JP2002536024A - 蛍光結合型ｐｃｒを用いて食品中の遺伝子改変ｄｎａを定量的に検出するための試験キットおよび方法 - Google Patents

蛍光結合型ｐｃｒを用いて食品中の遺伝子改変ｄｎａを定量的に検出するための試験キットおよび方法

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JP2002536024A
JP2002536024A JP2000598658A JP2000598658A JP2002536024A JP 2002536024 A JP2002536024 A JP 2002536024A JP 2000598658 A JP2000598658 A JP 2000598658A JP 2000598658 A JP2000598658 A JP 2000598658A JP 2002536024 A JP2002536024 A JP 2002536024A
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ローター、フランク−ローマン
グローマン、ラッツ
ステーシュ、ロジャー
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バイオインサイド ゲーエムベーハー
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

(57)【要約】 本発明は食物中のDNAを定性的かつ定量的に検出するための試験キットおよび特異的方法に関する。本発明は、遺伝子改変生物（GMO）由来、好ましくはRRS遺伝子およびBt-176トウモロコシ遺伝子由来の食品に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、遺伝子改変生物（GMO）由来の食品中のDNAの定性的かつ定量的検出
のための試験キットならびに方法に関する。さらに、本発明は前記検出における
特異的なプライマーおよびプローブDNA配列の使用に関する。
【０００２】 食品製造には、食品の成分および組成について消費者に対してそれらの品質保
証をし、情報提供をすることが包含される。
【０００３】 1998年９月以来、欧州では欧州理事会による指令第1139/98号が施行されてお
り、それに基づいて遺伝子改変生物由来のDNA（GMO DNA）を含む食品には表示し
なければならない。同指令は、将来の使用に向けてGMO DNA量の限界値をより低
く設定することを推奨しており、それを上回る食品は表示しなければならない。
この指令についてのGMO DNAの検出能に関する監視およびその限界値の遵守には
、高い感度および再現性をもって操作し得るGMO DNAの定量的検出系が必要とさ
れる。
【０００４】 現在、GMO DNAはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて検出されている（Hupf
erら, 1997, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 205, 442-445）。GMO DNAの定量的
検出のためには、定量的競合PCR法が用いられている（Studerら, 1998, Z. Lebe
nsm. Unters. Forsch. 207, 207-213）。
【０００５】 定量的競合PCRでは、標的遺伝子を特定量の標準DNAの存在下で増幅する。該標
準DNAは標的遺伝子と同一のプライマーで増幅される。標的遺伝子と標準物とに
ついて得られたPCR増幅産物はサイズが異なるので、ゲル電気泳動で分離するこ
とができる。PCRの後、ゲル電気泳動で分離した該PCR産物を染色し、標的遺伝子
増幅産物および標準DNA増幅産物の量をデンシトメトリーで測定する。標準DNAコ
ピーを特定量添加すると、標的遺伝子コピーの量を、標準PCR産物を標的PCR産物
と比較することにより算出することができる。
【０００６】 遺伝子改変DNAは一般にPCRを用いて検出することができ、またその量は定量的
競合PCRを用いて定量的に検出することができるが、これらの方法は製品、特に
食品のルーチン分析にはあまり適していない。該方法は自動化するには適当でな
く、PCR産物の混入（疑陽性の結果）のリスクを伴い、また不十分な精度という
結果を生ずる。
【０００７】 したがって本発明の目的は、食品中の遺伝子改変DNAを検出する方法であって
、混入が生じず、高度な自動化が可能であり高い再現性のある分析を行うことの
できる方法を提供することであった。
【０００８】 本発明によれば、前記目的は、図１に図式的に示したように、蛍光結合型PCR
を用い、特定の変更工程に対して特定のプライマーとプローブとの組み合わせを
使用することによって、達成することができる。
【０００９】 蛍光結合型PCRは、それ自体公知の方法である。すなわち、US 5,210,015およ
びUS 5,487,972（TaqMan(登録商標)）には、３種のオリゴヌクレオチド（２種の
プライマーおよび１種の発蛍光性プローブ）を利用するPCR反応について記載さ
れている。該プローブは、その5'末端がリポーター蛍光色素（フルオレセイン誘
