JP3903044B2 - コムギの検査方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明はコムギの検査方法に関し、特にアレルギー物質が食品中に含まれているか否かを表示するために、食品の全ての流通段階において微量に含まれるコムギの存在を検出する方法に関する。
背景技術
近年、アレルギー物質を含む食品に起因する健康危害を防止するために、表示による情報提供の要望が高まり、平成１３年４月の食品衛生法関連法令の改正に伴い、アレルギー物質を含む食品の表示が義務づけられた。特に症例数が多い卵、乳、コムギと症状が重篤なソバ、落花生の５品目（特定原材料）については、食品の全ての流通段階において適切な表示を行うことが義務化されることになった。
アレルギー物質としてどの食品をアレルゲンとして認識するか否かは、個体差により異なり、食品に含まれる特定物がごく微量であっても適切に表示されていれば、食品を摂取するものは自己にとってアレルゲンが含まれるか否かを知ることができ、健康危害を未然に防止できる。しかし、ごく微量の特定原材料の有無を加熱等の加工が行われた食品で検出することは、従来公知の食品分析法では困難である。
また、特定原材料を生産者が自社で用いていれば加工食品に表示できることは当然であるが、末端製品の中間原料として特定原材料が用いられた場合、特に購入される中間原料に微量含まれているか否かについては確認できない場合がある。また、実際に意図しない混入もありうる。
したがって、食品メーカーでは、加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存あるいは製造ライン間の相互汚染の実態を正確に把握し、適切な対応をとるとともに、消費者に対しては法律に基づく正しい情報を提供することが重要であり、そのためにはアレルギー物質の正確な分析技術の提供が望まれている。
特に、コムギは様々な食品の原材料の一部として使用されることが多く、さらに最終製品となると食品を見ただけでは使用されていることが判別できないことがほとんどである。そして、コムギによるアレルギー症状は重く、食生活の欧米化に伴い患者数増加の傾向があり、即時型アレルギー物質の中で主要なもののひとつとなっている。
そのため、食品衛生法のアレルギー物質を含む食品の表示においても、コムギは特定原材料の１つとして規定され、食品中に混入がある場合はその旨を表示することが義務化された。
しかし、コムギについても、その検出に適切な測定方法はなく、微量成分の確実な測定方法が望まれている。
本発明では、食品中のコムギの混入の有無を正確に分析する方法の開発を目的として、コムギ特異的プライマーの構築、その分析系による検出限界の確認、および加工食品への応用を試みた知見により、食品中のコムギの有無を測定する方法を開発することを目的としている。
発明の開示
〔１〕すなわち本発明は、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づき特定のプライマーを設計してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、 食品中のコムギの有無を測定する方法を提供する。
〔２〕また、食品中の微量成分の有無を食品に表示するために、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づき特定のプライマーを設計してＰＣＲを行い、コムギの有無を測定し、食品に表示する方法を提供する。
〔３〕さらに、食品摂取者にとって有害なコムギのアレルゲンを含む食品を識別するために、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づき特定のプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中のコムギの有無を測定する方法、食品アレルギー患者またはその疑いがある者にとって有害なアレルゲンを含むコムギが食品に含まれるか否かの情報を提供する方法、これらのいずれかを食品に表示する方法を提供することができる。
〔４，５〕ここで、前記食品は、加工処理された食品であってもよいし、食品原料であってもよい。食品は、ヒトの食品のみならず動物用の食品（飼料）を含む。
〔６〜８〕ここで、前記遺伝子および前記プライマーが、以下のものである方法が好ましい。
▲１▼前記遺伝子が、配列表の配列番号１３に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、６６１番目のａ〜１３２０番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲２▼前記遺伝子が、配列表の配列番号１４に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、１８１番目のａ〜５４０番目のｔまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲３▼前記遺伝子が、配列表の配列番号１５に示す、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＧＢＳＳＩ）（Ｗｘ−Ｄ１）、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＢ０１９６２４、全長２８８６ｂｐ）遺伝子であり、前記プライマーが、２４０１番目のｇ〜２８８６番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
プライマーは、ターゲットの遺伝子の相補鎖であり、ターゲット遺伝子のＮ−末側の配列部分とＣ−末側の配列部分とがペアーで選択される。ペアーの長さは同じでもよいし異なっていても良い。
〔９〕上記した、▲１▼〜▲３▼のセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーのペアーの中でも、後に第３表で示すＷｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ０５（配列番号５）／Ｗｇｓ１０（配列番号６）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーがさらに好ましく、Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーが特に好ましい。
ＰＣＲに用いられるプライマーは、鋳型となるＤＮＡ（コムギの場合を例示すれば、配列番号１３〜１５の配列が挙げられる）の該当領域が同様の領域であれば、プライマーの個々の配列の５’−上流側、３’−下流側の塩基の位置が、対応する同一鋳型上で、または数塩基ないしは１０数塩基ずれても同様の機能を有し、同様の結果（ＰＣＲ産物）が得られることが知られている。
したがって、好ましいプライマーペアーは、上記第３表のものに限定されず、実質的に上記第３表のプライマーペアーと同一の機能をＰＣＲで達成することができるものも、好ましいプライマーペアーに含まれる。
上記プライマーについては、各プライマーの１または数塩基を欠失、置換、付加および／または挿入したプライマーで、鋳型となるＤＮＡの該当領域へハイブリダイズするプライマーも上記プライマーと実質的に同一である。具体的には、例えば、配列番号１〜１２の各プライマーについて、対応する鋳型ＤＮＡに対し５’−上流側／下流側および／または３’−上流／下流側に１または数塩基ないしは１０数塩基ずれているもので、配列番号１〜１２の配列のうち、連続した少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列を含むプライマー等が、本発明の好ましいプライマーに含まれる。
〔１０〕また、本発明は、前記プライマーを用いて、ＰＣＲを行い、電気泳動像で、明瞭な増幅バンドが、下記コムギ群から選択される１種以上のコムギを含む被検物質において認められ、ライムギ、コムギ以外の動植物（由来食品原料）を含む被検物質において認められない方法を提供する。
コムギ群：強力コムギ、中力（準強力）コムギ、薄力コムギ、デュラム（マカロニ）コムギ、その他食用の単粒系コムギ
コムギとしては、具体的に、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｈｉｔｅ（アメリカ）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｐｒｉｎｇ Ｗｈｅａｔ Ｎｏ．１（カナダ）、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｗｈｅａｔ（オーストラリア）、農林６１号（日本）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｍｂｅｒ Ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ、カナダ）等が例示できる。
