WO2004101794A1 - 食品または食品原材料中の特定植物属の定量的pcr検出法 - Google Patents

食品または食品原材料中の特定植物属の定量的pcr検出法 Download PDF

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WO2004101794A1
WO2004101794A1 PCT/JP2004/006913 JP2004006913W WO2004101794A1 WO 2004101794 A1 WO2004101794 A1 WO 2004101794A1 JP 2004006913 W JP2004006913 W JP 2004006913W WO 2004101794 A1 WO2004101794 A1 WO 2004101794A1
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seq
buckwheat
sample
dna
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PCT/JP2004/006913
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Takashi Hirao
Masayuki Hiramoto
Satoshi Watanabe
Jinji Shono
Original Assignee
House Foods Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantitatively detecting a specific plant genus contained in food or food raw materials.
  • the ELISA method is a very sensitive protein detection method, which is a conventional technique in the art.
  • the ELISA method using polyclonal antibodies has relatively high cross-reactivity and may detect non-specific proteins (translated by Eiji Ishikawa: Enzymimnoassy (1989)). Positive judgment may be obtained. Testing for false positives requires reconfirmation in other ways.
  • the dynamic range in measurement is narrow.
  • the narrow dynamic range of the measurement means that in order to accurately measure samples of unknown concentration, several dilutions of the test solution were prepared and the measurement results of the test solution falling within the range of the calibration curve May need to be selected.
  • correction for effects such as extraction efficiency and inhibition of ELISA reaction for each sample to be tested is not taken into account, and a wide variety of processing and contaminants such as food are estimated. Care must be taken when measuring the amount of sample and other data to give a quantitative value.
  • the detection sensitivity of a commercially available ELISA for sopa protein detection is 1 ng / ml (20-400-fold diluted with ELISA standard standard buckwheat protein test solution included in the kit), and subjected to ELISA.
  • the total protein content of specific raw materials is as high as 0.02 to lppm when converted to the weight of the final product [(Journal of the Food Hygienics Society of Japan (SH0KUHIN EISEIGAKUZASSHD), (Japan), Japan Society for Food Hygiene, 2002, Vol. 43, No. 4, p.
  • the currently known PCR method for detecting contaminated buckwheat has a sensitivity of about 5 pg of buckwheat MA, and about 10 ppm of buckwheat can be detected in a sample added with buckwheat in wheat.
  • Quantitative analysis is not possible with this known method [(“Journal of the Food Hygienics Society of Japan (SH0KUH INEI SE I GAKU ZASSHD), (Japan), Japan Society for Food Hygiene, 2002, Vol.43, No.4, p.j-280-j-282 ", (" The 84th Annual Meeting of the Japan Society for Food Hygiene ", (Japan), Japan Society for Food Hygiene , 2002, p. 104)).
  • the present inventors have developed a qualitative PCR method targeting an ITS sequence that can be detected with a sensitivity of lppm or more (DNA / DNA) as a method for detecting the presence of a specific plant genus.
  • a Japanese patent application was filed on September 27, 2000 (application number: Japanese Patent Application No. 2002-284222), but quantitative analysis cannot be performed using this method.
  • ⁇ Measure the copy number of the gene sequence unique to the genetically modified corn, and correct it with the copy number of the endogenous gene sequence unique to the corn that was measured separately.
  • Some measure the amount of genetically modified corn material in corn material [[Journal of AOAC INTERNATIONAL J, (USA), A0AC International (A0AC) INTERNATIONAL), 2002, Vol. 85, No. 5, p. 107 7—10 89)] .
  • a correction sample in which a sample derived from a specific plant genus to be detected and a standard plant sample are mixed at a predetermined ratio, and extracting genomic DNA from the sample;
  • test sample prepared by adding a known amount of a standard plant sample to the food or food raw material to be tested, and extracting geno DNA from the sample;
  • the value of the copy number of the DNA derived from the standard plant / the copy number of the MA derived from the specific plant genus is determined for the correction sample by the quantitative PCR method, and
  • the number of copies of the DNA derived from the specific plant genus was determined by the above-mentioned quantitative PCR method. The value of the number of copies of the DNA derived from the standard plant was determined, and this was corrected using the corrected standard value to obtain Calculating the amount of plants of a specific plant genus contained in the raw materials,
  • the real-time PCR method uses a probe that has a luminescent dye at the 5 'end and a quencher at the 3' end and that hybridizes inside the genomic DNA site where each oligonucleotide of the PCR primer set hybridizes.
  • a method for quantifying DNA based on the amount of luminescence in which the luminescence of the luminescent dye at the 5 'end of the probe is suppressed by a quencher at its 3' end, but primers are used by Tad polymerase in the PCE reaction.
  • the above-mentioned probe When the DNA is extended from, the above-mentioned probe is decomposed by the 5'-3 'exonuclease activity of TaQ polymerase, and the luminescent dye and the quencher dissociate to generate luminescence.
  • the standard plant is S. ichisu
  • the primer set for detecting statice is a set comprising an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 57 and a oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 58.
  • the method according to the above 2 or 3, wherein the probe for detecting a statice is an oligonucleotide having a sequence of SEQ ID NO: 59;
  • the specific plant genus to be detected is buckwheat
  • the primer set for buckwheat detection comprises an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the method according to the above 2 or 3, wherein the probe for detecting buckwheat is an oligonucleotide having a sequence of SEQ ID NO: 64;
  • the specific plant genus to be detected is peanut, and the primer set for detecting peanut is an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 21 and any of SEQ ID NOs: 26, 65 or 66.
  • a primer set for detecting a starch comprising an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 57 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 58;
  • a buckwheat detection primer set comprising an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 15.
  • a set of primers for detecting peanuts comprising an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 21 and an oligonucleotide having any of the sequences of SEQ ID NO: 26, 65 or 66;
  • kits for use in a method for detecting a plant belonging to a specific plant genus in food or food raw material comprising a primer set for detecting a standard plant sample; 14.
  • the standard plant is a statice
  • a primer set for detecting a statice is a set comprising an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 57 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 58, Kit according to 13 or 14;
  • the specific plant genus to be detected is buckwheat
  • the primer set for detection is an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 15.
  • kit according to 18 above further comprising a buckwheat detection probe having a sequence consisting of SEQ ID NO: 64;
  • the specific plant genus to be detected is peanut, and the primer set for detection has an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 21 and a sequence of SEQ ID NO: 26, 65 or 66
  • kit according to 20 above further comprising a peanut detection probe having a sequence consisting of SEQ ID NO: 34;
  • kit according to 15 above further comprising a starch sample as a standard plant sample
  • the standard plant is statice
  • the specific plant genus to be detected is buckwheat
  • the DNA and buckwheat containing the amplified target sequence of staticis are used to prepare a calibration curve for sugarcane and buckwheat.
  • the standard plant is statice, and the specific plant genus to be detected is peanut, and DNA containing the amplification target sequence of staticis for preparing a calibration curve for sugarcane and peanut
  • a kit for use in a method for detecting a plant belonging to the genus Buckwheat in a food or food raw material comprising: an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 14;
  • the above kit comprising: a primer set 1 for detecting buckwheat consisting of an oligonucleotide having a sequence;
  • kit according to 25 further comprising a buckwheat detection probe having a sequence consisting of SEQ ID NO: 64;
  • kits for use in a method for detecting a plant belonging to the genus Peanut in a food or food raw material comprising: an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 21; Or a kit comprising a primer set for detecting peanuts consisting of an oligonucleotide having the sequence of 66 or
  • kit according to 27 further comprising a probe for detecting peanuts having a sequence consisting of SEQ ID NO: 34;
  • the method of the present invention i.e., as a method for correcting effects such as MA extraction efficiency and PCR reaction inhibition for each sample to be tested, adding DNA as a standard from the outside and adding
  • a specific plant genus to be detected is referred to from a sample to which a standard plant sample other than DM has been added.
  • the effects of DNA extraction efficiency, PCR inhibition, etc. can be measured under uniform conditions between the standard plant sample and the sample derived from the specific plant genus to be detected. It is possible.
  • the method of the present invention has the advantageous effect that the effect of DNA extraction efficiency, the effect of inhibition of PCR reaction, etc., and the difference in DNA content in the sample to be tested can be corrected. Has.
  • the quantitative analysis by the PCR method is industrially useful because false positives can be reliably excluded by subjecting the PCR amplification products to DNA sequence analysis when false positives are found. It can be said that it is excellent. Therefore, the present invention is useful for the quantitative detection of plants belonging to a specific plant genus that causes allergies contained in foods or food raw materials.
  • the starch detection standard used as the standard plant sample is used.
  • a primer set for detecting a primer set and a buckwheat genus or a peanut genus as a specific plant genus is also included in the present invention.
  • a probe for use in detection by real-time PCR in combination with these primer sets are also included in the present invention.
  • a kit for use in carrying out the method of the present invention comprising one or both of a primer set for detecting a standard plant sample and a primer set for detecting a plant belonging to a specific plant genus to be detected.
  • Such a kit may include the above probe.
  • a standard plant sample may be included.
  • a static plant is preferable as the standard plant, and a dry powder of a plant of Suisse ichisu is preferable as the sample, and a dry powder of a seed is particularly preferable.
  • the standard plant sample and the specific plant gene which are obtained by linking DNA containing the sequence of the standard plant sample and DNA containing the sequence of the specific plant gene to be detected, which can be amplified by the primer set included in the kit, A plasmid for preparing a calibration curve for preparing a calibration curve for the above may be included in the above kit.
  • the term "primer comprising an oligonucleotide for specifically amplifying a part of the genomic DNA of a plant or a plant belonging to the genus of a plant in the PCR method” refers to a forward primer and a reverse primer for use in the PCR method.
  • a primer pair consisting of two oligonucleotides per primer may be referred to as a “primer set” in this specification.
  • the primer of the present invention can be used for quantitative PCR for quantifying each plant genus, but can also be used for non-quantitative (ie, qualitative) detection of each plant genus. Needless to say, there is.
  • any plant species belonging to the plant genus to be detected can be detected, and the primer and the primer set of the present invention are advantageous in quantitative and non-quantitative PCIM. .
  • detection encompasses both qualitative and quantitative detection.
  • primers for specifically amplifying DM from a specific plant genus to be detected are designed. That is, a primer capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid molecule having a base sequence common to a specific plant genus in the 45S rRNA precursor gene sequence, and when hybridized with the nucleic acid molecule, 3 ' The end is a specific plant genus
  • the ITS of a specific plant genus -Design primers that can detect the presence of a specific plant genus using the presence of a PCR amplification product containing at least a part of the ITS-1 or ITS-2 sequence as an indicator.
  • hybridizes under stringent conditions means that two DNA fragments hybridize to each other under standard hybridization conditions as described by Sambrook J et al. ( Expression of cloned genes in E. coli (Molecular Cloning: A laboratory manual (1989)) Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.47-9.62 and 11.45-11.61). More specifically, for example, after performing hybridization (for example, at about 3.0 X SSC or 2.0 X SSC at 30 ° C. or 37) based on the Tm value obtained by the following formula, hybridization is performed.
  • Tm 81.5 + 16.6 (log 10 [Na ⁇ ]) + 0.41 (fraction G + C) -one (600 / N)
  • the term "genus" as used in the present specification includes all plants belonging to the genus, Or a plant containing several species selected from plants belonging to the genus.
  • the primer set used in the present invention is a pair of primers capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence common to a specific plant genus in the 45S rRNA precursor gene sequence, At least one primer of the primer pair, when hybridized with the nucleic acid molecule, has a 3 ′ end that is complementary to a base in the ITS-1 sequence of a specific plant genus (A) or ITS- It is important that the primer (B) binds complementarily to the bases in the two sequences.
  • primers (A) include those that hybridize to the region containing the boundary between ITS-1 and the 5.8S rRNA gene sequence and those that hybridize to the region containing the boundary between ITS-1 and the SSU rRNA gene sequence .
  • primer (B) Includes those that hybridize to the region containing the boundary between ITS-2 and the 5.8S rRNA gene sequence and those that hybridize to the region containing the boundary between ITS-2 and the LSU rRNA gene sequence.
  • the primers (A) and (B) are preferably composed of at least 15 bases, more preferably composed of 15 to 30 bases.
  • the ITS nucleic acid molecule in the 45S rRNA precursor gene sequence has a common base sequence within a specific plant genus.
  • -1 or ITS-2 sequence by suitably selecting a nucleic acid molecule that is common within a specific plant genus and has a nucleotide sequence specific to that genus, A primer (A) or (B) having specificity for the genus can be obtained.
  • one or more primers (A) or (B) may be used, and when two or more primers are used, the specificity to a specific plant genus is further increased.
  • the primer (A) and a part of the base sequence of a sequence in which ITS-1, 5.8S rRNA gene, ITS-2 and LSU rRNA gene of a specific plant genus are continuously linked
  • a primer (C) capable of hybridizing under stringent conditions capable of hybridizing under stringent conditions.
  • a primer (D) capable of hybridizing under stringent conditions e.g., a primer (B) and a primer capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid molecule having a partial nucleotide sequence of a sequence continuously linked to ITS-2 and LSU rRNA genes of a specific plant genus ( F) Use and.
  • the 5.8S rRNA gene is highly conserved and contains many sequences common to most plants.
  • a primer capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid molecule having a partial base sequence of the 5.8S rRNA gene, and being capable of hybridizing with the nucleic acid molecule
  • a primer capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid molecule having a partial base sequence of the 5.8S rRNA gene, and being capable of hybridizing with the nucleic acid molecule
  • the primer can also be used commonly for various plants by suitably selecting a primer whose 3 'end complementarily binds to the base sequence in the 5.8S rRNA gene sequence when It is. By immobilizing these primers and selecting primers that are common and specific to the specific plant genus to be detected from the ITtS-1 or ITS-2 region, contamination of plants belonging to the specific plant genus can be achieved. Primers can be easily designed to detect DNA with high sensitivity.
  • the primers (C) to (F) preferably have at least 15 bases, and more preferably have 15 to 30 bases.
  • the primer (C) or (D) is a primer capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence of a complementary strand thereof.
  • SEQ ID NO: 1 a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence of a complementary strand thereof.
  • there is. 5 Since the 8S rRNA gene sequence has high homology between plants over almost the entire region, any primer that can hybridize to any region can be used, but SEQ ID NO: 1 has particularly high homology.
  • the primer is preferable because it is a region having the property.
  • primers capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence at positions 11 to 63 of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of a complementary strand thereof.
  • a primer (C) oligonucleotides represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 are preferable (hybridizes to SEQ ID NO: 1).
  • a primer (D) oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 5 to 7 are preferable (eight oligonucleotides are complementary to the complementary strand of SEQ ID NO: 1).
  • the primer needs to specifically hybridize to the target nucleic acid molecule under stringent conditions.
  • the primer is represented by a nucleotide sequence in which one or several nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 2 to 7 have been deleted, substituted or added. It may be an oligonucleotide.
  • the nucleotide sequences common to and specific to the specific plant genus in the ITS-1 and ITS-2 sequences are the ITS-1 of various plants belonging to the specific plant genus and other plant genera to be detected.
  • 55.8S rRNA gene ITS-2 sequence can be identified by obtaining it from GenBank, performing an alignment, and searching for a region that is common to the specific plant genus and highly specific to the genus.
  • a primer sequence by setting a base capable of ensuring specificity between the specific plant genus and a plant considered to be a closely related species to the 3′-terminal base and selecting a primer sequence. it can.
  • the base sequence common to buckwheat genus in the ITS-1 sequence of buckwheat and specific to the genus is Fagopyrum esculen tum (common buckwheat) and the actual commercial buckwheat sequence matched with the Fagopyrum escu.l entum (ordinary buckwheat) sequence of GenBank, so that it can be selected from the F. escul entum sequence.
  • Fagopyrum esculen tum common buckwheat
  • the actual commercial buckwheat sequence matched with the Fagopyrum escu.l entum (ordinary buckwheat) sequence of GenBank so that it can be selected from the F. escul entum sequence.
  • SEQ ID NO: 10 is a primer for specifically detecting F. escul entum (ordinary buckwheat), F. tatar icum (Dattan sopa), F. homotrop icura, and F. cymosum, which are part of the genus buckwheat. Useful as an area.
  • oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 11 to 16 are preferable (SEQ ID NOs: 11 to 14 are complementary to SEQ ID NO: 8; SEQ ID NOs: 15 and 16). Hybridizes to SEQ ID NO: 9 under stringent conditions, respectively).
  • the primer may be an oligonucleotide represented by a base sequence in which ⁇ or several bases of the base sequence represented by SEQ ID NOS: 11 to 16 are deleted, substituted or added. Also,
  • ITS-2 sequence a nucleotide sequence common to the genus Buckwheat and specific to the genus is SEQ ID NO: 3
  • the base sequence represented by 6 or 37 or the base sequence of a complementary strand thereof can be exemplified. These are, in particular, F. escu l entum (usually buckwheat) and F. tataricum (part of the buckwheat genus). It is useful as a region for selecting primers when specifically detecting F. homotropic cum and F. cymosum.
  • As a combination of the primers a combination of any one of SEQ ID NOS: 11 to 14 with any one of SEQ ID NOs: 15, 16 or 2 to 4 is preferable.
  • the base sequence that is common within the peanut genus and specific to the genus in the ITS-1 sequence of the peanut genus may be selected from the sequence of A. vil losa.
  • the base sequences represented by Nos. 17 to 20 or the base sequences of their complementary chains can be exemplified.
  • the nucleotide sequence at positions 11 to 62 of SEQ ID NO: 17 or its complementary strand, the nucleotide sequence at positions 11 to 47 of SEQ ID NO: 18 or its complementary strand, and the nucleotide sequence of its complementary strand at position 1 of SEQ ID NO: 19 It is the nucleotide sequence of 1 to 50 or the nucleotide sequence of its complementary strand, the nucleotide sequence of positions 11 to 58 of SEQ ID NO: 20 or the nucleotide sequence of its complementary strand.
  • the oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 21 to 31, 65 and 66 are preferable (SEQ ID NOs: 21 to 23 correspond to the complementary strand of SEQ ID NO: 17; Nos. 24 and 25 are complementary to SEQ ID No. 18; SEQ ID Nos. 30 and 31 are complementary to SEQ ID No. 20; SEQ ID Nos. 26-29, 65 and 66 are SEQ ID Nos.
  • step 19 hybridization is performed under stringent conditions.
  • the primer is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 21 to 31, 65 and 66 if it is an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the sequence of the other partner as described above.
  • the base sequence common to the peanut genus and specific to the genus is a base sequence represented by SEQ ID NO: 38 or a base sequence of a complementary strand thereof.
  • SEQ ID NO: 38 the base sequence common to the peanut genus and specific to the genus is a base sequence represented by SEQ ID NO: 38 or a base sequence of a complementary strand thereof.
  • SEQ ID NO: 38 the base sequence common to the peanut genus and specific to the genus.
  • it is the nucleotide sequence of positions 11 to 47 of SEQ ID NO: 38 or the nucleotide sequence of its complementary strand.
  • SEQ ID NO: 3 the primer (B) of peanut.
  • the oligonucleotide represented by 9 is preferred (hybridizes under stringent conditions to SEQ ID NO: 38). Further, the primer may be an oligonucleotide represented by a base sequence in which one or several bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 are deleted, substituted or added.
  • SEQ ID NOS: 21 and 24 -Or 25 in combination with any of SEQ ID NOS: 2 to 4 SEQ ID NO: 21, 24 or 25 in combination with SEQ ID NO: 39, or SEQ ID NO: 39 with any of SEQ ID NOs: 5 to 7 A combination, or a combination of any of SEQ ID NOs: 21 to 23, 30 and 31 with any of SEQ ID NOs: 26 to 29, 65 and 66 is preferred, but SEQ ID NOs: 21, 24, More preferably, a combination of any of SEQ ID NOS: 2 and 25 with any of SEQ ID NOs: 2 to 4, or a combination of SEQ ID NO: 21 with any of SEQ ID NOs: 26, 65, and 66 is more preferred.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 40 to 42 in the genus ITS-2 sequence of the wheat genus which is common within the wheat genus and specific to the genus
  • the base sequences of their complementary strands can be mentioned.
  • the base sequence of the base sequence at positions 11 to 50 of SEQ ID NO: 40 or its complementary strand the base sequence of the base sequence at positions 11 to 47 of SEQ ID NO: 41 or its complementary strand, SEQ ID NO: 42
  • the base sequence of the complementary strand thereof at positions 11 to 47 is a wheat genus.
  • oligonucleotides represented by SEQ ID NOs: 43 to 45 are preferable (SEQ ID NO: 43 is a complementary strand of SEQ ID NO: 40, and SEQ ID NO: 44 is a SEQ ID NO: 4). 1 and SEQ ID NO: 45 hybridize to SEQ ID NO: 42 under stringent conditions, respectively).
  • the primer may be an oligonucleotide represented by a base sequence in which one or several bases of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 43 to 45 are deleted, substituted or added.
  • a combination of SEQ ID NO: 43 with one or more of SEQ ID NOs: 44 and 45 is preferable.
  • the specific plant genus is the soybean genus
  • it is represented by SEQ ID NO: 46, 47 or 48 as a nucleotide sequence common to the soybean genus and specific to the genus in the ITS-2 sequence of the soybean genus Base sequences or their complementary strand base sequences.
  • the nucleotide sequence of positions 11 to 48 of SEQ ID NO: 46 or the complementary strand thereof, the nucleotide sequence of positions 11 to 55 of SEQ ID NO: 47 or the complementary strand thereof, the position of SEQ ID NO: 48 It is the nucleotide sequence of 11 to 52 or the nucleotide sequence of its complementary strand.
  • oligonucleotides represented by SEQ ID NOs: 49 to 56 are preferable (SEQ ID NO: 49 is a complementary strand of SEQ ID NO: 46, and SEQ ID NOs: 50 to 65 is a sequence SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 56 hybridize to SEQ ID NO: 48, respectively, under stringent end conditions).
  • the primer is one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 49 to 56. It may be an oligonucleotide represented by a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added.
  • a combination of SEQ ID NO: 49 and one or more of SEQ ID NOs: 50 to 56 is preferable.
  • PCR simulation may be used.
  • regions common and highly specific to 21 sequences of buckwheat plants including edible buckwheat are identified as ITS-1 to 5.8S rRNA gene to ITS-
  • the sequence is selected by finding from the two sequence portions and setting the base that can ensure specificity with other plants as the base at the 3 'end.
  • ITS 1 to 5.8S rRNA gene-In the ITS-2 sequence part the bases are missing and the number of bases differs depending on the species. Further selection is required to obtain an amplified product of the size.
  • amplification products of the same size can be obtained, the presence of buckwheat can be easily detected.
  • amplification products of the same size can be obtained from all 21 sequences of buckwheat plants. Can be confirmed by simulation. As a result, it is possible to design a primer that can be easily distinguished from non-specific products depending on the size.
  • plants belonging to a specific plant genus to be detected are detected by PCR using the above primers.
  • the plant is quantified by a quantitative PCR method.
  • PCR is described in, for example, Saiki M, et al., Science, 230: 1350-1354 (1985), a separate volume on plant cell engineering, a protocol for plant PCR experiments, Isao Shimamoto and Takuji Sasaki (1995), etc.
  • PCR amplification is performed at a temperature higher than the Tm value of the primer calculated using commercially available software such as Express 11 version 1.5 (Applied Biosysteras), preferably at a Tm value of +10 to + 3 ° C, followed by annealing.
  • the PCR amplification can also be carried out by setting the temperature near the Tm value of the primer, preferably at a temperature of Tm value +7 to 0 ° C.
  • the quantitative PCR method a quantitative method using a real-time PCR method is preferable.
  • the real-time PCR method includes SYBR Green method, Fluorogen probe method such as TaaMan (trademark) probe method, molecular beacon (Molecular Beacon) method, and LightCyd method.
  • er (trademark) probe method but is not limited thereto.
  • Various methods have been vigorously developed recently, and those skilled in the art can implement any method.
  • a sequence that can hybridize under stringent-end conditions inside the site where the PCR primer hybridizes to the amplification target sequence is selected.
  • a specific plant-specific primer set designed as described above, and each oligonucleotide of a PCR primer set for the amplification target sequence, having a luminescent dye at the 5 'end and a quencher at the 3' end A method for quantifying DNA based on the amount of luminescence using a probe that hybridizes under stringent conditions inside a site where the DNA hybridizes, wherein the luminescent dye at the 5 ′ end of the probe is a quencher at the 3 ′ end
  • the probe is degraded by the 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity of TaQ polymerase, and the luminescent dye and quencher Is preferred to be characterized in that light is generated by dissociation of.
  • the entire probe sequence does not need to be inside the site where the above-mentioned PCR primer hybridizes, and the base at the 3 'end of the designed probe and the opposite side of the designed primer to the opposite strand of the hybridized probe are used. 'The base on the terminal side may be overlapped by ⁇ 10 or 55 bases. Further, it is more preferable to select the probe sequence from a portion having a sequence common to the specific plant genus to be detected. For the above probe, TaiMan Probe (trademark) is preferable. Methods for designing TadMan probes are known in the art (PrimerExpress software from PrimedExpress software from AlimedBiosystems).
  • a probe that can be used for quantitative PCR of a given plant or a plant belonging to the genus Plant is referred to as a “probe for detection” of a given plant or a plant belonging to the genus Plant. That is, in the present specification, a detection probe is a combination of a set of detection primers for each plant genus and the use of the probe. And a probe capable of detecting a plant belonging to the plant genus.
  • the detection includes both qualitative and quantitative detection as described above, and it will be understood that such a probe is also advantageous for quantitative detection.
  • FAM FAM
  • HEX HEX
  • TET FITC
  • the like FAM, HEX, TET, FITC and the like are known as the luminescent dye used for the probe, but are not limited thereto.
  • the quencher TAMRA, Dabcyl, and the like, and a non-fluorescent quencher are also known, but are not limited thereto.
  • the length of the probe is preferably 13 to 30 nucleotides, and particularly preferably 13 to 25 nucleotides. Further, in order to maintain a high Tm value even with a short base length, it is more preferable to use a probe labeled with MGB (Minor Groove Binden) for the quencher at the 3 'end.
  • MGB Minor Groove Binden
  • the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 64 can be exemplified.
  • the primer is represented by SEQ ID NO: 35 in addition to the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 34 Oligonucleotides that hybridize under stringent conditions to the base sequence of the base sequence or its complementary strand are preferred.
  • SEQ ID NO: 21 and any of SEQ ID NOs: 26, 65 and 66 are used as the primer, the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 34 is used as the probe. Good.
  • Such a probe can be produced using a commercially available kit after synthesizing an oligonucleotide having the designed sequence, or can be produced by custom order on a custom basis. It is known (for example, Appl ied Biosys tems, Inc. (ht tp // www. Appl iedbiosys tems. Co.j)).
  • the quantification method of the present invention is known for a correction sample in which a sample derived from a specific plant genus to be detected (particularly quantified) and a standard plant sample are mixed at a predetermined ratio, and a food or food raw material to be tested.
  • the copy number of the DNA derived from the standard plant (Lo) and the copy number of the DNA derived from the specific plant genus (Fo ) As the corrected standard value, and for the test sample, the value of one copy of the DNA derived from the specific plant genus (Fs) / the number of copies of the DNA derived from the standard plant (Ls) is calculated. Then, the amount (g) of the plant of the specific plant genus contained in the food or food raw material (1 g) is calculated by the following formula.
