KR100376796B1

KR100376796B1 - 유전자변형생물체 검출 키트 및 이에 사용되는 ｐｃｒ용프라이머

Info

Publication number: KR100376796B1
Application number: KR10-2000-0023539A
Authority: KR
Inventors: 이선교; 김성아; 정남준; 유제근
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2000-05-02
Filing date: 2000-05-02
Publication date: 2003-03-19
Also published as: KR20010100456A

Abstract

본 발명은 GMO여부를 스크린하기 PCR용 프라이머에 관한 것이다. 본 발명은 35S 프로모터의 특정부위와 하이브리드화 할 수 있는 검사용 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 GMO 검정을 실시하는 PCR 키트에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 PCR시 아닐링 온도가 64℃이상인 것을 특징으로 하는 GMO 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 제작된 프라이머는 PCR 반응시 35S 프로모터를 포함하는 유전자변형 생물체의 주형 DNA에 최적으로 매치되어 원하지 않는 PCR 결과물(artifact) 밴드와 잘못된 양성반응 밴드가 최소화된 결과를 보여준다. 나아가, 본 발명은 PCR시 아닐링 온도를 64℃이상으로 사용하여 아닐링 온도가 낮아 발생할 수 있는 잘못된 양성반응 밴드를 최대한 억제하며 출현하는 밴드의 신뢰도를 높인다. 따라서, 원하지 않는 PCR 결과물과 잘못된 양성 밴드가 적은 본 발명을 이용하면, GMO 여부를 정확하게 판단할 수 있다.

Description

유전자변형생물체 검출 키트 및 이에 사용되는 ＰＣＲ용 프라이머{GMO Detective Kit and Primer for PCR}

본 발명은, GMO를 검출하는 키트 및 이에 사용되는 PCR용 프라이머에 관한 것이다.

DNA의 구조와 생화학적 메카니즘, DNA 합성의 메카니즘에 대한 지식의 축적으로 생물학자들은 DNA 서열을 직접 조작할 수 있게 되었다. 이러한 분자생물학적 기술을 사용하여 다른 종류의 DNA 서열들을 재조합하여 새로운 DNA 단편을 조립하고 이들을 식물 또는 동물 등의 생물체의 게놈 DNA 내에 도입할 수 있게 되었다. GMO(Genetically-modified organisms: 유전자변형 생물체)는 이러한 연구들의 산물이다.

생물체에 외래 유전자가 도입되면, 원래는 존재하지 않던 단백질(non-natural protein)을 합성할 수 있는 능력을 소유하게 된다. 특히, 식물에 외래 유전자를 도입하는 이유는, 주로 병충해로부터 농작물을 보호하기 위해서이다. 나아가, 신품종 개발기간의 단축, 작물의 수량과 품질의 개선, 고부가가치 물질의 생산(의약품, 비타민, 바이오폴리머 등), 작물의 영양학적 품질 개선 등의 이유가 있다. 최근에는 곤충 유충들이나 제초제들에 대한 저항성을 제공하는 유전자를 소지하는 GMO들이 가장 일반적이다. 한편, 식용작물들 중에 가장 많이 재배되고 있는 GMO들은 콩, 옥수수, 유채 등이 있다.

최근 폭발적으로 증가하고 있는 GMO에 대한 표시가 국내외에서 커다란 관심사로 등장하고 있다. GMO 표기를 위해서 신속 정확한 검출방법이 요구되어 다양한 방법들이 개발되고 있는데, 현재 PCR 기법이 가장 선호된다.

PCR(Polymerase Chain Reaction : 중합효소연쇄반응)은, 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 PCR을 위한 주형(template)으로 사용하고 검출하고자 하는 표적 DNA(target DNA)에 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 프라이머("PCR용 프라이머")로 사용하여 표적 DNA 단편만을 증폭하는 방법이다.