〔１１〕コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計されたＰＣＲ用プライマーおよびこれを含有する、食品中のコムギの有無および／または濃度を測定するための試薬一式（キット）を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中のコムギの有無を測定する方法である。
検体として測定される食品は、原材料であっても、加工段階のいずれかであっても、加工後の食品であってもよい。本発明方法は、食品中の例えば、ＤＮＡレベルの体積比またはコムギの全食品に対する質量比で好ましくは０．１％以下、１０００ｐｐｍ以下、さらには５００ｐｍ以下、特に１００ｐｐｍ以下の微量のコムギの存在の有無を検出する方法であり、コムギの遺伝子が食品中に含まれる場合は、生産者が意図していない物が、調味料や添加物の一部として微量存在しても検出することができる。さらに遺伝子はタンパク質等の生物由来の他の物質に比べて、加熱等の食品加工に対して比較的安定であり、加熱、調理等、加工された食品中の微量の存在が検出できる。
コムギの遺伝子配列は、未知の場合は公知の遺伝子検出法によって検出してもよいが、今日では多くの既知の遺伝子情報を用いることができる。例えば国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）等のデーターベースからコムギの遺伝子の全配列の情報を得て、配列の一部からＰＣＲに適したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーのペアー（対、組）を選択してプライマーとすることができる。
プライマーの設計は、本発明の検査方法を考慮して以下の事項に留意した。まず、（ｉ）プライマーのＧＣ含量が４０〜６０％である、（ｉｉ）プライマーの融解温度（Ｔｍ値、下記参照）が、５５〜７０℃である、（ｉｉｉ）２つのプライマー対のＴｍ値が近い、（ｉｖ）２つのプライマーの３’末端間で相補的配列を保有していない、（ｖ）プライマー自身がヘアピンのような高次構造を形成しない、（ｖｉ）プライマーの全長は１５〜３５ｍｅｒとする、（ｖｉｉ）プライマーの３’末端側のＧＣ含量を低くする、（ｖｉｉｉ）プライマー内で同一ヌクレオチドが多数連続する配列は回避する、（ｉｘ）プライマーは増幅したい鋳型ＤＮＡの片側１本鎖の配列と完全に一致している必要はないが、３’末端側の相補性を高くする、（ｘ）使用する鋳型ＤＮＡにおいて、プライマー部位の他に同様の配列がない、等である。
本発明のプライマーは、原材料のコムギだけでなく、加工段階の食品や加熱、調理等の加工後の食品にも使用可能であることを必要とする。したがって、使用されるコムギの鋳型ＤＮＡはインタクトなものではなく、非常に細かく切断されたＤＮＡ断片であると考えられ、（ｘｉ）２つのプライマーによって増幅される遺伝子の一部は、比較的短い領域であることが好ましい。さらに、各種のコムギが共通して有する１つの遺伝子領域の中で、（ｉ）〜（ｘｉ）の全ての条件を満たすプライマーを設計する必要がある。しかし、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔわずか４つのヌクレオチドからなるＤＮＡ配列で、これらの条件を全て満たすプライマーを作製することは非常に難しく、それ故、プライマーの設計は、ＰＣＲを行う上で非常に困難な問題となっている。また、仮にこれらの多数の条件を全て満たすプライマーを設計できたとしても、それはＰＣＲを行う上での必要条件でしかなく、意図したＰＣＲを成功させることは実際にＰＣＲを行ってみないと判らない。
ＰＣＲ法は特に限定されず、公知である種々の改良方法を含むが、１例を挙げれば、プライマーのペアー、鋳型（被検）ＤＮＡの他にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、プライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の３つのステップからなっている。各ステップはそれぞれ異なった、場合によっては同一の反応温度と反応時間を必要とするので増幅しようとするＤＮＡ領域の塩基配列とその長さによって適切な範囲とする。このような操作のためのｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒが市販されている。ＧＣ含量と配列の長さから得られる下記式
Ｔｍ（℃）＝４×（Ｇ＋Ｃ）＋２×（Ａ＋Ｔ）
を、アニーリング温度の指標とする。ＰＣＲ増幅産物が５０〜５００ｂｐより好ましくは１００〜１５０ｂｐ程度になるようにする。この範囲とすれば、加工食品中で断片化しているＤＮＡの検出もできるからである。
本発明においては、前記遺伝子および前記プライマーが、以下に示すものが好ましい。
▲１▼前記遺伝子が、配列番号１３に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、６６１番目のａ〜１３２０番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲２▼前記遺伝子が、配列番号１４に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、１８１番目のａ〜５４０番目のｔまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲３▼前記遺伝子が、配列番号１５に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、２４０１番目のｇ〜２８８６番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
上記した、▲１▼〜▲３▼のセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーのペアーの中でも、第３表に示すＷｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ０５（配列番号５）／Ｗｇｓ１０（配列番号６）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーがさらに好ましく、Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーが特に好ましい。
プライマーは、ターゲットの遺伝子の相補鎖であり、ターゲット遺伝子のＮ−末側の配列部分とＣ−末側の配列部分とがペアーで選択される。ペアーの長さは同じでもよいし異なっていても良い。
後に「特異性の確認」で説明するように同じＴｍ値をとるプライマーペアー（Ｗｔｒ０５（配列番号３）／Ｗｔｒ０６（配列番号４）、Ｗｇｓ０７（配列番号７）／Ｗｇｓ０８（配列番号８））でも検出に不適当な場合があり、プライマーの選択が重要である。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２の濃度や反応サイクル数等好適なＰＣＲ条件の検討、あるいはｎｅｓｔｅｄＰＣＲを用いれば、さらに検出感度が向上する可能性がある。
ＰＣＲ反応物は、免疫反応を用いて同定しても、どのように同定してもよいが、電気泳動させて、必要な場合は陽性コントロールや、陰性コントロールを用いて電気泳動像で明瞭なバンドが認められれば、被検物質（食品）中に検出物質（コムギ）が存在することが確認できる。
本発明の方法は、検出物質が被検物質（食品）に含まれるコムギである場合に有効である。
ここで「コムギ」とは、強力コムギ、中力（準強力）コムギ、薄力コムギ、デュラム（マカロニ）コムギ、その他食用の単粒系コムギをいう。
コムギとしては、具体的は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｈｉｔｅ（アメリカ）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｐｒｉｎｇ Ｗｈｅａｔ Ｎｏ．１（カナダ）、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｗｈｅａｔ（オーストラリア）、農林６１号（日本）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｍｂｅｒ Ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ、カナダ）等が例示できる。