  • Amount of plant of specific plant genus ppm (d g / g) Fs / Ls X Lo / Fo X l, 000,000
  • this method corrects for the effects of DNA extraction efficiency and PCR reaction inhibition for each food or food ingredient to be tested, as well as differences in DNA content in samples to be tested. Is possible.
  • a food raw material that does not contain DNA such as a salt or a plant belonging to a specific plant genus in a food containing the raw material.
  • the standard plant sample used in the present invention is preferably similar to the specific plant genus to be detected, since it is desirable that the effects of various components on DNA extraction efficiency be as homogeneous as possible.
  • those derived from plant species that are unlikely to be mixed into the food or food ingredients to be tested are preferred.
  • a plant species other than a plant species recognized as a weed it is necessary to select a sample that does not have a risk of mixing with plants used for food or food ingredients, and that does not have a risk of mixing with food or food ingredients.
  • various field weeds are known, but mainly grasses, bamboo subfamilies, cattails, cyperaceae, asteraceae, polygonaceae, communisaceae, crocusaceae, crocodile family, subericaceae
  • the family includes the family Rosaceae, Nadesicoceae, Kazazaceae, Leguminosae, Oxalis, Euphorbiaceae, Apiaceae, Hirugidae, Lamiaceae, Obacoceae, Solanaceae, and Periaceae. For details, see the description on the website of the Japanese Society of Weed Science.
  • a large amount of uniform material can be obtained at once, for example, commercially available seeds. Is more preferable as a standard plant sample.
  • the standard plant sample may be derived from any plant tissue (seed, leaf, rhizome, etc.), but if the detection target is derived from seeds such as buckwheat, wheat, and peanuts, the like, It is preferably derived from. From this point of view, for example, when testing foods that do not eat watermelon, papaya, melon, etc., there are many seeds in the pulp isolated from the outside world by skin and pulp. Plant species such as watermelon, papaya and melon are preferred. Even if the seed is not isolated from the outside world, it is preferable that the seed is not cultivated as a food crop.
  • the standard plant sample used in the present invention is not particularly limited as long as it satisfies the above conditions, but it is derived from Nemofila (Hawberry family), Gloxinia (Illabionaceae) and starches And the seeds of Staticis (Pinaceae) are particularly preferred.
  • the present inventors have confirmed that it is not preferable to use, as a standard plant sample, rice in a gramineous family containing a large number of upland weeds, instead of the statice. This is thought to be due to the fact that the grass weeds, which are field weeds, are mixed into the harvested material when harvesting the raw material plants.
  • a crushed plant material eg, starch seeds
  • a crushed plant eg, buckwheat
  • a sample for correction by mixing at a predetermined ratio.
  • a test sample is prepared by adding the same ground plant material as above to the food or food ingredients to be tested.
  • it is important to give sufficient consideration so that other food raw materials, and in particular, a sample derived from a specific plant genus to be detected and a standard plant sample do not mix with each other. Thorough cleaning of equipment used for grinding should be ensured.
  • the amount of the sample derived from the specific plant in the correction sample and the amount of the food or food raw material sample in the test sample may be approximately the same.
  • the amount of the standard plant sample in the correction sample and the amount of the sample derived from the standard sample in the test sample are substantially the same.
  • DNA is extracted from these samples.
  • This DNA extraction can be performed by various known methods, and a commercially available kit or prepacked column can also be used.
  • a commercially available kit or prepacked column can also be used.
  • the extracted DNA is subjected to a quantitative PCR method.
  • a quantitative PCR method for quantitative analysis are known, a real-time PCR quantification method using a TaciMan probe (registered trademark) will be simple and advantageous.
  • the primer for detection (including quantitative detection) of the standard plant sample is a primer that causes amplification specific to the DNA of the standard plant sample.
  • the DNA derived from the standard plant when the quantitative PCR method is applied to the genomic DNA extracted from the correction sample in which the sample derived from the specific plant genus to be detected and the standard plant sample are mixed at a predetermined ratio
  • the primer has a copy number that is not very different from the copy number of DNA derived from a specific plant genus, and the difference between the two copy numbers is within 100-fold, preferably within 10-fold, and the LoZFo ratio described above is stable. Is preferred.
  • the Primer for Staticis has the following sequence derived from a part of its ITS-1 sequence:
  • any sequence can be used as long as it hybridizes inside the site where the PCK primer for the amplification target sequence hybridizes.
  • sequence derived from a part of the ITS-1 sequence is derived from a part of the ITS-1 sequence:
  • This calibration curve can be easily prepared by those skilled in the art by various methods. Generate a calibration curve by performing a quantitative PCR method using a known-length MA containing the target sequence containing the target sequence that is amplified by the quantitative PCR method for the standard plant sample and the sample derived from the specific plant genus to be detected. be able to.
  • a plasmid for a calibration curve is prepared by inserting a DNA containing an amplification target sequence of a sample derived from a specific plant genus to be detected and a DNA containing an amplification target sequence of a standard plant sample into one plasmid vector. By amplifying the plasmid with E. coli or the like, a template for a calibration curve can be obtained.
  • a target sequence amplified by a quantitative PCR method for a standard plant sample and a sample derived from a specific plant genus to be detected is determined by the method of Jayaraman K. et al. (1992. BioTechni dues 12: 392-) using an outer primer and a bridge primer. 398).
  • the number of copies contained in the calibration curve template solution can be determined from the weight concentration and the base length. In this copy number In light of this, calculate the number of copies contained in the test sample.
  • Such a concept of the quantitative PCR detection method of the present invention is applicable to a case where a specific raw material to be detected is derived from an animal such as a livestock product and a case where the specific raw material is derived from a microorganism. If the specific raw material to be detected is derived from animals such as livestock products, it is preferable to use animal-derived raw materials as standard samples, and the specific raw material is derived from microorganisms. In this case, it is preferable to use microbial raw materials as standard samples.
  • FIG. 1A shows the result of examining the sensitivity of PCR for white flower buckwheat. After PCK, the cells were stained with 2% agarose gel electrophoresis and etidumamide and prayed with a fluorescence image analyzer.
  • Figure 1B shows the results of investigating the sensitivity of PCR for buckwheat buckwheat. After the PCR, the cells were stained with 2% agarose gel electrophoresis and ethidium membrane, and analyzed with a fluorescence image analyzer.
  • Figure 2 shows the results of examining the specificity of buckwheat PCR. After PCR, the cells were subjected to 2% agarose gel electrophoresis and staining with ethidium umide, and analyzed with a fluorescence image analyzer.
  • Figure 3 shows the results of examining the specificity of the statice PCR for other plant seeds. After PCE, the cells were stained with 2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide, and analyzed with a fluorescence image analyzer.
  • Figure 4 shows the results of examining the specificity of the statice PCR for various food ingredients. After PCR, the cells were stained with 2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide, and analyzed with a fluorescence image analyzer.
  • FIG. 5A shows the results of quantitative PCR of buckwheat DNA.
  • 500 pg of buckwheat DNA, wheat, peanut, soybean, corn, mustard, pepper, and rice were subjected to quantitative PCR for 50 ng of DNA, respectively.However, other than buckwheat, it was not detected in the quantitative detection area, and only sopa was specifically detected. It was confirmed that quantification was possible.
  • FIG. 5B shows the results of quantitative PCR of buckwheat DNA. For buckwheat, quantitative PCR was performed on 500 pg DNA and 50 ng DNA, but it was confirmed that it was not detected in the quantitative detection range for statice.
  • Figure 6 shows the results of the quantitative PCR method for buckwheat DNA. Quantitative PCR was performed on S. pacifica DNA, and buckwheat was significantly slower when using 50 ng of DNA as a template, compared to the template with 10 copies of the standard curve plasmid, and the Threshold Line There was no such detection, and it was not detected in the quantitative detection range, confirming that only buckwheat can be specifically quantified.
  • FIG. 7 shows the results of quantitative PCE of buckwheat DNA using the standard curve plasmid.
  • FIG. 8 is a graph obtained from the results of FIG.
  • FIG. 9 shows the results of a quantitative PCR method for static DNA.
  • statice PCR was performed using 500 pg of DNA as a template.
  • Wheat, peanut, soybean, corn, potato, pepper, rice, and buckwheat were subjected to quantitative PCR for 50 ng of DNA, respectively.However, they were not detected in the quantitative detection area, indicating that only staticis was quantified specifically confirmed.
  • FIG. 10 shows the results of quantitative PCR of static DNA using the plasmid for the calibration curve.
  • FIG. 11 is a graph obtained from the results of FIG.
  • Figure 12 shows the results of examining the specificity of peanut PCR for various food ingredients. After PCE, the cells were stained with 2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide, and analyzed with a fluorescence image analyzer.
  • Figure 13 shows the results of the quantitative PCR method for peanut DNA. 500 ng of peanut DNA, wheat, buckwheat, soybean, corn, apple, azuki, and sugarcane were subjected to a quantitative PCR method for 50 ng of DNA, respectively. It was confirmed that quantitative determination was possible.
  • Figure 14 shows the results of a quantitative PCK method of peanut DNA using peanut MA.
  • FIG. 15 is a graph obtained from the results of FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the DNA was applied to Genomic-tip 20 / .G to adsorb to the column. Thereafter, the column was washed with 5 ml of buffer-QBT, followed by 2 ml of buffer-QC. Finally, the precipitate was eluted with 1.7 ml of buffer-QF, and the precipitate recovered by isopropanol precipitation was dissolved in 401 sterile ultrapure water. The DNA concentration in the solution was measured and appropriately diluted with sterile ultrapure water to obtain a type I DNA sample for PCR.
  • Proteinase K (20 mg / ml) and 10 ⁇ 1 RNaseA (100 mg / ral), mix, and mix at 50.
  • 120 1 buffer-AE which had been pre-warmed at 65 ° C, was added to the column, and eluted from the column by centrifugation at approximately 6, OOOXg for 1 minute.
  • the DNA concentration in the solution was measured and appropriately diluted with sterile ultrapure water to obtain a type I DNA sample for PCR.
  • a sequence common to the ITS-1 to 5.8S rRNA gene sequence in the following 21 sequences registered in GenBank of a plant belonging to the genus Buckwheat was used.
  • Fagopyrum urophyllum (AB000342)
  • Fagopyrum urophyl luni (AB000341)
  • PCR is performed by synthesizing oligo DNA primers of the following sequence (0PC purified product of QIAGEN Co., Ltd.) to detect part of the buckwheat ITS-1 to 5.8S rRNA gene sequence (hereinafter referred to as buckwheat PCR). Used as primers.
  • a plant of the species closely related to buckwheat is defined as the ITS-1 sequence portion of the base sequence of normal buckwheat Fagopyrum escu lentum registered in GenBank (AB000330), which is subjected to BLAST homologous search to obtain a score of 60 bi. It is a plant other than the buckwheat genus with ts or more. This time, the sequence of the species with the highest score among the genera to which the plant belongs was selected as the representative sequence of the genera. The PCR simulation was performed on the ITS-1 to 5.8S rRNA gene to ITS-2 sequence region of those sequences. The GenBank Accession Number of the sequence used for the simulation and the simulation results are shown in Tables 1A to 1C. The abbreviations and symbols in Tables 1A to 1C are as follows:
  • Buckwheat detection primer SEQ ID NO: 14 & SEQ ID NO: 15: amplification product
  • Buckwheat detection primer SEQ ID NO: 14 & SEQ ID NO: Amplification product
  • the purity of the extracted plant DNA was of a level that allows PCR amplification. It was confirmed that PCR amplification products were obtained using primers that amplify a portion of plant chloroplast DNA (data not shown).
  • the buckwheat PCR shows that the size of about lOlbp predicted from the ITS-1 to 5.8S rRNA gene sequence targeted from white flower buckwheat (normal buckwheat) and 500 to 50 fg of buckwheat DNA A PCR amplification product was obtained.
  • the sensitivity at which 500 to 50 ig of buckwheat DNA can be detected is a level that can detect 10 to 1 ppm of buckwheat DNA contained in the sample DNA when PCR is performed using DNA 50n extracted from a sample as type II. Is equivalent to
  • buckwheat PCR From the results of buckwheat PCR, as shown in Fig. 2, wheat leaves, peanut seeds, soybean leaves, corn leaves, power leaf, white pepper, rice No specific PCR amplification product was obtained. Similarly, PCR amplification products can be obtained from salmon sperm DNA. Confirmed that it cannot be performed (data omitted). Furthermore, as shown in Fig. 2, with respect to leaf DNA of buckwheat, which is one of the closely related species of buckwheat, a PCR amplification product of target size was obtained although it was very thin at 50 to 5 ng, but at 500 pg or less, No PCR amplification products or non-specific PCR amplification products were obtained.
  • Specificity of detecting 500 pg or less of buckwheat DNA as a false positive means that 50 ng of DNA extracted from a sample was subjected to PCR with type I, and 1% or less of buckwheat DNA was present in the sample DNA. Even so, it corresponds to a level of specificity that is not detected as a false positive. Also, by changing the PCR conditions, it may be impossible to obtain a target-sized product from 50 to 5 ng of buckwheat DNA.
  • the base sequence of the PCR amplification product derived from white flower buckwheat DNA obtained above was analyzed by a two-strand direct sequence using primers of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15.
  • the obtained base sequence is compared with the base sequence of normal buckwheat Fagopyrum esculentum (AB000330) registered in GenBank, and the base sequence of the PCR amplification product derived from the white buckwheat DNA is registered in GenBank. It was confirmed that the nucleotide sequence (AB000330) of buckwheat (Fagopyrum esculentum) matched 100% with the targeted portion.
  • Stat-1 PCR Primer for PCR (hereinafter referred to as “Statis PCR”) that detects a part of the following sequence of Stat-1 ITS-1 based on the DNA sequence of Aristis registered in GenBank (AJ222860).
  • the purity of the extracted plant DNA was at a level that allows PCR amplification. It was confirmed that PCR amplification products were obtained using primers that amplify a portion of plant chloroplast DNA (data not shown).
  • a PCR amplification product having a size of about 100 bp predicted from the target STAT-1 ITS-1 sequence was obtained from 50 ng of the static DNA seed DNA.
  • PCR amplification products of size and non-specific PCR amplification products are not available. It was also confirmed that no PCR amplification product could be obtained from salmon sperm DNA (data omitted).
  • the above-mentioned primer for detecting the static DNA has specificity to the static DNA.
  • the nucleotide sequence of the PCR amplification product derived from the starch DNA obtained above is SEQ ID NO: 57.
  • the analysis was performed by a double-strand direct sequence using the primer of SEQ ID NO: 58.
  • the obtained nucleotide sequence was compared with the nucleotide sequence of A. genus Limonium sinuatum registered in GenBank (AJ222860), and the nucleotide sequence of the PCR amplification product derived from the starch DNA was compared to the nucleotide sequence registered in GenBank. It was confirmed that the sequence matched 100 with the targeted portion of the base sequence of Limonium sinuatum (AJ222860). It was confirmed that a part of the target sequence of ITS-1 was amplified and detected by static PCR. .
  • a quantification method for quantitative analysis of buckwheat and starch copy numbers by ligating the buckwheat target amplification product and the starch target amplification product by PCR, introducing it into a TA cloning vector, transforming it into E. coli, and amplifying it.
  • a line plasmid was prepared.
  • an oligo DNA primer (0PC purified product from QIAGEN, Inc.) having the following sequence was synthesized and used as a primer.
  • These primers include the buckwheat and starch primers used in the buckwheat and starch PCR described above.
  • a ligated plasmid was prepared by the following method using the HotStarTaq Master Mix Kit manufactured by QIAGE.
  • PCR buffer 400 M each dNTP
  • dNTP further add dNTP to a final concentration of 500 M.
  • SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 63 were added as primers each at a final concentration of 1.OM each
  • SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62 were added as bridge primers at a final concentration of 25 nM, respectively.
  • the obtained PCR reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide, and analyzed with a fluorescence image analyzer Fluorlmager 595 manufactured by Amersham Biosciences.
  • the nucleotide sequence of the obtained PCR amplification product was analyzed by a double-chain direct sequence using primers of SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 63.
  • Ligation PCR resulted in the expected PCR amplification product of approximately 220 bp (data not shown). As a result of the nucleotide sequence analysis, it was confirmed that this PCR amplification product contained sopa and the target DNA sequence of the yeast PCR (data omitted).
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment introduced into the purified plasmid was analyzed by a two-strand sequence using a primer of the sequence on the plasmid, and as a result, the DNA introduced into the plasmid of the transformant was intended. It was confirmed that the nucleotide sequence of the fragment contained the target DNA sequence for buckwheat and statice PCR (data not shown).
  • the number of plasmid molecules was calculated from the length of the plasmid and the absorbance (Abs. 260 nm) of the plasmid extracted and purified as described above. 5 ng / l salmon sperm DNA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. The plasmid was diluted with sodium oxyribonucleic acid, salmon testes (dissolved in sterile ultrapure water) to prepare a plasmid dilution series of ⁇ 1 copy / 2.5 1 for the calibration curve. This was used to create a calibration curve for the quantitative PCR method for buckwheat and starche sequences.
  • TaqMan MGB probe for detecting buckwheat sequence (1) TaqMan MGB probe for detecting buckwheat sequence:
  • a TaqMan MGB probe (reporter dye FAM manufactured by Applied Biosystems Japan) having the following sequence was synthesized and used as a probe for detecting buckwheat sequences.
  • the probe sequence used was a sequence common to 21 sequences registered in GenBank as ITS-1 to 5.8S rRNA gene sequences of plants belonging to the genus Buckwheat.
  • the reaction was repeated 45 times with 1 minute (extension) cycle. All reactions were performed in duplicate on the same sample.
  • the fluorescence data in the extension step was analyzed.
  • the baseline was initially set to 0-1 cycle, the cycle at which the rise of fluorescence started was confirmed, and the baseline was set appropriately before the cycle. Also, the threshold line
  • the purity of the extracted plant DNA is of a level that allows PCR amplification to be confirmed by the fact that a PCR amplification product is obtained using primers that amplify a portion of plant chlorolast DNA. (Data omitted).
  • This specificity is due to the fact that when PCR is performed using 50 ng of DNA extracted from a sample to which staticis has been added as type III, the sample is a kind of weed that is not 100% edible and is a kind of weed that is closely related to buckwheat. If so, it represents a level that cannot be quantified as a false positive.
  • TadMan MGB probe of the following sequence (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.
  • the ITS-1 sequence of Staticis was specifically identified by quantitative PCR using the primers of SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 58, and the probe of SEQ ID NO: 59. It was found that it was possible to detect and quantify its copy number. Combined with the quantitative PCR method of the present starch sequence for correction and the quantitative PCR method of the buckwheat sequence shown in Example 1.F., it was decided to use it for the measurement of buckwheat contamination.
  • White flower buckwheat (normal buckwheat Fagopyrum escu l entum: 2 times) Body) buckwheat flour, buckwheat flour (F. tataricuin: diploid), buckwheat flour of Takamine Ruby (F. esculentum: diploid), buckwheat flour of Greater Ruby (F. escukntum: tetraploid) Using.
  • white flower buckwheat flour was used for the preparation of the pseudo-mixed sample.
  • the grinding was performed by setting a rotor (24 blades made of stainless steel) and a screen (0.220 stainless steel) in an Ultra Centrifugal Mill ZM1 manufactured by Eetscli.
  • parts such as the sample tray, sample lid, roaster, screen, fasteners, and jigs of the crusher were washed with water, immersed in a 10% bleach solution, washed with water, and dried. .
  • the body of the mill was cleaned with an air gun and wiped clean before use.
  • No. 5 (Fukusuke Kogyo Co., Ltd.) of No. 5 contains 12.5 g of crushed rice containing lOppm buckwheat and lOppm of sopa flour 12.5 g of ground wheat was weighed, the mouth of the bag was closed and mixed by hand for 15 minutes to produce ground rice and wheat containing lOppm buckwheat flour.
  • buckwheat flour the density including the empty wall inside the flour
  • measure the density of white buckwheat flour Hg method, a method of filling buckwheat flour into a fixed volume cell and then filling the cell with mercury
  • the measurement was requested to a powder measurement technology center of Seishin Corporation.
  • the bulk density (mercury method) of the white buckwheat flour was 1.181 gZcm 3 .
  • volume occupied by buckwheat flour (volume of cell) one (volume of mercury charged)
  • zirconia apoyl (YTZ pole ⁇ 7 manufactured by Nitsukato Co., Ltd.) After mixing the three pieces and mixing them with a shaker (KM Shaker V-DX, manufactured by Iwaki Industry Co., Ltd.) for 10 minutes or more until the lumps disappeared (SPEED 100), the mixture was kept at 74 for 20 minutes. During the incubation, the tube was shaken by hand every 5 minutes to mix.
  • the buffered QBT was added to Genomic-tip 20 / G which had been equilibrated with 1 ml of buffer QBT in advance to adsorb the DNA to the column. So After that, the column was washed with 4m] of buffer QC. Finally, the DNA was eluted with 1 ml of buffer-QF, and the precipitate recovered by isopropanol precipitation was dissolved in 401 sterile ultrapure water. The DNA concentration in the solution was measured and appropriately diluted with sterile ultrapure water to obtain a type I DNA sample for PCR.
  • the results of the LoZFo ratio measurement were as follows: white flower buckwheat flour 2.36 (six points extracted, 2 ⁇ l measurement at each point, twice measurement), Takamine ruby buckwheat flour 3.25, Greater rub buckwheat flour 2 70, tartary buckwheat flour 4.75 (3 points extraction, 2 ⁇ l measurement for each point, 2 measurements).
  • the amount of buckwheat mixed was determined.
  • the raw data obtained when measuring the Lo / Fo ratio of various sopa flours are shown in Table 4B and Table 4B.
  • Fagopyrum Quantification of copy number of PCR sequence Limonium: Quantification of copy number of statice sequence PCR Sample information (buckwheat flour) Sample information (buckwheat flour)
  • Baseline (3 10) Baseline: (3 10) Table 4A Raw data of Lo / Fo ratio measurement of various buckwheat flours (first measurement)
  • Fagopyr m Quantification of copy number of buckwheat sequence PCR Limonium: Quantification of copy number of statice sequence PCR Sample information (buckwheat flour) Sample information (buckwheat flour)
  • Baseline (1, 5)
  • Baseline (1, 5)
  • Table 4B Raw data of Lo / Fo ratio measurement of various buckwheat flours (2nd measurement)
  • Quantitative PCR for buckwheat and starch sequences was performed by the method described in Example 1 under F. and G. DNA extracted from a pseudo-contaminated sample to which a static standard was added based on the calibration curve
  • the Fs / Ls ratio of the pseudo-mixed sample was determined by extracting three points from the same sample and measuring each point at 2 ⁇ l. Calculated. Using the FsZLs ratio calculated here and the Lo / Fo ratio calculated in Example 2.F., the mixed amount (Hg.) Of buckwheat in the pseudo mixed sample (lg) was determined by the following equation.
  • Buckwheat contamination ppm ( ⁇ g / g) Fs / Ls X Lo / Fo X l, 000,000
  • Table 6A Raw data for measuring the amount of buckwheat mixed in various simulated mixed samples (1st time) '
  • Fagfo ⁇ ra Quantification of buckwheat sequence copy number PCR ⁇ Li ofi Mfii: Quantification of statice sequence copy number CJ
  • Baseline (3 10)
  • Baseline (3, 10)
  • Table 6A Raw data for measuring the amount of buckwheat mixed in various simulated mixed samples (1st time)
  • Table 6B Raw data for measuring the amount of buckwheat mixed in various simulated mixed samples (second time)
  • J3 ⁇ 4g 2 rm Quantification of copy number of buckwheat sequence PCR
  • Ltmonium Quantification of copy number of starch-sequence PCR sample information (pseudo-mixed sample) Sample information-sillon (pseudo-mixed sample)
  • Example 1 The same one as in (1) and (2) was used.
  • Example 1 The same one as in A. (3) was used.
  • Example 1 Performed in the same manner as in B. (2).
  • Example 1 Performed in the same manner as in B. (4).
  • Proteinase K (20 mg / ml)> 201 MaseA (100 mg / ml) was added and mixed.
  • the sample lg which had been finely ground, was placed in a 15-ml tube, 10 ml of buffer AP1 and 10 il of RNase A (100 mg / ml) were added, mixed, and incubated at 65 for 60 minutes. Then, the mixture was centrifuged at about 3,000 Xg for 10 minutes to obtain a supernatant. To this, 1.5 ml of buffer AP2 was added, the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes, and the supernatant was obtained by centrifugation. The obtained supernatant was applied to a QIAshredder spin column, and a column pass solution was obtained by centrifugation.
  • ITS-1 sequence As a primer sequence, a sequence common to the ITS-1 sequence among the following 11 sequences registered in GenBank of a plant belonging to the genus Peanut was used.
  • Arachis hypogaea a sequence obtained by analyzing commercial peanuts was used instead of Arach is hypogaea (AF156675) registered in GenBank.
  • an oligo DNA primer of the following sequence (0PC, manufactured by QIAGEN Co., Ltd.) is synthesized and used as a primer for PCR that detects a part of the peanut ITS-1 sequence (hereinafter referred to as peanut PCR). did.
  • the ITS-1 sequence portion of the base sequence of the peanut Arachis hypogaea (AF156675) registered in GenBank is subjected to BLAST homology search and is a plant other than the peanut genus that has a score of 60 bits or more. This time, the sequence of the species with the highest score among the genera to which the plant belongs was selected as the representative sequence of the genera.
  • the PCR simulation was performed on the ITS-1 to 5.8S rRNA gene to ITS-2 sequence region of those sequences. SEQ ID NO: 2
  • Table 7A shows the GenBank Accession Number of the sequence used for the simulation and the simulation result when the primer 1 and SEQ ID NO: 65 were used in combination.
  • ⁇ 7E are shown as representatives.
  • the abbreviations and symbols in Tables 7A to 7E are as follows. *: Expected to obtain a PCR amplification product near the target size (10 bp) W value: Possibility of obtaining a PCR amplification product
  • Peanut detection ply (SEQ ID NO: 21 & SEQ ID NO: 65)
  • Faaopyrum_esculentum AB000330, ⁇ ⁇ ⁇ Ichiichi (Shirahana Soba) AB000331
  • Prunus persica peach
  • peach one ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ fixed AF179562
  • a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 66 is used in combination.
  • a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 66 is used in combination.
  • a result was expected that a target PCR amplification product could be obtained from a peanut sequence.
  • a PCR amplification product of about 76 bp in size expected from the peanut ITS-1 sequence targeted from 500 ig of peanut DNA was obtained.
  • the sensitivity to detect 500 ig of peanut DNA means that 50 ng of DNA extracted from a certain sample is PCR This corresponds to the level of sensitivity that can detect 1 Oppm buckwheat DNA contained in the sample MA.
  • the base sequence of the PCR amplification product derived from peanut DNA obtained when the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 65 were used in combination was the same for both primers using SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 65. Analyzed by strand direct sequence. The obtained nucleotide sequence is compared with the nucleotide sequence of commercial peanut Arach is hypogaea, and the nucleotide sequence of the PCR amplification product derived from peanut DNA is 100% that of the target portion of the nucleotide sequence of commercial peanut (Arach is hypogaea). It was confirmed that they matched. (Data omitted) This proved that PCR using the above primers amplified and detected a part of peanut ITS-1 sequence.