GMO를 검출하기 위한 PCR 기법은 이러한 PCR 반응을 이용한 것으로, 생물체에 외래 유전자의 도입 및 발현에 필수적인 DNA 단편들(예, promoter, terminator 등)을 검출하기 위하여 다음과 같은 과정이 필요하다:

1. 대상 생물체의 전체 DNA를 분리하는 단계;

2. 검출 대상 DNA 단편의 핵산서열(nucleotide sequence)을 분석하여 특별히 선정된 프라이머들을 제작하는 단계;

3. 상기 분리된 대상 생물체의 전체 DNA를 주형 DNA로 사용하고 상기 제작된 프라이머를 사용하여, PCR 반응을 실시하는 단계 [서로 다른 세 가지 온도 순환(denaturation step, annealing step, extension step)과 DNA 폴리머라제의 작용에 의하여 검사대상 생물체에 표적 DNA 단편이 존재한다면 표적 DNA는 2∼3 시간 내에 정확하게 증폭(약 10⁶배/시간)된다]

4. PCR 반응후 일정량의 PCR 결과물을 아가로스겔상에서 전기영동한 후, GMO일 경우에 출현하게 될 밴드의 존재를 조사하여 GMO 여부를 결정하는 단계.

GMO 여부를 검정하는 PCR 기법의 종래기술로, 일본 TaKaRa 제품은, Monsanto사의 제초제내성 콩(Roundup-Ready)에 도입된 CP4 유전자에 대한 프라이머를 고안한 후, PCR에 사용하여 570bp의 DNA 단편을 검출함으로서 GMO여부를 판단하였다. 그러나, 본 발명자가 TaKaRa 제품을 사용하여 사용설명서에 명시된 반응조건 하에서 실험한 결과(비교실험예 1), 원하지 않는 PCR 결과물(artifact) 밴드들과 잘못된 양성반응 밴드들이 출현하였고, 기대하는 CP4 유전자에 대한 570bp 크기의 밴드를 확인하기 어려웠다. 한편, 음성반응으로 나와야 할 유전자조작 되지 아니한 국산 토종콩에서도 570bp 밴드가 출현하여 실험의 신뢰도가 떨어졌다.

한편, 또다른 종래기술로 스위스의 Biosmart 제품은, Monsanto사의 제초제내성 콩(Roundup-Ready)에서 제초제내성 유전자의 발현을 위하여 사용된 35S 프로모터의 일부분인 150bp의 DNA 단편을 검출하는 것이다. 그러나, 기대하는 35S 프로모토에 대한 150bp 크기의 밴드를 확인하기 어려웠고, 음성반응으로 나와야 할 유전자조작되지 아니한 국산 토종콩에서 150bp 밴드가 출현하여 실험의 신뢰도가 떨어진다. 또한, Biosmart의 사용설명서에 따르면 2회 PCR을 실시해야 하므로 검출에 소요되는 시간이 길다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 신규한 PCR용 프라이머를 고안하고 그 반응조건을 조정하여, GMO을 스크린하기 위한 원-스텝 PCR 스크리닝 키트를 준비하고자 한다.

도 1은, 4종류의 35S 프로모터 서열들에 대한 DNA 서열 배열 설계도이다.

도 2는 PCR 반응에 사용되는 온도 프로그램(thermal programming)을 그래프로 나타낸 것이다.

도 3 내지 도 7은 각각 전기영동한 결과물을 나타내는 사진이다.

본 발명은 GMO여부를 스크린하기 PCR용 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 35S 프로모터의 특정부위와 하이브리드화 할 수 있는 검사용 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 GMO 검정을 실시하는 PCR 키트를 제공한다.

나아가, 본 발명은 PCR시 아닐링 온도가 64℃이상인 것을 특징으로 하는 GMO 스크리닝 방법을 제공한다.

PCR 기법에 의하여 GMO 판별시 검출대상이 되고 있는 DNA 서열들은 생물체의 형질전환 및 도입유전자의 발현에 필수적인 것으로, 크게 세 개의 그룹 "유전자 발현조절 서열, 항생제 마커, 유전자"으로 나눌 수 있다.

본 발명은 GMO를 스크린하기 위하여, 작물 형질전환시 필수적인 프로모터들중에서 일반적으로 가장 많이 사용되고 있는 cauliflower mosaic virus의 35S 프로모터 부위를 검출하고자 한다.

