KR100841128B1 - 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속의 정량적 ｐｃｒ검출법 - Google Patents

식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속의 정량적 ｐｃｒ검출법 Download PDF

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Abstract

PCR법에 의한 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속을 정량하는 방법으로서, (i) 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료와 표준 식물 시료의 혼합비를 미리 알고 있는 보정용 샘플을 준비하고, 상기 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 것, (ii) 피검 대상으로 하는 식품 또는 식품 원재료에 기지량의 표준 식물 시료를 첨가한 피검 샘플을 조제하고, 상기 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 것, (iii) 상기 게놈 DNA와 프라이머로 정량적 PCR법을 실시하는 것, (iv) 보정용 샘플로 검출되는 보정 표준치를 이용하여 보정하고, 피검 샘플 중에 포함되는 특정 식물 원료의 양을 산출하는 것을 포함하는 상기 방법을 제공한다.
PCR법, 식품 원재료, 표준 식물 시료, 보정용 샘플, 특정 식물속, 게놈 DNA, 프라이머, 보정 표준치, 플라스미드, 증폭 산물

Description

식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속의 정량적 ＰＣＲ 검출법 {QUANTITATIVE PCR DETECTION METHOD FOR PLANT OF SPECIFIED GENUS IN FOOD OR FOOD RAW MATERIAL}
본 발명은 식품 또는 식품 원재료 중에 포함되는 특정 식물속의 정량적 검출 방법에 관한 것이다.
2002년 4월부터 일본에서 알레르기의 원인이 되는 특정 원재료에 대해서 제품에의 표시 제도가 개시되었다. 따라서, 식품에 대해서는 특정 원재료로서 밀, 메밀, 땅콩, 우유 및 계란의 5품목에 대해서 하기의 조건에 따라 의무적으로 표시하게 되었다[(「후생노동성 홈페이지: 알레르기 물질을 포함하는 식품에 관한 표시에 대해서」(http://www.mhlw.go.jp/topics/0103/tp0329-2b.html)), (「식품위생학 잡지(Journal of the Food Hygienics Society of Japan(SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)), (일본), 사단법인 일본 식품 위생 학회, 2002년, 제43권, 제4호, p. j-269-j-271」)」. 이에 따라 후생노동성에서는 특정 원재료에 대해서 일차 스크리닝용의 폴리크로날 항체에 의한 정량 ELISA법 및 확정 시험용의 정성 PCR법(밀, 메밀, 땅콩) 및 웨스턴 블롯법(우유, 계란)의 시험이 통지되어 있다. 일차 스크리닝의 ELISA법에 대해서는 2종의 ELISA 키트 중 어느 정량치가 10ppm 이상(특정 원재 료의 총단백질량/최종 제품 중량으로 환산)인 시료는 양성이라고 판단되고, 또한 제조 기록의 확인, PCR법(밀, 메밀, 땅콩) 또는 웨스턴 블롯법(우유, 계란)에 의한 정성 시험에서의 확인을 하게 된다[(후생노동성 홈페이지:「알레르기 물질을 포함하는 식품의 검사 방법에 대해서」(식발 제1106001호)(http://wwwhourei.mhlw. go.jp/-hourei/cgi-bin/t_docframe.cgi?MODE=tsuchi&DMODE=CONTENTS&SMODE=NORMAL&KEYWORD=&EFSNO=4642))].
일반적으로 ELISA법은 대단히 고감도의 단백질 검출법으로서, 상기 방법은 당 기술분야에 있어서는 관용 기술이 되어 있다. 그러나, 폴리크로날 항체를 이용한 ELISA법에서는 교차 반응성이 비교적 높고, 비특이적인 단백질을 검출할 가능성이 있기 때문에(이시카와 에이지 감역: 엔자이뮤노 에세이(1989)), 위양성의 판정이 나올 가능성이 있다. 위양성에 대해서 검정하기 위해서는 다른 방법으로 재확인하는 것을 필요로 한다.
또한, ELISA법은 고감도인 반면에, 측정에 있어서의 다이나믹 레인지가 좁다. 측정에 있어서의 다이나믹 레인지가 좁다고 하는 것은 미지의 농도의 시료를 정확하게 측정하기 위해서는 몇 단계로 희석한 검액을 준비하고, 검량선의 범위 내에 들어가는 검액의 측정 결과를 선택할 필요가 생길 가능성이 있다. 또한 통상 ELISA에 의한 측정에서는 피검 대상으로 하는 시료마다의 추출 효율이나 ELISA 반응의 저해 등의 영향에 대한 보정이 고려되지 않고, 특히 식품과 같은 다방면에 걸 친 가공 처리 및 혼입물이 추정되는 시료 등을 측정해서 정량치를 산출하는 경우에는 주의가 필요하다.
또한 예를 들면 시판되는 메밀 단백질 검출용 ELISA의 검출 감도는 키트 부속의 검량선용 표준 메밀 단백질 검액으로 1ng/㎖(20 내지 400배 희석해서 ELISA에 제공했다고 하면, 특정 원재료의 총단백질량/최종 제품 중량으로 환산하면 0.02 내지 0.1ppm)로 고감도이다［(「식품위생학 잡지(Journal of the Food Hygienics Society of Japan(SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)), (일본), 사단법인 일본 식품 위생 학회, 2002년, 제43권, 제4호, p. j-275-j-277」, (「식품위생학 잡지(Journal of the Food Hygienics Society of Japan(SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)), (일본), 사단법인 일본 식품 위생 학회, 2002년, 제43권, 제4호, p. j-277-j-279), (일본 햄 주식회사 FAST KIT(Food Allergen Screening Test) 시리즈 엘리사 메밀 -ELISA BUCKWHEAT-<<취급 설명서>>), (주식회사 모리나가 생과학 연구소 모리나가 메밀 측정 키트 취급 설명서)］. 그러나, 예를 들면 메밀의 총단백질량/시료 중량으로 환산해서 이 레벨의 농도가 되는 메밀가루를 포함하는 시료로부터 2g을 샘플링했을 경우, 검출 대상인 특정 원재료의 입경이 상당히 미세하지 않으면 시료로부터는 메밀가루의 그레인을 샘플링할 수 없을 우려가 있을 수 있다.
한편, 혼입한 메밀을 검출하기 위한 PCR법으로서 현재 알려져 있는 것은 감도가 메밀 DNA량으로서 약 5pg이며, 밀 중에 메밀을 첨가한 시료에서는 약 10ppm의 메밀을 검출할 수 있지만, 이 공지의 방법으로는 정량 분석은 할 수 없다[(「식품위생학 잡지(Journal of the Food Hygienics Society of Japan(SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)), (일본), 사단법인 일본 식품 위생 학회, 2002년, 제43권, 제4호, p. j-280-j-282」, (「(사)일본 식품 위생 학회 제84회 학술 강연회 강연 요지집」, (일본), 사단법인 일본 식품 위생 학회, 2002년, p.104)).
또한, 본 발명자들은 특정 식물속의 존재를 검출하기 위한 방법으로서 1ppm 이상(DNA/DNA)의 감도로 검출 가능한 ITS 서열을 표적으로 한 정성 PCR법을 개발하여 2002년 9월 27일자로 일본 특허 출원(출원 번호:특 2002-284222)을 했지만, 해당 방법으로는 정량 분석은 할 수 없다.
유전자 재조합 작물의 PCR에 의한 정량법으로서, 유전자 재조합 옥수수에 특유의 유전자 서열의 카피수를 측정하고, 별도 측정한 옥수수에 고유의 내재성 유전자 서열의 카피수로 보정을 실시하고, 옥수수 원료 중의 유전자 재조합과 수수 원료의 양을 측정하는 것이 있다[(「저널 오브 에이오에이씨 인터내셔널(Journal of AOAC INTERNATIONAL)」, (미국), 에이오에이씨 인터내셔널(AOAC INTERNATIONAL), 2002년, 제85권, 제5호, p.1077-1089)」.
상세하게는, 우선 순수한 유전자 재조합 옥수수의 대표적인 품종을 사용하고, 그 종자로부터 추출한 DNA의 「재조합 DNA 서열의 카피수/내재성 유전자 서열의 카피수」의 값(내표비)을 구한다. 다음에, 미지 시료의 「재조합 DNA 서열의 카피수/내재성 유전 서열의 카피수」의 값을 구하고, 여기에 내표비의 역수와 100을 곱해 유전자 재조합 옥수수의 혼입률을 측정하는 것이다. 이 방법에서는 여러 가지 품종의 옥수수로 카피수가 같고, 또한 공통된 염기 서열을 가지는 내재성 유전자를 내부 표준으로서 이용하고 있기 때문에, 옥수수라면 옥수수라고 하는 같은 식물종을 포함하는 시료 중에서의 재조합체의 함유량을 정량하는 것에는 적합하다.
그러나, 여러 가지 생물종이나 무생물의 원료를 포함하는 혼합물 중에 존재하는 알레르기의 원인이 되는 특정 원재료의 양을 측정하는 것을 생각했을 경우, 여러 가지 생물종의 DNA 중에서 내부 표준으로서 이용할 수 있는 내재성 서열을 찾아내는 것은 곤란하고, 또 무생물과 같이 DNA가 없는 것으로부터 그것을 찾아내는 것은 불가능하다.
따라서, 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입된 특정의 원재료의 정량적 검출 방법으로서, 보다 결점이 적은 방법을 개발하는 것을 시도했다. 즉, 피검 대상으로 하는 시료마다의 추출 효율이나 검출 반응의 저해 등의 영향에 대한 보정이 가능하고, ELISA법보다 다이나믹 레인지가 넓고, 또한 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입된 특정의 원재료의 정량적 검출에 충분한 특이성 및 감도를 가지는 정량 방법의 개발을 목적으로 하여 본 발명을 검토했다.
즉, 피검 대상으로 하는 시료마다의 추출 효율이나 검출 반응의 저해 등의 영향을 고려하기 위해서 표준 식물 유래의 시료(표준 식물 시료)를 이용해서 보정하는 것, 검출의 다이나믹 레인지가 공지의 ELISA법에 비해 넓은 것, 및 충분한 특이성 및 감도를 가지는 것을 특징으로 하는 정량적 PCR 검출법의 확립을 예의 검토하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은
1. PCR법에 따른 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 정량하는 방법으로서, 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료와 표준 식물 시료를 미리 정한 비율로 혼합한 보정용 샘플을 준비하고, 이 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 것, 피검 대상인 식품 또는 식품 원재료에 기지량의 표준 식물 시료를 첨가한 피검 샘플을 조제하고, 이 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 것, 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료를 검출하기 위한 프라이머 세트, 및 표준 식물 시료를 검출하기 위한 프라이머 세트를 이용해서 각 샘플로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 정량적 PCR법을 실시하는 것, 보정 표준치로서 보정용 샘플에 대해서 상기 정량적 PCR법에 따라 표준 식물 유래 DNA의 카피수/특정 식물속 유래 DNA의 카피수의 값을 구하는 것, 및 피검 샘플에 대해서 상기 정량적 PCR법에 따라 특정 식물속 유래 DNA의 카피수/표준 식물 유래 DNA의 카피수의 값을 구하고, 이것을 상기 보정 표준치를 이용해서 보정하고, 식품 또는 식품 원재료 중에 포함되는 특정 식물속의 식물의 양을 산출하는 것을 포함하는 상기 방법;
2. 정량적 PCR법이 실시간 PCR법인 상기 1 기재의 방법;
3. 실시간 PCR법이, 5' 말단에 발광 색소 및 3' 말단에 소광제를 가지고 있으며 PCR 프라이머 세트의 각 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 게놈 DNA 부위의 안쪽에 혼성화하는 프로브를 이용하고, 발광량에 근거해서 DNA를 정량하는 방법이며, 여기서 프로브의 5' 말단의 발광 색소는 3' 말단의 소광제에 의해 발광이 억제되어 있지만, PCR 반응에 있어서 Taq 폴리메라제에 의해 프라이머로부터 DNA가 신장되면, Taq 폴리메라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 상기 프로브가 분해되고, 발광 색소와 소광제가 해리되어 발광을 일으키는 것을 특징으로 하는 상기 2 기재의 방법;
4. 표준 식물이, 밭 잡초 및 식용 작물 이외의 식물종에 속하는 것인 상기 1 내지 3 중 어느 한 항 기재의 방법;
5. 표준 식물이 스타티스(statice)인 상기 4 기재의 방법;
6. 검출 대상인 특정 식물속이 메밀, 땅콩, 밀 또는 대두속인 상기 1 내지 5 중 어느 한 항 기재의 방법;
7. 표준 식물이 스타티스이며, 스타티스 검출용 프라이머 세트가 서열번호 57 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 58 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트이며, 스타티스 검출용 프로브가 서열번호 59 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 상기 2 또는 3 기재의 방법;
8. 검출 대상인 특정 식물속이 메밀속이며, 메밀속 검출용 프라이머 세트가 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트이며, 메밀속 검출용 프로브가 서열번호 64 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 상기 2 또는 3 기재의 방법;
9. 검출 대상인 특정 식물속이 땅콩속이며, 땅콩 검출용 프라이머 세트가 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 65 또는 66 기재 중 하나의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트이며, 땅콩 검출용 프로브가 서열번호 34 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 상기 2 또는 3 기재의 방법;
10. 서열번호 57 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 58 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 스타티스 검출용 프라이머 세트;
11. 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 메밀속 검출용 프라이머 세트.
12. 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 또는 66 기재 중 하나의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 땅콩 검출용 프라이머 세트;
13. 표준 식물 시료 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용하기 위한 키트;
14. 표준 식물 시료 검출용 프로브를 더 포함하는 상기 13 기재의 키트;
15. 표준 식물이 스타티스이며, 스타티스 검출용 프라이머 세트가 서열번호 57 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 58 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트인 상기 13 또는 14 기재의 키트;
16. 서열번호 59를 포함하는 서열을 가지는 스타티스 검출용 프로브를 더 포함하는 상기 15 기재의 키트;
17. 검출 대상인 특정 식물속 검출용 프라이머 세트를 더 포함하는 상기 13 내지 16 중 어느 한 항 기재의 키트;
18. 검출 대상인 특정 식물속이 메밀속이며, 그의 검출용 프라이머 세트가 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트인 상기 13 내지 16 중 어느 한 항 기재의 키트;
19. 서열번호 64를 포함하는 서열을 가지는 메밀속 검출용 프로브를 더 포함하는 상기 18 기재의 키트;
20. 검출 대상인 특정 식물속이 땅콩속이며, 그의 검출용 프라이머 세트가 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 65 또는 66 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트인 상기 13 내지 16 중 어느 한 항 기재의 키트;
21. 서열번호 34를 포함하는 서열을 가지는 땅콩 검출용 프로브를 더 포함하는 상기 20 기재의 키트:
22. 표준 식물 시료로서 스타티스 시료를 더 포함하는 상기 15 기재의 키트;
23. 표준 식물이 스타티스이고, 검출 대상인 특정 식물속이 메밀속이며, 스타티스 및 메밀에 대한 검량선을 제작하기 위한, 스타티스의 증폭 표적 서열을 포함하는 DNA와 메밀의 증폭 표적 서열을 포함하는 DNA를 연결해서 포함하는 검량선 제작용 플라스미드를 더 포함하는 상기 13 기재의 키트;
24. 표준 식물이 스타티스이고, 또한, 검출 대상인 특정 식물속이 땅콩속이며, 스타티스 및 땅콩에 대한 검량선을 제작하기 위한, 스타티스의 증폭 표적 서열을 포함하는 DNA와 땅콩의 증폭 표적 서열을 포함하는 DNA를 연결해서 포함하는 검량선 제작용 플라스미드를 더 포함하는 상기 13 기재의 키트;
25. 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 메밀속 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 식품 또는 식품 원재료 중의 메밀속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용하기 위한 키트;
26. 서열번호 64를 포함하는 서열을 가지는 메밀속 검출용 프로브를 더 포함하는 상기 25 기재의 키트;
27. 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 65 또는 66 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 땅콩 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 식품 또는 식품 원재료 중의 땅콩속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용하기 위한 키트; 및
28. 서열번호 34를 포함하는 서열을 가지는 땅콩 검출용 프로브를 더 포함하는 상기 27 기재의 키트에 관한 것이다.
본 발명의 방법, 즉, 피검 대상으로 하는 시료마다의 DNA 추출 효율이나 PCR 반응의 저해 등의 영향에 대한 보정의 방법으로서 외부로부터 DNA를 표준으로 하여 첨가해서 반응 용액 중의 PCR 반응의 저해 등의 영향에 대한 보정을 실시하는 것이 아니라, 외부로부터 정제 DNA 이외의 표준 식물 시료를 첨가한 샘플로부터 검출 대상인 특정 식물속(본 명세서 중, 「검출 대상인 특정 식물속」이란, 정량 대상의 특정 식물속도 포함한다) 유래의 DNA와 표준 식물 유래의 DNA를 동시에 추출해서 정량적 PCR법을 실시하는 방법은 본 명세서에서 처음으로 개시되는 것이다. 이러한 방법에 의해 표준 식물 시료와 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료 사이에서, DNA 추출 효율이나 PCR 반응의 저해 등의 영향을 균일한 조건으로 측정할 수 있기 때문에, 매우 신뢰도가 높은 정량이 가능하다. 또한, DNA 추출 효율, PCR 반응의 저해 등의 영향, 또한 피검 대상으로 하는 시료 중의 DNA 함유량의 차이에 대해서도 보정이 가능하다고 하는 유리한 효과를 본 발명의 방법은 가지고 있다. 또한 PCR법에 따른 정량 분석은 위양성이 나왔을 경우에, 그 PCR 증폭 산물을 DNA 서열의 해석에 제공함으로써 확실히 위양성을 제외할 수 있다고 하는 점에서, 산업상 이용성이 뛰어나다고 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 식품 또는 식품 원재료 중에 포함되는 알레르기의 원인이 되는 특정 식물속에 속하는 식물의 정량적 검출에 유용하다.