  • the peanut PCR using the above primers can detect the ITS-1 sequence of the whole plant belonging to the genus Peanut with high sensitivity and specificity.
  • These primers were used in PCR for quantifying the copy number of the peanut ITS-1 sequence (hereinafter referred to as the quantitative peanut sequence PCR method).
  • TatiMan MGB probe with the following sequence (Reporter manufactured by Applied Biosterns lapan, Inc.)
  • the dye FAM was synthesized and used as a probe for detecting peanut sequences.
  • As the probe sequence 11 sequences registered in GenBank as ITS-1 sequences of plants belonging to the genus Peanut, and sequences common to sequences obtained by analyzing commercially available peanuts were used.
  • the fluorescence data in the extension step was analyzed.
  • the baseline was set to 0-1 cycle at the beginning, and the cycle at which the rise of the fluorescence started was confirmed.
  • the threshold line was set according to the method described in Kuribara H et al. 2002. Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean. Journal of A0AC International 85: 1077-1089.
  • the results when the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 65 are used in combination are shown as representatives in FIGS. 13, 14, and 15.
  • the purity of the extracted plant DNA at a level that can be amplified by PCR means that PCR amplification products can be obtained using primers that amplify a part of the plant ch10rop1ast DNA or Rubisc0 gene sequence. Confirmed (data omitted).
  • a dough (diameter 6 cm, thickness Iran) was prepared by adding 35 g of water and 0.8 g of salt to 80 g; this was subjected to the following four heat treatments: 1 baking (160, 10 minutes), 2 frying (185 ° C, 5 seconds), 3 steam (100 ° C,
  • the PCR method of the present invention for quantifying plants belonging to a specific plant genus contaminated in foods or food raw materials, it is possible to detect and quantify the presence of a trace amount of plants of a specific plant genus in foods or food raw materials. Therefore, it is particularly effective in detecting the presence or absence of contamination by plants of allergen-causing plants such as buckwheat, peanut, wheat and soybean, and quantifying the same.
  • a method for compensating for effects such as DNA extraction efficiency and PCR reaction inhibition for each sample to be tested correction is made for effects such as inhibition of PCR reaction in the reaction solution by adding purified DNA as a standard from the outside.
  • DNA from a specific plant genus to be detected and DNA from a standard plant are simultaneously extracted from a sample to which a standard plant sample other than purified DNA has been added, and quantitative PCR is performed. Since the effects of DNA extraction efficiency and PCR reaction inhibition can be measured under uniform conditions between a plant sample and a sample derived from a specific plant genus to be detected, extremely reliable quantification is possible. In addition, it has the advantageous effect of being able to correct for effects such as DNA extraction efficiency and PCR reaction inhibition, as well as differences in DNA content in samples to be tested. In addition, for example, it is also possible to appropriately quantitatively detect a food raw material that does not contain DNA such as a salt or a plant belonging to a specific plant genus in a food containing the raw material.
  • the present invention is useful for the quantitative detection of plants belonging to a specific plant genus that causes allergies mixed in food or food raw materials. Furthermore, in the quantitative analysis by the PCR method, when a false positive is found, the PCR amplification product is subjected to DNA sequence analysis, The fact that false positives can be reliably excluded means that it has excellent industrial applicability.
  • the quantitative PCR method has a wider dynamic range than the ELISA method, and has high specificity and sensitivity sufficient for quantitative detection of specific raw materials mixed in food or food raw materials.
  • the use of synthetic products (primers and probes) enables high reproducibility of measurement results and high reliability.

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Description

明 細 書 食品または食品原材料中の特定植物属の定量的 PCR検出法 技術分野
本発明は、食品または食品原材料中に含まれる特定植物属の定量的検出方法に関する。 背景技術
2002年 4月より、 日本において、 アレルギーの原因となる特定原材料について製品へ の表示制度が開始された。 したがって、食品については特定原材料として、小麦、 ソバ、 落花生、 乳および卵の 5品目について下記の条件に沿って表示が義務づけられた [(「厚 生労働省ホームページ ： アレルギー物質を含む食品に関する表示について」 ( ttp://www. mhlw. go. jp/topics/0103/tp0329-2b. html)), (「食品衛生学雑誌 (Journal of the Food Hygienics Society of Japan (SH0KUHIN EISEIGAKU ZASSHD), (日本）， 社 団法人 日本食品衛生学会， 2 0 02年， 第 4 3巻， 第 4号， p. j - 2 6 9— j - 2 7 1J)]。 これに伴い、 厚生労働省からは、 特定原材料について、 一次スクリーニング用の ポリクローナル抗体による定量 ELISA法ならびに確定試験用の定性 PCR法（小麦、ソパ、 落花生） およびウェスタンブロッ卜法 （乳、 卵） の試験が通知されている。 一次スクリ 一二ングの ELISA法については 1種の ELISAキットのうちのいずれかの定量値が lOppm 以上 （特定原材料の総タンパク質量 最終製品重量に換算） である試料は陽性であると 判断され、 さらに、 製造記録の確認、 PCR法 （小麦、 ソバ、 落花生） またはウエスタン プロット法 （乳、 卵） による定性試験での確認が行われることになる [(厚生労働省ホー ムページ： 「アレルギー物.質を含む食品の検査方法について」 （食発第 1106001 号） (http://www ourei. mhlw. go. jp/~hourei/cgi-bin/t_doc frame. cgi?M0DE=tsuc!iiH)M0DE =C0NTENTS&SM0DE=N0RMAL&KEYW0RD=SEFSN0=4642)) ]。
一般に、 ELISA 法は非常に高感度のタンパク質検出法であり、 当該方法は当技術分野 においては慣用技術となっている。 しかしながら、 ポリクローナル抗体を用いた ELISA 法では交差反応性が比較的高く、非特異的なタンパク質を検出する可能性があるため（石 川栄治監訳：ェンザィムィムノアッセィ （1989))、 偽陽性の判定が出る可能性がある。 偽陽性について検定するためには、 他の方法で再確認することを要する。
また、 ELISA法は、 高感度である一方で、 測定におけるダイナミックレンジが狭い。 測定におけるダイナミックレンジが狭いということは、 未知の濃度の試料を正確に測定 するためには、 何段階かに希釈した検液を用意して、 検量線の範囲内に収まる検液の測 定結果を選択する必要が生じる可能性がある。 さらに、 通常 ELISAによる測定では、 被 検対象とする試料毎の抽出効率や ELISA反応の阻害などの影響に対する補正が考慮され ておらず、 特に食品のような多岐に渡る加工処理および混入物が推定される試料等を測 定して定量値を出す場合には注意が必要である。
さらに、 例えば、 市販のソパタンパク質検出用 ELISAの検出感度は、 キット付属の検 量線用標準ソバタンパク質検液で 1 ng/ml ( 20〜400倍希釈して EL I SAに供したとすると、 特定原材料の総タンパク質量 Z最終製品重量に換算すると 0.02〜 lppm) と高感度であ る [(「食品衛生学雑誌 （Joournal of the Food Hygienics Society of Japan (SH0KUHIN EISEIGAKUZASSHD), (日本）， 社団法人 日本食品衛生学会， 2002年， 第 43巻， 第 4号， p. j - 275 - j - 277」、（「食品衛生学雑誌（Joournal οί theFood Hygienics Society of Japan (SH0KUHI EISEIGAKU ZASSHD), (日本）， 社団法人 日本食品衛生学 会， 2002年， 第 43卷， 第 4号， p. j - 277— j - 279」、 （日本ハム株式会 社 FAST KIT (Food Allergen Screening Test)シリーズ ェライザ そば— ELISA BUCKWHEAT 一 <<取扱い p¾明書 >>：)、 （株式会社森永生科学研究所 モリナガ そば測定キット 取 扱い説明書）]。 しかしながら、 例えばソバの総タンパク質量 Z試料重量に換算してこの レベルの濃度となるソバ粉を含む試料から 2 gをサンプリングした場合、検出対象の特定 原材料の粒径がかなり細かくないと、 試料からはソバ粉の粒をサンプリングできない恐 れもあり得る。
一方、 混入したソバを検出するための PCR法として現在知られているものは、 感度が ソバ MA量として約 5pgであり、 小麦中にソバを添加した試料では約 lOppmのソバが検 出できるが、この公知の方法では定量分析はできない [(「食品衛生学雑誌（Journal of the Food Hygienics Society of Japan ( SH0KUH I N E I SE I GAKU ZASSHD), (日本）， 社団法人 日 本食品衛生学会， 2002年，第 43巻， 第 4号， p. j - 280 - j - 282」、 （「（社） 日本食品衛生学会第 84回学術講演会 講演要旨集」， （日本）， 社団法人 日本食品衛生学 会， 2002年， p. 104))。 また、本発明者らは、 特定植物属の存在を検出するための方法として、 lppm以上 （DNA /DNA) の感度で検出可能な ITS配列を標的とした定性 PCR法を開発し、 2 0 0 2年 9月 2 7日付けで日本国特許出願 （出願番号：特 2002-284222) をしたが、 当該方法では定 量分析はできない。
遺伝子組換え作物の PCRによる定量法として、 遗伝子組換えとうもろこしに特有の遺 伝子配列のコピー数を測定し、 別途測定したとうもろこしに固有の内在性遺伝子配列の コピー数で補正を行い、 とうもろこし原料中の遺伝子組換えとうもろこし原料の量を測 定するものがある [ (「ジャーナル ォブ エーオーエーシー イン夕一ナショナル (Journal of AOAC INTERNATIONAL) J , (米国）， エーォ一エーシ一 インターナショナル (A0AC INTERNATIONAL) , 2 0 0 2年， 第 8 5巻， 第 5号， p . 1 0 7 7— 1 0 8 9 ) ]。 詳しくは、 まず純粋な遺伝子組換えとうもろこしの代表的な品種を使用して、 その種 子から抽出した DNAの 「組換え DNA配列のコピー数 内在性遺伝子配列のコピ一数」 の 値 （内標比） を求める。 次に、 未知試料の 「組換え DNA配列のコピー数 Z内在性遺伝配 列のコピー数」 の値を求め、 これに内標比の逆数と 100を乗じて遺伝子組換えとうもろ こしの混入率を測定するものである。 この方法では、 種々の品種のとうもろこしでコピ —数が同じであり、 かつ共通な塩基配列を持つ内在性遺伝子を内部標準として用いてい るため、 とうもろこしならとうもろこしというように同じ植物種からなる試料中での組 換え体の含有量を定量することには適している。
しかしながら、 様々な生物種や無生物の原料からなる混合物中に存在するアレルギー の原因となる特定原材料の量を測定することを考えた場合、 様々な生物種の DNAの中か ら内部標準として用いることのできる内在性配列を見出すことは困難であり、 さらには 無生物の様に MAの無いものからそれを見出すことは不可能である。 発明の開示
そこで、 食品または食品原材料中に混入した特定の原材料の定量的検出方法として、 より欠点の少ない方法を開発することを試みた。 すなわち、 被検対象とする試料毎の抽 出効率や検出反応の阻害などの影響に対する補正が可能であり、 ELISA 法よりダイナミ ックレンジが広く、 かつ食品または食品原材料中に混入した特定の原材料の定量的検出 に十分な特異性および感度を有する定量方法の開発を目的として、 本発明を検討した。 すなわち、 被検対象とする試料毎の抽出効率や検出反応の阻害などの影響を考慮する ために標準植物由来の試料 （標準植物試料） を用いて補正すること、 検出のダイナミツ クレンジが公知の ELISA法に比べて広いこと、 ならびに十分な特異性および感度を有す ることを特徴とする、 定量的 PCR検出法の確立を鋭意検討し、 本発明を完成させるに至 つ 7こ。
すなわち、 本発明は、
1 . PCR法による食品または食品原材料中の特定植物属に属する植物を定量する方 法であって、
検出対象である特定植物属由来の試料と標準植物試料とを予め定めた比率で混合した 補正用サンプルを用意し、 該サンプルからゲノム DNAを抽出すること、
被検対象である食品または食品原材料に既知量の標準植物試料を添加した被検サンプ ルを調製し、 該サンプルからゲノ DNAを抽出すること、
検出対象である特定植物属由来の試料を検出するためのプライマーセット、 および標 準植物試料を検出するためのプライマ一セットを用いて各サンプルから抽出したゲノム DNAをテンプレートとして定量的 PCR法を実施すること、
補正標準値として、 補正用サンプルについて上記定量的 PCR法によって標準植物由来 DNAのコピー数/特定植物属由来 MAのコピー数の値を求めること、 ならびに
被検サンプルについて上記定量的 PCR法によって特定植物属由来 DNAのコピ一数 Z標 準植物由来 DNAのコピ一数の値を求め、 これを上記補正標準値を用いて補正して、 食品 または食品原材料中に含まれる特定植物属の植物の量を算出すること、
を含む上記方法；
2 . 定量的 PCR法がリアルタイム PCR法である、 上記 1記載の方法；
3 . リアルタイム PCR法が、 5 ' 末端に発光色素および 3 ' 末端に消光剤を有してい る、 PCRプライマーセットの各オリゴヌクレオチドがハイブリダィズするゲノム DNAの 部位の内側にハイブリダィズするプローブを用いて、 発光量に基づいて DNAを定量する 方法であって、 ここで、 プローブの 5 ' 末端の発光色素はその 3 ' 末端の消光剤によって その発光が抑制されているが、 PCE反応において Tadポリメラーゼによってプライマー から DNAが伸長されると、 TaQポリメラーゼの 5'—3'ェキソヌクレアーゼ活性により上 記プロ一ブが分解され、発光色素と消光剤とが解離して発光を生じることを特徴とする、 上記 2記載の方法；
4 . 標準植物が、 畑地雑草および食用作物以外の植物種に属するものである、 上記 ；!〜 3のいずれかに記載の方法；
5 . 標準植物が、 ス夕一チスである上記 4記載の方法；
6 . 検出対象の特定植物属が、 ソバ、 落花生、 小麦または大豆属である、 上記 1〜 5のいずれかに記載の方法；
7 . 標準植物がス夕一チスであり、 スターチス検出用プライマーセットが、 配列番 号 5 7記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 5 8記載の配列を有する才 リゴヌクレオチドとからなるセットであり、 スターチス検出用プローブが、 配列番号 5 9記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、 上記 2または 3記載の方法；
8 . 検出対象の特定植物属がソバ属であり、 ソバ属検出用プライマーセットが、 配 列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 1 5記載の配列を有す るオリゴヌクレオチドとからなるセットであり、 ソバ属検出用プローブが、 配列番号 6 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、 上記 2または 3記載の方法；
9 . 検出対象の特定植物属が落花生属であり、落花生属検出用プライマーセッ卜が、 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットであ り、 落花生属検出用プローブが、 配列番号 3 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチド である、 上記 2または 3記載の方法；
1 0 . 配列番号 5 7記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 5 8記載 の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるスターチス検出用プライマーセット ；
1 1 . 配列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 1 5記載 の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソバ属検出用プライマーセット。
1 2 . 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花生属検 出用プライマ一セット ；
1 3 . 食品または食品原材料中の特定植物属に属する植物を検出するための方法に 用いるためのキットであって、 標準植物試料検出用プライマーセットを含む、 上記キッ 卜 ； 1 4 . 標準植物試料検出用プローブをさらに含む、 上記 1 3記載のキッ卜 ；
1 5 . 標準植物がスターチスであり、 スターチス検出用プライマーセット力 配列 番号 5 7記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 5 8記載の配列を有する ォリゴヌクレ才チドとからなるセッ卜である、 上記 1 3または 1 4記載のキット ；
1 6 . 配列番号 5 9からなる配列を有する、 スターチス検出用プローブをさらに含 む、 上記 1 5記載のキット ；
1 7 . 検出対象の特定植物属検出用プライマ一セットをさらに含む、 上記 1 3〜 1 6のいずれかに記載のキット ；
1 8 . 検出対象の特定植物属がソバ属であり、 その検出用プライマーセットが、 配 列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 1 5記載の配列を有す るオリゴヌクレオチドとからなるセットである、 上記 1 3〜 1 6のいずれかに記載のキ ッ卜 ；
1 9 . 配列番号 6 4からなる配列を有するソバ属検出用プロ一ブをさらに含む、 上 記 1 8記載のキット ；
2 0 . 検出対象の特定植物属が落花生属であり、 その検出用プライマーセットが、 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、 上記 1 3〜 1 6の いずれかに記載のキット ；
2 1 . 配列番号 3 4からなる配列を有する落花生属検出用プローブをさらに含む、 上記 2 0記載のキッ卜 ；
2 2 . 標準植物試料としてスターチス試料をさらに含む、 上記 1 5記載のキット ；
2 3 . 標準植物がスターチスであり、かつ、検出対象の特定植物属がソバ属であり、 ス夕一チスおよびソバについての検量線を作製するための、 スターチスの増幅標的配列 を含む DNAとソバの増幅標的配列を含む DNAとを連結して含む検量線作製用プラスミド をさらに含む、 上記 1 3記載のキット ；
2 4 . 標準植物がスターチスであり、 かつ、 検出対象の特定植物属が落花生属であ り、 ス夕一チスおよび落花生についての検量線を作製するための、 スターチスの増幅標 的配列を含む DNAと落花生の増幅標的配列を含む DNAとを連結して含む検量線作製用プ ラスミドをさらに含む、 上記 1 3記載のキット ； 2 5 . 食品または食品原材料中のソバ属に属する植物を検出するための方法に用いる ためのキットであって、 配列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配歹 IJ 番号 1 5記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソバ属検出用プライマーセ ッ 1、を含む、 上記キッ卜 ；
2 6 . 配列番号 6 4からなる配列を有するソバ属検出用プローブをさらに含む、 上 記 2 5記載のキット ；
2 7 . 食品または食品原材料中の落花生属に属する植物を検出するための方法に用 いるためのキットであって、 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花 生属検出用プライマーセットを含む、 上記キット ；ならびに .
2 8 . 配列番号 3 4からなる配列を有する落花生属検出用プローブをさらに含む、 上記 2 7記載のキット ；
に関する。
本発明の方法、 すなわち、 被検対象とする試料毎の MA抽出効率や PCR反応の阻害な どの影響に対する補正の方法として、 外部から DNAを標準として添加して反応溶液中の
PCR反応の阻害などの影響に対する補正を行うのではなく、 外部から精製 DM以外の標 準植物試料を添加したサンプルから検出対象の特定植物属（本明細書中、 「検出対象の特 定植物属」 とは、定量対象の特定植物属をも包含する） 由来の DNAと標準植物由来の DNA を同時に抽出して定量的 PCR法を行うという方法は、 本明細書において初めて開示され るものである。 かかる方法により、 標準植物試料と検出対象の特定植物属由来の試料と の間で、 DNA抽出効率や PCR反応の阻害等の影響が均一な条件で測定できるため、 非常 に信頼度の高い定量が可能である。 また、 DNA抽出効率、 PCR反応の阻害等の影響、 さら には被検対象とする試料中の DNA含有量の違いに対しても補正が可能であるという、 有 利な効果を本発明の方法は有している。 さらに、 PCR 法による定量分析は、 偽陽性が出 た場合に、 その PCR増幅産物を DNA配列の解析に供することにより、 確実に偽陽性を除 外することができるという点から、 産業上利用性に優れているといえる。 したがって、 本発明は、 食品または食品原材料中に含まれるアレルギーの原因となる特定植物属に属 する植物の定量的検出に有用である。
したがって、 本発明の方法において、 標準植物試料として用いるスターチス検出用プ ライマーセット、 および特定植物属としてのソバ属または落花生属検出用のプライマー セットも本発明に包含し、 さらに、 これらのプライマ一セットと組合わせて、 リアルタ ィム PCR法による検出に用いるためのプローブも本発明に包含される。 また、 標準植物 試料を検出するためのプライマーセット、 および検出対象の特定植物属に属する植物を 検出するためのプライマ一セットのいずれかまたは両方を含む、 本発明の方法の実施に 用いるためのキットも本発明の範囲に含まれる。 かかるキットは、 上記プロ一ブを含ん でいてもよい。 さらには、 標準植物試料を含んでいてもよく、 標準植物としてはスター チスが好ましく、 その試料としてはス夕一チス植物体の乾燥粉末が好ましいが、 特に種 子の乾燥粉末が好ましい。 さらには、 該キットに含まれるプライマーセットが増幅し得 る、 標準植物試料の配列を含む DNAと検出対象の特定植物属の配列を含む DNAとを連結 して含む、 標準植物試料と特定植物属についての検量線を作成するための検量線作成用 プラスミドが、 上記キッ卜に含まれていてもよい。
本明細書において、 所定の植物もしくは植物属 （その属に属する、 即ち含まれる植物 を指す場合も含む）、 またはこれらに由来する試料の 「検出用プライマ一」 または「検出 するためのプライマ一 jとは、 PCR法において、 所定の植物または植物属に属する植物の ゲノム DNAの一部を特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドからなるプライマ一を いう。 PCR法に用いるためのフォワードプライマ一とリバ一スプライマ一の 2つのオリ ゴヌクレオチドからなるプライマ一対を、 本明細書においては 「プライマーセット」 と 称する場合がある。 - 本発明のプライマーは、 各植物属を定量するための定量的 PCR法に用いることができ るものであるが、 各植物属の非定量的 （即ち、 定性） 検出に用いることもできるもので あることは言うまでもない。 本発明のプライマーを用いると、 検出対象とする植物属に 属するあらゆる植物種を検出することができ、 本発明のプライマーおよびプライマーセ ットは、 定量的および非定量的 PCIMこおいて有利である。
本明細書中、 「検出」 という用語は、 定性および定量的検出の両方を包含する。
本発明においては、 検出対象である特定植物属由来の DMを特異的に増幅させるため のプライマーを設計する。 すなわち、 45S rRNA前駆体遺伝子配列中で特定植物属に共通 する塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得るプ ライマ一であって、 該核酸分子とハイブリダィズしたときに 3'末端が特定植物属の ITS- 1配列中の塩基と相補的に結合するプライマー （A) または ITS-2配列中の塩基と 相補的に結合するプライマー （B) を 1種以上使用した PCRの後、 特定植物属の ITS - 1 または ITS- 2配列の少なくとも一部を含む PCR増幅産物の存在を指標として特定植物属 の存在を検出することができるプライマーを設計する。
なお、 「ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする」 とは、 2つの DNA断片が、 Sambrook Jらによって記載されたような標準的なハイブリダィゼーション条件下で相互 にハイブリダィズすることを意味する （Expression of cloned genes in E. col i (Molecular Cloning:A laboratory manual (1989)) Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9. 47-9. 62及び 11.45-11.61)。 より具体的には、 例えば以下の式で求 められる Tm値を基準としてハイブリダイゼ一シヨン （例えば約 3.0 X SSCまたは 2.0 X SSC、 30°Cまたは 37で） を行った後、 ハイブリダィゼーシヨンの条件よりストリンジェ ンシ一の高い条件での洗浄 （例えば約 2.0XSSC、 30°C、 37°C、 40°C、 44°Cもしくは 48°C 以上、 または 1. OXSSCもしくは 0.5XSSC、 37°C以上など） を行うことを意味する。 ノ、 ィブリダイズする塩基配列などに応じて適宜ハイプリダイゼ一シヨンおよび洗浄に適切 な 「ストリンジェントな条件」 を選択することは、 当技術分野では周知技術である。 な お、 本明細書中、 単に 「ハイブリダィズする」 と記載する場合も、 特に条件等を言及し ているものを除き、 ストリンジェントな条件でハイブリダィズすることを意味する。
Tm=81.5 + 16.6(log10 [Na}]) +0.41 (fraction G+C)一 (600/N) また、 本明細書でいう 「属」 とは、 その属に属する植物全部を含むもの、 または属に 属する植物の中から選んだ幾つかの種を含むものを意味する。
