KR100439168B1 - 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 ｄｎａ 증폭 키트 및이를 이용한 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법 - Google Patents

유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 ｄｎａ 증폭 키트 및이를 이용한 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법 Download PDF

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Abstract

유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트 및 이를 이용한 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) (ⅰ) 식물체로부터 분리된 DNA 주형, (ⅱ) 5'→3' 누클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소, (ⅲ) 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로머터에 대하여 혼성화 되는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 (ⅳ) 상기 전방향 프라이머와 역방향 프라이머가 혼성화 되는 상기 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위 사이에서 상기 프로머터와 혼성화 되며, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 형광성 리포터 분자가 결합되어 있고, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 상기 형광성 리포터 분자의 형광을 소멸시키는 형광 소멸자가 결합되어 있는 올리고 누클레오티드 프로브를 포함하는 DNA 증폭 반응 혼합물을 이용하여 상기 분리된 DNA 주형을 증폭하는 단계; 그리고, (b) 상기 리포터로부터 유래되는 형광의 세기를 측정하는 단계를 포함하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법 및 DNA 증폭 키트에 관한 것이다.

Description

유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 ＤＮＡ 증폭 키트 및 이를 이용한 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법{DNA Amplification Kits for Detecting Genetically-Modified Plants Quantitatively and Methods Using the Same}
본 발명은 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트 및 이를 이용한 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법에 관한 것이다.
분자생물학적 기술을 이용하여 외래 DNA 서열들을 재조합하여 새로운 DNA 단편을 조립하고 이들을 식물 또는 동물 등의 생물체의 게놈 DNA 내에 도입할 수 있게 되었다. 유전자 변형 생물체 (Genetically-modified organisms: GMO)는 이러한 연구의 산물이다.
생물체에 외래 유전자가 도입되면 원래는 존재하지 않던 단백질 (non-natural protein)을 합성할 수 있는 능력을 소유하게 된다. 특히, 식물에 외래 유전자를 도입하는 이유는 주로 병충해로부터 농작물을 보호하기 위해서이다. 또한, 신품종 개발기간의 단축, 작물의 수량과 품질의 개선, 고부가가치 물질의 생산 (의약품, 비타민, 바이오 폴리머 등), 작물의 영양학적 품질 개선 등의 이유로 유전자 변형 식물체를 제조하고 있다. 한편, 최근에 많이 제조되고 있는 유전자 변형 식물체는 곤충 유충 또는 제초제에 대한 저항성을 갖는 것이다. 식용 작물들 중에 가장 많이 재배되고 있는 유전자 변형 식물체는 콩, 옥수수 및 유채 등이다.
한편, 유전자 변형 식물체에 대한 표시가 국내외에서 커다란 관심사로 등장하고 있다. 특히, 국내에서 소비되는 콩의 90.5%, 옥수수의 98.8%가 수입에 의존하고 있기 때문에, 국내에도 상당한 물량의 유전자 변형 작물들이 도입되고 있는 실정이다. 국내 수입작물에 있어서 콩의 수입량은 약 93 만톤 (1999년도기준), 옥수수의 경우에는 약 495 만톤으로 콩 보다 약 5배 정도 많이 수입되고 있다. 이에, 상기 수입 작물들에 대한 신속 정확한 유전자 변형 식물체 검출 방법이 요구되어 다양한 방법들이 개발되고 있다.
유전자 변형 식물체를 검출하기 위한 키트로서 현재 시판되고 있는 것은, 일본국 TaKaRa사에서 개발된 키트 (PCR Screening Kit for GM Maize Ver. 2.0) 및 스위스국 Biosmart에서 개발된 키트 (Allin 1.0) 등이 있다. 그러나, 상기 키트는 정성적인 검출을 위해 이용되는 키트이고, 대한민국 특허출원 제 2000-23539 호의 명세서에 개시된 바와 같이 높은 빈도로 잘못된 양성 밴드를 출현시키는 문제점이 있다.
