR法では、 反応液 5 1 を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を表 4及び図 8に示す。 表 4
増幅サイズ （b p) 検出限界 （セル）
I CAN法：所要時間、 70分
135 1 02
173 1 03
P C R法 （ 25サイクル：所要時間、 約 66分）
135 1 03
P C R法 (30サイクル:所要時間、 約 80分）
135 1 02 図 8は、 I C A N法及び P C R法を用レ、た大月昜菌 O 157の検出を示す電気泳 動の結果を示し、 増幅鎖長は 135 b pである。 レーン 1は分子量マーカー （1 O Ob pラダー） 、 レーン 2は I CAN法で細胞 1 O4個、 レーン 3は I CAN 法で細胞 103個、 レーン 4は I C AN法で細胞 102個、 レーン 5は 25サイク ルの PCRで細胞 104個、 レーン 6は 25サイクルの PCR法で細胞 103個、 レーン 7は 25サイクルの PCRで細胞 102個、 レーン 8は 30サイクルの P CRで細胞 104個、 レーン 9は 30サイクルの PCR法で細胞 103個、 レーン 10は 30サイクルの PC Rで細胞 102個の場合である。
表 4及び図 8に示したように、 本発明の検出方法は、 PCR法と同等の検出感 度を有し、 さらに P CR法よりも短時間で検出できることを確認した。
( 2 ) 実施例 2及び 4で用いた配列表の配列番号 40及び 56のプライマーを用 いて、 LDNAを検出した。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 前記各 1 20 pmo 1のプライマー、 2 1の500111]^ 塩ィ匕カリウム及ぴ 8 μΜ ス ペルミジンを含むァニーリング溶液、 10 f g〜： L n gの; IDNA (宝酒造社 製） 及び滅菌水を含む全液量 10 1の混合液を調製し、 98°Cで 2分間、 熱変 性させた後、 氷中で急冷することによりプライマーを铸型にアニーリングさせた。 ァニーリング処理後、 該混合液に各 0. 625 mM dNTP混合物、 42. 5mM トリシン一水酸化力リゥム緩衝液 (pH8. 5 ) 、 5. 0 mM 酢酸マ グネシゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 3011の£. c o l i RNa s eH及ぴ 11Uの B c a BEST DNAポリメラーゼを含む 40 μ 1を添加し、 滅菌水で最終容量を 50 IX 1にした。 該反応液は、 60でで1時 間保持した。 反応終了後、 反応液 3 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供 した。 その結果を表 5に示す。 表 5
増幅サイズ （b p) 検出限界
125 1 g 表 5に示したように、 ； LDNAの検出において本発明の方法は有効であること を確認した。
(3) フラポバタテリゥム細菌 （Flavobacterium sp. SA- 0082) のゲノム DNA を鍚型とし、 実施例 6 ( 1 ) で用レ、た配列表の配列番号 61及ぴ 62記載のプラ イマ一を用いて検出を行った。 鎳型として、 国際公開第 97/32010号パン フレツト記載の方法で培養したフラボパクテリゥム細菌からゲノム DNAを常法 により調製した。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 前記各 120 pmo 1のプライマー、 2 1の500111]\1 塩化カリウム及ぴ 8 iM スペルミジン を含むァユーリング溶液、 10 f g〜； L n gのゲノム DNA及び滅菌水で全液量 10/ 1の混合液を調製し、 98 °Cで 2分間、 熱変性させた後、 氷中で急冷する ことによりプライマーを铸型にァニーリングさせた。
ァニーリング処理後、 上記混合液に各 0. 625 mM dNTP混合物、 42. 5 mM トリシン一水酸化力リゥム緩衝液 （ p H 8. 5) 、 5. 0 mM 酢酸マ グネシゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 3011の£. c o l i RN a s eH及び 1 1Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼを含む 40 μ 1を添加し、 滅菌水で最終容量を 5 1にした。 該反応液は、 52でで1時 間保持した。 反応終了後、 反応液 3/i 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供 した。 その結果を表 6及び図 9に示す。 表 6
増幅サイズ （b p) 検出限界
— 100 f g 図 9は、 フラボバタテリゥム属細菌の検出を示す電気泳動の結果を示し、 レー ン 1は分子量マーカー （100 b pラダー） 、 レーン 2は鐃型 I n g、 レーン 3 は鎊型 10 p g、 レーン 4は鎳型 l p gゝ レーン 5は鎵型 100 f g、 レーン 6 は鎳型 10 f gの場合である。
表 6及ぴ図 9に示したように細菌の検出において、 本発明の方法は有効である ことを確認した。
実施例 9
本発明の増幅方法とハイブリダイゼーション法との組み合わせによる標的核酸 の検出方法を検討した。 ターゲットとして、 腸管出血性大腸菌 O— 157を選択 した。 铸型 DNAは、 実施例 8 (1) 記載の方法で調製した。 増幅断片長は、 G C含量約 40 %で約 100 b pの領域を選び， プライマーとして配列表の配列番 号 51及ぴ 72記載の塩基配列で示される VT 2— I F 20及ぴ VT 2 _ I R 2 0— 2プライマーを使用した。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 各 50 pmo 1の VT2— I ?20及ぴ¥丁2— 1 R 20— 2プライマー、 最終濃度 0· 01 %プロピレンジアミンを含むァニーリング溶液、 0〜104セル相当の各細 胞数熱抽出液及び滅菌水で全液量 10 μ 1の混合液を調製した。 該混合液をサー マルサイクラ一パーソナル （宝酒造製） にて 98°C 2分間、 熱変性後、 55°C まで冷却し、 1分間保持後、 さらに氷上に置き、 アニーリング処理を行った。 ァ-—リング処理後、 上記混合液に最終濃度 20 mM へぺス一水酸化力リゥ ム緩衝液 (pH7. 8) 、 l OOmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 0 1%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500 μ M dNTP混合物、 30 Uの E. c o l i RNa s eH及び 5. 5Uの B c aBEST DNA ポリ メラーゼを添カ卩し、 滅菌水で最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液は、 あらかじ め 55 °Cに設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、 60分間保持し た。 対照として 0— 157 Ty p i n g S e t (宝酒造製） を用い、 マ-ュ アル通りにサーマルサイクラ一パーソナルにて PC Rを行った。 PCR条件は、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 1分を 1サイクルとする 35サイクルで 行った。 該反応での所要時間は、 1サイクルが約 4分で、 全所要時間は、 約 14 5分になる。 この際、 予想される増幅産物は、 404 b pである。 反応終了後、 各反応液 3 1を 3%ヌシーブ 3： 1ァガロース電気泳動に供した。 その結果を 図 28 Aに示す。 図 28 Aは、 I CAN法と P C R法での腸管出血性大腸菌〇 1 57ベロ毒素 I I型遺伝子検出の電気泳動結果であり、 レーン M 1は分子量マー カー （50— 2000 b p) 、 レーン M 2は分子量マーカー （l OOb pラダ 一） 、 レーン Nはネガティブコントローノレ、 レーン 1は 1セノレ相当、 レーン 2は 10セノレ相当、 レーン 3は 102セル相当、 レーン 4は 103セノレ相当、 レーン 5 は 104セル相当の铸型の場合である。 さらに、 1， 10セルにおける I CAN 法と P C R法の増幅量の比較結果を表 7に示す。 表 7
大腸菌 O— 1 5 7細胞数
0 1 1 0 .
I CAN法 一 +
P CR法 一 + + + 一：増幅しない +〜+ + +：増幅の程度を 3段階で示す。 図 28 A及ぴ表 7に示したように、 本発明の検出方法も P C R法も予想される 増幅産物を 1細胞相当量の熱水抽出液を用いた反応系まで得ることができた。 さ らに、 I CAN法で得られた増幅産物については、 配列表の配列番号 7 3記載の 塩基配列で示される 5 '末端にビォチン標識された V T 2 オリゴヌクレオチド プローブを用いてドットハイブリダィゼーションを行った。 ハイブリダイズは以 下の条件で行った。 すなわち、 9 8°C、 5分間変性後、 氷上にて急冷させた反応 液 1 μ 1を Hy b o n d— Ντ Μ (アマシャム フアルマシア バイオテク社製) にスポットし、 U V照射後、 ハイブリバックに入れ、 0. 5Μ リン酸水素ニナ トリウム （ρΗ7. 2) 、 I mM エチレンジァミン四酢酸、 7%ラウリル硫酸 ナトリゥムのハイブリ溶液 1 Om lを添加し、 4 2 °Cでプレハイプリダイゼーシ ヨンを 30分間行なった。 次に 1 0 μ 1の上記 VT 2 プローブ l O O n g/ ix 1溶液を熱変性後、 プレハイブリダイゼーション反応系に添加した。 4 2 °C、 6 0分間ハイプリダイゼーシヨン後、 6 6. 6mM 塩化ナトリウム、 6 6. 6 mM クェン酸三ナトリウム水和物、 0. 1 %ラウリル硫酸ナトリウムの溶液で 室温にて 5分間 2回洗浄し、 洗浄バッファー （0. 3 M塩化ナトリウム、 1 7. 3mM リン酸二水素ナトリウム二水和物， 2. 5mM EDTA溶液、 0. 1 %ラウリノレ硫酸ナトリウム) 6m lに 5mg /m.1の Horseradish peroxidase streptoavidin conjugate (P I ERCE製） を 2 μ 1添加し、 4 2。C、 1 2分 間インキュベート後、 洗浄バッファーで、 室温で 2回洗浄した。 その後、 0. 1 M クェン酸バッファー （pH5. 0) 1 0m l室温で洗浄し、 0. 1M クェ ン酸バッファー 5m l、 3%過酸化水素 5 μ 1、 2mgZm 1テトラメチルベン ジジンエタノール溶液 （TMB、 ナカライネ土製） 2 5 0 μ 1の混合溶液で暗室に て約 1 0分間反応させた。 発色後、 脱イオン水にて反応停止させた。 その結果を 図 2 8 Βに示す。 図 2 8 Βは、 I CAN法での腸管出血性大腸菌 Ο— 1 5 7ベロ 毒素 I I型遺伝子検出のドットハイブリ結果であり、 上記電気泳動結果と同一で あった。 すなわち、 本発明の方法の検出感度も PCRの検出感度も同等であるこ とから、 増幅反応の全所要時間を比較すると P CRに対し本発明の I CAN法は、 1/2以下の時間で行えることができ、 病原菌等の検出方法として有効であるこ とを確認した。
実施例 10
(1) 培養細胞由来 RNAを铸型として、 逆転写反応と本発明の方法の組み合わ せを検討した。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 10%ゥシ胎児血清 (ギブコ社製） 含有、 ダルベッコ改良イーグル培地 （バイオウイタカ一社製、 1 2- 604 F) に RAW264. 7細胞 （ATCC T I B 71) を 1. 5
X 105/m 1になるように懸濁し、 6穴マイクロタイタープレートのゥエルに 5 m 1ずつ加えて 5 %炭酸ガス存在下、 37 °Cでー晚培養した。 各ゥェルに 50 μ 1の 100 μ g/m 1のリポポリサッカライド （L P S、 シグマ社製） 水溶液 および 50 a 1の 100 1 インターフェロン一 γ水溶液 ( I FN— γ、 ジェンザィムテクネ社製） を添加して 4時間培養後、 R N e a s y Mi n i
K i t (キアゲン社製） を用いてキットの説明書に従い RNAを調製した。 なお、 陰性対照として L P Sおよび I F N— γを添カ卩しない区分を設定した。
上記により調製した RNA 3 gと 10mM トリスー塩酸緩衝液 （ p H 8. 3) 、 5 OmM KC 1、 5mM MgC lい 1 mM dNTP混合物、 15 0 pmo 1のランダム 6me r s プライマー、 60 Uのリボヌクレアーゼ ィ ンヒビター （宝酒造社製） 、 15 Uの R e v e r s e Tr a n s c r i p t a s e XL (AMV) (宝酒造社製、 262 OA) を含む全液量 60 μ 1をサー マノレサイクラ一 （G e n e Amp PCR Sy s t em 9600、 アプライ ドバイォシステムズ社製） を用いて、 30 °Cで 10分間、 続いて 42 °Cで 1時間 保温した後、 酵素を失活させるために 99°Cで 5分間加熱して cDNAを調製し た。
マウス誘導型 NO合成酵素 （i NOS) の mRNAの塩基配列 （GeneBank accession No. NM— 010927) に従って、 配列表の配列番号 74及び 7 5記載の塩基配列を有するプライマーを合成した。 また、 対照として PC Rのた めに配列表の配列番号 76及び 77記載のプライマーも合成した。
各 50 pmo 1の上記プライマーと 2μ 1の 0. 05%プロピレンジァミン水 溶液、 铸型として上記 c DNA 1 μ 1 (RNAとして 50 n g相当） 及び滅菌 水で全液量 10 μ 1の混合液を調製した。 該混合液は、 サーマルサイクラ一で 9 8 °Cで 2分間、 熱変性後、 55 °Cに冷却し、 1分間保持して铸型にプライマーを アニーリングさせた。
ァニーリング処理後、 上記混合液に 0. 625 mM dNTP混合物、 42. 5mM トリシン一水酸化カリウム緩衝液 （pH8. 5) 、 5. OmM 酢酸マ グネシゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 1511の£. c o l i RNa s eH、 1111の8。 & 8£3丁 DNAポリメラーゼを含む全液量
40 1を加え、 滅菌水で最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液は、 サーマルサ ィクラーで 55 °C、 1時間保持した。 反応後のサンプルは分析するまで一 20°C で凍結して保存した。 対照の P C Rは以下のように行つた。 すなわち、 各 50 p mo 1のプライマーと c DNA 1 μ 1 (RNAとして 50 n g相当） を含む 1 0 XEx T a qバッファー （宝酒造社製） 5 μ 1、 1. 25U タカラ
Exタック DN Aポリメラーゼ （宝酒造社製） 、 0. 2mM dNTP混合物 を含む全液量 50 μ 1の反応液をサーマルサイクラ一を用い、 94°C 2分間を 1サイクル、 次に 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイク ノレとする 30サイクル、 さらに 72°C 5分間の 1サイクルのプログラムで反応 を行った。 反応後のサンプルは分析するまで一 20 °Cで凍結して保存した。 反応 終了後、 各反応液 5 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果 を図 10に示す。
図 10は、 RT— I CAN法 （Α) 及び RT— PCR法 （Β) の比較を示した 電気泳動の結果を示し、 レーン 1は分子量マーカー （100 b pラダー） 、 レー ン 2は陰性対照区分、 レーン 3は LPS、 I FN— γ処理区分である。
図 10に示したように、 本発明の方法および PC Rのいずれの反応においても、 LPSおよび I FN— γで処理した細胞より調製した c D Ν Αを铸型にした場合 のみ増幅産物が確認された。 従って、 PCR法より反応所要時間が短い本発明の 方法が、 逆転写反応後の DNA増幅方法として有効であることを確認した。 実施例 11
E. c o 1 i RNa s e Hの至適温度は、 37°Cであることから、 本 明の 増幅反応中に失活していくことが考えられた。 そこで、 増幅反応の途中で E. c o 1 i RNa s eHをさらに添加することによる増幅反応への影響を検討した c 铸型 DNAは、 カリフラワーモザイクウィルス 35 Sプロモーター及ぴ EP S P S遺伝子の挿入された組み換えダイズより抽出したゲノム DNAから配列表の 配列番号 78及び 79記載の GMO— PCR— F及び GMO—PCR— Rプライ マーを用いた PCRにより得られた増幅断片 (1071 b p) を使用した。 また、 配列表の配列番号 80〜83記載の塩基配列を有するプライマー、 GMO— S 1、 S2、 Al、 A 2を使用した。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 各 50 pmo 1の上記プライマー、 最終濃度 0. 01%プロピレンジァミン、 l p g〜 10 n gの铸型 DNA及び滅菌水で全液量 10 μ 1の混合液を調製した。 該混合 液は、 98°C、 2分間熱変性し、 55 °Cまで冷却し、 アニーリング処理を行った。 ァユーリング処理後、 上記混合溶液に最終濃度各 500μΜ dNTP混合物、 34mM トリシン一水酸ィ匕カリウム緩衝液 (pH8. 7) 、 4. OmM 酢酸 マグネシウム、 0. 01%BSA、 l%DMSO、 30Uの E. c o l i RN a s eH、 5. 5Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼを添カ卩し、 滅菌水で 最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液は、 サーマルサイクラ一で 55°Cで 25分 間保持した。 反応開始から 25分後に、 さらに 3011の£. c o l i RNa s eHを添カ卩し、 55 °Cで 30分間保持した。 対照として、 55 °Cで 55分間保持 したものも調製した。 反応終了後、 反応液 3 μ 1を 3%ァガロース電気泳動に供 した。 その結果、 いずれの铸型 DN A濃度でも、 いずれのプライマーの組み合わ せ、 S 1/A1、 S 1/A2、 S 2/Al、 S 2ZA2においても E. c o l i RNa s eHを反応途中で力 Πえることにより増幅効率が改善されることを確認し た。
実施例 12
本発明で使用する铸型となる核酸を増幅あるいは複製する方法と、 本発明の方 法の組み合わせについて検討した。 反応は以下のように行った。 すなわち、 実施 例 5 (3) で調製した菊ウイロイド遺伝子を含み、 大腸菌で複製したプラスミド を铸型とし、 T7 RNAポリメラーゼ （宝酒造社製） を用いてインビトロトラ ンスクリプション （i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n) を行い、 R N A複製断片を得た。 配列表の配列番号 57及ぴ 58記載の塩基配列を有するプ ライマー及ぴ cDNA シンセシスキット （宝酒造社製） を用いて cDNAを合 成した。 該 c D N A断片及び上記複製ブラスミドを鏡型として実施例 5 ( 3 ) 記 載の方法で増幅反応を行った。 その結果、 铸型となる核酸をプラスミドの形で複 製した場合及び R NAポリメラーゼで RNAを複製し、 c D N Aにした場合のレヽ ずれにおいても本発明の方法で使用できることを確認した。
実施例 13
(1) プライマーの合成
マウス誘導型 NO合成酵素 （i NOS) の mRNAの塩基配列に従って、 配列 表の配列番号 86〜87記載のオリゴヌクレオチドプライマー NS 1、 NS 2を それぞれ合成した。
(2) PCR産物を铸型にした I CAN法による DN A断片の増幅
前記各 50 pmo 1の合成オリゴヌクレオチドプライマーと 2 w 1の 0. 0
5 %プロピレンジァミン水溶液、 10 f g〜10 p gの鎳型を含む全液量 10 μ 1をサ一マノレサイクラ一 （Ge n e Amp PCR Sy s t em9600、 アプライドバイオシステムズ社製） を用いて、 98°Cで 2分間、 続いて 60°Cで 2分間の加熱処理を行い鎳型にプライマーをアニーリングさせた。 なお、 この際 の鎵型は、 i NOS cDNAを配列表の配列番号 132及び 133記載のプラ イマ一 NS— PCR1とプライマー NS— PCR2により増幅し （741 b p) 、 Sup r e c 02 (宝酒造社製） で精製したものを用いた。 上記熱処理をした各 溶液に 0. 625 mM dNTP混合液、 40 mM へぺス—水酸化力リゥム緩 衝溶液 (pH7. 8) 、 125mM 酢酸カリウム、 5. OmM 酢酸マグネシ ゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 0. 0156 の？ £ 11 由来 RNa s eH、 0. 66Uの B e a BE ST D NAポリメラーゼを含む全 液量 40 1の反応液を添加し、 サーマルサイクラ一で 60 °C、 1時間保温した。 この反応液 5 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動により分析した。 その結果 を図 1 1に示す。 図 1 1は、 P f u RNa s e Hを用いた I CAN法の結果を 示すものであり、 レーン 1は分子量マーカー （100 b p) 、 レーン 2は铸型 1 O f g、 レーン 3は铸型 100 f g、 レーン 4は铸型 l p g、 レーン 5は铸型 1 0 p gの場合である。
図 1 1に示したように、 100 f gの鍚型量まで目的の増幅産物が確認できた。 実施例 14
(1) RNAの調製
10%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有、 ダルベッコ改良イーグル培地 （バイ ォウイタカ一社製） に RAW264. 7細胞 （ATCC T I B 71) を 1. 5X 105/m 1になるように懸濁し、 6穴マイクロタイタープレートのゥエル に 5 m 1ずつ加えて 5 %炭酸ガス存在下、 37 °Cで一 B免培養した。 各ゥエルに 5
0 μ 1の 100 t g/m 1リポポリサッカライ ド （L P S、 シグマ社製） 水溶液 および 50 IX 1の 100 OU/m 1 インターフェロン一 γ水溶液 （I FN—y、 ジ工ンザィムテクネ社製） を添加して 4時間培養後、 RNe a s y Mi n i
K i t (キアゲン社製、 74104) を用いてキットの説明書に従い RNAを調 製した。 なお、 陰性対照として L P Sおよび I F N— γを添加しない区分を設定 した。
