JPH0759577A

JPH0759577A - プローブ及びプライマーの製造方法

Info

Publication number: JPH0759577A
Application number: JP5227806A
Authority: JP
Inventors: Ariaki Obara; 有晶小原
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1993-08-23
Filing date: 1993-08-23
Publication date: 1995-03-07

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】柑橘植物の品種の遺伝的同一性の判定に好適
に用いられるプローブ又はプライマーとを設計する基と
なるバレンシアオレンジのリボソームＲＮＡをコードす
る遺伝子；柑橘植物の品種の遺伝的同一性の判定方法に
用いられるプローブ又はプライマー及びこれらを用いる
柑橘植物の品種の遺伝的同一性の判定方法の提供。【構成】特定の塩基配列を含むバレンシアオレンジの
リボソームＲＮＡをコードする遺伝子；柑橘系植物のリ
ボソームＲＮＡをコードする遺伝子のスペーサー領域の
塩基配列の一部又は全部を含む柑橘植物の遺伝子の制限
断片長多型検出用プローブ；柑橘系植物のリボソームＲ
ＮＡをコードする遺伝子のスペーサー領域の塩基配列の
一部又は全部を増幅し得る遺伝子増幅用プライマー；特
定の塩基配列を含む遺伝子増幅用プライマー；上記制限
断片長多型検出用プローブを用いる柑橘植物の遺伝子の
制限断片長多型のサザンブロット法による検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、柑橘植物の品種の遺伝
的同一性の判定に好適に用いられるプローブ又はプライ
マーとを設計する基となるバレンシアオレンジのリボソ
ームＲＮＡをコードする遺伝子；柑橘植物の品種の遺伝
的同一性の判定方法に用いられるプローブ又はプライマ
ー及び当該プローブ又はプライマーを用いることを特徴
とする柑橘植物の品種の遺伝的同一性の判定方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】今日まで、オレンジ等の柑橘植物では、
より優良な品種を求めて何百種にも及ぶ栽培品種が作出
されている。そしてそれら品種を判定するために、開花
・結果・熟期や栽培条件など生理的特性の分析や葉・花
・果実の構造や樹姿など生態的特性の観察などが、事細
かに行なわれている。

【０００３】また、柑橘植物の果実あるいは果汁を主原
料とする果汁飲料では、高品質の製品を製造するため
に、優良な果実品種とそれに由来する原料果汁を選び、
確保する必要がある。そのため、試飲による香味試験
や、糖や酸組成など理化学的分析指標を用いて果実品種
の比較判定が現在行われている。しかしながら、上記の
ような従来法では植物の成長を待たなければならず、時
間的に効率的ではないことに加えて、その結果の見極め
にかなりの経験と熟練を要する。さらに、果汁中の糖や
酸の組成等を検定するための理化学的測定手段を用いて
得られる情報は少ない上、個々の農作物間のばらつきが
大きく、直接的に品種判定をするには適していない。か
かる課題を解決するために、植物の小リボソームＲＮＡ
遺伝子の高度に保存された部分をプライマーとして、柑
橘系植物の小リボソームＲＮＡ遺伝子可変部を増幅させ
ることによって柑橘植物種を判定する試みがなされてい
る（平成４年４月３日，日本農芸化学会１９９２年度大
会）。

【０００４】確かに上記判定方法は柑橘植物種を的確に
判断し得る優れた方法である。しかしながら、当該方法
は同一種に属する異なる品種を明確にかつ簡便に判別し
得るまでには至っていない。柑橘系植物は、その種は勿
論のことその品種が異なることによって、当該果実や果
汁製品の風味が大きく異なる。よって、柑橘系植物の品
種の違いを正確にかつ簡便に判別し得る方法の確立が産
業界で待たれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な欠点がなく、柑橘植物の葉、果実あるいはその果汁中
に存在する遺伝子ＤＮＡを解析することにより、迅速か
つ直接的に品種判定を行なう手段の提供をその目的とす
るものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題の
解決のために鋭意検討を重ねた結果、柑橘系植物の細胞
内リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析し、かかる
塩基配列のスペーサー部分の全部又は一部をＲＦＬＰｓ
法やＤＮＡフィンガープリント法に用いられるプローブ
又はプライマーとして用いることで上記の課題を解決し
得ることを見出した。

【０００７】すなわち、本発明は以下の事項をその要旨
とするものである。 (1)配列番号１に示す塩基配列を含む、バレンシアオレ
ンジのリボソームＲＮＡをコードする遺伝子。 (2)柑橘系植物のリボソームＲＮＡをコードする遺伝子
の、スペーサー領域の塩基配列の一部又は全部を含む、
柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型検出用プローブ。

【０００８】(3)柑橘系植物のリボソームＲＮＡをコー
ドする遺伝子の、スペーサー領域の塩基配列の一部又は
全部を増幅し得る、遺伝子増幅用プライマー。 (4)配列番号１に示す塩基配列を含むバレンシアオレン
ジのリボソームＲＮＡをコードする遺伝子の、スペーサ
ー領域の塩基配列の一部又は全部を含む、柑橘植物の遺
伝子の制限断片長多型検出用プローブ。

【０００９】(5)配列番号１に示す塩基配列を含む、バ
レンシアオレンジのリボソームＲＮＡをコードする遺伝
子のスペーサー領域の塩基配列の一部又は全部を増幅し
得る、遺伝子増幅用プライマー。 (6)配列番号２に示す塩基配列を含む、柑橘植物の遺伝
子の制限断片長多型検出用プローブ。

【００１０】(7)配列番号３又は配列番号４に示す塩基
配列を含む、遺伝子増幅用プライマー。 (8)柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型をサザンブロッ
ト法によって検出する方法において、前記(2),(4) 又は
(6) に記載した増幅断片長多型検出用プローブを用いる
ことを特徴とする、柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型
の検出方法。

【００１１】(9)柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型を
特定の遺伝子を増幅させることによって検出する方法に
おいて、前記(3),(5) 又は(7) に記載した遺伝子増幅用
プライマーを用いて特定の遺伝子を増幅させることを特
徴とする、柑橘植物の遺伝子の増幅断片長多型の検出方
法。以下、本発明について詳細に説明する。

【００１２】近年、ＲＦＬＰｓ法やＤＮＡフィンガープ
リント法により生物の遺伝的多型を検出し、その系統を
遺伝的に鑑別することが可能となった。例えば、人の個
人識別では、Alu I ファミリーなど遺伝子の特徴的な反
復配列を持つＤＮＡ断片が用いられる。しかしながら、
ヒトの遺伝子と植物の遺伝子とは異なるので、そのよう
なＤＮＡ断片を植物の判定に用いることは難しい。

【００１３】そこで、染色体中で長い縦列反復配列を形
成するリボソームＲＮＡ遺伝子に注目し、リボソームＲ
ＮＡ遺伝子を単離し、その構造を明らかにすることが必
要となる。本発明において「リボソームＲＮＡ遺伝子」
とは、細胞内において蛋白質合成等を司る細胞内小器官
であるリボソームの構成成分であるリボソームＲＮＡを
コードする遺伝子である。そして、かかるリボソームＲ
ＮＡ遺伝子は全ての生物の遺伝子中に存在し、当該遺伝
子を構成する塩基配列中に生物の進化に関する情報が含
まれていることが既に判明しており、当該遺伝子の塩基
配列は微生物の分類等に現在利用されている（David M.
Ward,Roland Weller＆Mary M.Bateson,Nature,345,63-6
5(1990))。なお、以下に必要に応じて「リボゾームＲＮ
Ａ」をrＲＮＡと略記する。