本発明の検出方法は、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計されたプライマーを、試薬として含有した試薬一式（キット）を用いて行えば、容易に実施することもできる。試薬一式（キット）は、ＰＣＲに広く用いられる公知の試薬を含有していても、電気泳動装置等の他の装置が付属していてもよい。具体的に試薬としては、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等が挙げられる。これらの試薬は試薬一式（キット）の中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。試薬一式（キット）中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、本発明のＰＣＲを実施するについて可能な範囲であればよい。また、試薬一式（キット）には、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。
ＤＮＡは熱に安定であり加工食品中でも微量で検出できるので得られた結果は食品に表示したり、食品のアレルギー情報として利用できるほか、食品中のコムギの有無を検出することにより加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存、あるいは製造ライン間の相互汚染の有無等の生産者の意図していない工程を検出することができる。
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）コムギ検知のためのプライマーの構築
コムギ由来ＤＮＡを検知するためのプライマーを構築するにあたって、まず国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）のデータベースにアクセスし、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の既知遺伝子の検索を行い、得られたコムギに関する遺伝子情報の中からコムギの貯蔵タンパクである、▲１▼Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｔｒｉｔｉｃｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、ｍＲＮＡ、ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ．（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｓ６２６３０、全長１５６７ｂｐ）（配列番号１３）；▲２▼Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｇｌｕｔａｔｈｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）ｇｅｎｅ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＦ１０９７１４、全長２９４７ｂｐ）（配列番号１４）；▲３▼Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＧＢＳＳＩ）（Ｗｘ−Ｄ１）、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＢ０１９６２４、全長２８８６ｂｐ）（配列番号１５）を選択した。
次に、ＤＤＢＪのＢＬＡＳＴ検索によって、選択したコムギの遺伝子配列と類似の配列がコムギ以外の植物にはないことを確認した。
発明者は、プライマーを設計するために、コムギの特定の遺伝子配列についてソフトウェア”ＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣ”を使用して、プライマーの候補となる配列の検索を行った。ＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣは、プライマー設計の上記条件のうち、手計算では解析困難な種々の条件（ｉ）ＧＣ含量、（ｉｉ）Ｔｍ値の範囲設定を行えることから使用した。その結果、候補となる配列を１２６対同定することができた。その中で上記（ｉ）〜（ｘｉ）のプライマー設計のための条件を全て満たす配列を、発明者が独自に検索することにより、本発明の検査方法で使用可能なプライマー配列を１２対選択した。なお、本発明の検査方法のプライマーの設計については、ＤＮＡが断片化している加工食品からの検知を鑑み、ＰＣＲによる増幅産物が１００〜１５０ｂｐ程度になるよう考慮した。このようにして選択したプライマー１２対のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマー（バイオロジカ（株）で合成）を作製した。
（２）ＤＮＡの抽出
コムギおよびその他の植物の種子については表面を１％ＴｒｉｔｏｎＸ（和光純薬）により洗浄した後蒸留水ですすぎ、よく乾燥させた後マルチビーズショッカー（安井機械）で微粉砕した。次に粉砕サンプル１〜１．５ｇをＤｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。小麦粉等の粉末サンプルについても上記種子と同様に微粉砕後、Ｄｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔを用いてＤＮＡを抽出した。また加工食品については水分含量の高いものは２４時間凍結乾燥後１ｇを、水分含量の低いものについてはそのまま１ｇからＧｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ２０／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡは吸光度の測定により濃度を求めた後、純水を用いて１０ｎｇ／μｌに希釈し、これをＰＣＲの鋳型（被検）ＤＮＡ試料液として用いた。
（３）ＰＣＲと電気泳動像によるコムギの検出
ＰＣＲ反応液は以下のように調整した。すなわちＰＣＲ緩衝液（ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒＩＩ、アプライドバイオシステムズ社），２００μｍｏｌ／ｌ；ｄＮＴＰ，１．５ｍｍｏｌ／ｌ；ＭｇＣｌ２，０．５μｍｏｌ／ｌ；５’および３’プライマー、および０．６２５ｕｎｉｔｓ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、アプライトバイオシステムズ社）を含む液に１０ｎｇ／μｌに調整したＤＮＡ試料液２．５μｌを加え、全量を２５μｌとした。第４表で鋳型ＤＮＡ量の記載のないものはこの場合の濃度である。但し、抽出されたＤＮＡの濃度が１０ｎｇ／μｌ以下の場合、または添加物が多い加工食品等で、得られたＤＮＡの吸光度ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の値が１．７以下と夾雑物が多くＤＮＡの純度が低い場合には、抽出ＤＮＡ原液または１０ｎｇ／μｌ希釈液を２．５μｌ〜１７．８μｌ ＰＣＲ反応液に添加し、その量に応じて全量が２５μｌとなるように純水を用いて調整した。第４表で鋳型ＤＮＡ量が付記されているものはこの場合の濃度である。
ＰＣＲ増幅装置にはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。まず９５℃に１０分間保ち反応を開始させ、次に９５℃ ３０秒間、６０℃ ３０秒間、７２℃ ３０秒間を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲの増幅を行った。最後に終了反応として７２℃ ７分間保った後４℃で保存し、得られた反応液をＰＣＲ増幅反応液とした。
ＰＣＲ増幅反応液はエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲル（２％Ｅ−Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による電気泳動に供し、陽性コントロール（コムギ種子より抽出したＤＮＡ）および陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなしのブランク反応液）の増幅バントの有無によってＰＣＲの妥当性を判断すると共に、各プライマーによる至適サイズのＤＮＡ増幅バンドを確認することによってサンプル中のコムギの混入の有無を判定した。
（４）実験１．コムギ検知プライマーの特異性の確認