上記により調製した RNA 3 ^ gと 10mM トリス一塩酸緩衝液 （ p H 8. 3) 、 5 OmM KC 1、 5mM MgC lい 1 mM dNTP混合液、 15 O pmo lの Ra n d om 6me r s、 60Uの R i b o nu c l e a s e I nh i b i t o r (宝酒造ネ環） 、 15Uの Re v e r s e Tr a n s c r
1 p t a s e XL (AMV) (宝酒造社製） を含む全液量 60 μ 1をサーマル サイクラ一 （G e n e Amp PCR Sy s t em9600、 アプライドバ ィォシステムズ社製） を用いて、 30 °Cで 10分間、 続いて 42 °Cで 1時間保温 した後、 酵素を失活させるために 99°Cで 5分間加熱して cDNAを調製した。 マウス誘導型 NO合成酵素 （i NOS) の mRNAの塩基配列に従って、 配列 表の配列番号 92〜 93に記載の塩基配列を有するプライマー N S 5、 N S 6を それぞれ合成した。 また、 PCR反応のために配列表の配列番号 88〜89記載 のプライマー NS 3、 NS 4を合成した。
各 50 p mo 1の上記プライマー NS 5、 NS 6、 铸型として上記により合成 した cDNA溶液 1 1 (RNAとして 50 n g分） あるいは水により 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍希釈したもの 1 μ 1、 および 0. 5mM dNTP混合液、 32mM へぺス一水酸化力リゥム緩衝溶液 (pH7. 8 ) 、 10 OmM 酢酸カリウム、 4. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 01%BSA、 10/0DMSO、 0. 0156 の P f u RNa s eH、 0. 66Uの B c a
BEST DNAポリメラーゼを含む全液量 50 1をサーマルサイクラ一で 6 0 °C、 1時間保温した。 反応後のサンプルは分析するまで一 20 °Cで凍結して保 存した。
一方、 対照として PCR法を行った。 各 50 pmo 1のプライマー NS 3、 N S4と cDNA溶液 Ι μ ΐ (RNAとして 50 n g分） あるいは水により 10倍、
100倍、 1000倍、 10000倍希釈したもの 1 μ 1と 10 XE X タツ クバッファー （宝酒造社製） 5 1、 1. 25U タカラ Exタック ポリ メラーゼ (宝酒造社製） 、 0. 2mM dNTP混合液を含む全液量 50 μ 1の 反応系でサーマルサイクラ一を用い、 94°C 2分間を 1サイクル、 94°C 3 0秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒のサイクルを 35サイクル、 72°C 5 分間を 1サイクルのプログラムで反応を行った。 反応後のサンプルは分析するま で一 20 °Cで凍結して保存した。
上記 I CAN反応液および P C R反応液 5 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気 泳動により分析した。 その結果を図 12に示す。 すなわち、 図 12は P f u R Na s e Hを用いた I CAN法及び P C 法での i NO S遺伝子検出結果であり、 レーン 1は l O Obp DNAラダーマーカー、 レーン 2は陰性対照 cDN Aの 10000倍希釈サンプル、 レーン 3は陰性対照 c DNAの 1000倍希釈サン プル、 レーン 4は陰性対照 cDNAの 100倍希釈サンプル、 レーン 5は陰性対 照 cDNAの 10倍希釈サンプル、 レーン 6は陰性対照 c D N Aの原液サンプル、 レーン 7は LP Sと I FN— γ区分 c DNAの 1000◦倍希釈サンプル、 レー ン 8は LPSと I FN— γ区分 cDNAの 1000倍希釈サンプル、 レーン 9は LP Sと I FN— Y区分 cDNAの 100倍希釈サンプル、 レーン 10は LP S と I FN— γ区分 cDNAの 10倍希釈サンプル、 レーン 11は LPSと I FN 一 0 /区分 c D N Aの原液サンプ の場合である。 図 1 2に示したように、 I CANおよび PCRのいずれの反応においても、 L P Sおよび I FN— γで処理した細胞より調製した cDNAを铸型にした場合の み増幅産物が確認された。 I CAN反応においては 1000倍希釈した c DNA まで増幅産物の増加が確認された。 P C R反応においては 100倍希釈した c D NAまで増幅産物の増加が確認された。
実施例 1 5
( 1 ) ΧΌΝΑの塩基配列に従って、 配列表の配列番号 90〜 9 1記載のォリゴ ヌクレオチドプライマー 4とオリゴヌクレオチドプライマ一 5を合成した。 オリ ゴヌクレオチドプライマー 4は GC含量 75%のセンス方向のプライマーであり、 オリゴヌクレオチドプライマー 5は GC含量 80%のアンチセンス方向のプライ マーである。
各 1 20 pmo 1の上記プライマー 4と 5に 2 /i lの 0. 05%プロピレンジ ァミン溶液と、 10 n gの铸型を含む全液量 10 ;ζ 1の反応系で 98 で 2分間、 熱変性させた後、 氷中で急冷することによりプライマーを铸型にァエールさせた。 なお、 この際の錶型は、 実施例 2記載の PC R反応物 （1 005 b p) を S u p r e c 02で精製したものを用いた。
( 2 ) ァニール後に各 0. 625 mMの d N T P混合液、 42. 5 mM ビシン 一水酸化カリウム緩衝液 (pH8. 3) 、 5. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 0 1 25%B SA、 1. 25%DMSO、 0. 5 μ 1の Th e rmo t o g a ma r i t i m a RNa s eH I I (0. 58 g /m 1 ) 及び B c a B E S
T DNAポリメラーゼを 2. 2U含む 40 1を添カ卩し、 I CAN反応を 6 0°C、 6 5°C、 70°Cで 1時間行なった。 この I CAN反応後の反応液 3 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動で確認した。 その結果を図 1 3に示す。 図 1 3 は、 Th e rmo t o g a ma r i t i ma RNa s eH I I 用いた I C AN法の結果を示すものであり、 レーン 1は分子量マーカー （1 00 b p) 、 レ 一、ノ 2は反応温度 60 °C、 レーン 3は反応温度 65 °C、 レーン 4は反応温度 7 0°Cの場合である。
図 1 3に示した様に、 いずれの反応温度においても目的の増幅産物が確認でき た。 実施例 1 6
(1) PCR産物を錄型にした I CAN法による DNA断片の増幅 （アルカリ変 性） について検討した。 1 0 f g〜： L 0 p gの铸型 1 1と 0. 4N N a OH 1 /z lを混合し、 3 7 °Cで 5分間保温し铸型の変性を行った。 なお、 この際の铸 型は、 i NOS c DNAを実施例 1 3記載の PCR増幅断片 （74 1 b p) を S u p r e c 0 2 (宝酒造社製） で精製したものを用いた。 上記変性した各铸型 を 0. 4N HC 1 1 1により中和し、 続いてこれに前記各 50 pmo 1の NS 1及ぴ NS 2プライマーと、 0. 5mMの dNTP混合液、 3 2mM へぺ ス一水酸化カリウム緩衝溶液 (pH7. 8) 、 l O OmM 酢酸カリウム、 4. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 0 1 %B SA、 1. 0%DMSO、 0. 0 1 5
6 ^u gの P f u RN a s e H、 0. 6 6Uの B c a BE ST DNAポリメラ ーゼを含む全液量 4 7 μ 1の反応液を添カ卩し、 サーマルサイクラ一で 60°C、 1 時間保温した。 この反応液 5 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動により分析 した。 その結果を図 1 4に示す。 図 1 4は、 アル力リ変性した铸型を用いた I C AN法の結果を示すものであり、 レーン 1は分子量マーカー （l O O b p) 、 レ ーン 2は铸型 1 0 f g、 レーン 3は錶型 1 00 f g、 レーン 4は鏺型 l p g、 レ ーン 5は錶型 1 0 p gの場合である。
図 1 4に示した様に、 1 p gの鍚型量まで明らかな増幅産物の増加が確認でき た。
実施例 1 7
(1) 铸型の変性を伴わない I CAN法による DNA断片の増幅について検討し た。 プライマーは、 配列表の配列番号 9 2〜 9 3に示す NS 5及び NS 6プライ マーを使用した。 铸型 D N Aは、 実施例 1 3で調製したものを使用した。
铸型 1 0 f g〜： L 00 p gあるいは陰性対照の水、 各 50 pmo 1の NS 5お よび NS 6プライマー、 0. 5mM dNTP混合液、 3 2mM へぺス一水酸 化カリウム緩衝溶液 (pH7. 8) 、 1 0 OmM 酢酸カリウム、 4. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 0 1 %B SA、 1. 0%DMSO、 0. 0 1 5 6 /i gの P f u RN a s e H、 1 Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼ （宝酒造社 製） を含む全液量 5 0 1の反応液をサーマルサイクラ一で 6 0°C、 1時間保温 した。 反応終了後、 この反応液 5 μ ΐを 3. 0%ァガロースゲル電気泳動により 分析した。 その電気泳動の結果を図 15に示す。 図 15は、 鏺型 DN Α変性工程 のない場合の本発明の増幅方法についての電気泳動の結果を示し、 レーン 1は 1 00 b p DNAラダーマーカー、 レーン 2は陰性対照 （水） の場合、 レーン 3 は鎳型 10 f gの場合、 レーン 4は錶型 100 f gの場合、 レーン 5は铸型 1 p gの場合、 レーン 6は鍀型 10 p gの場合、 レーン 7は铸型 100 p gの場合で ある。
図 15に示したように、 1 p gの鐯型量まで、 目的の増幅産物が確認できた。 実施例 18
(1) ベクタ プラスミド pDON— A I DNA (宝酒造社製） のパッケージ ング領域の塩基配列に従って、 配列表の配列番号 94及ぴ 95記載の p DON— AI— 1、 p DON— A I _ 2プライマーをそれぞれ合成した。
(2) 鎵型の変性を伴わない I CAN法による DNA断片の増幅
10 f g〜： L n gの pDON— AI DNA 1 μ 1あるいは陰性対照の水 1 ;ζ 1、 前記各 50 pmo 1のプライマー、 0. 5 mM dNTP混合液、 32m
M へぺス一水酸化力リゥム緩衝溶液 (pH7. 8) 、 100 mM 酢酸力リゥ ム、 4. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 01%BSA、 1. 0%DMSO、 参 考例 4で調製した 0. 0156 §の？ £ 11 RNa s eH、 1Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼを含む全液量 50 μ 1の反応液をサーマルサイクラ一 で 60 °C、 1時間保温した。 この反応液 5 μ 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳 動により分析した。 その結果を図 16に示す。 図 16は、 環状 2本鎖 DNAを変 性処理なしで錶型とした場合の本発明の方法についての電気泳動の結果を示し、 レーン 1は 100 b p DNAラダーマーカー、 レーン 2は陰性対照 （水） 、 レ ーン 3は鎳型 10 f g、 レーン 4は錶型 100 f g、 レーン 5は鎵型 l p g、 レ ーン 6は铸型 10 p g、 レーン 7は鐯型 100 p g、 レーン 8は鎳型 I n gの場 合である。
図 16に示すように、 10 f gの鎳型量まで目的とする増幅断片が得られるこ とを確認した。
実施例 19 本発明の方法を利用したヒトパピローマウィルス 1 6型遺伝子の検出について 検討した。 铸型として、 ヒトパピローマウィルス 1 6型の感染している細胞であ る C a S k i c e l l (大日本製薬社製、 c e 1 1あたり 500コピーのヒ ト パピローマウィルス 1 6型を保有している） の DNAを用いた。 HP V I 6検出 用プライマーとして、 配列表の配列番号 96〜 97記載の塩基配列を有する H P V 16 S 3プライマー及び HPV 1 6 A 2プライマーを使用した。 該プライ マー対で得られる増幅産物は、 約 1 20 b pである。 反応は、 以下のように行つ た。
上記錶型 DNAを l p g、 3 p g、 30 p g、 1 00 p g、 300 p g、 I n g、 3 n gあるレ、は 10 n g、 各 50 pmo 1の HPV1 6 S 3プライマー及 び HPV1 6 A 2プライマー、 最終濃度 0. 0 1%プロピレンジァミンを含む 混合液 10 Iを調製した。 この混合液をサーマルサイクラーパーソナルにて 9 8°C 2分間、 55°C 1分間保温後、 氷上に置いた。 該混合液に、 最終濃度 2 OmM へぺス一水酸化カリウムバッファー （pH7. 8) 、 l O OmM 酢酸 カリウム、 l%DMSO、 0. 0 1%B SA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 5
00 Μ dNTP混合液、 3 OU大腸菌由来 RNa s eH、 5. 5 Uの B e a BEST DNAポリメラーゼを添加し最終容量を 50 μ 1とした。 この反応液 を、 あらかじめ 5 5°Cに設定したサーマルサイクラ一にセットし、 60分間反応 させに。 対照として、 Huma n P a p i l l oma v i r u s P r i me r s HPVp l 6 (f o r wa r d, r e v e r s e) (宝酒造社製） を用い、 マニュアルに記載の方法に従い、 サーマルサイクラ一パーソナルにて PC Rを行 つた。 この際、 予想される増幅産物は、 140 b pである。
反応終了後、 各反応液 3 1を 4%ヌシープ 3 ： 1ァガロース電気泳動に供し た。 その結果を図 1 7 Aに示す。 すなわち、 図 1 7 は1 CAN法とPCR法を 利用した H PV1 6遺伝子の検出結果であり、 レーン M 1は分子量マーカー （ 1 00 b pラダー） 、 レーン M2は分子量マーカー （50— 2000 b p) 、 レー ン 1は錶型無し、 レ ン 2は铸型 l p g、 レーン 3は錶型 3 p g、 レーン 4は鎳 型 30 p g、 レーン 5は鍚型 100 p g、 レーン 6は铸型 300 p g、 レーン 7 は铸型 I n g, レーン 8は鍚型 3 n g、 レーン 8は铸型 3 n g、 レーン 9は鍚型 1 0 n gの場合である。
図 1 7Aに示したように、 I CAN反応では鍚型 DNA 3 p gを用いた反応 まで、 P C R反応では铸型 DNA 1 p gの場合まで予想される増幅産物が得られ ることが確認できた。
さらに、 これらの反応産物について、 配列表の配列番号 9 8に記載の塩基配列 で示されるオリゴヌクレオチド HP V 1 6プローブを用いてドットハイプリダイ ゼーションを行つた。 ハイプリダイゼーションは、 実施例 9記載の条件で行つた。 その結果を図 1 7 Bに示す。 すなわち、 図 1 7 Bは PC R法と I CAN法での H PV 1 6遺伝子のドットハイブリ検出の結果であり、 レーン 1は鎵型無し、 レー ン 2は铸型 l p g、 レーン 3は鎳型 3 p g、 レーン 4は鍀型 3 O p g、 レーン 5 は铸型 1 0 O p g、 レーン 6は铸型 3 00 p g、 レーン 7は錄型 I n g, レーン 8は铸型 3 n g、 レーン 8は铸型 3 n g、 レーン 9は铸型 1 0 n gの場合である。 図 1 7 Bに示したように I CAN法及ぴ PC R法のいずれにおいても検出感度 はほぼ同等であることから、 ウィルス等の検出方法として有効であることが確認 できた。
実施例 2 0
臨床検体 DN Aサンプルからのヒトパピローマウィルス 1 6型遺伝子検出につ いて検討した。 鎳型として、 インフォームドコンセントの得られた臨床検体 6検 体から常法で調製された DNAを用いた。 この臨床検体から調製されたサンプル は、 P CRにより感染 HP Vのタイプが判明しているものである。 検出用プライ マーは、 実施例 1 9記載の HPV 1 6 S 3プライマー及び HPV 1 6 A2プ ライマーを用いた。 铸型となる臨床検体からの D NAサンプルは T Eバッファー により Ι μ ΐあたり l O O n gとなるように調製して使用した。 鎊型量以外は、 実施例 1 9記載の反応液組成及ぴ反応条件で行つた。 さらに、 ネガティブコント ロールとして鎳型 DN Aを加えないもの、 ポジティブコントロールとして HP V
1 6の感染している細胞である C a S k i c e l l DNA 50 0 p gを用 い、 同様の反応を行った。 反応終了後、 各反応液 3 μ 1を 4%ヌシーブ 3 ： 1ァ ガロース電気泳動に供した。 その結果を図 1 8 Αに示す。 すなわち、 図 1 8 Aは 臨床検体からの HPV 1 6遺伝子検出の結果であり、 レーン Mは分子量マーカー、 レーン 1〜 6は臨床検体、 レーン 7はネガテイブコント口ール、 レーン 8はポジ ティブコントロールの場合である。
図 18 Aに示したように、 従来法の PCR法により HP VI 6型感染と判明し ているサンプルにおいて、 I CAN法でも約 120b pの増幅産物が認められ、 その他の型の H P Vが感染しているサンプルおよび非感染サンプルでは増幅は認 められなかった。
さらに、 これらの増幅産物について、 実施例 9記載のドットハイプリを行った。 その結果を図 18 B及び表 8に示す。 すなわち、 図 18Bは、 臨床検体からの H PV 16遺伝子のドットハイブリ検出結果であり、 レーン 1〜 6は臨床検体、 レ ーン 7はネガテイブコント口ール、 レーン 8はポジテイブコント口ールの場合で ある。
図 18に示したように電気泳動で得られた結果と同じ結果が得られ、 電気泳動 的にもドットハイブリ的に P C R法と同様の結果が得られることを確認した。 す なわち、 本発明の方法により、 実際の臨床検体から HP VI 6型を検出でき、 ゥ ィルス等の検出方法として有効であることを確認した。 表 8
サンプル PCRによるタイビング HPV16検出プライマ
による ICA増幅
No.3 非感染
No.4
No.6 Typel8
No.7 Type 16 +
No.8 ypeo7
No.9 Type 16 +
铸型未添加 氺
ポジティプコントロ一ノレ 氺 +
一：増幅なし、 + 実施例 21
臨床検体からの HCVの検出について検討した。 検体試料は、 インフォームド コンセントの得られた H C V患者の血清 5検体各々 300μ 1からトライゾール ック社製） を使用して該試薬添付の説明書に従い調製し、 最終的 に注射用水 （大塚製薬製） 6 μ 1に溶かし RNAサンプルとした。 陰性コント口 ールとして健常者の血清 300 1から同様に抽出した RN Αをおいた。 先ず、 RNA PGR k i t (AMV) v e r 2. 1 (宝酒造製） を用いて、 逆 転写反応液として 1 XRNA PCR Bu f f e r, 5mM MgC l2、 1 mM dNTP s 、 1 U AMV Re v e r s e Tr a n s c r i p t a s e XL, 配列表の配列番号 99〜 100に記載の H C V— Fプライマー及び H C V— Rプライマーを各 10 pmo 1及び各 RNAサンプル 2 1を含む 4 μ 1 の反応液を調製し、 30°C、 10分間加温後、 50°Cで 30分間反応させた。 逆 転写反応終了後、 I CAN反応を行った。 I CAN反応では、 配列表の配列番号 101〜102記載の塩基配列を有する HCV— F 2プライマー及び HCV— R 1プライマーを使用した。 反応は以下のようにして行った。
上記プライマー各 50 p m o 1、 各逆転写反応液 3 1、 最終濃度 0. 01 % プロピレンジァミンを含む全液量 1 1の混合液を調製した。 また、 ブランク として滅菌水 3 1を用いた。 該混合液をサーマルサイクラ一パーソナルで 9 8°C、 2分間熱処理後、 60°Cまで急冷し 1分間保持後、 氷上に保存した。
ァニーリング処理後、 上記混合 ί夜に最終濃度が 20 mM へぺス一水酸化力リ ゥムバッファー （pH7. 8) 、 10 OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500 /zM dNTP s、 3 OU の大腸菌由来 RN a s e H及び 5. 5Uの B e a BEST DNAポリメラーゼ を添加し滅菌水で最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液をあらかじめ、 60°Cに 設定したサーマルサイクラ一 M Pにセットし 60分間反応させた。 反応終了後、 各反応液 3 w 1を 3%ヌシーブ 3： 1ァガロース電気泳動に供した。 その結果を 図 19 Aに示す。 すなわち、 図 19 Aは、 臨床検体からの HCV検出の結果を示 すものであり、 レーン Bは滅菌水を铸型にした場合、 レーン 1は健常人試料、 レ ーン 2〜 6は H C V患者試料、 レーン Mは分子量マーカー （50〜 2000 b p) である。
図 19Aに示したように、 HCV患者由来の RNAサンプルのみ、 HCVゲノ ムの塩基配列から予想される約 107 b pの増幅産物が得られ、 健常人由来の血 清及びブランクは、 上記増幅産物は得られなかつた。 さらに実施例 9記載の条件 で、 配列表の配列番号 103記載の 5'末端をピオチン化した HCVプローブを 使用して、 I CAN増幅産物についてドットハイプリダイゼーシヨンを行った。 その結果を図 19 Bに示す。 図 19 Bにおいて、 各レーンのサンプルは、 電気泳 動の場合と同じである。
図 19に示したように、 電気泳動結果とドットハイプリ結果とは一致すること が確認できた。 このことから、 本発明の方法により実際の臨床検体から HCVを 検出することができ、 ウィルス等の検出方法として有効であることが確認できた。 実施例 22
アデノウィルスの検出方法について検討した。