【００１４】植物のリボソームＲＮＡ遺伝子は、遺伝子
上にスペーサー領域を介して、18SrＲＮＡ遺伝子、5.8S
rＲＮＡ遺伝子及び25S rＲＮＡ遺伝子の順に並んでい
る。これらのリボソームＲＮＡ遺伝子は、ＲＮＡポリメ
ラーゼＩによって転写され、次いで当該転写産物は切断
され、それぞれ18S rＲＮＡ、5.8S rＲＮＡ及び25S rＲ
ＮＡとなる。そして、この際上記スペーサー領域は分解
される。その後、18SrＲＮＡは植物のリボソームの小サ
ブユニットを構成し、5.8S rＲＮＡ及び25S rＲＮＡは
植物のリボソームの大サブユニットを構成する。

【００１５】なお、上記において「スペーサー領域」と
は、リボソームＲＮＡの遺伝子のコード領域間に介在す
る当該遺伝子における非コード領域のことをいう。そし
て、かかるスペーサー領域は、柑橘系植物品種間におい
てさえも非常に特異性が高いことを特徴とする。本発明
の遺伝子の制限断片長多型検出用プローブ又は遺伝子増
幅用プライマーの基となるリボソームＲＮＡ遺伝子を保
有する柑橘系植物は、特にその種類が限定されるもので
はない。例えば、オレンジ、グレープフルーツ、温州み
かん、レモン等を代表的な柑橘系植物として例示するこ
とができる。さらに、これらの柑橘系植物の品種を指定
し、当該品種を他の当該柑橘系植物と判別することを可
能ならしめることが本発明の大きな特徴である。

【００１６】そして柑橘系植物以外の植物においても、
本発明遺伝子の制限断片長多型検出用プローブ又は遺伝
子増幅用プライマーを用いて品種間の差異を判定するこ
とが可能である。ここで、柑橘系植物のリボソームＲＮ
Ａ遺伝子の塩基配列の決定方法について説明する。

【００１７】まず、サンプルとして用いる柑橘植物の組
織から通常公知のＤＮＡ抽出法、例えばフェノール抽出
法又はＣＴＡＢ法（M.G.Murray,W.F.Thompson,Nucleic
Acids Res.,8,4321(1980))により、染色体ＤＮＡを抽出
する。この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素を用いて切断
し、ＤＮＡフラグメントを調製する。そしてこのＤＮＡ
フラグメントをプラスミドベクターあるいはファージベ
クター等の形質転換用ベクターに組み込み、宿主、例え
ば大腸菌を形質転換し、サンプルとして用いた柑橘系植
物の遺伝子ライブラリーを作製する。次いで、かかる遺
伝子ライブラリーを、既知の植物由来のリボソームＲＮ
Ａ遺伝子又はその一部、あるいは当該塩基配列を基に合
成したＤＮＡをプローブとしてスクリーニングし、リボ
ソームＲＮＡ遺伝子を含むクローンを単離する。そし
て、得られたクローンの塩基配列を通常公知の手段（例
えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Maxam-Gilb
ert,Meth.Enzym.,65,499-560(1980));ジデオキシヌクレ
オチド鎖修飾法(Messing,J.and Vieira,J.,Gene,19,269
-276(1982)等）に従って決定することができる。

【００１８】このようにして決定された塩基配列は、既
知の植物由来のリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列、例
えばイネの17S リボソームＲＮＡ遺伝子、5.8Sリボソー
ムＲＮＡ遺伝子及び25SリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基
配列(Takaiwa,F.,Oono,K.andSugiura,M.,Nucleic Acids
Res.12,5441-5448(1984),Sugiura,M.,Iida,Y.,Oono,K.
and Takaiwa,F.,Gene 37,255-259(1985),Takaiwa,F.,Oo
no,K.and Sugiura,M.,Plant Mol.Biol.4,355-364(198
5))と比較することによりリボソーム遺伝子をコードす
る領域とスペーサー領域とを判別することができる。本発明においては、上記スペーサー領域の全部又は
一部をＲＦＬＰｓ法において用いるプローブとすること
を一つの特徴とする。

【００１９】ＲＦＬＰｓ法とは、ＲＦＬＰ（restrictio
n fragment length polymorphism)（制限酵素断片長多
型）を用いた遺伝子多型を用いた遺伝子解析法である。
かかるプローブとして用いる遺伝子断片の設計は、当該
プローブの少なくとも一部が上記スペーサー領域を構成
する塩基配列の全部又は一部を含むべく設計する。当該
遺伝子断片の塩基長は最長、上記スペーサー領域の全体
長をそのまま用いることが可能である。しかしながら、
プローブとしての特異性を確保する必要性を考慮すれ
ば、当該スペーサー領域として２Kb程度を上限とするこ
とが好ましい。逆に当該塩基長は、最小は当該スペーサ
ー領域として２mer 程度までとすることが可能である。
しかしながら、プローブとしての検出感度を確保する必
要性を考慮すれば、当該塩基長は少なくとも４mer 以上
であることが好ましい。

【００２０】なお、上記の柑橘植物の品種判定をおこな
うためのプローブは、バレンシアオレンジ由来のリボソ
ームＲＮＡ遺伝子を含むベクターを適当な制限酵素で消
化し、リボソームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡフラグメントを
分取することにより得ることができる。また、本発明プ
ローブの塩基配列は、当該プローブを用いたＲＦＬＰｓ
法における検出感度を良好に保つべきであるという観点
により、可能な限りスペーサー領域を構成する塩基配列
と一致させることが好ましい。しかしながら、当該プロ
ーブは必ずしも全体が、スペーサー領域の塩基配列と完
全に一致していなくても植物品種間の差異を検出するこ
とは可能である。例えば、プローブの一部にリボソーム
ＲＮＡの構造遺伝子が含まれていたり、スペーサー領域
を構成する塩基配列の一部が改変されている場合でも本
発明プローブとして用いることが可能である。かかる場
合においても、本来のスペーサー領域を構成する塩基配
列との差異は、30％以内であることが好ましい。当該塩
基配列間の差異が30％を越えると、当該プローブを用い
たＲＦＬＰｓ法における検出感度が低下し好ましくな
い。

【００２１】柑橘植物の品種判定をおこなうための上記
プローブは、化学合成法を用いて調製することが可能で
ある。例えばβ- シアノエチル合成法を用いた、市販の
自動ＤＮＡ合成装置により合成することができる。そし
てさらに、所定のリボソームＲＮＡ遺伝子を含むプラス
ミドを適当な制限酵素で消化し、リボソームＲＮＡ遺伝
子のＤＮＡフラグメントを分取することにより得ること
も可能である。

【００２２】さらに、得られた遺伝子断片をプローブを
サザンブロット法等で検出することを可能ならしめるた
めに、標識を行う。かかる標識方法は、当該標識方法の
種類に応じた通常公知の方法を用いることができる。例
えば、³²P により標識する場合には、ニックトランスレ
ーション法やマルチプライム法を、またオリゴヌクレオ
チドの標識には5'末端標識等を用いることができる。Ｒ
ＦＬＰｓ法においては、試料とする柑橘植物の果実から
はフェノール抽出法等で、また葉からはＣＴＡＢ法等で
染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素で消化した後、
電気泳動法によりＤＮＡフラグメントをサイズ別に分離
する。次いで、当該ＤＮＡフラグメントと上記プローブ
とでサザンブロット−ハイブリダイゼーションをおこな
うと多くのバンドのパターンが得られる。このパターン
は、染色体ＤＮＡの構造により決定される。すなわち、
同一である染色体ＤＮＡでは、同一のパターンが得ら
れ、近縁にある染色体ＤＮＡでは、非常に似通ったパタ
ーンが得られる。

【００２３】従って、このパターンを比較することによ
り柑橘植物の品種を判定することが可能となる。また、上記スペーサー領域の遺伝子断片を遺伝子増幅
法により増幅させて、ＤＮＡフィンガープリント法に供
するべく、遺伝子増幅プライマーを設計及び調製するこ
とを特徴とする。