コムギを特異的に検出するプライマーの選抜を目的として、コムギおよびその他の植物の種子から得たＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。コムギのサンプルとしては５種類のコムギ銘柄または品種［Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｈｉｔｅ（アメリカ）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｐｒｉｎｇ Ｗｈｅａｔ Ｎｏ．１（カナダ）、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｗｈｅａｔ（オーストラリア）、農林６１号（日本）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｍｂｅｒ Ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ、カナダ）］を用いた。また、他の植物としてライムギ（カナダ）、オオムギ（ミノリムギ）、オーツムギ（競馬向け飼料用）、コメ（コシヒカリ）、トウモロコシ（飼料用ｎｏｎＧＭＯ）、ダイズ（ムラユタカ）、アワ（熊本）、ナタネ（Ｃａｎｏｌａ）の種子およびソバを用いた。
ＰＣＲ後電気泳動を行い、至適サイズの明瞭な増幅バンドがコムギサンプルにおいてのみ認められ、他の植物では認められないプライマーを、コムギを特異的に検知するプライマーとして選抜した。
コムギ検知用プライマー；Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）、Ｗｔｒ０５（配列番号３）／Ｗｔｒ０６（配列番号４）、Ｗｇｓ０７（配列番号７）／Ｗｇｓ０８（配列番号８）、Ｗｇｓ０５（配列番号５）／Ｗｇｓ１０（配列番号６）およびＷｓｓ０１（配列番号１１）／Ｗｓｓ０２（配列番号１２）の特異性を示す検出結果の電気泳動像を、それぞれ図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ、図１ｅおよび図５に示す。
図１および図５において、Ｍ：１００ｂｐラダー、ＮＣ：Ｎｏ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。図１のレーン番号（サンプル名）およびその結果を下記第１表に示す。図５のレーン番号（サンプル名）およびその結果を下記第２表に示す。
実験１の結果、Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）およびＷｇｓ０５（配列番号５）／Ｗｇｓ１０（配列番号６）の３対のプライマーセットが、コムギを特異的に検出できるため、１０対のプライマー候補の中からコムギ検知プライマーとして選抜された。特に、Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）およびＷｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）の２対のプライマーセットは、ＰＣＲ増幅バントが最も明瞭であるため、コムギ検知プライマーとして好ましく選抜される。
なお、Ｗｔｒ０５（配列番号３）／Ｗｔｒ０６（配列番号４）のプライマーセットはコムギ以外の多くの種の雑穀との交差反応が認められ、Ｗｇｓ０７（配列番号７）／Ｗｇｓ０８（配列番号８）のプライマーセットはライムギとの交差反応が認められ、コムギ検出用プライマーとして適当でないことが分かる。
また、他のプライマー対の多くは、特定原材料として食品衛生法で定められているコムギの範疇から外れるライムギとの交差反応が認められた。
上記のプライマーセットを第３表に示す。
（５−１）実験２−１．ＰＣＲによるコムギの検出限界の碓認
実験２−１ではＷｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）プライマーを用いたＰＣＲによるコムギの検出限界を調べることを目的として、ＤＮＡレベルおよび粉体レベルでコムギの擬似混入サンプルを作製し、それらのＤＮＡ試料液を用いてＰＣＲを行いコムギの検出限界を確認した。
ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルは、コムギの種子より抽出されたＤＮＡを１０ｎｇ／μｌに希釈し、それをサケ精子ＤＮＡ中のコムギＤＮＡの混入率が０、１、１０、５０、１００、１０００ｐｐｍおよび１％となるように体積比で混合して作製した。また、粉体レベルの擬似混入サンプルは、トウモロコシ粉中のコムギ粉の混入率が０、１、１０、５０、１００、１０００ｐｐｍおよび１％となるように質量比で混合してサンプルを作製し、各混入サンプルを微粉砕した後ＤＮＡを抽出した。
図２ａおよび図２ｂに検出結果の電気泳動像を示す。上部の数字はコムギの混入率を示し、Ｍ：１００ｂｐラダー、ＮＣ：Ｎｏ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。ここで図２ａは、コムギＤＮＡをサケ精子ＤＮＡで希釈した、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルを被検体とし、図２ｂは、コムギ粉をトウモロコシ粉で希釈した、粉体レベルの擬似混入サンプルを被検体とした。
実験２−１においてＷｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）を用いたＰＣＲによるコムギ検出限界を確認した結果、ＤＮＡレベルおよび粉体レベルのいずれの擬似混入サンプルにおいてもコムギ混入率として５０ｐｐｍが検出限界であった（図２）。但し複数回行った実験の内、数回の検出限界は１００ｐｐｍであり、このＰＣＲ反応系で安定して検出される限界は１００ｐｐｍであることが示唆された。小麦粉のタンパク質含量は約１０質量％（五訂食品成分表より）であることから、本ＰＣＲ反応系の検出限界１００ｐｐｍはコムギのタンパク質の混入率に換算すると１０ｐｐｍとなる。
すなわちここで示したＰＣＲによるコムギの検知法は、従来にはない高い検出限界を達成し、しかも、特異性が高く、微量成分の確実な測定（分析）方法であると考えられる。
（５−２）実験２−２．ＰＣＲによるコムギの検出限界の碓認
実験２−２ではＷｓｓ０１（配列番号１１）／Ｗｓｓ０２（配列番号１２）プライマーを用いたＰＣＲによるコムギの検出限界を調べることを目的として、上記実験２−１と同様にして、ＤＮＡレベルでコムギの擬似混入サンプルを作製し、それらのＤＮＡ試料液を用いてＰＣＲを行いコムギの検出限界を確認した。
図４に検出結果の電気泳動像を示す。上部の数字はコムギの混入率を示し、Ｍ：１００ｂｐラダー、ＮＣ：Ｎｏ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。ここで図４は、コムギＤＮＡをサケ精子ＤＮＡで希釈した、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルを被検体とした。
（６）実験３．ＰＣＲによる加工食品からのコムギの検知
コムギ検知プライマーとしてＷｇｓ１１（配列番号９）／１２（配列番号１０）を用いて、原料としてコムギが含まれる加工食品からのコムギの検知を行った。用いたサンプルはレトルト缶詰、ケーキミックス、スパゲッティー、シリアル、菓子７種類（ビスケット、せんべい、プレチェル、ふがし、カステラ、スナック菓子、チョコレート）で、それぞれ微粉砕後、Ｄｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔまたはＧｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ２０／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲに供した。レトルト缶詰については、得られたＤＮＡのｐ純度が低く、ＰＣＲ反応チューブ当たり５０〜１２０ｎｇ（吸光度からの計算値）のＤＮＡを添加した。
図３ａ、図３ｂのレーン番号（サンプル名）を以下の第４表に示す。
Ｗｇｓ１１（配列番号９）／１２（配列番号１０）を用いて加工食品からのコムギの検知をＰＣＲにより行った結果（実験３）、レトルト缶詰を除くサンプルからコムギが検出された（図３）。レトルト缶詰は鋳型ＤＮＡの添加量を５０ｎｇまたは１２０ｎｇに増やしてもコムギは検出されなかった（図３ａ）。レトルト缶詰は１２０℃で３０分程度のレトルト処理が施されており、この加熱工程でＤＮＡが細かく断片化されたため、ＰＣＲによる検出ができなかったものと推測された。