ジーンバンク登録番号 （AC C No. J O 1917) 記載のアデノウイルス の塩基配列に従って、 配列表の配列番号 104〜： L 06記載の E 1 A (腫瘍遺伝 子） 増幅用プライマー E 1 A— 1 (センス方向） 、 E 1A— 2 (アンチセンス方 向） 、 E 1A— 3 (アンチセンス方向） を構築した。 アデノウイルスは、 ATC C登録番号 V R-5を使用した。 铸型は、 以下のように調製した。 8. 73 X 1 O10 PFU/m 1のアデノウイルス溶液 100 μ 1を終濃度 0. 1%SDS— 0. 2 mgZm 1プロティナーゼ K溶液で 37°C、 1時間インキュベートし、 その後シリカゲルにより DNAを吸着させ、 精製した。 これを滅菌水にて希釈し、 10 104、 105、 106 PFUに相当するアデノウイルス DNAを調製した ものを使用した。 反応は、 以下のようにして行った。 すなわち、 各 60 pm o 1 の E 1 A— 1プライマー及び E 1 A— 2プライマー （増幅鎖長 1 12 b p) ある いは E 1 A— 1プライマー及び E 1 A— 3プライマー （増幅鎖長 91 b p) の組 み合わせに、 2/ lの 0. 05%プロピレンジァミンと錶型を含む全液量 10〃 1の反応系で 98 °Cで 2分間、 熱変性させた後、 氷中で急冷することによりブラ イマーを錶型にァニールさせた。
アニーリング処理後に各 0. 625mM dNTP混合液、 42. 5mM ト リシン一水酸化力リウム （ p H 8. 5) 緩衝液、 5. OmM 酢酸マグネシゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 30 Uの大腸菌由来 RN a s e H 及び 5. 5Uの B e a BEST DNAポリメラーゼを含む 40 μ 1を添加し、 最終容量を 50 / 1にした。 該反応液を 60でで 1時間保持した。 また対照とし て、 上記と同じ铸型と配列表の配列番号 107〜 108及び 142記載の塩基配 列を有する E l A (月重瘍遺伝子） PCR増幅用プライマー E 1 A— 1 P (センス 方向） 、 E 1A—2P (アンチセンス方向） 、 E 1A—3 P (アンチセンス方 向） を構築した。 プライマーを用いて、 PCRによる検出を行なった。 PCRは 以下のようにして行った。 すなわち、 各 60 pmo 1の E 1 A— 1 Pプライマー 及び E 1 A_2 Pプライマー （増幅鎖長 112 b p) あるいは E l A— I Pプラ イマ一及び E 1 A— 3 Pプライマー （増幅鎖長 91 b p) の組み合わせに、 10 XEx T a qバッファー （宝酒造社製） 5 μ 1、 1. 25Uのタカラ Ex T a q DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） 、 0. 2 mM dNTP sを含む全 量 50 1の PCR溶液を調製した。 PCR条件は 94°C、 30秒、 55°C、 3
0秒、 72。C、 30秒を 1サイクルとした 30サイクルで行なつた。
反応終了後、 I CAN法、 PCR法の両反応液 3 μ 1を 3. 0%ァガロースゲ ル電気泳動に供した。 その結果を図 20及び表 9に示す。 すなわち、 図 20は、 アデノウィルス粒子からのウィルス Ε 1 Α遺伝子の検出結果を示すものであり、 レーン 1〜レーン 10までがプライマー E 1 A— 1及び E 1 A— 2の組み合わせ に関する結果であり、 レーン 11〜20までがプライマー E 1 A— 1及び E 1 A 一 3の組み合わせに関する結果である。 レーン 1は分子量マーカー （ 10 Obpラ ダー） 、 レーン 2は I CAN法で 106 (PFU相当 DNA) 、 レーン 3は I C AN法で 105、 レーン 4は I CAN法で 104、 レーン 5は I C AN法で 103、 レーン 6は分子量マーカー （10 Obpラダー） 、 レーン 7は PC R法で 106
(PFU相当 DNA) 、 レーン 8は PCR法で 105、 レーン 9は PCR法で 1 0 レーン 10は PCR法で 103の場合である。 さらに、 レーン 11は分子量 マーカー （10 Obpラダー） 、 レーン 12は I CAN法で 106 (PFU相当 D NA) 、 レーン 13は I CAN法で 105、 レーン 14は I C AN法で 104、 レ ーン 15は I CAN法で 103、 レーン 16は分子量マーカー （10 Obpラダ 一） 、 レーン 17は PCR法で 106 (PFU相当 DNA) 、 レーン 18は PC R法で 105、 レーン 19は PCR法で 104、 レーン 20は PCR法で 103の 場合である。 ま 9
増幅サイズ （b p) 検出限界
I CAN法 PCR法
112 104 104
91 104 104 図 20及び表 9に示すようにアデノウイルス E 1 A遺伝子の検出において I C AN法は P C R、法と同等の検出感度であることを確認した。
実施例 23
レトロウイルスべクタ一感染細胞からの組み込みゥィルス遺伝子の検出につい て検討した。 レトロウィルス感染細胞の調製およぴゲノム DNA調製法は以下の ようにして行った。 すなわち、 ベクタープラスミド pDON— AI (宝酒造社） をパッケージング細胞 GP E + 86にリン酸カルシウム法にて導入し、 導入細胞 の培養上清からェコトロピックベクターを調製した。 NIHZ3T3細胞に、 ェ コトロピックべクターを感染させ、 G 418を含む培地で 14日間培養すること によりウィルスベクタ一感染細胞を調製した。 調製したレトロウイルス感染細胞 4X 104個より常法によりレトロウイルス感染細胞のゲノム DNA 21 IX ^ を得た。 また、 プライマーは、 実施例 18 (1) 記載のプライマー pDON— A I一 1及ぴ pDON— A I— 2を用いた。 反応は以下のようにして行った。 すな わち、 前記各 60 pmo 1のプライマー、 2 ^ 1の 0. 25%プロピレンジアミ ン水溶液、 上記铸型ゲノム DNA1000ng〜0. lngを含む全液量 10 μ 1の反応系でサーマルサイクラ一 （宝酒造社製） で 98°Cで 2分間の後、 60°C の加熱処理により铸型にプライマーをアニーリングさせた。
上記ァニーリング処理後の各溶液に 0. 625 mM dNTP混合液、 40m M へぺス一水酸化力リゥム緩衝溶液 (ρΗ7. 8) 、 125 mM 酢酸力リゥ ム、 5mM 酢酸マグネシウム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 3 OUの大腸菌由来 RNa s eH及ぴ、 5. 511の50 & 8 6 3 DNAポリ メラーゼを含む全液量 40 IX 1の反応液を添加し、 最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液をサーマルサイクラ一で 60でで 1時間保持した。 反応終了後、 該反応 液 5〃 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動に供した。 さらに I C AN法と P C R法による DNAの検出感度を比較するために、 配列表の配列番号 111〜： L 1 2記載の p DON— A I一 3及ぴ p DON— A I一 4プライマーを使用して P C Rを行った。 PCRは、 上記鍚型 1 00 n g〜0. l n g、 上記各プライマー 6 0 pmo l、 1 0 XE xT a qバッファー 5 μ 1、 1. 2 5Uのタカラ E x タックポリメラーゼ、 0. 2mM dNTP sを含む全量 5 0 μ 1の反応液を調 製し、 サーマルサイクラ一パーソナルを用レ、、 94°C 30秒、 5 5°C 3 0秒、 7 2°C 3 0秒を 1サイクルとした反応を 3 5サイクル行つた。 反応終了後、 該 反応液 5 μ 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図 2 1に 示す。 すなわち、 図 2 1は、 I CAN法及ぴ PCR法でのレトロウイルスベクタ 一感染細胞からの組み込みウィルス遺伝子の検出結果を示すものであり、 レ―ン 1は分子量マーカー （1 00 b pラダー） 、 レーン 2は铸型 1 000ng、 レー ン 3は錶型 1 00ng、 レーン 4は铸型 1 0ng、 レーン 5は铸型 lng、 レーン 6は铸型 0. lngの場合である。
図 2 1に示したように I CAN法では、 铸型 DN Aが I n まで、 P CR法で は 3 5サイクルで錶型 1 n gまで目的の増幅産物を確認できた。
実施例 2 4
大腸菌 O— 1 5 7 ベロ毒素 I型遺伝子の検出について、 本発明の増幅方法と ハイブリダイゼーション法との組み合わせによる標的核酸の検出方法を検討した。 ターゲットとして、 腸管出血性大腸菌 O— 1 5 7 ベロ毒素 I型遺伝子を選択し た。 铸型 DNAは、 実施例 8 (1) 記載の方法で調製した。 増幅領域は、 GC含 量約 40 %で約 8 0 b pの領域を選び、 プライマーとして配列表の配列番号 1 1 3及び 1 1 4記載の塩基配列で示される VT 1 - I F 4及び VT 1— I R 1プラ イマ一を使用した。 反応は、 以下のように行った。 すなわち、 各 6 O p mo 1の VT 1 - I F 4及び VT 1— I R 1プライマー、 最終濃度 0. 0 1%プロピレン ジァミン、 0〜 1 05セル相当の各細胞数熱抽出液及ぴ滅菌水で全液量 5 μ 1の 混合液を調製した。 該混合液をサーマルサイクラ一パーソナルにて 9 8 °C 2分間、 熱変性後、 5 5°Cまで急冷し、 1分間保持後、 さらに氷上に置き、 アニーリング 処理を行った。
ァニーリング処理後、 上記混合液に最終濃度 20 mM へぺス一水酸化力リゥ ム緩衝液 (pH7. 8) 、 l O OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 0 1%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500 μ M dNTP s、 15Uの 大腸菌由来 RNa s eH及び 2. 75Uの B e a BE ST DNA ポリメラー ゼを添力 Πし、 滅菌水で最終容量を 25 μ 1にした。 該反応液は、 あらかじめ 5 5 °Cに設定したサーマルサイクラ一パーソナルにセットし 60分間保持した。 対 照として上記熱抽出液について O— 157 Ty i n g S e t (宝酒造製） を用い、 マニュアル通りにサーマルサイクラ一パーソナルにて PCRを行った。 PCR条件は、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 1分を 1サイクルとする 35サイクルで行った。 該反応での所要時間は、 約 145分になる。 この際、 予 想される増幅産物は、 349 b pである。 反応終了後、 各反応液 3 / 1を 3 %ヌ シープ 3 ： 1ァガロース電気泳動に供した。 I CAN法の結果を図 22に示した。 図 22は、 O— 157ベロ毒素 I型遺伝子の検出結果であり、 レーン Mは分子量 マーカー （50— 2 O O Ob p) 、 レーン Nは、 滅菌水を鍀型にした場合、 レー ン 1は 1セル相当の鍀型、 レーン 2は 10セル相当の鎳型、 レーン 3は 102セ ル相当の鏡型、 レーン 4は 103セル相当の铸型の場合である。 さらに、 I CA N法と P CR法の検出結果について表 10に示す。 表 10
大腸菌 O— 157細胞数
0 1 10
I CAN法 一 + ++ +
PCR法 一 + ++
一 ：増幅しない、 +〜 + h +：増幅量を 3段階で示した 表 10に示したように、 I C AN法も PC R法も予^ ®される増幅産物を 1細胞 相当量の熱抽出液を用いた反応系まで得ることができた。 さらに、 増幅産物につ いては、 配列表の配列番号 1 15に記載の塩基配列で示される 5， 末端がビォチ ン標識された VT 1 オリゴヌクレオチドプローブを用いてドットハイブリダィ ゼーションを行つた。 ハイブリダイズは実施例 19記載の条件で行つた。 その結 果は、 上記電気泳動結果と同一であった。 すなわち、 I CAN法と PCR法の検 出感度は同等であることが確認できた。 さらに増幅反応の全所要時間を比較する と P C Rに対し本発明の I C AN法は 1/2以下の時間で行うことができ、 病原 菌などの検出方法として有効であることを確認した。
実施例 25
ボツリヌス A型毒素遺伝子の検出方法について検討した。 鎳型は、 ボツリヌス 菌 （C l o s t r i d i um b o t ii l i num、 食中毒事例株、 t y p e A - 190) より調製した DNAを用いた。 該菌株は女子栄養大学 ·衛生学教室保 存菌株である。 検出用プライマーとして、 配列表の配列番号 1 16〜； 1 17記載 の塩基配列で示される B o t A S 2プライマー） 及ぴ B o t A A 2プライマ 一を合成した。 該プライマー対で約 150 b pの増幅産物が得られる。 铸型とな る上記 A型毒素産生ボツリヌス菌 DNAは、 滅菌水にて 1 μ 1あたり 100 f g、 l p g、 10 p g、 100 p gとなるように調製した。 反応は以下のようにして 行った。
各 50 p m o 1の上記プライマー、 最終濃度 0. 01 %プロピレンジァミン、 上記铸型 DNA溶液各 1 1を添加し、 容量 10 1の混合液を調製した。 該混 合液を実施例 19記載の反応液組成及び反応条件で I C AN反応を行つた。 対照 として、 ボツリヌス A型毒素遺伝子検出用プライマ一セット BAS— 1 a n d BAS— 2 (宝酒造社製） を用い、 マニュアルに記載の方法に従い、 サーマ ノレサイクラ一パーソナルにて PC Rを行った。 この際、 予想される増幅産物は、 284 b pである。
反応終了後、 各反応液 3 1を 4%ヌシープ 3 ： 1ァガロース電気泳動に供し た。 その結果を図 23 Aに示す。 すなわち、 図 23Aは、 I CAN法及び PCR 法でのポッリヌス A型毒素遺伝子の検出結果を示すものであり、 レーン M 1は分 子量マーカー （100 b pラダー） 、 レーン M 2は分子量マーカー （50〜20 0 O b pマーカー） 、 レーン 1は鍀型なし、 レーン 2は錶型 100 f g、 レーン 3は铸型 10 p g、 レーン 4は錄型 100 p gの場合である。
図 23 Aに示すように、 I CAN法では鎳型 DNA 100 f gを用いた反応 まで、 予想される増幅産物が得られたが、 PCR法では鎳型 DNA 100 f g を用いた反応では予想される増幅産物が得られなかった。 さらに、 これらの反応 産物について、 配列表の配列番号 1 18に記載の塩基配列で示される B o t Aプ ロープを用レ、てドットハイブリダイゼーションを行つた。 ドットハイプリは、 実 施例 9記載の条件と同様にして行った。 その結果を図 23Bに示す。 図 23Bに 示したように、 I CAN反応では铸型 100 f gまで、 PCR反応では錄型 10 P gまでシグナルが確認でき、 上記電気泳動結果と一致することが確認できた。 実施例 26
菊ウイロイドの検出について検討した。 特開平 9 _ 140383号公報 実施 例 1に記載の、 キクわい化ウイロイド （CSVd) 感染キクからの低分子 RNA の抽出法に従って得た低分子 RNAの 10倍希釈系列を調製した。 逆転写反応は、 RNA PCR k i t (AMV) v e r 2. 1 (宝酒造社製） を用いて行った。 すなわち、 逆転写反応液として、 1 XRNA PCR Bu f f e r, 5mM MgC l2、 ImM dNTP s、 20Uの RNa s e I nh i b i t o r,
5 U AMV Re v e r s e Tr a n s c r i p t a s eXL 50 p m o 1 Ra n d om 9 m e r s、 各希釈系列 RN A溶液 1 μ 1を用いて 20 μ 1 の反応液を調製し、 30°C 10分間加温後、 55°C 30分間反応させた。 反 応終了後、 99°C 5分間熱処理により逆転写酵素を失活させ、 冷却後、 I CA N反応を行った。 I CAN反応液 50 μ 1の反応系に対して上記逆転写反応液 1 μ 1を铸型として用いた。 本実施例においてプライマーは、 配列表の配列番号 1 19及び 120記載の塩基配列を有する CSVD— F4プライマーと CSVD— R 3プライマーを使用した。 反応は、 反応温度を 60°C、 サーマルサイクラ一 M Pを使用する以外は、 実施例 19記載の反応条件と同じにした。 反応終了後、 各 反応液 3 1を 3 %ヌシーブ 3 ： 1ァガロース電気泳動に供した。
一方、 同じ逆転写反応液 1 μ 1を錶型として用いて 50 IX 1の反応系で PC R 増幅を行った。 このとき使用したプライマーは配列表の配列番号 109及び 11 0記載の F 94と R 264プライマーを使用した。 反応は以下のように行った。 すなわち、 TaKaRa PCR Am l i f i c a t i o n k i tを使用 し、 プロトコールに従い、 反応液を調製し、 上記プライマー各 1 Opmo 1用い て、 各逆転写反応液 1 β 1を添加して全量 50 ^ 1にし、 サーマルサイクラ一 Μ Ρにより増幅反応をおこなった。 反応条件は、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとし 30サイクルをおこなった。 反応終了後、 各反 応液 5 At 1を 3%ヌシーブ 3 ： 1ァガロース電気泳動に供した。 その結果を表 1 1に示す。 表 11 ϋ 〇
鐃型 RN Aの希釈率 X 102 X 103
+ + +
+
-：増幅していない、 + ：増幅している、 ++； ：良く増幅している 表 1 1に示したように、 I CAN法では 103倍に希釈した RN Aサンプルを 铸型に用いた反応まで、 PCR法では 102倍に希釈した RNAサンプルを鐯型 に用レ、た反応まで増幅産物が得られた。
さらに I CAN増幅産物と PC R増幅産物についてドットハイプリダイゼーシ ヨンにより目的の産物であることを確認した。 配列表の配列番号 121記載の塩 基配列で示される 5，末端にビォチン標識された C SV dプローブを用いてドッ トハイブリダイゼーションを行つた。 ハイブリダイズの方法は実施例 9に記載の 条件に従つた。 その結果は、 上記電気泳動結果と一致しており、 I C ANでは 1 03倍希釈の RNAサンプルまでシグナルが得られ、 PCRでは 102倍希釈の R NAサンプルまでシグナルが得られた。 PCRに比べて I CANの方が感度がよ いことが示された。
実施例 27
P f u RNa s eHを用いたキクわい化ウイロイド （CSVd) 感染キクか らのウイロイド遺伝子の検出について検討した。 実施例 26で調製した RNAの 10倍希釈液 3μ 1と 1 OmM トリス一塩酸緩衝液 (pH8. 3) 、 5 OmM 塩ィ匕カリウム、 5mM 塩化マグネシウム、 ImM dNTP混合液、 15 O p mo lの Ra n d om 6me r s、 60Uの R i b o nu c l e a s e I n h i b i t o r (宝酒造ネ環） 、 15Uの Re v e r s e Tr a n s c r i p t a s e XL (AMV) (宝酒造社製） を含む全液量 60 μ 1をサーマルサイ クラ一 （Ge n e Amp PCR Sy s t em9600, アプライドバイオ システムズ社製） を用いて、 30°Cで 10分間、 続いて 42 °Cで 1時間保温した 後、 酵素を失活させるために 99°Cで 5分間加熱して cDNAを調製した。 次に、 ウイロイ ドの mRNAの塩基配列に従って、 配列表の配列番号 122〜125記 载のプライマー Vd l、 Vd 2、 Vd 3、 Vd 4を合成した。
各 50 p mo 1の上記プライマー Vd 1、 Vd 2と铸型として上記により合成 した c DNA溶液 1 μ 1あるいは水により 10倍、 100倍、 1000倍、 10 000倍希釈したもの 1 μ 1、 または陰性対照として水 1 μ 1と 0. 5mM d NTP混合液、 32 mM へぺス—水酸化力リゥム緩衝溶液 (pH7. 8 ) 、 1
0 OmM 酢酸カリウム、 4. OmM 酢酸マグネシウム、 0. 01%BSA、 l%DMSO、 0. 0156/i gの P f u RNa s eH、 1Uの B c aBES T DN Aポリメラーゼを含む全液量 50 μ 1をサーマルサイクラ一で 57 °C、 1時間保温した。 反応後のサンプルは分析するまで一 20°Cで凍結して保存した。 対照として PCRを行った。 すなわち、 各 50 pmo 1のプライマー Vd 3、
Vd4と上記 cDNA 溶液 1 μ 1あるいは水により 10倍、 100倍、 100 0倍、 10000倍希釈したもの 1 μ 1または陰性対照として水 1 μ 1と 10 X Ε X Ta qバッファー 5 μ 1、 1. 25Uのタカラ Exタック ポリ メラーゼ、 0. 2 mM dNTP混合液を含む全液量 50 1の反応系でサーマ ルサイクラ一を用い、 94°C 2分間を 1サイクル、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとする 35サイクル、 72°C 5分間を 1 サイクルのプログラムで反応を行った。 反応後のサンプルは分析するまで一 2 0 °Cで凍結して保存した。
上記 I C AN反応液および P C R反応液 5 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気 泳動に供した。 その結果を図 24に示す。 すなわち、 図 24は P f u RNa s eHを使用した I CAN法及ぴ PCR法でのウイロイドの検出結果を示すもので あり、 レーン 1は 100 b p DNAラダーマーカー、 レーン 2は陰性対照、 レ ーン 3は c DNAの 10000倍希釈サンプル、 レーン 4は c DNAの 1000 倍希釈サンプル、 レーン 5は c D N Aの 100倍希釈サンプル、 レーン 6は c D NAの 10倍希釈サンプル、 レーン 7は cDNAの原液サンプルの場合である。 図 24に示したように I CANおよび PC Rのいずれの反応においても、 10 0倍希釈した c D N Aまで目的の増幅産物を確認することができた。
実施例 28
K一 r a s遺伝子の検出について検討した。 (1) ゲノム DNAからの検出
ヒト c一 K i— r a sの塩基配列に従って、 配列表の配列番号 126及び 12 7記載の c— K i - r a s— 1及ぴ c—K i一 r a s— 2プライマーを構築した。 前記各 60 pmo 1のプライマー、 2 1の0. 25 %プロピレンジァミン水 溶液、 ヒ トゲノム DNA (クロンテック社製） 100 n g〜l n gの铸型を含む 全液量 10 μ 1の混合液を調製した。 該混合液をサーマルサイクラ一パーソナル で 98°Cで 2分間処理後、 53°Cの加熱処理により鎵型にプライマーをァニーリ ングさせた。