【００２４】上記プライマーの設計に関しては、増幅す
る領域の長さは100 〜1000bp程度とし、その内にスペー
サー領域の全部又は一部を含むようにするのが増幅産物
の多型性を高めやすいという点において好ましい。ま
た、プライマーの長さは15〜30mer 程度、好ましくは20
mer 程度である。また、２種のプライマーを用いる場合
は、それぞれのＴ_m値を可能な限り近づけることが増幅
の再現性を高め得るという点において好ましい。

【００２５】なお、植物間において保存性の高いリボソ
ームＲＮＡコード領域をプライマーとすると植物間にお
いてＰＣＲ増幅のパターンが保存されやすく、スペーサ
ー領域をプライマーとすると柑橘植物間での特異性が高
まる傾向がある。また、当該プライマーの塩基配列は、
可能な限りリボソームＲＮＡの塩基配列と一致させるこ
とが、増幅を企図する遺伝子部分への結合性を向上させ
るという点において好ましい。しかしながら、当該配列
が、完全にリボソームの塩基配列と一致していない場合
にも、本発明増幅用プライマーとして用いることが可能
である。しかしながら、当該増幅用プライマーの塩基配
列と本来のリボソームＲＮＡの塩基配列との相違は30％
以内であることが好ましい。かかる相違が30％を越える
とリボソームＲＮＡ遺伝子の増幅を企図する部分への結
合効率が低下する故に好ましくない。

【００２６】柑橘植物の品種判定をおこなうための上記
プライマーは、例えば新規に単離されたバレンシアオレ
ンジ由来のリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列をもと
に、１種あるいは適当な領域をはさむ２種の配列を設計
し、β−シアノエチル合成法を用いたアプライド−バイ
オ−システム社製などの自動ＤＮＡ合成装置により簡単
に合成できる。

【００２７】なお、また柑橘系植物以外のリボソームＲ
ＮＡ遺伝子であっても、その保存されている領域は共通
する傾向にあるので、柑橘系植物とその保存領域が共通
すると推測される柑橘系植物以外の植物の既知の当該遺
伝子の塩基配列に準じて、本発明遺伝子増幅用プライマ
ーを設計及び調製することができる。例えば、既知のイ
ネの塩基配列(Takaiwa,F.,Oono,K. ＆Sugiura,M.,Nucle
ic Acids Res ,12,5441-5448(1984)) より、そのリボソ
ームＲＮＡ遺伝子部分の塩基配列に準じて本発明遺伝子
増幅用プライマーを設計及び調製することができる。Ｂ．本発明は、先に述べた課題を解決するために新たに
単離したリボソームＲＮＡ遺伝子をもとに、プローブや
プライマーを作製し、これらを用いてＲＦＬＰｓ、ＤＮ
Ａフィンガープリント法を行うことを特徴とする。

【００２８】ＲＦＬＰｓ法においては、試料とする柑橘
植物の果実からフェノール抽出法あるいは葉からＣＴＡ
Ｂ法により染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素で消
化した後、電気泳動法によりＤＮＡフラグメントをサイ
ズ別に分離する。ついでＤＮＡフラグメントとプローブ
とでサザンブロット−ハイブリダイゼーションをおこな
うと多くのバンドのパターンが得られる。このパターン
は、染色体ＤＮＡの構造により決定される。すなわち、
同一である染色体ＤＮＡでは、同一のパターンが得ら
れ、近縁にある染色体ＤＮＡでは、非常に似通ったパタ
ーンが得られる。従って、このパターンを比較すること
により柑橘植物の品種を判定することが可能となる。２）ＤＮＡフィンガープリント法試料とする柑橘植物の果実からはフェノール抽出法等
で、また葉からはＣＴＡＢ法等で染色体ＤＮＡを抽出す
る。その一部に適当な条件下で上記増幅用プライマーと
ＤＮＡ合成酵素を作用させＰＣＲ反応等を行うと染色体
ＤＮＡに存在するある特定の領域が増幅される。増幅産
物を電気泳動法によりＤＮＡフラグメントをサイズ別に
分離すると多くのバンドのパターンが得られる。このパ
ターンは、上記ＲＦＬＰｓ法の場合と同様に染色体ＤＮ
Ａの構造により決定される。すなわち、同一である染色
体ＤＮＡでは、同一のパターンが得られ、近縁にある染
色体ＤＮＡでは、非常に似通ったパターンが得られる。
従って、このパターンを比較することにより柑橘植物の
品種を判定することが可能となる。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲が当該実施例によって限
定的に解釈されるものではない。〔実施例１〕バレンシアオレンジのリボソームＲＮＡ遺
伝子の塩基配列の決定本実施例は、バレンシアオレンジ染色体遺伝子中からリ
ボソームＲＮＡ遺伝子を単離しようとするものである。

【００３０】試料は、バレンシアオレンジの成葉を用い
た。葉からの染色体ＤＮＡの抽出は、約１g の成葉から
ＣＴＡＢ法により行い、得られた沈殿を10mM Tris-HCl
(pH7.4)，１mMＥＤＴＡ(pH8.0) を含む緩衝液１mlに溶
解し、ＤＮＡ溶液とした。遺伝子ライブラリーの作製は
以下の手順で行った。染色体ＤＮＡの切断は、50mM Tri
s-HCl(pH7.5),10mM MgCl₂,１mM Dithiothreitol,50mM N
aCl,0.01％ BSAと10単位の制限酵素Xba I （宝酒造社
製) と４ugの染色体ＤＮＡを含む反応液50ulを37℃で６
時間反応を行った。当該反応液をフェノール・クロロフ
ォルム抽出及びクロロフォルム抽出により精製し、エタ
ノール沈殿により濃縮した後、10ulの滅菌水に溶解し、
これをＤＮＡ溶液とした。ベクターの調製は、10ulのラ
ムダFIXII ベクター（ストラタジーン社製，１ug/ul)
に、300mM Tris-HCl(pH7.4),100mM DTT,100mM MgCl₂,10
mM ATPを含むライゲーション反応液２ul、１ulのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社製，１U/ul)
と７ulの滅菌水を加え、16℃で一晩連結反応を行った。
反応液20ulに、500mM Tris-HCl(pH7.5),100mM MgCl₂,10
mM Dithiothreitol,500mM NaClを含むバッファーＭ 10u
l,10ulの0.1 ％BSA,10ulのTritonX-100,１ulの制限酵素
XbaIと49ulの滅菌水を加え、37℃で２時間反応を行っ
た。さらにこの反応液100ul に25ulの１M Tris-HCl(pH
9.0) 、374ul の滅菌水と１ulの牛小腸由来のアルカリ
フォスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製，１U/
ul) を加え、37℃で30分間脱リン酸化反応を行った。当
該反応液をフェノール・クロロフォルム抽出及びクロロ
フォルム抽出により精製し、エタノール沈殿により濃縮
した後10ulの滅菌水に溶解し、これをベクター溶液とし
た。断片化された染色体ＤＮＡのベクターへの組み込み
は、３ulのＤＮＡ溶液に、１ulのベクター溶液、ライゲ
ーション反応液0.5ul 、及び0.5ul のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを加え、16℃で一晩連結反応を行った。この反応液の
うち１ulをギガパックIIゴールドパケージングエキスト
ラクト（ストラタジーン社製) を用いて、invitroパッ
ケージングを行い、遺伝子ライブラリーとした。

【００３１】ＤＮＡプローブの作製は、以下の手順で行
った。すなわち、１ulのバレンシアオレンジ由来の染色
体ＤＮＡ溶液を10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mM
MgCl₂,0.001 ％(W/V) ゼラチン,200uM dATP,200uM dCT
P,200uM dGTP,200uM dTTPと20pmolのプライマー（配列
番号５及び配列番号６）及び2.5 単位のアンプリタック
ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液98.5ulに加え、50ulの
ミネラルオイルを重層した後、パーキンエルマーシータ
ス社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、94℃，１分
間、55℃, ２分間、72℃, １分間の条件で25サイクルの
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ増幅産
物をエタノール沈殿により濃縮した後、３％アガロース
ゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡフラグメ
ントとして分離した。ＤＮＡフラグメントをGene Clean
IIキット(Bio 101社製) によりアガロースゲルから回収
し、プローブ溶液とした。