본 발명자는, 35S 프로모터 부위를 검출하기 위해, 먼저 NCBI 데이터베이스에서 4종류의 35S 프로모터 서열들(GenBank accession No. AJ251014, X84105, AF044029, X04879)을 선발하였다. 이들 서열들에 대하여 DNA 분석 프로그램을 사용하여 DNA 서열 배열 설계도(DNA sequence alignment)를 작성하였다(도 1 참조). 그리고 나서, 공통서열(consensus sequence)을 조사하여 보존되어 있는(conserved) 서열들을 4개의 검정색 박스들로 표시하였다(도 1 참조). 4개의 검정색 박스안에 배열되어 있는 공통서열들은 각각 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시된다.

서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시된 35S 프로모터 부위 또는 상기 부위와 동일한 기능을 할 수 있는 DNA들을 주형으로 하여, 이로부터 DNA 단편을 PCR에 의하여 증폭할 수 있는 2개의 PCR용 프라이머를 제작하고, 도 1로부터 상기 2개의 PCR용 프라이머를 포함하는 35S 프로모터 부위의 DNA 단편의 크기를 예측할 수 있다. 따라서, 상기 2개의 PCR용 프라이머로 PCR을 실시하고 전기영동한 후, 상기 예측된 크기의 DNA 밴드를 확인할 수 있으면, PCR에 의한 증폭의 대상이 된 생물체의 DNA 주형에는 35S 프로모터 부위가 있다는 것을 유추할 수 있으며, 나아가, 상기 생물체는 유전자조작된 것임을 알 수 있다.

여기서, 동일한 기능이란, 비록 DNA 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 4와 일부 동일성이 없는 염기로 치환되어 있더라도 35S 프로모터로서의 기능을 하는 것을 의미한다.

PCR을 이용하여 35S 프로모터 부위를 증폭하기 위한 하나의 프라이머는 서열번호 1 내지 4로 나타나는 공통서열과 일치하게 제작하고, 또 다른 하나의 프라이머는 상기 공통서열보다 다운스트림(down stream)에 있는 공통서열과 상보적으로 제작한다(도 2 참조). 그러나, 본 발명의 PCR용 프라이머는 프라이머의 크기에 따라 또는 프라이머의 제작상 문제점 등에 따라 프라이머의 서열 중 일부가 상기 공통서열과 일치하거나 상보적이지 아니할 수 있다. 따라서, 서열번호 1 내지 4 중 일부에 해당하는 35S 프로모터 부위와 동일한 기능을 할 수 있는 DNA중에서 일부 선택된 DNA 단편이 PCR에 의하여 증폭될 수 있는 한, 상기 공통서열과 일부 비일치하거나 비상보적인 PCR용 프라이머도 본 발명의 범위에 속한다.

PCR용 프라이머의 크기는 아닐링 반응시의 주형과의 특이적인 결합을 고려하여 20bp 내외가 바람직하다. 또한, PCR 클로닝될 DNA 단편의 크기가 200∼300bp 되도록 두 개의 PCR용 프라이머를 제작하는 것이 바람직하다. 증폭할 단편의 길이가 길어지면 질수록 증폭효율이 떨어지기 때문이다.

본 발명자는 35S 프로모터 부위를 PCR에 의하여 증폭하는데 적합한 PCR 프라이머로 프라이머-1 (5'-attgccccagctatctgtcac-3'; 서열번호 5)과 프라이머-2 (5'-atcacatcaatccacttgc-3'; 서열번호 6)를 제작하였다(도 1 참조).

프라이머 1 및 2를 이용하여 GMO를 대상으로 PCR 증폭할 경우 200bp와 450bp의 밴드가 출현한다. 이는 PCR 반응 후, 형질전환되지 않은 국산콩나물의 전기영동 밴드 양상과 형질전환된 유채식물의 전기영동 밴드 양상을 비교함으로서 뒷받침될 수 있다(도 3 참조).

따라서, 본 발명에 따른 2개의 PCR용 프라이머를 이용하여 식물들의 전체 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시한 후 전기영동하면, 상기 2개의 PCR 프라이머를 포함하는 특정 크기의 35S 프로모터 밴드를 확인할 수 있으며, 그 크기는 도 1로부터 유추할 수 있다.

한편, GMO 여부를 판단하기 위한 PCR 반응은, 사전-변성 단계(Pre-denaturation Step)를 수행하고 난 후, 변성 단계(Denaturation Step); 아닐링 단계(Annealing Step); 신장 단계(Extension Step)로 이루어진 사이클을 수회 수행하고 마지막 신장 단계(Final-extension Step)를 수행하는 것이 바람직하다(도 2 참조).