上記ァ-ーリング処理をした各溶液に 0. 625 mM d NT P混合液、 40 mM へぺス一水酸化カリウム緩衝溶液 （pH7. 8) 、 125mM 酢酸カリ ゥム、 5mM 酢酸マグネシウム、 0. 01250/。BSA、 1. 25%DMSO、 3 OUの大腸菌由来 RNa s eH及ぴ 5. 511の：8。 &86 3 七 DNAポリメ ラーゼを含む全液量 40 μ 1の反応液を添加し、 最終容量を 50 μ 1にした。 該 反応液を 53 で 1時間保持した。 反応終了後、 該反応液 5 1を 3. 0 %ァガ ロースゲル電気泳動に供した。
一方、 対照として PC Rを行った。 プライマーは、 配列表の配列番号 128及 び 129記載の c一 K i— r a s— 3、 c一 K i—r a s—4プライマーを使用 した。 上記プライマー 60 pmo 1、 上記鐯型 100 n g〜0. l n g、 10 XE xタックバッファー 5 μ 1、 1. 25Uのタカラ Exタック ポリメラ —ゼ、 0. 2mM d NT Pを含む全量 50 μ 1の溶液を調製し、 サーマルサイ クラ一パーソナルを用い、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとする 30または 35サイクルの反応を行った。 反応終了後、 核反応 液 5 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図 25に示す。 すなわち、 図 25は I CAN法及び PCR法でのヒトゲノム DNAからの c一 K i - r a s遺伝子の検出結果を示すものであり、 I C AN法では、 レーン 1は分 子量マーカー、 レーン 2は铸型 100 n g、 レーン 3は铸型 10 ng、 レーン 4 は鏺型 1 n g、 レーン 5は铸型なしの場合である。 P C R法では、 レーン 1は铸 型 100n g、 レーン 2は铸型 10 n g、 レーン 3は铸型 I n g、 レーン 4は铸 型なしの場合である。 図 2 5に示したように I CAN法では、 铸型 1 n gまで、 PCR法では、 30 サイクルで鍚型 1 O n gまで、 目的の増幅産物が確認できた。 さらに、 铸型が 1 n gから l O O n gの場合の I C AN法と P C R法での増幅産物量の比較結果を 図 3 0に示す。 図中、 斜線を付した棒は 3 0サイクルの P C R法の、 点を付した 棒は 3 5サイクルの PCR法の、 黒棒は I CAN法の結果をそれぞれ示す。 図 3 0に示したように、 I CAN法が PCR法に比較して、 増幅産物量が多いことが 確認できた。
(2) 血液サンプ からの検出
抗凝固剤として、 タエン酸ナトリゥムおよびへパリンを用いて健常人から採血 した血液サンプルそれぞれ Ι Ο Ο μ Ιより G e nとるくん ΤΜ (血液用） （宝酒造 社製） を用いてゲノム DNAを調製してきた。 調製した血液換算で 5 μ 1〜0. 04 μ Ϊの DNAより I CAN反応により上記 (1) と同様の条件で c一 K i - r a s遺伝子の検出を行った。 さらに、 I CAN反応と PCR反応による DNA の検出感度を比較するために、 上記 (1) と同様の条件で上記血液サンプル由来 DNA 5 μ 1〜0. 04 1からの検出を行った。 その結果を図 2 6に示す。 すなわち、 図 2 6は、 I CAN法及ぴ PC R法での血液サンプルからの c_K i — r a s遺伝子の検出結果であり、 I CAN法では、 レーン 1は分子量マーカー、 レーン 2はクェン酸血 5 1、 レーン 3はクェン酸血 1 ^ 1、 レーン 4はクェン 酸血 0. 2 ju 1、 レーン 5はクェン酸血 0. 04 1、 レーン 6はへパリン血 5 IX 1 , レーン 7はへパリン血 1 μ 1、 レーン 8はへパリン血 0. 2 1、 レーン
9はへパリン血 0. 04 ^ 1の場合である。 また、 PCR法では、 レーン 1は分 子量マーカー、 レーン 2はクェン酸血 5 ^ 1で 3 0サイクル、 レーン 3はクェン 酸血 1 1で 30サイクル、 レーン 4はクェン酸血 0. 2 1で 30サイクル、 レーン 5はクェン酸血 0. 04 μ 1で 3 0サイクル、 レーン 6はクェン酸血 5 1で 3 5サイクル、 レーン 7はクェン酸血 1 μ 1で 3 5サイクル、 レーン 8はク ェン酸血 0. 2 μ 1で 3 5サイクノレ、 レーン 9はクェン酸血 0. 04 1で3 5 サイクル、 レーン 1 0はへパリン血 5 1で 30サイクル、 レーン 1 1はへパリ ン血 1 1で 30サイクル、 レーン 1 2はへパリン 0. 2 ju lで 30サイクル、 レーン 1 3はへパリン 0. 04 ^ 1で 3 0サイクル、 レーン 1 4はへパリン血 5 μ ΐで 35サイクル、 レーン 15はへパリン血 1 μ 1で 35サイクル、 レーン 1 6はへパリン 0. 2 i lで 35サイクル、 レーン 17はへパリン 0. 04 1で 35サイクルの場合である。
図 26に示したように、 I CAN法では、 いずれの血液サンプルからも血液換 算で 0. 2 μ 1相当のゲノム DNAまで、 PCR法では、 クェン酸血については、
30サイクルで 0. 2 μ 1、 へパリン血についても 30サイクルで 0. 2 μ 1相 当まで目的の増幅産物が確認できた。
実施例 29
B c a RNa s eH I I Iを用いた大腸菌 O— 157ベロ毒素 2型 （VT— 2) 遺伝子の検出について検討した。 腸管出血性大腸菌である O—l 57をノボ ピオシン加 m EC培地において 42 °C、 18時間培養後、 95°C、 10分間熱処 理を行った。 これを滅菌水にて 0、 1、 10、 102、 103相当細胞数液に調製 し、 铸型として使用した。 検出用プライマーとして、 配列表の配列番号 130〜 131記載の塩基配列で示される VT— 2 I F4プライマー及び V T— 2 I R 3プライマ） を合成した。 該プライマー対で得られる増幅産物は約 146 b p である。 反応は以下のようにして行った。 すなわち、 各 50 pm o 1の上記プラ イマ一、最終濃度 0. 01%プロピレンジァミン、 上記各細胞数熱抽出液を添加 し、 Ι Ομ Ιに調製した。 この混合液をサーマルサイクラ一パーソナルにて 9 8°C 2分間熱処理、 55°C 1分間保温後、 氷上に置いた。 該混合液に、 最終 濃度 34mM トリシンバッファー （p H 8. 7) 、 1 OmM 塩化カリウム、
1 OmM 硫酸アンモニゥム、 l%DMSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸 マグネシウム、 各 500 μΜ dNTP s、 参考例 3 (5) にて調製した B c a RNa s e H I I I 32U、 5. 5Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼ を添加し最終容量を 50 μ 1にした。 この反応液を、 あらかじめ 55°Cに設定し たサーマルサイクラ一にセットし、 60分間反応させた。 反応終了後、 各反応液 3 μ 1を 4%ヌシーブ 3： 1ァガロース電気泳動に供した。 その結果を図 27に 示す。 すなわち、 図 27は、 B c a RNa s eHI I Iを用いた大腸菌 O—l 57ベロ毒素 I I型 （VT2) 遺伝子の検出結果を示すものであり、 レーン Mは 分子量マーカー （100 b pラダー) 、 レーン Nは滅菌水を铸型とした場合、 レ ーン 1は 1セル相当、 レーン 2は 1 0セル相当、 レーン 3は 1 02セル相当、 レ ーン 4は 1 03相当の鍚型の場合である。
図 2 7に示すように、 I CAN法で 1セル相当の熱抽出物からも VT 2遺伝子 を検出することができた。 この結果は、 実施例 9で示される大腸菌 RNa s e H を使用した場合の I CAN法および P C Rによる検出反応と同等の結果であり、 耐熱性の RN a s e Hである B c a RNa s e H I I Iを使用した I CAN法 もまた、 ウィルス、 細菌等の検出方法として有効であることが確認できた。
実施例 30
黄色ブドウ球菌ェンテロトキシン A遺伝子の検出について検討した。 まず、 黄 色ブドウ球菌ェンテロトキシン A遺伝子領域の塩基配列に従って、 配列表の配列 番号 1 36及び 1 3 7のプライマー S EA— 1、 S E A— 2をそれぞれ合成した。 次に 1 1 5 p g、 1. 1 5 n gの ATCC登録番号 1 3 5 6 5の黄色ブドウ球菌 由来ゲノム DNA 1 μ 1あるいは陰性対照の水 1 μ 1と、 これに前記各 5 O pm o lの上記プライマー、 0. 5mM dNTP混合液、 3 2mM へぺス一水酸 ィ匕カリウム緩衝液 (pH7. 8) 、 l O OmM 酢酸カリウム、 4. OmM 酢 酸マグネシウム、 0. 0 1%B SA、 1. 0%DMSO、 0. 0 1 5 6 μ §の P f u RNa s e H, 1Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼを含む全液量 5 0 μ Iの反応液をサーマルサイクラ一で 5 8 °C、 1日寺間保温した。 反応終了後、 該反応液 5 μ 1を 3. 0 %ァガロースゲル電気泳動により分析した。 その結果を 図 2 9に示す。 図 2 9は、 黄色ブドウ球菌ェンテロトキシン Α遺伝子検出の電気 泳動結果であり、 レーン 1は分子量マーカー （1 O O b pラダー） 、 レーン 2は 陰性対照 （滅菌水） 、 レーン 3は錶型 1 1 5 p g、 レーン 4は铸型 1 · 1 5 n g の場合である。
図 2 9に示したように、 铸型が約 1. 1 5 n gの場合まで目的の増幅産物の増 加が確認できた。
実施例 3 1
C型肝炎ウィルス （HCV： He p a t i t i s C V i r u s) の検出に ついて検討した。 まず HCVの塩基配列に従って、 配列表の配列番号 1 3 8及び 1 3 9記載の塩基配列を有するプライマー HCV— F 3、 HCV— R 1をそれぞ れ合成した。 次に铸型 DNAは以下のように調製した。 すなわち、 健常人および H C V患者の血清 100 1より実施例 21と同様の方法で調製した R N A、 1 OmM トリス—塩酸緩衝液 (pH8. 3) 、 5mM MgC lい 1 mM d NTP、 10 pmo 1のランダム 6me r sプライマー、 10Uの Re v e r s Tr a n s c r i p t a s e XL (宝酒造社製） を含む全量 4 μ 1をサーマル サイクラ一 （Ge n e Am PCR Sy s t em 9600、 アプライド バイォシステムズ社製） を用いて 30 °Cで 10分間、 続いて 42でで 1時間保温 した後、 酵素を失活させるために 99 °Cで 5分間加熱して cDN Aを調製した。 上記 cDNA反応溶液 1 μ 1と上記各 100 pmo 1の HCV— F 3及ぴ HC V— R 1プライマーを用いる以外は、 実施例 13と同様の条件下で I CAN反応 を 55 °C、 1時間行つた。 反応終了後、 該反応液 2. 5 μ 1を 3. 0 %ァガロー スゲル電気泳動に供した。 その結果を図 31に示す。 図 31は、 C型肝炎ウィル ス検出の電気泳動結果であり、 レーン 1は分子量マーカー （l O Ob p) 、 レー ン 2は健常人、 レーン 3〜レーン 6は HCV感染患者のそれぞれの血清より調製 した錶型を用いた場合である。
図 31に示したように HCV感染患者の血清サンプルから特異的に HCVを検 出できることが確認できた。
実施例 32
本発明の増幅方法について検討した。
(1) 実施例 2 (2) で調製した pUC 19— 150プラスミド DNAを錄型に し、 配列表の配列番号 35及ぴ 36記載の MCS— F、 MCS— Rプライマーを 用いて PCRを行った後、 マイクロコン一 100 (ミリポアネ環） で精製し、 5 34 b pの P C R増幅断片を得た。 上記 P C R断片 15 n gに 30pmo lの 5' 末端を [ τ/一32 P ] A T Pでリン酸化ラベルした配列表の配列番号 140記 載の塩基配列を有する MF 2プライマー及び滅菌蒸留水で 5 1とした反応液、 さらに配列表の配列番号 141記載の塩基配列を有する MR 1プライマー 30 p mo 1を加えた反応液を用意した。 これらの反応液を 98 °C、 2分間熱変性後、 55 °Cまで冷却した後、 1 Uの B c a BEST DNAポリメラーゼを含む反応 液 （42. 5mM トリシン緩衝液 (pH8. 7) 、 12. 5mM 塩化力リウ ム、 12. 5mM 硫酸アンモニゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25 %DM SO、 5mM 酢酸マグネシウム、 各 0. 625mMdNTP) 20 1を添加 し 55 °Cで 15分間反応した。 反応終了後、 5 μ 1の反応液に 2. 5 μ 1の反応 停止液 （95%ホルムアミド、 20mM EDTA、 0. 05%プロモフエノル ブルー、 0. 5%キシレンシァノール） を加えて、 94°C、 3分間の熱変性を行 つた。 この反応液 1. 6 μ 1を 8 M 尿素を含む 6 %ポリアクリルアミドゲルを 用いて電気泳動した後、 BAS 2000 (フジッタス） でシグナルを読みとり、 MR 1プライマーからの伸長産物を検出した。 その結果を図 32 Aに示す。 図 3 2 A中のシークェンスラダーは [γ—32Ρ] ATPでリン酸ィヒラベルした MF 2 プライマーを用いて Ml 3m 18 s i n g 1 e s t r a n d DNA (宝酒 造社製） を配列決定したものであり、 伸長産物の長さを決定するのに使用した。 さらに、 レーン 1は MF 2及ぴ MR 1プライマーの組み合わせ、 レーン 2は MR 1を用いた場合である。
図 32 Aに示したように上記鐃型に MR 1プライマーのみを加えて伸長反応し た場合は MR 1プライマーより铸型の末端まで伸長した 448 b pのパンドが検 出されたが、 さらに MF 2プライマーを加えることにより、 上記のバンドに加え て、 MR 1プライマーと MF 2プライマーに挟まれた 373 b pのバンドが検出 された。 従って、 最初、 Bc aBEST DNAポリメラーゼにより、 PCR増 幅断片を铸型にして MR 1プライマーより伸長していたものが、 途中、 铸型交換 により、 MF 2プライマーからの伸長鎖を铸型として伸長したことが確認できた。 さらに、 鎖置換活性を有する常温菌由来の DNAポリメラーゼとしてクレノゥ D N Aポリメラーゼを用いた場合について、 上記と同様の条件で検討を行つたと ころ、 鐃型交換が起こっていることが確認できた。 一方、 鎖置換活性を有さない タカラ Ta q DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） や Py r o BEST DN A ポリメラーゼ （宝酒造社製） を用いた場合には鎳型交換は確認できなかった。
(2) 上記铸型交換反応に、 プライマーがァ-ーリングしている铸型 DNA鎖に ついて検討した。 最初に MF 2プライマー及ぴ MR 1プライマーがアニーリング できる DN A断片を以下のように調製した。 pUC19プラスミドを鎳型に MC SFプライマーと RVプライマー （宝酒造社製） および M4プライマー （宝酒造 社製） と MC SRプライマーを用いて PCRを行い、 マイクロコン一 100で精 製し、 236 b pと 271 b pの PCR増幅断片、 MS C F— R V断片及ぴ M4 —MCSR断片を得た。 この 2つの PCR増幅断片の中で M4プライマーと RV プライマーにはさまれた領域は共通配列である。
次に、 プライマーがアニーリングしている鎳型 DN A鎖同士がアニーリングし ていない形態の鍚型ープライマー （1) とプライマーがアニーリングしている鏡 型 DNA鎖同士がアニーリングしている形態の铸型ープライマー （2) を以下の ように作製した。
(1) MC S F-RV®ft, 30ngに 40 pmo 1の 5， 末端を [γ— 32 P] ATPでリン酸ィヒラベルした MF 2プライマーとプロピレンジァミンを最終濃度
0. 01 %になるよう添加し滅菌蒸留水で 5 ί 1とした反応液および M 4-MC SR断片、 30n gに 40pmo 1の MR 1プライマーとプロピレンジァミンを 最終濃度 0. 01 %になるよう添カ卩し、 滅菌蒸留水で 5 μ 1とした反応液を別々 に 98 °C、 2分間熱変性後、 55 °Cまで冷却した後、 それぞれの反応液 2. 5 μ 1ずつ混合して铸型ープライマーを調製した。
(2) 15 n gの MCSF— RV断片、 15 n gの M4 _MC S R断片、 20 p mo lの 5， 末端を [γ—32 P] AT Ρでリン酸ィ匕ラベルした MF 2プライマー、 20 pmo 1の MR 1プライマー、 及ぴプロピレンジァミンを最終濃度 0. 0
1 %になるよう添カ卩し、 滅菌蒸留水で 5 μ 1 とした反応液を 98 °C、 2分間熱変 性後、 55°Cまで冷却して铸型一プライマーを調製した。
上記、 鍚型一プライマー反応液 5 1に 1Uの B c aBEST DNAポリメ ラーゼを含む反応液 （42. 5mMトリシン緩衝液 （pH8. 7) 、 12. 5m M 塩化カリウム、 12. 5mM 硫酸アンモニゥム、 0. 0125%BSA、 1. 25%DMSO、 5mM 酢酸マグネシウム、 各 0. 625mM dNT P) 20 1を添加し 55°Cで 15分間反応した。 反応終了後、 5 μ 1の反応液 に 2. 5 μ 1の反応停止液 （ 95 %ホルムァミド、 20 mM E D T A、 0. 0 5 °/0プロモフエノルブルー、 0. 5%キシレンシァノール） を加えて、 94°C3 分間の熱変性を行つた。 この反応液 1. 6 μ 1を 8 Μ尿素を含む 6 %ポリアタリ ルアミドゲルを用いて電気泳動した後、 BAS 2000 (フジックス） でシグナ ルを読みとり MF 2プライマーからの伸長産物を検出した。 その結果を図 32B に示す。 図 32 B中のシークェンスラダーは [γ— 32P] ATPでリン酸ィ匕ラベ ルした MR 1プライマーを用いて Ml 3mp 18 s i n g 1 e s t r a n d DNAを配列決定したものであり、 伸長産物の長さを決定するのに使用した。 さ らに、 レーン 1は铸型 DNA鎖がアニーリングしていない場合、 レーン 2は錄型 DNA鎖がアニーリングしている場合である。
図 32 Bに示したようにプライマーがァニーリングしている铸型 DN A鎖同士 がアニーリングしていない形態の錶型一プライマーの場合には MF 2プライマー より铸型の末端まで伸長した 161 b pのバンドのみが検出されたが、 プライマ 一がアニーリングしている铸型 DN A鎖同士がアニーリングしている形態の錄型 一プライマーの場合には、 上記のバンドに加えて、 MF 2プライマーと MR 1プ ライマーに挟まれた 223 b pのバンドが検出された。 従って、 プライマーがァ エーリングしている铸型 DNA鎖同士がァエーリングしている場合は、 铸型交換 反応が起こることが確認できた。
実施例 33
( 1 ) 前記参考例 7記載のアルカェォグロバス フルギタス （A f u ： A r c h a e o g l o bu s f u l g i du s) 由来 RN a s e Hを用いた結核菌の検 出について検討をした。 まず、 ジーンバンク登録番号 AL 123456記載の結 核菌ゲノムの塩基配列に従って配列表の配列番号 155及び 156記載の塩基配 列を有するプライマー MT I S 2 Fプライマー、 MT I S 2 Rプライマーをそれ ぞれ合成した。 該プライマー対で挟まれる領域は、 プライマー部を含めて 103 b pである。 次に、 鍀型として乾燥 BCGワクチン （日本ビーシージ一製造社 製） より結核菌ゲノムを常法により抽出した。 該ゲノムを滅菌水にて 1 1あた り 100p g、 10p g、 l p g、 100 f g、 10 f g、 l f gとなるように 調製した。 反応は以下のようにして行った。 即ち、 最終濃度 32 mM へぺス一 水酸化カリウムバッファー （pH7. 8) 、 10 OmM 酢酸カリウム、 1 %D MSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500 M d NT P s、 各 50 pmo 1の MT I S 2 F及び MT I S 2 Rプライマー、 8. 7 5Uの A f u由来 RNa s e H、 8Uの Bc aBEST DNAポリメラーゼ、 各鎳型量 1 Hi 1を添加し滅菌水で最終容量を 50 μ 1にした。 該反応液はあらか じめ 60°Cに設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、 60分間保持 した。 反応終了後、 該反応液 3 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 一方、 対照として PCRをおこなった。 使用するプライマーは、 臨床病理、 第 43卷、 第 9号、 第 941頁〜 947頁 （1 995) 記載の MT I S PCR—
Fプライマー、 MT I S PCR— Rプライマーを使用した。 該プライマー対で 276 b pの増幅産物が得られる。 各プライマー 10 pmo 1を用いて ExTa q DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） の使用マニュアルに従い容量 50 1の 反応液を調製した。 サーマルサイクラ一にセットし、 反応温度条件 94 °C 30 秒、 50°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとする 40サイクル反応を行 つた。 反応終了後、 該反応液 3〃 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果、 いずれの場合においても 100 f gの鐃型量の場合まで目的の増幅 産物を確認できた。