【００３２】遺伝子ライブラリーのスクリーニングは、
遺伝子ライブラリーの一部をプレートに播き、プラーク
のプロット、プライマーの標識、ハイブリダイゼーショ
ン、ハイブリッドの検出は、ＥＣＬ−ダイレクトＤＮＡ
／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャム社製）
を用いて行った。その結果、数個の陽性クローンが得ら
れた。

【００３３】陽性クローンのサブクローニングは、以下
の手順で行った。すなわち、１個の陽性クローンからの
ファージの調製は、Maniatisらの方法(T.Maniatis,E.E.
Fritsch,and J.Sambrook,"Molecular Cloning"Cold Spr
ing Harbor Laboratory 1982) により行った。得られた
ファージＤＮＡ10ugを10mMTris-HCl(pH7.5),10mM MgC
l₂, １mM Dithiothreitol,50mM NaCl,0.01％ BSAと10単
位の制限酵素Xba I(宝酒造社製) とを含む反応液20ulで
37℃で２時間消化した後、２ulの１MTris-HCl(pH9.0)、
77ulの滅菌水と１ulの牛小腸由来のアルカリフォスファ
ターゼを加え、37℃で30分間脱リン酸化反応を行った。
反応液をフェノール・クロロフォルム抽出及びクロロフ
ォルム抽出により精製し、エタノール沈殿により濃縮し
た後、10ulの滅菌水に溶解し、これをベクター溶液とし
た。回収したＤＮＡのベクターへの組み込みは、３ulの
ＤＮＡ溶液に、0.5ul のベクター溶液、ライゲーション
の反応液１ul、及び１ulのT4ＤＮＡリガーゼを加え、16
℃で一晩連結反応を行った。２ulの反応液と100ul のJM
109 コンピテントセル（東洋紡製）を混合し、１mMＩＰ
ＴＧ，0.02％X-Gal を含むLB培地に播き形質転換を行っ
た。プレートから組換え体を含むクローンを選別し、プ
ラスミドp ＲＮＡ−ＶＯ１を含む大腸菌EKBC001 とし
た。かかる大腸菌EKBC001 は、1993年７月20日に通商産
業省工業院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4365とし
て寄託されている。

【００３４】リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定
は、以下の手順で行った。プラスミドp ＲＮＡ−ＶＯ１
を含む大腸菌EKBC001 からアルカリ−ＳＤＳ法(T.Mania
tis,E.E.Fritsch,and J.Sambrook,"Molecular Cloning"
Cold Spring Harbor Laboratory 1982) によりプラスミ
ドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを適当な制限酵素
で切断し、ＤＮＡフラグメントをプラスミドベクターpU
C118あるいはpUC119に挿入し、大腸菌JM109 へ導入し
た。また、それからプラスミドＤＮＡを抽出し、キロシ
ーケンス用デレーションキット（宝酒造社製）を用い
て、多数のデレーションクローンを得た。リボソームＲ
ＮＡ遺伝子の一部を含むクローンから、プラスミドＤＮ
Ａを抽出し、アプライドバイオシステム社製の蛍光プラ
イマー−サイクル−シーケンシング−キットを用いてシ
ーケンス反応を行った後、アプライドバイオシステムズ
社製373A型ＤＮＡシーケンサーを用いて挿入されたＤＮ
Ａの塩基配列の決定を行った。得られた塩基配列を連結
し、リボソームＲＮＡ遺伝子の全塩基配列を決定した。

【００３５】当該塩基配列を、配列番号１に表示する。
また、制限酵素部位を含む当該リボソームＲＮＡ遺伝子
の構造の略図を図１に示す。〔実施例２〕ＲＦＬＰｓ法による柑橘植物の品種の解析本実施例は、本発明を用いて柑橘植物の品種を比較判定
しようとするものである。

【００３６】試料は、オレンジの品種であるバレンシ
ア、ハムリン、ペラ、ワシントンネーブル、タロッコ及
びサンタカタリーナの葉を用いた。それぞれの葉からの
染色体ＤＮＡの抽出は、約0.5gの成葉からＣＴＡＢ法に
より行ない、得られた沈殿を10mM Tris-HCl(pH7.4)，１
mM EDTA(pH8.0)) を含む緩衝液１mlに溶解し、ＤＮＡ溶
液とした。

【００３７】染色体ＤＮＡの切断は、50mM Tris-HCl(pH
7.5)，10mM MgCl₂, １mM Dithiothreitol,100mM NaCl，
８単位の制限酵素Eco RI（宝酒造社製) と２ugの染色体
ＤＮＡを含む反応液20ulを37℃で４時間反応を行った。
反応液を0.8 ％アガロースゲル電気泳動に供し、切断さ
れたＤＮＡをＤＮＡフラグメントとして分離した。ＤＮ
Ａフラグメントのサザンブロットは、Vacu Gene ^TMXLバ
キュームブロッティングシステム（ファルマシア社製）
によりHybound-Ｎ⁺ナイロンフィルター（アマシャム社
製）へおこなった。ＤＮＡフラグメントの転写されたフ
ィルターは、80℃で２時間焼け付け処理をおこなった。

【００３８】ＤＮＡプローブの調製は、以下の手順でお
こなった。上記実施例１において調製したプラスミドp
ＲＮＡ−ＶＯ１を含む大腸菌EKBC 001からアルカリ−SD
S 法（T.Maniatis,E.E．Fritsch,and J.Sambrook,"Mole
cular Cloning ”Cold Spring Harbor Laboratory (198
2)) によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤ
ＮＡ10ugを10mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl₂, １mM D
ithiothreitol,50mM NaCl,0.01％BSA,10単位の制限酵素
Xba I （ベーリンガーマンハイム社製) を含む反応液10
0ulで37℃で２時間消化した。反応液を１％アガロース
ゲル電気泳動に供し、ＤＮＡフラグメントとベクターＤ
ＮＡとを分離し、Gene CleanIIキット（Bio 101 社製）
によりアガロースゲルからＤＮＡフラグメントを回収し
た。回収したＤＮＡフラグメント約５ugを50mM Tris-HC
l(pH7.5)，10mM MgCl₂, １mM Dithiothreitol ，100mM
NaCl，10単位の制限酵素Taq I （ベーリンガーマンハイ
ム社製）を含む反応液20ulで65℃で２時間消化した。反
応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡフラ
グメントを分離し、約1kbpのＤＮＡフラグメントを先と
同様にゲルから回収した。この回収されたＤＮＡフラグ
メントをプローブとした（配列番号２）。

【００３９】プローブの標識、先に調製したナイロンフ
ィルタとのハイブリダイゼーション、ハイブリッドの検
出は、ECL −ダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検
出システム（アマシャム社製）を用いておこなった。そ
の結果、サンタカタリーナでは２本、バレンシア、ハム
リン、ワシントンネーブル及びタロッコではそれぞれ１
本のバンドが検出され、ペラでは検出されなかった。

【００４０】また、検出されたバンドの移動度は、ワシ
ントンネーブル、バレンシア、ハムリン、タロッコの順
に大きかった。このようにして、各試料において異なる
シグナルのパターンが得られた。従って、本発明により
柑橘植物の品種の比較判定が可能であることが示された
（図２）。〔実施例３〕ＤＮＡフィンガープリント法による柑橘植
物の品種の解析本実施例は、本発明を用いてオレンジの品種を比較判定
しようとするものである。

【００４１】試料は、オレンジの品種であるバレンシ
ア、ハムリン、ペラ、ワシントンネーブル、タロッコ、
サンタカタリーナ、長島、宮川早生、グレープフルー
ツ、ベルナ、タンゼロ及び山川の葉を用いた。それぞれ
の葉からの染色体ＤＮＡの抽出は、約0.5gの成葉からCT
AB法(M.G.Murray,W.F.Thompson,Nucleic Acids Res.,8,
4321(1980)) により行い、得られた沈殿を10mM Tris-HC
l(pH7.4),1mM EDTA(pH8.0)を含む緩衝液１mlに溶解し、
これをＤＮＡ溶液とした。