따라서, 본 발명의 방법에 있어서 표준 식물 시료로서 이용하는 스타티스 검출용 프라이머 세트, 및 특정 식물속으로서의 메밀속 또는 땅콩속 검출용의 프라이머 세트도 본 발명에 포함되고, 또한 이들 프라이머 세트와 조합하여 실시간 PCR법에 따른 검출에 이용하기 위한 프로브도 본 발명에 포함된다. 또한, 표준 식물 시료를 검출하기 위한 프라이머 세트, 및 검출 대상인 특정 식물속에 속하는 식물을 검출하기 위한 프라이머 세트 중 어느 것 또는 양쪽 모두가 포함되고, 본 발명의 방법의 실시에 이용하기 위한 키트도 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 키트는 상기 프로브를 포함하고 있을 수 있다. 나아가서는 표준 식물 시료를 포함하고 있을 수 있으며, 표준 식물로서는 스타티스가 바람직하고, 그 시료로서는 스타티스 식물체의 건조 분말이 바람직하지만, 특히 종자의 건조 분말이 바람직하다. 또한, 상기 키트에 포함되는 프라이머 세트를 증폭할 수 있는 표준 식물 시료의 서열을 포함하는 DNA와 검출 대상인 특정 식물속의 서열을 포함하는 DNA를 연결해서 포함하고, 표준 식물 시료와 특정 식물속에 대한 검량선을 작성하기 위한 검량선 작성용 플라스미드가 상기 키트에 포함되어 있을 수 있다.
본 명세서에 있어서 소정의 식물 또는 식물속(그 속에 속하는, 즉 포함되는 식물을 가리키는 경우도 포함한다), 또는 이것들에 유래하는 시료의 「검출용 프라이머」 또는 「검출하기 위한 프라이머」란, PCR법에 있어서 소정의 식물 또는 식물속에 속하는 식물의 게놈 DNA의 일부를 특이적으로 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 말한다. PCR법에 이용하기 위한 전방향 프라이머와 역방향 프라이머 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머쌍을 본 명세서에서는 「프라이머 세트」라고 칭하는 경우가 있다.
본 발명의 프라이머는 각 식물속을 정량하기 위한 정량적 PCR법에 이용할 수 있는 것이지만, 각 식물속의 비정량적(즉, 정성) 검출에 이용할 수도 있음은 물론이다. 본 발명의 프라이머를 이용하면, 검출 대상으로 하는 식물속에 속하는 모든 식물종을 검출할 수 있어 본 발명의 프라이머 및 프라이머 세트는 정량적 및 비정량적 PCR에 있어서 유리하다.
본 명세서 중, 「검출」이라고 하는 용어는 정성 및 정량적 검출 양쪽 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서는 검출 대상인 특정 식물속 유래의 DNA를 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머를 설계한다. 즉, 45S rRNA 전구체 유전자 서열 중에서 특정 식물속에 공통되는 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머로서, 상기 핵산 분자와 혼성화했을 때에 3' 말단이 특정 식물속의 ITS-1 서열 중의 염기와 상보적으로 결합하는 프라이머(A) 또는 ITS-2 서열 중의 염기와 상보적으로 결합하는 프라이머(B)를 1종 이상 사용한 PCR 후, 특정 식물속의 ITS-1 또는 ITS-2 서열의 적어도 일부를 포함하는 PCR 증폭 산물의 존재를 지표로 하여 특정 식물속의 존재를 검출할 수 있는 프라이머를 설계한다.
또한, 「엄격한 조건하에서 혼성화한다」란, 2개의 DNA 단편이, Sambrook J 등에 의해 기재된 것 같은 표준적인 혼성화 조건하에서 서로 혼성화하는 것을 의미한다(문헌 [Expression of cloned genes in E. coli(Molecular Cloning: A laboratory manual(1989)) Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.47-9. 62 및 11.45-11.61]). 보다 구체적으로는 예를 들면 이하의 식으로 구해지는 Tm값을 기준으로 하여 혼성화(예를 들면 약 3.0×SSC 또는 2.0×SSC, 30℃ 또는 37℃)를 실시한 후, 혼성화의 조건보다 엄격성이 높은 조건에서의 세정(예를 들면 약 2.0×SSC, 30℃, 37℃, 40℃, 44℃ 또는 48℃ 이상, 또는 1.0×SSC 또는 0.5×SSC, 37℃ 이상 등)을 실시하는 것을 의미한다. 혼성화하는 염기 서열 등에 따라 적당히 하이프리다이제이션 및 세정에 적절한 「엄격한 조건」을 선택하는 것은 당 기술분야에서는 주지 기술이다. 또한 본 명세서 중, 단지 「혼성화한다」라고 기재하는 경우도, 특히 조건 등을 언급하고 있는 것을 제외하고, 엄격한 조건으로 혼성화하는 것을 의미한다.
Tm=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C 분율)-(600/N)
또한, 본 명세서에서 말하는 「속」이란, 그 속에 속하는 식물 전부를 포함하는 것, 또는 속에 속하는 식물 중에서 선택한 몇 개의 종을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 이용하는 프라이머 세트는 45S rRNA 전구체 유전자 서열 중의, 특정 식물속 내에서 공통되어 있는 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머쌍으로서, 상기 프라이머쌍 중 적어도 한쪽의 프라이머는 상기 핵산 분자와 혼성화했을 때에 3' 말단이 특정 식물속의 ITS-1 서열 중의 염기와 상보적으로 결합하는 프라이머(A) 또는 ITS-2 서열 중의 염기와 상보적으로 결합하는 프라이머(B)인 것이 중요하다. 여기서 프라이머(A)는 ITS-1과 5.8S rRNA 유전자 서열의 경계를 포함하는 영역에 혼성화하는 것 및 ITS-1과 SSU rRNA 유전자 서열의 경계를 포함하는 영역에 혼성화하는 것도 포함한다. 마찬가지로 프라이머(B)는 ITS-2와 5.8S rRNA 유전자 서열의 경계를 포함하는 영역에 혼성화하는 것 및 ITS-2와 LSU rRNA 유전자 서열의 경계를 포함하는 영역에 혼성화하는 것도 포함한다. 프라이머(A) 및(B)는 15개 이상의 염기를 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 15 내지 30개의 염기를 포함한다. ITS-1 서열 및 ITS-2 서열은 종에 특이적인 서열을 많이 포함하고 있으므로, 45S rRNA 전구체 유전자 서열 중의, 특정 식물속 내에서 공통되어 있는 염기 서열을 가지는 핵산 분자로서 ITS-1 또는 ITS-2 서열 중의, 특정 식물속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열을 가지는 핵산 분자를 매우 적합하게 선택함으로써, 특정 종류의 식물속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이성을 가지는 프라이머(A) 또는 (B)를 얻을 수 있다. 또한, 프라이머(A) 또는 (B)를 1개 또는 2개 이상 사용할 수 있고, 2개 이상 사용하는 경우에는 특정 종류의 식물속에 대한 특이성이 더욱 높아진다.
또한, 다른 양태로서는 프라이머(A)와 특정 식물속의 ITS-1, 5.8S rRNA 유전자, ITS-2 및 LSU rRNA 유전자가 연속해서 결합한 서열의 일부의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머(C)를 사용한다. 또는 프라이머(A)와 특정 식물속의 SSU rRNA 유전자 및 ITS-1이 연속해서 결합한 서열의 일부의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머(E)를 사용한다. 또한 다른 양태로서는 프라이머(B)와 특정 식물속의 SSU rRNA 유전자, ITS-1, 5.8S rRNA 유전자 및 ITS-2 가 연속해서 결합한 서열의 일부의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머(D)를 사용한다. 또는 프라이머(B)와, 특정 식물속의 ITS-2 및 LSU rRNA 유전자에 연속해서 결합한 서열의 일부의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머(F)를 사용한다. 여기서 5.8S rRNA 유전자는 보존성이 높고, 대다수의 식물에 공통된 서열을 대부분 포함하고 있다. 그러므로, 프라이머(C)로서 5.8S rRNA 유전자의 일부의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머로서, 상기 핵산 분자와 혼성화했을 때에 3' 말단이 5.8S rRNA 유전자 서열 중의 염기 서열과 상보적으로 결합하는 프라이머를 매우 적합하게 선택함으로써, 또는 프라이머(D)로서 5.8S rRNA 유전자의 일부의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머로서, 상기 핵산 분자와 혼성화했을 때에 3' 말단이 5.8S rRNA 유전자 서열 중의 염기 서 열과 상보적으로 결합하는 프라이머를 매우 적합하게 선택함으로써, 상기 프라이머는 여러 가지 식물에 대해서 공통해서 사용하는 것도 가능하다. 이들 프라이머를 고정하고, ITS-1 또는 ITS-2 영역으로부터 검출하고 싶은 특정 식물속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 프라이머를 선택함으로써 상기 특정 식물속에 속하는 식물의 혼입을 고감도로 검출하기 위한 프라이머를 용이하게 설계할 수 있다. 프라이머(C) 내지 (F)는 15개 이상의 염기를 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 15 내지 30개의 염기를 포함한다.
이들 프라이머를 설계하는 데 있어서는 예를 들면 「PCR법 최전선-기초 기술로부터 응용까지」(단백질·핵산·효소 임시 증간호 1996년 교리쯔 출판 주식회사)나 「바이오 실험 일러스트레이티드 3, 정말로 증가하는 PCR: 세포 공학 별지, 눈으로 보는 실험 노트 시리즈」(나카야마 히로키저 1996년 주식회사 슈쥰사), 「PCR 테크놀러지 -DNA 증폭의 원리와 응용-」(Henry A Erlich 편, 카토 쿠니노신 감수 타마 주조 주식회사) 등에 근거해서 설계할 수 있지만, 미가공품으로부터의 검출의 경우에는 DNA가 분해되어 있을 가능성이 적기 때문에, 700 염기 이내의 증폭 산물을 얻을 수 있는 프라이머일 수 있고, 가공 식품으로부터의 검출의 경우에는 DNA가 분해되어 짧아져 있을 가능성을 생각할 수 있고, 이러한 관점에서 200 염기 이내의 증폭 산물을 얻을 수 있는 프라이머가 높은 감도를 얻을 수 있다는 점에서 바람직하다.
전술의 관점에서, 프라이머(C) 또는 (D)는 서열번호 1로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화 할 수 있는 프라이머인 것이 바람직하다. 5.8S rRNA 유전자 서열은 거의 전역에 걸쳐서 식물 사이에서 상동성이 높기 때문에, 어느 영역에 혼성화하는 프라이머라도 사용할 수 있지만, 서열번호 1은 특히 높은 상동성을 가지는 영역이기 때문에, 상기 프라이머가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 위치 11 내지 63의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열을 가지는 핵산 분자와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 프라이머이다. 이러한 프라이머(C)로서는 서열번호 2 내지 4로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다(서열번호 1에 혼성화한다). 또한, 이러한 프라이머(D)로서는 서열번호 5 내지 7로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다(서열번호 1의 상보쇄에 혼성화한다). 상기 프라이머는 표적으로 하는 핵산 분자와 특이적으로 엄격한 조건하에서 혼성화하는 것이 필요하고, 또 혼성화한 프라이머가 프라이머로서 기능하여 신장 반응이 일어나려면 3' 말단의 염기가 표적으로 하는 DNA 서열 부분과 상보적인 염기가 되어 있을 필요가 있다. 따라서, 이러한 요건을 충족시키고 있으면, 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 7로 나타내어지는 염기 서열 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
ITS-1이나 ITS-2 서열 중의, 특정 식물속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열은 검출 대상인 특정 식물속 및 다른 식물속의 여러 가지 식물의 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 내지 ITS-2 서열을 GenBank로부터 취득하여 얼라이먼트를 실시하고, 상기 특정 식물속에 공통되고, 또한 상기 속에 특이성이 높은 영역을 찾음으로써 특정할 수 있다. 또한 이 특정한 영역 중에서, 특히 상기 특정 식물속과 그 근연종이라고 생각되는 식물의 특이성을 확보할 수 있는 염기를 3' 말단의 염기로 설정하고, 프라이머 서열을 선정할 수 있다.
예를 들면 특정 식물속이 메밀속인 경우, 메밀속의 ITS-1 서열 중의, 메밀속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열로서는 시판 메밀의 대다수가 파고피룸 에스쿨렌툼(Fagopyrum esculentum)(보통 메밀)인 것이나 실제의 시판 메밀의 서열이 GenBank의 파고피룸 에스쿨렌툼(보통 메밀) 서열과 합치함으로써 에프. 에스쿨렌툼의 서열로부터 선택할 수 있고, 구체적으로는 서열번호 8, 9 또는 10으로 나타내어지는 염기 서열 또는 그러한 상보쇄의 염기 서열을 들 수 있다. 바람직하게는 서열번호 8의 위치 11 내지 61의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 9의 위치 11 내지 67의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열을 들 수 있다. 또한, 서열번호 10은 특히 메밀속의 일부인 에프. 에스쿨렌툼(보통 메밀), 에프. 타타리쿰(F. tataricum)(달단 메밀), 에프. 호모트로피쿰(F. homotropicum), 에프. 시모숨(F. cymosum)을 특이적으로 검출하고 싶은 프라이머를 선택하는 영역으로서 유용하다.
메밀속의 프라이머(A)로서는 서열번호 11 내지 16으로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다(서열번호 11 내지 14는 서열번호 8의 상보쇄에, 서열번호 15 및 16은 서열번호 9에 각각 엄격한 조건으로 혼성화한다). 또한, 상기 프라이머는 서열번호 11 내지 16으로 나타내어지는 염기 서열 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, ITS-2 서열 중에서, 메밀속에 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열 로서는 서열번호 36 또는 37로 나타내어지는 염기 서열 또는 그러한 상보쇄의 염기 서열을 들 수 있다. 이것들은 특히 메밀속의 일부인 에프. 에스쿨렌툼(보통 메밀), 에프. 타타리쿰(달단 메밀), 에프. 호모트로피쿰, 에프. 시모숨을 특이적으로 검출하고 싶을 때의 프라이머를 선택하는 영역으로서 유용하다. 그리고, 프라이머의 조합으로서는 서열번호 11 내지 14 중 하나와, 서열번호 15, 16 또는 서열번호 2 내지 4 중 하나의 조합이 바람직하다.
특정 식물속이 땅콩속인 경우, 시판 땅콩의 대다수가 아라키스 히포개아(Arachis hypogaea)이지만, 실제의 시판 땅콩의 서열이 GenBank의 에이. 코렌티나(A. correntina), 에이. 빌로사(A. villosa)의 서열과 합치함으로써 땅콩속의 ITS-1 서열 중의, 땅콩속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열로서는 에이. 빌로사의 서열로부터 선택할 수 있고, 구체적으로는 서열번호 17 내지 20으로 나타내어지는 염기 서열 또는 그러한 상보쇄의 염기 서열을 들 수 있다. 바람직하게는 서열번호 17의 위치 11 내지 62의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 18의 위치 11 내지 47의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 19의 위치 11 내지 50의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 20의 위치 11 내지 58의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열이다.
땅콩속의 프라이머(A)로서는 서열번호 21 내지 31, 65 및 66으로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다(서열번호 21 내지 23은 서열번호 17의 상보쇄에, 서열번호 24 및 25는 서열번호 18의 상보쇄에, 서열번호 30 및 31은 서열번호 20의 상보쇄에, 서열번호 26 내지 29, 65 및 66은 서열번호 19에 각각 엄격한 조건 으로 혼성화한다). 또한, 상기 프라이머는 상기한 대로 각각의 상대측의 서열과 엄격한 조건으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이면, 서열번호 21 내지 31, 65 및 66으로 나타내어지는 염기 서열 중 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 땅콩속의 ITS-2 서열 중의, 땅콩속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열로서는 서열번호 38로 나타내어지는 염기 서열 또는 그러한 상보쇄의 염기 서열을 들 수 있다. 바람직하게는 서열번호 38의 위치 11 내지 47의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열이다. 또한 땅콩속의 프라이머(B)로서는 서열번호 39로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다(서열번호 38에 엄격한 조건으로 혼성화한다). 또한, 상기 프라이머는 서열번호 39로 나타내어지는 염기 서열 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 그리고, 프라이머의 조합으로서는 서열번호 21, 24 또는 25와 서열번호 2 내지 4 중 하나의 조합, 서열번호 21, 24 또는 25와 서열번호 39의 조합, 또는 서열번호 39와 서열번호 5 내지 7 중 하나의 조합, 또는 서열번호 21 내지 23, 30 및 31 중 하나와 서열번호 26 내지 29, 65 및 66 중 하나의 조합이 바람직하지만, 서열번호 21, 24, 및 25 중 하나와 서열번호 2 내지 4 중 하나의 조합, 또는 서열번호 21과 서열번호 26, 65 및 66 중 하나의 조합이 보다 바람직하다.
특정 식물속이 밀속인 경우, 밀속의 ITS-2 서열 중의, 밀속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열로서 서열번호 40 내지 42로 나타내어지는 염기 서열 또는 그러한 상보쇄의 염기 서열을 들 수 있다. 바람직하게는 서열번호 40의 위치 11 내지 50의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 41의 위치 11 내지 47의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 42의 위치 11 내지 47의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열이다.
밀속의 프라이머(B)로서는 서열번호 43 내지 45로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다(서열번호 43은 서열번호 40의 상보쇄에, 서열번호 44는 서열번호 41에, 서열번호 45는 서열번호 42에 각각 엄격한 조건으로 혼성화한다). 또한, 상기 프라이머는 서열번호 43 내지 45로 나타내어지는 염기 서열 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 그리고, 프라이머의 조합으로서는 서열번호 43과 서열번호 44 및 45의 1개 이상의 조합이 바람직하다.
특정 식물속이 대두속인 경우, 대두속의 ITS-2 서열 중의, 대두속 내에서 공통되고, 또한 상기 속에 특이적인 염기 서열로서 서열번호 46, 47 또는 48로 나타내어지는 염기 서열 또는 그러한 상보쇄의 염기 서열을 들 수 있다. 바람직하게는 서열번호 46의 위치 11 내지 48의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 47의 위치 11 내지 55의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열, 서열번호 48의 위치 11 내지 52의 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열이다.
