KR102636355B1 - 복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 및 프로브 세트 및 진단 방법 - Google Patents
복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 및 프로브 세트 및 진단 방법 Download PDFInfo
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Abstract
서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 프로브, 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 표시되는 프로브, 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트; 상기 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트; 및 복숭아 곰팡이 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 5종의 복숭아 곰팡이 각각에 특이적이면서 재조합효소 중합효소 증폭법 및 측면흐름분석에 적용가능한 프라이머 및 프로브를 설계하여 진단의 신속성 및 정확성을 높일 수 있는바, 복숭아 곰팡이 진단, 복숭아 무병묘 생산 및 복숭아 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트; 상기 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트; 및 복숭아 곰팡이 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 5종의 복숭아 곰팡이 각각에 특이적이면서 재조합효소 중합효소 증폭법 및 측면흐름분석에 적용가능한 프라이머 및 프로브를 설계하여 진단의 신속성 및 정확성을 높일 수 있는바, 복숭아 곰팡이 진단, 복숭아 무병묘 생산 및 복숭아 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 프로브, 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 표시되는 프로브, 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트; 상기 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트; 및 복숭아 곰팡이 진단 방법에 관한 것이다.
복숭아(Prunus persica)는 낙엽성의 과수 나무로 원산지는 중국의 북서쪽으로 알려져 있으며 살구, 자두, 체리, 매실 등과 같이 벚과류(the family Prunus)에 속하는 과수 나무이다. 국내에도 굉장히 다양한 종류의 복숭아 품종들이 재배되고 있으며, 과실에 털이 있는 일반 복숭아와 과실에 털이 없는 천도복숭아(nectarine)로 나눌 수 있다. 복숭아의 경우 대부분 접목을 통해 품종 유지 및 재배를 하고 있으나, 접목을 통해 바이러스, 바이로이드, 세균, 곰팡이 등 다양한 병원성 미생물에 감염되기도 한다. 최근 국내에서는 강추위와 잦은 강우와 같은 기후 변화로 인해 복숭아의 수세가 많이 약해졌으며, 병든 복숭아 나무의 줄기를 통해 다양한 종류의 곰팡이들이 감염되고 있어서 피해 예방을 위한 노력이 필요하다.
국내 복숭아 줄기에 많이 발생하는 곰팡이로는 줄기마름병을 일으키는 사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 줄기썩음병을 일으키는 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina)등이 알려져 있다. 이러한 복숭아 곰팡이병을 예방하기 위해 국내 복숭아 재배 농가에서는 꽃이 피기 전 이른 봄에 석회유황합제를 살포하고, 주기적으로 곰팡이 방제 농약을 살포하며, 복숭아 열매에 봉지를 씌우는 작업을 하고 있으나, 이러한 복숭아 곰팡이병은 감염시기 예측이 매우 어렵기 때문에 곰팡이병을 손쉽고 정확하게 진단할 수 있는 방법 개발이 필요하다.
최근에는 차세대염기서열분석(Next-generation sequencing; NGS) 기술의 빠른 발달로 인해 이를 이용하여 곰팡이를 비롯한 다양한 미생물의 유전체, 전사체 정보의 확보 및 미생물 동정 등을 손쉽게 할 수 있게 되었다. 특히 NGS와 생물정보학 분석을 통해 새롭게 분리된 곰팡이균의 정확한 동정이 가능하며, 관련 유전자 정보등을 손쉽게 확보할 수 있다.
정확한 곰팡이 동정은 곰팡이병을 예방하는데 매우 중요하다. 곰팡이병을 진단하는 가장 일반적인 방법으로는 곰팡이균 배양을 통한 방법이 있다. 이 방법의 경우 특이적인 배지에 자라는 곰팡이로부터 DNA를 추출한 후, 곰팡이 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고, 증폭된 PCR 산물은 클로닝(Cloning)과 Sanger-sequencing을 통해 염기서열을 결정하여, BLAST를 이용해 기존 곰팡이 데이타베이스에 유전자 서열을 비교한 후 새롭게 동정된 곰팡이 균의 종을 결정한다.