한편, 일반 소비자들에게 시판되는 식용 작물 (예: 옥수수, 콩 등)에 대하여 유전자 변형 식물체의 함량을 표시할 것을 의무화 하는 움직임이 전 세계적으로 일어나고 있으나, 유전자 변형 식물체를 정량적으로 검출할 수 있는 효율적이고, 정확성이 높은 방법은 개발되어 있지 않은 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상기한 당업계의 요구를 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus)의 35S 프로모터를 이용하여 유전자 변형된 다양한 유전자 변형 식물체를 정량적으로 검출하는 데 적합한 특정의 35S 프로모터 부위를 규명하고, 상기 부위에 작용하여 DNA 증폭을 할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트를 제공하는 데 있다.
도 1은 종래의 리포터-형광 소멸자 프로브 분석 방법을 도시적으로 나타낸 모식도;
도 2a는 4종류의 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터의 염기 서열을 을 배열한 도면;
도 2b는 4종류의 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터의 염기 서열을 을 배열한 도면;
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 측정된 형광의 세기의 변화를 나타낸 그래프; 및
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 얻어진 표준곡선 및 이를 통하여 미지의 시료를 정량하는 것을 나타내는 그래프.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (ⅰ) 식물체로부터 분리된 DNA 주형, (ⅱ) 5'→3' 누클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소, (ⅲ) 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로머터에 대하여 혼성화 되는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 (ⅳ) 상기 전방향 프라이머와 역방향 프라이머가 혼성화 되는 상기 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위 사이에서 상기 프로머터와 혼성화 되며, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 형광성 리포터 분자가 결합되어 있고, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 상기 형광성 리포터 분자의 형광을 소멸시키는 형광 소멸자(quencher)가 결합되어 있는 올리고 누클레오티드 프로브를 포함하는 DNA 증폭 반응 혼합물을 이용하여 상기 분리된 DNA 주형을 증폭하는 단계; 그리고, (b) 상기 리포터로부터 유래되는 형광의 세기를 측정하는 단계를 포함하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 이용되는 DNA 증폭 방법은 미합중국 특허 제 5,538,848 호 및 제 5,952,202 호에 개시된 리포터-형광 소멸자 프로브 분석 방법을 변형한 것이다. 상기 리포터-형광 소멸자 프로브 분석 방법은 첨부한 도 1에 도시된 바와 같은 과정으로 이루어져 있다. 도 1을 참조하여 설명하면, 5'→3' 누클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소에 의해 프라이머의 신장 (extension)이 이루어지고, 상기 효소가 형광성 프로브에 도달하게 되면, 누클레아제 활성에 의해 프로브를 절단하게 된다. 이어, 프로브의 형광성 형광성 리포터 분자는 형광 소멸자 분자로부터 이격되므로 자신의 고유의 형광을 회복하게 된다. 결국, 형광의 세기를 측정하게 되면, DNA 증폭을 정량적으로 분석할 수 있게 된다.
본 발명자들은 상기한 종래의 리포터-형광 소멸자 프로브 분석 방법을 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터를 이용하여 형질전환된 유전자 변형 식물체의 정량적 분석에 적용시켰다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적용될 수 있는 유전자 변형 식물체는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터를 이용하여 형질전환된 모든 식물체를 포함하고, 예컨대, 옥수수, 콩, 옥수수, 콩, 카놀라, 면, 파파야, 감자 및 토마토 등이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 첨부한 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위와 혼성화 되는 것이다.
본 명세서에서 용어 "혼성화 (hybridization)"는 DNA 주형과 비공유적으로 결합하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 프라이머가 DNA 증폭 반응에서 자신의 기능을 할 수 있을 정도로 DNA 주형과 비공유적으로 결합되어 있는 상태를 의미하는 것이다. 즉, DNA 주형에 대하여 완전하게 왓슨/크릭 염기-쌍을 이루는 것 뿐만 아니라, 부분적으로 왓슨/크릭 염기-쌍을 이루지 못하는 부분이 있다 하더라도, 프라이머로서의 기능을 할 수 있을 정도의 DNA 주형에 대한 결합능을 갖는 것을 의미한다.