대두속의 프라이머(B)로서는 서열번호 49 내지 56으로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다(서열번호 49는 서열번호 46의 상보쇄에, 서열번호 50 내지 65는 서열번호 47에, 서열번호 56은 서열번호 48에 각각 엄격한 조건으로 혼성화한다). 또한, 상기 프라이머는 서열번호 49 내지 56으로 나타내어지는 염기 서열 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 그리고, 프라이머의 조합으로서는 서열번호 49와 서열번호 50 내지 56의 1개 이상의 조합이 바람직하다.
이들 프라이머의 설계나, 설계한 프라이머의 평가에 있어서는 PCR 시뮬레이션을 이용할 수 있다.
예를 들면 메밀속을 검출하는 프라이머의 설계에 있어서는 식용 메밀(보통 메밀, 달단 메밀)을 포함하는 메밀속의 식물 21 서열에 공통이면서 특이성이 높은 영역을 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 내지 ITS-2 서열 부분으로부터 찾아내고, 다시 다른 식물과의 특이성을 확보할 수 있는 염기를 3' 말단의 염기로 설정해서 서열을 선정한다. 단, 메밀속의 경우 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 내지 ITS-2 서열 부분에 있어서는 종마다 염기의 결락 부분이나 결락 염기수에 차이가 있기 때문에, 메밀속의 식물 21 서열 모두로부터 같은 사이즈의 증폭 산물을 얻기 위해서는 더욱 선별할 필요가 있다. 같은 사이즈의 증폭 산물을 얻을 수 있으면, 용이하게 메밀속의 존재를 검출할 수 있다. 메밀속에서는 특히 프라이머(A)와 프라이머(C), 또는 2개의 프라이머(A)를 선정함으로써 메밀속의 식물 21 서열 모두로부터 같은 사이즈의 증폭 산물을 얻는 것을 시뮬레이션으로 확인할 수 있다. 이것에 의해 사이즈에 의해 비특이 산물과의 식별을 용이하게 할 수 있는 프라이머를 설계할 수 있다.
본 발명에 있어서는 상기 프라이머를 이용하고, PCR법에 의해 검출 대상인 특정 식물속에 속하는 식물을 검출한다. 또는 정량적 PCR법에 의해 상기 식물을 정량한다.
PCR에 있어서는 예를 들면 문헌 [Saiki RK, et al., Science, 230:1350-1354(1985)]나 [식물세포 공학 별책, 식물의 PCR 실험 프로토콜, 시마모토 이사오·사사키 타쿠지 감수(1995년)] 등에 기재되어 있는 통상의 방법에 근거해서 변성, 어닐링, 신장의 각 스텝의 온도와 시간, 효소(DNA 폴리메라제)의 종류와 농도, dNTP 농도, 프라이머 농도, 염화마그네슘 농도, 주형 DNA량 등의 조건을 적당히 변경해서 최선의 것을 선택한다.
또한, PCR 증폭에서 사용하는 프라이머와 주형 DNA의 어닐링 온도를, HYB 시뮬레이터(HYB Simulator)(상표명) 버전 4.0(어드밴스트 진 컴퓨팅 테크놀로지스, 인크.(Advanced Gene Computing Technologies, Inc.))이나 프라이머 익스프레스(Primer Express)(상표명) 버전 1.5(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)사) 등의 시판 소프트로 산출한 상기 프라이머의 Tm값보다 높은 온도, 바람직하게는 Tm값＋10 내지 +3℃로 설정해서 PCR 증폭을 실시하고, 그 다음에 어닐링 온도를 상기 프라이머의 Tm값 근방, 바람직하게는 Tm값＋7 내지 ±0℃의 온도로 설정해서 PCR 증폭을 실시할 수도 있다.
정량적 PCR법으로서는 실시간 PCR법을 이용하는 정량 방법이 바람직하다. 실시간 PCR법으로서는 사이버 그린(SYBR Green)법, TaqMan(상표) 프로브법 등의 형광 프로브(Fluorogenic probe)법, 몰리큘라 비콘(Molecular Beacon)법, 및 라이트 사이클러(Light Cycler)(상표) 프로브법 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정은 되지 않는다. 여러 가지 방법이 최근 정력적으로 개발되고 있어, 당업자이면 임의의 방 법을 실시할 수 있다. 이 경우의 프로브의 설계에 있어서는 증폭 표적 서열에 대한 PCR 프라이머가 혼성화하는 부위의 안쪽에, 엄격한 조건으로 혼성화할 수 있는 서열로부터 선택한다.
특히, 상기한 대로 설계된 특정 식물 특이적인 프라이머 세트와, 5' 말단에 발광 색소 및 3' 말단에 소광제를 가지고 있는 증폭 표적 서열에 대한 PCR 프라이머 세트의 각 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 부위의 안쪽에, 엄격한 조건으로 혼성화하는 프로브를 이용하여 발광량에 근거해서 DNA를 정량하는 방법으로서, 상기 프로브의 5' 말단의 발광 색소는 3' 말단의 소광제에 의해 그 발광이 억제되어 있지만, PCR 반응에 있어서 Taq 폴리메라제에 의해 프라이머로부터 DNA가 신장되면, Taq 폴리메라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 상기 프로브가 분해되고, 발광 색소와 소광제가 해리해서 발광을 일으키는 것을 특징으로 하는 방법이 바람직하다. 또한, 프로브 서열 전체가 상기 PCR 프라이머가 혼성화하는 부위의 안쪽에 존재할 필요는 없고, 설계한 프로브의 3' 말단측의 염기와 프로브가 혼성화하는 쇄의 역쇄에 설계한 프라이머의 3' 말단측의 염기가 1 내지 10, 또는 1 내지 5 염기 중복하고 있을 수 있다. 또한, 프로브 서열은 검출 대상인 특정 식물속에 공통된 서열을 가지는 부분으로부터 선택하는 것이 보다 바람직하다. 상기 프로브에는 TaqMan 프로브(상표)가 바람직하다. TaqMan 프로브의 설계 방법은 당 기술분야에서는 공지이다(어플라이드 바이오시스템스사의 프라이머 익스프레스 소프트웨어 간이 조작 가이드, 프라이머 익스프레스 소프트웨어 TaqMan 프로브 검색을 위한 간이 조작 가이드: Rev. C(http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/ctlgpage.jsp?MODELCD=9775&PLCD=17689&BUCD=131 등을 참조할 것). 본 명세서 중에 있어서는 소정의 식물 또는 식물속의 식물의 정량적 PCR에 이용할 수 있는 프로브를, 소정의 식물 또는 식물속의 식물의 「검출용 프로브」라고 칭한다. 즉, 본 명세서 중, 검출용 프로브란, 각 식물속에 대한 검출용 프라이머 세트와 조합하여 상기 프로브를 이용함으로써 상기 식물속에 속하는 식물을 검출할 수 있는 프로브를 가리킨다. 여기서 검출이란, 전술한 대로 정성 및 정량적 검출의 양쪽 모두를 포함하고, 이러한 프로브는 정량적 검출에도 유리한 것은 당연히 이해될 것이다.
상기 프로브에 이용하는 발광 색소로서는 FAM, HEX, TET 및 FITC 등이 알려져 있지만, 이것들로 한정은 되지 않는다. 또한, 소광제로서는 TAMRA, 다브실(Dabcyl) 등, 및 비형광성 소광제도 알려져 있지만, 역시 이것들로 한정은 되지 않는다.
상기 프로브의 길이로서는 13 내지 30 염기 길이가 바람직하고, 특히 13 내지 25 염기 길이가 바람직하다. 또한, 짧은 염기 길이에서도 Tm값을 높게 유지할 수 있도록, 3' 말단의 소광제에 다시 MGB(Minor Groove Binden)를 표식한 프로브를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 구체적으로는 메밀속인 경우의 프로브로서는 서열번호 64로 표현되는 올리고뉴클레오티드를 예시할 수 있다. 땅콩속의 프로브로서는 프라이머에 서열번호 24와 25 중 하나와 서열번호 2 내지 4 중 하나를 조합하는 경우에는 서열번호 32 또는 33으로 나타내어지는 염기 서열의 상보쇄의 염기 서열에 엄격한 조건으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드가 바람직하고, 또한, 프라이 머에 서열번호 21 내지 23 중 하나와 서열번호 26 내지 29, 65 및 66 중 하나를 조합하는 경우에는 서열번호 34로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 예시할 수 있다. 또한 프라이머에 서열번호 30, 31 중 하나와 서열번호 26 내지 29 중 하나를 조합하는 경우에는 서열번호 34로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드에 부가해서 서열번호 35로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 상보쇄의 염기 서열에 엄격한 조건으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 프라이머에 서열번호 21과 서열번호 26, 65 및 66 중 하나를 조합하는 경우에는 프로브로서는 서열번호 34로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것이 좋다.
이러한 프로브는 설계한 서열의 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, 시판되는 키트를 사용해서 제작하는 것도 가능하고, 또 고객 주문으로 위탁 제작도 가능하고, 당 기술분야에서는 다수 위탁처가 알려져 있다(예를 들면 어플라이드 바이오시스템스사(http//www.appliedbiosvstems.co.jp) 등).
본 발명의 정량 방법은 검출(특히 정량) 대상인 특정 식물속 유래의 시료와 표준 식물 시료를 미리 정한 비율로 혼합한 보정용 샘플과 피검 대상으로 하는 식품 또는 식품 원재료에 기지량의 표준 식물 시료를 첨가한 피검 샘플을 이용해서 이들 샘플로부터 동일한 수법으로 게놈 DNA를 추출하고, 동일한 조건으로 정량적 PCR법을 실시함으로써 보정용 샘플에 대해서 표준 식물 유래 DNA의 카피수(Lo)/특정 식물속 유래 DNA의 카피수(Fo)의 값을 보정 표준치로서 구하고, 피검 샘플에 대해서 특정 식물속 유래 DNA의 카피수(Fs)/표준 식물 유래 DNA의 카피수(Ls)의 값을 구하고, 이것을 상기 보정 표준치를 이용해서 보정하고, 식품 또는 식품 원재료 (1g) 중에 포함되는 특정 식물속의 식물의 양(㎛)을 이하의 식에 의해 산출한다.
특정 식물속의 식물의 양 ppm(㎍/g)=Fs/Ls×Lo/Fo×1,000,000
따라서, 상기 방법에서는 피검 대상으로 하는 식품이나 식품 원재료마다의 DNA 추출 효율이나 PCR 반응의 저해 등의 영향, 또 피검 대상으로 하는 시료 중의 DNA 함유량의 차이에 대해서도 보정이 가능하다. 이러한 방법에 따라, 예를 들면 소금 등의 DNA를 함유하지 않는 식품 원재료나 해당 원재료를 포함하는 식품 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 적절히 정량 검출하는 것도 가능하다.
또한 위양성인지의 여부를 판단할 필요가 있는 경우에는 PCR 종료 후의 반응액 중에 포함되는 PCR 증폭 산물의 DNA 서열을 해석함으로써, 엄밀하게 조사할 수 있다.
본 발명에 이용하는 표준 식물 시료는 여러 가지 성분에 의한 DNA 추출 효율에의 영향이 가능한 한 균질한 것이 바람직한 점에서, 검출 대상인 특정 식물속과 유사한 상태인 것이 바람직하다. 또한, 검사에 제공하는 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입될 가능성이 없는 식물종에 유래하는 것이 바람직하다. 또한, 재배 과정에서, 밭 잡초가 식용 작물에 혼입될 가능성을 배제하는 것이 지극히 곤란하고, 미량의 잡초 유래의 물질이 식용 작물 중에 혼입되어 있다는 현상을 감안하여, 이러한 밭 잡초로서 인지되고 있는 식물종 이외의 식물종을 표준 식물 시료로 하는 것이 바람직하다. 즉, 표준 식물 시료의 선정에 있어서는 식품 또는 식품 원재료에 사용하는 식물이 혼입될 우려가 없고, 또한 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입될 우 려가 없는 것을 선정할 필요가 있다.
상기 밭 잡초로서는 여러 가지 밭 잡초가 알려져 있지만, 주로 벼과, 대나무아과, 부들과, 사초과, 국화과, 여뀌과, 달개비과, 속새과, 뽕나무과, 쇠비름과, 석죽과, 명아주과, 콩과, 괭이밥과, 대극과, 미나리과, 메꽃과, 차조기과, 질경이과, 가지과, 박과 등을 들 수 있다. 상세하게는 일본 잡초 학회의 홈페이지 등의 기재를 참조해 주었으면 좋겠다.
또한, 예를 들면 시판되고 있는 종자 등, 한 번에 대량으로 균일한 재료를 입수 가능하고, 그것을 보존해 둘 수 있는 것이 표준 식물 시료로서 더욱 바람직하다.
또한 표준 식물 시료는 식물의 어떠한 조직(종자, 잎, 뿌리와 줄기 등)에 유래하는 것일 수 있지만, 검출 대상이 메밀, 밀 및 땅콩 등의 종자에 유래하는 것이면, 같은 종자에 유래하는 것이 바람직하다. 이러한 관점에서 말하면, 예를 들면 수박, 파파야, 멜론 등을 포함하지 않는 식품에 대해서 검사하는 경우에는 껍질이나 과육에 의해 외계와 격리된 과육 안에 수많은 종자가 존재하는 수박, 파파야, 멜론 등의 식물종이 바람직하다. 또한, 종자가 외계와는 격리되어 있지 않아도, 식용 작물로서 재배되지 않는 식물종이면 바람직하다. 이러한 조건을 고려하면, 본 발명에 이용하는 표준 식물 시료로서는 상기 조건을 충족시키는 것이면 특히 한정은 되지 않지만, 네모필라(히드로필라과(Hydrophyllaceae)), 글록시니아(암연초과) 및 스타티스 유래의 것을 들 수 있고, 스타티스(갯길경과)의 종자가 특히 바람직하다.
표준식물 시료로서는 DNA 추출 저해 활성 또는 PCR 반응 저해 활성을 가지는 성분의 함량이 많은 것은 DNA 추출 효율, 및 정량적 PCR법의 감도 및(또는) 정밀도등의 관점에서 피하는 것이 바람직하다.
본 명세서 중의 실시예에는 표준 식물 시료로서 스타티스의 종자를 이용한 예를 들고 있다. 위에서 설명한 바와 같이 밭 잡초는 식용 작물에 혼입될 우려가 높고, 표준 식물 시료로서는 부적절하기 때문에, 밭 잡초로서 일본 잡초 학회의 홈페이지(http//wssj.ac.affrc.go.jp)에 거론되어 있는 860종류의 식물 전부의 과명을 조사하고, 그 중에 없는 과에 속하는 식물로서 스타티스가 선택되었다. 스타티스의 ITS-1 서열을 특이적으로 검출하는 프라이머를 이용하고, 일반적인 식품 원재료인 시판되는 소맥분 5종류, 옥수수 가루 5종류, 겨자 3종류에 대해서 스타티스의 혼입의 유무를 시험했지만, 어느 것에서도 전혀 검출되지 않았기 때문에, 스타티스는 본 발명에 있어서의 표준 식물 시료로서 매우 적합하다고 추정되었다.
또한, 스타티스 대신에 밭 잡초를 많이 포함하는 벼과 중 쌀을 표준 식물 시료로서 이용하는 것이 바람직하지 않은 것을 본 발명자 등은 확인했다. 이것은 밭 잡초인 벼과 식물이 원재료 식물의 수확 시 등에, 수확물에 혼입되기 때문이라고 생각된다.
표준 식물 시료로서 선택한 식물 재료(예를 들면 스타티스의 종자)를 분쇄한 것을 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료로서 선택한 식물(예를 들면 메밀)의 분쇄물과 미리 정한 비율로 혼합해서 보정용 샘플을 준비한다. 이것과는 별도로 상기와 같은 표준 식물 시료의 분쇄물을 피검 대상인 식품 또는 식품 원재료에 첨가 해서 피검 샘플을 조제한다. 또한 상기 분쇄 공정에 있어서는 다른 식품 원재료나, 특히 검출 대상으로 하는 특정 식물속 유래의 시료와 표준 식물 시료가 서로 혼입되지 않게, 충분히 배려하는 것이 중요하고, 분쇄에 사용하는 기구 등의 세정 등에 만전을 기해야 하는 것이다. 또한 상기 보정용 및 피검 샘플을 조제함에 있어서는 보정용 샘플 중의 특정 식물 유래의 시료의 양과 피검 샘플 중의 식품 또는 식품 원재료의 시료의 양은 거의 같은 양으로 하는 것이 바람직하고, 또한, 보정용 샘플 중의 표준 식물 시료의 양과 피검 샘플 중의 표준 시료 유래의 시료의 양은 거의 같은 양으로 하는 것이 바람직하다.
다음에, 이들 샘플로부터 DNA를 추출한다. 이 DNA의 추출은 여러 가지 공지의 방법에 따라 실시할 수 있고, 시판되는 키트 또는 프리팩 컬럼을 이용할 수도 있다. 예를 들면 문헌 [QIAGEN Genomic DNA Handbook]이나 [User-Developed Protocol:Isolation of genomic DNA from plants using the QIAGEN Genomic-tip]을 참고로 하고, QIAGEN사제의 게노믹-팁(Genomic-tip)을 이용할 수 있다.
그리고, 추출된 DNA를 정량적 PCR법으로 제공한다. 정량 분석을 위한 PCR 기술은 여러 가지 것이 공지이지만, TaqMan 프로브(등록상표)를 이용하는 실시간 PCR 정량법이 간편하면서도 유리할 것이다.
표준 식물 시료의 검출(정량적 검출도 포함한다)용의 프라이머는 표준 식물 시료의 DNA에 특이적인 증폭을 가져오는 프라이머인 것이 바람직하다. 또한, 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료와 표준 식물 시료를 미리 정한 비율로 혼합한 보정용 샘플로부터 추출한 게놈 DNA에 대해서 정량적 PCR법을 실시했을 때의 표준 식 물 유래의 DNA의 카피수가, 특정 식물속 유래의 DNA의 카피수와 너무 차이나지 않고, 양자의 카피수의 차이가 100배 이내, 바람직하게는 10배 이내가 되는 프라이머인 것이 전술의 Lo/Fo비가 안정되기 때문에 바람직하다.