그러나, 이러한 종래 PCR 증폭에 의한 검출은 실험실이나 연구실에서 정확하게 곰팡이 종을 진단할 수 있다는 장점이 있으나, 고가의 장비 및 전문인력이 요구되어 현장에서 신속하게 곰팡이를 진단하기에는 한계가 있다. 따라서, 현장에서 빠르고 정확하게 곰팡이를 진단하기 위한 진단방법의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 현장에서 복숭아 감염 곰팡이의 진단 및 모니터링, 나아가 복숭아 피해 예방에 활용하고자, 다양한 지역에서 채취한 복숭아로부터 5종의 곰팡이를 분리 동정하여, 재조합효소-중합효소 증폭법에 적용 가능한 5종 복숭아 곰팡이 특이적 프라이머-프로브 세트를 설계하고, 상기 프라이머-프로브 세트에 의해 증폭된 앰플리콘(amplicon)을 측면흐름분석에 의해 확인하여 5종 곰팡이를 진단함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 예시적 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 프로브, 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 표시되는 프로브, 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은
(a) 시료로부터 복숭아 곰팡이 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 프로브, 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 표시되는 프로브, 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
구체적으로, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브는 사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브는 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 프로브는 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 표시되는 프로브는 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 표시되는 프로브는 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 본 발명에서 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.
본 발명에 있어서, 역방향 프라이머인 서열번호 2, 5, 8, 11 및 14로 표시되는 프라이머들은 5' 말단에 비오틴(biotin)을 표지물질로 가질 수 있으며, 프라이머에 상기 표지물질을 이용할 경우 측면흐름분석에 용이하게 적용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브는 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프로브는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다.
유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함하고, 5‘말단과 3’말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함할 수 있으며, 복수의 프로브를 포함할 때 각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일할 수 있다.
상기 형광물질은 FAM(Fluorescein amidites), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texasred), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 FAM(Fluorescein amidites)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가질 수 있으며, 상기 표지물질을 이용할 경우 측면흐름분석에 용이하게 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브는 측면흐름분석에 적용되기 위하여 염기서열 내에서 비염기성(Abasic) 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "비염기성(Abasic) 잔기(moiety)"는 특정한 염기 코딩 정보를 갖고 있지 않은 뉴클레오시드인 비염기형태 부분을 의미한다. 이러한 비염기성 잔기로는, 디스페이서(dSpacer, 5'-Odimethoxytrityl-1',2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl) -(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 메톡시디 스페이서(1'-OMe-dSpacer, 5'-O- dimethoxytrityl-1'-methoxy-2'-dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,Ndiisopropyl)]-phosphoramidite), 피씨스페이서 포스포아미다이트(PC Spacer Phosphoamidite, [4-(4,4'- 6 - Dimethoxytrityloxy)butyramidomethyl)-1-(2-nitrophenyl)-ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)- phosphoramidite), 알스페이서 씨이 포스포아미다이트(rSpacer CE Phosphoamidite,5'-O-Dimethoxytrityl-1'- Deoxyribose-2'-O-Triisopropylsilyloxymethyl-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스 페이서 씨12 씨이 포스포아미다이트(Spacer C12 CE Phosphoamidite, 12-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-dodecyl-1- [(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 포스포아미다이트 18(Spaer Phosphoamidite 18, 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페 이서 포스포아미다이트 9(Spacer Phosphoamidite 9,9-O-Dimethoxytrityl-triethyleneglycol,1-[(2- cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite), 스페이서 포스포아미다이트 씨3(Spacer Phosphoamidite C3,3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diiso-propyl)]-phosphoramidite) 등을 포함한다.
상기 프로브 서열 내에 비염기성 잔기의 수는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1 내지 10개 범위인 것이 더욱 바람직하다.
상기 비염기성 잔기는 상기 프로브의 34번째 염기 다음에 위치하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브는 3' 말단에 스페이서를 포함하여 엔도뉴클레아제에 의해 3' 부위가 제거되지 않은 상태에서의 불필요한 증폭반응이 일어나지 않도록 할 수 있으며, 상기 스페이서는 구체적으로 C3 스페이서(C3 spacer)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브는 재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)을 수행하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)은 주형 핵산의 등온 이용 재조합효소를 포함하는 프라이머 어닐링과 가닥 변위 DNA 합성의 조합을 통해 수행되는 등온증폭 방법이다. 일반적으로 RPA는 등온에서 DNA가 증폭되므로 정교한 가열 작업을 요구하지 않으며, 아가로스 젤 전기영동으로 시각화 하거나 측면흐름분석을 통해 시각화할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 재조합효소 중합효소 증폭법에 이용가능한 복숭아 5종 병원성 곰팡이(사이토스포라 류코스토마, 마크로포미나 파서리나, 디아포르테 헤리안티, 모닐리니아 프룩티콜라 및 파이토프토라 칵토룸) 특이적 프라이머 쌍 및 프로브를 각각 제작하였으며, 재조합효소 중합효소 증폭법에 의해 각 복숭아 곰팡이 특이적 유전자가 증폭됨을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은
서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 프로브, 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 표시되는 프로브, 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 및 프로브는 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 측면흐름분석(Lageral flow assay, LFA)을 수행하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "측면흐름분석"은 스트립 상에 배치된 복합 혼합물에서 분석물의 검출 및 정량화를 위한 종이 플랫폼에 기초한 기술로, 재조합효소 중합효소 증폭법에 의해 증폭된 증폭산물을 측면흐름분석에 적용하면 현장에서 빠르고 신속하게 목적 대상을 검출할 수 있다는 장점이 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 상기 프라이머 중 역방향 프라이머의 5' 말단에 바이오틴을 라벨링하고, 상기 프로브의 5' 말단에 FAM을 라벨링한 후, 프로브의 3' 말단에 C3 스페이서를 라벨링하고, 프로브의 34번째 염기 다음에 비염기성 잔기를 포함하여 재조합효소 중합효소 증폭법 및 측면흐름분석법에 적용가능한 5종 곰팡이 특이적 프라이머 및 프로브를 제작하였다. 이후 복숭아 5종 병원성 곰팡이에 대하여 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 재조합효소 중합효소 증폭법을 수행하였고, 증폭된 복숭아 곰팡이 특이적 유전자를 측면흐름분석법에 의해 확인하여 5종 복숭아 곰팡이가 검출되는 것을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 복숭아 곰팡이 진단용 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 재조합 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA) 키트, 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 재조합 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은
(a) 시료로부터 복숭아 곰팡이 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단 방법을 제공한다.