서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위는 하기의 실시예 2에 기재된 바와 같이 서열의 보존성이 가장 우수한 부위로서, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터를 갖는 다양한 유전자 변형 식물체에 적용될 수 있도록 본 발명자들에 의해 엄격하게 선별된 것이다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 전방향 프라이머는 서열 2, 서열 4 및 서열 6 등의 염기 서열을 갖는 것이고, 상기 역방향 프라이머는 서열 3, 서열 5 및 서열 7 등의 염기 서열을 갖는 것이다.
상기 올리고 누클레오티드 프로브는, 바람직하게는, 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위와 혼성화 되는 것이고, 보다 바람직하게는 서열 8에 기재된 염기 서열을 갖는 것이다.
상기 올리고 누클레오티드 프로브의 말단에 인접한 부위에 결합하는 상기 형광성 리포터 분자는 5-카복시플루오레세인 (5-carboxyfluorescein: 5-FAM), 6-카복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein: 6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (tetrachlorofluorescein: TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (hexachlorofluorescein: HEX) 및 2',7'-디메톡시(dimethoxy)-4',5'-디클로로 (dichloro)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: JOE) 등이 바람직하다.
한편, 상기 형광 소멸자 분자는 테트라메틸(tetramethyl)-6-카복시로다민 (carboxyrhodamine: TAMRA), 테트라프로파노(tetrapropano)-6-카복시로다민(carboxyrhodamine: ROX), 시아닌 (cyanine), 안트로퀴논 (anthraquinone), 니트로티아졸 (nitrothiazole) 및 니트로이미다졸 (nitroimidazole) 등이 바람직하다.
가장 바람직하게는, 상기 형광성 리포터 분자는 FAM이고, 상기 형광 소멸자 분자는 TAMRA이다.
본 발명의 방법에 있어서, 형광의 세기를 측정하는 단계는 실시간으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법은 유전자 변형 식물체의 함량 정도를 이미 알고 있는 식물체로부터 얻은 DNA 주형을 이용하여 표준 곡선을 작성하는 단계; 및 미지의 DNA 시료를 이용하여 측정된 형광 값을 상기 표준곡선에 대입하여 유전자 변형 식물체의 함량을 확인하는 단계를 추가적으로 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, DNA 주형을 증폭하는 단계 이전에 상기 DNA 증폭 반응 혼합물에 우라실 N-글리코실라아제를 첨가하여 우라실을 포함하는 DNA 오염물을 제거하는 단계; 및 상기 우라실 N-글리코실라아제를 변성시키는 단계를 추가적으로 포함한다. DNA 증폭 반응 이전에 상기와 같은 전처리 과정을 거치는 경우에는 다양한 루트를 통하여 DNA 증폭 반응물에 함유된 오염물 (contamination)을 제거하여, 매우 정밀한 정량분석을 가능하게 한다.
상기 DNA 주형을 증폭하는 단계는 통상적인 DNA 증폭반응과 동일하게 변성 과정, 어닐링 과정 및 신장 반응 과정을 포함하나, 상기 어닐링 과정은 62℃-66℃에서 실시되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 64℃-66℃이다. 일반적으로 어닐링 과정은 60℃ 이하에서 실시하나, 본 발명의 경우에는 이 보다 높은 온도에서 실시되며, 이는 어닐링 조건을 보다 엄격하게 하는 것이고, 이에 따라 잘못된 어닐링을 막을 수 있으며, 결국 잘못된 DNA 증폭을 막을 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 5'→3' 누클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소; (b) 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로머터에 대하여 혼성화 되는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머; (c) 상기 전방향 프라이머와 역방향 프라이머가 혼성화 되는 상기 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위 사이에서 상기 프로머터와 혼성화 되며, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 형광성 리포터 분자가 결합되어 있고, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 상기 형광성 리포터 분자의 형광을 소멸시키는 형광 소멸자 분자가 결합되어 있는 올리고 누클레오티드 프로브; 및 (d) dNTP를 포함하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트를 제공한다.