예를 들면 스타티스를 표준 식물 시료로 하는 경우, 스타티스의 프라이머는 그 ITS-1 서열의 일부에 유래하는 이하의 서열:
5'-TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3'(서열번호 57) 및
5'-CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3'(서열번호 58)을 포함하는 프라이머를 이용할 수 있고, 또한 스타티스 검출용의 TaqMan 프로브로서는 전술한 바와 같이 증폭 표적 서열에 대한 PCR 프라이머가 혼성화하는 부위의 안쪽에 혼성화하는 것일 수 있고, 예를 들면 ITS-1 서열의 일부에 유래하는 이하의 서열:
5'-TGT GCG ACG CGG AAT G-3'(서열번호 59)을 가지는 프로브에 형광 색소를 표식하여 TaqMan 프로브로서 이용할 수 있다.
실시간 PCR 정량법에 의해 보정용 샘플 및 피검 샘플의 표준 식물 유래의 DNA의 카피수와 검출 대상인 특정 식물속 유래의 DNA의 카피수를 검량선으로부터 산출한다.
이 검량선의 제작은 당업자이면 여러 가지 방법에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 표준 식물 시료 및 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료에 대한 정량적 PCR법에 따른 증폭 표적 서열을 포함하는 기존의 길이의 DNA를 주형으로 하여 이용해서 정량적 PCR법을 실시하여 검량선을 제작할 수 있다.
나아가서는 표준 식물 시료 및 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료에 대한 정량적 PCR법에 따른 증폭 표적 서열을 포함하는 검량선용의 플라스미드를 제작하고, 이것을 주형에 이용함으로써 보다 재현성이 높고 오차가 적은 검량선을 제작할 수 있다. 검출 대상으로 하는 특정 식물속 유래의 시료의 증폭 표적 서열을 포함하는 DNA와, 표준 식물 시료의 증폭 표적 서열을 포함하는 DNA를 1개의 플라스미드 벡터에 삽입한 검량선용 플라스미드를 제작한다. 상기 플라스미드를 대장균 등으로 증폭시킴으로써 검량선용의 주형을 얻을 수 있다.
예를 들면 표준 식물 시료 및 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료에 대한 정량적 PCR법에 따른 증폭 표적 서열을, 아우터 프라이머와 브릿지 프라이머를 이용하는 Jayaraman K. 등의 방법(1992. BioTechniques 12:392-398)을 이용해서 연결할 수 있다.
1개의 플라스미드 중에 표준 식물 시료 및 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료에 대한 증폭 표적 서열을 함유시킴으로써, 희석에 의한 양 서열의 농도의 오차를 저감시킬 수 있다. 또한, 짧은 플라스미드 DNA 분자를 이용하는 것에 의해서도 희석의 오차를 저감시킬 수 있다.
검량선용 주형은 그 염기 길이가 기지인 것을 사용하기 때문에, 중량 농도와 염기 길이로부터 검량선용 주형 용액 중에 포함되는 카피수가 결정될 수 있다. 이 카피수에 비추어 피검 샘플 중에 포함되는 카피수를 산정한다.
이러한 본 발명의 정량적 PCR 검출법의 사고방식은 검출 대상인 특정의 원료가 축산 제품 등의 동물에 유래하는 것인 경우, 및 특정의 원료가 미생물에 유래하는 경우에도 적용 가능하고, 검출 대상인 특정의 원료가 축산 제품 등의 동물에 유 래하는 경우는 동물 유래의 원재료를 표준 시료로 하는 것이 바람직하고, 특정의 원료가 미생물에 유래하는 경우는 미생물 유래의 원재료를 표준 시료로 하는 것이 바람직하다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2003-139513호의 명세서 및(또는) 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1A는 백화 메밀에 대해서 PCR의 감도를 조사한 결과이다. PCR 후, 2％ 아가로오스 겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드로 염색하고, 형광 이미지 애널라이저로 해석했다.
도 1B는 달단 메밀에 대해서 PCR의 감도를 조사한 결과이다. PCR 후, 2％ 아가로오스 겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드로 염색하고, 형광 이미지 애널라이저로 해석했다.
도 2는 메밀 PCR의 특이성을 조사한 결과이다. PCR 후, 2％ 아가로오스 겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드로 염색하고, 형광 이미지 애널라이저로 해석했다.
도 3은 스타티스 PCR의 특이성을 다른 식물 종자에 대해서 조사한 결과이다. PCR 후, 2％ 아가로오스 겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드로 염색하고, 형광 이미지 애널라이저로 해석했다.
도 4는 스타티스 PCR의 특이성을 여러 가지 식품 원재료에 대해서 조사한 결과이다. PCR 후, 2％ 아가로오스 겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드로 염색하고, 형광 이미지 애널라이저로 해석했다.
도 5A는 메밀 DNA의 정량적 PCR법의 결과이다. 메밀 DNA 500pg, 밀, 땅콩, 대두, 옥수수, 겨자, 후추, 쌀은 각각 DNA 50ng에 대해서 정량적 PCR법을 실시했지만, 메밀 이외에서는 정량 검출역에서는 검출되지 않고, 메밀만이 특이적으로 정량 가능한 것을 확인했다.
도 5B는 메밀 DNA의 정량적 PCR법의 결과이다. 메밀은 DNA 500pg, 스타티스 DNA 50ng에 대해서 정량적 PCR법을 실시했지만, 스타티스에서는 정량 검출역에서는 검출되지 않는 것을 확인했다.
도 6은 메밀 DNA의 정량적 PCR법의 결과이다. 메밀덩굴 DNA에 대해서 정량적 PCR법을 실시하여, 메밀덩굴은 DNA 50ng을 주형으로 했을 경우에 있어서도 검량선용 플라스미드 10 카피의 주형의 경우에 대해서 증폭 속도가 분명하게 느리고, 또한 임계값 라인(Threshold Line)에도 걸리지 않고, 정량 검출역에서는 검출되지 않고, 메밀만이 특이적으로 정량 가능한 것을 확인했다.
도 7은 검량선용 플라스미드를 이용해서 메밀 DNA의 정량적 PCR법을 실시한 결과이다.
도 8은 도 7의 결과로부터 얻어진 그래프이다.
도 9는 스타티스 DNA의 정량적 PCR법의 결과이다. 스타티스는 DNA 500pg을 주형으로 하여 PCR을 실시했다. 밀, 땅콩, 대두, 옥수수, 겨자, 후추, 쌀, 메밀덩굴은 각각 DNA 50ng에 대해서 정량적 PCR법을 실시했지만, 정량 검출역에서는 검출되지 않고, 스타티스만이 특이적으로 정량 가능한 것을 확인했다.
도 10은 검량선용 플라스미드를 이용해서 스타티스 DNA의 정량적 PCR법을 실 시한 결과이다.
도 11은 도 10의 결과로부터 얻어진 그래프이다.
도 12는 땅콩 PCR의 특이성을 여러 가지 식품 원재료에 대해서 조사한 결과이다. PCR 후, 2％ 아가로오스 겔 전기 영동 및 에티듐 브로마이드로 염색하고, 형광 이미지 애널라이저로 해석했다.
도 13은 땅콩 DNA의 정량적 PCR법의 결과이다. 땅콩 DNA 500fg, 밀, 메밀, 대두, 옥수수, 사과, 팥, 스타티스는 각각 DNA 50ng에 대해서 정량적 PCR법을 실시했지만, 땅콩 이외에서는 정량 검출역에서는 검출되지 않고, 땅콩만이 특이적으로 정량 가능한 것을 확인했다.
도 14는 땅콩 DNA를 이용해서 땅콩 DKA의 정량적 PCR법을 실시한 결과이다.
도 15는 도 14의 결과로부터 얻어진 그래프이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1
A. DNA 추출에 이용한 식물 시료
(1) 메밀 종자:
타카노 주식회사에서 판매되고 있는 백화 메밀(보통 메밀; 파고피룸 에스쿨렌툼: 2배체), 달단 메밀(파고피룸 타타리쿰: 2배체)의 종자를 이용했다.
(2) 밀, 땅콩, 대두, 옥수수, 겨자, 스타티스의 종자와 백후추, 쌀(현미):
시판품을 이용했다.
(3) 밀, 대두, 옥수수, 겨자, 메밀덩굴의 잎:
시판품의 종자로부터 발아시킨 잎을 이용했다.
B. DNA 추출
(1) 메밀 종자, 백후추로부터의 DNA 추출:
문헌 [QIAGEN Genomic DNA Handbook]이나 [User-Developed Protocol:Isolation of genomic DNA from plants using the QIAGEN Genomic-tip]을 참고로 하고, QIAGEN사제의 게노믹-팁을 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
미세하게 분쇄한 시료 1g을 15㎖들이 튜브에 넣고, 4㎖의 칼손 라이시스(Carlson Lysis) 완충액(0.1M Tris-HCl(pH 9.5), 2％ CTAB, 1.4M 폴리에틸렌 글리콜 #6000, 20mM EDTA), 8㎕의 RNase A(100㎎/㎖), 10㎕의 2-메르캅토에탄올, 80㎕의 프로테이나제 K(20㎎/㎖))를 가하여 혼합한 후, 74℃로 20분간 보온했다. 실온으로 되돌린 후, 여기에 5㎖의 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1)을 가하여 잘 혼합한 후, 원심분리에 의해 수층을 회수했다. 이 수층에 등량의 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 가하여 잘 혼합한 후, 원심분리에 의해 수층을 회수했다. 재차, 이 수층에 등량의 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 가하여 잘 혼합한 후, 원심분리에 의해 수층을 회수했다.
얻어진 수층의 1/2량을 취해서 이소프로판올 침전에 의해 침전물을 회수했다. 침전물은 500㎕의 완충액 QBT에 용해시키고, 미리 1㎖의 완충액 QBT로 평형화한 게노믹-팁 20/G에 제공하여 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 후, 5㎖의 완충액 QBT, 계속해서 2㎖의 완충액 QC로 컬럼을 세정했다. 최종적으로 1.7㎖의 완충액 QF로 용출시키고, 이소프로판올 침전에 의해 회수한 침전물을 40㎕의 멸균 초순수에 용해시켰다. 용액 중의 DNA 농도를 측정하여 적당히 멸균 초순수로 희석한 것을 PCR의 주형 DNA 시료로 했다.
(2) 밀, 대두, 옥수수, 겨자, 스타티스의 종자와 쌀(현미)로부터의 DNA 추출:
문헌 [DNeasy Plant Maxi Kit Handbook]을 참고로 하고, QIAGEN사제의 DNeasy 플랜트 맥시 키트(DNeasy Plant Maxi Kit)를 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
미세하게 분쇄한 시료 2g을 50㎖들이 튜브에 넣고, 10㎖의 완충액 AP1, 20㎕의 RNase A(100㎎/㎖)를 가해서 혼합하여 65℃로 15분간 보온한 후, 약 3,000×g으로 10분간 원심분리했다. 얻어진 상청 중 4㎖를 15㎖들이 튜브에 회수하고, 거기에 1.8㎖의 완충액 AP2를 가하여 얼음 중에서 10분간 방치한 후, 약 3,000×g으로 10분간 원심분리했다. 얻어진 상청을 QIA쉬레더 스핀 컬럼(QIAshredder Spin Column)에 제공하고, 약 3,000×g으로 5분간 원심분리했다. 얻어진 패스액 중 5㎖를 50㎖들이 튜브에 회수하고, 거기에 7.5㎖의 완충액 AP3/E를 가하여 혼합한 후, DNeasy 스핀 컬럼(DNeasy Spin Column)에 제공하고, 약 3,000×g으로 5분간 원심분리해서 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 후, 컬럼에 12㎖의 완충액 AW를 가하고, 약 3,000×g으로 5분간 원심분리해서 컬럼을 세정, 재차 12㎖의 완충액 AW를 가하고, 약 3,000×g으로 10분간 원심분리해서 컬럼을 세정했다. 최종적으로 65℃로 미리 보온해 둔 1㎖의 완충액 AE를 컬럼에 가하고, 10분간 방치 후에 약 3,000×g으로 5 분간 원심분리해서 컬럼으로부터 DNA를 용출시켰다. 용액 중의 DNA 농도를 측정하여 적당히 멸균 초순수로 희석한 것을 PCR의 주형 DNA 시료로 했다.
(3) 땅콩 종자로부터의 DNA 추출:
문헌 [QIAGEN Genomic DNA Handbook]과 [Nucleospin Extract 2 in 1 For Direct Purification of PCR Products]를 참고로 하고, QIAGEN사제의 DNeasy 플랜트 맥시 키트와 마케리-나겔(MACHEREY-NAGEL)사제의 뉴클레오스핀 익스트랙트 2 인 1(Nucleospin Extract 2 in 1)을 조합해서 이용하고, 이하의 방법으로 실시했다.
미세하게 분쇄한 시료 1g을 15㎖들이 튜브에 넣고, 10㎖의 완충액 G2, 100㎕의 프로테이나제 K(20㎎/㎖), 10㎕의 RNase A(100㎎/㎖)를 가하여 혼합한 후, 50℃로 1 시간 보온했다. 그 후, 약 3.000×g으로 10분간 원심분리하여 그 상청액을 얻었다. 얻어진 상청액을, 미리 1㎖의 완충액 QBT로 평형화한 게노믹-팁 20/G에 제공하여 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 후, 4㎖의 완충액 QC로 컬럼을 세정하고, 미리 50℃로 가온되어 있는 1㎖의 완충액 QF로 용출시켰다. 용출액에 4용량의 완충액 NT2를 가하여 혼합한 후, 2개의 뉴클레오스핀 익스트랙트 컬럼에 1회에 650㎕식 제공하고, 약 6,000×g으로 1분간 원심분리해서 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 이것을 전액량 처리할 때까지 반복했다. 그 후, 컬럼에 600㎕의 완충액 NT3을 가하고, 약 6,000×g으로 1분간 원심분리해서 컬럼을 세정, 재차 600㎕의 완충액 NT3을 가하고, 최고속도로 1분간 원심분리하여 컬럼에 남아 있는 완충액 NT3을 완전하게 제거했다. 최종적으로 100㎕의 완충액 NE를 컬럼에 가하고, 최고속도로 1분간 원심분리해서 컬럼으로부터 용출시키고, 이소프로판올 침전에 의해 회수한 침전물을 50㎕의 멸균 초순수에 용해시켰다. 용액 중의 DNA 농도를 측정하여 적당히 멸균 초순수로 희석한 것을 PCR의 주형 DNA 시료로 했다.
(4) 밀, 대두, 옥수수, 겨자, 메밀덩굴의 잎으로부터의 DNA 추출:
문헌 [DNeasy Plant Mini Kit Handbook]을 참고로 하고, QIAGEN사제의 DNeasy 플랜트 미니 키트(DNeasy Plant Mini Kit)를 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
미세하게 분쇄한 시료 0.5g을 15㎖들이 튜브에 넣고, 3㎖의 완충액 AP1, 30㎕의 RNase A(100㎎/㎖)를 가하여 혼합한 후, 65℃로 15분간 보온했다. 그 후, 여기에 975㎕의 완충액 AP2를 가하여 얼음 중에서 10분간 방치하고, 원심분리에 의해 그 상청액을 얻었다. 얻어진 상청을 QIA쉬레더 스핀 컬럼에 제공하고, 원심분리에 의해 컬럼의 패스액을 얻었다. 이 패스액에 0.5용량의 완충액 AP3, 1용량의 에탄올을 가하여 혼합한 후, 2개의 DNeasy 스핀 컬럼에 1회에 650㎕씩 제공하고, 약 6,000×g으로 1분간 원심분리해서 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 이것을 전액량 처리할 때까지 반복했다. 그 후, 컬럼에 500㎕의 완충액 AW를 가하고, 약 6,000×g으로 1분간 원심분리해서 컬럼을 세정, 재차 500㎕의 완충액 AW를 컬럼에 가하고, 최고속도로 1분간 원심분리하여 컬럼에 남아 있는 완충액 AW를 완전하게 제거했다. 최종적으로 65℃로 미리 보온해 둔 120㎕의 완충액 AE를 컬럼에 가하고, 약 6,000×g으로 1분간 원심분리해서 컬럼으로부터 용출시켰다. 용액 중의 DNA 농도를 측정하여 적당히 멸균 초순수로 희석한 것을 PCR의 주형 DNA 시료로 했다.
C. 메밀의 ITS -1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열의 일부를 검출하는 PCR
(1) 메밀속 검출용 프라이머 :
프라이머 서열에는 메밀속에 속하는 식물의 GenBank에 등록되어 있는 이하의 21 서열 중의 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열에 공통인 서열을 이용했다.
1: 파고피룸 우로필룸(Fagopyrum urophyllum)(AB000342)
2: 파고피룸 우로필룸(AB000341)
3: 파고피룸 타타리쿰(아종: 포타니니(potanini))(AB00034)
4: 파고피룸 타타리쿰(AB000339)
5: 파고피룸 스타티스(Fagopyrum statice)(AB000338)
6: 파고피룸 스타티스(AB000337)
7: 파고피룸 플레이오라모숨(Fagopyrum pleioramosum)(AB000336)
8: 파고피룸 리네아레(Fagopyrum lineare)(AB000335)
9: 파고피룸 렙토포둠(Fagopyrum leptopodum)(AB000334)
10: 파고피룸 호모트로피쿰(Fagopyrum homotropicum)(AB000333)
11: 파고피룸 그라실리페스(Fagopyrum gracilipes)(AB000332)
12: 파고피룸 에스쿨렌툼 안세스트랄리스(Fagopyrum esculentum ancestralis)(AB000331)
13: 파고피룸 에스쿨렌툼(AB000330)
14: 파고피룸 시모숨(AB000329)
15: 파고피룸 시모숨(AB000328)
16: 파고피룸 시모숨(AB000327)
17: 파고피룸 시모숨(AB000326)
18: 파고피룸 시모숨(AB000325)
19: 파고피룸 시모숨(AB000324)
20: 파고피룸 카필라툼(Fagopyrum capillatum)(AB000323)
21: 파고피룸 카필란툼(Fagopyrum callianthum)(AB000322)
그리고, 하기 서열의 올리고 DNA 프라이머(주식회사 QIAGEN사제 OPC 정제품)를 합성하여, 메밀 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열의 일부를 검출하는 PCR(이하, 메밀 PCR로 한다)용 프라이머로서 사용했다.