導体）で標識されており、一方その3'末端が消光剤色素（ローダミン誘導体）を
保持しさらにリン酸残基でブロックされている、オリゴヌクレオチドからなる。
特定波長（488 nm）で完全なプローブを励起させて蛍光を発させると、リポータ
ー色素の蛍光は、消光剤と空間的に近接しているために蛍光エネルギー転移（FE
T）により抑制されるであろう。PCRの際、まず、該プローブとプライマーとがDN
Aの鋳型鎖にハイブリダイズする。伸長段階において、プライマーとプライマー
の間に配置される該プローブはTaqポリメラーゼと接触し、Taqポリメラーゼのエ
キソヌクレアーゼ活性によりニックを入れられる。プローブ加水分解の結果、リ
ポーターと消光剤との間の空間的近接性、すなわちFETはもはや存在しなくなる
。リポーターの蛍光は、各PCRサイクルと共にPCR産物の蓄積に伴って増加するで
あろう。100％結合していないプローブ分子は、Taqポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性が活性化されるより前であっても排除されるであろうから、生ずるシ
グナルは厳密に配列特異的である。最後に、異なる色素の蛍光における変化を、
密封した反応容器中で、Perkin Elmer Applied Biosystems Division（PEABD）
により供給されるABIPRISM 7700等の市販の機器を用いて、サイクル毎に検出す
ることができる。
【００１０】 ここで本発明の検出は、最初に、当業者にはそれ自体公知の方法（Zimmermann
ら, 1998, Z. Lebensm. Unters. Forsch. A 207, 81-90を参照のこと）により食
品試料から全DNAを抽出し、さらに図１に図示するように以下の(a)および(b)： (a)：トランスジーン特異的蛍光標識プローブS1ならびに２種のトランスジー
ン特異的プライマーP1およびP2を用いて第１の反応容器中でPCR反応を行い、対
照と比較して蛍光放射の変化を測定することによる、全DNA中のトランスジーン
量の測定であって、但し第１の反応容器中でのトランスジーン測定のための内部
増幅対照（IAC）として、プライマーP1およびP2ならびに蛍光標識プローブS2に
加えて合成遺伝子断片（標的IAC DNA）を使用するものであり、またその断片は
プライマーP1およびP2に対する２箇所の結合部位ならびに蛍光標識プローブS2に
対する結合部位１箇所を有するものであり、さらにそのプローブS2は配列がプロ
ーブS1とは異なり、かつプローブS1とは異なる蛍光色素で標識されているもので
ある、前記測定； (b)：基準遺伝子の選択、そして、基準遺伝子特異的蛍光標識プローブS3なら
びに２種の基準遺伝子特異的プライマーP3およびP4を用いて第２の反応容器中で
PCR反応を行い、対照と比較して蛍光放射の変化を測定することによる、全DNA中
の基準遺伝子の量の測定であって、但し第２の反応容器中での基準遺伝子測定の
ための内部増幅対照（IAC）として、プライマーP3およびP4ならびに蛍光標識プ
ローブS2に加えて合成遺伝子断片（基準IAC DNA）を使用するものであり、また
その断片はプライマーP3およびP4に対する２箇所の結合部位ならびに蛍光標識プ
ローブS2に対する結合部位１箇所を有するものであり、さらにその蛍光標識プロ
ーブS2は標的遺伝子系中の蛍光標識プローブS2と同一であるが、その配列および
蛍光色素はプローブS3とは異なるものである、前記測定； ならびに最終的にはトランスジーンと基準遺伝子との量の比からの遺伝子改変DN
Aレベルの算出、 を行うことにより、実施される。
【００１１】 蛍光結合型PCRにおいて、検査される遺伝子コピーの量は、DNAを含まない対照
PCR反応と比較した、測定された蛍光の変化量と相関する。従って、測定された
蛍光の変化量に基づいて、検査した試料DNAの量を算出することができる。
【００１２】 本発明をより詳細に説明するために、以下に、本発明の内容において特定の用
語をいかに理解すべきかという定義を示す。
【００１３】 プライマー プライマーはDNAオリゴヌクレオチドである。適切な条件下では、プライマー
は、検出すべき遺伝子断片の相補的DNA配列に対してのみハイブリダイズする。
プライマーは、DNAポリメラーゼ酵素によるDNA合成の開始のための開始点として
機能する。遺伝子内の２種のプライマーの位置により、どの遺伝子断片をPCRに
より増幅し続いてそれを検出可能とするかが決まる。
【００１４】 プローブ プローブは、結合されたリポーター色素を有するDNAオリゴヌクレオチドであ
る。適切な条件下では、プローブは、検出すべき遺伝子断片の相補的DNA配列に
対してのみハイブリダイズする。
【００１５】 蛍光結合型PCR 蛍光結合型PCRにおいて、プローブは、プライマーとプライマーの間に位置す
る。PCR反応が成功すると、蛍光放射を誘導する光源の存在下でのプローブの蛍
光に変化が生ずる。プローブの蛍光放射における変化は、生成されるPCR産物の
量と相関し、従って本来検査される遺伝子コピーの量と相関する。蛍光放射を用
いて、検出すべき遺伝子の量を算出することができる（Heidら, 1996, Genome M
ethods 6, 986-994；Wittwerら, 1997, BioTechniques 22, 130-138）。