본 발명의 DNA 증폭 키트는 DNA 증폭을 위한 시약 (reagent) 키트로서, 유전자 변형 식물체의 정량분석에 적합하도록 발명한 것이다.
본 발명의 키트 성분 중 하나인 상기 dNTP는 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP의 혼합물일 수 있고, dATP, dGTP, dCTP 및 dUTP의 혼합물일 수도 있다.
상기 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위와 혼성화 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 상기 전방향 프라이머는 서열 2, 서열 4 및 서열 6의 염기 서열을 갖는 것이며, 상기 역방향 프라이머는 서열 3, 서열 5 및 서열 7의 염기 서열을 갖는 것이다.
상기 올리고 누클레오티드 프로브는 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위와 혼성화 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 서열 8에 기재된 염기 서열을 갖는 것이다.
상기 형광성 리포터 분자는 5-카복시플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인, 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 및 2',7' 디메톡시-4',5'-디클로로-6-카복시로다민 등이 바람직하고, 상기 형광 소멸자 분자는 테트라메틸-6-카복시로다민, 테트라프로파노-6-카복시로다민, 시아닌, 안트로퀴논, 니트로티아졸 및 니트로이미다졸 등이 바람직하며, 가장 바람직하게는 상기 형광성 리포터 분자는 FAM이고, 상기 형광 소멸자 분자는 TAMRA이다.
본 발명의 DNA 증폭 키트는 양성 대조군으로서 유전자 변형 식물체의 함량을 이미 알고 있는 DNA 시료를 추가적으로 포함한다. 상기 양성 대조군 DNA 시료는 상술한 바와 같이, 표준곡선을 작성하는 데 이용된다.
본 발명의 DNA 증폭 키트는 바람직하게는 우라실 N-글리코실라아제를 추가적으로 포함하며, 이는 DNA 증폭 반응물에 함유된 오염물을 제거하기 위한 것이다.
본 발명의 키트는 DNA 증폭 반응 완충액을 물론 포함하며, 상기 완충액의 조성은 선택된 DNA 중합효소의 종류 등에 따라 그 조성이 다양하게 될 수 있다 (참조: McPherson, M.J. et al., A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, pp. 7, 19(1995). 상기 완충액의 예는 하기의 실시예 4에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 키트는 농축형 또는 사용전에 희석 과정이 필요 없는 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 키트에 검출하고자 하는 미지의 DNA 시료를 추가적으로 첨가하여 상술한 방법에 따라 DNA 증폭을 하게 되면, 미지의 DNA 시료로부터 유전자 변형 식물체의 함량을 측정할 수 있게 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 식물 DNA 추출
유전자 변형 생물체 여부를 검출하기 위해 형질전환 되지 않은 재래종 찰옥수수, 유전자 변형 옥수수 (BT-11 corn, 플루카), 형질전환 되지 않은 재래종 콩, 유전자 변형 콩 (Roundup Ready Soybean, 플루카) 또는 유전자 변형 정도가 미지인 식물체 각각의 DNA를 Edwards K., et al. 방법 (Nucleic Acids Research, 19:1349(1991))에 따라 다음과 같이 추출하였다: 우선, 200 mM 트리스 HCl, pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA 및 0.5% SDS로 구성된 추출용 완충액 200 ㎕를 조사 대상 작물의 조직에 첨가한 후 막자를 이용하여 조직 샘플을 파쇄 하였다. 이어, 동량의 추출용 완충액을 더 첨가 한 다음, 10 분 동안 회전시켰다. 그런 다음, 파쇄액 300 ㎕를 새로운 튜브로 옮긴 후 클로로포름:이소아밀알콜 (24:1) 300 ㎕를 첨가한 후, 혼합(invert)하고, 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 그리고 나서, 새로운 에펜도르프 튜브에 상층액을 옮긴 다음, 이소프로판올 300 ㎕을 첨가하고 혼합하였다. 이어, 원심분리 하고 침전된 DNA 시료를 70% 에탄올로 2회 세척한 다음, 50 ㎕ ddH2O로 재용해 하였다. 유전자 변형 콩 또는 옥수수의 DNA 및 형질전환 되지 않은 콩 또는 옥수수의 DNA를 각각 50 ng/㎕ 농도로 희석하여 준비하였고, %별 희석은 다음 표 1과 같다. 이는 하기 실시예 5에 기재된 실시간 PCR에서 양성 대조군으로서 이용하기 위한 것이다.