本発明に用いるプライマーセットは、 45S rRNA前駆体遺伝子配列中の、 特定植物属.内 で共通している塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイ ズし得るプライマ一対であって、該プライマー対のうち少なくとも一方のプライマーは、 該核酸分子とハイブリダイズしたときに 3'末端が特定植物属の ITS- 1配列中の塩基と相 補的に結合するプライマ一 （A) または ITS- 2配列中の塩基と相補的に結合するプライ マー （B) であることが重要である。 ここで、 プライマー （A) は ITS- 1 と 5.8S rRNA 遺伝子配列との境界を含む領域にハイプリダイズするもの及び ITS-1と SSU rRNA遺伝子 配列との境界を含む領域にハイブリダィズするものをも含む。 同様に、 プライマー （B) は ITS- 2 と 5. 8S rRNA遺伝子配列との境界を含む領域にハイブリダィズするもの及び ITS- 2 と LSU rRNA遺伝子配列との境界を含む領域にハイブリダィズするものをも含む。 プライマー （A) 及び （B ) は少なくとも 15個の塩基からなるものが好ましく、 より好 ましくは 15から 30個の塩基からなる。 ITS-1配列及び ITS- 2配列は種に特異的な配列 を多く含んでいるので、 45S rRNA前駆体遺伝子配列中の、 特定植物属内で共通している 塩基配列を有する核酸分子として、 ITS-1 または ITS- 2配列中の、 特定植物属内で共通 し、 かつ該属に特異的な塩基配列を有する核酸分子を好適に選択することにより、 特定 種類の植物属内で共通し、 かつ該属に特異性を持つプライマー （A) または （B ) を得 ることができる。 また、 プライマー （A) または （B ) を 1個または 2個以上使用して もよく、 2 個以上使用する場合には、 さらに特定種類の植物属に対する特異性が高くな る。
また、 別の態様としては、 プライマ一 （A) と、 特定植物属の ITS- 1、 5. 8S rRNA遺伝 子、 ITS-2及び LSU rRNA遺伝子が連続して結合した配列の一部の塩基配列を有する核酸 分子とストリンジ工ントな条件下でハイブリダィズし得るプライマー （C ) とを使用す る。 あるいはプライマー （A) と、 特定植物属の SSU rRNA遺伝子及び ITS-1が連続して 結合した配列の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし得るプライマ一 （E ) とを使用する。 さらに、 別の態様としては、 プライマ 一 ( B ) と、 特定植物属の SSU rRNA遺伝子、 ITS-1、 5. 8S rMA遺伝子及び ITS- 2が連 続して結合した配列の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下で ハイブリダィズし得るプライマー （D ) とを使用する。 あるいはプライマー （B ) と、 特定植物属の ITS- 2及び LSU rRNA遺伝子に連続して結合した配列の一部の塩基配列を有 する核酸分子とストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし得るプライマー （F ) と を使用する。 ここで、 5. 8S rRNA遺伝子は保存性が高く、 大多数の植物に共通な配列を 多く含んでいる。 それ故、 プライマ一 （C ) として、 5. 8S rRNA遺伝子の一部の塩基配 列を有する核酸分子とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし得るプライマーで あって、 該核酸分子とハイブリダィズしたときに 3'末端が 5. 8S rRNA遺伝子配列中の塩 基配列と相補的に結合するプライマーを好適に選択することにより、 またはプライマー
(D ) として、 5. 8S rMA遺伝子の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし得るプライマーであって、 該核酸分子とハイプリダイズ したときに 3'末端が 5. 8S rRNA遺伝子配列中の塩基配列と相補的に結合するプライマー を好適に選択することにより、 該プライマ一は種々の植物に対して共通して使用するこ とも可能である。 これらのプライマーを固定し、 ITtS - 1 または ITS-2領域から検出した い特定植物属内で共通し、 かつ該属に特異的なプライマーを選択することによって、 該 特定植物属に属する植物の混入を高感度で検出するためのプライマーを容易に設計する ことができる。 プライマ一 （C ) 〜 ( F ) は少なくとも 15個の塩基からなるものが好ま しく、 より好ましくは 15から 30個の塩基からなる。
これらプライマーを設計するに当たっては、 例えば 「PCR法最前線一基礎技術から応 用まで」 （タンパク質 ·核酸 ·酵素 臨時増刊号 1996年 共立出版株式会社） や 「バイ ォ実験イラストレイテッド 3本当に増える PCR :細胞工学別紙 目で見る実験ノートシ リーズ」 （中山広樹著 1996年 株式会社秀潤社）、 「PCRテクノロジ.一— DNA増幅の原理と 応用一」 （Henry A Erl ich編、 加藤邦之進監修 宝酒造株式会社） 等に基づいて設計す ればよいが、未加工品からの検出の場合には、 DNAが分解している可能性が少ないので、 700 塩基以内の増幅産物を得ることができるプライマーであってもよく、 加工食品から の検出の場合には、 DNAが分解して短くなつている可能性が考えられ、 このような観点 から 200塩基以内の増幅産物を得ることができるプライマーが高い感度を得ることがで きるという点から好ましい。
上述の観点から、 プライマー （C ) または （D ) は配列番号 1で表される塩基配列ま たはその相補鎖の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし得るプライマーであることが好ましい。 5. 8S rRNA遗伝子配列は、 ほぼ全域にわ たって植物間で相同性が高いため、 どこの領域にハイブリダイズするプライマーであつ ても使用することができるが、 配列番号 1は特に高い相同性を有する領域であるため、 前記プライマーが好ましい。 さらに好ましくは、配列番号 1の位置 1 1〜63の塩基配列ま たはその相補鎖の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし得るプライマーである。 このようなプライマー （C ) としては、 配列番号 2〜4 で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい （配列番号 1にハイブリダィズする）。 また、 このようなプライマ一 （D) としては、 配列番号 5〜 7で表されるオリゴヌクレオチド が好ましい （配列番号 1の相補鎖に八イブリダィズする）。 前記プライマーは、 標的とす る核酸分子と特異的にストリンジェントな条件下で八ィプリダイズすることが必要であ り、 またハイブリダィズしたプライマーがプライマーとして機能し、 伸長反応が起きる には 3'末端の塩基が標的とする DNA配列部分と相補的な塩基となっている必要がある。 従って、 このような要件を満たしていれば、 前記プライマーは、 配列番号 2〜 7で表さ れる塩基配列の 1個または数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列で表され るオリゴヌクレ才チドであってもよい。
ITS-1や ITS- 2配列中の、 特定植物属内で共通し、 かつ該属に特異的な塩基配列は、 検出対象である特定植物属および他の植物属の種々の植物の ITS-1〜5. 8S rRNA遺伝子〜 ITS - 2配列を GenBankから取得し、 ァライメントを行い、 該特定植物属に共通し、 かつ 該属に特異性の高い領域を探すことによって特定することができる。 さらに、 この特定 した領域の中から、 特に該特定植物属とその近縁種と考えられる植物との特異性が確保 できる塩基を 3'末端の塩基に設定して、 プライマー配列を選定することができる。
例えば、 特定植物属がソバ属の場合、 ソバ属の ITS- 1配列中の、 ソバ属内で共通し、 かつ該属に特異的な塩基配列としては、 市販ソバの大多数が Fagopyrum escu l en tum (普 通ソパ） であることや実際の市販ソバの配列が GenBankの Fagopyrum escu.l entum (普通 ソバ） 配列と合致したことにより、 F. escul entum の配列から選択すればよく、 具体的 には、 配列番号 8、 9または 1 0で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配 列を挙げることができる。好ましくは、配列番号 8の位置 1 1〜61の塩基配列またはその 相補鎖の塩基配列、配列番号 9の位置 11〜67の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列を 挙げることができる。 また、 配列番号 1 0は、 特にソバ属の一部である F. escul entum (普通ソバ）、 F. tatar icum (ダッタンソパ）、 F. homotrop icura、 F. cymosum を特異的 に検出したいプライマーを選ぶ領域として有用である。
ソバ属のプライマー （A) としては、 配列番号 1 1 ~ 1 6で表されるオリゴヌクレオ チドが好ましい （配列番号 1 1〜 1 4は配列番号 8の相補鎖に、 配列番号 1 5及び 1 6 は配列番号 9に、 それぞれストリンジェントな条件でハイブリダィズする）。 また、 前記 プライマ一は配列番号 1 1〜1 6で表される塩基配列の〗個または数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよい。 また、
ITS-2 配列中で、 ソバ属に共通し、 かつ該属に特異的な塩基配列としては、 配列番号 3
6または 3 7で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることがで きる。 これらは、 特にソバ属の一部である F. escu l entum (普通ソバ）、 F. tataricum (だ つたんソバ）、 F. homo t rop i cum, F. cymosumを特異的に検出したい際のプライマーを選 ぶ領域として有用である。 そして、 プライマーの組み合わせとしては、 配列番号 1 1〜 1 4のいずれかと、 配列番号 1 5、 1 6または配列番号 2〜4とのいずれかとの組み合 わせが好ましい。
特定植物属が落花生属の場合、 巿販落花生の大多数が Arachi s hypogaeaであるが、 実 際の市販落花生の配列が GenBankの A. corrent ina, A. vi 1 l osaの配列と合致したこと により、 落花生属の ITS- 1配列中の、 落花生属内で共通し、 かつ該属に特異的な塩基配 列としては、 A. v i l losaの配列から選択すればよく、 具体的には、 配列番号 1 7〜2 0 で表される塩基配列またはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。 好ましく は、配列番号 1 7の位置 11〜62の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号 1 8 の位置 11〜47の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、 配列番号 1 9の位置 1 1〜50の 塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号 2 0の位置 11〜58の塩基配列またはそ の相補鎖の塩基配列である。
落花生属のプライマー （A) としては、 配列番号 2 1〜3 1、 6 5および 6 6で表さ れるオリゴヌクレオチドが好ましい （配列番号 2 1 - 2 3は配列番号 1 7の相補鎖に、 配列番号 2 4および 2 5は配列番号 1 8の相補鎖に、 配列番号 3 0および 3 1は配列番 号 2 0の相補鎖に、 配列番号 2 6 ~ 2 9、 6 5および 6 6は配列番号 1 9に、 それぞれ ストリンジ工ン卜な条件でハイブリダィズする）。 また、 前記プライマーは、 上記のとお りそれぞれの相手側の配列とストリンジェン卜な条件でハイブリダィズするオリゴヌク レオチドであれば、 配列番号 2 1 ~ 3 1、 6 5および 6 6で表される塩基配列のうちの
1 個または数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列を有するものであっても よい。 また、 落花生属の ITS- 2配列中の、 落花生属内で共通し、 かつ該属に特異的な塩 基配列としては、 配列番号 3 8で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配列 を挙げることができる。好ましくは、配列番号 3 8の位置 11〜47の塩基配列またはその 相補鎖の塩基配列である。 さらに、 落花生属のプライマー （B ) としては、 配列番号 3
9で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい （配列番号 3 8にストリンジェン卜な条件 でハイブリダィズする）。 また、 前記プライマーは配列番号 3 9で表される塩基配列の 1 個または数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオ チドであってもよい。 そして、 プライマーの組み合わせとしては、 配列番号 2 1、 2 4 ― または 2 5と配列番号 2〜4のいずれかとの組み合わせ、 配列番号 2 1、 2 4または 2 5と配列番号 3 9との組み合わせ、 または配列番号 3 9と配列番号 5 ~ 7のいずれかと の組み合わせ、 または配列番号 2 1〜 2 3、 3 0および 3 1のいずれかと配列番号 2 6 〜2 9、 6 5および 6 6のいずれかとの組合わせが好ましいが、 配列番号 2 1、 2 4、 および 2 5のいずれかと配列番号 2〜4のいずれかとの組み合わせ、 または、 配列番号 2 1と配列番号 2 6、 6 5および 6 6のいずれかとの組合わせがより好ましい。
特定植物属が小麦属の場合、 小麦属の ITS- 2配列中の、 小麦属内で共通し、 かつ該属 に特異的な塩基配列として、 配列番号 4 0〜4 2で表される塩基配列あるいはそれらの 相補鎖の塩基配列を挙げることができる。好ましくは、配列番号 4 0の位置 1 1 ~50の塩 基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号 4 1の位置 1 1〜47の塩基配列またはその 相補鎖の塩基配列、配列番号 4 2の位置 11~47の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列 である。
小麦属のプライマ一 （B ) としては、 配列番号 4 3〜4 5で表されるオリゴヌクレオ チドが好ましい （配列番号 4 3は配列番号 4 0の相補鎖に、 配列番号 4 4は配列番号 4 1に、 配列番号 4 5は配列番号 4 2に、 それぞれストリンジェントな条件でハイブリダ ィズする）。 また、前記プライマーは配列番号 4 3〜4 5で表される塩基配列の 1個また は数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドで あってもよい。 そして、 プライマーの組み合わせとしては、 配列番号 4 3と配列番号 4 4および 4 5の 1個以上との組み合わせが好ましい。
特定植物属が大豆属の場合、 大豆属の ITS- 2配列中の、 大豆属内で共通し、 かつ該属 に特異的な塩基配列として、 配列番号 4 6、 4 7または 4 8で表される塩基配列あるい はそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。 好ましくは、 配列番号 4 6の位置 11〜48の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、 配列番号 4 7の位置 11〜55の塩基配 列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号 4 8の位置 11〜52の塩基配列またはその相補 鎖の塩基配列である。
大豆属のプライマー （B ) としては、 配列番号 4 9〜5 6で表されるオリゴヌクレオ チドが好ましい （配列番号 4 9は配列番号 4 6の相補鎖に、 配列番号 5 0〜 6 5は配列 番号 4 7に、 配列番号 5 6は配列番号 4 8に、 それぞれストリンジエンドな条件でハイ ブリダィズする）。 また、 前記プライマ一は配列番号 4 9〜5 6で表される塩基配列の 1 個または数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオ チドであってもよい。 そして、 プライマーの組み合わせとしては、 配列番号 49と配列 番号 5 0~5 6の 1個以上との組み合わせが好ましい。
これらプライマーの設計や、 設計したプライマ一の評価にあたっては、 PCR シミュレ ーシヨンを利用しても良い。
例えば、 ソバ属を検出するプライマーの設計においては、 食用ソパ （普通ソパ、 ダッ タンソバ）を含むソバ属の植物 21配列に共通かつ特異性の高い領域を ITS-1〜5.8S rRNA 遺伝子〜 ITS- 2配列部分から見出し、 さらに他の植物との特異性が確保できる塩基を 3' 末端の塩基に設定して配列を選定する。 ただし、 ソバ属の場合 ITS 1~5.8S rRNA遺伝子 -ITS-2配列部分においては、 種ごとに塩基の欠落部分や欠落塩基数に違いがあるため、 ソバ属の植物 21配列すベてから同じサイズの増幅産物を得るためには、さらに選別する 必要がある。 同じサイズの増幅産物を得ることができれば、 容易にソバ属の存在を検出 することができる。 ソバ属では、 特にプライマー （A) とプライマ一 （C)、 または 2 個のプライマー （A) を選定することによって、 ソバ属の植物 21配列すベてから同じサ ィズの増幅産物を得ることがシミュレーションで確認できる。 これにより、 サイズによ つて非特異産物との識別が容易にできるプライマ一を設計することができる。
本発明においては、 上記プライマ一を用いて、 PCR 法により検出対象である特定植物 属に属する植物を検出する。 または、 定量的 PCR法により該植物を定量する。
PCRに当たっては、 例えば Saiki M, et al., Science, 230： 1350-1354 (1985)や植物 細胞工学別冊、 植物の PCR実験プロトコ一ル、 島本功 ·佐々木卓治監修 （1995年） 等に 記載されている通常の方法に基づき、 変性、 アニーリング、 伸長の各ステップの温度と 時間、 酵素 （DNAポリメラーゼ） の種類と濃度、 dNTP濃度、 プライマー濃度、 塩化マグ ネシゥム濃度、 錶型 DNA量等の条件を適宜、 変更し最良のものを選択する。
また、 PCR増幅で使用するプライマ一とテンプレート DNAのアニーリング温度を、 HYB
Simulator ^ version 4.0 (Advanced Gene Computing Technologies, Inc. ) や Primer
Express 11 version 1.5 (Applied Biosysteras 社） 等の市販ソフトで算出した該プライ マ一の Tm値よりも高い温度、 好ましくは Tm値 + 10~ + 3°Cに設定して PCR増幅を行い、 次いでァニーリング温度を該プライマ一の Tm値近傍、 好ましくは Tm値 + 7〜土 0°Cの温 度に設定して PCR増幅を行うこともできる。 定量的 PCR法としては、 リアルタイム PCR法を用いる定量方法が好ましい。 リアル夕 ィム PCR法としては、 サイバーグリーン （SYBR Green) 法、 TaaMan (商標） プローブ法 などの蛍光プローブ（F luorogeni c probe)法、モレキュラービーコン（Mol ecu l ar Beacon) 法、 および L i ghtCyd er (商標） プローブ法などが挙げられるが、 これらに限定はされ ない。 種々の方法が最近精力的に開発されており、 当業者であれば、 任意の方法を実施 することができる。この場合のプローブの設計に当たっては、増幅標的配列に対する PCR プライマ一がハイプリダイズする部位の内側に、 ストリンジエンドな条件でハイブリダ ィズし得る配列から選択する。
特に、 上記の通り設計された特定植物特異的なプライマ一セットと、 5 '末端に発光色 素および 3 ' 末端に消光剤を有している、 増幅標的配列に対する PCRプライマーセッ卜 の各オリゴヌクレオチドがハイブリダィズする部位の内側に、 ストリンジェントな条件 でハィブリダイズするプローブとを用いて発光量に基づいて DNAを定量する方法であつ て、 該プローブの 5 ' 末端の発光色素は 3 '末端の消光剤によってその発光が抑制されて いるが、 PCR反応において Taq ポリメラーゼによってプライマ一から MAが伸長される と、 TaQ ポリメラーゼの 5'→3 'ェキソヌクレア一ゼ活性により上記プローブが分解され、 発光色素と消光剤とが解離して発光を生じることを特徴とする方法が好ましい。 また、 プローブ配列全体が上記 PCRプライマ一がハイプリダイズする部位の内側に存在する必 要はなく、 設計したプローブの 3'末端側の塩基とプローブがハイブリダィズする鎖の逆 鎖に設計したプライマーの 3'末端側の塩基とが 〜 10、または 〜 5塩基重複していても よい。 また、 プローブ配列は、 検出対象である特定植物属に共通な配列を有する部分か ら選択することがより好ましい。 上記プローブには、 Ta iManプローブ （商標） が好まし い。 TadMan プローブの設計方法は、 当技術分野では公知である （A卯 l i ed B i osys tems 社の Pr imerExpress ソフトウェア 簡易操作ガイ ド Pr imerExpress ソフトウェア
TaqMan プ ロ ー ブ 検 索 の た め の 簡 易 操 作 ガ イ ド ： Rev. C
( t tp : //www. app l i edbiosys tems. co. j /webs i t e/j /produc t/c 11 gpage. j sp?MODELCD=l
9775&PLCD=17689&BUCD=131 などを参照のこと）。 本明細書中においては、 所定の植物ま たは植物属の植物の定量的 PCRに用いることができるプロ一ブを、 所定の植物または植 物属の植物の 「検出用プローブ」 と称する。 即ち、 本明細書中、 検出用プローブとは、 各植物属に対する検出用プライマ一セットと組合わせて、 該プローブを用いることによ り、該植物属に属する植物を検出することができるプローブを指す。ここで、検出とは、 前述の通り定性および定量的検出の両方を包含し、 かかるプローブは、 定量的検出にも 有利であることは当然理解されるであろう。
該プローブに用いる発光色素としては、 FAM、 HEX, TETおよび FITCなどが知られてい るが、 これらに限定はされない。 また、 消光剤としては TAMRA、 Dabcylなど、 および非 蛍光性消光剤も知られているが、 やはり、 これらに限定はされない。
上記プローブの長さとしては、 13〜30塩基長が好ましく、 特に 13〜25塩基長が好ま しい。 また、短い塩基長でも Tm値が高く維持できるように、 3 '末端の消光剤にさらに、 MGB (Minor Groove Binden) を標識したプローブを使用することが、 より好ましい。 具 体的には、 ソバ属の場合のプローブとしては配列番号 6 4で表わされるオリゴヌクレオ チドを例示することができる。 落花生属のプローブとしては、 プライマーに配列番号 2 4と 2 5のいずれかと配列番号 2〜4のいずれかとを組み合わせる場合には配列番号 3 2または 3 3で表される塩基配列の相補鎖の塩基配列に、 ストリンジェントな条件でハ イブリダィズするオリゴヌクレオチドが好ましく、 また、 プライマーに配列番号 2 1〜 2 3のいずれかと配列番号 2 6 ~ 2 9、 6 5および 6 6のいずれかとを組み合わせる場 合には、 配列番号 3 4で表されるオリゴヌクレオチドを例示することができる。 さらに プライマーに配列番号 3 0、 3 1のいずれかと配列番号 2 6〜2 9のいずれかとを組み 合わせる場合には、 配列番号 3 4で表されるオリゴヌクレオチドに加え、 配列番号 3 5 で表される塩基配列あるいはその相補鎖の塩基配列にストリンジエンドな条件でハィブ リダィズするオリゴヌクレオチドが好ましい。 特に好ましい組合せは、 プライマーに配 列番号 2 1と配列番号 2 6、 6 5および 6 6のいずれかとを組合わせる場合には、 プロ ーブとしては配列番号 3 4で表されるオリゴヌクレオチドを用いることが良い。
かかるプローブは、 設計した配列のオリゴヌクレオチドを合成した後、 市販のキッ卜 を使用して作製することも可能であり、 またカスタムオーダーにて委託作製も可能であ り、 当技術分野では多数委託先が知られている （例えば、 Appl ied Bi osys tems 社 (ht tp//www. appl iedbiosys tems. co. j )なと 。
本発明の定量方法は、 検出 （特に定量） 対象である特定植物属由来の試料と標準植物 試料とを予め定めた比率で混合した補正用サンプルと、 被検対象とする食品または食品 原材料に既知量の標準植物試料を添加した被検サンプルとを用い、 これらのサンプルか ら同一の手法でゲノム DNAを抽出し、 同一の条件で定量的 PCR法を行うことにより、 補 正用サンプルについて標準植物由来 DNAのコピー数（Lo)ノ特定植物属由来 DNAのコピー 数（Fo)の値を補正標準値として求め、 被検サンプルについて特定植物属由来 DNAのコピ 一数 (Fs) /標準植物由来 DNAのコピー数（Ls)の値を求め、 これを上記補正標準値を用い て補正して、 食品または食品原材料 （1 g ) 中に含まれる特定植物属の植物の量 （ g ) を以下の式によって算出する。
特定植物属の植物の量 ppm ( d g/g) =Fs/Ls X Lo/Fo X l, 000, 000
したがって、該方法では、被検対象とする食品や食品原材料ごとの DNA抽出効率や PCR 反応の阻害等の影響、 さらには被検対象とする試料中の DNA含有量の違いに対しても補 正が可能である。 かかる方法によって、 例えば塩等の DNAを含有していない食品原材料 や当該原材料を含む食品中の特定植物属に属する植物を適切に定量検出することも可能 である。
さらに、 偽陽性か否かの判断をする必要がある場合には、 PCR終了後の反応液中に含 まれる PCR増幅産物の DNA配列を解析することにより、 厳密に調べることができる。 本 ¾明に用いる標準植物試料は、 種々の成分による DNA抽出効率への影響がなるべく 均質であることが望ましいことから、 検出対象である特定植物属に類似の状態のもので あることが好ましい。 また、 検査に供する食品または食品原材料中に混入する可能性の ない植物種に由来するものが好ましい。 また、 栽培過程で、 畑地雑草が食用作物に混入 する可能性を排除することが極めて困難であり、 微量の雑草由来の物質が食用作物中に 混入しているとの現状に鑑みて、 かかる畑地雑草として認知されている植物種以外の植 物種を標準植物試料とすることが好ましい。 すなわち、 標準植物試料の選定に当たって は、 食品または食品原材料に使用する植物が混入する恐れがなく、 かつ食品または食品 原材料中に混入する恐れがないものを選定する必要がある。
該畑地雑草としては、様々な畑地雑草が知られているが、主には、イネ科、 タケ亜科、 ガマ科、 カャッリグサ科、 キク科、 タデ科、 ツユクサ科、 トクサ科、 クヮ科、 スベリヒ ュ科、 ナデシコ科、 ァカザ科、 マメ科、 カタバミ科、 トウダイダサ科、 セリ科、 ヒルガ ォ科、 シソ科、 ォォバコ科、 ナス科、 ゥリ科などが挙げられる。 詳細には、 日本雑草学 会のホームページ等の記載を参照されたい。
また、 例えば市販されている種子等、 一度に大量に均一の材料を入手可能でき、 それ を保存しておけるものが、 標準植物試料としてさらに好ましい。
さらに、 標準植物試料は植物のいかなる組織 （種子、 葉、 根茎など） に由来するもの でもよいが、 検出対象がソバ、 小麦および落花生等の種子に由来するものであれば、 同 様の種子に由来するものであることが好ましい。 このような観点から言えば、 例えば、 すいか、 パパイヤ、 メロン等を食まない食品について検査する場合には、 皮や果肉によ り外界と隔離された果肉の中に数多くの種子が存在する、 すいか、 パパイヤ、 メロン等 の植物種が好ましい。 また、 種子が外界とは隔離されていなくとも、 食用作物として栽 培されていない植物種であれば好ましい。 このような条件を考慮すると、 本発明に用い る標準植物試料としては、 上記条件を満たすものであれば特に限定はされないが、 ネモ フイラ （ハゼリソゥ科）、 グロキシニア （イワタバコ科） およびスターチス由来のものが 挙げられ、 スターチス （イソマツ科） の種子が特に好ましい。
標準植物試料としては、 DNA抽出阻害活性または PCR反応阻害活性を有する成分の含 量が高いものは、 DM抽出効率、 ならびに定量的 PCR法の感度およびノまたは精度等の 観点から、 避けた方が好ましい。
本明細書中の実施例には、 標準植物試料としてスターチスの種子を用いた例を挙げて いる。 上述のように畑地雑草は食用作物に混入する恐れが高く、 標準植物試料としては 不適切で あ る ため、 畑地雑草 と して 日 本雑草学会のホーム ページ (ht tp//wss j . ac. af f rc. go. j p) に挙げられている 8 6 0種類の植物全部の科名を調べ、 その中にない科に属する植物としてスターチスが選択された。 スターチスの ITS- 1配列 を特異的に検出するプライマ一を用いて、 一般的な食品原材料である市販の小麦粉 5種 類、 コーングリッツ 5種類、 力ラシ 3種類についてスターチスの混入の有無を試験した が、 いずれにおいても全く検出されなかったことから、 スターチスは、 本発明における 標準植物試料として好適であると推定された。
尚、 スターチスの代わりに、 畑地雑草を数多く含むイネ科の中の米を標準植物試料と して用いることが好ましくないことを本発明者らは確認している。 これは、 畑地雑草で あるイネ科植物が原材料植物の収穫の際等に、 収穫物に混入するためであると考えられ る。
標準植物試料として選択した植物材料 （例えばスターチスの種子） を粉砕したものを 検出対象である特定植物属由来の試料として選択した植物 （例えばソバ） の粉砕物と予 ― め定めた比率で混合して補正用サンプルを用意する。 これとは別に、 上記と同様の標準 植物試料の粉碎物を被検対象である食品または食品原材料に添加して被検サンプルを調 製する。 なお、 上記粉砕工程においては、 他の食品原材料や、 特に検出対象とする特定 植物属由来の試料と標準植物試料とが、 お互いに混入しないように、 十分に配慮するこ とが重要であり、 粉碎に使用する器具等の洗浄等に万全を期すべきである。 なお、 上記 補正用および被検サンプルを調製するに当たっては、 補正用サンプル中の特定植物由来 の試料の量と被検サンプル中の食品または食品原材料の試料の量はほぼ同じ量とするこ とが好ましく、 また、 補正用サンプル中の標準植物試料の量と被検サンプル中の標準試 料由来の試料の量はほぼ同じ量とすることが好ましい。
次に、 これらサンプルから DNAを抽出する。 この DNAの抽出は、 種々の公知の方法に よって行うことができ、 市販のキットまたはプレパックカラムを用いることもできる。 例えば、 QIAGEN Genomi c MA Handbookや User-Deve l oped Protocol： Isol at i on of genomi c DNA f rom pl ants us ing the QIAGEN Genomi c- Upを参考にして、 QIAGEN社製の Genomi c- t i p を用いればよい。
そして、抽出された DNAを定量的 PCR法に供する。定量分析のための PCR技術は、種々 のものが公知であるが、 TaciManプローブ （登録商標） を用いるリアルタイム PCR定量法 が簡便かつ有利であろう。
標準植物試料の検出 （定量的検出も含む） 用のプライマーは、 標準植物試料の DNAに 特異的な増幅をもたらすプライマーであることが好ましい。 さらには、 検出対象である 特定植物属由来の試料と標準植物試料を予め定めた比率で混合した補正用サンプルから 抽出したゲノム DNAに対して定量的 PCR法を行った時の標準植物由来の DNAのコピー数 が、 特定植物属由来の DNAのコピー数とかけ離れておらず、 両者のコピー数の差が 100 倍以内、 好ましくは 10倍以内になるプライマーであることが、 前述の LoZFo比が安定 するため好ましい。
例えば、 スターチスを標準植物試料とする場合、 スターチスのプライマーは、 その ITS- 1配列の一部に由来する以下の配列：
5' -TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3' (配列番号 5 7 ) および
5' -CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3' (配列番号 5 8 )