【００１６】 トランスジーン トランスジーンは、人為的に操作したヌクレオチド配列であると定義される。
例えば、それを用いて形質転換すると、ある生物が天然には存在しない別の生物
へ変わるようなヌクレオチド配列である。
【００１７】 基準遺伝子 基準遺伝子は、検出すべき生物種の全ての関連変異体に存在するヌクレオチド
配列として定義される。基準遺伝子は、トランスジーンの相対的定量において基
準値として機能する。基準遺伝子の量、すなわちそれらのコピー数を、定量化に
おいて100％と定め、続いてトランスジーンのコピー数をそれらと関連付ける。
【００１８】 標的DNA 標的DNAは、PCR系によって認識され、増幅されるヌクレオチド配列である。ヌ
クレオチド配列は様々な起源のものであってよい。基準遺伝子はゲノムDNAであ
り、かつ、ある生物種（例えばダイズまたはトウモロコシ）の全ての関連変異体
に存在する特定の遺伝子断片である。トランスジーンは特定のDNA断片を遺伝子
改変したDNAであり、該DNAの存在が検出対象である。標的IAC DNAは、本発明の
合成DNA断片に相当し、一方で特異的プライマーのヌクレオチド配列を含み、他
方で本発明の普遍的プローブS2のヌクレオチド配列を含む。
【００１９】 内部増幅対照（IAC） 内部増幅対照（IAC）は、特定のプライマーの組み合わせを用いたPCR反応の効
率を制御する。それは、本発明の標的IAC DNAまたは本発明の基準IAC DNA、およ
び本発明の普遍的プローブS2を含んでなる。
【００２０】 従って、本発明によれば、以下のパラメーターを測定することにより、食品中
の遺伝子改変DNAの量を測定可能である（図１を参照のこと）。
【００２１】 (1)全DNA中のトランスジーンの量を、プライマーP1およびP2ならびにプローブ
S1を用いて測定する。この測定は反応容器(A)中で行う。
【００２２】 (2)全DNA中の基準遺伝子の量を、プライマーP3およびP4ならびにプローブS3を
用いて測定する。この測定は反応容器(B)中で行う。
【００２３】 基準遺伝子に対するトランスジーンの比率から、特定のタイプの生物のDNA中
の、遺伝子改変DNAの割合、および、検査すべき関連DNAの量を反映する基準遺伝
子の量が導かれる。
【００２４】 (3)PCR反応毎の効率を、本発明のプライマーP1〜P4、プローブS2、ならびに標
的IAC DNAおよび基準IAC DNAを用いて、上記２つの反応容器(A)および(B)中で測
定する。
【００２５】 特異的内部増幅対照（IAC）は、本発明の、トランスジーンに特異的なプライ
マーP1およびP2、基準遺伝子に特異的なプライマーP3およびP4、本発明の普遍的
プローブS2、ならびに本発明のトランスジーン系に対する標的IAC DNAおよび本
発明の基準遺伝子系に対する基準IAC DNAを含んでなる。該IACはDNAの性質を制
御できる。この目的のために、トランスジーン系および基準遺伝子系の両方のPC
R効率を測定する。
【００２６】 本発明のこれらの４つのプライマー／プローブ系（図１を参照のこと）を提供
することにより、DNA量とその性質の両方を制御することができ、それによりDNA
定量に必要かつ十分な前提条件をもたらすことができる。
【００２７】 本発明によれば、２つのPCR系に用いるプローブが異なる蛍光色素で標識され
ているため、反応容器毎に両系を同時に測定することができる。例えば、プロー
ブS1およびS3は同一のリポーター色素で標識し、S2は異なるリポーター色素で標
識することができる。
【００２８】 本発明の好適な実施形態においては、例えば食品中にしばしば存在するトラン
スジーンとして、ラウンドアップ・レディ(Roundup Ready)大豆遺伝子（RRS遺伝
子）およびBt-176トウモロコシ遺伝子を検出することができる。しかし、本発明
の検出法はまた、他のトウモロコシトランスジーン（例えばBt-11トウモロコシ
中のトランスジーン）に対して、あるいは、GMO DNAの非特異的検出によるスク
リーニング法における35S CMVプロモーターの検出において、または、将来、食
品市場に導入されるトランスジーン全てに対して、本発明の検出法を使用するこ
とができ、また非常に好適である。
【００２９】 本発明の特に好適な実施形態においては、新規の配列である配列番号３もしく
は配列番号３a、および新規の配列である配列番号４もしくは配列番号４a、また
は欠失、置換、もしくは付加により得られるそれらの変異体であって、化学合成
法により製造可能なものを、それぞれプライマーP1およびP2として用いて、配列
番号１の核酸配列を有するRRS遺伝子の本発明による検出を実施する。該配列は
、専門家の算出によると20,000〜30,000種の食品に含まれている。新規の核酸配
列である配列番号２もしくは配列番号２a、または欠失、置換、もしくは付加に
より得られるそれらの変異体は、プローブS1として特に好適であることが判明し
た。またそれらの調製は化学合成法で行うことができる。
【００３０】 レクチン遺伝子は本発明のRRS遺伝子の検出において基準遺伝子として特に好
適であることが判明した。基準遺伝子としてレクチン（配列番号１１）を用いる
場合、本発明の好適な実施形態においては、配列番号６もしくは配列番号６a、