現在食品アレルギーの検査として臨床現場では、誘発試験やプリック・スクラッチ試験、ＲＡＳＴ法等が実施されているが、これらの方法はアレルギー患者自身あるいは血液を対象として実施する検査であり、食品分析への適用は困難である。一方、アレルゲンそのものを検出、定量するための特定タンパク質の分離検出法として、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）やウェスタンブロッティング法、免疫化学的手法（ＥＬＩＳＡ法）が使われているが、これらは既知の主要アレルゲンの検出のためには有効であるが、未知のアレルゲンの検出あるいは加熱工程によってタンパクが変性している可能性のある加工食品においては必ずしも適当ではない。
産業上の利用可能性
ＤＮＡはタンパク質よりも加熱耐性が高いため加工食品中でも残存している場合が多い。このため本発明で示した遺伝子を指標としたＰＣＲによるコムギの検知法は、特に加工食品において従来からのタンパク質の検出法を補う間接的な食品中のアレルギー物質の分析手段として極めて有用であると考えられる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、コムギ検出プライマーのコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像である。図１ａはコムギ検出プライマーＷｔｒ０１／１０のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｂはコムギ検出プライマーＷｇｓ１１／１２のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｃはコムギ検出プライマーＷｔｒ０５／０６のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｄはコムギ検出プライマーＷｇｓ０７／０８のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｅはコムギ検出プライマーＷｇｓ０５／１０のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像である。
図２は、ＰＣＲによるコムギ検出系の検出限界を示す電気泳動像である。図２ａは、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルの測定結果であり、図２ｂは、粉体レベルの擬似混入サンプルの測定結果を示す電気泳動像である。
図３は、ＰＣＲによる加工食品からのコムギの検出結果を示す電気泳動像である。図３ａ、図３ｂはそれぞれ測定した加工食品がレーン毎に異なっている。
図４は、ＰＣＲによるコムギ検出系の結果を示す電気泳動像である。
図５は、コムギ検出プライマーＷｓｓ０１／Ｗｓｓ０２のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像である。
本発明はコムギの検査方法に関し、特にアレルギー物質が食品中に含まれているか否かを表示するために、食品の全ての流通段階において微量に含まれるコムギの存在を検出する方法に関する。
背景技術
近年、アレルギー物質を含む食品に起因する健康危害を防止するために、表示による情報提供の要望が高まり、平成１３年４月の食品衛生法関連法令の改正に伴い、アレルギー物質を含む食品の表示が義務づけられた。特に症例数が多い卵、乳、コムギと症状が重篤なソバ、落花生の５品目（特定原材料）については、食品の全ての流通段階において適切な表示を行うことが義務化されることになった。
アレルギー物質としてどの食品をアレルゲンとして認識するか否かは、個体差により異なり、食品に含まれる特定物がごく微量であっても適切に表示されていれば、食品を摂取するものは自己にとってアレルゲンが含まれるか否かを知ることができ、健康危害を未然に防止できる。しかし、ごく微量の特定原材料の有無を加熱等の加工が行われた食品で検出することは、従来公知の食品分析法では困難である。
また、特定原材料を生産者が自社で用いていれば加工食品に表示できることは当然であるが、末端製品の中間原料として特定原材料が用いられた場合、特に購入される中間原料に微量含まれているか否かについては確認できない場合がある。また、実際に意図しない混入もありうる。
したがって、食品メーカーでは、加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存あるいは製造ライン間の相互汚染の実態を正確に把握し、適切な対応をとるとともに、消費者に対しては法律に基づく正しい情報を提供することが重要であり、そのためにはアレルギー物質の正確な分析技術の提供が望まれている。
特に、コムギは様々な食品の原材料の一部として使用されることが多く、さらに最終製品となると食品を見ただけでは使用されていることが判別できないことがほとんどである。そして、コムギによるアレルギー症状は重く、食生活の欧米化に伴い患者数増加の傾向があり、即時型アレルギー物質の中で主要なもののひとつとなっている。
そのため、食品衛生法のアレルギー物質を含む食品の表示においても、コムギは特定原材料の１つとして規定され、食品中に混入がある場合はその旨を表示することが義務化された。
しかし、コムギについても、その検出に適切な測定方法はなく、微量成分の確実な測定方法が望まれている。
本発明では、食品中のコムギの混入の有無を正確に分析する方法の開発を目的として、コムギ特異的プライマーの構築、その分析系による検出限界の確認、および加工食品への応用を試みた知見により、食品中のコムギの有無を測定する方法を開発することを目的としている。
発明の開示
〔１〕すなわち本発明は、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づき特定のプライマーを設計してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、 食品中のコムギの有無を測定する方法を提供する。
〔２〕また、食品中の微量成分の有無を食品に表示するために、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づき特定のプライマーを設計してＰＣＲを行い、コムギの有無を測定し、食品に表示する方法を提供する。
〔３〕さらに、食品摂取者にとって有害なコムギのアレルゲンを含む食品を識別するために、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づき特定のプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中のコムギの有無を測定する方法、食品アレルギー患者またはその疑いがある者にとって有害なアレルゲンを含むコムギが食品に含まれるか否かの情報を提供する方法、これらのいずれかを食品に表示する方法を提供することができる。
〔４，５〕ここで、前記食品は、加工処理された食品であってもよいし、食品原料であってもよい。食品は、ヒトの食品のみならず動物用の食品（飼料）を含む。
〔６〜８〕ここで、前記遺伝子および前記プライマーが、以下のものである方法が好ましい。
▲１▼前記遺伝子が、配列表の配列番号１３に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、６６１番目のａ〜１３２０番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲２▼前記遺伝子が、配列表の配列番号１４に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、１８１番目のａ〜５４０番目のｔまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲３▼前記遺伝子が、配列表の配列番号１５に示す、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＧＢＳＳＩ）（Ｗｘ−Ｄ１）、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＢ０１９６２４、全長２８８６ｂｐ）遺伝子であり、前記プライマーが、２４０１番目のｇ〜２８８６番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
プライマーは、ターゲットの遺伝子の相補鎖であり、ターゲット遺伝子のＮ−末側の配列部分とＣ−末側の配列部分とがペアーで選択される。ペアーの長さは同じでもよいし異なっていても良い。
〔９〕上記した、▲１▼〜▲３▼のセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーのペアーの中でも、後に第３表で示すＷｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ０５（配列番号５）／Ｗｇｓ１０（配列番号６）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーがさらに好ましく、Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーが特に好ましい。