(2) 上記 Af u由来 RNa s eH及ぴピロコッカス ホリコシィ （Pho : P y r o c o c c u s h o r i k o s h i) 由来 RN a s e Hを用レゝてクフミジ ァ トラコーマ （Ch l amy d i a t r a c h oma t i s) の検出につい て検討した。 まず、 ジーンパンク登録番号 X06707記載のクラミジァ トラ コーマ プラスミドの塩基配列に従って配列表の配列番号 157、 158記載の 塩基配列を有するプライマー CT 2 Fプライマー、 CT 2 Rプライマーをそれぞ れ合成した。 該プライマー対で挟まれる領域は、 プライマー部分を含めて 109 b pである。 また、 铸型 DNAとしてインフォームド コンセントの得られた患 者より提供された臨床検体よりフエノール'クロ口ホルム処理後、 エタ沈回収し たものをサンプルとして用いた。 反応は、 以下のようにして行った。 即ち、 最終 濃度 32mM へぺス一水酸化カリウムバッファー （pH7. 8) 、 l O OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 01 %B SA 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500/zM dNTP s、 各 50 pmo lの CT2 F及ぴ C T 2 Rプライマー、 46. 4Uの Ph o由来 RNa s eHあるいは 8. 75 Uの A f u由来 RN a s eH、 8U B c aBEST D N Aポリメラーゼ、 サンプル 1 μ 1を添加し滅 菌水で最終容量を 50 1にした。 該反応液は、 あらかじめ 55°Cに設定したサ 一マルサイクラ一パーソナルにセットし、 60分間保持した。 反応終了後、 該反 応液 3 1を 3. ◦%ァガロースゲル電気泳動に供した。 その結果、 目的の増幅 産物を確認できた。 このことから、 Ai u由来あるいは Ph o由来 RNa s eH を用いた本発明の方法においてクラミジァ トラコーマの検出ができることが確 認できた。
(3) さらに、 市販の検出装置を用いた磁気ビーズ検出について検討した。 即ち、 プライマーとして上記 (1) で使用した MT I S 2Rプライマーの 5，末端に ビォチン標識を導入したものを用い、 鎳型として 100 n gの結核菌ゲノムを用 いて上記 (1) 記載の増幅反応を行った。 得られた増幅断片を 30倍、 300倍、 3000倍に希釈し、 自動検出装置、 ルミパルス （富士レビォ社製） にセットし、 ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ （ピアス社製） による検出を行った。 ピオチン結合食 100 pmo 1相当のストレプトアビジン固層ィヒ磁気ビーズを キュベット第 1層でピオチン化増幅断片と 5分間反応させ、 次いで 0. IN N aOHを加えて F I TC標識プローブ MT I SBFと 5分間ハイブリダィズさせ、 洗浄後 POD標識抗 F I TC抗体を加え、 5分間反応後洗浄し発光基質を加えた。 この結果、 既存の自動化検出装置において磁気ビーズを用いて 20分という短時 間で半定量が可能であることが示された。 検出は、 発光量をフォトカウンティン グすることで測定した。 その結果を表 12に示す。 表 12
結核菌アンプリコン フォトカウンティング SZN比
X 30 3. 55 X 107 29. 6
X 300 1. 21 X 107 10. 0
X 3000 0. 21 X 107 1. 75
0 0. 12 X 10 表 12に示した結果から、 従来のプレート発光法と同等の感度で検出できるこ とを確認した。
(4) 上記増幅断片の検出方法として、 ハイブリッド ·クロマト法を検討した。 即ち、 ニトロセルロース膜にストレプトアビジン （ナカライテスタ社製） を固定 化し、 吸水パッドを連結し、 ハイプリ 'クロマト ·ストリップを作製した。 これ を用いて、 上記 (3) で用いた増幅断片のハイプリ 'クロマト法による検出を行 つた。 検出は、 1— s t e p TMB-B l o t t i n g (ピアス社製） を用い た発色で行った。 すなわち、 ニトロセルロース膜上に増幅断片を含有する反応液 を展開し、 その後順に 0. 1 N N a OH溶液、 F I T C標識プローブ、 洗浄液、 発色液を展開した。 その結果、 結核菌陽性の増幅断片では、 ブルーのバンドが検 出された。 また、 この方法を用いる事により、 本発明の方法実施後、 5〜10分 で結果が肉眼で判明することから、 迅速な遺伝子検査方法として有用であること が確認できた。
実施例 34
( 1 ) ラダーバンドを含む増幅産物のサザンハイプリダイゼーション解析 本発明の増幅方法において、 目的とする 3本のバンド以外に高分子側に複数の ラダー状バンドが存在する場合があり、 このラダーバンドについて検討した。 タ ーゲットとして、 腸管出血性大腸菌 O— 157を選択した。 鏡型 DNA、 使用す るキメラプライマー、 I CAN法の反応条件については、 実施例 9記載の方法で 調製した。 反応終了後、 該反応液 5 1を 3%Nu S i e V e 3 ： 1ァガロー スにて電気泳動した。 その結果を図 37に示す。 図 37において、 レーン Mは 1 00 b p DNAラダーマーカー、 レーン 1はネガティブコントロール、 レーン 2 は菌体熱抽出液 1セル相当、 レーン 3は 10セル相当、 レーン 4は 102 セル相 当、 レーン 5は 103 セル相当、 レーン 6は 104 セル相当、 レーン 7は 105 セル相当の場合を示す。 図 37に示したようにラダー状バンドが確認できた。
(2) ラダー増幅断片の解析
上記 (1) で得られたラダーバンドについて、 その塩基配列を解析した。 すな わち、 （ 1 ) で調製した反応液 50 1を 3 %ァガロース電気泳動に供し、 電気 泳動後、 ラダーバンドをゲルから切り出した。 次に、 EASYTRAP Ve r. 2 (宝酒造社製） を用いて、 ゲルから DNA増幅断片を回収した。 回収後、 該増 幅断片を DNA B l un t i n g k i t (宝酒造社製） にて、 末端平滑化処 理を行った。
制限酵素 H i n c I I (宝酒造社製） で処理した p GEM— 3 Zベクター （プ ロメガネ環） と上記平滑末端化処理した DN A断片を DNA l i g a t i on K i t (宝酒造社製） を用いてライゲーシヨンした。 この反応液を用いてコンビ テントセル JM109 (宝酒造社製） を形質転換した。 形質転換後、 上記セルを 0. ImM アンピシリン及び ImM I PTG/0. 02%X— Ga lを含む L B培地で 37 °Cで一 B免培養した。
培養後のプレートから、 ホワイトコロニーを数個選択し、 M13—M4及びM
13— RVプライマー （いずれも宝酒造社製） にてコロニー PCRを行い、 イン サートの有無を確認した。 インサートの確認されたコロニーを 0. ImM アン ピシリンを含む LB液体培地で 37°C、 ー晚振とう培養した。 培養後の菌体より、 Q IAGEN p l a smi d mi n i K i t (キアゲン社製） をもちいて プラスミドを精製した。 該プラスミド中の H i n c I Iサイトにクローニングさ れた断片を Ml 3— M4及ぴ Ml 3— RVプライマーを用いて両方向から常法に よりシークェンス解析を行った。
その結果、 本発明の方法で得られるラダー断片は、 目的の増幅領域の繰り返し 構造であることが確認できた。 また、 この繰り返しは、 5'から 3'方向に同じ向 きに並列になっていることが確認できた。
(3) 本発明の方法における結核菌、 HCV、 クラミジァ トラコーマの検出方 法において形成される目的の 3本の増幅断片以外のラダー増幅断片について検討 した。 HCV検出は、 実施例 31記載の反応条件、 結核菌及びクラミジアトラコ 一マ検出は、 実施例 33記載の反応条件で行った。 得られたラダー増幅断片は、 上記 （2) 記載の方法でサブクローニングを行いシークェンス解析を行った。 そ の結果、 本発明の方法で得られるラダー断片は、 目的の増幅領域の繰り返し構造 であることが確認できた。 また、 この繰り返しは、 5'から 3'方向に同じ向きに 直列になっていることが確認できた。
実施例 35
(1) 結核菌を対象とした本発明の検出方法について検討した。 まず、 結核菌ゲ ノムのうち、 比較的 GC含量が低い領域を目的の増幅領域として、 配列表の配列 番号 159〜160記載の塩基配列を有する K一 F— 1033 (60) 及び K— F - 1 133 (62) プライマーをそれぞれ合成した。 铸型となる結核菌ゲノム は、 実施例 33 (1) 記載のものを使用し、 l O O f g〜； L Op gの範囲で段階 希釈した。 反応は、 以下のようにして行った。 即ち、 最終濃度 32mM
一水酸ィ匕カリウムバッファー （pH7. 8) 、 l O OmM 酢酸カリウム、 1% DMSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500 M dN TP s、 各 50 pmo 1の K一 F— 1033 ( 60 ) 及ぴ K_ F— 1 133 (6 2) プライマーの組み合わせ、 9. 375Uの P f u由来 RNa s e H I Iある いは 4. 375Uの A f u由来 RNa s e H、 2. 75Uの B c aBEST D NAポリメラーゼ、 各錶型量 1 β 1を添加し滅菌水で最終容量を 25 1にした。 該反応液はあらかじめ 62°Cに設定したサーマルサイクラ一パーソナルにセット し、 60分間保持した。 反応終了後、 該反応液 3 μ 1を 3. 0%ァガロースゲル 電気泳動に供した。 その結果、 いずれの RNa s eHにおいてもゲノム DNAを 铸型とした場合において、 100 f g〜l 0 p gのいずれの濃度においても検出 できることを確認した。
(2) 上記 (1) の方法について、 更に Tm値が高いプライマー.について検討し た。 まず、 配列表の配列番号 161〜162記載の塩基配列を有する K—F— 1 033 (68) 及ぴ K— F— 1 133 ( 68 ) プライマーをそれぞれ合成した。 増幅反応は、 反応温度を 63 °Cにする以外は、 上記 （ 1 ) と同じ条件で行つた。 反応終了後、 該反応液 3 1を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。 その 結果を図 38に示す。 図 38は、 P f u由来 RNa s eH及ぴ A f u由来 RNa s eHを用いた場合の結核菌ゲノムの電気泳動結果を示すものであり、 レーン 1 〜4は、 P f u由来 RNa s eH I Iを用いた場合であり、 レーン 1は铸型 DN
Aが 10 p g、 レーン 2は l p g、 レーン 3は 100 f g、 レーン 4はネガティ ブコントロールの場合である。 さらに、 レーン 5〜8は、 Af u由来RNa s e H I Iを用いた場合であり、 レーン 5は铸型 DNAが 10 p g、 レーン 6は l p g、 レーン 7は 100 f g、 レーン 8はネガティブコントロール、 レーン Mは 1 00 b p DNAラダーマーカーを示す。
図 38に示したように、 いずれの RNa s eHを用いた場合でも 100 f gの 錶型 DNAを用いた場合まで、 目的の増幅断片を検出することができた。 また、 Af u由来 RNa s eHを用いた方が、 増幅産物量が多くなることが確認できた。 さらに、 Af u由来 RNa s eHを用いた方が、 安定した検出感度が得られるこ とを確認した。
(3) K-F— 1033 (68) 及び K_F_ 1 133 (68) プライマーの糸且 み合わせの場合について目的の増幅領域を含むプラスミドを踌型とした場合につ レ、て検討した。 目的の増幅領域を含むプラスミドを調製するためにまず、 配列表 の配列番号 163〜 164記載の塩基配列を有する F 26プライマーと R 131
0プライマーを合成した。 これらのプライマーと BCGワクチン株を用いて PC Rを行い、 得られた増幅産物を p T 7-B 1 u e _τベクター （宝酒造社製） に 導入することにより調製した。 また、 反応条件は、 411の 0 & DNAポリメ ラーゼ用いる以外は、 上記 （2) と同様の反応液組成にした。 その結果、 1 f g まで検出できることを確認した。
(4) 目的の 3本の増幅断片を含むラダー増幅断片を形成する MT I S 2 F及び MT I S 2 Rプライマーの組み合わせの場合と、 目的の 3本の増幅断片が得られ る K—F— 1033 (68) 及び K— F_ 1 133 (68) プライマーの組み合 わせの場合について検出感度を比較した。 対象としては、 結核菌を選択した。 反 応は、 MT I S 2 F及び MT I S 2 Rプライマーの組み合わせの場合は実施例 3
3 (2) の条件で、 K一 F— 1033 (68) 及び K— F— 1 133 (68) プ ライマーの組み合わせについては、 上記 (2) 記載の条件と同様にして行った。 その結果、 いずれの場合においても同じ検出感度が得られることが確認できた。 実施例 36
鍚型ゲノム DN Aの変性を伴わない本発明の増幅方法について検討した。
(1) プラスミド pDON— AI (宝酒造社製） のパッケージング領域の塩基配 列に従って、 配列表の配列番号 165、 166記載の塩基配列を有する、 pDO N-A I - 68— 1及ぴ pDON— A I— 68 _ 2プライマーをそれぞれ合成し た。
(2) それぞれ 10 f g、 1 p gの： DON— AIを含む 1 1の溶液、 あるい は実施例 23で調製した p D O N— A Iを組み込まれた： N I H/ 3 T 3細胞由来 のゲノム DNAそれぞれ l n g、 10 ng、 l O On gを含む 1 μ 1の溶液、 あ るいは陰性対照である 1 μ 1の水に、 上記 (1) のプライマー各 50 pmo 1、 0. 5 mMの d N T P混合液、 32 mM へぺス一水酸化力リゥム緩衝液 ( H 7. 8) 、 l O OmM 酢酸カリウム、 4mM 酢酸マグネシウム、 0. 01% BSA、 10/0DMSO、 18. 5Uの P f u由来 RNa s e H I I、 4Uの B c a BEST DN Aポリメラーゼを含む全量 50 μ 1の反応液を調製した。 この 反応液をサーマルサイクラーにセットし、 64でで 1時間保温した。 反応終了後、 反応液 5 μ 1を 3%ァガロースゲル電気泳動に供し、 増幅産物を確認した。 この 結果を図 39に示す。 図 39において、 レーン Μは 100 b pDNAラダーマー カー、 レーン 1はネガティブコントロール、 レーン 2は pDON— A Iを組み込 んだゲノム DNA 1 n gの場合、 レーン 3は p DON— A Iを組み込んだゲノ ム DNA 10n gの場合、 レーン 4は p DON— A Iを組み込んだゲノム DN A l O On gの場合、 レーン 5は p DON— A I DNA 10 f gの場合、 レーン 6は p DON— A I DNA 1 p gの場合を示す。
図 39に示されるように、 p DON— A I、 p DON— A Iを組み込まれたゲ ノム DNAのいずれにおいても特異的な DNA断片の増幅が確認された。 すなわ ち、 鎳型としてゲノム DNAを用いる場合も、 反応に先立って鎳型 DNAを変性 することなく目的の DN A断片を増幅することが可能であることが確認できた。 実施例 37
本発明の忠実度 （正確性） を L Aテクノロジーを用いたタカラ E X T a q ポリメラーゼ （宝酒造社製） による P C Rと比較した。 まず、 鍚型ブラスミドは 以下のようにして行った。
即ち、 ジーンバンク登録番号 L 20861記載のヒトプロトオンコジーン W n t -5 a遺伝子、 ジーンバンク登録番号 XM—009371記載のリポゾ一マ ルプロテイン S 5遺伝子、 ジーンバンク登録番号 NM—000903記載のヒト NADH遺伝子、 ジーンバンク登録番号 AU077347記載のヒトプロトカド ヘリン 43遺伝子について、 配列表の配列番号 167〜170記載の各々 300 b pの領域を PC Rで増幅した。 この際、 プライマーの 5， 末端に S f i I制限 酵素サイトを付加した特異的プライマーを用いて PCR増幅した。 反応終了後、 該増幅断片を S f i I制限酵素 （宝酒造社製） で処理した。 次に pUC l 9 (宝 酒造社製） を Af 1 I I I制限酵素 （NEB製） と Nd e I制限酵素 （宝製） で 処理後、 ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2 k b ϋのサイズのフラグメントを 抜き出しイージートラップ （宝酒造社製） で回収した。 DN A合成機で配列表の 配列番号 171に記載の DN Aを合成した。 この配列に相補的な DNAも合成し これらの DN Aを熱変性後、 ァニールさせ 2本鎖 DN Aにした。 その 2本鎖 DN Aの末端には A f 1 I I Iと Nd e I制限酵素付着部位を有している。 前述の p UC 19制限酵素処理フラグメントに 2本鎖合成 DNAを DNA L i g a t i o n k i t v e r . 2 (宝酒造社製） を用いて揷入した。 このプラスミドを p I C 62とした。 この p I C 62には I CAN 2プライマー （配列番号 17 2) と I CAN6プライマー （配列番号 173) がァニールする配列を有し、 さ らに S f i I制限酵素サイトも有している。 この p I C62プラスミドを S f i I制限酵素処理したものを調製した。 次に上記 PCR増幅 ZS f i I制限酵素消 化断片をライゲーシヨンキット v e r. 2 (宝酒造社製） を用いてライゲーショ ンし、 大腸菌 JM109 (宝酒造社製） を形質転換した。 この形質転換体を培養 し、 約 300 b pの DNAが挿入されたプラスミドを取得し、 シークェンスの確 認をおこなった後、 本実施例の铸型とした。
(2) I CAN増幅産物の調製は、 以下のようにして行った。 即ち、 上記錄型プ ラスミド l On g、 各 50 pmo 1配列表の配列番号 172、 173記載の I C AN2及ぴ I CAN6 キメラプライマー、 プロピレンジァミン 0. 01%を 含む 10 1の溶液を調製し、 サーマルサイクラ一パーソナルにて 98 °C、 2分 間変性後、 60°C1分間保持してから、 氷上に移した。 次に、 最終濃度 20 mM へぺス一水酸化カリウムバッファー （pH7. 8) 、 10 OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸マグネシウム、 各 500 M dNTP s、 3 OUの大腸菌由来 RNa s eH及び 5. 5Uの B e a BE ST DNAポリメラーゼを添加し、 滅菌水で最終容量を 50 1にした。 該反応液は、 あらかじめ 60DCに設定したサーマルサイクラ一パーソナルにセットし、 60分 間保持した。 反応終了後、 該反応液を 2 % S e a K e m G T Gァガロース （宝 酒造社製） 電気泳動に供した。 電気泳動後、 ァガロースゲルより目的の増幅産物 のバンドを切り出し、 SUPREC— 01 (宝酒造社製） にて回収後、 フエノー ル/ク口口ホルム処理してエタ沈回収した。
•(3) タカラ Exタック DN Aポリメラーゼによる PCR増幅産物の調製は、 以下のようにして行った。 即ち、 上記鎳型プラスミド 10n g、 配列表の配列番 号 174、 175記載の塩基配列を有する I CAN 2 DNAプライマー及ぴ I CAN 6 DNAプライマーを各 10 pmo 1用いてタカラ ExTa q DN Aポリメラーゼ （宝酒造社製） の使用マニュアルに従い反応液を調製した。 該反 応液をサーマルサイクラ一にセットし、 反応温度条件 94 °C 30秒、 55 °C
30秒、 72。C 30秒を 1サイクルとする 30サイクル反応を行つた。 反応終 了後、 該反応液を上記 （2) と同様にァガロース電気泳動に供し、 目的の増幅産 物を M i c r o c o n— 100 (宝酒造製） で回収し、 フエノール/クロ口ホル ム処理してエタ沈回収した。
(4) 上記 （2) 及び （3) で得られた増幅産物は、 以下の方法でサブクロー二 ングした。 即ち、 P e r f e c t l y B l un t C l o n i ng k i t (宝酒造製） を用いてマニュアルに従い、 I CAN増幅産物と PC R増幅産物を pT7 Β 1 u eベクター （宝 造社製） に導入し、 Nov aB l ue S i n g l e s Comp e t e n t Ce l l (宝酒造社製） を形質転換した。 その 形質転換体を各クローンについて 10コロニーずつ選択後、 培養し、 約 0. 4 k bの DNAが揷入されたプラスミドを取得し、 該プラスミド中の挿入断片のシー クエンスを T 7 p r omo t e r p r ime r (宝酒造社製） と M3 p r im e r (宝酒造社製） を用いて行った。
上記シークェンシングで約 16000塩基を解析した結果、 本発明の方法で増 幅したフラグメントとタカラ Exタック DNAポリメラーゼによる PCRで 増幅したフラグメントについて比較したところ、 いずれの方法においても約 25 00塩基に一個の変異が認められた。 すなわち、 本発明の方法は、 忠実度 （正確 性） の高い L A— P C Rと同等の忠実度を有することが確認できた。
実施例 38
(1) PCRによる I CAN反応用テンプレートの作製
マウス脳由来ポリ A+ RNA (Or i Ge n e社製） を用いて、 cDNA合成 キット（宝酒造社製）により二本鎖 c DNAを作製した。 この二本鎖 c DNAを鎳 型として配列表の配列番号 176〜189記載の塩基配列を有するプライマーの 組合せで増幅した各々の P CR断片を、 pT7 B l ue T一 ve c t o r (宝酒造社製） に TAクローニングしてプラスミドクローンを得た。 作製した各 プラスミドクローン （1 n g) 1 μ 1と各 1 0 pmo 1の配列表の配列番号 1 9 0〜1 9 1記載の塩基配列を有する MC S— F及び MC S— Rプライマー、 1. 2 5 Uの E x T a q (宝酒造社製） 、 5 1の 1 O XE xタック b u f f e r (宝酒造ネ： h^) および 0. 2mMの dNTP 合物を含む全量 50 μ 1を T a K a R a P GR Th e rma l C y c l e r P e r s o n a l (宝酒 造社製） を用いて、 94 °Cで 2分間、 続いて 94でで 30秒、 5 5。じで 30秒、 7 2°Cで 1分間を 1サイクルとする反応を 3 0サイクル行い、 得られた DNA増 幅断片を I CAN反応の铸型とした。
(2) PCR産物を錡型にした I CAN法による DNA断片の増幅
I CAN増幅産物にアミノ基をいれるため、 Am i n o a 1 1 y 1 dUTP (シグマ社製） を用いて I CAN反応を行った。 その際、 （1下丁？量と 111 ]： 11 o a 1 1 y 1 dUTP量の割合を 1 0 : 0、 9 : 1、 8 : 2、 7 : 3、 6 : 4 とかえて I CAN反応を行い、 I CAN増幅産物にいれるァミノ基の割合を検討 した。 反応は、 以下のようにして行った。
まず、 上記 （ 1 ) で調製した P C R反応液 Ι μ ΐと各 50 pmo lの配列表の 配列番号 1 9 2、 1 9 3記載の塩基配列を有するプライマー MF 2N 3 (24) と MR 1 N 3 (24) と 2 1の 0. 0 5 %プロピレンジァミン水溶液を含む全 液量 1 0 μ 1を T a Ka R a PCR Th e r ma l C y c l e r P e r s o n a 1を用いて、 98 °Cで 2分間の加熱処理、 続いて 6 5°Cで 30秒、 氷上 で急冷の処理を行い铸型にプライマーをアニーリングさせた。 次に、 熱処理をし た各溶液に各 0. 6 2 5111]^の（1八丁？、 d CTP、 dGTP混合液、 0. 6 2