한편, 유전자 변형 식물체 함량을 알고 있는 기지의 DNA 시료는 고도로 정제된 것을 사용하여야 하며, 이는 DNA 시료의 순도가 낮은 경우에는 잘못된 표준 곡선의 원인이 되기 때문이다. 따라서, 본 발명에서는 순도 99.99%의 DNA 시료를 이용하여 양성 대조군으로서 이용하였다.
유전자 변형 식물체 함량 (%) 유전자 변형 식물체의 DNA(50 ng/㎕) 유전자 변형되지 않은 식물체의 DNA(50 ng/㎕) 최종 부피
1 10 ㎕ 990 ㎕ 1000 ㎕
3 30 ㎕ 970 ㎕ 1000 ㎕
5 50 ㎕ 950 ㎕ 1000 ㎕
10 100 ㎕ 900 ㎕ 1000 ㎕
50 500 ㎕ 500 ㎕ 1000 ㎕
실시예 2: 프라이머의 제작
꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터를 갖는 유전자 변형 식물체를 검출하기 위한 PCR에 이용될 프라이머를 제작하기 위하여, 우선 35S 프로모터 서열 중 증폭시킬 최적의 부위를 공지된 서열 (GenBank accession No. AJ251014, X84105, AF044029 및 X04879)을 이용하여 선택하였다. 먼저, 상기의 공지 서열들을 얼라인먼트하고, 공통 서열 (consensus sequence)을 조사한 다음 보존 서열 (conserved sequence)들을 찾아 내었다 (참조: 도 2a 및 도 2b). 첨부 도 2a 및 도 2b에서 TBI251014, Astdnabv, Af044029 및 Arcamvpr은 각각 GenBank accession No. AJ251014, X84105, AF044029 및 X04879에 대한 것이고, 3'-말단에 인접한 부위의 음영 부위가 보존 서열을 나타내는 부위이다. 상기 보존 서열을 갖는 부위의 염기 서열은 첨부한 서열 1에 나타나 있다. 다양한 식물체 시료에 대하여 실시하는 점을 고려하여, 본 발명의 실시간 PCR에서 증폭되는 부위를 상기의 보존 서열을갖는 부위로 결정하였다. 이어, 상기 선택된 부위의 증폭에 이용될 전방향 프라이머 (참조: 서열 2) 및 역방향 프라이머 (참조: 서열 3)를 합성하였다. 상기한 프라이머 뿐만 아니라, 상기한 보존 서열 부위 또는 그 인접한 부위와 혼성화 될 수 있는 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7 등 다수의 프라이머를 합성하였고, 이들 프라이머들도 하기 실시예 5에 기재된 실시간 PCR에서 우수한 프라이머 특성을 나타내었다.
실시예 3: 프로브의 제작
본 발명의 실시간 PCR 수행시 첨가되는 프로브를 제작하기 위하여, 먼저 프로브가 주형 DNA 상에 위치할 부위를 선택하였다. 프로브는 상기 실시예 2에서 제조된 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 사이에 위치하도록 하되, 증폭의 결과를 신속하게 확인하기 위하여 전방향 프라이머에 보다 근접하도록 제작하였다.
모든 프로브는 Expedite 8909 DNA/PNA 합성기 (PerSeptive Biosystems 사)를 이용하여 1 μmole 스케일로 트리틸-온 (trityl-on) 상태로 상기 합성기의 사용 매뉴얼에 따라 합성하였다. 3'-말단에 인접하여 도입되는 TAMRA 형광 소멸자는 TAMRA가 CPG (controlled pore glass)에 부착되어 있는 3'-TAMRA-CPG (Glen Research사; 1-Dimethoxytrityloxy-3-[O-(N-carboxy-(tetramethyl-rhodamine)-3-aminopropyl)]-propyl-2-O-succinoyl-long chain alkylamino-CPG)를 사용하고, 5' -말단에 인접하여 도입되는 FAM은 5-플루오레세인 포스포라미디트 (Glen Research사; [(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-6-carboxyamidohexyl]-1-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phospharamidite)를 사용하였다.