본 발명에 따라 제작된 프라이머 1 및 프라이머 2는, PCR 반응시 유전자변형 생물체의 전체 DNA를 주형으로 최적으로 매칭(matching)되어, 프라이머들이 주형 DNA에 비특이적으로 결합하여 생성될 수 있는 원하는 않는 PCR 결과물(artifact)에 대한 밴드들 및 잘못된 양성반응 밴드가 최소화된 결과를 보여준다(도 3 참조, 실시예 4 참조).

한편, 반응 저해 등에 의한 잘못된 음성반응(false negative)을 방지하기 위하여, PCR 반응의 양성 대조군(positive control)으로, 35S 프로모토를 가지고 있는 유전자변형생물체에서 분리한 게놈 DNA를 주형 DNA로 사용할 수 있다. 따라서, 양성 대조군 유전자의 증폭유무로 PCR 반응이 정상적으로 종료하였는지를 전기영동으로 동시에 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 1 및 2를 사용하여 PCR 클로닝한 후 전기영동한 결과의 판정은 다음과 같다.

·200 bp의 밴드가 검출된 경우 - 유전자변형 생물체가 포함되어 있다.

·450 bp의 밴드가 검출된 경우 - 유전자변형 생물체가 포함되어 있다.

·200 bp와 450 bp의 밴드가 검출된 경우 - 유전자변형 생물체가 포함되어 있다.

·양성대조군 DNA에서만 200 bp 또는 450 bp 밴드가 검출된 경우 - 검사하고자 하는 생물체내에 혼입된 유전자변형 생물체가 극소량 들어 있어 주형으로 사용하여 증폭할 35S 프로모터 부위가 검출한계 이하이거나 유전자변형 생물체가 존재하지 않는다.

·어느 밴드도 검출되지 않은 경우 - 양성·음성을 확인할 수 없다. 이 경우 PCR 반응이 정상적으로 일어나지 않았을 가능성이 높으므로 PCR 반응을 다시 실시한다.

·검출 DNA 대신에 멸균증류수를 첨가한 음성대조군의 래인에서 밴드가 검출된 경우 - 오염(Contamination)을 일으킨 것으로 여겨지는 반응액의 조제 장소 및 사용한 기기, 시약 등의 오염을 제거한 후 다시 검출한다.

나아가, 바람직하게는, 종래 TaKaRa 제품 또는 Biosmart 제품에서 사용되는 아닐링 온도가 각각 60℃(TaKaRa), 50∼59℃(Biosmart)인 것과 달리, 본 발명은, PCR시 아닐링 온도를 64℃를 사용하여 아닐링 온도가 낮아 발생할 수 있는 잘못된 양성반응 밴드를 최대한 억제하여, 출현하는 밴드의 신뢰도를 높일 수 있다.

아래에서는, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 자세히 살펴 보고자 한다. 그러나, 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1. 식물 DNA 추출]

GMO 여부를 검출하기 위해, Edwards K. et al. 방법(Nucleic Acids Research, 1991, 19:1349 참조)에 따라, 형질전환되지 않은 국산 콩나물콩, 수입산 울타리콩, 수입산 흰콩, 수입산 완두콩, 수입산 강낭콩, 형질전환된 유채식물 각각의 DNA를 추출하였다. 즉, 조사 대상 작물의 디스크(disc)를 잘라 낸 후 멸균된 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)의 뚜껑(lid)을 이용하여 조직 샘플(tissue samples)을 수집하였다. 200mM Tris HCl pH7.5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS로 구성된 추출용 완충액(extraction buffer) 200㎕을 첨가한 후 막자(pestle)를 이용하여 조직 샘플을 빻았다. 그리고 나서, 추출용 완충액 200㎕를 더 첨가 한 후, 2초동안 와류(vortex)시켰으며, 10분간 회전(spin)시켰다. 다음, 새로운 튜브로 300㎕ 옮긴 후, 300㎕의 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알콜(Isoamylalcohol) (24:1)을 첨가하고, 혼합(invert)시킨 후 5분간 원심분리(cfg)하였다. 그런 다음, 새로운 에펜도르프 튜브에 상층액을 옮겼다. 이소프로판올 300㎕를 첨가하고 2 분간 혼합하였다. 5분간 회전시킨 후, 70% Et-OH로 2번 세척하였다. 그리고 나서, 50㎕의 ddH₂O로 용해시켰다.