【００４２】プライマーは、前記プラスミドpＲＮＡ−
ＶＯ１の塩基配列をもとに２組設計し、アプライドバイ
オシステム社製394 型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを
用いて合成した。さらにOPC カートリッジ（アプライド
バイオシステム社製）により精製し、滅菌水により20pm
ol/ul となるように調整した（配列番号３乃至４）。次
に、ＤＮＡの増幅は、10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KC
l,1.5mM MgCl₂,0.001％(W/V)gelatin，200uM dATP，200
uM dCTP，200uM dGTP，200uM dTTP，及び20pmolのプラ
イマーを含む反応液98.5ulに１ulのＤＮＡ溶液と0.5ul
のアンプリタックＤＮＡポリメラーゼ（５Units/ul) を
加え、50ulのミネラルオイルを重層した後、パーキンエ
ルマーシータス社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用い
て、94℃，１分間、55℃，２分間、72℃，１分間の条件
で25サイクルのＰＣＲ反応を行なった。当該ＰＣＲ反応
終了後、反応液に10ulの３M CH₃COONaを加えエタノール
沈殿をおこない、沈渣を10ulの滅菌水に溶かした。これ
を３％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロ
マイド染色後、ＵＶ照射より増幅したＤＮＡの有無およ
び長さを確認した。その結果、各試料においてＰＣＲ増
幅産物の異なるバンドのパターンが検出された。

【００４３】従って、本発明により柑橘植物の品種の比
較判定が可能であることが示された（図３）。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、柑橘植物の品種の遺伝的
同一性の判定に好適に用いられるプローブ又はプライマ
ーとを設計する基となるバレンシアオレンジのリボソー
ムＲＮＡをコードする遺伝子；柑橘植物の品種の遺伝的
同一性の判定方法に用いられるプローブ又はプライマー
及び当該プローブ又はプライマーを用いることを特徴と
する柑橘植物の品種の遺伝的同一性の判定方法が提供さ
れる。