5'-CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G-3'(서열번호 14)
5'-CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT-3'(서열번호 15)
(2) 메밀속 검출용 프라이머와 특이성( PCR 시뮬레이션):
PCR 시뮬레이션 소프트 앰플리파이 1.0(빌 엔젤스(Bill Engels))에 의해 메밀속에 속하는 식물의 21 서열, 메밀 이외의 알레르기를 일으킬 우려가 있는 식물 8 서열(땅콩, 밀, 대두, 호두, 송이버섯, 복숭아, 사과, 오렌지), 식품 원재료로서 흔히 사용되고 있는 식물 4 서열(옥수수, 쌀, 후추, 겨자), 메밀 근연종 식물의 27 서열로부터, 메밀 검출용 프라이머로 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 시뮬레이션 결과가 되는지를 확인했다. 여기서 말하는 메밀 근연종의 식물이란, GenBank에 등록되어 있는 보통 메밀 파고피룸 에스쿨렌툼의 염기 서열(AB000330)의 ITS-1 서열 부분을 BLAST 상동성 검색에 제공하여 스코어 60 점(bit) 이상이 된 메밀속 이외의 식물이다. 이번에는 또 그 식물이 속하는 속 중에서 가장 스코어가 높은 값이 된 종의 서열을, 그 속의 대표 서열로서 선정했다. 또한 PCR 시뮬레이션은 그들 서열의 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 내지 ITS-2 서열의 영역에 대해서 실시했다. 시뮬레이션에 이용한 서열의 GenBank 수탁 번호 및, 시뮬레이션 결과를 표 1A 내지 1C에 나타낸다. 표 1A 내지 1C의 생략 문자, 기호는 이하에 나타내는 바와 같다:
흑별표: 표적 사이즈 부근(+10bP)의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있다고 예상된 것
W값: PCR 증폭 산물을 얻을 수 있을 가능성
얻을 수 있을 가능성이 높다…W6>WS>W4>W3>W2…얻을 수 있을 가능성이 낮다
수치(bp): PCR 증폭 산물의 사이즈(bp)
앰플리파이로 얻어진 값으로부터 2를 뺀 값
-: PCR 증폭 산물이 없을 것으로 예상된 것
Figure 112005065695796-pct00001
Figure 112005065695796-pct00002
Figure 112005065695796-pct00003
시뮬레이션의 결과, 표 1A 내지 1C에 나타내는 바와 같이, 메밀속의 21 서열로부터는 표적으로 한 101bp 사이즈의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것이 예상되었다. 또한, 메밀속 이외의 알레르기를 일으킬 우려가 있는 식물 8 서열(땅콩, 밀, 대두, 호두, 송이버섯, 복숭아, 사과, 오렌지), 식품 원재료로서 흔히 사용되고 있는 식물 4 서열(옥수수, 쌀, 후추, 겨자), 메밀 근연종 식물의 27 서열로부터는 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물 및 비특이적인 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없는 것이 예상되었다.
(3) 메밀 PCR :
QIAGEN사제의 핫스타택 마스타 믹스 키트(HotstarTaq Master Mix Kit)를 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
12.5㎕의 2×핫스타택 마스타 믹스(핫스타택 DNA 폴리메라제, 3mM MgCl2 함유 PCR 완충액, 400μM 각 dNTP)에, 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머를 각각 종농도로 0.5μM씩, 및 주형 DNA를 가하고, 최종적으로 멸균 초순수로 25㎕로 한 반응용 용액을 0.2㎖ 마이크로 튜브에 넣어 어플라이드 바이오시스템스사제의 서멀 사이클 GeneAmp PCR 시스템 9600에 의해 95℃, 15분(효소 활성화) 후, 95℃, 1분(변성), 66℃, 2분(어닐링), 72℃, 1분(신장)의 사이클을 45회 반복한 후, 72℃, 4분(최종 신장)으로 해서 반응시켰다. 얻어진 PCR 반응액을 에티듐 브로마이드 함유의 2％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences) 주식회사제의 형광 이미지 애널라이저 플루오로이미저(FluorImager) 595에 의해 해석했다. 그 결과를 도 1A, 1B와 도 2에 나타낸다. 도 1A, 1B와 도 2의 생략 문자, 기호 등은 이하에 나타내는 바와 같이이다:
M: 100bp DNA 래더 마커(Ladder Marker)
(-): 주형 DNA 미첨가
숫자: 첨가한 주형 DNA량
화살표: 표적의 PCR 증폭 산물의 밴드(약 101bp).
또한 추출한 식물 DNA가 PCR 증폭 가능한 레벨의 순도인 것은, 식물 엽록체 DNA의 일부를 증폭하는 프라이머에 의해 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것으로 확인했다(데이터 생략).
(4) 메밀 PCR 의 감도와 특이성:
메밀 PCR의 결과, 도 1A, 1B에 나타내는 바와 같이, 백화 메밀(보통 메밀)과 달단 메밀 DNA 500 내지 50fg으로부터 표적으로 한 메밀 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열로부터 예상되는 약 101bp 사이즈의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 500 내지 50fg의 메밀 DNA를 검출할 수 있는 감도란, 어느 시료로부터 추출한 DNA 50ng을 주형으로 하여 PCR을 실시했을 경우, 그 시료 DNA 중에 포함되는 10 내지 1ppm의 메밀 DNA를 검출할 수 있는 레벨의 감도에 상당한다.
메밀 PCR의 결과, 도 2에 나타내는 바와 같이, 밀의 잎, 땅콩의 종자, 대두의 잎, 옥수수의 잎, 겨자의 잎, 백후추, 쌀 DNA 50ng으로부터는 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물 및 비특이적인 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없었다. 연어 정자 DNA로부터도 마찬가지로 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없는 것을 확인했다(데이터 생략). 또한 도 2에 나타내는 바와 같이, 메밀 근연종의 하나인 메밀덩굴의 잎 DNA에 대해서는 50 내지 5ng에서는 매우 얇으면서 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었지만, 50Opg 이하에서는 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물 및 비특이적인 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없었다. 500pg 이하의 메밀덩굴 DNA를 위양성으로 검출하지 않는 특이성이란, 어느 시료로부터 추출한 DNA 50ng을 주형으로 하여 PCR했을 경우, 그 시료 DNA 중에 1％ 이하의 메밀덩굴 DNA가 존재하고 있었다고 해도, 그것이 위양성으로서 검출되지 않는 레벨의 특이성에 상당한다. 또한, PCR 조건을 변경함으로써 메밀덩굴 DNA 50 내지 5ng으로부터도 표적 사이즈의 산물을 얻을 수 없게 될 가능성도 있다.
(5) 메밀 PCR 증폭 산물의 염기 서열 해석:
상기에서 얻어진 백화 메밀 DNA 유래의 PCR 증폭 산물의 염기 서열은 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머를 이용한 양쇄 다이렉트 시퀀스에 의해 해석했다. 얻어진 염기 서열을, GenBank에 등록되어 있는 보통 메밀 파고피룸 에스쿨렌툼의 염기 서열(AB000330)과 비교하여, 백화 메밀 DNA 유래의 PCR 증폭 산물의 염기 서열은 GenBank에 등록되어 있는 보통 메밀(파고피룸 에스쿨렌툼)의 염기 서열(AB000330)의 표적으로 한 부분과 100％ 합치하는 것을 확인했다. 이것으로부터 상기 프라이머를 이용한 PCR에 의해 메밀 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자의 일부 서열을 증폭, 검출하고 있는 것이 입증되었다.
이상의 결과로부터 상기 프라이머를 이용한 메밀 PCR에 의해 메밀속에 속하는 식물 전반의 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열을 고감도인 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 것이 분명해졌다. 본 프라이머를 메밀 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열의 카피수를 정량하는 PCR(이하, 메밀 서열의 정량적 PCR법으로 한다)에 이용하기로 했다.
D. 스타티스 ITS -1 서열의 일부를 검출하는 PCR (보정용)
다음에, 보정에 이용하는 표준 식물 시료의 PCR에 의한 검출에 대해서 검토했다.
본 실시예에 있어서는 일본 잡초 학회의 밭 잡초의 리스트에는 없는 종자 식물로서, 종자의 입수가 용이한 스타티스를 표준 식물 시료로서 이용했다.
(1) 스타티스 검출용 프라이머 :
GenBank에 등록되어 있는 스타티스의 DNA 서열(AJ222860)을 기초로, 하기 서열의 스타티스 ITS-1 서열의 일부를 검출하는 PCR(이하, 스타티스 PCR로 한다)용 프라이머를 설계하여 올리고 DNA 프라이머(주식회사 QIAGEN사제 OPC 정제품)를 합성했다.
5'-TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3'(서열번호 57)
5'-CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3'(서열번호 58)
(2) 스타티스 PCR :
상기 프라이머를 각각 종농도로 0.2μM씩 이용한 것 이외는 기본적으로 상기 실시예 1.C.(3)과 같은 방법으로 실시했다. 그 결과를 도 3과 도 4에 나타낸다.
또한 추출한 식물 DNA가 PCR 증폭 가능한 레벨의 순도인 것은, 식물 엽록체 DNA의 일부를 증폭하는 프라이머에 의해 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(데이터 생략).
(3) 스타티스 PCR 의 특이성주:
스타티스 PCR의 결과, 도 3에 나타내는 바와 같이, 스타티스의 종자 DNA 50ng으로부터 표적으로 한 스타티스 ITS-1 서열로부터 예상되는 약 101bp 사이즈의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 또한, 백화 메밀, 달단 메밀의 종자, 밀의 종자, 땅콩의 종자, 대두의 종자, 옥수수의 종자, 겨자의 종자, 백후추, 쌀, 메밀덩굴의 잎 DNA 50ng으로부터는 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물 및 비특이적인 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없었다. 연어 정자 DNA로부터도 마찬가지로 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없는 것을 확인했다(데이터 생략).
따라서, 상기 스타티스 DNA 검출용의 프라이머는 스타티스 DNA에 대한 특이성을 가지고 있다고 추측된다.
(4) 식품 원재료에의 스타티스 혼입의 유무의 평가:
다음에, 스타티스가 표준 식물 시료로서 적절한 것을 확인한다. 즉, 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입되어 있지 않은 것을 확인하기 위해서, 스타티스 PCR을 실시했다. 스타티스 PCR의 결과, 도 4에 나타내는 바와 같이, 5종류의 소맥분, 5종류의 옥수수 가루, 3종류의 겨자의 종자 DNA 50ng으로부터는 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물 및 비특이적인 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없었다.
(5) 스타티스에의 메밀 혼입의 유무의 평가:
스타티스 종자의 시료 중에, 메밀이 혼입되어 있지 않는지의 여부를 확인하기 위해서, 후술한 대로 확립한 메밀 서열의 정량적 PCR법으로 확인했다. 메밀 서열의 정량적 PCR법의 결과와 스타티스의 종자 DNA로부터는 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승은 보여지지 않고, 혼입은 인지되지 않는 것을 확인했다(데이터 생략).
(6) 스타티스 PCR 증폭 산물의 염기 서열 해석:
상기에서 얻어진 스타티스 DNA 유래의 PCR 증폭 산물의 염기 서열은 서열번호 57과 서열번호 58의 프라이머를 이용한 양쇄 다이렉트 시퀀스에 의해 해석했다. 또한 얻어진 염기 서열을, GenBank에 등록되어 있는 스타티스(리모니움 시누아툼(Limonium sinuatum))의 염기 서열(AJ222860)과 비교하여, 스타티스 DNA 유래의 PCR 증폭 산물의 염기 서열은 GenBank에 등록되어 있는 스타티스(리모니움 시누아툼)의 염기 서열(AJ222860)의 표적으로 한 부분과 100％ 합치하는 것이 확인되었다. 스타티스 PCR에 의해 표적으로 한, 스타티스 ITS-1의 일부 서열을 증폭, 검출하고 있는 것이 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 스타티스는 식품 원재료와의 상호 혼입이 없고, 보정용 표준 식물 시료로서 적절하다고 하는 것이 시사되었다. 그래서, 서열번호 57과 서열번호 58의 프라이머를, 스타티스 ITS-1 서열의 카피수를 정량하는 PCR(이하, 스타티스 서열의 정량적 PCR법으로 한다)에 이용하기로 했다.
E. 정량 해석에 이용하는 검량선용 플라스미드의 제작
(1) 메밀과 스타티스 PCR 의 표적 DNA 서열의 연결 PCR 과 연결 PCR 증폭 산물의 염기 서열 해석:
메밀 표적 증폭 산물과 스타티스 표적 증폭 산물을 PCR법에 의해 연결하고, TA 클로닝 벡터에 도입하여 대장균에 형질 전환해서 증폭시킴으로써, 메밀과 스타티스의 카피수를 정량 해석하기 위한 검량선용 플라스미드를 제작했다.
우선, 하기 서열의 올리고 DNA 프라이머(주식회사 QIAGEN사제 OPC 정제품)을 합성해서 프라이머로서 사용했다. 이들 프라이머는 상술의 메밀과 스타티스 PCR에 이용한 메밀 및 스타티스의 프라이머 부위를 포함하고 있다.
5'-TCT AGA CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G-3'(서열번호 60)
5'-CAA AAG CTT CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT-3'(서열번호 61)
5'-ACG AAG CTT TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3'(서열번호 62)
5'-GGA TCC CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3'(서열번호 63)
제이아라만 케이(Jayaraman K) 등(1992. A PCR-Mediated Gene Synthesis Strategy Involving the Assembly of Oligonucleotides Representing Only One of the Strands. BioTechniques 12:392-398)의 방법을 참고로 하고, QIAGEN사제의 핫스타택 마스타 믹스 키트를 이용해서 이하의 방법에 의해 연결 플라스미드를 제작했다.
25㎕의 2×핫스타택 마스타 믹스(핫스타택 DNA 폴리메라제, 3mM Mgcl2 함유 PCR 완충액, 400μM 각 dNTP)에 다시 dNTP를 종농도로 500μM가 되도록 가하고, 서열번호 60과 서열번호 63을 아우터 프라이머로서 각각 종농도로 1.0μM씩, 서열번호 61과 서열번호 62를 브릿지 프라이머로서 각각 종농도로 25nM씩 가하고, 다시 주형 DNA로서 실시예 1.C.(4)에서 얻어진 메밀 PCR의 표적 DNA 서열을 가지는 PCR 증폭 산물과 실시예 1.D.(3)에서 얻어진 스타티스 PCR의 표적 DNA 서열을 가지는 PCR 증폭 산물을 가하고, 최종적으로 멸균 초순수로 50㎕로 한 반응용 용액을 0.2㎖ 마이크로 튜브에 넣고, MJ 리서치(MJ Research)사제의 서멀 사이클러 PTC-200 DNA 엔진(Engine)에 의해 95℃, 15분(효소 활성화) 후, 95℃, 1분(변성), 40℃, 1분(어닐링), 72℃, 1분(신장)의 사이클을 15회 반복하고, 다시 95℃, 1분(변성), 66℃, 1분(어닐링), 72℃, 1분(신장)의 사이클을 30회 반복해서 반응시켰다. 얻어진 PCR 반응액을 에티듐 브로마이드 함유의 2％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 아마샴 바이오사이언스 주식회사제의 형광 이미지 애널라이저 FluorImager 595에 의해 해석했다. 또한 얻어진 PCR 증폭 산물의 염기 서열은 서열번호 60과 서열번호 63의 프라이머를 이용한 양쇄 다이렉트 시퀀스에 의해 해석했다.
연결 PCR의 결과, 예상된 약 220bp의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었다(데이터 생략). 염기 서열 해석의 결과, 이 PCR 증폭 산물에는 메밀과 스타티스 PCR의 표적 DNA 서열이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다(데이터 생략).
(2) 연결 PCR 증폭 산물의 플라스미드에의 도입과 도입 DNA 단편의 염기 배역 해석:
상기에서 얻어진 PCR 증폭 산물을, pGEM-T 이지 벡터 시스템(Easy Vector System)(프로메가(Promega)사제)를 이용해서 pGEM-T 이지 벡터에 TA 클로닝하고, 대장균(E. coli JM109(DH5α))에 형질 전환했다. 콜로니 PCR 및 염기 서열 해석에 의해 메밀과 스타티스 PCR의 표적 DNA 서열이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있는 약 220bp의 도입 단편을 가지는 형질 전환체를 LB 배지에서 액체 배양하고, 균체로부터 QIAGEN사제의 QIAGEN 하이 스피드 플라스미드 미디 키트(Hi Speed Plasmid Midi Kit)를 이용해서 플라스미드를 추출, 정제했다. 또한 정제한 플라스미드에 도입된 DNA 단편의 염기 서열은 플라스미드 상에 있는 서열의 프라이머를 이용한 양쇄 시퀀스에 의해 해석한 결과, 의도한 대로 형질 전환체의 플라스미드에 도입된 DNA 단편의 염기 서열에는 메밀과 스타티스 PCR의 표적 DNA 서열이 포함되어 있는 것이 확인할 수 있었다(데이터 생략).
(3) 검량선용 플라스미드의 조제:
플라스미드의 길이와, 상기에서 추출, 정제한 플라스미드의 흡광치(Abs. 260nm)로부터, 플라스미드의 분자수(카피수)를 계산했다. 5ng/㎕의 연어 정자 DNA(와코우쥰야쿠사제 디옥시리보 핵산 나트륨 연어 정소제 섬유상을 멸균 초순수에 용해시킨 것)로 플라스미드를 희석하여, 109 내지 101 카피/2.5㎕의 검량선용 플라스미드 희석 계열을 제작했다. 이것을 메밀과 스타티스 서열의 정량적 PCR법의 검량선 작성에 이용하기로 했다.
F. 메밀 서열의 카피수를 정량하는 PCR
(1) 메밀 서열의 검출용 TaqMan MGB 프로브 :
하기 서열의 TaqMan MGB 프로브(어플라이드 바이오시스템스 재팬(Applied Biosystems Japan) 주식회사제 리포터 색소 FAM)를 합성하여, 메밀 서열의 검출용 프로브로서 사용했다. 또한 프로브서열에는 메밀속에 속하는 식물의 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열로서 GenBank에 등록되어 있는 21 서열에 공통인 서열을 이용했다.