검사대상이 될 작물의 DNA 시료는 고도로 정제한 것을 사용하여야 한다. DNA 시료의 순도가 낮은 경우에는 잘못된 음성반응 등의 원인이 되기 때문이다.

[실시예 2. PCR 실험]

PCR 반응 완충액 (10X) 250㎕, 2.5mM dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200 ㎕, 프라이머-1 (100pmole/ul) 25 ㎕, 프라이머-2 (100pmole/ul) 25 ㎕, 증류수(D.W.) 1500 ㎕을 혼합하여 PCR 칵테일 2 ㎖를 준비하고 각각 1㎖씩 2개의 튜브에 넣었다. 이 때, PCR 반응 완충액(10X)의 조성은(PH8.3), 100mM Tris/HCl, 400mM KCl, 15mM MgCl₂, 10mM DTT, 5ug/ml 아세틸화된 BSA이다.

PCR 반응을 시작하기 직전에 상기 PCR 칵테일 1㎖에 5 ㎕의 Taq DNA 폴리머라제 (5U/㎕)를 첨가하고 혼합하였다. 그리고 나서, 각 PCR 튜브에 상기 PCR 칵테일 및 Taq DNA 폴리머라제의 혼합액을 40 ㎕씩 분주한 후, 실시예 1에서 분리된 형질전환되지 않은 국산 콩나물콩, 수입산 울타리콩, 수입산 흰콩, 수입산 완두콩, 수입산 강낭콩, 형질전환된 유채식물로부터 추출된 각 DNA 용액 10 ㎕를 첨가하고 신속히 혼합하였다.

그리고 나서, 96℃에서 2분간 사전-변성 단계(Pre-denaturation Step)을 수행하였다. 그런 다음, 94℃에서 1분간의 변성 단계(Denaturation Step); 64℃에서 1분간의 아닐링 단계(Annealing Step); 72℃에서 2분간의 신장 단계(Extension Step)로 이루어진 사이클을 40회 수행하였다(도 2 참조). 그런 후, 72℃에서 10분간의 마지막 신장 단계(Final-extension Step)를 수행하였다.

상기와 같이 PCR반응을 수행하고 난 후, 결과물로 나온 각 시료를 -20℃에서 보존하였다.

여기서, 형질전환된 유채식물은 35S 프로모터를 소지하고 있는 유전자변형체식물로서, 형질전환된 유채식물로부터 추출된 DNA는 양성 대조군 DNA에 해당한다.

한편, 음성대조군으로서 검사대상인 DNA 용액 대신 멸균수 10 ㎕를 첨가하는 것을 제외하고는 동일한 반응조건 및 방법으로 PCR을 실시하였다.

[실시예 3. 아가로즈 겔의 제작]

삼각 플라스크에 전기영동용 TBE 완충액을 넣고 아가로즈 (Agarose-ME, USB)를 2%가 되도록 천천히 첨가하면서 교반하였다. 전자레인지로 2~3분 가열하였다. 꺼내어 잘 교반하여 용액을 균일하게 용해시켰다. 아가로즈 겔 용액을 60℃로 식히고 난 후, 캐스팅 트레이 (casting tray)에 부었다. 코움(comb)을 삽입한 다음 30분간 실온에 방치하여 겔을 굳혔다. 충분히 굳은 아가로스 겔을 전기영동 챔버에 셋팅한 후 아가로즈 겔이 충분히 잠길 때까지 전기영동 완충액을 추가하였다.

[실시예 4. 전기영동 및 염색밴드의 확인]

PCR 반응이 종료한 각 반응액 10 ㎕에 로딩 완충액(loading buffer)을 첨가하여 혼합하고 마이크로 피펫을 이용하여 천천히 웰에 주입하였다. 이때, 양끝의 웰에는 DNA 마커를 적당량 주입하였다. 전기영동 챔버에 100V의 정전압을 걸어 브로모페놀 블루(BPB)가 코움으로부터 3~4 cm이동할 때까지 전기영동하였다.