からなるプライマーを用いることができ、 さらに、 スターチス検出用の TatiManプロ一ブ としては、 前述した如く、 増幅標的配列に対する PCKプライマーがハイブリダィズする 部位の内側にハイブリダィズするものであればよく、 例えば、 ITS-1 配列の一部に由来 する以下の配列：
5' -TGT GCG ACG CGG AAT G-3' (配列番号 5 9 )
を有するプローブに蛍光色素を標識して TatiManプローブとして用いることができる。 リアルタイム PCK定量法により、 補正用サンプルおよび被検サンプルの標準植物由来 の DNAのコピー数と検出対象の特定植物属由来の DNAのコピー数を、 検量線から算出す る。
この検量線の作製は、 当業者であれば種々の方法により容易に実施できる。 標準植物 試料および検出対象の特定植物属由来の試料についての定量的 PCR法による増幅標的配 列を含む既知の長さの MAをテンプレートとして用いて定量的 PCR法を実施して検量線 を作製することができる。
さらには、 標準植物試料および検出対象の特定植物属由来の試料についての定量的 PCR 法による増幅標的配列を含む検量線用のプラスミドを作製し、 これをテンプレー卜 に用いることにより、より再現性が高く、誤差の少ない検量線を作製することができる。 検出対象とする特定植物属由来の試料の増幅標的配列を含む DNAと、 標準植物試料の増 幅標的配列を含む DNAとを 1つのプラスミドベクタ一に挿入した検量線用プラスミドを 作製する。 該プラスミドを、 大腸菌等で増幅させることにより、 検量線用のテンプレー トを得ることができる。
例えば、 標準植物試料および検出対象の特定植物属由来の試料についての定量的 PCR 法による増幅標的配列を、 アウタープライマ一とブリッジプライマーを用いる Jayaraman K.らの方法 （1992. BioTechni dues 12 : 392-398) を用いて連結することがで きる。
1つのプラスミド中に標準植物試料および検出対象の特定植物属由来の試料について の増幅標的配列を含有させることにより、 希釈による両配列の濃度の誤差を低減させる ことができる。 また、 短いプラスミド DNA分子を用いることによつても、 希釈の誤差を 低減させ得る。
検量線用テンプレートは、 その塩基長が既知であるものを使うため、 重量濃度と塩基 長より検量線用テンプレート溶液中に含まれるコピー数が決定できる。 このコピ一数に 照らして、 被検サンプル中に含まれるコピー数を算定する。
こうした本発明の定量的 PCR検出法の考え方は、 検出対象である特定の原料が畜産製 品等の動物に由来するものである場合、 および特定の原料が微生物に由来するものであ る場合にも適用することは可能であり、 検出対象である特定の原料が畜産製品等の動物 に由来するものである場合は動物由来の原材料を標準試料とすることが好ましく、 特定 の原料が微生物に由来するものである場合は、 微生物由来の原材料を標準試料とするこ とが好ましい。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第 2003-139513号の明細書およ び/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 白花ソバについて PCRの感度を調べた結果である。 PCK後、 2 %ァガロー スゲル電気泳動およびェチジゥムブ口マイドで染色し、 蛍光イメージアナライザーで角军 祈した。
図 1 Bは、 ダッ夕ンソバについて PCRの感度を調べた結果である。 PCR後、 2 %ァガ ロースゲル電気泳動およびェチジゥムブ口マイドで染色し、 蛍光イメージアナライザー で解析した。
図 2は、 ソバ PCRの特異性を調べた結果である。 PCR後、 2 %ァガロースゲル電気泳 動およびェチジゥムブ口マイドで染色し、 蛍光イメージアナライザ一で解析した。
図 3は、 スターチス PCR の特異性を、 他の植物種子について調べた結果である。 PCE 後、 2 %ァガロースゲル電気泳動およびェチジゥムブロマイドで染色し、 蛍光イメージ アナライザ一で解析した。
図 4は、 スターチス PCRの特異性を、 種々の食品原材料について調べた結果である。 PCR後、 2 %ァガロースゲル電気泳動およびェチジゥムブロマイドで染色し、 蛍光ィメ —ジアナライザーで解析した。
図 5 Aは、 ソバ DNAの定量的 PCR法の結果である。 ソバ DNA 500pg、 小麦、 落花生、 ダイズ、 トウモロコシ、 力ラシ、 胡椒、 米はそれぞれ DNA 50ngについて定量的 PCR法を 行ったが、 ソバ以外では、 定量検出域では検出されず、 ソパのみが特異的に定量可能で あることを確認した。 図 5 Bは、 ソバ DNAの定量的 PCR法の結果である。 ソバは DNA 500pg、 ス夕一チス DNA 50ngについて定量的 PCR法を行ったが、 スターチスでは定量検出域では検出されないこ とを確認した。
図 6は、 ソバ DNAの定量的 PCR法の結果である。 ソパカズラ DNAについて定量的 PCR 法を行い、 ソバカズラは、 DNA 50ngをテンプレートにした場合においても、 検量線用プ ラスミ ド 10 コピーのテンプレートの場合に対して増幅速度が明らかに遅く、 かつ Threshold Lineにもかかることはなく、 定量検出域では検出されず、 ソバのみが特異的 に定量可能であることを確認した。
図 7は、 検量線用プラスミドを用いてソバ DNAの定量的 PCE法を行った結果である。 図 8は、 図 7の結果から得られたグラフである。
図 9は、 スターチス DNAの定量的 PCR法の結果である。 スターチスは DNA 500pgをテ ンプレ一トとして PCRを行った。 小麦、 落花生、 ダイズ、 トウモロコシ、 力ラシ、 胡椒、 米、 ソバカズラはそれぞれ DNA 50ngについて定量的 PCR法を行ったが、 定量検出域では 検出されず、 スターチスのみが特異的に定量可能であることを確認した。
図 1 0は、 検量線用プラスミドを用いてスターチス DNAの定量的 PCR法を行った結果 である。
図 1 1は、 図 1 0の結果から得られたグラフである。
図 1 2は、 落花生 PCRの特異性を、 種々の食品原材料について調べた結果である。 PCE 後、 2 %ァガロースゲル電気泳動およびェチジゥムブロマイドで染色し、 蛍光イメージ アナライザーで解析した。
図 1 3は、 落花生 DNAの定量的 PCR法の結果である。 落花生 DNA 500ig、 小麦、 ソバ、 ダイズ、 トウモロコシ、 リンゴ、 ァズキ、 ス夕一チスはそれぞれ DNA 50ngについて定量 的 PCR法を行ったが、 落花生以外では、 定量検出域では検出されず、 落花生のみが特異 的に定量可能であることを確認した。
図 1 4は、 落花生 MAを用いて落花生 DNAの定量的 PCK法を行った結果である。
図 1 5は、 図 1 4の結果から得られたグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 実施例
A. DNA抽出に用いた植物試料
(1) ソバの種子：
夕カノ株式会社より販売されている白花ソバ （普通ソバ Fagopyrum esculentum： 2倍 体）、 ダッタンソバ （Fagopyrmn ta ricum： 2倍体） の種子を用いた。
(2) 小麦、 落花生、 大豆、 とうもろこし、 力ラシ、 スターチスの種子と白胡椒、 米 （玄 米） ：
市販品を用いた。
(3) 小麦、 大豆、 とうもろこし、 力ラシ、 ソパカズラの葉：
市販品の種子から発芽させた葉を用いた。
B. DNA抽出
(1) ソバの種子、 白胡椒からの DNA抽出
QIAGEN Genomic DNA Handbookや User-Developed Protocol： Isolat ion of genomic DNA from plants using the QIAGEN Genomic- tipを参考にして、 QIAGEN社製の Genomic- tip を用い、 以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料 lgを 15ml容チューブに入れ、 4mlの Carlson Lysis バッファー (0.1M Tris-HCl ( H 9.5)、 2% CTAB、 1.4M Polyethylene Glycol #6000、 20mM EDTA)、 8^1 の RNase A (100mg/ml)、 10 Iの 2 -メルカプトエタノール、 80 1 のプロティナ ーゼ K (20mg/nil)) を加え、 混合した後、 74でで 20分間保温した。 室温に戻した後、 これに 5ralのフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール (25： 24： 1) を加え、 良く混合した後、 遠心分離により水層を回収した。 この水層に等量のクロ口ホルム：ィ ソァミルアルコール（24: 1)を加え、良く混合した後、遠心分離により水層を回収した。 再度、 この水層に等量のクロ口ホルム：イソアミルアルコール （24 : 1) を加え、 良く混 合した後、 遠心分離により水層を回収した。
得られた水層の 1 2量をとり、イソプロパノール沈殿により沈殿物を回収した。沈殿 物は 500 ^1 のバッファ一 QBT に溶解し、 予め lml のバッファ一 QBT で平衡化した
Genomic- tip 20/.Gに供して DNAをカラムに吸着させた。その後、 5mlのバッファ一 QBT、 続いて 2mlのバッファ一 QCでカラムを洗浄した。最終的に 1.7mlのバッファ一 QFで溶 出し、 イソプロパノール沈殿により回収した沈殿物を 40 1の滅菌超純水に溶解した。 溶液中の DNA濃度を測定し、 適宜滅菌超純水で希釈したものを PCRの錶型 DNA試料とし た。
(2) 小麦、 大豆、 とうもろこし、 力ラシ、 スターチスの種子と米 （玄米） からの DNA 抽出
DNeasy Plant Ma i Kit Handbookを参考にして、 QIAGEN社製の DNeasy Plant Maxi Kit を用い、 以下の方法で行った。
細かく粉碎した試料 2gを 50inl容チューブに入れ、 10ml のバッファー AP1、 20 1 の RNaseA (lOOmg/ l) を加えて混合し、 65でで 15分間保温した後、 約 3，000Xgで 10分 間遠心分離した。 得られた上清のうち 4ml を 15ml 容チューブに回収し、 そこに 1.8ml のバッファー AP2を加えて、 氷中で 10分間放置した後、 約 3， OOOXgで 10分間遠心分 離した。 得られた上清を QIAsiiredder Spin Columnに供し、 約 3, GOOXgで 5分間遠心分 離した。得られたパス液のうち 5mlを 50ml容チューブに回収し、そこに 7.5mlのバッフ ァ一 AP3ZEを加えて混合した後、 DNeasy Spin Columnに供し、 約 3, OOOXgで 5分間遠 心分離して DNAを Columnに吸着させた。 その後、 Columnに 12mlのバッファー AWを加 え、 約 3, OOOXgで 5分間遠心分離して Columnを洗浄、 再度 12mlのバッファー AWを加 え、 約 3, OOOXgで 10分間遠心分離して Columnを洗浄した。 最終的に 65°Cで予め保温 しておいた lmlのバッファー AEを Columnに加え、 10分間放置後に約 3， OOOXgで 5分 間遠心分離して Columnから DNAを溶出した。溶液中の DNA濃度を測定し、適宜滅菌超純 水で希釈したものを PCRの铸型 DNA試料とした。
(3) 落花生の種子からの DNA抽出：
QIAGEN Genomic DNA Handbookと NucleoSpin Extract 2 in 1 For Direct Purification of PCR Productsを参考にして、 QIAGEN社製の DNeasy Plant Maxi Ki tと MACHEREY- NAGEL 社製の NucleoSpin Extract 2 in 1を組合わせて用い、 以下の方法で行った。
細かく粉碎した試料 lgを 15ml容チューブに入れ、 10mlのバッファー G2、 100/ilの
Proteinase K (20mg/ml), 10 ^1の RNaseA (lOOmg/ral) を加え、 混合した後、 50でで
1時間保温した。 その後、 約 3, OOOXgで 10分間遠心分離し、 その上清液を得た。 得ら れた上清液を、予め 1mlのバッファー QBTで平衡化した Genomic- tip 20/Gに供して DNA を Columnに吸着させた。 その後、 4mlのバッファ一 QCで Columnを洗浄し、 予め 50^に 加温してある 1mlのバッファ一 QFで溶出させた。 溶出液に 4容量のバッファー NT2を加 えて混合した後、二本の NucleoSpin Extract Columnに一回に 650 1ずつ供し、約 6, 000 Xgで 1分間遠心分離して MAを Columnに吸着させた。 これを全液量処理するまで繰り 返した。 その後、 Columnに 600μΙのバッファー ΝΤ3を加え、 約 6, OOOXgで 1分間遠心 分離して Columnを洗浄、 再度 600^1 のバッファー NT3を加え、 最高速度で 1分間遠心 分離して、 Columnに残っているバッファー NT3を完全に除去した。最終的に 100 1のバ ッファー NEを Columnに加え、 最高速度で 1分間遠心分離して Columnから溶出し、 イソ プロパノ一ル沈澱により回収した沈澱物を 50^1の滅菌超純水に溶解した。溶液中の DNA 濃度を測定し、 適宜滅菌超純水で希釈したものを PCRの踌型 DNA試料とした。
(4) 小麦、 大豆、 とうもろこし、 力ラシ、 ソバカズラの葉からの DNA抽出：
DNeasy Plant Mini Kit Handbookを参考にして、 QIAGEN社製の DNeasy Plant Mini Kit を用い、 以下の方法で行なった。
細かく1粉砕した試料 0.5gを 15ml 容チューブに入れ、 3inl のバッファー AP1、 30 1 の RNase A (100mg/ml) を加え、 混合した後、 65°Cで 15分間保温した。 その後、 これ に 975 1のバッファ一 AP2を加えて、 氷中で 10分間放置し、 遠心分離によりその上清 液を得た。 得られた上清を QIAshredder Spin Column に供し、 遠心分離により Column のパス液を得た。 このパス液に 0.5容量のバッファー AP3、 1容量のエタノールを加え て混合した後、 二本の DNeasy Spin Columnに一回に 650 1ずつ供し、 約 6, OOOXgで 1 分間遠心分離して DNAを Co 1 umnに吸着させた。これを、全液量処理するまで繰り返した。 その後、 Columnに 500 1 のバッファー AWを加え、 約 6, OOOXgで 1分間遠心分離して Columnを洗浄、再度 500 1のバッファー AWを Columnに加え、最高速度で 1分間遠心分 離して、 Columnに残っているバッファー AWを完全に除去した。 最終的に 65°Cで予め保 温しておいた 120 1のバッファ一 AEを Columnに加え、 約 6, OOOXgで 1分間遠心分離 して Columnから溶出した。溶液中の DNA濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したもの を PCRの铸型 DNA試料とした。
C. ソバの ITS- 1〜5.8S rRNA遺伝子配列の一部を検出する PCR
( 1) ソバ属検出用プライマー：
プライマー配列には、ソバ属に属する植物の GenBankに登録されている以下の 21配列 中の ITS- 1〜5.8S rRNA遺伝子配列に共通な配列を用いた。
1: Fagopyrum urophyllum (AB000342) 2: Fagopyrum urophyl luni (AB000341)
3: Fagopyrum tataricum (subtspecies :potanini) (AB000340)
4: Fagopyrum tataricum (AB000339)
5: Fagopyrum statice (AB000338)
6: Fagopyrum statice (AB000337)
7: Fagopyrum pleioramosum (AB000336)
8: Fagopyrum lineare (AB000335)
9: Fagopyrum leptopodum (AB000334)
10: Fagopyrum homotro icum (AB000333)
11: Fagopyrum gracilipes (AB000332)
12: Fagopyrum esculentum ancestral is (AB000331)
13: Fagopyrum esculentum (AB000330)
14: Fagopyrum cymosum (AB000329)
15: Fagopyrum cymosum (AB000328)
16: Fagopyrum cymosum (AB000327)
17: Fagopyrum cymosum (AB000326)
18: Fagopyrum cymosum (AB000325)
19: Fagopyrum cymosum (AB000324)
20: Fagopyrum capillatura (AB000323)
21: Fagopyrum cal 1 iant um (AB000322)
そして、 下記配列のオリゴ DNAプライマー （株式会社 QIAGEN社製 0PC精製品） を合 成して、 ソバ ITS- 1〜5.8S rRNA遺伝子配列の一部を検出する PCR (以下、 ソバ PCRとす る） 用プライマーとして使用した。
5' -CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G—3' (配列番号 14)
5' -CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT一 3' (配列番号 1 5)
(2) ソバ属検出用プライマーの特異性 （PCRシミュレーション） ：
PCRシミュレーションソフト Amplify 1.0 (Bill Engels) により、 ソバ属に属する植 物の 21配列、 ソバ以外のアレルギーを起こす恐れのある植物の 8配列 （落花生、 小麦、 大豆、 クルミ、 松茸、 桃、 リンゴ、 オレンジ）、 食品原材料としてよく使われている植物 の 4配列 （とうもろこし、 米、 胡椒、 力ラシ）、 ソバ近縁種の植物の 27配列から、 ソバ 検出用プライマーで PCR増幅産物が得られるシミュレーション結果となるかを確認した。 ここでいぅソバ近縁種の植物とは、 GenBank に登録されている普通ソバ Fagopyrum escu lentumの塩基配列（AB000330)の ITS - 1配列部分を BLASTホモ口ジ一検索に供して、 Score 60 bi ts 以上となったソバ属以外の植物のことである。 今回は、 さらにその植物 が属する属の中で最も Scoreが高い値となった種の配列を、 その属の代表の配列として 選定した。なお、 PCRシミュレーションはそれら配列の ITS-1〜5. 8S rRNA遺伝子〜 ITS - 2 配列の領域に対して行った。 シミュレーションに用いた配列の GenBank Access ion Numberならびに、 シミュレーション結果を表 1A〜1Cに示す。 表 1A~ 1Cの省略文字、 記 号は以下に示す通りである ：
黒星印：標的サイズ付近 （± 10bp) の PCR増幅産物が得られると予想されたもの
W値： PCR増幅産物の得られる可能性
得られる可能性が高い… W6>W 5>W 4>W 3>W 2…得られる可能性が低い
数値 （bp) ： PCR増幅産物のサイズ （bp)
Ampl i fyで得られた値から 2を引いた値
一： PCR増幅産物なしと予想されたもの
表 1A
そば検出用プライマー (配列番号 14 & 配列番号 15) ：増幅産物
GenBank
学名
Accession W6 W5 W4 W3 W2 (一般名）
No.
Fagopyrum urophyllum AB000342 lOlbp 一 439bp
Fagopyrum urophyllum AB000341 IDlbp 一
- Fagopyrum tataricum
AB000340 lOlbp
(ダッタンそば） ―
Fagopyrum tataricum
AB000339 lOlbp
(ダッタンそば）
Fagopyrum statice AB000338 lOlbp ― ― —— ―
Fagopyrum statice AB000337 lOlbp ― ― ― ―
Fagopyrum pleioramosum AB000336 lOlbp ―
Fagopyrum Jineare AB000335 lOlbp ― ― ―
Fagopyrum leptopodum AB000334 lOlbp ― c Fagopyrum homotropicum AB000333 lOlbp _
そ
ば "k Fagopyrum gracilipes AB000332 lOlbp ―
)禺 Fagopyrum esculentum
AB000331 lOlbp — — ―
(普通そば）
Ά" Fagopyrum esculentum
AB000330 lOlbp
(普通そば）
Fagopyrum cymosum AB000329 lOlbp ― ― ― ― c Fagopyrum cymosum AB000328 lOlbp ―
-k Fagopyrum cymosum AB000327 lOlbp ―
"AT Fagopyrum cymosum AB000326 lOlbp
-k Fagopyrum cymosum AB000325 lOlbp
~k Fagopyrum cymosum AB000324 lOlbp
"k Fagopyrum capillatum AB000323 lOlbp
"k Fagopyrum callianthum AB000322 lOlbp 440bp
Figure imgf000032_0001
科外近デ以の夕表 1C
そば検出用プライマー （配列番号 14 &配列番号 ）：増幅産物
GenBank
学名
Accession W6 W5 W4 W3 W2 (一般名）
No.
Talinum paraguayense L78056
Bruinsmia stjrracoides AF396438
Talinella pachypoda L78054
JRehderodendron
AF396448
kwangtungense
Pterostyrax corymbosus AF396445
Anredera cordifolia L78086
Cistanthe quadnpetala L78062
Xenia vulcanensis L78060
Talinopsis frutescens L78058
Talinaria palmeri L78052
Portulaca sp. L78049
Phemeranthus
L78039
confertiHorus
Mbntiopsis umbellata L78033
Grah^mia bracteata L78028
Herniaria glabra AJ310965
Alluaudia dumosa L78011
Sinojackia xylocarpa AF396451
Halesia macgregori AF396442
Changiostyrax dolichocarpa AF396439
Alectryon subdentatus AF314765
Anacampseros recurvata L78014
Weinmannia racemosa AP485597
Bursera tecomaca AF080029 シミュレーションの結果、 表 1A〜1Cに示す通り、 ソバ属の 21配列からは標的とした l O lbpのサイズの PCR増幅産物が得られることが予想された。 また、 ソパ属以外のァレ ルギ一を起こす恐れのある植物の 8配列 （落花生、 小麦、 大豆、 クルミ、 松茸、 桃、 リ ンゴ、オレンジ）、食品原材料としてよく使われている植物の 4配列（とうもろこし、米、 胡椒、 力ラシ）、 ソバ近縁種の植物の 27配列からは、 標的サイズの PCR増幅産物ならび に非特異的な PCR増幅産物は得られないことが予想された。
(3) ソバ PCR：
QIAGEN社製の HotStarTaQ Master Mix Kitを用い、 以下の方法で行った。
12.5 z 1 の 2xHotStartTaq Master Mix (HotStar Taq DNA Polymerase, PCRバッフ ァー with 3mM MgClr 400 M each dNTP) に、 配列番号 1 4と配列番号 1 5のプライマ 一をそれぞれ終濃度で 0.5 Μずつ、 及び铸型 DNAを加え、 最終的に滅菌超純水で 25 1 とした反応用溶液を 0.2mlマイクロチューブに入れ、 Applied Biosystems社製のサ一マ ルサイクラ一 GeneA即 PCRSystem 9600により、 95t；， 15分 （酵素活性化） の後、 95で， 1分 （変性）、 66°C, 2分 （アニーリング）、 72°C, 1分 （伸長） のサイクルを 45回繰り 返した後、 TTC, 4分 （最終伸長） として反応させた。 得られた PCR反応液をェチジゥ ムブロマイド含有の 2%ァガロースゲル電気泳動に供して、 Amersham Biosciences株式 会社製の蛍光イメージアナライザー Fluorlmager 595により解析した。その結果を図 1A、 IBと図 2に示す。 図 1A、 IBと図 2の省略文字、 記号などは以下に示す通りである ： M ： lOObp DNA Ladder Marker
(一） ： 铸型 DNA未添加
数字 ： 添加した铸型 DNA量
矢印 ： 標的の PCR増幅産物のバンド （約 101bp)。
なお、 抽出した植物 DNA が PCR 増幅可能なレベルの純度であることは、 植物 chloroplast DNAの一部を増幅するプライマーにより、 PCR増幅産物が得られることで確 認した.（データ省略）。
(4) ソバ PCRの感度と特異性：
ソバ PCRの結果、 図 1A、 IBに示す通り、 白花ソバ（普通ソバ） とダッタンソバ DNA 500 〜50fgから標的としたソバ ITS - 1~5.8S rRNA遺伝子配列から予想される約 lOlbpのサ ィズの PCR増幅産物が得られた。 500〜50igのソバ DNAを検出できる感度とは、 ある試 料から抽出した DNA 50n を踌型として PCRを行った場合、 その試料 DNA中に含まれる 10〜lppmのソバ DNAを検出できるレベルの感度に相当する。
ソバ PCRの結果、 図 2に示す通り、 小麦の葉、 落花生の種子、 大豆の葉、 とうもろこ しの葉、 力ラシの葉、 白胡椒、 米 DNA50ngからは標的サイズの PCR増幅産物ならびに非 特異的な PCR増幅産物は得られなかった。 サケ精子 DNAからも同様に PCR増幅産物は得 られないことを確認した （データ省略）。 さらに、 図 2に示す通り、 ソバ近縁種の一つで あるソバカズラの葉 DNAについては、 50〜5ngでは非常に薄いながら標的サイズの PCR 増幅産物が得られたものの、 500pg以下では標的サイズの PCR増幅産物ならびに非特異 的な PCR増幅産物は得られなかった。 500pg以下のソバカズラ DNAを偽陽性で検出しな い特異性とは、 ある試料から抽出した DNA 50ngを铸型として PCR した塲合、 その試料 DNA中に 1 %以下のソバカズラ DNAが存在していたとしても、それが偽陽性として検出さ れないレベルの特異性に相当する。 また、 PCR条件を変更することで、 ソバカズラ DNA 50 〜5ngからも標的サイズの産物が得られなくなる可能性もある。
( 5 ) ソバ PCR増幅産物の塩基配列解析：
上記で得られた白花ソバ DNA由来の PCR増幅産物の塩基配列は、 配列番号 1 4と配列 番号 1 5のプライマーを用いた両鎖ダイレクトシークェンスにより解析した。 得られた 塩基配^を、 GenBank に登録されている普通ソバ Fagopyrum escul entum の塩基配列 (AB000330) と比較し、 白花ソバ DNA由来の PCR増幅産物の塩基配列は、 GenBankに登 録されている普通ソバ （Fagopyrum esculentum) の塩基配列 （AB000330) の標的とした 部分と 100%合致することを確認した。 このことから、 上記プライマーを用いた PCRによ り、ソバ ITS-1〜5. 8S rRNA遺伝子の一部の配列を増幅、検出していることが立証された。 以上の結果より、 上記プライマ一を用いたソパ PCRにより、 ソバ属に属する植物全般 の ITS-1〜5. SS rRNA遺伝子配列を、 高感度かつ、 特異的に検出できることが明らかとな つた。本プライマーを、ソパ ITS- 1〜5. 8S rRNA遺伝子配列のコピー数を定量する PCR (以 下、 ソバ配列の定量的 PCR法とする） に用いることとした。
D. スターチス ITS- 1配列の一部を検出する PCR (補正用）
次に、 補正に用いる標準植物試料の PCRによる検出について検討した。
本実施例においては、 日本雑草学会の畑地雑草のリス卜にはない種子植物であって、 種子の入手が容易であるスターチスを標準植物試料として用いた。
( 1 ) スターチス検出用プライマ一：
GenBankに登録されているスターチスの DNA配列 (AJ222860) を基に、 下記配列のス ターチス ITS-1配列の一部を検出する PCR (以下、 スターチス PCRとする） 用プライマ
—を設計し、 オリゴ DNAプライマー （株式会社 QIAGEN社製 0PC精製品） を合成した。
5' -TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC- 3' (配列番号 5 7 ) '5' - CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT- 3' (配列番号 5 8 )
( 2 ) スターチス PCR：
上記プライマーをそれぞれ終濃度で 0. 2 i Mずつ用いたこと以外は、基本的に上記実施 例 1 . C . ( 3 ) と同じ方法で行った。 その結果を図 3と図 4に示す。
なお、 抽出した植物 DNA が PCR 増幅可能なレベルの純度であることは、 植物 chl oropl as t DNAの一部を増幅するプライマーにより、 PCR増幅産物が得られることで確 認した （データ省略）。
( 3 ) スターチス PCRの特異性：
スターチス PCRの結果、 図 3に示す通り、 スターチスの種子 DNA 50ngから標的とした スターチス ITS-1配列から予想される約 lO lbpのサイズの PCR増幅産物が得られた。 ま た、 白花ソバ、 ダッ夕ンソバの種子、 小麦の種子、 落花生の種子、 大豆の種子、 とうも ろ.こしの種子、 力ラシの種子、 白胡椒、 米、 ソバカズラの葉 DNA 50ngからは標的サイズ の PCR増幅産物ならびに非特異的な PCR増幅産物は得られなかつ广：。 サケ精子 DNAから も同様に PCR増幅産物は得られないことを確認した （データ省略）。
したがって、 上記スターチス DNA検出用のプライマーは、 スターチス DNAに対する特 異性を有していると推測される。
( 4 ) 食品原材料へのスターチス混入の有無の評価：
次に、 スターチスが標準植物試料として適切であることを確認する。 すなわち、 食品 または食品原材料中に混入していないことを確認するため、 スターチス PCRを行った。 スターチス PCRの結果、 図 4に示す通り、 5種類の小麦粉、 5種類のコ一ングリッツ、 3種類の力ラシの種子 DNA 5 Ongからは標的サイズの PCR増幅産物ならびに非特異的な PCR 増幅産物は得られなかった。
( 5 ) スターチスへのソバ混入の有無の評価：
スターチスの種子の試料中に、 ソバが混入していないか否かを確認するために、 後述 の通りに確立したソバ配列の定量的 PCR法で確認した。ソバ配列の定量的 PCR法の結果、 ス夕一チ.スの種子 DNAからは増幅を示す蛍光シグナルの立上がりはみられず、 混入は認 められないことを確認した （データ省略）。
( 6 ) スターチス PCR増幅産物の塩基配列解析：
上記で得られたスターチス DNA由来の PCR増幅産物の塩基配列は、 配列番号 5 7と配 列番号 58のプライマーを用いた両鎖ダイレクトシ一クエンスにより解析した。 なお、 得られた塩基配列を、 GenBankに登録されているスターチス Limonium sinuatumの塩基 配列 （AJ222860) と比較し、 スターチス DNA由来の PCR増幅産物の塩基配列は、 GenBank に登録されているス夕一チス Limonium sinuatumの塩基配列 （AJ222860) の標的とした 部分と 100 合致することが確認された。 スターチス PCRにより、 標的とした、 スターチ ス ITS- 1の一部の配列を増幅、 検出していることが確認できた。 .