および配列番号７の配列、または欠失、置換、もしくは付加により得られるそれ
らの変異体を、プライマーP3およびP4として用いる。新規の核酸配列である配列
番号５、または欠失、置換、もしくは付加により得られるその変異体は、プロー
ブS3として特に好適であることが判明した。プローブS1と同様、プローブS3はそ
の5'末端またはその3'末端がリポーター蛍光色素で標識されており、その反対の
末端が消光剤で標識されている。
【００３１】 本発明によれば、トランスジーン測定および基準遺伝子測定においては内部増
幅対照を用いる。RRS遺伝子の検出においては、配列番号８の核酸配列、または
欠失、置換、もしくは付加により得られるその変異体が、トランスジーン測定に
特に好適な内部増幅対照（標的IAC DNA)であること、配列番号１０もしくは配列
番号１０aの核酸配列、または欠失、置換、もしくは付加により得られるその変
異体が、基準遺伝子測定に特に好適な内部増幅対照であることが判明した。
【００３２】 本発明の特に好適な別の実施形態においては、配列番号１３の配列をプライマ
ーP1として、配列番号１４の配列、または少なくとも80％の相同性を有するその
変異体をプライマーP2として、Bt-176トウモロコシ遺伝子（その配列は公知であ
り、WO 93/07278に掲載されている）の検出に用いる。配列番号１２の配列、ま
たは少なくとも80％の相同性を有するその変異体は、プローブS1として特に好適
であることが判明した。該プローブS1は、下記の通り、リポーター色素および消
光剤で標識されている。
【００３３】 本発明によれば、トウモロコシのインベルターゼ遺伝子（その配列はXu J.ら
Plant Physiol. 1995 Jul., 108(3), 1293-4に掲載されている）を、Bt-176トウ
モロコシ遺伝子を検出するための基準遺伝子として用いる。この基準遺伝子を用
いる場合、配列番号１６の配列をプライマーP3として、配列番号１７の配列、ま
たは少なくとも80％の相同性を有するその変異体をプライマーP4として、本発明
の好適な実施形態において用いる。この場合、配列番号１５の配列、またはその
変異体を基準特異的プローブS3として用いる。同様に、プローブS3は下記の通り
標識されている。
【００３４】 内部増幅対照としては、配列番号１８の配列、および配列番号１９の配列、ま
たは少なくとも80％の相同性を有するそれらの変異体を、本発明のBt-176トウモ
ロコシ遺伝子の検出方法において、それぞれ標的IAC DNAおよび基準IAC DNAとし
て用いる。
【００３５】 好適な実施形態においては、配列番号９の核酸配列、または欠失、置換、もし
くは付加により得られる少なくとも80％の相同性を有するその変異体を、全ての
検出における普遍的プローブS2として用いる。プローブS2は、その5'末端もしく
は3'末端にて、プローブS1およびS3の色素(テトラクロロ-6-カルボキシフルオレ
セインなど)とは異なるリポーター蛍光色素、好ましくは、6-カルボキシフルオ
レセイン、テトラクロロ-6-カルボシキフルオレセイン、2,7-ジメトキシ-4,5-ジ
クロロ-6-カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイ
ンから選択されるフルオレセイン誘導体によって標識される。該プローブは、も
う一方の配列末端にて消光剤で、好ましくはプローブS1およびS3と同一のローダ
ミン誘導体で標識される。6-カルボキシテトラメチルローダミンがこの目的に特
に好適であることが判明した。
【００３６】 同様に、プローブS1およびS3は、その5'末端もしくは3'末端にて、リポーター
蛍光色素、好ましくは6-カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ-6-カルボシ
キフルオレセイン、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン
、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセインから選択されるフルオレセイン誘
導体で標識される。特に好適な実施形態においては、6-カルボキシフルオレセイ
ン（FAM）を標識として用いる。ローダミン誘導体、最も好ましくは6-カルボキ
シテトラメチルローダミンを、消光剤としてもう一方の配列末端にて用いる。
【００３７】 本発明は、本明細書および特許請求の範囲に具体的に記載されたプライマーお
よびプローブ配列だけでなく、欠失、置換、もしくは付加により得られるそれら
の変異体であって、明示した配列に対し少なくとも80％、好ましくは少なくとも
90％の相同性を有し、明示した配列と同程度の良好な試験特異性および試験感度
を確保できるものにも関する。
【００３８】 プライマーおよびプローブ配列は全て、当業者には周知の方法に従って化学合
成法で調製することができる。RRS遺伝子配列以外の、レクチン遺伝子配列、Bt-
176遺伝子配列、インベルターゼ遺伝子配列、およびプライマー配列No.6は、ど
れも新規の配列である。それらの配列は本明細書の一部である配列表に示す。
【００３９】 高度に特異的かつ高感度である本発明の方法を用いることによって初めて、工