상기 프라이머 및 프로브는 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계의 시료는 본 발명의 복숭아 곰팡이 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 핵산, 구체적으로는 DNA를 추출하기 위한 미지의 물질을 의미하는 것으로, 예컨대 상기 바이러스가 감염된 복숭아 또는 복숭아 나무의 잎, 줄기, 뿌리 등을 포함할 수 있으며, 그밖에도 식품, 천연물(예컨대, 물) 또는 생물학적 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA) 키트, 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행할 수 있으며, 구체적으로 재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계에서 증폭된 표적 핵산의 검출은 측면흐름분석(Lageral flow assay, LFA), 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), DNA 칩, 겔 전기영동(gel electrophoresis), 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 구체적으로 측면흐름분석(Lageral flow assay, LFA)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면 5종의 복숭아 곰팡이 각각에 특이적이면서 재조합효소 중합효소 증폭법 및 측면흐름분석에 적용가능한 프라이머 및 프로브를 설계하여 진단의 신속성 및 정확성을 높일 수 있는 바, 복숭아 곰팡이 진단, 복숭아 무병묘 생산 및 복숭아 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 복숭아에서 분리한 사이토스포라 류코스토마의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 복숭아에서 분리한 마크로포미나 파서리나의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 복숭아에서 분리한 디아포르테 헤리안티의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 복숭아에서 분리한 모닐리니아 프룩티콜라의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 복숭아에서 분리한 파이토프토라 칵토룸의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 복숭아 5종 병원성 곰팡이의 전사체를 이용한 종 특이적 유전자 분석 및 선발 방법의 모식도이다.
도 7은 복숭아 5종 병원성 곰팡이 특이적 프라이머를 이용해 RPA를 수행한 후 증폭된 앰플리콘(amplicon)을 나타낸 것이다.
도 8은 복숭아 5종 병원성 곰팡이 특이적 프라이머를 이용해 RPA로 증폭된 앰플리콘(amplicon)을 측면흐름분석으로 확인한 결과이다.
도 2는 복숭아에서 분리한 마크로포미나 파서리나의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 복숭아에서 분리한 디아포르테 헤리안티의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 복숭아에서 분리한 모닐리니아 프룩티콜라의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 복숭아에서 분리한 파이토프토라 칵토룸의 전사체 정보를 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 복숭아 5종 병원성 곰팡이의 전사체를 이용한 종 특이적 유전자 분석 및 선발 방법의 모식도이다.
도 7은 복숭아 5종 병원성 곰팡이 특이적 프라이머를 이용해 RPA를 수행한 후 증폭된 앰플리콘(amplicon)을 나타낸 것이다.
도 8은 복숭아 5종 병원성 곰팡이 특이적 프라이머를 이용해 RPA로 증폭된 앰플리콘(amplicon)을 측면흐름분석으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 복숭아 곰팡이 연구를 위한 샘플 수집 및 곰팡이 분리 동정
복숭아 감염 곰팡이를 식별하고자, 5개 지역(상주, 전주, 장성, 완주 및 장호원)에서 줄기마름병, 줄기썩음병, 잿빛무늬병 및 역병 증상을 보이는 복숭아들을 수집하였다. 수집된 샘플에서 총 5종의 곰팡이 사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)을 분리 동정하였고(표 1), 이렇게 분리 동정된 곰팡이들은 RNA 추출에 사용하였다.
| 균주번호 | 기주식물 | 분리지역 | 곰팡이 | 병징 |
| 18-484 | 복숭아 | 경북 상주 | Cytospora leucostoma | 줄기마름병 |
| 19-016 | 복숭아 | 전북 전주 | Macrophomina phaseolina | 줄기썩음병 |
| 19-168 | 복숭아 | 전남 장성 | Diaporthe helianthi | 줄기마름병 |
| 19-382 | 복숭아 | 전북 완주 | Monillinia fructicola | 잿빛무늬병 |
| 19-435 | 복숭아 | 경기도 장호원 | Phytophthora cactorum | 역병 |
실시예 2: RNA 추출 및 라이브러리 제작
복숭아 샘플로부터 분리 동정된 5종 곰팡이들로부터 total RNA를 추출하여 mRNA 라이브러리를 제작하였다.