또한, 각각의 염기는 dAbz, dCbz, dGdmf및 T 포스포라미디트 (ABI 사)를 사용하였다. 5' 위치의 FAM의 축합의 경우에는 3분 동안의 축합 시간을 설정하였다 (일반적인 축합 시간은 1분). 프로브의 합성이 완료된 다음, 고체 지지물과 보호기는 티부틸아민:메탄올:증류수 (1:1:2)의 혼합물을 사용하여 65℃에서 3 시간 동안 가열하여 분리하였고, 반응이 완료된 최종 용액을 동결 건조하였다. 이어, 잔사를 1 ㎖의 100 mM 트라이에틸암모니움 아세테이트 (triethylammonium acetate, pH 7, 이하 "TEAA"라 한다) 용액에 용해하고, 이를 역상 고질 크로마토그래피 (Hamilton PRP-1, 300 mm x 7 mm, 18-38 % 아세토나이트릴/100 mM TEAA, pH 7, 260 nm 및 560 nm에서 UV로 모니터)로 정제하였다. 원하는 분획을 동결 건조하고 1 ㎖의 증류수를 두 번 첨가하여 용해하고, 이를 다시 동결 건조하여 잔류하는 TEAA 염을 완전히 제거하였다. 그런 다음, 잔사에 1 ㎖의 증류수를 가한 후 이 용액을 70℃에서의 UV 흡광도 값으로 정량하였다. 농도 계산을 위한 자연 누클레오티드의 흡광 계수는 다음과 같다: dAMP, 15200; dCMP, 7700; TMP, 8830: dGMP, 11500; FAM, 20958; 및 TAMRA, 31980.
올리고머의 구성은 효소분해 (알칼린 포스파타제 및 스낵 베놈 포스포디에스터라아제) 후 HPLC (Hewlett Packard, ODS hypersil, C-18; 20 mM K2HPO4, pH 5.6(A), MeOH(B), 100% A:40% B, 20 분) 및 레이져 탈착 질량 분석으로 확인하였다. 최종적으로 합성된 올리고 누클레오티드는 5'-FAM-aaggaaaggccatcgttgaagatg-TAMRA-3'이다.
실시예 4: 유전자 변형 식물체의 정량 키트 제작
다음과 같은 조성을 갖는 유전자 변형 정량 키트를 제작하였다: 1) 정량 반응 칵테일 1 ㎖ 각각 8 튜브, 2) AmpliTaq GoldTMDNA 중합효소 (Perkin-Elmer) 250 유니트 (5 U/㎕), 3) AmpErase 우라실 N-글리코실라아제 (UNG; Perkin-Elmer) 100 유니트 (1 U/㎕), 4) 유전자 변형 옥수수 1%, 3%, 5%, 10% 및 50% 표준 대조군 각각 300 ㎕, 그리고 5) 유전자 변형 콩 1%, 3%, 5%, 10% 및 50% 표준 대조군 각각 300 ㎕.
상기 정량 반응 칵테일의 조성은 다음과 같다: PCR 반응 완충액 (10X, 로슈사), MgCl2(3.5 mM), dATP (200 μM), dCTP (200 μM), dGTP (200 μM), dUTP (400 μM), 전방향 프라이머 (300 nM), 역방향 프라이머 (300 nM) 및 프로브 (200 nM). 상기 PCR 반응 완충액(10X)의 조성은 100 mM Tris/HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl2, 10 mM DTT 및 5 ㎍/㎖ BSA이다.