ＰＣＲに用いられるプライマーは、鋳型となるＤＮＡ（コムギの場合を例示すれば、配列番号１３〜１５の配列が挙げられる）の該当領域が同様の領域であれば、プライマーの個々の配列の５’−上流側、３’−下流側の塩基の位置が、対応する同一鋳型上で、または数塩基ないしは１０数塩基ずれても同様の機能を有し、同様の結果（ＰＣＲ産物）が得られることが知られている。
したがって、好ましいプライマーペアーは、上記第３表のものに限定されず、実質的に上記第３表のプライマーペアーと同一の機能をＰＣＲで達成することができるものも、好ましいプライマーペアーに含まれる。
上記プライマーについては、各プライマーの１または数塩基を欠失、置換、付加および／または挿入したプライマーで、鋳型となるＤＮＡの該当領域へハイブリダイズするプライマーも上記プライマーと実質的に同一である。具体的には、例えば、配列番号１〜１２の各プライマーについて、対応する鋳型ＤＮＡに対し５’−上流側／下流側および／または３’−上流／下流側に１または数塩基ないしは１０数塩基ずれているもので、配列番号１〜１２の配列のうち、連続した少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列を含むプライマー等が、本発明の好ましいプライマーに含まれる。
〔１０〕また、本発明は、前記プライマーを用いて、ＰＣＲを行い、電気泳動像で、明瞭な増幅バンドが、下記コムギ群から選択される１種以上のコムギを含む被検物質において認められ、ライムギ、コムギ以外の動植物（由来食品原料）を含む被検物質において認められない方法を提供する。
コムギ群：強力コムギ、中力（準強力）コムギ、薄力コムギ、デュラム（マカロニ）コムギ、その他食用の単粒系コムギ
コムギとしては、具体的に、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｈｉｔｅ（アメリカ）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｐｒｉｎｇ Ｗｈｅａｔ Ｎｏ．１（カナダ）、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｗｈｅａｔ（オーストラリア）、農林６１号（日本）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｍｂｅｒ Ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ、カナダ）等が例示できる。
〔１１〕コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計されたＰＣＲ用プライマーおよびこれを含有する、食品中のコムギの有無および／または濃度を測定するための試薬一式（キット）を提供する。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中のコムギの有無を測定する方法である。
検体として測定される食品は、原材料であっても、加工段階のいずれかであっても、加工後の食品であってもよい。本発明方法は、食品中の例えば、ＤＮＡレベルの体積比またはコムギの全食品に対する質量比で好ましくは０．１％以下、１０００ｐｐｍ以下、さらには５００ｐｍ以下、特に１００ｐｐｍ以下の微量のコムギの存在の有無を検出する方法であり、コムギの遺伝子が食品中に含まれる場合は、生産者が意図していない物が、調味料や添加物の一部として微量存在しても検出することができる。さらに遺伝子はタンパク質等の生物由来の他の物質に比べて、加熱等の食品加工に対して比較的安定であり、加熱、調理等、加工された食品中の微量の存在が検出できる。
コムギの遺伝子配列は、未知の場合は公知の遺伝子検出法によって検出してもよいが、今日では多くの既知の遺伝子情報を用いることができる。例えば国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）等のデーターベースからコムギの遺伝子の全配列の情報を得て、配列の一部からＰＣＲに適したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーのペアー（対、組）を選択してプライマーとすることができる。
プライマーの設計は、本発明の検査方法を考慮して以下の事項に留意した。まず、（ｉ）プライマーのＧＣ含量が４０〜６０％である、（ｉｉ）プライマーの融解温度（Ｔｍ値、下記参照）が、５５〜７０℃である、（ｉｉｉ）２つのプライマー対のＴｍ値が近い、（ｉｖ）２つのプライマーの３’末端間で相補的配列を保有していない、（ｖ）プライマー自身がヘアピンのような高次構造を形成しない、（ｖｉ）プライマーの全長は１５〜３５ｍｅｒとする、（ｖｉｉ）プライマーの３’末端側のＧＣ含量を低くする、（ｖｉｉｉ）プライマー内で同一ヌクレオチドが多数連続する配列は回避する、（ｉｘ）プライマーは増幅したい鋳型ＤＮＡの片側１本鎖の配列と完全に一致している必要はないが、３’末端側の相補性を高くする、（ｘ）使用する鋳型ＤＮＡにおいて、プライマー部位の他に同様の配列がない、等である。
本発明のプライマーは、原材料のコムギだけでなく、加工段階の食品や加熱、調理等の加工後の食品にも使用可能であることを必要とする。したがって、使用されるコムギの鋳型ＤＮＡはインタクトなものではなく、非常に細かく切断されたＤＮＡ断片であると考えられ、（ｘｉ）２つのプライマーによって増幅される遺伝子の一部は、比較的短い領域であることが好ましい。さらに、各種のコムギが共通して有する１つの遺伝子領域の中で、（ｉ）〜（ｘｉ）の全ての条件を満たすプライマーを設計する必要がある。しかし、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔわずか４つのヌクレオチドからなるＤＮＡ配列で、これらの条件を全て満たすプライマーを作製することは非常に難しく、それ故、プライマーの設計は、ＰＣＲを行う上で非常に困難な問題となっている。また、仮にこれらの多数の条件を全て満たすプライマーを設計できたとしても、それはＰＣＲを行う上での必要条件でしかなく、意図したＰＣＲを成功させることは実際にＰＣＲを行ってみないと判らない。
ＰＣＲ法は特に限定されず、公知である種々の改良方法を含むが、１例を挙げれば、プライマーのペアー、鋳型（被検）ＤＮＡの他にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、プライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の３つのステップからなっている。各ステップはそれぞれ異なった、場合によっては同一の反応温度と反応時間を必要とするので増幅しようとするＤＮＡ領域の塩基配列とその長さによって適切な範囲とする。このような操作のためのｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒが市販されている。ＧＣ含量と配列の長さから得られる下記式
Ｔｍ（℃）＝４×（Ｇ＋Ｃ）＋２×（Ａ＋Ｔ）
を、アニーリング温度の指標とする。ＰＣＲ増幅産物が５０〜５００ｂｐより好ましくは１００〜１５０ｂｐ程度になるようにする。この範囲とすれば、加工食品中で断片化しているＤＮＡの検出もできるからである。
本発明においては、前記遺伝子および前記プライマーが、以下に示すものが好ましい。
▲１▼前記遺伝子が、配列番号１３に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、６６１番目のａ〜１３２０番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲２▼前記遺伝子が、配列番号１４に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、１８１番目のａ〜５４０番目のｔまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
▲３▼前記遺伝子が、配列番号１５に示すコムギ遺伝子であり、前記プライマーが、２４０１番目のｇ〜２８８６番目のａまでの配列から選択される少なくとも５〜３５個の連続したＤＮＡ断片の情報から選択されるセンスプライマーまたは、アンチセンスプライマー。