【００４５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：9558 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：genomic ＤＮＡ起源生物名：バレンシアオレンジ配列の特徴 1-1597 18S ｒＲＮＡ遺伝子コード領
域 1598-1848 スペーサー領域 1849-2011 5.8S ｒＲＮＡ遺伝子コード領域 2012-2238 スペーサー領域 2239-5582 25S ｒＲＮＡ遺伝子コード領域 5583-9396 スペーサー領域 9397-9558 18S ｒＲＮＡ遺伝子コード領域配列 TCTAGAGTCG ACGCGGGCTC TGCCCGTTGC TCTGATGATT CATGATAACT CGACGGATCG 60 CAAGGCCACC GTGCCGGCGA CGCATCATTC AAATTTCTGC CCTATCAACT TTCGATGGTA 120 GGATAGAGGC CTACCATGGT GGTGACGGGT GACGGAGAAT TAGGGTTCGA TTCCGGAGAG 180 GGAGCCTGAG AAACGGCTAC CACATCCAAG GAAGGCAGCA GGCGCGCAAA TTACCCAATC 240 CTGACACGGG GAGGTAGTGA CAATAAATAA CAATACCGGG CTCTATGAGT CTGGTAATTG 300 GAATGAGTAC AATCTAAATC CCTTAACGAG GATCCATTGG AGGGCAAGTC TGGTGCCAGC 360 AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTTAAGTT GTTGCAGTTA AAAAGCTCGT 420 AGTTGGACCT TGGGTTGGGT CGGCCGGTCC GCCTCGCGGT GTGCACCGGC CGGCTCGTCC 480 CTTCTGCCGG CGATGCGCTC CTGGCCTTAA CTGGCCGGGT CGTGCCACCG GCGCTGTTAC 540 TTTGAAGAAA TTAGAGTGCT CAAAGCAAGC CTACGCTCTG TATACATTAG CATGGGATAA 600 CATCATAGGA TTTCGGTCCT ATTCTGTTGG CCTTCGGGAT CGGAGTAATG ATTAACAGGG 660 ACAGTCGGGG GCATTCGTAT TTCATAGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTT ATGAAAGACG 720 AACAACTGCG AAAGCATTTG CCAAGGATGT TTTCATTAAT CAAGAACGAA AGTTGGGGGC 780 TCGAAGACGA TCAGATACCG TCCTAGTCTC AACCATAAAC GATGCCGACC AGGGATCAGC 840 GGATGTTACT TTTAGGACTC CGCTGGCACC TTATGAGAAA TCAAAGTCTT TGGGTTCCGG 900 GGGGAGTATG GTCGCAAGGC TGAAACTTAA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC CACCAGGAGT 960 GGAGCCTGCG GCTTAATTTG ACTCAACACG GGGAAACTTA CCAGGTCCAG ACATAGTAAG 1020 GATTGACAGA CTGAGAGCTC TTTCTTGATT CTATGGGTGG TGGTGCATGG CCGTTCTTAG 1080 TTGGTGGAGC GATTTGTCTG GTTAATTCCG TTAACGAACG AGACCTCAGC CTGCTAACTA 1140 GCTATGCGGA GGTATCCCTC CGTGGCCAGC TTCTTAGAGG GACTATGGCC GCTTAGGCCA 1200 AGGAAGTTTG AGGCAATAAC AGGTCTGTGA TGCCCTTAGA TGTTCTGGGC CGCACGCGCG 1260 CTACACTGAT GTATTCAACG AGTCTATAGC CTTGGCCGAC AGGCCCGGGT AATCTTTGAA 1320 ATTTCATCGT GATGGGGATA GATCATTGCA ATTGTTGGTC TTCAACGAGG AATTCCTAGT 1380 AAGCGCGAGT CATCAGCTCG CGTTGACTAC GTCCCTGCCC TTTGTACACA CCGCCCGTCG 1440 CTCCTACCGA TTGAATGGTC CGGTGAAGTG TTCGGATCGC GGCGACGCGG GCGGTTCGCT 1500 GCCTGCGACG TCGCGAGAAG TCCACTGAAC CTTATCATTT AGAGGAAGGA GAAGTCGTAA 1560 CAAGGTTTCC GTAGGTGAAC CTGCGGAAGG ATCATTGTCG AAACCTGCCC AGCAGAACGA 1620 CCCGCGAACC AGTTGATATC ACCGGCGGCG GGAGGGGGTG CGCGTCCGCA ACGGGCGCTC 1680 CTCCTTCCCG CCCCATGCCG CGGGGAGAGG GACTCGTCCC GCTCCCGGCT GGCGAAACAA 1740 CGAACCCCCG GCGCGGACTG CGCCAAGGAA ATCTAACGAG AGAGCACGCT CCCGCGGCCC 1800 CGGAGACGGT GCGCCGCGGG GTGCGGCGCC TTCTTTCACA TGTATCCAAA ACGACTCTCG 1860 GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG AAGAACGTAG CGAAATGCGA TACTTGGTGT 1920 GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC CAAGCCATTA 1980 GGCCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGTGTCACG CATCGTTGCC CCACCCCACC CCCCCAAACC 2040 AAGGCGGGGG CCCCGGGGTG CGGGCGGAGA TTGGCCTCCC GTGCGCTGAC CGCTCGCGGT 2100 TGGCCCAAAT CTGAGTCCTC GGCGACCGAA GCCGCGGCGA TCGGTGGTGA AACAAAAGCC 2160 TCTCGAGCTC CCGCCGCGCG CCCGGTCTCC GATTGGGGAC TCTGCGGCCC TGAAGCTCCG 2220 CGCAAGCGCG CTCGCATTGC GACCCCAGGT CAGGCGGGAT TACCCGCTGA GTTTAAGCAT 2280 ATCAATAAGC GGAGGAAAAG AAACTTACCA GGATTCCCTT AGTAACGGCG AGCGAACCGG 2340 GAAGAGCCCA GCTTGAAAAT CGGGCGCCCC CGGCGTCCGA ATTGTAGTCT GGAGAAGCGT 2400 CCTCAGCGGC GGACCGGGCC CAAGTCCCCT GGAAAGGGGC GCCGGAGAGG GTGAGAGCCC 2460 CGTCGCGCCC GGACCCTGTC GCACCACGAG GCGCTGTCTG CGAGTCGGGT TGTTTGGGAA 2520 TGCAGCCCAA ATCGGGCGGT AAATTCCGTC CAAGGCTAAA TACGGGCGAG AGACCGATAG 2580 CAAACAAGTA CCGCGAGGGA AAGATGAAAA GGACTTTGAA AAGAGAGTCA AAGAGTGCTT 2640 GAAATTGTCG GGAGGGAAGC GGATGGGGGC CGGCGATGCG CCCCGGTCGG ATGTGGAACG 2700 GCGAGAGCCG GTCCGCCGAT CGGCTCGGGG CGCGGACCCA TGCGGATTGC GGCGGCGGCC 2760 CAAGCCCGGG CCTTCGATAA GCCTGTGGAG ACGTCGTCGC CGCGATCGTG GCTGGCAGCG 2820 CGCGCTTCGG GCGTGCATCC GCACCTGCGC GCTCCCGGCA TCGGCCTGCG GGCTCCCCAT 2880 TCGGCCCATC TTGAAACACG GACCAAGAAG TCTGACATGT GTGCGAGTCA ACGGGCCAGT 2940 AAACCCGTAA GGCGCAAGGA AGCTGATTGG CGGGATCCTC GCGGGTGCAC CGCCGACCGA 3000 CCTTGATCTT CTGAGAAGGG TTCGAGTGTG AGCATGCCTG TCGGGACCCG AAAGATGGTG 3060 AACTATGCCT GAGCGGGGCG AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG 3120 ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG ACTTGGGTAT AGGGGCGAAA GACTAATCGA ACCGTCTAGT 3180 AGCTGGTTCC CTCCGAAGTT TCCCTCAGGA TAGCTGGAGC CCGGAAACGA GTTCTATCGG 3240 GTAAAGCCAA TGATTAGAGG CATCGGGGGC GCAACGCCCT CGACCTATTC TCAAACTTTA 3300 AATAGGTAGG ACGGCGCGGC TGCTTCGTTG AGCCGCGCCA CGGAATCGAG TGCTCCAAGT 3360 GGGCCATTTT TGGTAAGCAG AACTGGCGAT GCGGGATGAA CCGGAAGCCG GGTTACGGTG 3420 CCCAACTGCG CGCTAACCTA GAACCCACAA AGGGTGTTGG TCGATTAAGA CAGCAGGACG 3480 GTGGTCATGG AAGTCGAAAT CCGCTAAGGA GTGTGTAACA ACTCACCTGC CGAATCAACT 3540 AGCCCCGAAA ATGGATGGCG CTTAAGCGCG CGACCTATAC CCGGCCGTCG GGGCAAGTGC 3600 CAGGCCCCGA TGAGTAGGAG GGCGCGGCGG TCGCCGAAAA ACCCGGGGCG CGAGCGGGCG 3660 GAGCGGCCGT CGGTGCAGAT CTTGGTGGTA GTAGCAAATA TTCAAATGAG AACTTTGAAG 3720 GCCGAAGAGG GGAAAGGTTC CATGTGAACG GCACTTGCAC ATGGGTTAGT CGATCCTAAG 3780 AGACGGGGGA AGCCCGTCCG ACAGCGCCAC GGCGGAGCTT CGAAAGGGAA TCGGGTTAAA 3840 ATTCCTGAAC CGGGACGCGG CGGCTGACGG CAACGTTAGG GAGTCCGGAG ACGTCGGCGG 3900 GGGCCTCGGG AAGAGTTATC TTTTCTGTTT AACGGCCTGC CCACCCTGGA AACGGCTCAG 3960 CCGGAGGTAG GGTCCAGCGG CCGGAAGAGC ACCGCACGTC GCGCGGTGTC CGGTGCGCCC 4020 CCGGCGGCCC TTGAAAATCC GGAGGACCGA GTGCCGCCCG CGCCCGGTCG TACTCATAAC 4080 CGCATCAGGT CTCCAAGGTG AACAGCCTCT GGTCGATGGA ACAATGTAGG CAAGGGAAGT 4140 CGGCAAAATG GATCCGTAAC TTCGGGAAAA GGATTGGCTC TGAGGGCTGG GCACGGGGGT 4200 CCCAGTCCCG AACCCGTCGG CTGTCGGCGG ACTGCTCGAG CTGCCAACGC GGCGAGAGCG 4260 GGTCGCCGCG TGCCGGCCGG GGGACGGACT GGGAACGGTC CTTTCGGGGG CCTTCCCCGG 4320 GCGTCGAACA GTCGACTCAG AACTGGTACG GACAAGGGGA ATCCGACTGT TTAATTAAAA 4380 CAAAGCATTG CGATGGTCCC TGCGGATGCT CACGCAATGT GATTTCTGCC CAGTGCTCTG 4440 AATGTCAAAG TGAAGAAATT CAACCAAGCG CGGGTAAACG GCGGGAGTAA CTATGACTCT 4500 CTTAAGGTAG CCAAATGCCT CGTCATCTAA TTAGTGACGC GCATGAATGG ATTAACGAGA 4560 TTCCCACTGT CCCTGTCTAC TATCCAGCGA AACCACAGCC AAGGGAACGG GCTTGGCAGA 4620 ATCAGCGGGG AAAGAAGACC CTGTTGAGCT TGACTCTAGT CCGACTTTGT GAAATGACTT 4680 GAGAGGTGTA GTATAAGTGG GAGCCGGAAA CGGCGAAAGT GAAATACCAC TACTTTTAAC 4740 GTTATTTTAC TTATTCCGTG AATCGGAGGC GGGGCACTGC CCCTCTTTTT GGACCCAAGG 4800 CCCCCTCACG GGGGCCGATC CGGGCGGAAG ACATTGTCAG GTGGGGAGTT TGGCTGGGGC 4860 GGCACATCTG TTAAAAGATA ACGCAGGTGT CCTAAGATGA GCTCAACGAG AACAGAAATC 4920 TCGTGTGGAA CAAAAGGGTA AAAGCTCGTT TGATTCTGAT TTTCAGTACG AATACGAACC 4980 GTGAAAGCGT GGCCTATCGA TCCTTTAGAC CTTCGGAATT TGAAGCTAGA GGTGTCAGAA 5040 AAGTTACCAC AGGGATAACT GGCTTGTGGC AGCCAAGCGT TCATAGCGAC GTTGCTTTTT 5100 GATCCTTCGA TGTCGGCTCT TCCTATCATT GTGAAGCAGA ATTCACCAAG TGTTGGATTG 5160 TTCACCCACC AATAGGGAAC GTGAGCTGGG TTTAGACCGT CGTGAGACAG GTTAGTTTTA 5220 CCCTACTGAT GACTGCGTCG TAATAGTAAT TCAACCTAGT ACGAGAGGAA CCGTTGATTC 5280 GCACAATTGG TCATCGCGCT TGGTTGAAAA