구체적으로, 분리 동정된 5종 곰팡이들은 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 키웠으며, 각 곰팡이의 균사를 채취하여 액체질소로 얼린 후 막자사발과 절구를 이용해 곱게 갈았다. 곱게 갈은 샘플은 Fruit-mate for RNA Purification (Takara, Shiga, Japan) 키트와 RNeasy Plant Mini Kit for RNA extraction (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용해 제조사의 지침에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA은 NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB, Ipswich, MA, USA)을 이용해 mRNA를 추출하였다. 추출된 mRNA는 NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB)와 NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)을 사용해 제조사의 지침에 따라 RNA-sequencing용 라이브러리를 제작하였다.
실시예 3: 전사체 조립
제작된 5개 라이브러리에 대해 차세대염기서열분석(next-generation sequencing, NGS) 기기인 Novaseq 6000 시스템을 이용해 RNA sequencing을 수행하여 raw data를 얻었으며, 상기 raw data로 Trinity 프로그램(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)을 이용해 de novo assembly 를 수행하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 곰팡이별로 조립된 컨티그(contig)의 수는 최소 26,832 contigs(사이토스포라 류코스토마)에서 최대 37,261 contigs(모닐리니아 프룩티콜라)이었다. 조립된 전사체의 유전자 기능을 알기 위해 각 조립된 컨티그(contig)들을 이용해, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 non-redundant 단백질(protein) 데이터베이스에서 BLASTX를 수행하였다. 이때 cutoff로 Evalue 1E-5를 적용하였다. BLASTX 수행 후 얻어진 data를 MEGAN6 프로그램(https://software-ab.informatik.uni-tuebingen.de/download/megan6/welcome.html)을 이용해 각 곰팡이 유전자들의 분류체계(Taxonomy)를 분석하였다.
분석 결과 복숭아에서 분리한 18-484 균주의 경우 대부분의 유전자들이 사이토스포라 류코스토마에 매치되었고(도 1), 19-016 균주의 경우 대부분의 유전자들이 마크로포미나 파서리나에 매치되었고(도 2), 19-168 균주의 경우 대부분의 유전자들이 디아포르테 헤리안티에 매치되었으며(도 3), 19-382 균주의 경우 대부분의 유전자들이 모닐리니아 프룩티콜라에 매치되었으며(그림 4), 19-435 균주의 경우 대부분의 유전자들이 파이토프토라 칵토룸에 가장 많이 매치되었다(그림 5).
| 균주번호 | 핵산 종류 |
Read 수 | 컨티그(Contig) 수 | 조립된 전사체 크기(MB) | 프로그램 | 곰팡이 |
| 18-484 | RNA | 30,026,954 | 26,832 | 43.000 | Trinity | Cytospora leucostoma |
| 19-016 | RNA | 45,381,556 | 27,071 | 54.811 | Trinity | Macrophomina phaseolina |
| 19-168 | RNA | 37,304,080 | 32,582 | 52.991 | Trinity | Diaporthe helianthi |
| 19-435 | RNA | 40,404,856 | 28,100 | 47.665 | Trinity | Phytophthora cactorum |
| 19-382 | RNA | 31,519,198 | 37,261 | 46.091 | Trinity | Monillinia fructicola |
실시예 4: 복숭아 5종 병원성 곰팡이 종 특이적 유전자 선발
복숭아 5종 병원성 곰팡이 전사체를 이용하여 곰팡이 종 특이적 유전자를 분석하고 선별하였다(도 6).