실시예 5: 유전자 변형 식물체의 정량 키트를 이용한 실시간 PCR
미지의 시료 및 표준곡선을 위한 표준 시료 1개 당 3개의 실시간 PCR 반응액을 제조하였다. 실시간 PCR 반응액의 총 부피는 50 ㎕이며, 조성은 정량 반응 칵테일 39.25 ㎕, AmpliTaq GoldTMDNA 중합효소 (5 U/㎕) 0.25 ㎕, AmpErase 우라실N-글리코실라아제 (1 U/㎕) 0.5 ㎕ 및 DNA 주형 10 ㎕ (양성 대조군 시료, 음성 대조군 시료 또는 미지의 시료)이다.
PCR 반응을 시작하기 직전에 상기 PCR 칵테일 39.25 ㎕에 0.25 ㎕의 AmpliTaq GoldTMDNA 중합효소 및 AmpErase 우라실 N-글리코실라아제 (1 U/㎕) 0.5 ㎕를 첨가하고 혼합하였다. 이어, 각 PCR 튜브에 상기 PCR 칵테일 및 효소의 혼합액을 분주한 후, DNA 주형을 첨가하고 신속히 혼합하였다. 상기 DNA 주형으로 이용되는 시료는 실시예 1에서 얻은 양성 대조군, 즉 1%, 3%, 5%, 10% 및 50% 유전자 변형 옥수수 또는 유전자 변형 콩의 DNA 용액 10 ㎕ (각 50 ng/㎕), 음성 대조군으로서의 증류수 및 형질전환 되지 않은 콩 또는 옥수수 DNA 용액 10 ㎕ (각 50 ng/㎕), 유전자 변형 정도가 미지인 DNA 시료 10 ㎕ (50 ng/㎕)이다.
그런 다음, 50℃에서 2분 동안 사전-변성 반응 (AmpErase 우라실 N-글리코실라아제를 변성)을 실시한 다음, 95℃에서 10분 동안 AmpliTaq GoldTMDNA 중합효소의 활성화를 실시하고, 95℃에서 15초 동안의 변성 반응, 64℃ 에서 1분 동안의 어닐링 및 신장 반응으로 이루어진 사이클을 총 40회 실시 하였다. 실시간 PCR은 ABI사의 Prism 7700 또는 Corbett사의 Rotor Gene 2000 기기를 이용하여 수행하였고, 실시간으로 주형 DNA가 증폭되는 정도를 형광 측정으로 하였으며, PCR 결과의 분석도 상기한 기기 내에 있는 프로그램에 의해 얻었다.
상기 실시간 PCR은 데이터의 정확성을 제고하기 위하여 각각의 시료에 대하여 2회씩 실시하였다. 실시간 PCR 결과는 도 4 및 도 5에 나타나 있다. 도 4에서 볼 수 있듯이, PCR 사이클 수가 증가될수록 형광의 세기가 시그모이드 (sigmoid) 패턴으로 증가되어, 본 발명자에 의해 제작된 프라이머 및 프로브가 자신의 기능을 함을 알 수 있다.
도 5는 상기 양성 대조군 및 음성 대조군으로부터 얻은 표준 곡선을 나타낸다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 표준 곡선의 상관 계수 (correlation coefficient)는 0.995로서 이상치인 1에 매우 근접해 있으며, 미지 시료는 5.68%의 유전자 변형식물체를 갖는 것임을 알 수 있다. 하기 표 2는 본 실험결과를 정리한 것이다.
시 료 주어진 유전자 변형 식물체의 함량 (%) 측정된 유전자 변형 식물체의 함량 (%) Ct
양성 대조군 1 1.00 0.92 33.69
1.00 1.09 33.38
양성 대조군 2 3.00 3.12 31.47
3.00 2.86 31.63
양성 대조군 3 5.00 5.03 30.6
5.00 4.79 30.69
양성 대조군 4 10.00 9.96 29.36
10.00 10.93 29.19
양성 대조군 5 50.00 45.70 26.59
50.00 52.44 26.34
미지 시료 - 4.87 30.66
- 6.48 30.14
상기 표 2에서 Ct값은 역치 사이클 수 (threshold cycle number)로서, 백그라운드 형광 값으로부터 명확히 구별되는 형광을 나타내는 PCR 사이클 수를 나타낸다.