以上の結果より、 スターチスは、 食品原材料との相互混入がなく、 補正用の標準植物 試料として適切であることが示唆された。 そこで、 配列番号 5 7と配列番号 5 8のブラ イマ一を、 スターチス ITS- 1配列のコピ一数を定量する PCR (以下、 ス夕一チス配列の 定量的 PCR法とする） に用いることとした。
E. 定量解析に用いる検量線用プラスミドの作製
( 1 ) ソバとスターチス PCRの標的 DNA配列の連結 PCRと連結 PCR増幅産物の塩基配列 解析：
ソバ標的増幅産物とスターチス標的増幅産物を PCR法により連結し、 TA クロ一ニング ベクタ一に導入して大腸菌に形質転換して増幅させることにより、 ソバとスターチスの コピー数を定量解析するための検量線用プラスミドを作製した。
まず、 下記配列のオリゴ DNAプライマ一 （株式会社 QIAGEN社製 0PC精製品） を合成 してプライマ一として使用した。 これらのプライマーは、 上述のソバとスターチス PCR に用いたソバぉよびスターチスのプライマ一部位を含んでいる。
5'一 TCT AGA CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G-3' (配列番号 6 0)
5' - CAA AAG CTT CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT— 3' (配列番号 6 1 )
5' -ACG AAG CTT TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3' (配列番号 6 2) .
5' - GGA TCC CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT -3' (配列番号 6 3)。
Jayaraman K ら (1992. A PCR - Mediated Gene Synthesis Strategy Involving the
Assembly of Oligonucleotides Representing Only One of the Strands. BioTechniques
12: 392-398) の方法を参考にして、 QIAGE 社製の HotStarTaq Master Mix Kit を用い て以下の方法により、 連結プラスミドを作製した。
25 / 1 の 2XHotStartTaQ Master Mix (HotStar Taa DNA Polymerase, 3mM MgCl2含有
PCRバッファ一、 400 M各 dNTP)に、さらに dNTPを終濃度で 500 Mとなるように加え、 配列番号 6 0と配列番号 6 3をァウタ一プライマ一としてそれぞれ終濃度で 1. O M ず つ、 配列番号 6 1と配列番号 6 2をブリッジプライマ一としてそれぞれ終濃度で 25nM ずつ加え、 さらに、 铸型 DNAとして実施例 1. C. (4) で得られたソバ PCRの標的 DNA 配列を持つ PCR増幅産物と実施例 1. D. (3) で得られたスターチス PCR の標的 DNA 配列を持つ PCR増幅産物を加え、最終的に滅菌超純水で とした反応用溶液を 0.2ml マイクロチューブに入れ、 MJ Research 社製のサーマルサイクラ一 PTC-200 DNA Engine により、 95で， 15分 （酵素活性化） の後、 95で， 1分 （変性）、 40 ， 1分 （ァニーリン グ）、 n° , 1分 (伸長) のサイクルを 15回繰り返し、 さらに 95で， 1分 （変性）、 66°C, 1分 （アニーリング）、 n°C, 1分 （伸長） のサイクルを 30回繰り返して反応させた。 得 られた PCR反応液をェチジゥムブロマイド含有の 2 %ァガロースゲル電気泳動に供して、 アマシャムバイオサイエンス株式会社製の蛍光イメージアナライザ一 Fluorlmager 595 により解析した。 なお、 得られた PCR増幅産物の塩基配列は、 配列番号 6 0と配列番号 6 3のプライマーを用いた両鎖ダイレクトシークェンスにより解析した。
連結 PCRの結果、 予想された約 220bpの PCR増幅産物が得られた （データ省略）。 塩基 配列解析の結果、 この PCR増幅産物には、 ソパとス夕一チス PCRの標的 DNA配列とが含 まれていることが確認できた （データ省略）。
(2) 連結 PCR増幅産物のプラスミドへの導入と導入 DNA断片の塩基配列解析： 上記で得られた PCR増幅産物を、 pGEM-T Easy Vector System (Promega社製） を用い て pGEM-T Easy Vectorに TA cloningし、 大腸菌 （E. coli JM109 (DH5ひ）） に形質転 換した。 コロニー PCRならびに塩基配列解析によりソバとスターチス PCRの標的 DNA配 列が含まれていることが確認できた約 22013Pの導入断片を持つ形質転換体を LB培地で液 体培養して、 菌体から QIAGEN社製の QIAGEN Hi Speed Plasmid Midi Kitを用いてプラ スミドを抽出、 精製した。 なお、 精製したプラスミドに導入された DNA断片の塩基配列 は、 プラスミド上にある配列のプライマ一を用いた両鎖シークェンスにより解析した結 果、 意図した通り、 形質転換体のプラスミドに導入された DNA断片の塩基配列には、 ソ バとスターチス PCRの標的 DNA配列が含まれていることが確認できた （データ省略）。
(3) 検量線用プラスミドの希釈系列の調製：
プラスミドの長さと、 上記で抽出、精製したプラスミドの吸光値 （Abs. 260nm) から、 プラスミドの分子数（コピー数）を計算した。 5ng/ lのサケ精子 DNA (和光純薬社製 デ ォキシリボ核酸ナトリウム サケ精巣製 繊維状を滅菌超純水に溶解したもの） でプラス ミドを希釈して、 〜 1コピー /2.5 1 の検量線用プラスミド希釈系列を作製した。 これを、 ソバとスターチス配列の定量的 PCR法の検量線作成に用いることとした。
F. ソパ配列のコピー数を定量する PCR
( 1 ) ソバ配列の検出用 TaqMan MGBプローブ：
下記配列の TaqMan MGBプローブ （Applied Biosystems Japan株式会社製 リポーター 色素 FAM) を合成して、 ソバ配列の検出用プローブとして使用した。 なお、 プローブ配 列には、 ソバ属に属する植物の ITS-1〜5.8S rRNA遺伝子配列として GenBankに登録され ている 21配列に共通な配列を用いた。
5' -CGG GAC GCG CTT C一 3' (配列番号 64)
(2) ソバ配列の定量的 PCR法：
QIAGEN社製の QuantiTect Probe PCR Kitを用い、 以下の方法で行った。
12.5 1 の 2xQuantiTect Probe PCR Master Mixに、 配列番号 14と配列番号 1 5の プライマ一を終濃度でそれぞれ 0.2 Μずっと、 配列番号 64の TaQMan MGBプロ一ブを 終濃度で 0.2wM、 及び錶型 MAを加え、 最終的に滅菌超純水で 25^1 とした溶液を 96 穴 PCEプレートに分注した。 なお、 検量線用としては、 錶型 DNAの代わりに、 検量線用 プラスミド DNAの希釈系列を加えた溶液を分注した。 分注した 96穴 PCRプレートを、
Applied Biosystems社製の Real Time PCR装置 Sequence Detection System 7700にセ ッ卜し、 50で， 2分、 95 ， 15分の後、 95°C, 1分 （変性）、 66°C, 2分 （アニーリング）、
Ώ , 1分 （伸長） のサイクルを 45回繰り返して反応させた。 反応は全て同一試料を 2 ゥエル並行で行なった。 反応終了後、 伸長ステップにおける蛍光デ一夕を解析した。 な お、 ベースラインは、 始めに 0-1サイクルに設定して蛍光の立ち上がりの始まるサイク ルを確認して、 そのサイクルよりも前の範囲で適宜設定した。 また、 閾値ライン
(Threshold Line) の設定は、 Kuribara H et al. 2002. Novel Reference Molecules for
Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean. Journal of A0AC
International 85: 1077-1089 に記載の方法に従って行なった。 その結果を図 5 Aおよ び B、 図 6、 図 7と図 8に示す。
なお、 抽出した植物 DNAが PCR増幅可能なレベルの純度であることは、 植物クロロプ ラスト DNAの一部を増幅するプライマーにより、 PCR増幅産物が得られることで確認し た （データ省略）。
( 3 ) ソバ配列の定量的 PCR法の特異性：
ソバ配列の定量的 PCR法の結果、 図 5 Aおよび Bに示す通り、 白花ソバの種子 DNAか ら増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりが確認された。一方、小麦の葉、落花生の種子、 大豆の葉、 とうもろこしの葉、 力ラシの葉、 白胡椒、 米、 スターチスの種子 DNA 50ng からは増幅を示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。 サケ精子 DNAからも増 幅を示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。 （データ省略） なお、 図 6に示す 通り、 ソバカズラの葉 DNA 50ngで増幅シグナルの立ち上がりはみられたものの、 その立 ち上がりは検量線の lOcopyよりも遅い立ち上がりサイクル数 （Ct値）、 かつ Threshol d L ineにかからなかった。
この特異性は、 ある試料にスターチスを添加したものから抽出した DNA 50ngを铸型と して PCRを行った場合、 その試料が 100%食用ではない雑草の一種のソパカズラ （ソバ近 縁種） であったとしても、 それが偽陽性として定量されないレベルに相当する。
( 4 ) ソバ配列の定量的 PCR法の定量性と感度：
ソバ配列の定量的 PCR法の結果、 図 7と図 8に示す通り、 ΙΟ8^ ^)1コピーの検量線用 プラスミドで、相関係数 0. 999、かつ傾き一 3. 504の検量線を引くことができる定量性と 感度を確認できた。 また、 白花ソバ MA 50igからも増幅を示す蛍光シグナルの立ち上が りがみられる感度を確認でき、 さらには白花ソパ DNA 5ng〜50fgの Ct値をプロットする と、この範囲でも相関のある直線を引くことができる定量性を確認できた（データ省略）。 以上の結果より、 配列番号 1 4と配列番号 1 5のプライマ一、 配列番号 6 4のプロ一 ブを用いたソバ配列の定量的 PCR 法により、 ソバ属に属する植物全般の ITS- 1~ 5. 8S rRNA遺伝子配列を高感度かつ特異的に検出し、 そのコピー数を定量できることが明らか となった。 本ソバ配列の定量的 PCR法と次に示す補正用のスターチス配列の定量的 PCR 法と組合わせて、 ソバの混入量測定に用いることとした。
G . スターチス配列のコピー数を定量する PCR
( 1 ) スターチス配列の検出用 TaQMan MGBプローブ：
下記配列の TadMan MGBプローブ （Appl ied B iosys tems Japan株式会社製 リポ一夕
—色素 FAM) を合成して、 スターチス配列の検出用プローブとして使用した。
5' - TGT GCG ACG CGG AAT G- 3' (配列番号 5 9 ) ( 2 ) スターチス配列の定量的 PCR法と解析：
配列番号 5 7と配列番号 5 8のプライマ一をそれぞれ終濃度で 0. 2 ¾1 ずつ用いたこ と、 配列番号 5 9の TaQMan MGBプローブを終濃度で 0. 2 用いたこと以外は、 基本的 に実施例 1 . の F. ( 2 ) と同じ方法で行なった。 その結果を図 9、 図 1 0と図 1 1に示 す。
( 3 ) スターチス配列の定量的 PCR法の特異性：
スターチス配列の定量的 PCR法の結果、 図 9に示す通り、 スターチスの種子 DNAから 増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりがみられた。 一方、 白花ソバとダッタンソパの種 子、 小麦の種子、 落花生の種子、 大豆の種子、 とうもろこしの種子、 力ラシの種子、 白 胡椒、 米、 ソバカズラの葉 DNA 50ngからは増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりがみら れなかった。 サケ精子 DNAからも増幅を示す蛍光シグナルの立上がりはみられなかった (データ省略）。
( 4 ) スターチス配列の定量的 PCR法の定量性：
スターチス配列の定量的 PCE法の結果、 図 1 0と図 1 1に示す通り、 8〜^1コピー の検量線用プラスミドで、相関係数 0. 999、かつ傾き一 3. 386の検量線を引くことができ る定量性を確認できた。
以上の結果より、 配列番号 5 7と配列番号 5 8のプライマー、 配列番号 5 9のプロ一 ブを用いたス夕一チス配列の定量的 PCR法により、 スターチスの ITS-1配列を特異的に 検出し、 そのコピー数を定量できることが明らかとなった。 補正用の本スターチス配列 の定量的 PCR法と実施例 1 . F . に示したソバ配列の定量的 PCR法と組合わせて、 ソバ の混入量測定に用いることとした。
実施例 2
A . 標準としたスターチスと、 各種ソバ粉、 擬似混入試料の作製に用いたソバ、 米、 小 a
( 1 ) スターチス：
サカ夕のタネより販売されている切花用ェキセレントライ卜ブルー (単一ロット品） を用いた。
( 2 ) ソパ：
夕カノ株式会社より販売されている白花ソバ （普通ソバ Fagopyrum escu l entum： 2倍 体） のソバ粉、 ダッタンソバ （F. tataricuin： 2 倍体） のソバ粉、 高嶺ルビー （F. esculentum： 2倍体） のソバ粉、 グレートルビー （F. escukntum： 4倍体） のソバ粉を 用いた。 なお、 擬似混入試料の作製には、 白花ソバ粉を用いた。
( 3 ) 小麦：
市販の農林 61号を用いた。
(4) 米：
市販の秋田小町の無農薬玄米を用いた。
B. 標準としたスターチスと、 擬似混入試料の作製に用いた米、 小麦の粉砕と DNA抽出
( 1 ) 粉砕：
粉碎は、 Eetscli社製の超遠心粉碎機 Ultra Centrifugal Mill ZM1 にロータ （ステン レス鋼製 24本刃） とスクリーン （ステンレス鋼製 0· 20MI) をセットして行った。
(2) 粉砕機の洗浄：
試料の粉碎前と後に、粉砕機の試料受け皿、 試料蓋、 ロー夕、 スクリーン、 とめ具類、 治具などの部品は、 水洗浄、 10%ブリーチ溶液に浸漬、 水洗浄、 乾燥して使用した。 粉碎 機の本体部分は、 エアガン洗浄、 拭き掃除して使用した。
(3) 粉砕機にソバとスターチス汚染がないことの確認：
大量粉砕前に、 その試料の一部、 あるいはソバゃスターチスの混入が無い市販の皮付 きとうもろこしを凍結乾燥したものを粉砕して、そこから DNAを抽出し、実施例 1. F. と G. に記載のソバ配列やスターチス配列の定量的 PCR法で、 50ngの铸型 DNAから増幅 の立ち上がりを示す蛍光シグナルの有無を確認した。 蛍光シグナルがなかった場合には 汚染がないと判断して、 以下の大量粉砕に進んだ。 蛍光シグナルがあった場合には汚染 があると判断して、 粉碎機を再度洗浄し、 ソバゃスターチスの混入が無いことを確認済 みの玄米 （1kg) を当該粉砕機で粉砕した後、 洗浄するとともに新品スクリーンに交換を 行つた後、 再度上記ソバゃスターチスの混入が無い市販の皮付きとうもろこしを凍結乾 燥したものを粉碎し、 同様の方法で蛍光シグナルの有無を確認し、 粉砕機にソバとス夕 一チスの汚染がないと判断できた上で、 以下の大量粉碎に進んだ。
(4) スターチスの大量粉碎と、 その粉碎物にソパの混入がないことの確認：
ソバの汚染が無いことを確認した粉砕機で、 約 lkgのスターチスを粉砕した。 粉砕物 から 2gずつ 10点サンプリングして、 実施例 1. B. (2) に記載の方法で DNeasyPlant Maxi K により DNAを抽出し、 ソバ配列の定量的 PCR法で、 50ngの
铸型 DNAから増幅の立ち上がりを示す蛍光シグナルがないことを確認した（デー夕省略） , これにより、 ソバの混入がない、 スターチスの粉碎物を確保した。
(5) 米、 小麦の大量粉砕と、 それらの粉砕物にソバとスターチスの汚染がないことの ソバとスターチスの汚染が無いことを確認した粉碎機で、 約 500gの米を粉砕した。粉 碎物から 2gずつ 5点サンプリングして、実施例 1 - B. (2)に記載の方法で DNeasyPlant Maxi Kitにより DNAを抽出し、 ソバ配列とスターチス配列の定量的 PCR法で、 50ngの錶 型 DMから増幅の立ち上がりを示す蛍光シグナルがないことを確認した （データ省略）。 小麦も同様にして行った。 これにより、 ソバとスターチスの混入がない、 米、 小麦の粉 碎物を確保した。
C. 擬似混入試料の作製
(1) ソバ粉 Z米の粉砕物の擬似混入試料：
静防 0P [特殊静防処理] PZタイプ （三方チャック袋） の号数 No.6 (福助工業株式会 社） に、 米の粉砕物 45. OOgをはかり込んだものを 6個準備して、 No. 1〜6の番号を付 けた。 ソバ粉 5. OOgを No. 1の袋にはかり込み、 袋の口を閉じて手で】 5分間混合して、 10%のソバ粉を含む米の粉碎物を得た。 続いて、 この 10¾ (100, OOOppm) のソバ粉を含む 米の粉砕物 5. OOgを No. 2の袋にはかり込み、 袋の口を閉じて手で 15分間混合して、 1% (10, OOOppm)のソバ粉を含む米の粉砕物を得た。この希釈、混合操作を繰り返し、 100, 000 ~1ρρπιのソバ粉を含む米の粉砕物を作製した。
(2) ソバ粉 Ζ小麦の粉碎物の擬似混入試料：
同様にして、 100, 000〜lppmのソバ粉を含む小麦の粉碎物を作製した。
(3) ソバ粉 Z米と小麦の粉砕物の擬似混入試料：
静防 0Ρ [特殊静防処理] ΡΖタイプ （三方チャック袋） の号数 No.5 (福助工業株式会 社） に、 lOppmのソバ粉を含む米の粉砕物 12.5gと lOppmのソパ粉を含む小麦の粉碎物 12.5g をはかり込み、 袋の口を閉じて手で 15分間混合して、 lOppmのソバ粉を含む米と 小麦の粉砕物を作製した。
P. DNA抽出時の擬似混入試料サンプリングスケールの決定
(1) 白花ソバ粉の粒度分布測定： 3 ソバ粉を球と仮定した時の粒径を求めるため、 白花ソバ粉の粒度分布測定 （レーザー 回折 ·散乱法 ·乾式、 圧力 0. 5kg/cm2の条件） を行なった。 測定は、 粉株式会社セイシ ン企業の粉体測定技術センターに依頼した。 結果、 白花ソバ粉の累積 50%の粒径 （X50) は 80. 941 mとなった。
( 2 ) 白花ソバ粉のカザ密度測定：
ソパ粉の密度 (粉の内部にある空壁を含めた密度) を求めるため、 白花ソバ粉のカサ 密度測定 （Hg法 ·一定体積のセルにソバ粉を入れた後に水銀でセルを満たす方法） を行 つた。 測定は、 粉株式会社セイシン企業の粉体測定技術センターに依頼した。 結果、 白 花ソバ粉のカサ密度 （水銀法） は 1. 181 gZcm3となった。
ソバ粉の占める体積 = (セルの体積） 一 （入れた水銀の体積）
ソバ粉のカサ密度 （水銀法） = (入れたソバ粉の重量） ノ （ソバ粉の占める体積）
( 3 ) 擬似混入試料中のソバ粉粒数の試算とサンプリングスケールの決定：
白花ソパ粉の粒径 80. 941 mと密度 L 181 gZcm3の測定値から、 ソバ粉一粒あたりの 重さを計算し、種々のソバ粉濃度の擬似混入試料中に存在するソバ粉の粒数を試算した。 結果を表 2に示す。 今回、 定量の目標とした混入量 l Oppmのソバを含む擬似混入試料か ら MA抽出のための試料をサンプリングする場合、 サンプリングした試料の中に最低で も 100粒程度のソバ粉が入る様にしょうとすると、サンプリング量は 4g以上必要という ことがわかった。 DNA抽出には 5gサンプリングすることとした。
表 2 擬似混入試料中の白花そば粉の粒子数 擬似混入試料中の 擬似混入試料を Ngサンプリングした時の 白花そば粉濃度 白花そば粉の粒子数 （そば粉一粒 0.3277 gで計算）
(ppm: g/g) N(g)= 2 4 5
1,000,000 ppm 3,051,167 12,204,669 15,255,836
100,000 ppm 305,117 1,220,467 1,525,584
10,000 ppm 30,512 122,047 152,558
1,000 ppm 3,051 12,205 15,256
100 ppm 305 1,220 1,526
10 ppm 31 122 153
1 ppm 3 12 15
100粒以上 E. 100%ソバ粉 +スターチス標準、 擬似混入試料 +スターチス標準からの DNA抽出
(1) 各種ソバ粉試料：
白花ソバ粉を 6点、 高値ルビーソバ粉、 グレートルビーソバ粉、 ダッタンソバ粉をそ れぞれ 3点サンプリングして醒抽出に用いた。
(2) 擬似混入試料：
lOOppm白花ソパ粉/小麦の粉碎物、 lOppm白花ソバ粉 Z小麦の粉砕物、 lOppm白花ソ バ粉/米の粉砕物、 lOppm白花ソパ粉/小麦と米の粉碎物をそれぞれ 3点サンプリング して、 DNA抽出に用いた。
(3) DNA抽出；
QIAGEN Genomic DNA Handbookや User-Developed Protocol： Isolation of genomic DNA from plants using the QIAGEN Genomic-ti を参考にして、 QIAGEN社製の Genomic- tip を用い、 以下の方法で行った。
試料 5gとスターチス粉碎物 lgを 50ml容チューブに入れ、 30mlの Carlson Lysis バ ッファー (0.1M Tris-HCl ( H 9.5), 2% CTAB、 1.4M Polyethylene Glycol #6000、 20mM EDTA)、 の RNase A (100mg/ml)、 75 1の 2-メルカプ卜ェタノール、 600 1のプ ロティナーゼ K ( nigZml) を加え、 さらに試料の分散性を高めるためにジルコ二アポ ール （株式会社ニツカト一社製 YTZポール Φ7匪） 3つを入れてシェーカー （イワキ産 業株式会社製 KM Shaker V-DX) で 10分間以上ダマが無くなるまで混合 （SPEED 100) し た後、 74でで 20分間保温した。 なお、 保温中は 5分おきにチューブを手で振って混合し た。
3， OOOXgで 10分間遠心分離した後、 15ml容チューブに上清を 4ml とり、 5mlのフエ ノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコ一ル （25 : 24: 1) を加えて良く混合した。 こ れを、 3, OOOXgで 10分間遠心分離した後、 15ml容チューブに上清（水層）をとり、 3.5ml のクロ口ホルム：イソアミルアルコール（24： 1) を加えて良く混合した。 これを、 3, 000
Xgで 10分間遠心分離した後、 15ml容チューブに上清 （水層） をとり、 再度クロ口ホル ム ：イソアミルアルコール （24 : 1) 抽出と遠心分離を行い、 上清 (水層) を回収した。 上清 （水層） のうちの からイソプロパノール沈殿により回収した沈殿物を 100/i
1の滅菌超純水に溶解した後、 のバッファー QBTを加えたものを、 予め 1mlのバ ッファー QBTで平衡化した Genomic-tip 20/Gに供して DNAをカラムに吸着させた。 そ の後、 4m】のバッファー QCでカラムを洗浄した。 最終的に 1m lのバッファ一 QFで DNA 溶出し、ィソプロパノール沈殿により回収した沈殿物を 40 1の滅菌超純水に溶解した。 溶液中の DNA濃度を測定し、 適宜滅菌超純水で希釈したものを PCRの鐯型 DNA試料とし た。
F . スターチス標準を添加した 1 00¾ソバ粉から抽出した DNA中の「スターチス配列のコ ピー数 ソバ配列のコピー数比」の算出
ソバ配列とスターチス配列の定量的 PCR法は、 実施例 1 . の F . と G . に記載の方法 で行なった。 検量線をもとに、 スターチス標準を添加した 100%ソバ粉から抽出した DNA 50ng中のソバ配列のコピー数と、 スターチス配列のコピ一数を定量した。 その定量値を もとに、 「スターチス配列のコピー数 ソバ配列のコピ一数 =Lo/Fo比」を算出した。 な お、 各ソバ粉の Lo/Fo比は、 同一サンプルを 2ゥエル並行で測定し、 測定を二回繰り返 して得られた比を平均して算出した。
LoZFo比測定の結果、 表 3に示す通り、 白花ソバ粉 2. 36 ( 6点抽出、 各点 2ゥエル測 定、 測定 2回）、 高嶺ルビ一ソバ粉 3. 25、 グレートルビ一ソバ粉 2. 70、 ダッタンソバ粉 4. 75 ( 3点抽出、 各点 2ゥエル測定、 測定 2回） となった。 ここで得られた白花ソバ粉 の LoZFo比と、 実施例 2 . G . で算出した擬似混入試料の「ソパ配列のコピー数 Zス夕 ーチス配列のコピー数 = Fs/Ls 比」を用いて、 ソバの混入量を求めることとした。 な お、 各種ソパ粉の Lo/Fo比を測定した時の生データを « 4Αと表 4Bに示す。
4 006913 表 3 各種そば粉の Lo/Fo比
Lo I Fo Lo I Fo Lo I Fo
51¾料名 1回目測定 2回目測定 1回目と 2回目測定の 測定値 平均 測定値 平均 平均
Mo. 2.23 2.24
No. 2 2.38 2.44
白花そば粉 Έ . 3 2.12 2.11
2.37 2.36 2.36
100% No. 4 2.84 2.70
No. 5 2.12 2.11
No. 6 2.50 2.56
No. 4.33 4.06
ダッタンそば粉
No. 2 5.42 4.82 5.27 4.69 4.75 100%
No. 3 4.70 4.72
No. 1 3.40 3.66
高嶺ルビ一そば粉
No. 2 2.58 3.20 2.40 3.30 3.25 100%
No. 3 3.61 3.85
No. 2.39 2.38
グレートルビ一そば粉
No. 2 2.92 2.67 2.92 2.72 2.70 100%
No. 3 2.72 2.87
表 4A 各種そば粉の Lo/Fo比測定の生デ- -タ （1回目測定）
各種そば粉の測定の生データ（ 1回目）
Fagopyrum：そぱ配列コピー数の定量 PCR Limonium： ：スターチス配列コピー数の定量 PCR サンプルインフォメーション（そば粉） サンプルインフォメーション（そば粉）
―
サンプル Ct コピー数 サンプル Ct コピー数
( © copy) ( ^o co )
14.4 2.70E+07 13.8 5.70E+07
26,013,826 58,115 ,672 14.6 2.50E+07 13.7 5.90E+07
14.8 2.10E+07 14.0 4.90E+07
No. 2 20,441,034 48,713,304 14.9 2.00E+07 14.0 4.90E+07
14.3 3.00E+07 13.6 6.20E+07
No. 3
白花 29,482,716 62，454，708
14.4 2.90E+07 白花 13.6 6.30E+07
そば粉 14.7 2.30E+07 そば粉 13.7 6.10E+07
100% No. 4 22,277,192 100% No. 4 63,166,024
14.8 2.20E+07 13.6 6.50E+07
14.3 3.00E+07 13.6 6.20E+07
No. 5 29,360,360 No. 5 62,256 ,136
14.4 2.80E+07 13.6 6.20E+07
14.6 2.50E+07 13.7 6.10E+07
No. 6 24,691,600 No. 6 61,832,168
14.6 2.40E+07 13.6 6.20E+07
15.2 1.60E+07 13.6 6.50E+07
No. 1 14,956,499 No. 1 64，791 648
15.4 1.40E+07 13.6 6.50E+07
ダッタン 15.6 1.30E+07 ダヅタン 13.5 6.90E+07
そば粉 No. 2 12,823,798
15.6 1.30E+07 そば粉 No. 2 69,477,952
13.5 6.90E+07
100% ' 100%
15.3 1.60E+07 13.4 7.20E+07
No. 3 14,854,976 No. 3 69,844,016
15.4 1.40E+07 13.5 6.80E+07
15.1 1.70E+07 13.8 5.60E+07
No. 1 17,177,656 No. 1 58,425,484
15.2 1.70E+07 13.7 6.00E+07
高嶺ルビー 14.4 2.80E+07 高嶺ルビ一 13.5 6.70E+07
そば粉 No. 2 26,409,548 ば粉 No. 2 68,158,464
14.6 2.50E+07 そ 13.5 6.90E+07
100% 100%
14.9 2.00E+07 13.4 7.10E+07
No. 3 19,925,876 No. 3 72,032,008
14.9 1.90E+07 13.4 7.30E+07
14.3 3.00 +07 13.5 6.70E+07
No. 1 28,209,852 No. 1 67,316,112
14.5 2.70E+07 13.5 6.80E+07
グレートルビー 14.7 2.30E+07 グレートルビ一 13.6 6.50E+07