GCCAGTGGCG CGAAGCTACC GTGCGCTGGA 5340 TTATGACTGA ACGCCTCTAA GTCAGAATCC GGGCTAGAGC GACGCGTGCG CCCGCCGCCC 5400 GTTTGCCGAC CCGCAGTAGG ACCTCCCGGT CCCCAGAGGC ACGTGTCGTA GGCCAAGCCC 5460 CCGCGGCGGA AGGGCCGCGG CGGCCGCCTT GAATCGTAAT TCCCATCGAG CGGCGGGTAG 5520 AATCCTTTGC AGACGACTTA AATACGCGAC GGGGTATTGT AAGTGGCAGA GTGGCCTTGC 5580 TGCCACGATC CACTGAGATT CAGCCCTACG TCGCTCAGAT TCGTCCCTCC CCCCTCACTC 5640 GCACCGTCTT CTCTTGTTCG GAACCCGTCG GAGGTTAGCC CCCTGCGGCG CACACACCCG 5700 CACGGACTGC CCCCGCCCAA GGCTCGGAGT GGACTTGTGT TTTTTCACGA GGCTAACTCT 5760 CGGCAAAATC TAAGCGGCTG GCACAAAGGC AGCACACTCT CCTTTTCATG AGGCTAACTC 5820 TGGCACAAAG ACTTGTGTGA TGGCTCCGAA AGGAGGCTAA CTCGGGGCTT GTGTTTTTTC 5880 ATGAGCCTAA GCTCCGCGAA ATCTAAGTGG CTTGCACAAA GGCGAAATTT GGCCAAAACG 5940 CGTGTGCTGT CGGCACCCGT TCGCGCGCGT GCACGGCCGG TAAAATGGCC ATAAAACGAG 6000 TTCCGGAGCT CGGAATCGGC TTCCGTTTTC TCTGCGGCTA ACTCCCACCA ACATCGACAA 6060 TACCAGCCAA AAATCCCACG CCGCCCCGAA AACGCGAATT TTGGCCTTTT TTGGCCGAAA 6120 AATGGGTCCC CCTGCGCGTT CGGTAAATTG GCCATAAAAC GGGATCCGGA CCTCGCAATC 6180 GACTTCCGTC TCCTCCGACG GTTAACAAAC GCGCATATCT ACAATTCCGG CCCAAAATCC 6240 CCTGCCGCCC CAAAAACGCA AAATTTGGCC AAAATCTGTG TGCTATAGCT CACGGTTTTT 6300 GCCCATTTTT GCCCAAATTT CGGGACCCGG AGCTCCGGCA TAATTTCCAC CACTTTTTGG 6360 TCCCATCAGA TAATTCAGGT CGATATACGG CGCCTCCTAA AATTTCAGCC CATTCCGGTG 6420 CCGTTTGCTA CTTCTTCCGA GTTTTTTTGT GTCCCGGTTT CTCCATTTTG GACGATTTTT 6480 CAAACTGTTT TTTCCGGCGG CAAAAAAATT TTTCCCTAAC CCCGCCAACC CATGTCCTGC 6540 GTCCGCGCAA AAAATCTAGG CCTTCAAAAC AAGTCGGACG CTTGTCCGCT GCCCGTGGTA 6600 GTTTCTCGCA TGACGGAGGC TAGCTGCAGC ATCCGGCCCC CATGGAACAG CGGCAGCAGC 6660 GCCGAAAGGG GCATGGCCAC TTCCCGCCCG CCACCTGCGA GGGAAGTGCC GACGGGCACG 6720 AACAGGCCTG GGCGAGCGCG GGTGCTGTGC CTGCCCCGCG ACCCTGCGCT GCTTGCCCCG 6780 TGGGCGCGCG CTGCTTGCCT CGCCAGCGTG GGTAGCGTGC CGCGCGACCG CCCTGCCGCA 6840 TGCCCCGCGC GAGCCTGGGC TGCATCCTTG CCCGCGAGCG TGCGCTGCTC GCAGCCTCCC 6900 GCGCGCGGGC GAGCTGTGCC TGTTCCTCGC TGTCTGCGCC TTGCAGCACG CGATGGTGCC 6960 GCGCGCTGGA GCGCCTGCTG CGCGCGATGG TGCCGCGGCT TCGGTCGCTG TCTGCGCGCG 7020 ATGGTGCCGC GCGCTGGCGT GCTTGCTGCG CGCGATGGTG CCTACACGAC CATGCTGCGC 7080 TCGATGGTGC GGCGCGCTTG CGCGCTGTTG TCGCGCGATG GTGCCGCGCG CTGGCTTGCT 7140 TGCTGCGCGC GATGGTGCCG CGCACTGGCG CCCATGCTGC GCGCGATGGT GCCGCGCGCT 7200 GGCGGGCTTG CTGCGCGCGA TGGTGTCGCG GTCGCGAGGG TGCCGCGCGC TGGCTTGCTT 7260 GCTGCGCGCG ATGGACATGC GCGCGTGGCG CCCATGCTGC GCTCGATGGT GCCGCGCACT 7320 GGCGCCCATG CTGCGCTCGA TGGTGCCGCG CGCTTGCGCG CTGTTGTCGC GCGATGGTGC 7380 CGCGAGCTGG CTTGCTTGCT GCGCGCAATG GTGCCGCGCG CTGGCGCCCA TGCTGCGCGC 7440 AATGGTGCCG CGCGCTGGCT TGCTTGCTGT GCGCAATGGT GCCGCGAGCT GGCGCCCATG 7500 CTGCGCGCAA TGGTGCCGCG CGCTGGCGTG CTTGCTGCGC GCGGCAGTCG CGCGATGGTG 7560 CCGCGCGCTG GCTTGCTTGC TGCGCGCGAT GGTGCCGCGC GCGGGCGTTC TTGCTGCGCG 7620 CGATGGTGGC GCGCGCTGGC TTGCTTGCTG CGCGCGATGG TGCCGCGCGC TGGCTAGCTT 7680 GTTGCCCGCG ATGGTGCCGC GCGCGGGCGC GCTTGCTTCC CGCGATGGTG CCGCGCGCTG 7740 GTTTGCTTGC TGCGCGCGAT GGTGCCGCGC GCTGGCTTGC TTGCTGCGCG CGATGGTGCC 7800 GCGCGATGGT GCCGCGCGTG GCGCCCATGC TGCGCGCGAT GGTGCCGCGC GTGGCGCCCA 7860 TGCTGCGCGC GATGGTGCCG CGGGTGGCGC CCATGCTGCG CGCGATGGTG CCGCGCGTGG 7920 CGCCCATGCT GCGCGCGATG GTGCCGCGCG CTGGCGCCCA TGCTGCGCGC GATGGTGCCG 7980 CGCGCTGGCG CCCATGCTGC GCGCGATGGT GCCGCACGCT GGCGCCCATG CTGCGCGCGA 8040 TGGTGCCGCG CGCTGGCTTG CTTGCTGCGC GCGATGGTGC CGCGCGCTGG CGCCCATGCT 8100 GCGCGCGATG GTGCCGCGCG CTGGCGCCCA TGCTGCGCGC GATGTTGCCG CGCGCGTGCG 8160 CGCTGTTGTC GCGCGATGGT GCTGCGCGAT GGTGGCGTGC GCAGGCGCGC TGGCTGCGCC 8220 TTCCGCTGGT CATTTCTCGC ACGAAGGGAG GTTAGCTGTG CGGGAAATGG CCTGCCAGTG 8280 CCCACGTGTC GATGTGGCTA AAAATTCCTC TTTTTGCACT CCAATTTTTT TTCTCTTTCT 8340 CTTGAAAAAT TGTTCATATT TTTCTCGAGC ATGATGCAAA AAATCAGACC AAGATTCAAT 8400 ATATTTTTTT TTTTTGGGGG TGGGGGTCAG CTCAAGTATT GGGGGTGTCT ATTGCTGCTA 8460 GATCAAAAAA AGCTCTAAGA CCTCTTTAGG GGGGTAAGGG ATGAGAGGTG CCTTGGTCGG 8520 GTGGTGGGTG CCCCGGCCTT CGTTGGCCTT GGCCTTGCTG CTCGGCCTTG GTCCTTCGGT 8580 TTTGGGATGT CCGTCGGAAT GTCGCCGTCG AGCTCGCTCC GGCGTCATTC CGACGACGTT 8640 CTGGCGACCT TGTTTTTGCG GAAAAAGAAA ATGTGTGCTG CTTTTCGCGT CCGACGGTGC 8700 TGGCTTGGCC TTGCTTGGTG CTTCCGTAGA CCCGATTGCA TTTGCTTCAG GCATGCGGGG 8760 CACTCGGCAA GGTCGTAGCC AAGTGATGGC CTTGTTTTTG CGGAAAAAGA AAATGTGTGC 8820 TGCTTTTCGC GTCCGACGGT GCTGGCTTAG CCTTGCTTGG TGCTTCCGTA GACCCGACGG 8880 CAATTGCTTC GGGCATGCGG GACGCTCGGC AAGGTCATAG CCAAGTGAAC GGCAGGGCGT 8940 GTGAGTGGTG ATTGGAGGGC GTCAGTCTGC AGGCTCCGTG CTCGTGCACC GAACTGCTCG 9000 AAGGCCGTCC GCTTCAGTCT TTCCCCAAGC GCAGCTGTTG CCTTGAGGGT TTGTTCGGTA 9060 TCCTGTGTTG CTTACCAACA AAACGGAATT GCTGGTTTCG ATTTTCCCCG TCCGCCTTGT 9120 GCCCTTCCGG GTGCGGGGTG GACGCGAGGC GAGCTCCGTG TTCCCGCCGT GCCTCGCGCT 9180 CAGACGCTTG GCCGCCTCGG CCCACGAAGT CTCTGCCCGT TCTCTCGGAT GCGGAATGCT 9240 GCGCATGGAC GTGAGGTCTC GGCCTCGATC GTCCAAGCTA CACGCATCGT CTCTTGACGC 9300 GAACGACCGC CGCACCCGTC TTGGCCGACC GACCGAGGCC CCGAACGGGG CCCCGAGACG 9360 GACGGACATG CGGGCGCCGG CGTCGGGAAG GAATGCTACC TGGTTGATCC TGCCAGTAGT 9420 CATATGCTTG TCTCAAAGAT TAAGCCATGC ATGTGTAAGT ATGAACTAAT TCAGACTGTG 9480 AAACTGCGAA TGGCTCATTA AATCAGTTAT AGTTTGTTTG ATGGTATTTG CTACTCGGAT 9540 AACCGTAGTA ATTCTAGA 9558 配列番号：２配列の長さ：954 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：genomic ＤＮＡ起源生物名：バレンシアオレンジ配列の特徴：配列番号１に示す塩基配列の7337-8291 に相当する。配列： CGATGGTGCC GCGCGCTTGC GCGCTGTTGT CGCGCGATGG TGCCGCGAGC TGGCTTGCTT 60 GCTGCGCGCA ATGGTGCCGC GCGCTGGCGC CCATGCTGCG CGCAATGGTG CCGCGCGCTG 120 GCTTGCTTGC TGTGCGCAAT GGTGCCGCGA GCTGGCGCCC ATGCTGCGCG CAATGGTGCC 180 GCGCGCTGGC GTGCTTGCTG CGCGCGGCAG TCGCGCGATG GTGCCGCGCG CTGGCTTGCT 240 TGCTGCGCGC GATGGTGCCG CGCGCGGGCG TTCTTGCTGC GCGCGATGGT GGCGCGCGCT 300 GGCTTGCTTG CTGCGCGCGA TGGTGCCGCG CGCTGGCTAG CTTGTTGCCC GCGATGGTGC 360 CGCGCGCGGG CGCGCTTGCT TCCCGCGATG GTGCCGCGCG CTGGTTTGCT TGCTGCGCGC 420 GATGGTGCCG CGCGCTGGCT TGCTTGCTGC GCGCGATGGT GCCGCGCGAT GGTGCCGCGC 480 GTGGCGCCCA TGCTGCGCGC GATGGTGCCG CGCGTGGCGC CCATGCTGCG CGCGATGGTG 540 CCGCGGGTGG CGCCCATGCT GCGCGCGATG GTGCCGCGCG TGGCGCCCAT GCTGCGCGCG 600 ATGGTGCCGC GCGCTGGCGC CCATGCTGCG CGCGATGGTG CCGCGCGCTG GCGCCCATGC 660 TGCGCGCGAT GGTGCCGCAC GCTGGCGCCC ATGCTGCGCG CGATGGTGCC GCGCGCTGGC 720 TTGCTTGCTG CGCGCGATGG TGCCGCGCGC TGGCGCCCAT GCTGCGCGCG ATGGTGCCGC 780 GCGCTGGCGC CCATGCTGCG CGCGATGTTG CCGCGCGCGT GCGCGCTGTT GTCGCGCGAT 840 GGTGCTGCGC GATGGTGGCG TGCGCAGGCG CGCTGGCTGC GCCTTCCGCT GGTCATTTCT 900 CGCACGAAGG GAGGTTAGCT GTGCGGGAAA TGGCCTGCCA GTGCCCACGT GTCG 954 配列番号：３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の配列合成ＤＮＡ起源生物名：バレンシアオレンジ配列の特徴：配列番号１に示す塩基配列の1556-1575 に相当する。配列：CGTAACAAGGTTTCCGTAGG 配列番号：４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の配列合成ＤＮＡ起源生物名：バレンシアオレンジ配列の特徴：配列番号１に示す塩基配列の2257-2276 の相補鎖に相当
する。配列：TTAAACTCAGCGGGTAATCC 配列番号：５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ起源生物名：イネ配列：AGTTAAAAAGCTCGTAGTTG 配列番号：６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ起源生物名：イネ配列：GCACTCTAATTTCTTCAAAG