(1丁丁？+ 111 1 11 0 & 1 1 7 1 dUTP混合液、 3 2mM へぺス
(He p e s ) 一水酸化力リゥム緩衝溶液 (pH 7. 8) 、 5. 0 mM 酢酸マ グネシゥム、 0. 6Uの大腸菌由来 RNa s e H (宝酒造社製） 、 2. 7 5Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼを含む全液量 40 μ 1の反応液を添加し、 サーマルサイクラ一で 6 5 °C、 1時間保温した。
この反応液 5 0 μ 1に 50 1のイソプロパノール、 5 μ 1の 3M 酢酸ナト リゥム溶液 （ ρ Η 5. 2) を添カ卩して一 8 0 °Cで 20分放置後、 遠心して上清除 いた。 続いて 70 %エタノール溶液 200 ^ 1を添加後、 遠心により上清を除 去して風乾した。 得られた DNAを水で再溶解して OD2 6 。 / 2 8 。 を測定し 産物量を求めた。
(3) I CAN増幅産物への Am i n o a 1 1 y 1 dUTP導入の確認
I CAN産物にァミノ基が入っていることの確認は、 5— c a r b o xy f l u o r e s c e i n s u c c i n im i d i 1 e s t e r (モレキュフープ ローブ社製） を用いて I CAN産物のアミノ基を蛍光ラベルすることにより行つ た。 前記 DN A溶液の一部を 2 gZ50 / 1になる様に希釈し、 20 1の 1 Μ 炭酸ナトリウム緩衝液 (ρΗ9. 0 ) を加えた後、 濃度が 10 mMになるよ うに N, N—ジメチルホルムアミドに溶解した F I TC (ナカライテスク社製) を 4 μ 1添カ卩し、 20 で 16時間反応させた。 市販のスピンカラムで過剰な F I TCを除去後、 2. 0%ァガロースゲノレに 10 μ 1アプライして電気泳動を行 つた。 電気泳動後、 FM— B I Οで蛍光色素を確認、 さらに E t B r染色を行い I CAN増幅断片の確認を行った。 その結果、 Am i n o a 1 1 y 1 dひ TP を用いて I CANを行うことで、 I CAN増幅産物にアミノ基を入れることがで きる事が確認できた。 また、 増幅産物に官能基を有する修飾ヌクレオチドと蛍光 標識を組み合わせることにより、 さらに検出感度を向上させることができること を確認した。
(4) デォキシ UTPを用いた本発明の増幅方法について検討した。 対象として 結核菌を選択した。 まず、 ジーンバンク登録番号 A L 123456記載の結核菌 ゲノムの塩基配列に従って配列表の配列番号 194、 195記載の塩基配列を有 する MT I S 2 F— 16プライマー、 MT I S 2 R— AC Cプライマーをそれぞ れ合成した。 該プライマー対で増幅される領域は、 プライマー部を含めて 98 b Pである。 铸型は、 以下のようにして行った。 すなわち、 結核菌ゲノムを配列表 の配列番号 196、 197記載の塩基配列を有する MT I S— PCR— F— 2プ ライマーと MT I S— PCR— R— 2プライマーで PCR増幅した産物を p T 7 B l u e T-V e c t o r (宝酒造社製） に DNA L i g a t i o n k i t Ve r . 2をもちいて揷入し、 該プラスミドを用いて大腸菌 JM109を形 質転換した。 この形質転換体を培養し、 糸勺 400 b pの DNAが導入されたプラ スミドを取得し、 OD260で計算上、 1 ^ 1中に 1 03 コピー含まれる溶液を 調製した。
最終濃度 32mM へぺス一水酸ィ匕カリウムバッファー （pH7. 8) 、 1 0 OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 0 1 %B SA, 4mM 酢酸マグネ シゥム、 500 M dATP、 500 ,αΜ dCTP、 500 dGTP、 dTTP/dUTP混合物 (500 AtM： 0または 400 μΜ： 100 μΜまた は 300 /ίΜ : 200 iMまたは 200 μΜ 300 Μまたは 100 ： 4 00 または 0 : 500 μΜ) 、 各 50 pmo lの MT I S 2 F— 1 6及ぴ MT I S 2R— AACプライマー、 8. 75 Uの A f u由来 RN a s e H、 8 Uの B e a BEST DNAポリメラーゼ、 铸型 103 コピー 1 μ 1を添加し滅 菌水で最終容量を 50 1にした。 該反応液はあらかじめ 60°Cに設定したサー マルサイクラ一パーソナルにセットし、 60分間保持した。 反応終了後、 該反応 液 3 μ 1を 3%ァガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、 どの dTTPZdUTP混合物の比率においても目的の増幅産物が 確認できた。 以上のことから、 修飾ヌクレオチドも本努明の方法の基質として用 いることができることを確認した。
実施例 3 9
本発明の方法において、 ONE— S TE P増幅方法への応用について検討した。 対象としては、 HCVを選択した。
(1) トランスクリプト RNAの調製
まず、 铸型となるトランスクリプト RNAの調製を行った。 インフォームド コンセントの得られた C型肝炎患者の血清 300 μ 1からトライゾール試薬 （ラ ィフテック社製) を使用して該試薬添付の説明書に従い調製し、 最終的に注射用 水 （大塚製薬製） 20 μ 1に溶かした。 この RNAサンプルを鎳型に RT— PC Rを行なった。 反応は以下のようにして行った。 上記 RNAサンプル 2 μ 1と配 列表の配列番号 1 98、 1 99に記載の S P 6—HCV— Fプライマー及び Τ 7 — HCV— Rプライマーのそれぞれ 20 pmo 1を用いて On e -S t e p R NA PCR k i t (宝酒造製） でマ-ユアル通りに反応液量 50 1を調製 した。 サーマルサイクラ一パーソナルにセットし、 50°C 1 5分、 94°C 2 分反応後、 94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 30秒を 1サイクルとし て 40サイクル反応を行った。 反応終了後、 該反応液を 2% S e a P 1 a q u e GTG ァガロースゲルによる電気泳動に供し、 目的増幅産物 3 50 b pを切り 出した。 その後、 EASYTRAP Ve r . 2を用いて該キット添付の説明書 に従い DNAを回収した。 これを铸型に C omp e t i t i V e RNA T r a n s c r i p t i o n キット （宝酒造社製） を用いて該キット添付の説明書 に従いトランスクリプト RNAを合成した。 これを On e_S t e p RT— I CANの検討用铸型とした。
(2) On e-S t e p RT— I CANの検討
上記 （1) で調製したトランスクリプト RNAを OD2 6 。値より計算し、 1 1あたり 1 04 , 1 05 ， 106 , 107 コピーに調製した。 次に最終濃度 3 2mM へぺス一水酸化カリウムバッファー （pH7. 8) 、 1 0 OmM 酢酸 カリウム、 l%DMSO、 0. 0 1%B SA、 4mM 酢酸マグネシウム、 50 0 μΜ dNTP s、 配列表の配列番号 200と 20 1に記載の HCV— A S プライマーと HCV— A Aプライマー各 50 pmo 1、 3011の？ £ 11由来11
Na s eH、 8Uの B c a BE ST DNAポリメラーゼ、 20Uの RNa s e i nh i b i t o r, AMV RT a s e XL (宝酒造製） （ 0、 1、 2. 5、 3又は 5U) 、 各コピー数のトランスクリプト RNA Ι μ ΐを添加した 50 μ 1反応液量を調製した。 該反応液は、 あらかじめ 60°Cに設定したサーマルサイ クラ一パーソナルにセットし、 60分間保持した。 反応終了後、 該反応液 2 μ 1 を 3 %ァガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、 AMV RTa s e (—） の場合、 どの铸型量の時も目的の増幅産 物は確認できなかった。 一方、 AMV RTa s 6 を111添加時は1 07 コ ピーまで、 2. 5U添加時は 1 06 コピー、 3 U添加時は 1 06 コピー、 5U添 加時は 106 コピーまで目的増幅産物が得られた。 また、 反応温度を 57 °Cにし たとき、 AMV RT a s e XLを 2. 5 U添加時に 1 05 コピーまで目的の增 幅産物を確認できた。 また、 1Uの B e a BEST DNAポリメラーゼ、 10 Uの P f u由来 RNa s eHを用いたときは、 AMV RTa s eを無添加でも 1 06 コピーまで目的の増幅産物が確認できた。 産業上の利用の可能性
本発明により、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する D N A合成反 応により標的核酸の塩基配列中の特異的増幅に適した領域を増幅することを特徴 とする標的核酸の増幅方法が提供される。 また、 該標的核酸の増幅方法で得られ た標的核酸の増幅断片を検出する工程を包含することを特徴とする標的核酸の検 出方法が提供される。 また、 本発明の増幅方法は、 他の核酸増幅方法あるいは核 酸複製方法と組み合わせて使用することにより、 効率的な核酸配列の製造方法と して利用できる。 また、 本発明によりウィルス、 細菌、 カビ、 酵母などの微生物、 特に病原性微生物等の高感度、 特異的検出、 定量のための標的核酸の検出方法及 ぴ該方法のためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーが提供される。 さらに、 本 明により自動化、 微量化、 高集積化された核酸の増幅、 検出システムが提供 される。 配列表フリーテキスト
SEQ ID NO: 1： PGR primer BsuII - 3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a R aseHII activity from Bacillus
caldotenax.
SEQ ID NO: 2： PCR primer BsuII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus
caldotenax.
SEQ ID NO: 3： PCR primer RNII-S1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus
caldotenax.
SEQ ID NO: 4: PCR primer RNII - S2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus
caldotenax.
SEQ ID NO: 5 : PCR primer RNII— S5 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 6 : PCR primer RNII-S6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID N0: 7: PCR primer RNII-Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID N0:8 : Nucleotide sequence of ORF in RNaseHII gene from Bucillus caldotenax.
SEQ ID NO: 9 : Amino acid sequence of RNaseHII from
Bucillus caldotenax.
SEQ ID NO: 10 : PCR primer BsuIII 1 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 11： PCR primer BsuIII-3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 12 : PCR primer BsuIII-6 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 13: PCR primer BsuIII— 8 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 14: PCR primer RNIII- S3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 15 : PCR primer BcaRNIII- 3 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax. SEQ ID NO: 16: Nucleotide sequence of ORF in RNaseHIII from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 17: Amino acid sequence of RNaseHIII from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 18: PCR primer BcaRNIIINde for amplifying a gene encoding a polypeptide having a RNaseHIII activity from Bacillus caldotenax.
SEQ ID NO: 19: Nucleotide sequence conserving between PH1650 and a portion of Pyrococcus furiosus genome sequence.
SEQ ID NO: 20： PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus.
SEQ ID NO: 21 : PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus.
SEQ ID NO：22： Nucleotide sequence of ORF in RNaseHII from Pyrococcus furiosus.
SEQ ID NO : 23 : Amino acid sequence of RNaseHII from Pyrococcus furiosus.
SEQ ID NO: 24： PCR primer 915 - Fl for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Therraotoga maritima.
SEQ ID NO：25： PCR primer 915-F2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO: 26: PCR primer 915-Rl for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO : 27: PCR primer 915-R2 for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO: 28 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 150 to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 24 to 25 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 29: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MR1N3 to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 28 to 30 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides'1
SEQ ID NO: 30 : Designed oligonucleotide primer
designated as M13M4
SEQ ID NO: 31 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 1— encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 32 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 1— encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 33 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides lb to 18 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 34: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic
Escherichia coli 0-157. "nucleotides lb to 18 are ribonucleotides other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 35 : Designed oligonucleotide primer
designated as MCR—F to amplify a long DNA fragment SEQ ID NO: 36 : Designed oligonucleotide primer designated as MCR-R to amplify a long DNA fragment
SEQ ID NO: 37: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MF2N3 (24) to amplify a long DNA fragment, "nucleotides 22 to 24 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 38: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MR1N3 (24) to amplify a long DNA fragment, "nucleotides 22 to 24 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 39 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. "nucleotides 18 to 20 are
ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0:40: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. "nucleotides 18 to 20 are
： ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 41 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA
SEQ ID NO :42 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA
SEQ ID NO :43 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. "nucleotides 18 to
20 are ribonuc丄 eotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 44: esigned chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. "nucleotides 18 to 20 are ribonuc丄 eotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0:45 : Designed oligonucleotide primer to ampliiy a portion of
avobacterium species DNA.
SEQ ID N0:46: Designed oligonucleotide primer to amp丄 liy a portion of Flavobacterium species DNA.
SEQ ID NO : 47 : esigned chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0 : 48 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0 - 1D7. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 9： Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
SEQ ID N0 : 50 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
SEQ ID NO : 51 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 52 : Designed chimeric oligonucleotide primer to ampl ify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 53 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic
Escherichia coli 0- lo nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 54 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2— encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
SEQ ID NO: 55 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
^EQ ID NO : 56 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. "nucleotides 18 to 20 are
ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0: 57: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.
SEQ ID NO : 58 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.