そば粉 No. 2 22,488,190
14.8 2.20E+07 そば粉 No. 2 65,631,320
13.5 6.70E+07
100% 100%
14.4 2.80E+07 13.4 7.20E+07
No. 3 26,490,346 No. 3 71,952,496
14.6 2.50E+07 13.4 7.20E+07 サンプルインフォメーション（検量線用プラスミド） サンプルインフォメーション（検量線用プラスミド）
Figure imgf000048_0001
26.3 1.00E+04 26.6 1.00E+04
10,000 copy 10,000 10,000 copy 10,000
26.3 1.00E+04 26.8 1.00E+04
22.9 1.00E+05 23.1 1.00E+05
100,000 copy 100,000 100,000 copy 100,000
22.8 1.00E+05 23.1 1.00E+05
19.3 1.00E+06 19.6 1.00E+06
1,000,000 copy 1,000,000 1,000,000 copy 1,000,000
19.3 1.00E+06 19.6 1.00E+06
15.7 1.00E+07 16.1 1.00E+07
10,000,000 copy 10,000,000 10,000,000 copy 10,000,000
15.7 1.00E+07 16.2 1.00E+07
12.7 1.00E+08 13.1 1.00E+08
100,000,000 copy 100,000,000 100,000,000 copy 100,000,000
12.8 1.00E+08 13.1 1.00E+08
テンプレ一卜なし 45.0 テンプレー卜なし 45.0
0 0 コン卜ロール 45.0 コントロール 45.0 検量線 検量線
傾き：-3.461 Y切片：40.165 傾き : -3.390 Y切片：40.055
相閡係数：0.999 闊値ライン : 0.26 相関係数：0.999 閻値ライン :0.26
ベースライン： (3 10) ベースライン：(3 10) 表 4A 各種そば粉の Lo/Fo比測定の生データ （1回目測定）
各種そば粉の Lo/Fo比
( 1回目測定)
そば粉 100% ©Lo/Fo比 サンプル 測定値 平均
No. 1 o
No. 2 «· ο
No. 3
白花 2.12
そば粉 2-37
100% No. 4 2.84
No. 5 2.12
No. 6 2.50
No. 1 4.33
ダッタン
そば粉 No. 2 5.42 4.82
100%
No. 3 4.70
No. 1 3.40
高嶺ルビ一
そば粉. No. 2 2.58 3.20
100%
No. 3 3.61
No. 1 2.39
No. 2 2.92 2.67
No. 3 2.72 表 4B 各種そば粉の Lo/Fo比測定の生データ （2回目;淀)
各種そば粉の測定の生データ（ 2回目）
Fagopyr m：そば配列コピー数の定量 PCR Limonium：スターチス配列コピー数の定量 PCR サンプルインフォメ一シヨン（そば粉） サンプルインフォメーション（そば粉）
サンプル ひ コピー数 コピー数平均 サンプル ct コピー数 コヒ:—数平均
( F©
- Τ ， 14.3 2.90Ε+ 7 ~ ~~， 15.9 5.90E+07
Ν°· 1 14.5 2.40Ε+07 26*518^46 Ν°· 1 15.9 6.00E+07 59'483'544 """"" Ϊ4Ϊ7 " 2Ϊ10Ε+07 16.Ϊ " 5.10έ;+07
Ν0· 2 14.7 2.10E.07 21^164'988 Ν°· 2 16.1 5.30Ε+07 51,726,840 " 1 fl " 3.30E+07 " """"" ― Ϊ5.7 - 6.70Ε+07" - 白花 3 14.2 3.00Ε+07 31?55S 5050 白花 3 15.8 6.50Ε+07 66,458 ,736 そ ¾S """" " Ϊ4.6 " 2730E+07" """ 0Ε+07"
100% No. 4 6 2 30E+07 23,066,282 ¾ 10S0% ' N7o.'—
4 - Ί"5Ϊ9 " 6".0
8 6 40E+07 62,320,324
" " Ϊ4.Ϊ " 3V2OE+O7 " Ϊ5.8 6.60E+07" """"
No. 5 30,485,280
14.2 2.90E+07 ' Νθ· 5 15.8 6.30E+07 64,315,224 一 14.5" " _2— . 7 " Ϊ5.8― 6Ϊ30Ε+07" " Ν°· 6 14.5 2.50E+07 25^642 Ν°· 6 15.8 6.50E+07 _64'025'272
~ ~~ , 15.7 6.60E+07
No. 1 15A 。歸 16,326,365
15.2 1.60E+07 ' * 1 15.7 6.60E+07 66,255,696 ダッタン · "— _ Ϊ5Ϊ4 " ΪΓ40Ε+07 · ダッタン · "— Ϊ5Ϊ6 " 7.Ϊ0Ε+07
' Ν0· 2 15.5 1.30E+07 13'136'491 ¾ 2 15.7 6.應 +07 69,291,272
"：""""" Ϊ5.5 " 7Ϊ50Ε+07 " 15.3 1.40E+07 丄。, Ν°· 3 15.6 7.30 7 ― 74'041'168
^ ~ n 15.0 1.70E+07 777~~7" ~ ~， 15.9 5.90E+07 N( l 15.1 1.70E+07 16'998，440 Ν°· 1 15.7 6.60Ε+07 62,179,320 高嶺ルビ一 '；：""；" " 14.Ϊ― 3.30E+07 " """" """ - ' 高嶺ルビ一 '—- — 15.7― 7.00Ε+07 '
¾ 15.6 7.50 7 72,273,880 14·3 +07 ，135'004
。 · :，—丁 14.9一 Y.90EV07" " ° " Ϊ5Ϊ7 " 7.00Ε+07"
Ν°· 3 15.0 1.80Ε+07 一 18'706'756 Ν0· 3 15.6 7.40Ε+07 _ 72,066,528 ~ , 14.1 3.20Ε+07 „„ „,„ ~ ~~， 15.6 7.30Ε+07
Ν°· 1 14.3 2.80E+07 29'831'912 Ν°· 1 15.7 6.靈 +07 71'145'°08 グレートルビ一 14.5 " 2.40E+07" ヮレ一トル C— "" """" Ϊ5.7 " 6.80Ε+07
¾ 14.6 2.30歸 23,647,696 ¾| 15-7 7.00Ε+07 68'944'320
° """" -" " 14.4 " 2V60E+07" ° · — " " Ϊ5.6 - 7.Ϊ0Ε+07" ―
3 14.6 2.30Ε+07 24,742,444 Ν0· 3 15.6 7.10E+07 71'057'568 サンプルインフォメーション（検量線用プラスミド) サンプルインフォメーション (検量線用プラスミド）
Figure imgf000050_0001
検量線 検 fi線
傾き ：-3.43 Y切片：39.853 傾き ： -3.398 Y切片 :42.303 相関係数 ：0.999 闘値ライン ：0.26 相関係数 ：0.999 闘値ライン : 1.02
ベースライン：（1 , 5) ベースライン：（1 ， 5) 表 4B 各種そば粉の Lo/Fo比測定の生データ （2回目測定）
各種そば粉の Lo/Fo比
(2回目測定)
そば粉 100%の Lo/Fo比
サンプル 測定値 干
No. 1 2.24
No. 2 2.44
No. 3
白花 2.11
そば粉 2.36
100% No. 4 2.70
No. 5 2.11
No. 6 2.56
No. 1 4.06
ダッタン
そば粉 No. 2 5.27 4.69
100%
No. 3 4.72
No. 1 3.66
高嶺ルビー
そば粉 No. 2 2.40 3.30
100%
No. 3 3.85
No. 1 2.38
グレートルビー
そば粉 No. 2 2.92 2.72
100%
No. 3 2.87
白花ソバ粉に対して、 最も測定値のずれが大きかったダッタンソバ粉でも約 2倍であ り、 本方法は PCRによる定量法としては十分の精度を有していると考えられる。
G .スターチス標準を添加した擬似混入試料から抽出した DNA中の「ソバ配列のコピー数 Zスターチス配列のコピー数比. Iの算出と、 擬似混入試料中のソバ混入量の計算
ソバ配列とスターチス配列の定量的 PCR法は、 実施例 1 . の F . と G . に記載の方 ¾ で行なつた。検量線をもとに、スターチス標準を添加した擬似混入試料から抽出した DNA
50ng中のソバ配列のコピー数と、 ス夕一チス配列のコピー数を定量した。 その定量値を もとに、 「ソ 配列のコピー数 Zスターチス配列のコピー数 =FsZLs比」を算出した。 な お、 擬似混入試料の Fs/Ls比は、 同一サンプルから 3点抽出、 各点 2ゥエルで測定して 算出した。 ここで算出した FsZLs比と、 実施例 2 . F . で算出した Lo/Fo比を用い、 下式により、 擬似混入試料 （l g ) 中のソバの混入量 ( H g.) を求めた。
ソバの混入量 ppm ( ^ g/g) =Fs/Ls X Lo/Fo X l, 000, 000
； FsZLs比測定と混入量算出の結果..表 5に示す通り、 lOOppm白花ソバ粉 Z小麦の粉砕 物、 10 ppm白花ソバ粉/小麦の粉砕物、 10 ΡΡΠΙ白花ソバ粉/米の粉碎物、 lOppm白花ソバ 粉ノ小麦と米の粉砕物について、 1回測定した結果ともに妥当な値を得ることができた。 なお、 各種擬似混入試料の Fs/Ls比を測定した時の生データを表 6Aと表 6Bに示す。 表 5 擬似混入試料中のそば混入量の測定結果まとめ （PCR)
擬似混入試料中のそば混入量の測定結果 そば粉濃度
擬似混入試料名 ( ppm : μ g/g)
1回目測定 2回目測定
No. 1 97.9 83.0 lOOppmそば/小麦 No. 2 ― 84.5 75.5
No. 3 89.6 81.6
No. 1 6.4 4.6 lOppmそば/小麦 No. 2 14.4 10.8
No. 3 8.9 7.7
No. 1 9.0 (参考値） 7.5 lOppmそば/米 No. 2 7.5 5.1
No. 3 5.5 (参考値） 4.7
No. 1 9.2 6.2 lOppmそば/米と小麦 No. 2 7.0 4.9
No. 3 9.0 8.2
※各擬似混入試料から 3点サンプリングして抽出、各点について n=2で測定した。
※擬似混入試料 5gにスターチス標準 1 gを添加して抽出した DNA 50ngを PCRに供した。 ※擬似混入試料中のそば粉濃度 (ppm)の算出には、白花そばの Lo/Fo値 = 2.36を用いた lOppmそば/米の No.l, No. 3については、スターチス配列のコピー数定量において、 検量線範囲外となったため、参考値として記載した。 04006913
表 6A 各種擬似混入試料のそば混入量測定の生データ （1回目）'
擬似混入試料の測定の生データ（ 1回目）
i o
Fagfo^ra :そば配列コピー数の定量 PCR ■Li ofi Mfii:スターチス配列コピー数の定量 CJ
1
サンプルインフォメーション（擬似混入試料） サンプルインフォメーション (擬似混入試料)
；
サンプル ひ コピー数 コピー数平均 サンプル ひ コピー数 コピー数平均
( Fs copj 一 （Ls copy) _
~ ~ 29.4 1.40E+03 ~ Λ. 14.6 3.40Ε+07 ―
29.4 1.40E+03 1'"93 Ν°· 1 14.6 3.30Ε+07 33,597,292 lOOppm ---"-"297"1 0£+()3 ；'；', '
そば/小麦 - 29.6 1.20E+03 そば/^麦 1 .6 3.30Ε+07 32452070
"... ' '""' 96''"1'20 +0'3 ""'—— ' ''"'146"''3'401+07
Ν0· 3 29.5 1.30Ε+03 ^280 Ν°· 3 14.6 3.30Ε+07 33,721,376
"""""33.7" "7.90Ε+ΌΊ " ―-" - j" -γ 00Ε+07
- 33.6 8.50E+01 82 Ν°· 1 14.8 3.00Ε+07 30,161,998 そば/小笋 32.4 1.90E+02 そば 、麦 2 14.6 3.20Ε+07 32,846,720
1 ( ' ά 33.1 1.20E+02 121 Ν°· 3 14.7 3.10Ε+07 ― 31,901,436 ~ 31.1 4.40Ε+02 ~~" ~ ~， 12.8 1.10E+08
31.1 4.50Ε+02 4 Ν°· 1 12.7 1.20E+08 "6638 192 lOppm ---"31：7-2：9(¾?02
そば/米 1 31.7 3.00E+02 そ【J米 2 13.1.9.40E+07 94 101' 296
""" "·.' ' "''"320""'2"50 +02 """" """" "'·' "--"j2 g-"i";roE+08
3 31.9 2.70E+02 260 No' 3 ^ 12.8 1.10K+08 "2,316,848
~ ~ 13! b b.9 5.50E+07
32Λ 2-權 +02
Figure imgf000053_0001
15.7 1.00E+07 16.2 1.00E+07
10,000,000 copy 10,000,000 10,000,000 copy 10,000,000
15.7 1.00E+07 16.2 1.00E+07
12.7 1.00E+08 13.1 1.00E+08
100,000,000 copy 100,000,000 100,000,000 copy 100,000,000
12.7 1.00E+08 13.2 1.00E+08
テンプレー卜なし テンプレートなし
0 0 コントロール コン卜口一Jレ
検量線 検量線
傾き：-3.504 Y切片：40.394 傾き：-3.382 Y切片：40.043 相関係数：0.999 閾値ライン :0.26 相関係数：0.999 閾値ライン :0.26
ベースライン：(3 10) ベースライン： (3 , 10) 表 6A 各種擬似混入試料のそば混入量測定の生データ （1回目）
そば混入量の算出結果 そば混入量
( ppm: i g/g) 卄 プ 1し
No. 1 97.9 ppm lOOppm
No. 2 CSH-.O ppm そば/小麦
No. 3 3.8E-05 89.6 ppm
2.7E-06 6.4 ppm lOppm
No. 2 6.1E-06 14·4 ppm そば/小麦
No. 3 3.8E-06 8.9 ppm
No. 1 3.8E-06 9.0 ppm (参考） lOppm
No. 2 3.2E-06 7.5 ppm そば/米
No. 3 2.3E-06 5.5 ppm (参考）
3.9E-06 9.2 ppm lOopm
No. 2 3.0E-06 7.0 ppm そば/米 +小麦
No. 3 3.8E-06 9-0 ppm
※ l Oppmそば/来の擬似混入試料については、スターチス ※配列のコピー数が検量線範囲を超えたため、参考値とした。
表 6B 各種擬似混入試料のそば混入量測定の生データ （2回目）
擬似混入試料の測定の生データ（ 2回目）
J¾g 2 r m :そば配列コピー数の定量 PCR Ltmonium：スター -チス配列コピー数の定量 PCR サンプルインフォメーション （擬似混入試料） サンプルインフォメ- -シヨン（擬似混入試料）
サンプル ひ コピー数 コヒ: 数平均 サンプル Ct コピー数 コピー数平均
( Fs copy) ( copy)
~ ~~ , 30.8 1.20E+03 16.4 3.40E+07
No. 33,560,780
Ν 1 30.8 1.20 3 ^180 16.4 3.30E+07
10 Ν 2—— -: r ： 2 8— lOOppm No "ϊ*6.5" 3ΪΐδΕ+07"
31,837,948 そば/小麦 30.9 1.10E+03 ， 10 そば/小麦 16.4 3.20E+07
-. - 30.9 1.10E+03 , "Ϊ6.4" " θΕ+θ'Ϋ"
No. 33,067,796
Ν°· 3 30.8 1.20E+03 "43 16.4 3.30E+07 - ----- -35.2 " 6.20Ε+Ό 1 - " "Ϊ6.6 3 ΟΕ+07"
No. 29s930?496
Ν°· 1 35.4 5.40E+01 58 16.5 3.00E+07 lOppm — Ν:— 2ΐ4.Γ· 1 ·30Ε+02 lOppm No "Ϊ6.4" 3Ϊ30Ε+07"
32,418,082 そば/小麦 33.7 1.70E+02 そば/小麦 · 16.5 3.20E+07
：——二-.— : δ.·ϋ ϊόϊ —―" "Ϊ6.4" "3.30E+07"
No. 3 32,839， 880 3 34.2 1.20Ε+02 108 16.4 3.30E+07
~ ~~， 32.4 4.00Ε+02 一 一 14.4 1.30E+08
No. 133,923, 120 Ν°· 1 32.3 4.40Ε+02 423 14.3 1.40E+08 lOppm -^--^"33；1 ""2；50£¾2 lOppm No "Ϊ4.7" 'Ϊ ΓθΕ+θέ'"
107,428,504 そば/米 、 33.4 2.10E+02 そばノ米 14.7 1.10E+08
"Ϊ4 "
No. 3 249 No. 3 125,724,392 ― 33.0 .80E+02 ， 14.4 1.30E+08
33.7 1.70E+02 *~ ― ~ 15.6 5.60E+07
No. 1 147 No. 1 56,432,404
34.1 1.30E+02 15.6 5.70E+07
lOppm No "Ϊ5.7" '5"20Ε+07"'
52,445,608 そば/米 +小麦 34·2 1.20E+02 そば/米 +小麦 15.7 5.30E+07
¾τ 33.3 2.20Ε+02 *5.90 +07" No. 3 209 No. 3 60,105,248
33.5 2.00E+02 15.5 6.10E+07 サンプルインフォメ- -シヨン（検量線用プラスミド） サンプルインフォメ- -シヨン（検量線用プラスミド） サンプル ct コピ—数 コヒ—数平均 サンプル Ct コピー数 3ピ—
( Fs copy) ( s copy)
38.0 1.00E+01
10 copy 10
38.1 1.00E+01
35.1 1.00E+02 35.2 1.00E+02
100 copy 100 100 copy 100
34.2 1.00E+02 35.3 1.00E+02
1.00E+03 31.5 1.00E+03
1,000 copy 1,000 1,000 copy 1,000
1.00E+03 31.6 1.00E+03
27.5 1.00E+04 28.4 1.00E+04
10,000 copy- 10,000 10,000 copy 10,000
27.5 1.00E+04 28.6 1.00E+04
24.0 1.00E+05 24.7 1.00E+05
100,000 copy 100,000 100,000 copy 100,000
24.0 1.00E+05 24.9 1.00E+05
20.4 1.00E+06 21.5 1.00E+06
1,000,000 copy 1,000,000 1,000,000 copy 1,000,000
20.4 1.00E+06 21.6 1.00E+06
16.9 1.00E+07 17.9 1.00E+07
10,000,000 copy 10,000,000 10,000,000 copy
16.9 1.00E+07 17.9 1.00E+07 ιο,οοο,οοο
13.6 1.00E+08 14.7 1.00E+08
100,000,000 copy 100,000,000 100,000,000 copy 100,000,000
13.7 1.00E+08 14.8 1.00E+08
10.5 1.00E+09 1 1.6 1.00E+09
1,000,000,000 copy 1,000,000,000 1,000,000,000 copy 1,000,000,000
10.6 1.00E+09 1 1.6 1.00E+09
亍ンプレー卜なし 45.0 テンプレートなし 45.0
0 0 コント口一 Jレ 45.0 コントロール 45.0 検量線 検量線
傾き ：-3.475 Y切片： 41.45 傾き ：-3.385 Y切片： 41.855 相関係数：0.999 闘値ライン : 0.51 相関係数：0.999 闞値ライン : 0.77 ベースライン： (3 , 8) ベースライン：（3 , . 8) 表 6B 各種擬似混入試料のそば混入量測定の生データ （2回目）
そば混入量の算出結果 そば混入量
( PPm: ju g/g) サンプル Fs/Ls Fo/Lo - 2.36
No. 1 3.5E-05 83.0 ppm lOOppm
No. 2 3.2E-05 75.5 ppm そば 小麦
No. 3 3.5E-05 81.6 ppm
No. 1 1.9E-06 4.6 ppm lOppm
No. 2 4.6E-06 10.8 ppm そば/小麦
No. 3 3.3E-06 7.7 ppm
No. 1 3.2E-06 7.5 ppm lOppm
No. 2 2.2E-06 5.1 pm そば/来
No. 3 2.0E-06 4.7 ppm
No. 1 2.6E-06 6.2 ppm lOppm
No. 2 2.1E-06 4.9 ppm そば/米 +小麦
No, 3 3.5E-06 8.2 ppm
実施例 3
A. DNA抽出に用いた植物試料
(1) 落花生、 ソバ （白花ソバ）、 スターチスの種子：
実施例 1. A. (1)、 (2) と同じものを用いた。
(2) 小麦、 大豆、 とうもろこしの葉：
実施例 1. A. (3) と同じものを用いた。
(3) 小豆、 アーモンド、 クルミ、 マカデミアナッツ、 ヘーゼルナッツの種子と、 松の 実、 ヒマヮリの種、 ケシの実、 ごま、 リンゴ：
市販品を用いた。
(4) ソバ （白花ソバ）、 小豆の葉
市販品の種子から発芽させた葉を用いた。
B. DNA抽出
(1) スターチスの種子からの DNA抽出
実施例 1. B. (2) と同じ方法で行なった。
(2) 落花生、 アーモンド、 ヘーゼルナッツの種子と、 ケシの実、 ゴマからの DNA抽出 ： 実施例 1. B. (3) と同じ方法で行なった。
(3) ソバ （白花ソバ）、 小麦、 大豆、 とうもろこし、 小豆の葉と、 リンゴの種子からの DNA抽出；
実施例 1. B. (4) と同じ方法で行なった。
(4) マカデミアナッツの種子からの DNA抽出：
QIAGEN Genomic DNA Handbookを参考にして、 QIAGEN社製の Genomic-tipを用い、 以 下の方法で行った。
細かく粉砕した試料 lgを 50ml容チューブに入れ、 10mlのバッファー G2、 200 1の
Proteinase K (20mg/ml)> 20 1の MaseA (100mg/ml) を加え、 混合した後、 50°Cで
1時間保温した。 その後、 約 3, OOOXgで 10分間遠心分離し、 その上清液を得た。 さら に上清液の油分や粉末を取り除き、 約 3, OOOXgで 10分間遠心分離し、 その上清液を得 た。 得られた上清液を、 予め 1mlのバッファー QBTで平衡化した Genomic- tip 20/Gに 供して MAを Columnに吸着させた。 その後、 4mlのバッファー QCで Columnを洗浄し、 予め 50°Cに加温してある 1mlのバッファ一 QFで溶出し、イソプロパノール沈澱により回 収した沈澱物を 100 1の滅菌超純水に溶解した。溶液中の DNA濃度を測定し、適宜滅菌 超純水で希釈したものを PCRの鍀型 DNA試料とした。
(5) クルミの種子と、 松の実、 ヒマヮリの種からの DNA抽出：
DNeasy Plant Maxi Kit Handbookを参考にして、 QIAGEN社製の DNeasy Plant Maxi Ki t を用い、 以下の方法で行なった。
細かく粉枠した試料 lgを 15ml容チューブに入れ、 10mlのバッファー AP1、 10 ilの RNase A (100mg/ml) を加え、 混合した後、 65でで 60分間保温した。 その後、 約 3， 000 Xgで 10分間遠心分離し、その上清液を得た。これに 1.5mlのバッファー AP2を加えて、 氷中で 10分間放置し、 遠心分離によりその上清液を得た。 得られた上清を QIAshredder Spin Columnに供し、 遠心分離により Columnのパス液を得た。 このパス液に 1.5容量の バッファー AP3、 1容量のエタノールを加えて混合した後、 DNeasy Spin Columnに供し、 約 l, 500Xgで 1分間遠心分離して DNAを Columnに吸着させた。その後、 Columnに 10ml のバッファー AWを加え、 約 1, 500Xgで 1分間遠心分離して Columnを洗浄、 再度 10ml のバッファ一 AWを Columnに加え、約 1, 500Xgで 1分間遠心分離して、最後に約 3, 000 Xg で 10分間遠心分離して Co 1 umnに残っているバッファ一 AWを完全に除去した。 最終的に 65°Cで予め保温しておいた 1mlの滅菌超純水を Columnに加え、 5分間静置した後に、 約 3, OOOXgで 5分間遠心分離して Columnから溶出し、 ィソプロパノール沈殿により回収 した沈殿物を ΙΟΟμΙの滅菌超純水に溶解した。溶液中の DNA濃度を測定し、適宜滅菌超 純水で希釈したものを PCRの铸型 DNA試料とした。
C. 落花生の ITS- 1配列の一部を検出する PCR
(1) 落花生検出用プライマー：
プライマー配列には、 落花生属に属する植物の GenBank に登録されている以下の 11 配列中の ITS- 1配列に共通な配列を用いた。 なお、 このうちの Arachis hypogaeaについ ては、 GenBankに登録されている Arach is hypogaea (AF156675) の代わりとして、 市販 落花生を解析して得た配列も用いた。
1： Arachis batizocoi (AF203553)
2： Arachis correntina (AF203554)
3： Arachis hermannii (AF203556)
4： Arachis oehnei (AJ320395) 004/006913
5： Arachis hypogaea (AF156675及び、 市販落花生を解析して得た配列）
6： Arachis magna (AF203555)
7： Arachis major (AF203552)
8： Arachis palustris (AF203557)
9： Arachis pintoi (AF203551)
10： Arachis triseminata (AF204233)
11： Arachis villosa (AF203558)
そして、 下記配列のオリゴ DNAプライマ一 （株式会社 QIAGEN社製 0PC精製品） を合 成して、 落花生 ITS- 1配列の一部を検出する PCR (以下、 落花生 PCRとする） 用プライ マーとして使用した。
5' -GCG GAA AGC GCC AAG GAA GC-3' (配列番号 21 )
5' -GTC GCC CCG ACC GGA TG-3' (配列番号 66)
5' -CGT CGC CCC GAC CGG AT— 3' (配列番号 26)
5' -TCG TCG CCC CGA CCG GAT G— 3' (配列番号 65)
(2) 落花生検出用プライマ一の特異性 （PCRシミュレーション） ：
PCRシミュレーションソフト Amplify 1.0 (Bill Engels) により、 落花生属に属する 植物の 11配列、落花生以外のアレルギーを起こす恐れのある植物の 8配列（ソノ '、小麦、 大豆、 クルミ、 松茸、 桃、 リンゴ、 オレンジ）、 食品原材料としてよく使われている植物 の 8配列 （とうもろこし、 米、 胡椒、 力ラシ、 ニンジン、 椎茸、 白菜、 かぶ）、 マメ科植 物の 6配列 （インゲンマメ、 ライマメ、 ヒラマメ、 ヒョコマメ、 緑豆、 小豆）、 落花生近 縁種の植物の 69配列、 スターチスから、落花生検出用プライマーで PCR増幅産物が得ら れるシミュレーション結果となるかを確認した。 ここでいう落花生近縁種の植物とは、
GenBankに登録されている落花生 Arachis hypogaeaの塩基配列 （AF156675) の ITS- 1配 列部分を BLASTホモロジ一検索に供して、 Score 60 bits以上となった落花生属以外の 植物のことである。 今回は、 さらにその植物が属する属の中で最も Scoreが高い値とな つた種の配列を、 その属の代表の配列として選定した。 なお、 PCR シミュレーションは それら配列の ITS- 1〜5.8S rRNA遺伝子〜 ITS- 2配列の領域に対して行った。 配列番号 2
1と配列番号 65のプライマーを組み合わせて使用した場合について、 シミュレーショ ンに用いた配列の GenBank Accession Numberならびに、 シミュレーション結果を表 7 A 〜 7 Eに代表として示す。 表 7A〜7 Eの省略文字、 記号は以下に示す通りである * ：標的サイズ付近 （士 10bp) の PCR増幅産物が得られると予想されたもの W値： PCR増幅産物の得られる可能性
得られる可能性が高い… W6〉W 5>W 4>W 3>W 2…得られる可能性が低い 数値 （bp)： PCR増幅産物のサイズ （bp)
Amplifyで得られた値から 2を引いた値
一： PCR増幅産物なしと予想されたもの
3
Figure imgf000061_0001
表 7B
落花生検出用プライマー (配列番号 21 &配歹 1番号 65) :増幅産牧
GenBank
学名
Accession W6 W5 W4 W3 W2 (一般名）
No.