구체적으로, 각 곰팡이별로 조립된 전사체 정보로 TLBASTX를 수행하였다. 각 곰팡이의 전사체를 데이터베이스로 하고, Evalue 1E-5를 기준으로 매치되는 모든 유전자들은 제거하였다. 각 곰팡이별로 반복적으로 분석을 수행하였으며, 각 곰팡이 특이적으로 선발된 유전자로 NCBI non-redundant 단백질 데이터베이스에 BLASTX를 수행한 후 MEGAN6을 이용한 분류체계(taxonomy) 분석을 통해 동물, 식물, 세균, 바이러스 등 다른 생명체와 유사성을 보이는 모든 유전자서열들을 제거하였다. 오염된 유전자들을 제거하고 필터링된 유전자서열들로 다시 NCBI의 nucleotide(NT) 데이터베이스에 BLASTN을 수행하였다. 이때 NT 데이터베이스의 다른 곰팡이에 매칭되는 모든 유전자들을 모두 제거하였다. 위의 분석 과정들을 통해 최종적으로 복숭아 5종 병원성 곰팡이 종 특이적 유전자들을 선발하였다(표 3).
| 균주번호 | 핵산 | 곰팡이 | 곰팡이 종 특이적 유전자 수 |
| 18-484 | RNA | Cytospora leucostoma | 1012 |
| 19-016 | RNA | Macrophomina phaseolina | 1482 |
| 19-168 | RNA | Diaporthe helianthi | 554 |
| 19-435 | RNA | Phytophthora cactorum | 83 |
| 19-382 | RNA | Monillinia fructicola | 1267 |
실시예 5: 5종 복숭아 곰팡이 특이적 RPA용 프라이머 및 프로브 개발
최종 선발된 복숭아 5종 병원성 곰팡이 특이적 유전자 서열을 바탕으로 PrimedRPA프로그램을 이용하여 표 4에 나타낸 바와 같이, 각 곰팡이종을 증폭할 수 있는 재조합효소 중합효소 증폭법(RPA)용 프라이머와 프로브를 디자인하였다.
| 곰팡이 | 프라이머 및 프로브 |
염기서열 | 증폭 산물 (bp) |
서열 번호 |
| Cytospora leucostoma. |
18-484-168-F1 | TTCGATGCTGTGTACGAATTTCAGGAGTCT | 168 | 1 |
| 18-484-168-R1 | AGAGTCATCACTCGACTCCAGGTGCTGCAC | 2 | ||
| 프로브 | AAATCGCGAAGGCAGCGGACAGTGGCAGCTGGGC GTGCTGCCAAGAACAG |
3 | ||
| Macrophomina phaseolina | 19-016-185-F1 | TCAGCACAATCGACTTGAATCACACTACCG | 185 | 4 |
| 19-016-185-R1 | GAATTCGTCGAGGGTGACTTCGAAGGTGAG | 5 | ||
| 프로브 | AATGCAACGGCGTCGAACACCAGTATCGCTACGC CTACGGCAACTCTGGT |
6 | ||
| Diaporthe helianthi | 19-168-175-F1 | CAACAGCCACACGCTCCGACAGCTCGCCCT | 175 | 7 |
| 19-168-175-R1 | TGTTCGAAGAAAATAGACGAGGTTTTCAGC | 8 | ||
| 프로브 | GACCTGCCAAGCCGTTCATGATGTCGTAACCCCG GCACTATACAGCTCCA |
9 | ||
|
Monillinia
fructicola |
19-382-189-F1 | ATTATTGGATGATCACAACGGTACACATGC | 189 | 10 |
| 19-382-189-R1 | TTTGTTTTCATCGGGTCTAGACCTGGAAGC | 11 | ||
| 프로브 | TTCACAGTGCGCAGTCTCACAGGAAAGTATCCAG AGTCAAATTGACTCTT |
12 | ||
|
Phytophthora
cactorum |
19-435-192-F1 | TTCCCTGGATATCAGACTACGGAACCGCTG | 192 | 13 |
| 19-435-192-R1 | GTATGGATTTGGCGTTAATTCCCCTACAGT | 14 | ||
| 프로브 | CACTGAAGAATGATGACTCAAATCGTAGCAAACA ACGGCTTGAGGACAGC |
15 |
이후 복숭아 5종 곰팡이에 대해 상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 RPA를 수행하였다. RPA는 TwistAmp nfo kit (TwistDX, Cambridge, UK)를 이용하여 수행하였다.
구체적으로, 각 프라이머 0.4 μM, 각 프로브 0.1 μM, 마그네슘 아세테이트 14 mM, 냉동건조된 효소 펠렛(lyophilized enzyme pellets), 반응 완충액, DNA 시료를 포함한 반응 혼합물 50 μL로 RPA를 수행하였으며, RPA 증폭은 40 ℃에서 20분간 인큐베이션한 후 얼음 위에 보관하여 수행하였다. 음성 대조군(NC)으로 DNA 시료가 포함되지 않은, 뉴클레아제가 없는 증류수를 사용하였다. RPA로 증폭된 DNA 절편 중 10 μL를 1.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 5종 복숭아 곰팡이에서 상기 프라이머 프라이머 및 프로브들을 이용해 RPA를 수행하면 각 곰팡이 종 특이적으로 유전자가 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 5종 복숭아 곰팡이 특이적 RPA-LFA 프라이머 및 프로브 제작
측면흐름분석(LFA)에 적용할 수 있도록 상기 실시예 5에서 개발한 프라이머 및 프로브를 바탕으로 LFA용 프라이머 및 프로브를 제작하였다.