5'-CGG GAC GCG CTT C-3'(서열번호 64)
(2)메밀 서열의 정량적 PCR 법
QIAGEN사제의 퀀티텍트 프로브 PCR 키트(QuantiTect Probe PCR Kit)를 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
12.5㎕의 2×퀀티텍트 프로브 PCR 마스타 믹스에 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머를 종농도로 각각 0.2μM씩과, 서열번호 64의 TaqMan MGB 프로브를 종농도로 0.2μM, 및 주형 DNA를 가하고, 최종적으로 멸균 초순수로 25㎕로 한 용액을 96웰 PCR 플레이트에 분주했다. 또한 검량선용으로서는 주형 DNA 대신에, 검량선용 플라스미드 DNA의 희석 계열을 가한 용액을 분주했다. 분주한 96웰 PCR 플레이트를, 어플라이드 바이오시스템스사제의 리얼 타임(Real Time) PCR 장치, 시퀀스 디텍션 시스템(Sequence Detection System) 7700에 세트하고, 50℃, 2분, 95℃, 15분 후, 95℃, 1분(변성), 66℃, 2분(어닐링), 72℃, 1분(신장)의 사이클을 45회 반복해서 반응시켰다. 반응은 모두 동일 시료를 2웰 병행으로 실시했다. 반응 종료 후, 신장 스텝에 있어서의 형광 데이터를 해석했다. 또한 베이스 라인은 처음에 0-1 사이클로 설정해서 형광의 상승이 시작되는 사이클을 확인해서 그 사이클보다 전의 범위에서 적당히 설정했다. 또한, 임계값 라인(Threshold Line)의 설정은 문헌 [Kuribara H et al. 2002. Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean. Journal of AOAC International 85:1077-1089]에 기재된 방법에 따라 실시했다. 그 결과를 도 5A 및 B, 도 6, 도 7과 도 8에 나타낸다.
또한 추출한 식물 DNA가 PCR 증폭 가능한 레벨의 순도인 것은, 식물 엽록체 DNA의 일부를 증폭하는 프라이머에 의해 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(데이터 생략).
(3) 메밀 서열의 정량적 PCR 법의 특이성:
메밀 서열의 정량적 PCR법의 결과, 도 5A 및 B에 나타내는 바와 같이, 백화 메밀의 종자 DNA로부터 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승이 확인되었다. 한편, 밀의 잎, 땅콩의 종자, 대두의 잎, 옥수수의 잎, 겨자의 잎, 백후추, 쌀, 스타티스의 종자 DNA 50ng으로부터는 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승은 인지되지 않았다. 연어 정자 DNA로부터도 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승은 인지되지 않았다(데이터 생략). 또한 도 6에 나타내는 바와 같이, 메밀덩굴의 잎 DNA 50ng에서 증폭 시그널의 상승은 나타났지만, 그 상승은 검량선의 10 카피보다 느려 상승 사이클수(Ct값), 또한 임계값 라인에 걸리지 않았다.
이 특이성은 어느 시료에 스타티스를 첨가한 것으로부터 추출한 DNA 50ng을 주형으로 하여 PCR을 실시했을 경우, 그 시료가 100％ 식용이 아닌 잡초의 일종인 메밀덩굴(메밀 근연종)이었다고 해도, 그것이 위양성으로서 정량되지 않는 레벨에 상당한다.
(4) 메밀 서열의 정량적 PCR 법의 정량성과 감도:
메밀 서열의 정량적 PCR법의 결과, 도 7과 도 8에 나타내는 바와 같이, 108 내지 101 카피의 검량선용 플라스미드로, 상관계수 0.999, 또한 기울기 -3.504의 검량선을 그을 수 있는 정량성과 감도를 확인할 수 있었다. 또한, 백화 메밀 DNA 50fg으로부터도 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승이 나타나는 감도를 확인할 수 있고, 나아가서는 백화 메밀 DNA 5ng 내지 50fg의 Ct값을 플롯팅하면, 이 범위에서도 상관이 있는 직선을 그을 수 있는 정량성을 확인할 수 있었다(데이터 생략).
이상의 결과로부터, 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머, 서열번호 64의 프로브를 이용한 메밀 서열의 정량적 PCR법에 의해 메밀속에 속하는 식물 전반의 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 서열을 고감도인 동시에 특이적으로 검출하고, 그 카피수를 정량할 수 있는 것이 분명해졌다. 본 메밀 서열의 정량적 PCR법과 다음에 나타내는 보정용의 스타티스 서열의 정량적 PCR법과 조합하여 메밀의 혼입량 측정에 이용하기로 했다.
G. 스타티스 서열의 카피수를 정량하는 PCR
(1) 스타티스 서열의 검출용 TaqMan MGB 프로브 :
하기 서열의 TaqMan MGB 프로브(어플라이드 바이오시스템스 재팬 주식회사제 리포터 색소 FAM)를 합성해서 스타티스 서열의 검출용 프로브로서 사용했다.
5'-TGT GCG ACG CGG AAT G-3'(서열번호 59)
(2) 스타티스 서열의 정량적 PCR 법과 해석:
서열번호 57과 서열번호 58의 프라이머를 각각 종농도로 0.2μM씩 이용한 것, 서열번호 59의 TaqMan MGB 프로브를 종농도로 0.2μM 이용한 것 이외는 기본적으로 실시예 1의 F.(2)와 같은 방법으로 실시했다. 그 결과를 도 9, 도 10과 도 11에 나타낸다.
(3) 스타티스 서열의 정량적 PCR 법의 특이성:
스타티스 서열의 정량적 PCR법의 결과, 도 9에 나타내는 바와 같이, 스타티스의 종자 DNA로부터 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승이 나타났다. 한편, 백화 메밀과 달단 메밀의 종자, 밀의 종자, 땅콩의 종자, 대두의 종자, 옥수수의 종자, 겨자의 종자, 백후추, 쌀, 메밀덩굴의 잎 DNA 50ng으로부터는 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승이 보여지지 않았다. 연어 정자 DNA로부터도 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승은 보여지지 않았다(데이터 생략).
(4) 스타티스 서열의 정량적 PCR 법의 정량성:
스타티스 서열의 정량적 PCR법의 결과, 도 10과 도 11에 나타내는 바와 같이, 108 내지 101 카피의 검량선용 플라스미드로, 상관계수 0.999, 또한 기울기 -3.386의 검량선을 그을 수 있는 정량성을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 서열번호 57과 서열번호 58의 프라이머, 서열번호 59의 프로브를 이용한 스타티스 서열의 정량적 PCR법에 의해 스타티스의 ITS-1 서열을 특이적으로 검출하여, 그 카피수를 정량할 수 있는 것이 분명해졌다. 보정용의 본스타티스 서열의 정량적 PCR법과 실시예 1.F.에 나타낸 메밀 서열의 정량적 PCR법과 조합하여 메밀의 혼입량 측정에 이용하는 것으로 했다.
실시예 2
A. 표준으로 한 스타티스와 , 각종 메밀가루, 의사 혼입 시료의 제작에 이용한 메밀, 쌀, 밀
(1) 스타티스 :
사카타 종자에서 판매되고 있는 절화용 엑셀렌트 라이트 블루(단일 로트품)를 이용했다.
(2) 메밀:
타카노 주식회사에서 판매되고 있는 백화 메밀(보통 메밀; 파고피룸 에스쿨렌툼: 2배체)의 메밀가루, 달단 메밀(에프. 타타리쿰: 2배체)의 메밀가루, 고령 루비(에프. 에스쿨렌툼: 2배체)의 메밀가루, 그레이트 루비(에프. 에스쿨렌툼: 4배체)의 메밀가루를 이용했다. 또한 의사 혼입 시료의 제작에는 백화 메밀가루를 이용했다.
(3) 밀:
시판되는 농림 61호를 이용했다.
(4) 쌀:
시판되는 아키타 코마치의 무농약 현미를 이용했다.
B. 표준으로 한 스타티스와 , 의사 혼입 시료의 제작에 이용한 쌀, 밀의 분쇄와 DNA 추출
(1) 분쇄:
분쇄는 레취(Retsch)사제의 초원심 분쇄기, 울트라 센트리퓨갈 밀(Ultra Centrifugal Mill) ZM1에 로터(스테인레스강제 24개 칼날)와 스크린(스테인레스강제 0.20mm)을 세트해서 실시했다.
(2) 분쇄기의 세정:
시료의 분쇄 전과 후에, 분쇄기의 시료 받침 접시, 시료 덮개, 로터, 스크린, 고정구류, 지그 등의 부품은 물 세정, 10％ 표백 용액에 침지, 물 세정, 건조시켜 사용했다. 분쇄기의 본체 부분은 에어건 세정, 걸레질해서 사용했다.
(3) 분쇄기에 메밀과 스타티스 오염이 없는 것의 확인:
대량 분쇄 전에, 그 시료의 일부, 또는 메밀이나 스타티스의 혼입이 없는 시판되는 껍질붙은 옥수수를 동결건조한 것을 분쇄하여 그것으로부터 DNA를 추출하고, 실시예 1.F.와 G.에 기재된 메밀 서열이나 스타티스 서열의 정량적 PCR법으로, 50ng의 주형 DNA로부터 증폭의 상승을 나타내는 형광 시그널의 유무를 확인했다. 형광 시그널이 없는 경우에는 오염이 없다고 판단하고, 이하의 대량 분쇄로 진행되었다. 형광 시그널이 있는 경우에는 오염이 있다고 판단하고, 분쇄기를 재차 세정하여 메밀이나 스타티스의 혼입이 없음의 확인을 마친 현미(1kg)를 해당 분쇄기로 분쇄한 후, 세정하는 동시에 신품 스크린으로 교환을 실시한 후, 재차 상기 메밀이나 스타티스의 혼입이 없는 시판되는 껍질붙은 옥수수를 동결건조한 것을 분쇄하고, 같은 방법으로 형광 시그널의 유무를 확인하여, 분쇄기에 메밀과 스타티스의 오염이 없다고 판단한 후에 이하의 대량 분쇄로 진행되었다.
(4) 스타티스의 대량 분쇄와, 그 분쇄물에 메밀의 혼입이 없는 것의 확인
메밀의 오염이 없는 것을 확인한 분쇄기로, 약 1kg의 스타티스를 분쇄했다. 분쇄물로부터 2g씩 10점 샘플링하고, 실시예 1.B.(2)에 기재된 방법으로 DNeasy 플랜트 맥시 키트에 의해 DNA를 추출하고, 메밀 서열의 정량적 PCR법으로, 50ng의 주형 DNA로부터 증폭의 상승을 나타내는 형광 시그널이 없는 것을 확인했다(데이터 생략). 이것에 의해 메밀의 혼입이 없는, 스타티스 분쇄물을 확보했다.
(5) 쌀, 밀의 대량 분쇄와, 그들의 분쇄물에 메밀과 스타티스의 오염이 없는 것의 확인:
메밀과 스타티스의 오염이 없는 것을 확인한 분쇄기로, 약 500g의 쌀을 분쇄했다. 분쇄물로부터 2g씩 5점 샘플링하고, 실시예 1.B.(2)에 기재된 방법으로 DNeasy 플랜트 맥시 키트에 의해 DNA를 추출하고, 메밀 서열과 스타티스 서열의 정량적 PCR법으로, 50ng의 주형 DNA로부터 증폭의 상승을 나타내는 형광 시그널이 없는 것을 확인했다(데이터 생략). 밀도 마찬가지로 실시했다. 이것에 의해 메밀과 스타티스의 혼입이 없는 쌀, 밀의 분쇄물을 확보했다.
C. 의사 혼입 시료의 제작
(1) 메밀가루/쌀 분쇄물의 의사 혼입 시료:
정방 OP [특수정방처리] PZ 타입(세 방향 지퍼봉투)의 호수 No.6(후쿠스케 공업 주식회사)에, 쌀 분쇄물 45.00g을 계량하여 넣은 것을 6개 준비하고, No.1 내지 6의 번호를 붙였다. 메밀가루 5.00g을 No.1의 봉투에 계량하여 넣고, 봉투의 입구를 막고 손으로 15분간 혼합하여 10％의 메밀가루를 포함하는 쌀 분쇄물을 얻었다. 계속해서, 이 10％(100,000ppm)의 메밀가루를 포함하는 쌀 분쇄물 5.00g을 No.2의 봉투에 계량하여 넣고, 봉투의 입구를 막고 손으로 15분간 혼합하여 1％(10,000ppm)의 메밀가루를 포함하는 쌀 분쇄물을 얻었다. 이 희석, 혼합 조작을 반복하여 100,000 내지 1ppm의 메밀가루를 포함하는 쌀 분쇄물을 제작했다.
(2) 메밀가루/밀의 분쇄물의 의사 혼입 시료:
마찬가지로 해서 100,000 내지 1ppm의 메밀가루를 포함하는 밀 분쇄물을 제작했다.
(3) 메밀가루/쌀과 밀의 분쇄물의 의사 혼입 시료:
정방 OP [특수정방처리] PZ 타입(세 방향 지퍼봉투)의 호수 No.5(후쿠스케 공업 주식회사)에, 10ppm의 메밀가루를 포함하는 쌀 분쇄물 12.5g과 10ppm의 메밀가루를 포함하는 밀 분쇄물 12.5g을 계량하여 넣고, 봉투의 입구를 막고 손으로 15분간 혼합하여 10ppm의 메밀가루를 포함하는 쌀과 밀의 분쇄물을 제작했다.
D. DNA 추출 시의 의사 혼입 시료 샘플링 스케일의 결정
(1) 백화 메밀가루의 입도 분포 측정:
메밀가루를 구라고 가정했을 때의 입경을 구하기 위해서, 백화 메밀가루의 입도 분포 측정(레이저 회절·산란법·건식, 압력 0.5kg/cm2의 조건)을 실시했다. 측정은 가루주식회사 세이신 기업의 분체 측정 기술 센터에 의뢰했다. 그 결과, 백화 메밀가루의 누적 50％의 입경(×50)은 80.941㎛가 되었다.
(2) 백화 메밀가루의 부피 밀도 측정:
메밀가루의 밀도(가루의 내부에 있는 공벽을 포함하는 밀도)를 구하기 위해서, 백화 메밀가루의 부피 밀도 측정(Hg법·일정 부피의 셀에 메밀가루를 넣은 후에 수은으로 셀을 채우는 방법)을 실시했다. 측정은 가루주식회사 세이신 기업의 분체 측정 기술 센터에 의뢰했다. 그 결과, 백화 메밀가루의 부피 밀도(수은법)는 1.181g/cm3가 되었다.
메밀가루가 차지하는 부피=(셀의 부피)-(들어간 수은의 부피)
메밀가루 부피 밀도(수은법)=(들어간 메밀가루의 중량)/(메밀가루가 차지하는 부피)
(3) 의사 혼입 시료 중의 메밀가루 입도의 계산과 샘플링 스케일의 결정:
백화 메밀가루의 입경 80.941μm와 밀도 1.181g/cm3의 측정치로부터 메밀가루 1그레인당의 무게를 계산하여, 여러 가지 메밀가루 농도의 의사 혼입 시료 중에 존재하는 메밀가루의 그레인수를 시산했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 금회에 정량의 목표로 한 혼입량 10ppm의 메밀을 포함하는 의사 혼입 시료로부터 DNA 추출을 위한 시료를 샘플링하는 경우, 샘플링한 시료 중에 최저라도 100그레인 정도의 메밀가루가 들어가도록 하려고 하면, 샘플링량은 4g 이상 필요하다는 것을 알 수 있었다. DNA 추출에는 5g 샘플링하기로 했다.
의사 혼입 시료 중의 백화 메밀가루의 입자수
의사 혼입 시료 중의 백화 메밀가루 농도 (ppm:㎍/g) 의사 혼입 시료를 Ng 샘플링했을 때의 백화 메밀가루의 입자수(메밀가루 1그레인 0.3277㎍으로 계산) N(g)= 2 4 5
1,000,000ppm 3,051,167 12,204,669 15,255,836
100,000ppm 305,117 1,220,467 1,525,584
10,000ppm 30,512 122,047 152,558
1,000ppm 3,051 12,205 15,256
100ppm 305 1,220 1,526
10ppm 31 122 153
1ppm 3 12 15
100그레인 이상
E. 100％ 메밀가루+ 스타티스 표준, 의사 혼입 시료+ 스타티스 표준으로부터의 DNA 추출
(1) 각종 메밀가루 시료:
백화 메밀가루를 6점, 고가 루비 메밀가루, 그레이트 루비 메밀가루, 달단 메밀가루를 각각 3점 샘플링해서 DNA 추출에 이용했다.
(2) 의사 혼입 시료:
100ppm 백화 메밀가루/밀 분쇄물, 10ppm 백화 메밀가루/밀 분쇄물, 10ppm 백화 메밀가루/쌀 분쇄물, 10ppm 백화 메밀가루/밀과 쌀 분쇄물을 각각 3점 샘플링하여 DNA 추출에 이용했다.
(3) DNA 추출:
문헌 [QIAGEN Genomic DNA Handbook]이나 [User-Developed Protocol:Isolation of genomic DNA from plants using the QIAGEN Genomic-tip]을 참고로 하고, QIAGEN사제의 게노믹-팁을 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
시료 5g으로 스타티스 분쇄물 1g을 50㎖들이 튜브에 넣어 30㎖의 칼손 라이시스 완충액(0.1M Tris-HCl(pH 9.5), 2％ CTAB, 1.4M 폴리에틸렌 글리콜 #6000, 20mM EDTA), 60㎕의 RNase A(100㎎/㎖), 75㎕의 2-메르캅토에탄올, 600㎕의 프로테이나제 K(20㎎/㎖)를 가하고, 다시 시료의 분산성을 높이기 위해서 지르코니아 볼(주식회사 닛카토사제 YTZ 볼 ø78㎜) 3개를 넣고 진탕기(이와키 산업 주식회사제 KM 진탕기 V-DX)로 10분간 이상 덩어리가 없어질 때까지 혼합(SPEED 100)한 후, 74℃로 20분간 보온했다. 또한 보온 중에는 5분 간격으로 튜브를 손으로 흔들어 혼합했다.