上記した、▲１▼〜▲３▼のセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーのペアーの中でも、第３表に示すＷｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ０５（配列番号５）／Ｗｇｓ１０（配列番号６）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーがさらに好ましく、Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）のプライマーペアーが特に好ましい。
プライマーは、ターゲットの遺伝子の相補鎖であり、ターゲット遺伝子のＮ−末側の配列部分とＣ−末側の配列部分とがペアーで選択される。ペアーの長さは同じでもよいし異なっていても良い。
後に「特異性の確認」で説明するように同じＴｍ値をとるプライマーペアー（Ｗｔｒ０５（配列番号３）／Ｗｔｒ０６（配列番号４）、Ｗｇｓ０７（配列番号７）／Ｗｇｓ０８（配列番号８））でも検出に不適当な場合があり、プライマーの選択が重要である。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２の濃度や反応サイクル数等好適なＰＣＲ条件の検討、あるいはｎｅｓｔｅｄＰＣＲを用いれば、さらに検出感度が向上する可能性がある。
ＰＣＲ反応物は、免疫反応を用いて同定しても、どのように同定してもよいが、電気泳動させて、必要な場合は陽性コントロールや、陰性コントロールを用いて電気泳動像で明瞭なバンドが認められれば、被検物質（食品）中に検出物質（コムギ）が存在することが確認できる。
本発明の方法は、検出物質が被検物質（食品）に含まれるコムギである場合に有効である。
ここで「コムギ」とは、強力コムギ、中力（準強力）コムギ、薄力コムギ、デュラム（マカロニ）コムギ、その他食用の単粒系コムギをいう。
コムギとしては、具体的は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｈｉｔｅ（アメリカ）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｐｒｉｎｇ Ｗｈｅａｔ Ｎｏ．１（カナダ）、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｗｈｅａｔ（オーストラリア）、農林６１号（日本）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｍｂｅｒ Ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ、カナダ）等が例示できる。
本発明の検出方法は、コムギの遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計されたプライマーを、試薬として含有した試薬一式（キット）を用いて行えば、容易に実施することもできる。試薬一式（キット）は、ＰＣＲに広く用いられる公知の試薬を含有していても、電気泳動装置等の他の装置が付属していてもよい。具体的に試薬としては、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等が挙げられる。これらの試薬は試薬一式（キット）の中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。試薬一式（キット）中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、本発明のＰＣＲを実施するについて可能な範囲であればよい。また、試薬一式（キット）には、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。
ＤＮＡは熱に安定であり加工食品中でも微量で検出できるので得られた結果は食品に表示したり、食品のアレルギー情報として利用できるほか、食品中のコムギの有無を検出することにより加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存、あるいは製造ライン間の相互汚染の有無等の生産者の意図していない工程を検出することができる。
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）コムギ検知のためのプライマーの構築
コムギ由来ＤＮＡを検知するためのプライマーを構築するにあたって、まず国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）のデータベースにアクセスし、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の既知遺伝子の検索を行い、得られたコムギに関する遺伝子情報の中からコムギの貯蔵タンパクである、▲１▼Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｔｒｉｔｉｃｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、ｍＲＮＡ、ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ．（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｓ６２６３０、全長１５６７ｂｐ）（配列番号１３）；▲２▼Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｇｌｕｔａｔｈｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）ｇｅｎｅ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＦ１０９７１４、全長２９４７ｂｐ）（配列番号１４）；▲３▼Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＧＢＳＳＩ）（Ｗｘ−Ｄ１）、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＢ０１９６２４、全長２８８６ｂｐ）（配列番号１５）を選択した。
次に、ＤＤＢＪのＢＬＡＳＴ検索によって、選択したコムギの遺伝子配列と類似の配列がコムギ以外の植物にはないことを確認した。
発明者は、プライマーを設計するために、コムギの特定の遺伝子配列についてソフトウェア”ＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣ”を使用して、プライマーの候補となる配列の検索を行った。ＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣは、プライマー設計の上記条件のうち、手計算では解析困難な種々の条件（ｉ）ＧＣ含量、（ｉｉ）Ｔｍ値の範囲設定を行えることから使用した。その結果、候補となる配列を１２６対同定することができた。その中で上記（ｉ）〜（ｘｉ）のプライマー設計のための条件を全て満たす配列を、発明者が独自に検索することにより、本発明の検査方法で使用可能なプライマー配列を１２対選択した。なお、本発明の検査方法のプライマーの設計については、ＤＮＡが断片化している加工食品からの検知を鑑み、ＰＣＲによる増幅産物が１００〜１５０ｂｐ程度になるよう考慮した。このようにして選択したプライマー１２対のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマー（バイオロジカ（株）で合成）を作製した。
（２）ＤＮＡの抽出
コムギおよびその他の植物の種子については表面を１％ＴｒｉｔｏｎＸ（和光純薬）により洗浄した後蒸留水ですすぎ、よく乾燥させた後マルチビーズショッカー（安井機械）で微粉砕した。次に粉砕サンプル１〜１．５ｇをＤｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。小麦粉等の粉末サンプルについても上記種子と同様に微粉砕後、Ｄｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔを用いてＤＮＡを抽出した。また加工食品については水分含量の高いものは２４時間凍結乾燥後１ｇを、水分含量の低いものについてはそのまま１ｇからＧｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ２０／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡは吸光度の測定により濃度を求めた後、純水を用いて１０ｎｇ／μｌに希釈し、これをＰＣＲの鋳型（被検）ＤＮＡ試料液として用いた。
（３）ＰＣＲと電気泳動像によるコムギの検出