1 ㎍/ml의 EtBr 수용액 (TBE buffer로 10,000배 희석한 것)을 겔이 충분히 잠길 수 있는 양만큼 조제하여 아가로스 겔 염색용 트레이에 넣어 둔 후, 전기영동한 겔을 EtBr 수용액 트레이에 넣고 10분간 정치하였다.

UV 투사기(transilluminator)에 전기영동한 겔을 올려 놓고 사진촬영하여1kb 래더(DNA 크기 마커, BRL)와 대조하여 핵산의 밴드 유무와 크기를 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타나 있다.

[비교실시예 1]

GMO 여부를 검정하기 위해, 실시예 1에서 준비한 것으로, 형질전환되지 않은 국산 콩나물콩, 수입산 울타리콩, 수입산 흰콩, 수입산 완두콩, 수입산 강낭콩, 형질전환된 유채식물 각각의 DNA를 가지고 일본 TaKaRa의 제품("PCR Screening Kit for GM Soybean Ver.2.0", TaKaRa Shuzo Co., Ltd.)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. TaKaRa의 제품은 GMO 여부를 검정하기 위한 PCR용 프라이머를, Monsanto사의 제초제내성 콩(Roundup-Ready)에 도입된 CP4 유전자로부터 고안한 것이다. TaKaRa의 제품의 사용설명서에 따라, 94℃에서 2분간을 사전-변성(pre-denaturation)을 실시한 후, 94℃에서 0.5분의 변성 단계(Denaturation Step); 60℃에서 0.5분간의 아닐링 단계(Annealing Step); 72℃에서 1분간의 신장 단계(Extension Step)로 이루어진 사이클을 40회 수행하였다. 이렇게 PCR 반응을 수행하고, 전기영동한 결과, CP4 유전자에 해당하는 570bp의 DNA 단편을 검출함으로서 GMO여부를 판단하였다. 그 결과는 도 4에 나타나 있다.

도 4에 나타난 바와 같이, 원하지 않는 PCR 결과물(artifact) 밴드들과 잘못된 양성반응 밴드들이 출현하여, 기대하는 CP4 유전자에 대한 570bp 크기의 밴드를 확인하기 어려웠다. 한편, 음성반응으로 나와야 할 유전자조작되지 아니한 국산 토종콩에서도 570bp 밴드가 출현하여 실험의 신뢰도가 떨어졌다.

[비교실시예 2]

GMO 여부를 검정하기 위해, 실시예 1에서 준비한 것으로, 형질전환되지 않은 국산 콩나물콩, 수입산 울타리콩, 수입산 흰콩, 수입산 완두콩, 수입산 강낭콩, 형질전환된 유채식물 각각의 DNA를 가지고 스위스 Biosmart의 제품("Allin 1.0", Biosmart GmbH)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. Biosmart의 제품은 GMO 여부를 검정하기 위한 PCR용 프라이머를, Monsanto사의 제초제내성 콩(Roundup-Ready)에 도입된 35S 프로모터로부터 고안한 것이다. Biosmart의 제품의 사용설명서에 따라, 95℃에서 3분간 사전-변성 단계를 수행하고 난 후, 95℃에서 30초간의 변성 단계; 59℃에서 60초간의 아닐링 단계; 72℃에서 30초간의 신장 단계로 이루어진 사이클을 40회 수행하였으며, 72℃에서 3분간의 마지막 신장 단계(Final-extension Step)을 수행하였다. 이렇게 1차 PCR 반응을 수행하고, 1차 PCR의 반응물 1㎕를 주형으로 하여 2차 PCR을 Biosmart 제품의 사용설명서에 따라, 95℃에서 1분간 사전-변성 단계를 수행하고 난 후, 95℃에서 30초간의 변성 단계; 54℃에서 60초간의 아닐링 단계; 72℃에서 30초간의 신장 단계로 이루어진 사이클을 45회 수행하였으며, 72℃에서 3분간의 마지막 신장 단계(Final-extension Step)를 수행하였다. 전기영동한 결과, 35S 프로모터에 해당하는 150bp의 DNA 단편을 검출함으로서 GMO여부를 판단하였다. 그 결과는 도 5에 나타나 있다.