程設計ならびに特異的なプライマーとプローブとの組み合わせにより、本試験の
精度およびGMO DNA検出限界を、１製品に対する試験毎に特定することができる
。
【００４０】 前記検出方法だけでなく、本発明はまた、食品中の遺伝子改変DNA、特にRRS遺
伝子およびBt-176トウモロコシ遺伝子を検出するために用いる対応する試験キッ
トにも関する。好ましくは、上記配列のプローブ、プライマー、および内部増幅
対照を用いる。特に好適な実施形態においては、配列番号９の配列を普遍的プロ
ーブS2として用いる。
【００４１】 本発明によれば、試験キットは、トランスジーン特異的な蛍光標識プローブS1
ならびに２種のトランスジーン特異的プライマーP1およびP2、基準遺伝子特異的
な蛍光標識プローブS3、ならびに２種の基準遺伝子特異的プライマーP3およびP4
、ならびに内部増幅対照としての蛍光標識プローブS2（このプローブはその配列
および蛍光標識の両方の点でプローブS1およびS3と異なる）、プライマーP1およ
びP2に対する２箇所の結合部位ならびにプローブS2に対する結合部位１箇所を有
する合成遺伝子断片（標的IAC DNA）、プライマーP3およびP4に対する２箇所の
結合部位ならびにプローブS2に対する結合部位１箇所を有する合成遺伝子断片（
基準IAC DNA）を含む。
【００４２】 GMO DNAの検出はまた、本発明のハイブリダイゼーションプローブおよび工程
設計を用いた蛍光結合型PCRによって、高精度で実施することができることが判
明した。この目的のために、各回、２種の発蛍光性プローブを、プローブS1単体
、およびプローブS3単体の代わりに用いる。１つのプローブの3'末端を供与色素
（フルオレセイン誘導体）で標識する一方、隣接するプローブの5'末端を受容色
素（例えば、Cy5、Light Cycler Red 640、またはLight Cycler Red 710）で標
識する。プローブのヌクレオチド配列は、そのすぐ隣接したプローブが標的DNA
にハイブリダイズするように、選択される。
【００４３】 これにより、供与色素と受容色素とが空間的に直接近接する。このプローブ対
を特定波長で励起させて蛍光を発させるとき、供与色素の蛍光は受容色素へと転
移される。供与色素および受容色素は、異なる波長で発光するように選択される
。受容色素発光の増大は、標的DNAへの両プローブのハイブリダイゼーションの
後、供与色素の励起エネルギーが受容色素へ転移される際にだけ測定することが
できる。生成されるPCR産物が多いほど、より多くのプローブ対がハイブリダイ
ズすることができ、また受容色素の発光放射の増大も大きくなる。TaqMan技法に
おいては、生起される蛍光放射量は生成されるPCR産物量に比例し、従って検査
の開始時のDNA量に比例する。
【００４４】 実施例に関して、以下に本発明をより詳細に説明する。
【００４５】実施例１： FLUKA社（Deisenhofen, Germany）製のダイズ粉SB2中のRRS遺伝子の検出 各回200mgのダイズ粉を用い、全DNAをCTAB法（Zimmermannら. 1998, Z. Leben
sm. Unters. Forsch. A 207, 81-90）によって単離した。その収量は、ダイズ粉
200mg当たりDNA約500μgであった。単離したDNAは、トランスジーン系または基
準遺伝子系存在下でのPCR反応にて解析した。この目的のために、構成成分およ
び方法には以下記載のものを用いた。プライマーおよびプローブを含む構成成分
は全て、PE Applied Biosystems Division社（Weiterstadt, Germany）から購入
した。TaqMan PCR反応混合物の調製、PCR反応の実施、およびPCRホットステージ
および蛍光検出器（PEABD Model 7700またはModel LS50B）の操作は、機器製造
業者の説明書（User's Manual, ABI Prism 7700 Sequence Detection System, P
E Applied Biosystems Division, Foster City, USA 1997、およびUser's Manua
l, PE ABD LS50B）に従って実施した。
【００４６】 単離したDNAをPCR増幅するために、トランスジーン系および基準遺伝子系（PE
ABD Order No. N80105080）のそれぞれについて、以下の構成成分をPCR反応容器
中にて混合した。反応当たり50μl容量でのPCR反応を行った。
【００４７】トランスジーン系（ラウンドアップ・レディ系／RRS） 基準遺伝子系（レクチン系） 以下のピペッティング処方法をダイズ粉試料の定量に用いた（反応当たりの反
応容量：50μl）。
【００４８】 (i) NTC 各回、系（トランスジーンおよび基準遺伝子）当たり２つの無鋳型対照（NTC
）反応液を調製した。IACを除き、これらの反応液にはどのようなDNAも含まず、
混入の無い媒質中ではS1およびS3プローブのリポーター蛍光放射を全く生じない
。これらの陰性対照によって擬陽性の結果が生じないことが保証される。
【００４９】 (ii) 標準直線 各回、100％のトランスジェニックラウンドアップ・レディDNAの４種の異なる