구체적으로, TwistAmp사에서 개발한 Milenia hybridetct-1과 호환될 수 있는 프라이머 및 프로브를 개발하였다. 상기 실시예 5의 역방향 프라이머 (서열번호 2, 5, 8, 11 및 14)의 5' 말단에 비오틴(biotin)을 표지하고, 각 프로브의 5' 말단에 FAM을 표지하였으며, 프로브의 35번째 서열에 비염기 형태로 치환된 서열인 d스페이서(dSpacer)를 삽입하였고, 프로브의 3' 말단에 C3 스페이서를 표지하였다. 제작한 프라이머 및 프로브는 표 5에 나타낸 바와 같다.
| 곰팡이 | 프라이머 및 프로브 |
염기서열 | 증폭 산물 (bp) |
| Cytospora leucostoma.. |
18-484-168-F1 | TTCGATGCTGTGTACGAATTTCAGGAGTCT | 168 |
| 18-484-168-BioR1 | Biotin-AGAGTCATCACTCGACTCCAGGTGCTGCAC | ||
| 18-484-168-probe | FAM-AAATCGCGAAGGCAGCGGACAGTGGCAGCTGGGC- dSpacer-TGCTGCCAAGAACAG-C3 spacer |
||
| Macrophomina phaseolina | 19-016-185-F1 | TCAGCACAATCGACTTGAATCACACTACCG | 185 |
| 19-016-185-BioR1 | Biotin-GAATTCGTCGAGGGTGACTTCGAAGGTGAG | ||
| 19-016-185-probe | FAM-AATGCAACGGCGTCGAACACCAGTATCGCTACGC- dSpacer-TACGGCAACTCTGGT-C3 spacer |
||
| Diaporthe helianthi | 19-168-175-F1 | CAACAGCCACACGCTCCGACAGCTCGCCCT | 175 |
| 19-168-175-BioR1 | Biotin-TGTTCGAAGAAAATAGACGAGGTTTTCAGC |
||
| 19-168-175-probe | FAM-GACCTGCCAAGCCGTTCATGATGTCGTAACCCCG- dSpacer-CACTATACAGCTCCA-C3 spacer |
||
|
Monillinia
fructicola |
19-382-189-F1 | ATTATTGGATGATCACAACGGTACACATGC | 189 |
| 19-382-189-BioR1 | Biotin-TTTGTTTTCATCGGGTCTAGACCTGGAAGC | ||
| 19-382-189-probe | FAM-TTCACAGTGCGCAGTCTCACAGGAAAGTATCCAG- dSpacer-GTCAAATTGACTCTT-C3 spacer |
||
|
Phytophthora
cactorum |
19-435-192-F1 | TTCCCTGGATATCAGACTACGGAACCGCTG | 192 |
| 19-435-192-BioR1 | Biotin-GTATGGATTTGGCGTTAATTCCCCTACAGT | ||
| 19-435-192-probe | FAM-CACTGAAGAATGATGACTCAAATCGTAGCAAACA- dSpacer-CGGCTTGAGGACAGC-C3 spacer |
본 발명에서 측면흐름분석(LFA)은 Milenia hybridetect-1 LFA 시스템에 의해 수행되었으며, 상기 시스템은 비오틴+FITC/FAM으로 라벨링된 DNA 시료를 검출할 수 있다. LFA시스템에는 2개의 밴드가 있으며, 그 중 테스트 밴드에서는 스트렙토비딘(streptavidin)에 비오틴이 라벨링된 DNA가 결합하게 되어 밴드의 유무를 통해 타겟 유전자의 증폭을 알 수 있다. 대조군 밴드의 경우에는 anti-Rb 항체가 있어, 분석-특이적 용액 내 금 입자와 결합된 항-FTIC 항체와 결합하게 된다.