SEQ ID NO : 59 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 60: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
¾EQ ID NO: 61 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. "nucleotides 18 to 20 are ribonuc丄 eotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 62: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA. nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO :63 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Flavobacterium species DNA, "nucleotides 18 to
20 are ribonucleotides other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 64: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0—157. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides— nucloetide 18 is inosine - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0: 65: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0—157. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides- nucleotide 17 is inosine other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0: 66: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides- nucleotide 16 is inosine - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 67: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- nucleotide 17 is inosine - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0: 68: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic
Escherichia coli O-Ιο . "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- nucleotide 16 is inosine- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0: 69: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2 - encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- nucleotide 15 is inosine- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 70: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 9 to 11 and 19 to 21 are
： ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 71 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157· "nucleotides 8 to 10 and 18 to 20 are
ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO: 72 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2— encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 73 : Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifing a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
^EQ ID NO: 74: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS- encoding sequence from mouse, "nucleotides 18 to 20 are ribonuc丄 eotides— other nucleotides are deoxyribonuc丄 eotides"
SEQ ID NO: 75 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS— encoding sequence from mouse, "nucleotides 17 to 19 are ribonuc丄 eotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 76 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS— encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO : 77 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS- encoding sequence from mouse
SEQ ID NO: 78 : Designed oligonucleotide primer
designated as GMO- PCR- F 20mer
SEQ ID NO: 79 : Designed oligonucleotide primer
designated as GMO- PCR R 20mer
SEQ ID N0: 80: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as GMO - SI 20mer. "nucleotides 19 to 20 are ： ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 81 : Designed oligonucleotide primer
designated as GM0-S2 20mer. "nucleotides 19 to 20 are ： ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 82 : Designed oligonucleotide primer
designated as GMO— Al 20mer. "nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 83 : Designed oligonucleotide primer
designated as GMO - A2 20 mer. "nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 84 : Designed chimeric oligonucleotide primer to ampl ify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are (alpha - thio) ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0 : 85 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of vero toxin 2- encoding sequence from hemorrhagic
Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are (alpha- thio) ribonuc丄 eotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0 : 86 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of IN0S- encoding sequence from mouse. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0 : 87 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS - encoding sequence from mouse. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N0 : 88 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of IN0S - encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO : 89 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion oi 丄 N0S- encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO : 90 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. "nucleotides 18 to 20 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO: 91 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of lambda DNA. "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 92 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS - encoding sequence from mouse. "nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides51
SEQ ID NO: 93 : Designed cnimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of INOS - encoding sequence from mouse. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO-94: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON-AI DNA. "nucleotides 17 to 19 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 95 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON- AI DNA. "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 96 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HPV DNA. "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO :97: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HPV DNA. "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 98 : Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifing a portion of HPV DNA.
SEQ ID NO: 99 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV.
SEQ ID NO: 100 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV.
SEQ 丄 D NO: 101 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV, "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 102 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of HCV. "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO: 103: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifing portion of HCV.
SEQ ID NO: 104: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus, "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 105: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus, "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 106: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus, "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 107 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus
SEQ ID NO: 108: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus.
SEQ ID NO: 109: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.
SEQ ID NO: 110: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.
SEQ ID NO: 111 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON- AI DNA.
SEQ ID NO : 112: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of pDON-AI DNA.
SEQ ID NO: 113: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-l encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0 - 157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 114: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-1 encoding sequence from Hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 115: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of verotoxin- 1 encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157.
SEQ 丄 D NO: 116 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of botulinum toxin A encoding sequence from
Clostridium botulinum. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 117: Designed chimeric oligonucleotide primer to amp丄 ity a portion of botulinum toxin A encoding sequence from
し上 ostridium botulinum. "nucleotides 21 to 23 are ： ribonucleotides一 other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 118: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of botulinum toxin A encoding sequence from Clostridium botulinum.
SEQ ID NO: 119: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. "nucleotides 19 to 21 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 120 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. "nucleotides 18 to 20 are
ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 121 : Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of viroid CSVd.
SEQ ID NO: 122 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. "nucleotides 19 to 21 are
： ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 123 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 124: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.
SEQ ID NO: 125 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of viroid CSVd.
SEQ ID NO: 126: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of c - ki— ras oncogene. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 127: Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of c- ki- ras oncogene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO : 128 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of c- ki - ras oncogene.
SEQ ID NO: 129 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of c— ki— ras oncogene.
SEQ ID NO: 130 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-l encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0 - ID " nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 131 : Designed chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of verotoxin-l encoding sequence from hemorrhagic Escherichia coli 0-157. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 132 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of IN0S - encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 133 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of IN0S - encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 134: Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 150 to amplify a portion of plasmid pUC19. SEQ ID NO: 135 : Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 lower NN to amplify a portion of plasmid pUC19.
SEQ ID NO: 136: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as SEA - 1 to amplify a portion of Staphylococcus aureus.
"nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 137: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as SEA- 2 to amplify a portion of Staphylococcus aureus, "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 138 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV - F3 to amplify a portion of HCV. "nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 139: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV—Rl to amplify a portion of HCV. "nucleotides 16 to 18 are ； ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 140 : Designed oligonucleotide primer designated as MF2 to amplify a portion of pUC19 plasmid DNA.
SEQ ID NO: 141 : Designed oligonucleotide primer designated as MRl to amplify a portion of pUC19 plasmid DNA.
SEQ ID NO: 142 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of adenovirus.
SEQ ID NO: 143: Nucleotide sequence of ORF in RNaseHII gene from Thermotoga maritima.
SEQ ID NO: 144： Amino acid sequence of RNaseHII from
Thermotoga maritima.
SEQ ID NO: 145: Nucleotide sequence of PH1650 from Pyrococcus horikoshii.
SEQ ID NO: 146： PCR primer PhoNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii
SEQ ID NO: 147: PCR primer PhoBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii
SEQ ID NO: 148： Nucleotide sequence of ORF in RNaseHII gene from Pyrococcus horikoshii.
SEQ ID NO: 149 : Amino acid sequence of RNaseHII from Pyrococcus horikoshii.
SEQ ID NO: 150: Nucleotide sequence of AF0621 from
Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO: 151： PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO: 152 : PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO: 153 : Nucleotide sequence of ORF in RNaseHII gene from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO: 154: Amino acid sequence of RNaseHII from
Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO: 155 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2F to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides.〃.
SEQ ID NO: 156 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2R to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides. . SEQ ID NO: 157 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as CT2F to amplify a portion of Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides. ff .
SEQ ID NO: 158 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as CT2R to amplify a portion of Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA. "nucleotides 16 to 18 are： ribonucleotides other nucleotides are deoxyribonucleotides. " .
SEQ ID NO: 159 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K-F- 1033 (60) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides.〃.
SEQ ID NO: 160 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K-R- 1133 (62) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides.〃.
SEQ ID NO: 161 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K-F 1033 (68) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides.〃.
SEQ ID NO: 162 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as K - R- 1133 (68) to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNAノ, nucleotides 20 to 22 are： ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides,
SEQ ID NO: 163 : Designed oligonucleotide primer
designated as F26 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA.
SEQ ID NO: 164: Designed oligonucleotide primer
designated as R1310 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA. SEQ ID NO: 165 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as pDON-AI- 68 - 1 to amplify a portion of pDON-AIノ， nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides- other nucleotides are
deoxyribonucleotides.〃.
^EQ ID NO: 166 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as pDON - AI-68 - 2 to amplify a portion of pDON-AI. "nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides— other nucleotides are
deoxyribonucleotides.〃.
SEQ ID NO: 167: Nucleotide sequence of Homo sapiens proto— oncogene Wn t— 5a
SEQ ID NO: 168 : Nucleotide sequence of Homo sapiens ribosomal protein S5
SEQ ID NO: 169 : Nucleotide sequence of Homo sapiens diaphorase
SEQ ID NO: 170 : Nucleotide sequence of Human
protocadherin
SEQ ID NO: 171 : Designed oligonucleotide for making of pIC62.
SEQ ID NO: 172: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as Iし AN2. "nucleotides 19 to 20 are ribonuc丄 eotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides. ·
SEQ ID NO: 173 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as ICAN6ノ， nucleotides 19 to 20 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides. " ,
SEQ 丄 D NO: 174: Designed oligonucleotide primer designated as ICAN2 DNA.
SEQ iD NO: 175 : Designed oligonucleotide primer designated as ICAN6 DNA.
SEQ ID NO: 176: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ribosomal protein S18- encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 177: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ribosomal protein S18 - encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 178: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of transferrin receptor (TFR) -encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 179: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of transferrin receptor (TFR) -encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 180: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of stromal cell derived factor 4 (Sdf 4) -encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 181 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of stromal cell derived factor 4 (Sdf 4) -encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 182 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of cytoplasmic beta-act in encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 183 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of cytoplasmic beta-act in encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 184: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ornitnme decarboxylase— encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 185 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of ornithine decarboxylase - encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 186: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) -encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 187 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) -encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 188 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of tyrosine 3-monooxygenase encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 189: Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of tyrosine 3-monooxygenase encoding sequence from mouse.
SEQ ID NO: 190: Designed oligonucleotide primer
designated as MCS— F.
SEQ ID NO : 191 : Designed oligonucleotide primer
designated as MCS- R
SEQ ID NO: 192 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MF2N3 (24) . "nucleotides 22 to 24 are ribonucleoitdes - other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID NO : 193 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MR1N3 (24) . nucleotides 22 to 24 are ribonucleoitdes - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 194: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2F- 16 to amplify a portion of Mycobacterium
tuberculosis DNA. "nucleotides 14 to 16 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO: 195: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MTIS2R- ACC to amplify a portion of Mycobacterium
tuberculosis DNA. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides.〃
SEQ ID NO: 196: Designed oligonucleotide primer
designated as MTIS - PCR-F- 2 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA SEQ ID NO: 197: Designed oligonucleotide primer designated as MTIS - PCR- R - 2 to amplify a portion of Mycobacterium tuberculosis DNA
SEQ ID NO: 198 : Designed oligonucleotide primer designated as SP6- HCV- F to amplify a portion of HCV
SEQ ID NO: 199 : Designed oligonucleotide primer designated as SP6 - HCV- R to amplify a portion of HCV
SEQ ID N0:200: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV- A S to amplify a portion of HCV. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides.
SEQ ID NO: 201 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV - A A to amplify a portion of HCV. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides.

Claims

請 求 の 範 囲
1. 核酸を増幅する方法において、
(a) 錶型となる核酸、 デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有す る DNAポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 および RNa s e Hを 混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、 铸型となる核酸の 塩基配列に実質的に相補的であり、 少なくともデォキシリポヌクレオチド及ぴヌ クレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、 該リボ ヌクレオチドは該プライマーの 3 ' 末端又は 3 ' 末端側に配置されたキメラオリ ゴヌクレオチドプライマ一であり ；および、
(b) 反応産物を生成するのに充分な時間、 反応混合物をインキュベートするェ 程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
2. さらに鎳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオ リゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用することを特徴とする 請求項 1記載の核酸の増幅方法。
3. 核酸を増幅する方法において、
(a) 鎳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも 1種類 のプライマーと DNAポリメラーゼにより処理して該鎳型に相補的なプライマー 伸長鎖を合成し、 二本鎖核酸を合成する工程；ここで該プラィマーは少なくとも デォキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボ ヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該リ ポヌクレオチドは該プライマーの 3 ' 末端又は 3， 末端側に配置され、
(b) RNa s eHの存在下、 前記工程で得られる二本鎖核酸を鎳型とし、 鎖置 換活性を有する DNAポリメラーゼによって錶型に相補的な核酸配列を伸長して 鎖置換を行い、 置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；および、
(c) (b) 工程で得られる二本鎖核酸が錶型として （b) 工程に再利用される 工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
4. 少なくとも 2種類のプライマーを使用する、 核酸を増幅する方法において、 ( a ) 铸型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも 1種類 のプライマーと DNAポリメラ ゼにより処理して該鏡型に相補的なプライマー 伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキシリポヌクレ ォチド及ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含 有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一であって、 該リポヌクレオチドは該 プライマーの 3， 末端又は 3 ' 末端側に配置され；
(b) RNa s eHの存在下、 前記工程で得られる二本鎖核酸を铸型とし、 鎖置 換活性を有する DNAポリメラーゼによって鎳型に相補的な核酸配列を伸長して 鎖置換を行レヽ、 置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；
(c) (b) 工程で得られる二本鎖核酸が錶型として （b) 工程に再度利用され る工程；
(d) (b) 工程で得られる置換鎮を鎳型として （a) 工程で使用されたプライ マーとは異なる少なくとも 1種のプライマーと DNAポリメラーゼにより処理し て、 置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該 （a) 工程で 使用されたプライマーとは異なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補 的で、 少なくともデォキシリポヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択 されるものとリポヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ 一であって、 該リボヌクレオチドは該プライマーの 3' 末端又は 3， 末端側に配 置され；
(e) RNa s e Hの存在下、 前記工程で得られる二本鎖核酸を鍚型とし、 鎖置 換活性を有する DNAポリメラーゼによって鎳型に相補的な核酸配列を伸長して 鎖置換を行い、 置換鎖とニ本鎮核酸を合成する工程；および、
(f ) (e) 工程で得られる二本鎖核酸が鍀型として （e) 工程に再度利用され る工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
5. DNAポリメラーゼが鎖置換活性を有する少なくとも 1種の DNAポリメ ラーゼである請求項 3又は 4に記載の核酸の増幅方法。
6. 核酸を増幅する方法において、 ( a ) 錶型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2種 類のプライマーと鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼにより処理して該铸型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァニーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリボヌクレオチド及ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該リボヌク レオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、
( b ) ( a ) 工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリポヌクレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
( c ) ( b ) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼに よって鍚型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 铸型とプライマー伸長 鎖より成る二本鎖核酸を得る工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
7 . 核酸を増幅する方法において、