希釈物から反応液を３つずつ調製した。10ng、５ng、0.5ng、および0.25ngのDNA
が該希釈物中に用いられた。これらの12の反応液を、上記処方法に従い、トラン
スジーン系および基準遺伝子系の両方について、調製した。すなわち、２つの標
準直線（トランスジーン系で１つと基準遺伝子系で１つ）を得るために、24のPC
R反応液を調製した。
【００５０】 (iii) 試料の検査 各回、ラウンドアップ・レディダイズが２％含量で含まれるダイズ粉から抽出
したDNAの２種の異なる希釈物から反応液を２つずつ調製した。10ngおよび５ng
のDNAが該希釈物に用いられた。これらの４つの反応液を、トランスジーン系お
よび基準遺伝子系の両方について、上記の処方法に従って調製した。すなわち、
８つのPCR反応液を、試料DNAを調べるために調製した。
【００５１】 PCR反応を行なうためのピペッティング操作の完了後、全部で36個の反応容器
をPEABD Model 7700配列検出器のホットステージ中に移した。PCR増幅の際に、
以下の温度設定に調整した。
【００５２】 温度条件 10分 95℃ 保持 15秒 95℃ 45 60秒 60℃ サイクル ２分 25℃ 保持 PEABD Model 7700配列検出器を製造業者の説明書に従って稼動させた。PCR条
件は、プライマーおよびプローブの設計、プライマーおよびプローブの濃度、Mg
Cl2濃度、ならびにオリゴヌクレオチドアニーリング温度を様々に変化させるこ
とにより、最適化した。PCR反応の際、蛍光放射の変化は、PEABD Model 7700配
列検出器の蛍光検出器によって測定した。
【００５３】 生成したPCR産物の量の測定、すなわち、用いた標的遺伝子コピーの量の測定
には、いわゆる閾値サイクル値またはCt値をTaqMan技法にて用いる。
【００５４】 標準直線を用いて、IAC陽性値について得られたCt値を遺伝子コピーの相対数
に変換した。基準遺伝子コピーの相対値に対するトランスジーンコピーの相対値
の比率から、試験試料のGMO DNAと全ダイズDNAとの割合が導かれる。実際、本実
施例において試験した、２％割合のラウンドアップ・レディダイズ粉FLUKA SB2
No.85478を含むダイズ粉試料についての、基準遺伝子DNAに対するトランスジー
ンDNAの定量は2.00％±0.30％を示した。精度幅を決定するための誤差計算は、U
ser Bulletin #2, ABI Prism 7700 Sequence Detection System, 1997, p.34に
従って行った。すなわち、本明細書に記載された系は、意図した機能を完全に満
たすものである。
【００５５】実施例２： FLUKA社製のMZ 2 トウモロコシ粉中のBt-176トウモロコシ遺伝子の検出 実施例１に記載したのと同様のやり方で、上記の配列番号12〜19を用いて、20
0mgのトウモロコシ粉中のBt-176トウモロコシDNAの割合を測定した。本実施例に
おいて試験した、２％割合のFLUKAトウモロコシ粉MZ 2 No.63198を含むトウモロ
コシ粉試料についての、基準遺伝子DNAに対するトランスジーンDNAの定量は1.91
±0.25％を示した。誤差計算は、実施例１と同様のやり方で行った。
【００５６】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB20 DA12 DA13 DA14 DA30 FB02 FB07 FB12 GC15 JA20 2G054 AA10 AB10 CA22 CE02 EA03 GB02 JA06 JA20 4B024 AA07 AA11 CA04 CA07 CA09 HA12 4B063 QA01 QQ09 QQ16 QQ35 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR56 QR66 QS25 QS34 QX02

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 食品中の遺伝子改変DNA（トランスジーン）を定量的に検出
    する方法であって、該検出を蛍光結合型PCRを用いて行うことを特徴とし、さら
    に、食品試料由来の全DNAの抽出、および以下の(a)および(b)： (a)：トランスジーン特異的蛍光標識プローブS1ならびに２種のトランスジー
    ン特異的プライマーP1およびP2を用いて第１の反応容器中でPCR反応を行い、対
    照と比較して蛍光放射の変化を測定することによる、全DNA中のトランスジーン
    量の測定であって、但し第１の反応容器中でのトランスジーン測定のための内部
    増幅対照（IAC）として、プライマーP1およびP2ならびに蛍光標識プローブS2に
    加えて合成遺伝子断片（標的IAC DNA）を使用するものであり、またその断片は
    プライマーP1およびP2に対する２箇所の結合部位ならびに蛍光標識プローブS2に
    対する結合部位１箇所を有するものであり、さらにそのプローブS2は配列がプロ
    ーブS1とは異なり、かつプローブS1とは異なる蛍光色素で標識されたものである
    、前記測定； (b)：基準遺伝子の選択、そして、基準遺伝子特異的蛍光標識プローブS3なら