상기 프라이머 및 프로브를 이용해 RPA 방법으로 증폭된 산물 20 μL와 분석-특이적 용액(analytic-specific solution) 80 μL를 섞은 후 5분간 실온에서 인큐베이션하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, LFA를 통해 RPA로 증폭된 유전자들이 테스트 밴드에서 진하게 나오는 것을 확인하였다. 반면, DNA 시료 없이 RPA를 수행한 샘플을 테스트한 결과 테스트 밴드에서 매우 약한 밴드를 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 비오틴이 라벨링된 역방향 프라이머가 스트렙토비딘(streptavidin)에 결합하는 것으로 예측할 수 있었다. DNA 증폭 산물을 pGEM-T Easy 클로닝 벡터에 클론 후 Sanger-sequencing을 통하여, 표 6에 나타낸 바와 같이 RPA로 증폭된 복숭아 5종 병원성 곰팡이 유전자의 염기서열을 확인하였다.
| 곰팡이 | 염기서열 | 서열 번호 |
| Cytospora leucostoma... |
TTCGATGCTGTGTACGAATTTCAGGAGTCTACCCCCGAAAAATCGCGAAGGCAGCGGACA GTGGCAGCTGGGCGTGCTGCCAAGAACAGAAATACCGCTCCTCACTCACGCAATCAAACAA GCACACTTCCACGGTCTGTGCAGCACCTGGAGTCGAGTGATGACTCT |
16 |
| Macrophomina phaseolina | TCAGCACAATCGACTTGAATCACACTACCGCGTGGAATGCAACGGCGTCGAACACCAGTAT CGCTACGCCTACGGCAACTCTGGTTATCCTATCTAGCCCTACTACGACTGCTGCGCTGACA GGTTCGTGCGATAAAAGCTATTGGGTCAATCATCTCACCTTCGAAGTCACCCTCGACGAATTC |
17 |
| Diaporthe helianthi | CAACAGCCACACGCTCCGACAGCTCGCCCTGACCTGCCAAGCCGTTCATGATGTCGTAACC CCGGCACTATACAGCTCCATCTATTTCACAGGCCCCAGGACCGATCCTGATCTTCCCGTAC CGACAGACCGCCAAAACCCAGGCGCTGAAAACCTCGTCTATTTTCTTCGAACA |
18 |
| Monilliniafructicola | ATTATTGGATGATCACAACGGTACACATGCTTCACAGTGCGCAGTCTCACAGGAAAGTATC CAGAGTCAAATTGACTCTTTCGGGCGCATCTCCGAACCAAAGATCAGAAAGCGAAGCAAAC TATGGCCAGACGCTAGAAGAGAAAATTGGAAGCAATGGCTTCCAGGTCTAGACCCGATGAA AACAAA |
19 |
|
Phytophthora
cactorum |
TTCCCTGGATATCAGACTACGGAACCGCTGAAAGTATGGGAGAGTCTGATCGGTAAAAAG CGTCGATTATCTGACCCACTGAAGAATGATGACTCAAATCGTAGCAAACAACGGCTTGAGG ACAGCTTTGCTGTTGATTCATCGACATCACCTGACGATGACACTGTAGGGGAATTAACGCC AAATCCATAC |
20 |
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
BIO-FD&C
<120> Primer and probe sets for diagnosing five fungi infecting Prunus
persica and diagnostic methods using thereof
<130> KPA2021-210
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 1
ttcgatgctg tgtacgaatt tcaggagtct 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 2
agagtcatca ctcgactcca ggtgctgcac 30
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 3
aaatcgcgaa ggcagcggac agtggcagct gggcgtgctg ccaagaacag 50
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 4
tcagcacaat cgacttgaat cacactaccg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 5
gaattcgtcg agggtgactt cgaaggtgag 30
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 6
aatgcaacgg cgtcgaacac cagtatcgct acgcctacgg caactctggt 50
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 7
caacagccac acgctccgac agctcgccct 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 8
tgttcgaaga aaatagacga ggttttcagc 30
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<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 9
gacctgccaa gccgttcatg atgtcgtaac cccggcacta tacagctcca 50
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 10
attattggat gatcacaacg gtacacatgc 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
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tttgttttca tcgggtctag acctggaagc 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 12
ttcacagtgc gcagtctcac aggaaagtat ccagagtcaa attgactctt 50
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 13
ttccctggat atcagactac ggaaccgctg 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
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gtatggattt ggcgttaatt cccctacagt 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artifical sequence
<400> 15
cactgaagaa tgatgactca aatcgtagca aacaacggct tgaggacagc 50
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<212> DNA
<213> Cytospora leucostoma
<400> 16
ttcgatgctg tgtacgaatt tcaggagtct acccccgaaa aatcgcgaag gcagcggaca 60
gtggcagctg ggcgtgctgc caagaacaga aataccgctc ctcactcacg caatcaaaca 120
agcacacttc cacggtctgt gcagcacctg gagtcgagtg atgactct 168
<210> 17
<211> 185
<212> DNA
<213> Macrophomina phaseolina
<400> 17
tcagcacaat cgacttgaat cacactaccg cgtggaatgc aacggcgtcg aacaccagta 60
tcgctacgcc tacggcaact ctggttatcc tatctagccc tactacgact gctgcgctga 120
caggttcgtg cgataaaagc tattgggtca atcatctcac cttcgaagtc accctcgacg 180
aattc 185
<210> 18
<211> 175
<212> DNA
<213> Diaporthe helianthi
<400> 18
caacagccac acgctccgac agctcgccct gacctgccaa gccgttcatg atgtcgtaac 60
cccggcacta tacagctcca tctatttcac aggccccagg accgatcctg atcttcccgt 120
accgacagac cgccaaaacc caggcgctga aaacctcgtc tattttcttc gaaca 175
<210> 19
<211> 189
<212> DNA
<213> Monilinia fructicola
<400> 19