( a ) 鍚型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相捕的な 2種 類のプライマーと鎖置換活十生を有する D N Aポリメラーゼにより処理して該铸型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァユーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリボヌクレオチド及ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌタレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該リポヌク レオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、
( b ) ( a ) 工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌタレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
( c ) ( b ) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3 ' 末端より、 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼに よつて铸型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行レ、、 プライマー伸長鎖がァ ニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
8. 核酸を増幅する方法において、
( a ) 鏡型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な 2種 類のプライマーと鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼにより処理して該鎳型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァニーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一であって、 該リボヌク レオチドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され、
(b) (a) 工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌタレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；
(c) (b) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼに よって鎳型に相捕的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 プライマー伸長鎖同士 がアニーリングした二本鎖核酸、 および鎳型同士がアニーリングした二本鎖核酸 に （a) 工程の 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
(d) (c) 工程で得られる 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸の それぞれのプライマー部分の 3' 末端より、 鎖置換活 'I生を有する DN Aポリメラ ーゼによって铸型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 プライマー伸長 鎖同士がァニーリングした二本鎖核酸、 および錶型同士がアニーリングした二本 鎖核酸に （a) 工程の 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得るェ 程；および、
(e) (d) 工程で得られる 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸が (d) 工程で再利用される工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
9. 核酸を増幅する方法において、
( a ) 鎳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相捕的な 2種 類のプライマーと鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼにより処理して該铸型 に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、 合成されたプライマー伸長鎖がァニーリ ングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、 少なくともデォキ シリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌタレ ォチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該リポヌク レオチドは該プライマーの 3' 末端又は 3' 末端側に配置され、
(b) (a) 工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレ ォチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；
(c) (b) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞ れのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼに よって铸型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 プライマー伸長鎖同士 がアニーリングした二本鎖核酸、 および铸型同士がアニーリングした二本鎖核酸 に （a) 工程の 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
(d) (c) 工程で得られる 2種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸の それぞれのプライマー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DN Aポリメラ ーゼによつて铸型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、 錶型とプライマ 一伸長鎖よりなる二本鎖核酸を得る工程；
(e) (d) 工程で得られる鎵型とプライマー伸長鎖よりなる二本鎖核酸のリボ ヌクレオチド含有部位をェンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
( f ) (e) 工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプライ マー部分の 3， 末端より、 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼによって铸型 に相補的な核酸配列を伸長して置換鎖を合成する工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
10. エンドヌクレアーゼがエンドリボヌクレア一ゼである請求項 6〜 9いず れか 1項に記載の核酸の増幅方法。
11. エンドリボヌクレアーゼが RN a s e Hである請求項 10に記载の核酸 の増幅方法。
12. RNa s e Hが大腸菌 (E s c h e r i c h i a c o l i) 由来 RN a s eH、 サーモトガ （Th e r mo t o g a) 属細菌由来 RNa s e H、 サー マス （Th e r ma s) 属細菌由来 RNa s e H、 ピロコッカス （Py r o c o e c s) 属細菌由来 RNa s eH、 アルカェォグロバス （Ar c h a e o g l o b u s) 属細菌由来 RN a s e H、 及ぴバチルス （B a c i l l u s) 属細菌 由来 RNa s eHから選択される RNa s eHである請求項 1〜5、 1 1いずれ か 1項に記載の核酸の増幅方法。
1 3. 核酸の増幅領域が 200 b p以下であることを特徴とする請求項 1〜 1 2のいずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
14. 下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いるこ とを特徴とする請求項 1〜 1 3いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
一般式： 5' - dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリポヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及びノ又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよく、 3'末端のヌクレオチドは当該末端からの DN A ポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
1 5. cが 0である請求項 14に記載の核酸の増幅方法。
1 6. ヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 あるいは デォキシリポウラシ^/ヌクレオチドであり、 修飾リポヌクレオチドが （α— S) リボヌクレオチドである請求項 14又は 1 5に記載の核酸の増幅方法。
1 7. 請求項 1 4〜； 1 6いずれか 1項に記載のキメラオリゴヌクレオチドプラ イマ一に適した DN Α伸長反応温度で DN Α伸長反応を行うことを特徴とする請 求項 14〜 1 6いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
1 8. 铸型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相捕的なキメラオリゴヌ クレオチドプライマ一を、 当該核酸と当該プライマーのァニーリングを増強する 物質を含有するアニーリング溶液中でアニーリングさせる工程を包含することを 特徴とする請求項 1〜 1 7いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
1 9. スぺノレミジン及び Z又はプロピレンジァミンを含有するアニーリング溶 液が使用される請求項 1 8に記載の核酸の増幅方法。
20. アニーリング処理が、 铸型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相 捕的なキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を含有するアニーリング溶液を 9 0°C以上で保温した後、 増幅反応が実施される温度以下に冷却して行われること を特徴とする請求項 1 8又は 1 9に記載の核酸の増幅方法。
21. ビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成分を含有する緩衝液中で増 幅反応が実施されることを特徵とする請求項 1〜 20いずれか 1項に記載の核酸 の増幅方法。
22. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼとして、 大腸菌由来の DNAポ リメラーゼ Iのタレノウ断片、 バチルス ステアロサーモフィラス （B a c i 1 1 u s s t e a r o t he rmo p h i l u s; 由来の 5， → 3■ ェキソヌク レアーゼ欠損 B s t DNAポリメラーゼ、 およびバチルス カルドテナックス
(Ba c i 1 1 u s c a r d o t e na ) 由来の 5 ' →3 ' ェキソヌクレア ーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼからなる群から選択される DNAポリメラー ゼが使用される請求項 1〜 21いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
23. 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼと RN a s e Hがバチルス 力 ノレドテナックス由来の 5' →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラ ーゼと大腸菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌 由来からなる群から選択される RNa s eHの組み合わせであることを特徴とす る請求項 1〜 5、 11〜 22レ、ずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
24. RNa s eHが大腸菌由来 I型 RNa s eH、 ピロコッカス属細菌由来 又はアルカェォグロパス属細菌由来 I I型 RNa s eHである請求項 23に記载 の核酸の増幅方法。
25. エンドヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラーゼが使用される請求 項 1〜 24レ、ずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
26. DN Aポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の 5， →3， ェ キソヌクレアーゼ欠損 B c a DN Aポリメラーゼであり、 当該 B c a DNAポリ メラーゼのェンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質の存在下に当該 B c a DN Aポリメラーゼを使用する請求項 25に記載の核酸の増幅方法。
27. DNAポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質がマン ガンイオンである請求項 26に記載の核酸の増幅方法。
28. DN Aポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質の存在下で増幅反応が 実施される請求項 1〜 27のいずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
29. DN Aポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質がホスホノギ酸である 請求項 2 8に記載の核酸の増幅方法。
3 0 . 铸型となる核酸が一本鎖または二本鎖の DNAである請求項 1〜 2 9の いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
3 1 . 鍀型となる二本鎖 D NAを一本鎖 D NAにする工程の後に実施されるこ とを特徴とする請求項 3 0に記載の核酸の増幅方法。
3 2. 鍚型となる核酸が R NAを鑄型とする逆転写反応によって得られた c D N Aである請求項 3 0又は 3 1に記載の核酸の増幅方法。
3 3 . R NAを铸型とする逆転写反応によって c DNAを合成する工程の後に 実施されることを特徴とする請求項 3 2に記載の核酸の増幅方法。
3 4. 逆転写酵素として逆転写酵素活性を有する D N Aポリメラーゼを使用す ることを特徴とする請求項 3 2又は 3 3に記載の核酸の増幅方法。
3 5 . 逆転写反応と铸型に相捕的な伸長鎖の合成とが、 逆転写酵素活性と鎖置 換活性とを有する 1種の D N Aポリメラーゼにより実施されることを特徴とする 請求項 3 1〜 3 4のいずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
3 6 . D NAポリメラーゼが、 バチルス ステアロサーモフィラス由来の 5，
→3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B s t D NAポリメラーゼ、 もしくは、 バチルス カノレドテナックス由来の 5， →3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a D NAポリ メラーゼであることを特徴とする請求項 3 5記載の核酸の増幅方法。
3 7. 核酸の増幅反応が等温で行われることを特徴とする請求項 1〜 3 6のい ずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
3 8 . デォキシリボヌクレオチド 3リン酸のアナログの存在下に実施されるこ とを特徵とする請求項 1〜 3 7のいずれか 1項に記載の核酸の増幅方法。
3 9. デォキシリポヌクレオチド 3リン酸のアナログとして、 デォキシゥリジ ン 3リン酸またはその誘導体が使用される請求項 3 8記載の核酸の増幅方法。
4 0. 核酸増幅用組成物であって、
( a ) 铸型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相捕的な少なくとも 1種類 のプライマー；ここで該プライマーは、 少なくともデォキシリボヌクレオチド及 ぴヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキ メラオリゴヌクレオチドプライマーであって、 該リポヌクレオチドは該プライマ 一の 3 ' 末端又は 3 ' 末端側に配置されている、
( b ) エンドヌクレアーゼ；および、
( c ) 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物。
4 1 . 核酸増幅用組成物であって、
( a ) 鎳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な少な くとも 2種類のプライマー；ここで該プライマーは、 少なくともデォキシリポヌ クレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチド とを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一であって、 該リボヌクレオチ ドは該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側に配置され；
( b ) ェンドヌクレアーゼ；
( c ) 鎖置換活性を有する D NAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物。
4 2. 錶型となる核酸、 デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有 する D NAポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 およびエンドヌクレ ァーゼを混合して得られる核酸増幅用組成物；ここで該プライマーは、 鍚型とな る核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、 少なくともデォキシリボヌクレオチ ド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、 該リボヌクレオチドは該プライマーの 3 ' 末端又は 3， 末端側に配置されたキメ ラオリゴヌクレオチドプライマーである。
4 3 . 錶型となる核酸、 デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有 する D N Aポリメラーゼ、 少なくとも 2種類のプライマー、 およびエンドヌクレ ァーゼを混合して得られる核酸増幅用組成物；ここで該プライマーは、 鏺型とな る二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相捕的であり、 少なくともデ ォキシリポヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌ クレオチドとを含有し、 該リボヌクレオチドは該プライマーの 3 ' 末端又は 3， 末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマ一である。
4 4 . プライマーが下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマ 一であることを特徴とする請求項 4 0〜4 3いずれか 1項に記載の核酸増幅用組 成物。
一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリポヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及び/又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよく、 3'末端のヌクレオチドは当該末端からの DN A ポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
45. cが 0である請求項 44に記載の核酸増幅用組成物。
46. ヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 あるいは デォキシリボウラシ ヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが （a— S) リボヌクレオチドである請求項 44又は 45に記載の核酸増幅用組成物。
47. 核酸の増幅反応に適した緩衝成分を含有する請求項 40 ~ 46レ、ずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
48. ビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成分を含有する請求項 47に 記載の核酸増幅用組成物。
49. 鎖置換活性を有する DN Αポリメラーゼとして、 大腸菌由来の DNAポ リメラーゼ Iのクレノゥ断片、 バチルス ステアロサーモフィラス由来の 5' → 3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B s t DNAポリメラーゼ、 およびバチルス カル ドテナックス由来の 5' →3 ' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラー ゼからなる群から選択される DNAポリメラーゼが使用される請求項 40〜48 いずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
50. エンドヌクレアーゼがエンドリボヌクレアーゼである請求項 40〜49 いずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
51. ェンドリポヌクレアーゼが RN a s e Hである請求項 50に記載の核酸 増幅用組成物。
52. RN a s eHが大腸菌由来RNa s e H、 サーモトガ属細菌由来 RN a s eH、 サーマス属細菌由来 RN a s e H、 ピロコッカス属細菌由来 RN a s e H、 アルカェォグロバス属細菌由来 RN a s eH、 及びバチルス属細菌由来 RN a s eHから選択される RNa s eHである請求項 51記載の核酸増幅用組成物。
53. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼとェンドヌクレアーゼがバチル ス カルドテナックス由来の 5' →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポ リメラーゼと大腸菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス 属細菌由来からなる群から選択される RNa s eHの糸且み合わせであることを特 徴とする請求項 40〜 52のいずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
54. RNa s eHが大腸菌由来 I型 RNa s eH、 ピロコッカス属細菌由来 又はアルカェォグロバス属細菌由来 I I型 RNa s eHである請求項 53に記載 の核酸増幅用糸且成物。
55. エンドヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラーゼが使用される請求 項 40〜 54レ、ずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
56. DNAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の 5 ' →3， ェ キソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼであり、 当該 B c a DNAポリ メラーゼのェンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質を含有する請求項 55に記 載の核酸増幅用組成物。
57. DNAポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質がマン ガンイオンである請求項 56記載の核酸増幅用組成物。
58. DNAポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質を含有する請求項 40 〜 57のいずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
59. DNAポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質がホスホノギ酸である 請求項 58に記載の核酸増幅用組成物。
60. デォキシリボヌクレオチド 3リン酸のアナ口グを含有する請求項 40〜 59のいずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
61. デォキシリボヌクレオチド 3リン酸のアナ口グがデォキシゥリジン 3リ ン酸またはその誘導体である請求項 60記載の核酸増幅用組成物。
62. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法に使用する核酸増幅 用組成物であって、
(a) RN a s e H；および、
(b) 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物。
6 3 · 請求項 6〜 9いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法に使用する核酸増幅 用組成物であって、
(a) エンドヌクレアーゼ；および、
(b) 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物。
64. ェンドヌクレアーゼがェンドリボヌクレアーゼである請求項 6 3記載の 核酸増幅用組成物。
6 5. エンドリボヌクレアーゼが RN a s eHである請求項 64記載の核酸増 幅用組成物。
6 6. RNa s eHが大腸菌由来 RNa s eH、 サーモトガ属細菌由来 RNa s eH、 サーマス属細菌由来 RN a s e H、 ピロコッカス属細菌由来 RN a s e H、 アルカェォグロバス属細菌由来 RN a s eH、 及ぴバチルス属細菌由来 RN a s eHから選択される RNa s eHである請求項 62又は 65に記載の核酸増 幅用組成物。
6 7. 核酸増幅反応に適した緩衝成分を含有する請求項 62〜 66レ、ずれか 1 項に記載の核酸増幅用組成物。
68. ビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成分を含有する請求項 6 7に 記載の核酸増幅用組成物。
6 9. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼとして、 大腸菌由来の DNAポ リメラーゼ Iのクレノウ断片、 バチルス ステアロサーモフィラス由来の 5， → 3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B s tDNAポリメラーゼ、 およびバチルス カル ドテナックス由来の 5，→3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラー ゼからなる群から選択される DNAポリメラーゼが使用される請求項 62〜68 いずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
70. 鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼと R N a s e Hがバチルス 力 ルドテナックス由来の 5，→3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラ ーゼと大腸菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌 由来からなる群から選択される RNa s eHの組み合わせであることを特徴とす る請求項 62に記載の核酸増幅用組成物。
71. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼとェンドヌクレアーゼがバチル ス カルドテナックス由来の 5， →3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポ リメラーゼと大腸菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロパス 属細菌由来からなる群から選択される RN a s eHの組み合わせであることを特 徴とする請求項 63に記載の核酸増幅用組成物。
72. エンドヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラーゼが使用される請求 項 62〜 71いずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
73. DNAポリメラーゼがバチルス 力ノレドテナックス由来の 5 ' →3， ェ キソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼであり、 当該 B c a DNAポリ メラーゼのェンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質を含有する請求項 72に記 載の核酸増幅用組成物。
74. DNAポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質がマン ガンイオンである請求項 73に記載の核酸増幅組成物。
75. DNAポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質を含有する請求項 62 〜 74のいずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
76. DNAポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質がホスホノギ酸である 請求項75に記載の核酸増幅用組成物。
77. デォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログを含有する請求項 62〜76 のいずれか 1項に記載の核酸増幅用組成物。
78. デォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログがデォキシゥリジン 3リン酸 またはその誘導体である請求項 77記載の核酸増幅用組成物。
79. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法に使用する核酸増 用キットであって、
(a) RNa s eH；および、
(b) 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用キット。
80. 請求項 6〜 9いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法に使用する核酸増 Φ; 用キットであって、
(a) エンドヌクレアーゼ；および、 (b) 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用キット。
8 1. ェンドヌクレアーゼがェンドリボヌクレアーゼである請求項 8 0記載の 核酸増幅用キット。
8 2. エンドリポヌクレアーゼが RNa s e Hである請求項 8 1記載の核酸増 幅用キット。
8 3. RN a s eHが大腸菌由来 RNa s eH、 サーモトガ属細菌由来 RN a s e H、 サーマス属細菌由来 RN a s e H、 ピロコッカス属細菌由来 RN a s e H、 アルカェォグロパス属細菌由来 RNa s eH、 及びバチルス属細菌由来 RN a s e Hから選択される RN a s e Hである請求項 7 9又は 8 2に記載の核酸増 幅用キット。
84. 核酸増幅反応に適した緩衝液を含有する請求項 7 9〜 8 3いずれか 1項 に記載の核酸増幅用キット。
8 5. ビシン、 およびへぺスから選択される緩衝成分を含有する核酸増幅用緩 衝液を含有する請求項 84に記載の核酸増幅用キット。
8 6. 錶型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相捕的なプライマーのァ ニーリングを増強する物質を含有するアニーリング溶液を含有する請求項 7 9〜 8 5記載の核酸増幅用キット。
8 7. スペルミジンおよび Z又はプロピレンジァミンを含有するアニーリング 溶液である請求項 86に記載の核酸増幅用キット。
8 8. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼとして、 大腸菌由来の DNAポ リメラーゼ Iのクレノゥ断片、 バチルス ステアロサーモフィラス由来の 5，→ 3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B s t DNAポリメラーゼ、 およびバチルス カル ドテナックス由来の 5，→3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DN Aポリメラー ゼからなる群から選択される DNAポリメラーゼが使用される請求項 7 9〜8 7 レ、ずれか 1項に記載の核酸増幅用キット。
8 9. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼと RN a s e Hがバチルス 力 ルドテナックス由来の 5，→3， ェキソヌクレア一ゼ欠損 B c a DNAポリメラ ーゼと大腸菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌 由来からなる群から選択される RN a s eHの組み合わせであることを特徴とす る請求項 79に記載の核酸増幅用キット。
90. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼとェンドヌクレアーゼがバチル ス カルドテナックス由来の 5 ' →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DN Aポ リメラーゼと大月昜菌由来、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス 属細菌由来からなる群から選択される RN a s eHの組み合わせであることを特 徴とする請求項 80に記載の核酸増幅用キット。
91. RNa s eHが大腸菌由来 I型 RNa s eH、 ピロコッカス属細菌由来 又はアルカェォグロバス属細菌由来 I I型 RNa s eHである請求項 89又は 9 0に記載の核酸増幅用キット。
92. エンドヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラーゼが使用される請求 項 79〜 91レ、ずれか 1項に記載の核酸増幅用キット。
93. D NAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の 5 ' →3， ェ キソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼであり、 当該 B c aDNAポリ メラーゼのェンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質を含有する請求項 92に記 載の核酸増幅用キット。
94. DNAポリメラーゼのェンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質がマン ガンイオンである請求項 93に記載の核酸増幅用キット。
95. D N Aポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質を含有する請求項 79 〜94のいずれか 1項に記載の核酸増幅用キット。
96. DNAポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質がホスホノギ酸である 請求項 95に記載の核酸増幅用キット。
97. デォキシヌクレオチド 3リン酸のアナ口グを含有する請求項 79〜 96 のいずれか 1項に記載の核酸増幅用キット。
98. デォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログがデォキシゥリジン 3リン酸 またはその誘導体である請求項 97記載の核酸増幅用キット。
99. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法に使用する核酸増 用キットであって、 パッケージされた形態において、 鎖置換活性を有する DNA ポリメラーゼおよび RNa s eHの使用を指示した指示書を含むことを特徴とす る核酸増幅用キット。
100. 請求項 6〜 9レ、ずれか 1項に記載の核酸の増幅方法に使用されるキッ トであって、 パッケージされた形態において、 鎖置換活1生を有する DN Aポリメ ラーゼおよびェンドヌクレアーゼの使用を指示した指示書を含むことを特徴とす る核酸増幅用キット。
101. 包装材と該包装材に封入された核酸増幅用試薬からなる製造品であつ て、 該核酸増幅用試薬が鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼ及び/又は RN a s eHを含有し、 該包装材に賦されたラベル又は該包装材に添付された指示書 に前記核酸増幅用試薬が等温での核酸増幅に使用できることが表示してなる、 核 酸増幅用試薬の製造品。
102. 包装材と該包装材に封入された核酸増幅用試薬からなる製造品であつ て、 該核酸増幅用試薬が鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼ及び/又はェン ドヌクレアーゼを含有し、 該包装材に賦されたラベル又は該包装材に添付された 指示書に前記核酸増幅用試薬が等温での核酸増幅に使用できることが表示してな る、 核酸増幅用試薬の製造品。
103. 試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
(a) 請求項 1〜39いずれか 1項に記載の核酸の増幅方法により核酸を増幅す る工程；および
(b) (a) 工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法。
104. 得られる増幅核酸を検出用プローブを用いて検出する工程を包含する 請求項 103に記載の標的核酸の検出方法。
105. 検出用プローブがあらかじめ標識物質により標識されているプローブ であることを特徴とする請求項 104記載の標的核酸の検出方法。
106. プローブが、 消光状態になるような距離で配置された 2種類以上の蛍 光物質で標識された RNAプローブであることを特徴とする請求項 105記載の 標的核酸の検出方法。
107. 請求項 103〜 106のいずれか 1項に記載の標的核酸の検出方法に 使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
108. 下記一般式で表される請求項 107に記載のキメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一。
一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN ： デォキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及ぴ Z又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよく、 3 '末端のヌクレオチドは当該末端からの D N A ポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
1 09. cが 0である請求項 1 08に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライ マー。
1 1 0. ヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキ シリボウラシルヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが （α— S) リポヌ クレオチドである請求項 108又は 1 09に記載のキメラオリゴヌクレオチドプ ライマー。
1 1 1. 病原微生物検出用又は疾病関連遺伝子検出用キメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一である請求項 107〜1 10いずれか 1項に記載のキメラオリゴヌ
1 1 2. 病原性微生物が腸管出血性大腸菌、 ボツリヌス菌、 黄色ブドウ球菌、 結核菌、 クラミジァ、 パピローマウィルス、 C型肝炎ウィルス又はウイロイドで ある請求項 1 1 1記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
1 1 3. 配列表の配列番号 3 1〜34、 47、 48、 51〜53、 64-72, 84、 85、 1 1 3、 1 14、 1 30、 1 3 1でそれぞれ表される核酸配列を有 する腸管出血性大腸菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一。
1 1 4. 配列表の配列番号 59、 60、 1 1 9、 1 20、 1 22、 1 23でそ れぞれ表される核酸配列を有するウイロイド検出用キメラオリゴヌクレオチドプ ライマ' ~。
1 1 5. 配列表の配列番号 1 1 6、 1 1 7でそれぞれ表される核酸配列を有す るボツリヌス菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー。
1 1 6. 配列表の配列番号 96、 9 7でそれぞれ表される核酸配列を有するパ ピローマウィルス検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー。
117. 配列表の配列番号 101〜 102、 138〜； 139、 200〜 201 でそれぞれ表される核酸配列を有する C型肝炎ウィルス検出用キメラオリゴヌク レオチドプライマ一。
118. 配列表の配列番号 136、 137でそれぞれ表される核酸配列を有す る黄色ブドウ球菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一。
1 19. 配列表の配列番号 155〜 156、 159〜 162、 194〜 195 でそれぞれ表される核酸配列を有する結核菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプ ライマー。
120. 配列表の配列番号 157〜 158でそれぞれ表される核酸配列を有す るクラミジァ検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー。
121. 請求項 1〜 39のいずれか 1項に記載の核酸の増幅方法に使用される キットであって、 請求項 107〜120のいずれか 1項に記載のキメラオリゴヌ クレオチドプライマ一を含有することを特徴とする核酸増幅用キット。
122. 請求項 103〜 106のいずれか 1項に記載の標的核酸の検出方法に 使用されるキットであって、 請求項 107〜120のいずれか 1項に記載のキメ ラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とする標的核酸の検出用 キット。
123. 請求項 103〜 106のいずれか 1項に記載の標的核酸の検出方法に 使用されるプローブ。
124. 請求項 1〜 39のいずれか 1項に記載の核酸の増幅方法により増幅さ れた核酸にハイブリダイズするプローブ。
125. 請求項 1 13〜120のいずれか 1項に記載のキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一から選択されるプライマーで増幅される領域にハイブリダィズす るプローブ。
126. あらかじめ標識物質により標識されている請求項 123~125のい ずれか 1項に記載のプローブ。
127. 消光状態になるような距離で酉 B置された 2種類以上の蛍光物質で標識 された RNAプローブである請求項 126記載のプローブ。
128. 請求項 103〜 106のいずれか 1項に記載の標的核酸の検出方法に 使用されるキットであって、 請求項 123〜127のいずれか 1項に記載のプロ ープを含有することを特徴とする標的核酸の検出用キット。
129. 鎖置換活性を有する DNAポリメラ ^"ゼを使用し、 鎵型交換反応を行 う工程を包含する核酸の増幅方法。
130. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼとして、 大腸菌由来の DNA ポリメラーゼ Iのタレノウ断片、 バチルス ステアロサーモフィラス由来の 5， →3' ェキソヌクレアーゼ欠損 B s tDNAポリメラーゼ、 およびバチルス 力 ドテナックス由来の 5' →3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラ ーゼからなる群から選択される DNAポリメラーゼが使用される請求項 129記 載の核酸の増幅方法。
131. 核酸を所定の領域に整列させた核酸固定物を作製するための方法であ つて、
(a) 請求項 1〜39記載の核酸の増幅方法によって固定ィヒすべき核酸を増幅す る工程；および、
(b) (a) 工程で増幅された核酸を所定の領域に整列させて固定ィヒする工程； を包含することを特徴とする核酸固定物の作製方法。
132. 請求項 131に記載の方法で作製された、 核酸を所定の領域に整列さ せた核酸固定物。
133. 核酸を大量に製造する方法であって、
( a ) 請求項 1〜 39記載の核酸の増幅方法によつて核酸を増幅する工程；およ び、
(b) (a) 工程で増幅された核酸を採取する工程；
を包含することを特徴とする核酸の大量製造方法。
134. 核酸を増幅するための方法であって、
(a) 増幅しょうとする配列を含む DNAあるいは RNAを複製し、 铸型となる 核酸を調製する工程；及び、
(b) (a) で得られた鎊型となる核酸を請求項 1〜39記載の核酸の増幅方法 で増幅する工程； を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
135. 核酸の塩基配列を決定するための方法であって、 請求項 1〜39、 1 33、 134のいずれか 1項に記載の方法の核酸を増幅する工程を包含すること を特徴とする核酸の塩基配列の決定方法。
136. 請求項 1〜 39のいずれか 1項に記載の核酸の増幅方法を用いること を特徴とする 1本鎖核酸の調製方法。
137. 濃度が異なる少なくとも 2種類のプライマーを用いることを特徴とす る請求項 136記載の 1本鎖核酸の調製方法。
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