    びに２種の基準遺伝子特異的プライマーP3およびP4を用いて第２の反応容器中で
    PCR反応を行い、対照と比較して蛍光放射の変化を測定することによる、全DNA中
    の基準遺伝子の量の測定であって、但し第２の反応容器中での基準遺伝子測定の
    ための内部増幅対照（IAC）として、プライマーP3およびP4ならびに蛍光標識プ
    ローブS2に加えて合成遺伝子断片（基準IAC DNA）を使用するものであり、また
    その断片はプライマーP3およびP4に対する２箇所の結合部位ならびに蛍光標識プ
    ローブS2に対する結合部位１箇所を有するものであり、さらにその蛍光標識プロ
    ーブS2は標的遺伝子系中の蛍光標識プローブS2と同一であるがその配列および蛍
    光色素はプローブS3とは異なるものである、前記測定； ならびに最終的にはトランスジーンと基準遺伝子との量の比からの遺伝子改変DN
    Aレベルの算出、を伴う上記方法。
  2. 【請求項２】 ラウンドアップ・レディダイズ遺伝子（RRS遺伝子）をトラ
    ンスジーンとして検出することを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 配列番号２もしくは配列番号２aの核酸配列、または欠失、
    置換、もしくは付加により得られる少なくとも80％の相同性を有するそれらの変
    異体をプローブS1として使用することを特徴とする、請求項１または２に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 配列番号３もしくは配列番号３aの核酸配列、および配列番
    号４もしくは配列番号４aの核酸配列、または欠失、置換、もしくは付加により
    得られる少なくとも80％の相同性を有するそれらの変異体を、それぞれプライマ
    ーP1およびプライマーP2として使用することを特徴とする、請求項１または２に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 配列番号１１のレクチン遺伝子を基準遺伝子として使用する
    ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 配列番号５の核酸配列、または欠失、置換、もしくは付加に
    より得られる少なくとも80％の相同性を有するそれらの変異体を、プローブS3と
    して使用することを特徴とする、請求項１、２または５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 配列番号６もしくは配列番号６aの核酸配列、および配列番
    号７の核酸配列、または欠失、置換、もしくは付加により得られる少なくとも80
    ％の相同性を有するそれらの変異体を、それぞれプライマーP3およびプライマー
    P4として使用することを特徴とする、請求項１、２または５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 配列番号８もしくは配列番号８aの核酸配列、または欠失、
    置換、もしくは付加により得られる少なくとも80％の相同性を有するその変異体
    を、トランスジーン測定用の内部増幅対照である合成遺伝子断片（標的IAC DNA
    ）として使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 配列番号１０もしくは配列番号１０aの核酸配列、または欠
    失、置換、もしくは付加により得られる少なくとも80％の相同性を有するその変
    異体を、基準遺伝子測定用の内部増幅対照である合成遺伝子断片（基準IAC DNA
    ）として使用することを特徴とする、請求項１および５〜７のいずれか１項に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 Bt-176トウモロコシ遺伝子をトランスジーンとして検出す
    ることを特徴とする請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 配列番号１２の配列、または欠失、置換、もしくは付加に
    より得られる少なくとも80％の相同性を有するその変異体を、プローブS1として
    使用することを特徴とする、請求項１または１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 配列番号１３の配列、および配列番号１４の配列、または
    欠失、置換、もしくは付加により得られる少なくとも80％の相同性を有するそれ
    らの変異体を、それぞれプライマーP1およびプライマーP2として使用することを
    特徴とする、請求項１または１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 トウモロコシのインベルターゼ遺伝子を基準遺伝子として
    使用することを特徴とする、請求項１または１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 配列番号１５の配列、または欠失、置換、もしくは付加に