3,000×g으로 10분간 원심분리한 후, 15㎖들이 튜브에 상청을 4㎖ 취하고, 5㎖의 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1)을 가하여 잘 혼합했다. 이것을 3,000×g으로 10분간 원심분리한 후, 15㎖들이 튜브에 상청(수층)을 취하고, 3.5㎖의 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 가하여 잘 혼합했다. 이것을 3,000×g으로 10분간 원심분리한 후, 15㎖들이 튜브에 상청(수층)을 취하고, 재차 클로로포름:이소아밀알코올(24:1) 추출과 원심분리를 실시하여 상청(수층)을 회수했다. 상청(수층) 중의 150㎕로부터 이소프로판올 침전에 의해 회수한 침전물을 100㎕의 멸균 초순수에 용해한 후, 900㎕의 완충액 QBT를 가한 것을, 미리 1㎖의 완충액 QBT로 평형화한 게노믹-팁 20/G에 제공하여 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 후, 4㎖의 완충액 QC로 컬럼을 세정했다. 최종적으로 1㎖의 완충액 QF로 DNA 용출시키고, 이소프로판올 침전에 의해 회수한 침전물을 40㎕의 멸균 초순수에 용해시켰다. 용액 중의 DNA 농도를 측정하여 적당히 멸균 초순수로 희석한 것을 PCR의 주형 DNA 시료로 했다.
F. 스타티스 표준을 첨가한 100％ 메밀가루로부터 추출한 DNA 중의 「 스타티 스 서열의 카피수 /메밀 서열의 카피수 비 」의 산출
메밀 서열과 스타티스 서열의 정량적 PCR법은 실시예 1.의 F.와 G.에 기재된 방법으로 실시했다. 검량선을 기초로, 스타티스 표준을 첨가한 100％ 메밀가루로부터 추출한 DNA 50ng 중의 메밀 서열의 카피수와 스타티스 서열의 카피수를 정량했다. 그 정량치를 기초로, 「스타티스 서열의 카피수/메밀 서열의 카피수=Lo/Fo비」를 산출했다. 또한 각 메밀가루의 Lo/Fo비는 동일 샘플을 2웰 병행으로 측정하고, 측정을 2회 반복해서 얻어진 비를 평균해서 산출했다.
Lo/Fo비 측정의 결과, 표 3에 나타내는 바와 같이, 백화 메밀가루 2.36(6점 추출, 각 점 2웰 측정, 측정 2회), 고령 루비 메밀가루 3.25, 그레이트 루비 메밀가루 2.70, 달단 메밀가루 4.75(3점 추출, 각 점 2웰 측정, 측정 2회)가 되었다. 여기서 얻어진 백화 메밀가루의 Lo/Fo비와 실시예 2.G.에서 산출한 의사 혼입 시료의 「메밀 서열의 카피수/스타티스 서열의 카피수=Fs/Ls비」를 이용하여 메밀의 혼입량을 구하기로 했다. 또한 각종 메밀가루의 Lo/Fo비를 측정했을 때의 생 데이터를 표 4A와 표 4B에 나타낸다.
Figure 112005065695796-pct00004
Figure 112005065695796-pct00005
Figure 112005065695796-pct00006
Figure 112005065695796-pct00007
Figure 112005065695796-pct00008
백화 메밀가루에 대해서 가장 측정치의 편차가 컸던 달단 메밀가루에서도 약 2배이고, 본 방법은 PCR에 의한 정량법으로서는 충분한 정밀도를 가지고 있다고 생각된다.
G. 스타티스 표준을 첨가한 의사 혼입 시료로부터 추출한 DNA 중의 「메밀 매열의 카 피수 / 스타티스 서열의 카피수 비」의 산출과, 의사 혼입 시료 중의 메밀 혼입량의 계산
메밀 서열과 스타티스 서열의 정량적 PCR법은 실시예 1.의 F.와 G.에 기재된 방법으로 실시했다. 검량선을 기초로, 스타티스 표준을 첨가한 의사 혼입 시료로부터 추출한 DNA 50ng 중의 메밀 서열의 카피수와 스타티스 서열의 카피수를 정량했다. 그 정량치를 기초로, 「메밀 서열의 카피수/스타티스 서열의 카피수=Fs/Ls비」를 산출했다. 또한 의사 혼입 시료의 Fs/Ls비는 동일 샘플로부터 3점 추출, 각 점 2웰로 측정해서 산출했다. 여기서 산출한 Fs/Ls비와 실시예 2.F.에서 산출한 Lo/Fo비를 이용해서 하기 식에 의해 의사 혼입 시료(1g) 중의 메밀의 혼입량(㎍)을 구했다.
메밀의 혼입량 ppm(㎍/g)=Fs/Ls×Lo/Fo×1,000,000
Fs/Ls비 측정과 혼입량 산출의 결과, 표 5에 나타내는 바와 같이, 100ppm 백화 메밀가루/밀 분쇄물, 10ppm 백화 메밀가루/밀 분쇄물, 10ppm 백화 메밀가루/쌀 분쇄물, 10ppm 백화 메밀가루/밀과 쌀의 분쇄물에 대해서 2회 측정한 결과 모두 타당한 값을 얻을 수 있었다. 또한 각종 의사 혼입 시료의 Fs/Ls비를 측정했을 때의 생 데이터를 표 6A와 표 6B에 나타낸다.
의사 혼입 시료 중의 메밀 혼입량의 측정결과 종합(PCR); 의사 혼입 시료 중의 메밀 혼입량의 측정 결과
의사 혼입 시료명 메밀가루 농도(ppm:㎍/g)
1회째 측정 2회째 측정
100ppm 메밀/밀 번호 1 번호 2 번호 3 97.9 84.5 89.6 83.0 75.5 81.6
10ppm 메밀/밀 번호 1 번호 2 번호 3 6.4 14.4 8.9 4.6 10.8 7.7
10ppm 메밀/쌀 번호 1 번호 2 번호 3 9.0(참고치) 7.5 5.5(참고치) 7.5 5.1 4.7
10ppm 메밀/쌀과 밀 번호 1 번호 2 번호 3 9.2 7.0 9.0 6.2 4.9 8.2
※각 의사 혼입 시료로부터 3점 샘플링해서 추출, 각 점에 대해서 n=2로 측정했다.
※의사 혼입 시료 5g에 스타티스 표준 1g을 첨가해서 추출한 DNA 50ng을 PCR에 제공했다.
※의사 혼입 시료 중의 메밀가루 농도(ppm)의 산출에는 백화 메밀의 Lo/Fo 치=2.36을 이용했다.
※10ppm 메밀/쌀의 No.1, No.3에 대해서는 스타티스 서열의 카피수 정량에 있어서 검량선 범위 외가 되었기 때문에, 참고치로서 기재했다.
Figure 112005065695796-pct00009
Figure 112005065695796-pct00010
Figure 112005065695796-pct00011
Figure 112005065695796-pct00012
실시예 3
A. DNA 추출에 이용한 식물 시료
(1) 땅콩, 메밀(백화 메밀), 스타티스의 종자:
실시예 1.A.(1), (2)와 같은 것을 이용했다.
(2) 밀, 대두, 옥수수의 잎:
실시예 1.A.(3)과 같은 것을 이용했다.
(3) 팥, 아몬드, 호두, 마카다미아넛 , 헤이즐넛의 종자와, 솔방울, 해바라기 씨, 양귀비 열매, 참깨, 사과:
시판품을 이용했다.
(4) 메밀(백화 메밀), 팥의 잎
시판품의 종자로부터 발아시킨 잎을 이용했다.
B. DNA 추출
(1) 스타티스의 종자로부터의 DNA 추출
실시예 1.B.(2)와 같은 방법으로 실시했다.
(2) 땅콩, 아몬드, 헤이즐넛의 종자와 양귀비 열매, 참깨로부터의 DNA 추출:
실시예 1.B.(3)과 같은 방법으로 실시했다.
(3) 메밀(백화 메밀), 밀, 대두, 옥수수, 팥의 잎과, 사과의 종자로부터의 DNA 추출:
실시예 1.B.(4)와 같은 방법으로 실시했다.
(4) 마카다미아넛의 종자로부터의 DNA 추출:
문헌 [QIAGEN Genomic DNA Handbook]을 참고로 하고, QIAGEN사제의 게노믹-팁을 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
미세하게 분쇄한 시료 1g을 50㎖들이 튜브에 넣어 10㎖의 완충액 G2, 200㎕의 프로테이나제 K(20㎎/㎖), 20㎕의 RNase A(100㎎/㎖)를 가하여 혼합한 후, 50℃로 1 시간 보온했다. 그 후, 약 3,000×g으로 10분간 원심분리하여 그 상청액을 얻었다. 다시 상청액의 기름 성분이나 분말을 없애고, 약 3,000×g으로 10분간 원심분리하여 그 상청액을 얻었다. 얻어진 상청액을 미리 1㎖의 완충액 QBT로 평형화한 게노믹-팁 20/G에 제공하여 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 후, 4㎖의 완충액 QC로 컬럼을 세정하여 미리 50℃로 가온되어 있는 1㎖의 완충액 QF로 용출시키고, 이소프로판올 침전에 의해 회수한 침전물을 100㎕의 멸균 초순수에 용해시켰다. 용액 중의 DNA 농도를 측정하여 적당히 멸균 초순수로 희석한 것을 PCR의 주형 DNA 시료로 했다.
(5) 호두의 종자와 솔방울, 해바라기 시로부터의 DNA 추출:
문헌 [DNeasy Plant Maxi Kit Handbook]을 참고로 하고, QIAGEN사제의 DNeasy 플랜트 맥시 키트를 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
미세하게 분쇄한 시료 1g을 15㎖들이 튜브에 넣어 10㎖의 완충액 AP1, 10㎕의 RNase A(100㎎/㎖)를 가하여 혼합한 후, 65℃로 60분간 보온했다. 그 후, 약 3,000×g으로 10분간 원심분리하여 그 상청액을 얻었다. 이것에 1.5㎖의 완충액 AP2를 가하여 얼음 중에서 10분간 방치하고, 원심분리에 의해 그 상청액을 얻었다. 얻어진 상청을 QIA쉬레더 스핀 컬럼에 제공하고, 원심분리에 의해 컬럼의 패스액을 얻었다. 이 패스액에 1.5용량의 완충액 AP3, 1용량의 에탄올을 가하여 혼합한 후, DNeasy 스핀 컬럼에 제공하고, 약 1,500×g으로 1분간 원심분리해서 DNA를 컬럼에 흡착시켰다. 그 후, 컬럼에 10㎖의 완충액 AW를 가하고, 약 1,500×g으로 1분간 원심분리해서 컬럼을 세정, 재차 10㎖의 완충액 AW를 컬럼에 가해서 약 1,500×g으로 1분간 원심분리하고, 마지막으로 약 3,000×g으로 10분간 원심분리해서 컬럼에 남아 있는 완충액 AW를 완전하게 제거했다. 최종적으로 65℃로 미리 보온해 둔 1㎖의 멸균 초순수를 컬럼에 가하고, 5분간 정치한 후에, 약 3,000×g으로 5분간 원심분리해서 컬럼으로부터 용출시키고, 이소프로판올 침전에 의해 회수한 침전물을 100㎕의 멸균 초순수에 용해시켰다. 용액 중의 DNA 농도를 측정하여 적당히 멸균 초순수로 희석한 것을 PCR의 주형 DNA 시료로 했다.
C. 땅콩의 ITS -1 서열의 일부를 검출하는 PCR
(1) 땅콩 검출용 프라이머 :
프라이머 서열에는 땅콩속에 속하는 식물의 GenBank에 등록되어 있는 이하의 11서열 중의 ITS-1 서열에 공통인 서열을 이용했다. 또한 이 중의 아라키스 히포개아에 대해서는 GenBank에 등록되어 있는 아라키스 히포개아(AF156675) 대신에 시판땅콩을 해석해서 얻은 서열도 이용했다.
1: 아라키스 바티조코이(Arachis batizocoi)(AF203553)
2: 아라키스 코렌티나(Arachis correntina)(AF203554)
3: 아라키스 헤르만니이(Arachis hermannii)(AF203556)
4: 아라키스 호에네이(Arachis hoehnei)(AJ320395)
5: 아라키스 히포개아(AF156675 및 시판 땅콩을 해석해서 얻은 서열)
6: 아라키스 마그나(Arachis magna)(AF203555)
7: 아라키스 마요르(Arachis major)(AF203552)
8: 아라키스 팔루스트리스(Arachis palustris)(AF203557)
9: 아라키스 핀토이(Arachis pintoi)(AF203551)
10: 아라키스 트리세미나타(Arachis triseminata)(AF204233)
11: 아라키스 빌로사(Arachis villosa)(AF203558)
그리고, 하기 서열의 올리고 DNA 프라이머(주식회사 QIAGEN사제 OPC 정제품)를 합성하여 땅콩 ITS-1 서열의 일부를 검출하는 PCR(이하, 땅콩 PCR로 한다)용 프라이머로서 사용했다.
5'-GCG GAA AGC GCC AAG GAA GC-3'(서열번호 21)
5'-GTC GCC CCG ACC GGA TG-3'(서열번호 66)
5'-CGT CGC CCC GAC CGG AT-3'(서열번호 26)
5'-TCG TCG CCC CGA CCG GAT G-3'(서열번호 65)
(2) 땅콩 검출용 프라이머의 특이성( PCR 시뮬레이션):
PCR 시뮬레이션 소프트 앰플리파이 1.0(빌 엔젤스)에 의해 땅콩속에 속하는 식물의 11서열, 땅콩 이외의 알레르기를 일으킬 우려가 있는 식물 8 서열(메밀, 밀, 대두, 호두, 송이버섯, 복숭아, 사과, 오렌지), 식품 원재료로서 흔히 사용되고 있는 식물 8 서열(옥수수, 쌀, 후추, 겨자, 당근, 표고버섯, 배추, 순무), 콩과 식물 6 서열(까치콩, 라이콩, 넙적콩, 병아리콩, 녹두, 팥), 땅콩 근연종 식물 69 서열, 스타티스로부터, 땅콩 검출용 프라이머로 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 시뮬레이션 결과가 되는지를 확인했다. 여기서 말하는 땅콩 근연종 식물이란, GenBank에 등록되어 있는 땅콩 Arachis hypogaea의 염기 서열(AF156675)의 ITS-1 서열 부분을 BLAST 상동성 검색에 제공하여 스코어 60 점 이상이 된 땅콩속 이외의 식물이다. 이번에는 또 그 식물이 속하는 속 중에서 가장 스코어가 높은 값이 된 종의 서열을, 그 속의 대표 서열로서 선정했다. 또한 PCR 시뮬레이션은 그들 서열의 ITS-1 내지 5.8S rRNA 유전자 내지 ITS-2 서열의 영역에 대해서 실시했다. 서열번호 21과 서열번호 65의 프라이머를 조합해서 사용한 경우에 대해서 시뮬레이션에 이용한 서열의 GenBank 수탁 번호 및 시뮬레이션 결과를 표 7A 내지 7E에 대표로 나타낸다. 표 7A 내지 7E의 생략 문자, 기호는 이하에 나타내는 바와 같다:
*: 표적 사이즈 부근(±10bp)의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있다고 예상된 것
W값: PCR 증폭 산물을 얻을 수 있을 가능성
얻을 수 있을 가능성이 높다…W6>WS>W4>W3>W2…얻을 수 있을 가능성이 낮다
수치(bp): PCR 증폭 산물의 사이즈(bp)
앰플리파이로 얻어진 값으로부터 2를 뺀 값
-: PCR 증폭 산물이 없다고 예상된 것
Figure 112005065695796-pct00013
Figure 112005065695796-pct00014
Figure 112005065695796-pct00015
Figure 112005065695796-pct00016
Figure 112005065695796-pct00017
시뮬레이션의 결과, 서열번호 21과 서열번호 65의 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 표 7A 내지 7C에 나타내는 바와 같이, 땅콩속의 11 서열로부터는 표적으로 한 76bp 사이즈의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것이 예상되었다. 또한, 땅콩속 이외의 알레르기를 일으킬 우려가 있는 식물의 7 서열(메밀, 밀, 대두, 호두, 송이버섯, 복숭아, 오렌지), 식품 원재료로서 흔히 사용되고 있는 식물 8 서열(옥수수, 쌀, 후추, 겨자, 당근, 표고버섯, 배추, 순무), 콩과 식물 6 서열(까치콩, 라이콩, 넙적콩, 병아리콩, 녹두, 팥), 땅콩 근연종 식물 69 서열, 스타티스로부터는 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물 및 비특이적인 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없는 것이 예상되었다. 또한 사과로부터는 약하면서 표적과는 다른 사이즈의 비특이적인 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있을 가능성이 있다고 예상되었기 때문에, 별도로 실제의 PCR로 확인하기로 했다. 또한 서열번호 21과 서열번호 66에 나타내는 서열을 가지는 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 서열번호 21과 서열번호 26의 프라이머를 조합해서 사용한 경우에도 땅콩속의 서열로부터 표적으로 하는 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것이 예상되는 결과를 얻을 수 있었다.
(3) 땅콩 PCR
QIAGEN사제의 핫스타택 마스타 믹스 키트를 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
12.5㎕의 2×핫스타택 마스타 믹스(핫스타택 DNA 폴리메라제, 3mM MgCl2 함유 PCR 완충액, 400μM 각 dNTP)에, 프라이머를 각각 종농도로 0.2μM씩, 및 주형 DNA를 가하고, 최종적으로 멸균 초순수로 25㎕로 한 반응용 용액을 0.2㎖ 마이크로 튜브에 넣어 어플라이드 바이오시스템스사제의 서멀 사이클러 GeneAmp PCR 시스템 9600에 의해 95℃, 15분(효소 활성화) 후, 95℃, 30초(변성), 68℃, 30초(어닐링, 신장)의 사이클을 45회 반복한 후, 72℃, 4분(최종 신장)으로 해서 반응시켰다. 얻어진 PCR 반응액을 에티듐 브로마이드 함유의 2％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 아머샴 바이오사이언시즈 주식회사제의 형광 이미지 애널라이저, 플루오로이미저 595에 의해 해석했다. 서열번호 21과 서열번호 65의 프라이머를 조합해서 사용한 경우의 결과를 도 12에 대표로 나타낸다. 도 12의 생략 문자, 기호 등은 이하에 나타낸다.