attattggat gatcacaacg gtacacatgc ttcacagtgc gcagtctcac aggaaagtat 60
ccagagtcaa attgactctt tcgggcgcat ctccgaacca aagatcagaa agcgaagcaa 120
actatggcca gacgctagaa gagaaaattg gaagcaatgg cttccaggtc tagacccgat 180
gaaaacaaa 189
<210> 20
<211> 192
<212> DNA
<213> Phytophthora cactorum
<400> 20
ttccctggat atcagactac ggaaccgctg aaagtatggg agagtctgat cggtaaaaag 60
cgtcgattat ctgacccact gaagaatgat gactcaaatc gtagcaaaca acggcttgag 120
gacagctttg ctgttgattc atcgacatca cctgacgatg acactgtagg ggaattaacg 180
ccaaatccat ac 192
Claims (18)
- 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 프로브, 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 표시되는 프로브, 및 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 표시되는 프로브를 포함하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 2, 5, 8, 11 및 14로 표시되는 프라이머들은 5' 말단에 비오틴(biotin)을 표지물질로 가지고,
상기 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가지고, 비염기성(Abasic) 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제2항에 있어서,
상기 비염기성 잔기는 상기 프로브의 34번째 염기 다음에 위치하는 것을 특징으로 하는, 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 프라이머 및 프로브는 재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)을 수행하기 위한 것인, 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제2항에 있어서,
상기 프라이머 및 프로브는 측면흐름분석(Lageral flow assay, LFA)을 수행하기 위한 것인, 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
- 제1항의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 서열번호 2, 5, 8, 11 및 14로 표시되는 프라이머들은 5' 말단에 비오틴(biotin)을 표지물질로 가지고,
상기 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가지고, 비염기성(Abasic) 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 복숭아 곰팡이 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 비염기성 잔기는 상기 프로브의 34번째 염기 다음에 위치하는 것을 특징으로 하는, 복숭아 곰팡이 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 프라이머 및 프로브는 재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)을 수행하기 위한 것인, 복숭아 곰팡이 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 측면흐름분석(Lageral flow assay, LFA)을 수행하기 위한 것인, 복숭아 곰팡이 진단용 조성물.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 복숭아 곰팡이 진단용 키트.
- 제11항에 있어서,
상기 키트는 재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)용인, 복숭아 곰팡이 진단용 키트.
- 제11항에 있어서,
상기 키트는 측면흐름분석(Lageral flow assay, LFA)용인, 복숭아 곰팡이 진단용 키트.
- (a) 시료로부터 복숭아 곰팡이 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
사이토스포라 류코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파서리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헤리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monillinia fructicola) 및 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 서열번호 2, 5, 8, 11 및 14로 표시되는 프라이머들은 5' 말단에 비오틴(biotin)을 표지물질로 가지고,
상기 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가지고, 비염기성 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 복숭아 곰팡이 진단 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 비염기성 잔기는 상기 프로브의 34번째 염기 다음에 위치하는 것을 특징으로 하는, 복숭아 곰팡이 진단 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 표적 핵산을 증폭하는 단계는 재조합효소 중합효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)에 의해 수행되는 것인, 진단 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 표적 핵산을 검출하는 단계는 측면흐름분석(Lageral flow assay, LFA)에 의해 수행되는 것인, 진단 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020210122437A KR102636355B1 (ko) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 및 프로브 세트 및 진단 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020210122437A KR102636355B1 (ko) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 및 프로브 세트 및 진단 방법 |
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| KR20230039864A KR20230039864A (ko) | 2023-03-22 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020210122437A KR102636355B1 (ko) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 및 프로브 세트 및 진단 방법 |
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|---|---|
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Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
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-
2021
- 2021-09-14 KR KR1020210122437A patent/KR102636355B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Aradhika Tripathi et al., Archives of Microbiology, 2021.03.08. |
| J. Yu et al., Letters in Applied Microbiology, 69, pp.64-70, 2019. |
| Tae Heon Lim et al., Plant Pathol. J., 22(4), p.369-374, 2006.* |
| Y. Luo et al., Journal of Applied Microbiology, 122, p.416-428, 2016.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20230039864A (ko) | 2023-03-22 |
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