본 발명은 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법을 제공한다. 또한, 본발명은 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트를 제공한다. 본 발명의 방법 및 키트는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 갖는 유전자 변형 식물체를 보다 개선된 정밀도, 신속성 및 정확성으로 정량적으로 검출할 수 있도록 한다.
<110> Nexgen biotechnologies, Inc. <120> DNA Amplication kits for Detecting Genetically-Modified Plants Qu antitatively and Methods Using the Same <130> nexgen-1 <160> 8 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 169 <212> DNA <213> Cauliflower mosaic virus <220> <221> promoter <222> (1)..(169) <223> 3'-terminal sequence of 35S promoter <400> 1 gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa 60 gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa 120 aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgata 169 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tagtggaaaa ggaaggtggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agatatcaca tcaatccact 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 attgccccag ctatctgtca c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atcacatcaa tccacttgc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tagtggaaaa ggaaggtggc 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aggatagtgg gattgtgc 18 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 8 aaggaaaggc catcgttgaa gatg 24

Claims (14)

  1. 삭제
  2. (a) (ⅰ) 식물체로부터 분리된 DNA 주형, (ⅱ) 5'→3' 누클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소, (ⅲ) 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 대하여 혼성화 되는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 (ⅳ) 상기 전방향 프라이머와 역방향 프라이머가 혼성화 되는 상기 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위 사이에서 상기 프로모터와 혼성화 되며, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 형광성 리포터 분자가 결합되어 있고, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 상기 형광성 리포터 분자의 형광을 소멸시키는 형광 소멸자 분자가 결합되어 있는 올리고 누클레오티드 프로브를 포함하는 DNA 증폭 반응 혼합물을 이용하여 상기 분리된 DNA 주형을 증폭하는 단계; 그리고,
    (b) 상기 리포터로부터 유래되는 형광의 세기를 측정하는 단계를 포함하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 전방향 프라이머는 서열 2, 서열 4 및 서열 6로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염기 서열을 갖고, 상기 역방향 프라이머는 서열 3, 서열 5 및 서열 7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법.
  4. 삭제
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 올리고 누클레오티는 프로브로 서열 8에 기재된 염기 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법은 유전자 변형 식물체의 함량 정도를 이미 알고 있는 식물체로부터 얻은 DNA 주형을 이용하여 표준 곡선을 작성하는 단계; 및
    상기 청구항 2에 의해 기재된 방법에 의해 측정된 형광 값을 상기 표준곡선에 대입하여 유전자 변형 식물체의 함량을 확인하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법은 DNA 주형을 증폭하는 단계 이전에 상기 DNA 증폭 반응 혼합물에 우라실 N-글리코실라아제를 첨가하여 우라실을 포함하는 DNA 오염물을 제거하는 단계; 및
    상기 우라실 N-글리코실라아제를 변성시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출방법.
  8. 삭제
  9. 다음을 포함하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트:
    (a) 5'→3' 누클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소;
    (b) 서열 1에 기재된 염기 서열을 갖는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 대하여 혼성화 되는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머;
    (c) 상기 전방향 프라이머와 역방향 프라이머가 혼성화 되는 상기 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 부위 사이에서 상기 프로모터와 혼성화 되며, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 형광성 리포터 분자가 결합되어 있고, 자신의 5'-말단 또는 3'-말단에 인접한 부분에 상기 형광성 리포터 분자의 형광을 소멸시키는 형광 소멸자(quencher) 분자가 결합되어 있는 올리고 누클레오티드 프로브; 및
    (d) dNTP
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 전방향 프라이머는 서열 2, 서열 4 및 서열 6로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염기 서열을 갖고, 상기 역방향 프라이머는 서열 3, 서열 5 및 서열 7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트.
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 올리고 누클레오티드 프로브는 서열 8에 기재된 염기 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 DNA 증폭 키트는 양성 대조군으로서 유전자 변형 식물체의 함량이 확인된 DNA 시료를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 DNA 증폭 키트는 우라실 N-글리코실라아제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 식물체의 정량적 검출용 DNA 증폭 키트.
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