M: 100bp DNA 래더 마커
(-): 주형 DNA 미첨가
숫자: 첨가한 주형 DNA량
화살표: 표적의 PCR 증폭 산물의 밴드(약 76bp)
또한 추출한 식물 DNA가 PCR 증폭 가능한 레벨의 순도인 것은, 식물 엽록체 DNA나 루비스코(Rubisco) 유전자 서열의 일부를 증폭하는 프라이머에 의해 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(데이터 생략).
(4) 땅콩 PCR 의 감도와 특이성:
땅콩 PCR의 결과, 도 12에 나타내는 바와 같이, 땅콩 DNA 500fg으로부터 표적으로 한 땅콩 ITS-1 서열로부터 예상되는 약 76bp 사이즈의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 500fg의 땅콩 DNA를 검출할 수 있는 감도란, 어느 시료로부터 추출한 DNA 50ng을 주형으로 하여 PCR했을 경우, 그 시료 DNA 중에 포함되는 10ppm의 메밀 DNA를 검출할 수 있는 레벨의 감도에 상당한다.
땅콩 PCR의 결과, 도 12에 나타내는 바와 같이, 사과의 종자, 밀의 잎, 메밀의 잎, 팥의 잎, 대두의 잎, 옥수수의 잎, 스타티스의 종자 DNA 50ng으로부터는 표적 사이즈의 PCR 증폭 산물 및 비특이적인 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없었다. 사과에 대해서는 PCR 시뮬레이션으로 약하면서 표적과는 다른 사이즈의 비특이적인 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있을 가능성이 있다고 예상되었지만, 문제는 없는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 아몬드, 헤이즐넛, 마카다미아넛, 호두의 종자, 양귀비의 열매, 솔방울, 해바라기 씨, 참깨, 연어 정자 DNA로부터도 마찬가지로 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없는 것을 확인했다(데이터 생략). 그 밖에도, 서열번호 21과 서열번호 66의 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 서열번호 21과 서열번호 26의 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 모두 같은 감도와 특이성을 가진다고 하는 결과를 얻었다(데이터 생략).
(5) 땅콩 PCR 증폭 산물의 염기 서열 해석:
상기 서열번호 21과 서열번호 65의 프라이머를 조합해서 사용한 경우에 얻어진 땅콩 DNA 유래의 PCR 증폭 산물의 염기 서열은 서열번호 21과 서열번호 65의 프라이머를 이용한 양쇄 다이렉트 시퀀스에 의해 해석했다. 얻어진 염기 서열을, 시판 땅콩 아라키스 히포개아의 염기 서열과 비교해서, 땅콩 DNA 유래의 PCR 증폭 산물의 염기 서열은 시판 땅콩(아라키스 히포개아)의 염기 서열의 표적으로 한 부분과 100％ 합치하는 것을 확인했다(데이터 생략). 이것으로부터 상기 프라이머를 이용한 PCR에 의해 땅콩 ITS-1의 일부 서열을 증폭, 검출하고 있는 것이 입증되었다. 그 밖에도, 서열번호 21과 서열번호 66의 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 서열번호 21과 서열번호 26의 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 모두 똑같이 땅콩 ITS-1의 일부 서열을 증폭, 검출하고 있다고 하는 결과를 얻었다.(데이터 생략)
이상의 결과로부터, 상기 프라이머를 이용한 땅콩 PCR에 의해 땅콩속에 속하는 식물 전반의 ITS-1 서열을, 고감도인 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 것이 분명해졌다. 이들 프라이머를, 땅콩 ITS-1 서열의 카피수를 정량하는 PCR(이하, 땅콩 서열의 정량적 PCR법으로 한다)에 이용하기로 했다.
D. 땅콩 서열의 카피수를 정량하는 PCR
(1) 땅콩 서열의 검출용 TaqMan MGB 프로브 :
하기 서열의 TaqMan MGB 프로브(어플라이드 바이오시스템스 재팬 주식회사제 리포터 색소 FAM)를 합성하여 땅콩 서열의 검출용 프로브로서 사용했다. 또한 프로브 서열에는 땅콩속에 속하는 식물의 ITS-1 서열로서 GenBank에 등록되어 있는 11서열, 및 시판 땅콩을 해석해서 얻은 서열에 공통인 서열을 이용했다.
5'-TGC TCT CCC CGC CGG C-3'(서열번호 34)
(2) 땅콩 서열의 정량적 PCR 법:
QIAGEN사제의 퀀티텍트 프로브 PCR 키트를 이용해서 이하의 방법으로 실시했다.
12.5㎕의 2×퀀티텍트 프로브 PCR 마스타 믹스에, 프라이머를 종농도로 각각 0.2μM씩과, 서열번호 34의 TaqMan MGB 프로브를 종농도로 0.1μM, 및 주형 DNA를 가하고, 최종적으로 멸균 초순수로 25㎕으로 만든 용액을 96웰 PCR 플레이트에 분주했다. 분주한 96웰 PCR 플레이트를, 어플라이드 바이오시스템스사제의 리얼 타임 PCR 장치, 시퀀스 디텍션 시스템 7700에 세트하고, 95℃, 15분 후, 95℃, 30초(변성), 68℃, 30초(어닐링, 신장)의 사이클을 45회 반복한 후, 72℃, 4분(최종 신장)으로 해서 반응시켰다. 반응은 모두 동일 시료를 2웰 병행으로 실시했다. 반응 종료 후, 신장 스텝에 있어서의 형광 데이터를 해석했다. 또한 베이스 라인은 처음에 0-1 사이클로 설정해서 형광의 상승이 시작되는 사이클을 확인하고, 그 사이클보다 전의 범위에서 적당히 설정했다. 또한, 임계값 라인(Threshold Line)의 설정은 문헌 [Kuribara H et al. 2002. Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean. Journal of AOAC International 85:1077-1089]에 기재된 방법에 따라 행했다. 서열번호 21과 서열번호 65의 프라이머를 조합해서 사용한 경우의 결과를 도 13, 도 14, 도 15에 대표로 나타낸다.
또한 추출한 식물 DNA가 PCR 증폭 가능한 레벨의 순도인 것은 식물 엽록체 DNA나 루비스코 유전자 서열의 일부를 증폭하는 프라이머에 의해 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다(데이터 생략).
(3) 땅콩 서열의 정량적 PCR 법의 특이성:
땅콩 서열의 정량적 PCR법의 결과, 도 13에 나타내는 바와 같이, 땅콩의 종자 DNA로부터 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승이 확인되었다. 한편, 사과의 종자, 밀의 잎, 메밀의 잎, 팥의 잎, 대두의 잎, 옥수수의 잎, 스타티스의 종자 DNA 50ng으로부터는 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승은 인지되지 않았다. 또한, 아몬드, 헤이즐넛, 마카다미아넛, 호두의 종자, 양귀비의 열매, 솔방울, 해바라기 씨, 참깨, 사과, 연어 정자 DNA로부터도 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승은 인지되지 않았다(데이터 생략). 그 밖에도, 서열번호 21과 서열번호 66의 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 서열번호 21과 서열번호 26과 조합해서 사용한 경우, 모두 같은 특이성을 가진다고 하는 결과를 얻었다(데이터 생략).
(4) 땅콩 서열의 정량적 PCR 법의 정량성과 감도:
메밀 서열의 정량적 PCR법의 결과, 도 14와 도 15에 나타내는 바와 같이, 땅콩 DNA 50ng 내지 500fg의 범위에서, 상관계수 0.996, 또한 기울기 -3.911의 검량선을 그을 수 있는 정량성과 감도를 확인할 수 있었다. 또한, 땅콩 DNA 50fg으로부터도 증폭을 나타내는 형광 시그널의 상승이 보여지는 감도를 확인할 수 있었다. 그 밖에도, 서열번호 21과 서열번호 66의 프라이머를 조합해서 사용한 경우, 서열번호 21과 서열번호 26을 조합해서 사용한 경우, 모두 같은 정량성과 감도를 가진다고 하는 결과를 얻었다(데이터 생략).
이상의 결과로부터, 서열번호 21과 서열번호 65의 프라이머, 서열번호 34의 프로브를 이용한 땅콩 서열의 정량적 PCR법, 서열번호 21과 서열번호 66의 프라이머, 서열번호 34의 프로브를 이용한 땅콩 서열의 정량적 PCR법, 서열번호 21과 서열번호 26의 프라이머, 서열번호 34의 프로브를 이용한 땅콩 서열의 정량적 PCR법에 의해 땅콩속에 속하는 식물 전반의 ITS-1 서열을 고감도인 동시에 특이적으로 검출하고, 나아가서는 땅콩의 표적 서열을 포함하는 검량선용 플라스미드를 구축해서 검량선을 제작하면, 땅콩 서열의 카피수를 정량할 수 있는 것이 분명해졌다. 본 땅콩 서열의 정량적 PCR법과 보정용의 스타티스 서열의 정량적 PCR법과 조합하여 땅콩의 혼입량 측정에 이용할 수 있다.
실시예 4: 가공 처리 후의 샘플 중의 정량적 PCR 법의 정량성의 확인:
또한 가열 조리한 가공품 모델로서 100ppm(이하 W/W)의 메밀을 포함하는 소맥분 80g에 물 35g, 소금 0.8g을 가한 도우(직경 6cm, 두께 1㎜)를 제작하고, 이것을 이하의 4가지 가열 처리;① 굽기(160℃, 10분), ② 튀기기(185℃, 5초), ③ 찌기(100℃, 10분), ④ 데치기(100℃, 10분)를 한 것에 대해서, 스타티스 표준 시료와 혼합하고, 상기와 같이 DNA 추출을 한 후, 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열번호 64 기재의 서열을 가지는 프로브를 이용해서 상기 가열 후의 시료에 포함되는 메밀을 정량했다. 측정된 가공품 중의 메밀의 정량치를 기초로 수분량을 가미하고, 사용한 소맥분 중의 메밀 농도로 환산한 결과, ① 구운 것: 145ppm, ② 튀긴 것: 56ppm, ③ 찐 것: 198ppm, ④ 데친 것: 143ppm이며, 충분한 정량성이 나타났다. 따라서, 식품 가공에 있어서 가장 일반적인 가열 처리인, 굽기, 튀기기, 찌기 및 데치기 중 어느 처리에 있어서도, 본 발명의 방법에 따른 정량은 가능하다고 하는 것이 시사되고, 이것으로부터 이들 외의 가공 처리에 의해도 그 정량성을 상실하는 일은 없을 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 방법은 광범위한 가공 식품에 적용 가능하다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
본 발명의 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입된 특정 식물속에 속하는 식물을 정량하는 PCR법에 의하면, 식품 또는 식품 원재료 중에 있어서의 특정 식물속의 식물의 극미량의 존재를 검출하는 동시에 정량하는 것이 가능한 점에서, 메밀속, 땅콩속, 밀속 및 대두속 등의 알레르기 원인이 되는 식물속의 식물의 혼입 유무의 검출 및 그 정량을 하는데 특히 유효하다. 또한, 피검 대상으로 하는 시료마다의 DNA 추출 효율이나 PCR 반응의 저해 등의 영향에 대한 보정의 방법으로서 외부로부터 정제 DNA를 표준으로 하여 첨가해서 반응 용액 중의 PCR 반응의 저해 등의 영향 에 대한 보정을 실시하는 것이 아니라, 외부로부터 정제 DNA 이외의 표준 식물 시료를 첨가한 샘플로부터 검출 대상인 특정 식물속 유래의 DNA와 표준 식물 유래의 DNA를 동시에 추출해서 정량적 PCR법을 실시함으로써, 표준 식물 시료와 검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료 사이에서, DNA 추출 효율이나 PCR 반응의 저해 등의 영향이 균일한 조건으로 측정할 수 있기 때문에, 매우 신뢰도가 높은 정량이 가능하다. 또한, DNA 추출 효율이나 PCR 반응의 저해 등의 영향, 나아가서는 피검 대상으로 하는 시료 중의 DNA 함유량의 차이에 대해서도 보정이 가능하다고 하는 유리한 효과를 가지고 있다. 또한, 예를 들면 소금 등의 DNA를 함유하지 않는 식품 원재료 또는 해당 원재료를 포함하는 식품 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 적절히 정량 검출하는 것도 가능하다.
따라서, 본 발명은 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입되어 있는 알레르기의 원인이 되는 특정 식물속에 속하는 식물의 정량적 검출에 유용하다. 또한 PCR법에 따른 정량 분석은 위양성이 나왔을 경우에, 그 PCR 증폭 산물을 DNA 서열의 해석에 제공함으로써 확실히 위양성을 제외할 수 있다고 하는 점에서, 산업상 이용성이 뛰어나다고 할 수 있다.
또한 본 정량적 PCR법에 의하면, ELISA법보다 다이나믹 레인지가 넓고, 또한 식품 또는 식품 원재료 중에 혼입된 특정의 원재료의 정량적 검출에 충분한 특이성 및 감도가 높은 것으로 할 수 있다. 또한, 합성품(프라이머, 프로브)을 사용함으로써 측정 결과의 재현성이 높고, 또한 신뢰도도 높은 것으로 할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (28)

  1. PCR법에 따른 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 정량하는 방법으로서,
    검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료와 표준 식물 시료를 미리 정한 비율로 혼합한 보정용 샘플을 준비하고, 이 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 것,
    피검 대상인 식품 또는 식품 원재료에 기지량의 표준 식물 시료를 첨가한 피검 샘플을 조제하고, 이 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 것,
    검출 대상인 특정 식물속 유래의 시료를 검출하기 위한 프라이머 세트, 및 표준 식물 시료를 검출하기 위한 프라이머 세트를 이용해서 각 샘플로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 정량적 PCR법을 실시하는 것,
    보정 표준치로서 보정용 샘플에 대해서 상기 정량적 PCR법에 따라 표준 식물 유래 DNA의 카피수/특정 식물속 유래 DNA의 카피수의 값을 구하는 것, 및
    피검 샘플에 대해서 상기 정량적 PCR법에 따라 특정 식물속 유래 DNA의 카피수/표준 식물 유래 DNA의 카피수의 값을 구하고, 이것을 상기 보정 표준치를 이용해서 보정하고, 식품 또는 식품 원재료 중에 포함되는 특정 식물속의 식물의 양을 산출하는 것
    을 포함하는 상기 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 표준 식물이 밭 잡초 및 식용 작물 이외의 식물종에 속하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 표준 식물이 스타티스(statice)인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 검출 대상인 특정 식물속이 메밀, 땅콩, 밀 또는 대두속인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표준 식물이 스타티스이며, 스타티스 검출용 프라이머 세트가 서열번호 57 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 58 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트이며, 스타티스 검출용 프로브가 서열번호 59 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 검출 대상인 특정 식물속이 메밀속이며, 메밀속 검출용 프라이머 세트가 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트이며, 메밀속 검출용 프로브가 서열번호 64 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 검출 대상인 특정 식물속이 땅콩속이며, 땅콩속 검출용 프라이머 세트가 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 65 또는 66 기재 중 하나의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트이며, 땅콩속 검출용 프로브가 서열번호 34 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  10. 서열번호 57 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 58 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용되는 스타티스 검출용 프라이머 세트.
  11. 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용되는 메밀속 검출용 프라이머 세트.
  12. 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 65 또는 66 기재 중 하나의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용되는 땅콩 검출용 프라이머 세트.
  13. 표준 식물 시료 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 식품 또는 식품 원재료 중의 특정 식물속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용하기 위한 키트.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서, 표준 식물이 스타티스이며, 스타티스 검출용 프라이머 세트가 서열번호 57 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 58 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트인 키트.
  16. 삭제
  17. 제13항 또는 제15항에 있어서, 검출 대상인 특정 식물속 검출용 프라이머 세트를 더 포함하는 키트.
  18. 제13항 또는 제15항에 있어서, 검출 대상인 특정 식물속이 메밀속이며, 그의 검출용 프라이머 세트가 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트인 키트.
  19. 제18항에 있어서, 서열번호 64 기재의 서열을 가지는 메밀속 검출용 프로브를 더 포함하는 키트.
  20. 제13항 또는 제15항에 있어서, 검출 대상인 특정 식물속이 땅콩속이며, 그의 검출용 프라이머 세트가 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 65 또는 66 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세트인 키트.
  21. 제20항에 있어서, 서열번호 34 기재의 서열을 가지는 땅콩속 검출용 프로브를 더 포함하는 키트.
  22. 제15항에 있어서, 표준 식물 시료로서 스타티스 시료를 더 포함하는 키트.
  23. 제13항에 있어서, 표준 식물이 스타티스이고, 검출 대상인 특정 식물속이 메밀속이며, 스타티스 및 메밀에 대한 검량선을 제작하기 위한, 스타티스의 증폭 표적 서열을 갖는 DNA와 메밀의 증폭 표적 서열을 갖는 DNA를 연결해서 포함하는 검량선 제작용 플라스미드를 더 포함하는 키트.
  24. 제13항에 있어서, 표준 식물이 스타티스이고, 검출 대상인 특정 식물속이 땅콩속이며, 스타티스 및 땅콩에 대한 검량선을 제작하기 위한, 스타티스의 증폭 표적 서열을 갖는 DNA와 땅콩의 증폭 표적 서열을 갖는 DNA를 연결해서 포함하는 검량선 제작용 플라스미드를 더 포함하는 키트.
  25. 서열번호 14 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 15 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 메밀속 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 식품 또는 식품 원재료 중의 메밀속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용하기 위한 키트.
  26. 제25항에 있어서, 서열번호 64 기재의 서열을 가지는 메밀속 검출용 프로브를 더 포함하는 키트.
  27. 서열번호 21 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26, 65 또는 66 기재의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 땅콩속 검출용 프라이머 세트를 포함하는, 식품 또는 식품 원재료 중의 땅콩속에 속하는 식물을 검출하기 위한 방법에 이용하기 위한 키트.
  28. 제27항에 있어서, 서열번호 34 기재의 서열을 가지는 땅콩속 검출용 프로브를 더 포함하는 키트.
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