【図面の簡単な説明】

【図１】制限酵素部位を含む当該リボソームＲＮＡ遺伝
子の構造の略図。

【図２】ＲＦＬＰｓ法によって柑橘植物の品種の解析を
示した結果を示す電気泳動写真。

【図３】ＤＮＡフィンガープリント法による柑橘植物の
品種の解析を示す電気泳動写真。

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【手続補正書】

【提出日】平成６年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示す塩基配列を含む、バレ
ンシアオレンジのリボソームＲＮＡをコードする遺伝
子。
【請求項２】柑橘系植物のリボソームＲＮＡをコード
する遺伝子の、スペーサー領域の塩基配列の一部又は全
部を含む、柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型検出用プ
ローブ。
【請求項３】柑橘系植物のリボソームＲＮＡをコード
する遺伝子のスペーサー領域の塩基配列の一部又は全部
を増幅し得る、遺伝子増幅用プライマー。
【請求項４】配列番号１に示す塩基配列を含むバレン
シアオレンジのリボソームＲＮＡをコードする遺伝子
の、スペーサー領域の塩基配列の一部又は全部を含む、
柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型検出用プローブ。
【請求項５】配列番号１に示す塩基配列を含む、バレ
ンシアオレンジのリボソームＲＮＡをコードする遺伝子
のスペーサー領域の塩基配列の一部又は全部を増幅し得
る、遺伝子増幅用プライマー。
【請求項６】配列番号２に示す塩基配列を含む、柑橘
植物の遺伝子の制限断片長多型検出用プローブ。
【請求項７】配列番号３又は配列番号４に示す塩基配
列を含む、遺伝子増幅用プライマー。
【請求項８】柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型をサ
ザンブロット法によって検出する方法において、請求項
２、請求項４又は請求項６に記載した制限断片長多型検
出用プローブを用いることを特徴とする、柑橘植物の遺
伝子の制限断片長多型の検出方法。
【請求項９】柑橘植物の遺伝子の制限断片長多型を特
定の遺伝子を増幅させることによって検出する方法にお
いて、請求項３、請求項５又は請求項７に記載した遺伝
子増幅用プライマーを用いて特定の遺伝子を増幅させる
ことを特徴とする、柑橘植物の遺伝子の増幅断片長多型
の検出方法。