S [yloscLTithes Litiecinj olid AJ320367
StytosuTitnes mucroccivpci AJ320369
dtylosunthes macrocephala AJ320371
Stylosanthes macrosoma AJ320333
Stylosanthes mexicana AJ320374
Stylosanthes montevidensis AJ320336
Stylosanthes pilosa AJ320377
Stylosanthes scabra AJ320382
Stylosanthes seabrana AJ320384
Stulosanthes senceiceps AJ320386
Stylosanthes subsericea AJ320387
Stylosanthes sundaica AJ320389
Stylosanthes sympodialis AJ320391
落 Stylosanthes tomentosa AJ320337
花 Stylosanthes vuberculata AJ320392
生
近 Stylosanthes viscose AJ320340
Ormocarpum bernieri num AF 189036
の
植 O TTlOCO p TR CO T leWYl AF 189037
物 K TulOCOTpViTil CLTdK l AF189039
TTTlOCWpUTTL (lUui7l AF 189041
1 A-c tic/t c AF068155
Ο π o onn Kl iin pi Ar loy(J
Ormocarpum megalophyllum A Λ r Uoo Q l 1 o4
Ormocarpum muricatum A Ubi 丄； 3t
Ormocarpum orientale ΛΧ1 WUO
Ormocarpum pubesce7is AF189045
Ormocarpum rectangulare AF189046
Ormocarpum schUebenii AF189047
Ormocarpum sennoides AF068153
Ormocarpum somalense AF189048
Ormocarpum trachycarpum AF189049 表 7C
Figure imgf000063_0001
表 7D
落花生検出用プライ (配列番号 21 &配列番号 65) :増幅産物
GenBank
学名
Accession W6 W5 W4 W3 W2
(一般名）
No.
Faaopyrum_esculentum AB000330, ― ― ― 一 一 (白花そば） AB000331
Z11761 ,
Triticum aesif m (小麦) ― ― 一 ― ―
AJ301799
AJ011337,
Glvcine m x (大 S_) 一 ― ― 一 ―
U60551
AF303809,
Juol ns regia ヮ）レミ)
AF179581
U62964,
Tnqholoma matsutake (ΫΛΜ) ― ― ― ― ァ AF385751
レ
ル j
ギ
1 AF143535，
特 Prunus persica (桃) 一 ― ― ― ― 定 AF179562
原 AF185621
材
料 423bp?
Malus x domesiicct (リンゴ) AF186477 466bp.
238bp
238bp
Malus x domesiz'ca (リンゴ) AF186478
155bp
238bp?
Malus x do/nesiica (リンゴ) AF186479 112bp,
15 bp
Citrus sp.
E08821
レンシァオレンジ） 表 7E
Figure imgf000065_0001
シミュレーションの結果、 配列番号 2 1と配列番号 6 5のプライマ一を組み合わせて 使用した場合、 表 7 A ~ 7 Cに示す通り、 落花生属の 1 1配列からは標的とした 76bp .の サイズの PCR増幅産物が得られることが予想された。 また、 落花生属以外のアレルギー を起こす恐れのある植物の 7配列 （ソバ、 小麦、 大豆、 クルミ、 松茸、 桃、 オレンジ）、 食品原材料としてよく使われている植物の 8配列 （とうもろこし、 米、 胡椒、 力ラシ、 ニンジン、 椎茸、 白菜、 かぶ）、 マメ科植物の 6配列 （インゲンマメ、 ライマメ、 ヒラマ メ、 ヒョコマメ、 緑豆、 小豆）、 落花生近縁種の植物の 69配列、 スターチスからは、 標 的サイズの PCR増幅産物ならびに非特異的な PCR増幅産物は得られないことが予想され た。 なお、 リンゴからは、 弱いながら標的とは異なるサイズの非特異的な PCR増幅産物 が得られる可能性があると予想されたため、 別途、 実際の PCRで確認することとした。 なお、 配列番号 2 1と配列番号 6 6に示す配列を有するプライマーを組み合わせて使用 した場合、配列番号 2 1と配列番号 2 6のプライマーを組み合わせて使用した場合にも、 落花生属の配列から標的とする PCR増幅産物が得られることが予想される結果が得られ た。
(3) 落花生 PCR：
QIAGEN社製の HotStarTaQ Master Mix Kitを用い、 以下の方法で行った。
12.5 の 2XHotStartTaQ Master Mix (HotStar Taq DNA Polymerase, PC ノ ッフ ァー with 3mM MgCl2、 400 xM each dNTP) に、 プライマーをそれぞれ終濃度で 0.2 M ずつ、 及び铸型 DNAを加え、 最終的に滅菌超純水で 2521 とした反応用溶液を 0.2mlマ イク口チューブに入れ、 Applied Biosystems 社製のサーマルサイクラ一 GeneA即 PCR System 9600により、 95°C， 15分 （酵素活性化） の後、 95°C, 30秒 （変性）、 68°C, 30 秒 （アニーリング、 伸長） のサイクルを 45回繰り返した後、 72°C， 4分 （最終伸長） と して反応させた。 得られた PCR反応液をェチジゥムブ口マイド含有の 2%ァガ口一スゲ ル電気泳動に供して、 Amersham Biosciences 株式会社製の蛍光イメージアナライザー Fluorlmager 595 により解析した。 配列番号 2 1と配列番号 65とのプライマーを組み 合わせて使用した場合の結果を図 12に代表として示す。 図 12の省略文字、 記号など は以下に示す。
M ： lOObp DNA Ladder Marker
(一） ： 錶型 DNA未添加
数字 ： 添加した铸型 DNA量
矢印 ： 標的の PCR増幅産物のパンド （約 76bp) なお、 抽出した植物 DNA が PCR 増幅可能なレベルの純度であることは、 植物 ch 10 r op 1 as t DNAや RuM s co遺伝子配列の一部を増幅するプライマ一により、 PCR増幅産 物が得られることで確認した （データ省略）。
(4) 落花生 PCRの感度と特異性：
落花生 PCRの結果、 図 1 2に示す通り、落花生 DNA 500igから標的とした落花生 ITS-1 配列から予想される約 76bpのサイズの PCR増幅産物が得られた。 500igの落花生 DNAを 検出できる感度とは、 ある試料から抽出した DNA50ngを铸型として PCRした塲合、 その 試料 MA中に含まれる 1 Oppmのソバ DNAを検出できるレベルの感度に相当する。
落花生 PCRの結果、 図 1 2に示す通り、 リンゴの種子、 小麦の葉、 ソバの葉、 小豆の 葉、 大豆の葉、 とうもろこしの葉、 スターチスの種子 DNA 50ngからは標的サイズの PCR 増幅産物ならびに非特異的な PCR 増幅産物は得られなかった。 リンゴについては、 PCR シミュレーションで弱いながら標的とは異なるサイズの非特異的な PCR増幅産物が得ら れる可能性があると予想されていたが、 問題はないことが確認できた。 また、 ァーモン ド、 ヘーゼルナッツ、 マカデミアナッツ、 クルミの種子、 ケシの実、 松の実、 ヒマヮリ の種、 ゴマ、 サケ精子 DNAからも同様に PCR増幅産物は得られないことを確認した （デ 一夕省略）。他にも、配列番号 2 1と配列番号 6 6のプライマ一を組み合わせて使用した 場合、配列番号 2 1と配列番号 2 6のプライマーを組み合わせて使用した場合、ともに、 同様の感度と特異性を有するという結果を得た （データ省略）。
( 5 ) 落花生 PCR増幅産物の塩基配列解析：
上記配列番号 2 1と配列番号 6 5のプライマーを組み合わせて使用した場合に得られ た落花生 DNA由来の PCR増幅産物の塩基配列は、 配列番号 2 1と配列番号 6 5のプライ マーを用いた両鎖ダイレクトシークェンスにより解析した。 得られた塩基配列を、 市販 落花生 Arach i s hypogaeaの塩基配列と比較し、 落花生 DNA由来の PCR増幅産物の塩基配 列は、 市販落花生 （Arach i s hypogaea) の塩基配列の標的とした部分と 100%合致するこ とを確認した。 （データ省略) このことから、 上記プライマーを用いた PCRにより、 落花 生 ITS- 1の一部の配列を増幅、 検出していることが立証された。 他にも、 配列番号 2 1 と配列番号 6 6のプライマーを組み合わせて使用した場合、 配列番号 2 1と配列番号 2 6とのプライマ一を組み合わせて使用した場合、 ともに、 同様に落花生 ITS-1の一部の 配列を増幅、 検出しているという結果を得た。 （デ一夕省略）
以上の結果より、 上記プライマーを用いた落花生 PCRにより、 落花生属に属する植物 全般の ITS- 1配列を、 高感度かつ、 特異的に検出できることが明らかとなった。 これら プライマ一を、 落花生 ITS-1配列のコピー数を定量する PCR (以下、 落花生配列の定量 的 PCR法とする） に用いることとした。
D. 落花生配列のコピー数を定量する PCR
( 1 ) 落花生配列の検出用 TaaMan MGBプローブ：
下記配列の TatiMan MGBプローブ （App l i ed B i osys t erns lapan株式会社製 リポーター 色素 FAM) を合成して、 落花生配列の検出用プローブとして使用した。 なお、 プローブ 配列には、落花生属に属する植物の ITS- 1配列として GenBankに登録されている 11配列、 ならびに市販落花生を解析して得た配列に共通な配列を用いた。
5' -TGC TCT CCC CGC CGG C-3' (配列番号 34)
( 2 ) 落花生配列の定量的 PCR法：
QIAGEN社製の QuantiTect Probe PCR Kitを用い、 以下の方法で行った。
12.5 1 の 2 X QuantiTect Probe PCR Master Mi に、 プライマーを終濃度でそれぞれ 0.2 Μずっと、 配列番号 34の TatiMan MGBプローブを終濃度で 0, 1 M、 及び踌型 DNA を加え、最終的に滅菌超純水で とした溶液を 96穴 PCRプレートに分注した。分注 した 96穴 PCRプレートを、 Applied Biosystems社製の Real Time PCR装置 Sequence Detection System 7700にセットし、 95。C, 15分の後、 95°C, 30秒 （変性）、 68°C, 30 秒 （アニーリング、 伸長） のサイクルを 45回繰り返した後、 72で， 4分 （最終伸長） と して反応させた。 反応は全て同一試料を 2ゥエル並行で行なった。 反応終了後、 伸長ス テツプにおける蛍光データを解析した。 なお、 ベ一スラインは、 始めに 0-1サイクルに 設定して蛍光の立ち上がりの始まるサイクルを確認して、 そのサイクルよりも前の範囲 で適宜設定した。 また、 閾値ライン （Threshold Line) の設定は、 Kuribara H et al. 2002. Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maize and Soybean. Journal of A0AC International 85: 1077- 1089に記載の方法に従って行なつ た。 配列番号 2 1と配列番号 6 5とのプライマーを組み合わせて使用した場合の結果を 図 1 3、 図 1 4、 図 1 5に代表として示す。
なお、 抽出した植物 DNA が PCR 増幅可能なレベルの純度であることは、 植物 ch 10 r op 1 as t DNAや Rub i s c 0遺伝子配列の一部を増幅するプライマーにより、 P CR増幅産 物が得られることで確認した （データ省略）。
(3) 落花生配列の定量的 PCR法の特異性：
落花生配列の定量的 PCR法の結果、 図 1 3に示す通り、 落花生の種子 DNAから増幅を 示す蛍光シグナルの立ち上がりが確認された。 一方、 リンゴの種子、 小麦の葉、 ソバの 葉、 小豆の葉、 大豆の葉、 とうもろこしの葉、 スターチスの種子 DNA50ngからは増幅を 示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。また、アーモンド、ヘーゼルナッツ、 マカデミアナッツ、 クルミの種子、 ケシの実、 松の実、 ヒマヮリの種、 ゴマ、 リンゴ、 サケ精子 DMからも増幅を示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。（データ省 略）他にも、配列番号 2 1と配列番号 6 6とのプライマーを組み合わせて使用した場合、 配列番号 2 1と配列番号 2 6と組み合わせて使用した場合、 ともに、 同様の特異性を有 するという結果を得た。 （データ省略）
( 4 ) 落花生配列の定量的 PCR法の定量性と感度：
ソパ配列の定量的 PCR法の結果、 図 1 4と図 1 5に示す通り、落花生 DNA 50ng〜500 i g の範囲で、 相関係数 0. 996、 かつ傾き一 3. 91】の検量線を引くことができる定量性と感 度を確認できた。 また、 落花生 DNA 50f gからも増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりが みられる感度を確認できた。 他にも、 配列番号 2 1と配列番号 6 6のプライマーを組み 合わせて使用した場合、 配列番号 2 1と配列番号 2 6を組み合わせて使用した場合、 と もに、 同様の定量性と感度を有するという結果を得た。 （データ省略）
以上の'結果より、 配列番号 2 1と配列番号 6 5のプライマ一、 配列番号 3 4のプロ一 ブを用いた落花生配列の定量的 PCR法、 配列番号 2 1と配列番号 6 6とのプライマー、 配列番号 3 4のプローブを用いた落花生配列の定量的 PCR法、 配列番号 2 1と配列番号 2 6とのプライマー、 配列番号 3 4のプローブを用いた落花生配列の定量的 PCR法によ り、 落花生属に属する植物全般の ITS- 1配列を高感度かつ特異的に検出し、 さらには落 花生の標的配列を含む検量線用プラスミドを構築して検量線を作製すれば、 落花生配列 のコピー数を定量できることが明らかとなつた。 本落花生配列の定量的 PCR法と補正用 のスターチス配列の定量的 PCR法と組合わせて、 落花生の混入量測定に用いることがで きる。
実施例 4 ：加工処理後のサンプル中の定量的 PCR法の定量性の確認：
さらに、 加熱調理した加工品モデルとして、 l OOppm (以下 WZW) のソバを含む小麦粉
80gに水 35g、 塩 0. 8gを加えたドウ （直径 6cm、 厚さ Iran) を作製し； これを、 以下の 4 通りの加熱処理；①焼く （160 、 10分） 、 ②揚げる （185°C、 5秒） 、 ③蒸す （100°C、
10分） 、 ④茹でる （10(TC、 10分） を行なったものについて、 スターチス標準試料と混 合して、 上記と同様、 DNA抽出を行なった後、 配列番号 1 4記載の配列を有するオリゴ ヌクレオチドと配列番号 1 5記載の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマ 一セット、 および配列番号 6 4記載の配列を有するプローブを用いて、 該加熱後の試料 に含まれるソバを定量した。 測定された加工品中のソパの定量値をもとに、 水分量を加 味して、 使用した小麦粉中のソバ濃度に換算した結果、 ①焼いたもの： 145ppm、 ②揚げ たもの： 56ppm、 ③蒸したもの： 198ppm、 ④茹でたもの： 143ppm であり、 十分な定量性 が示された。 したがって、 食品加工において、 最も一般的な加熱処理である、 焼く、 揚 げる、 蒸すおよび茹でるのいずれの処理においても、 本発明の方法による定量は可能で あることが示唆され、 このことから、 これらの他の加工処理によってもその定量性を喪 失することはないと考えられる。 したがって、 本発明の方法は、 広範な加工食品に適用 可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として本明細 書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明の食品または食品原材料中に混入した特定植物属に属する植物を定量する P C R 法によると、 食品または食品原材料中における特定植物属の植物の極微量の存在を検出 するとともに定量することが可能であることから、 ソバ属、 落花生属、 小麦属及び大豆 属等のアレルギー原因となる植物属の植物の混入の有無の検出およびその定量をするの に特に有効である。 また、 被検対象とする試料毎の DNA抽出効率や PCR反応の阻害など の影響に対する補正の方法として、 外部から精製 DNAを標準として添加して反応溶液中 の PCR反応の阻害などの影響に対する補正を行うのではなく、 外部から精製 DNA以外の 標準植物試料を添加したサンプルから検出対象の特定植物属由来の DNAと標準植物由来 の DNAを同時に抽出して定量的 PCR法を行うことにより、 標準植物試料と検出対象の特 定植物属由来の試料との間で、 DNA抽出効率や PCR反応の阻害などの影響が均一な条件 で測定できるため、 非常に信頼度の高い定量が可能である。 また、 DNA抽出効率や PCR 反応の阻害等の影響、 さらには被検対象とする試料中の DNA含有量の違いに対しても補 正が可能であるという、 有利な効果を有している。 また、 例えば塩等の DNAを含有して いない食品原材料または当該原材料を含む食品中の特定植物属に属する植物を適切に定 量検出することも可能である。
したがって、 本発明は、 食品または食品原材料中に混入しているアレルギ一の原因と なる特定植物属に属する植物の定量的検出に有用である。 さらに、 PCR法による定量分 析は、 偽陽性が出た場合に、 その PCR増幅産物を DNA配列の解析に供することにより、 確実に偽陽性を除外することができるという点から、 産業上利用性に優れているといえ る。
さらに、 本定量的 PCR法によると、 ELISA法よりダイナミックレンジが広く、 かつ食 品または食品原材料中に混入した特定の原材料の定量的検出に十分な特異性および感度 が高いものとすることができる。 また、 合成品 （プライマ一、 プローブ） を使用するこ とにより測定結果の再現性が高く、 かつ信頼度も高いものとすることができる。

Claims

請求の範囲
1 . PCR 法による食品または食品原材料中の特定植物属に属する'植物を定量する方 法であって、
検出対象である特定植物属由来の試料と標準植物試料とを予め定めた比率で混合した 補正用サンプルを用意し、 該サンプルからゲノム DNAを抽出すること、
被検対象である食品または食品原材料に既知量の標準植物試料を添加した被検サンプ ルを調製し、 該サンプルからゲノム DNAを抽出すること、
検出対象である特定植物属由来の試料を検出するためのプライマーセット、 および標 準植物試料を検出するためのプライマーセットを用いて各サンプルから抽出したゲノム DNAをテンプレ一トとして定量的 PCR法を実施すること、
補正標準値として、 補正用サンプルについて上記定量的 PCR法によつて標準植物由来 DNAのコピー数/特定植物属由来 DNAのコピー数の値を求めること、 ならびに
被検サンプルについて上記定量的 PCR法によって特定植物属由来 DNAのコピー数 Z標 準植物由来 DNAのコピー数の値を求め、 これを上記補正標準値を用いて補正して、 食品 または食品原材料中に含まれる特定植物属の植物の量を算出すること、
を含む上記方法。
2 . 定量的 PCR法がリアルタイム PCR法である、 請求項 1記載の方法。
3 . リアルタイム PCR法が、 5 ' 末端に発光色素および 3 ' 末端に消光剤を有してい る、 PCRプライマ一セットの各オリゴヌクレオチドがハイブリダィズするゲノム DNAの 部位の内側にハイブリダィズするプローブを用いて、 発光量に基づいて DNAを定量する 方法であって、 ここで、 プローブの 5 ' 末端の発光色素はその 3 ' 末端の消光剤によって その発光が抑制されているが、 PCR反応において Taqポリメラ一ゼによってプライマー から DNAが伸長されると、 TaQポリメラ一ゼの 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性により上 記プロ一ブが分解され、発光色素と消光剤とが解離して発光を生じることを特徴とする、 請求項 2記載の方法。
4 . 標準植物が、 畑地雑草および食用作物以外の植物種に属するものである、 請求 項 1〜 3のいずれか 1項記載の方法。
5 . 標準植物が、 ス夕一チスである請求項 4記載の方法。
6 . 検出対象の特定植物属が、 ソパ、 落花生、 小麦または大豆属である、 請求項 1 〜 5のいずれか 1項記載の方法。
7 . 標準植物がスタ一チスであり、 スターチス検出用プライマーセットが、 配列番 号 5 7記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 5 8記載の配列を有するォ リゴヌクレオチドとからなるセットであり、 スターチス検出用プローブが、 配列番号 5 9記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、 請求項 2または 3記載の方法。
8 . 検出対象の特定植物属がソバ属であり、 ソバ属検出用プライマーセットが、 配 列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 1 5記載の配列を有す るオリゴヌクレオチドとからなるセットであり、 ソバ属検出用プローブが、 配列番号 6 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、 請求項 2または 3記載の方法。
9 . 検出対象の特定植物属が落花生属であり、落花生属検出用プライマーセッ卜が、 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットであ り、 落花生属検出用プローブが、 配列番号 3 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチド である、 請求項 2または 3記載の方法。
1 0 . 配列番号 5 7記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 5 8記載 の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるス夕—チス検出用プライマーセット。
1 1 . 配列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 1 5記載 の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソパ属検出用プライマーセット。
1 2 . 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花生属検 出用プライマーセッ卜。
1 3 . 食品または食品原材料中の特定植物属に属する植物を検出するための方法に 用いるためのキットであって、 標準植物試料検出用プライマーセットを含む、 上記キッ 卜。
1 4 . 標準植物試料検出用プローブをさらに含む、 請求項 1 3記載のキッ卜。
1 5 . 標準植物がスターチスであり、 スターチス検出用プライマーセットが、 配列 番号 5 7記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 5 8記載の配列を有する オリゴヌクレオチドとからなるセットである、 請求項 1 3または 1 4記載のキット。
1 6 . 配列番号 5 9からなる配列を有する、 スターチス検出用プローブをさらに含 む、 請求項 1 5記載のキッ卜。
1 7 . 検出対象の特定植物属検出用プライマ一セットをさらに含む、 請求項 1 3〜 1 6のいずれか 1項記載のキット。
1 8 . 検出対象の特定植物属がソバ属であり、 その検出用プライマ一セットが、 配 列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 1 5記載の配列を有す るオリゴヌクレオチドとからなるセットである、 請求項 1 3〜 1 6のいずれか 1項記載 のキット。
1 9 . 配列番号 6 4からなる配列を有するソバ属検出用プローブをさらに含む、 請 求項 1 8記載のキッ卜。
2 0 . 検出対象の特定植物属が落花生属であり、 その検出用プライマーセットが、 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、 請求項 1 3〜 1 6 のいずれか 1項記載のキット。
2 1 . 配列番号 3 4からなる配列を有する落花生属検出用プローブをさらに含む、 請求項 2 0記載のキッ卜。
2 2 . 標準植物試料としてスターチス試料をさらに含む、請求項 1 5記載のキット。
2 3 . 標準植物がスターチスであり、かつ、検出対象の特定植物属がソバ属であり、 スターチスおよびソパについての検量線を作製するための、 スターチスの増幅標的配列 を含む DNAとソバの増幅標的配列を含む DNAとを連結して含む検量線作製用プラスミド をさらに含む、 請求項 1 3記載のキット。
2 4 . 標準植物がスターチスであり、 かつ、 検出対象の特定植物属が落花生属であ り、 ス夕一チスおよび落花生についての検量線を作製するための、 スターチスの増幅標 的配列を含む DNAと落花生の増幅標的配列を含む DNAとを連結して含む検量線作製用プ ラスミドをさらに含む、 請求項 1 3記載のキット。
2 5 . 食品または食品原材料中のソバ属に属する植物を検出するための方法に用いる ためのキットであって、 配列番号 1 4記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列 番号 1 5記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソバ属検出用プライマ一セ ッ卜を含む、 上記キッ卜。
2 6 . 配列番号 6 4からなる配列を有するソバ属検出用プローブをさらに含む、 言青 求項 2 5記載のキット。
2 7 . 食品または食品原材料中の落花生属に属する植物を検出するための方法に用 いるためのキットであって、 配列番号 2 1記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、 配列番号 2 6、 6 5または 6 6記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花 生属検出用プライマ一セットを含む、 上記キット。
2 8 . 配列番号 3 4からなる配列を有する落花生属検出用プロ一ブをさらに含む、 請求項 2 7記載のキット。
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