도 5에 나타난 바와 같이, 원하지 않는 PCR 결과물(artifact) 밴드들과 잘못된 양성반응 밴드들이 출현하여, 기대하는 35S 프로모토에 대한 150bp 크기의 밴드를 확인하기 어려웠다. 한편, 음성반응으로 나와야 할 유전자조작되지 아니한 국산 토종콩에서도 150bp 밴드가 출현하여 실험의 신뢰도가 떨어졌다.

[비교실시예 3]

TaKaRa의 제품을 사용하여 GMO 검출 시험을 할 때 사용설명서에 명시된 아닐링 온도(55℃)를 사용하지 않고 본 발명에 따른 아닐링 온도인 64℃를 사용하는 것을 제외하고는 비교실시예 1과 동일하게 PCR 반응을 시행하였다. 그 결과는 도 6에 나타나 있다.

도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 비교실시예 1과 유사하게 원하지 않는 PCR 결과물 밴드와 잘못된 양성 밴드들이 출현하였다. 이러한 결과는 TaKaRa의 제품에서 사용되는 프라이머들이 검출대상 DNA 단편들에 불완전하게 매칭(matching)되는 서열을 사용하고 있다고 생각할 수 있다. 또한, Biosmart의 제품은 사용설명서에 따르면 2회 PCR을 실시해야 한다고 기재되어 있는데, 이는 PCR 용 프라이머의 주형(template)에 대한 특이성(specificity)이 떨어지기 때문에 1차 PCR을 하여 소량의 PCR 산물을 얻은 후, 다시 이것을 주형으로 하여 2차 PCR에서 원하는 밴드를 증폭하기 위한 것이라고 추측된다.

나아가, 증폭된 PCR 결과물의 밴드 양상이 다르기 때문에, Biosmart제품에서 사용한 프라이머의 DNA 서열은 본 발명에서 사용된 PCR용 프라이머의 서열과 다른 것임을 알 수 있다.

[비교실시예 4]

Biosmart의 제품을 사용하여 GMO 검출 시험을 할 때 사용설명서에 명시된 아닐링 온도(59℃ 또는 54℃) 본 발명에 따른 아닐링 온도인 64℃를 사용하는 것을 제외하고는 비교실시예 2와 동일하게 PCR 반응을 시행하였다. 그 결과는 도 7에 나타나 있다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 비교실시예 2와 유사하게 원하지 않는 PCR 결과물 밴드와 잘못된 양성 밴드들이 출현하였다. 이러한 결과는 Biosmart의 제품에서 사용되는 프라이머들이 검출대상 DNA 단편들에 불완전하게 매칭되는 서열을 사용하고 있다고 생각할 수 있다.

본 발명에 따라 제작된 프라이머는 PCR 반응시 35S 프로모터를 포함하는 유전자변형 생물체의 주형 DNA에 최적으로 매치되어 원하지 않는 PCR 결과물(artifact) 밴드와 잘못된 양성반응 밴드가 최소화된 결과를 보여준다. 나아가, 본 발명은 PCR시 아닐링 온도를 64℃이상으로 사용하여 아닐링 온도가 낮아 발생할 수 있는 잘못된 양성반응 밴드를 최대한 억제하며 출현하는 밴드의 신뢰도를 높인다. 또한, 두 번의 PCR을 해야 하는 Biosmart 제품과는 달리 1회의 PCR로 원하는 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 원하지 않는 PCR 결과물과 잘못된 양성 밴드가 적은 본 발명을 이용하면, GMO 여부를 정확하게 판단할 수 있다.

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 DNA 서열을 포함하는 CMV(cauliflower mosaic virus)의 35S 프로모터 부위를 PCR 방법으로 증폭하기 위한 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 PCR 용 프라이머.
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변성 단계, 어닐링 단계 및 신장 단계를 포함하는 PCR 반응에 있어서, 상기 PCR 반응은 상기 제 1 항의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 PCR 반응.
상기 제 1 항의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머, dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 유전자변형생물체 검출 키트.
제 5 항에 있어서, 상기 검출 키트는 양성대조군으로서 CMV의 35S 프로모터를 갖는 DNA로 형질전환된 생물체의 게놈 DNA를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자변형생물체 검출 키트.
제 4 항에 있어서, 상기 어닐링 온도는 62℃-68℃인 것을 특징으로 하는 PCR 반응.