    より得られる少なくとも80％の相同性を有するその変異体を、プローブS3として
    使用することを特徴とする、請求項１、１０または１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 配列番号１６の配列、および配列番号１７の配列、または
    欠失、置換、もしくは付加により得られる少なくとも80％の相同性を有するそれ
    らの変異体を、それぞれプライマーP3およびプライマーP4として使用することを
    特徴とする、請求項１、１０または１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 配列番号１８の配列、または欠失、置換、もしくは付加に
    より得られる少なくとも80％の相同性を有するその変異体を、標的IAC DNAとし
    て使用することを特徴とする、請求項１、および１０〜１２のいずれか１項に記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 配列番号１９の配列、または欠失、置換、もしくは付加に
    より得られる少なくとも80％の相同性を有するその変異体を、基準IAC DNAとし
    て使用することを特徴とする、請求項１、および１３〜１５のいずれか１項に記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】 配列番号９の核酸配列、または欠失、置換、もしくは付加
    により得られる少なくとも80％の相同性を有するその変異体を、プローブS2とし
    て使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 プローブS2が、その5'末端または3'末端にて、プローブS1
    およびS3のものとは異なるリポーター蛍光色素、好ましくは6-カルボキシフルオ
    レセイン、テトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン、2,7-ジメトキシ-4,5-ジ
    クロロ-6-カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイ
    ンから選択されるフルオレセイン誘導体で標識されており、さらにプローブS2が
    その反対の配列末端にて消光剤、好ましくはプローブS1およびS3のものと同一の
    ローダミン誘導体で、好ましくはTAMRAで標識されていることを特徴とする、請
    求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 プローブS1およびS3が、その5'末端または3'末端にて、リ
    ポーター蛍光色素、好ましくは6-カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ-6-
    カルボキシフルオレセイン、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオ
    レセイン、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセインから選択されるフルオレ
    セイン誘導体で、好ましくは6-カルボキシフルオレセイン（FAM）で標識されて
    おり、さらにその各々の反対の末端にて消光剤、好ましくはローダミン誘導体で
    、好ましくは6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)で標識されているこ
    とを特徴とする、請求項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】 蛍光結合型PCRを用いた食品中の遺伝子改変DNA（トランス
    ジーン）の定量的検出のための試験キットであって、トランスジーン特異的蛍光
    標識プローブS1、および２種のトランスジーン特異的プライマーP1およびP2、基
    準遺伝子特異的蛍光標識プローブS3、および２種の基準遺伝子特異的プライマー
    P3およびP4、ならびに、プローブS1およびS3とはその配列と蛍光標識の両方の点
    で異なっている内部増幅対照としての蛍光標識プローブS2、プライマーP1および
    P2に対する２箇所の結合部位ならびにプローブS2に対する結合部位１箇所を有す
    る合成遺伝子断片（標識IAC DNA）、ならびにプライマーP3およびP4に対する２
    箇所の結合部位ならびにプローブS2に対する結合部位１箇所を有する合成遺伝子
    断片（基準IAC DNA）を含む、前記キット。
  22. 【請求項２２】 RRS遺伝子の検出に用いられる請求項２１記載の試験キッ
    ト。
  23. 【請求項２３】 Bt-176トウモロコシ遺伝子の検出に用いられる請求項２１
    記載の試験キット。
  24. 【請求項２４】 プローブS2として配列番号９の配列または少なくとも80％
    の相同性を有するその変異体を含むことを特徴とする、請求項２１〜２３のいず
    れか１項記載の試験キット。
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