ＰＣＲ反応液は以下のように調整した。すなわちＰＣＲ緩衝液（ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒＩＩ、アプライドバイオシステムズ社），２００μｍｏｌ／ｌ；ｄＮＴＰ，１．５ｍｍｏｌ／ｌ；ＭｇＣｌ２，０．５μｍｏｌ／ｌ；５’および３’プライマー、および０．６２５ｕｎｉｔｓ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、アプライトバイオシステムズ社）を含む液に１０ｎｇ／μｌに調整したＤＮＡ試料液２．５μｌを加え、全量を２５μｌとした。第４表で鋳型ＤＮＡ量の記載のないものはこの場合の濃度である。但し、抽出されたＤＮＡの濃度が１０ｎｇ／μｌ以下の場合、または添加物が多い加工食品等で、得られたＤＮＡの吸光度ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の値が１．７以下と夾雑物が多くＤＮＡの純度が低い場合には、抽出ＤＮＡ原液または１０ｎｇ／μｌ希釈液を２．５μｌ〜１７．８μｌ ＰＣＲ反応液に添加し、その量に応じて全量が２５μｌとなるように純水を用いて調整した。第４表で鋳型ＤＮＡ量が付記されているものはこの場合の濃度である。
ＰＣＲ増幅装置にはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。まず９５℃に１０分間保ち反応を開始させ、次に９５℃ ３０秒間、６０℃ ３０秒間、７２℃ ３０秒間を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲの増幅を行った。最後に終了反応として７２℃ ７分間保った後４℃で保存し、得られた反応液をＰＣＲ増幅反応液とした。
ＰＣＲ増幅反応液はエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲル（２％Ｅ−Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による電気泳動に供し、陽性コントロール（コムギ種子より抽出したＤＮＡ）および陰性コントロール（鋳型ＤＮＡなしのブランク反応液）の増幅バントの有無によってＰＣＲの妥当性を判断すると共に、各プライマーによる至適サイズのＤＮＡ増幅バンドを確認することによってサンプル中のコムギの混入の有無を判定した。
（４）実験１．コムギ検知プライマーの特異性の確認
コムギを特異的に検出するプライマーの選抜を目的として、コムギおよびその他の植物の種子から得たＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。コムギのサンプルとしては５種類のコムギ銘柄または品種［Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｈｉｔｅ（アメリカ）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｐｒｉｎｇ Ｗｈｅａｔ Ｎｏ．１（カナダ）、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｗｈｅａｔ（オーストラリア）、農林６１号（日本）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｍｂｅｒ Ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ、カナダ）］を用いた。また、他の植物としてライムギ（カナダ）、オオムギ（ミノリムギ）、オーツムギ（競馬向け飼料用）、コメ（コシヒカリ）、トウモロコシ（飼料用ｎｏｎＧＭＯ）、ダイズ（ムラユタカ）、アワ（熊本）、ナタネ（Ｃａｎｏｌａ）の種子およびソバを用いた。
ＰＣＲ後電気泳動を行い、至適サイズの明瞭な増幅バンドがコムギサンプルにおいてのみ認められ、他の植物では認められないプライマーを、コムギを特異的に検知するプライマーとして選抜した。
コムギ検知用プライマー；Ｗｔｒ０１（配列番号１）／Ｗｔｒ１０（配列番号２）、Ｗｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）、Ｗｔｒ０５（配列番号３）／Ｗｔｒ０６（配列番号４）、Ｗｇｓ０７（配列番号７）／Ｗｇｓ０８（配列番号８）、Ｗｇｓ０５（配列番号５）／Ｗｇｓ１０（配列番号６）およびＷｓｓ０１（配列番号１１）／Ｗｓｓ０２（配列番号１２）の特異性を示す検出結果の電気泳動像を、それぞれ図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ、図１ｅおよび図５に示す。
図１および図５において、Ｍ：１００ｂｐラダー、ＮＣ：Ｎｏ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。図１のレーン番号（サンプル名）およびその結果を下記第１表に示す。図５のレーン番号（サンプル名）およびその結果を下記第２表に示す。
なお、Ｗｔｒ０５（配列番号３）／Ｗｔｒ０６（配列番号４）のプライマーセットはコムギ以外の多くの種の雑穀との交差反応が認められ、Ｗｇｓ０７（配列番号７）／Ｗｇｓ０８（配列番号８）のプライマーセットはライムギとの交差反応が認められ、コムギ検出用プライマーとして適当でないことが分かる。
また、他のプライマー対の多くは、特定原材料として食品衛生法で定められているコムギの範疇から外れるライムギとの交差反応が認められた。
上記のプライマーセットを第３表に示す。
実験２−１ではＷｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）プライマーを用いたＰＣＲによるコムギの検出限界を調べることを目的として、ＤＮＡレベルおよび粉体レベルでコムギの擬似混入サンプルを作製し、それらのＤＮＡ試料液を用いてＰＣＲを行いコムギの検出限界を確認した。
ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルは、コムギの種子より抽出されたＤＮＡを１０ｎｇ／μｌに希釈し、それをサケ精子ＤＮＡ中のコムギＤＮＡの混入率が０、１、１０、５０、１００、１０００ｐｐｍおよび１％となるように体積比で混合して作製した。また、粉体レベルの擬似混入サンプルは、トウモロコシ粉中のコムギ粉の混入率が０、１、１０、５０、１００、１０００ｐｐｍおよび１％となるように質量比で混合してサンプルを作製し、各混入サンプルを微粉砕した後ＤＮＡを抽出した。
図２ａおよび図２ｂに検出結果の電気泳動像を示す。上部の数字はコムギの混入率を示し、Ｍ：１００ｂｐラダー、ＮＣ：Ｎｏ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。ここで図２ａは、コムギＤＮＡをサケ精子ＤＮＡで希釈した、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルを被検体とし、図２ｂは、コムギ粉をトウモロコシ粉で希釈した、粉体レベルの擬似混入サンプルを被検体とした。
実験２−１においてＷｇｓ１１（配列番号９）／Ｗｇｓ１２（配列番号１０）を用いたＰＣＲによるコムギ検出限界を確認した結果、ＤＮＡレベルおよび粉体レベルのいずれの擬似混入サンプルにおいてもコムギ混入率として５０ｐｐｍが検出限界であった（図２）。但し複数回行った実験の内、数回の検出限界は１００ｐｐｍであり、このＰＣＲ反応系で安定して検出される限界は１００ｐｐｍであることが示唆された。小麦粉のタンパク質含量は約１０質量％（五訂食品成分表より）であることから、本ＰＣＲ反応系の検出限界１００ｐｐｍはコムギのタンパク質の混入率に換算すると１０ｐｐｍとなる。
すなわちここで示したＰＣＲによるコムギの検知法は、従来にはない高い検出限界を達成し、しかも、特異性が高く、微量成分の確実な測定（分析）方法であると考えられる。
（５−２）実験２−２．ＰＣＲによるコムギの検出限界の碓認
実験２−２ではＷｓｓ０１（配列番号１１）／Ｗｓｓ０２（配列番号１２）プライマーを用いたＰＣＲによるコムギの検出限界を調べることを目的として、上記実験２−１と同様にして、ＤＮＡレベルでコムギの擬似混入サンプルを作製し、それらのＤＮＡ試料液を用いてＰＣＲを行いコムギの検出限界を確認した。
図４に検出結果の電気泳動像を示す。上部の数字はコムギの混入率を示し、Ｍ：１００ｂｐラダー、ＮＣ：Ｎｏ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（鋳型ＤＮＡなしのブランク）水を示す。ここで図４は、コムギＤＮＡをサケ精子ＤＮＡで希釈した、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルを被検体とした。
（６）実験３．ＰＣＲによる加工食品からのコムギの検知
コムギ検知プライマーとしてＷｇｓ１１（配列番号９）／１２（配列番号１０）を用いて、原料としてコムギが含まれる加工食品からのコムギの検知を行った。用いたサンプルはレトルト缶詰、ケーキミックス、スパゲッティー、シリアル、菓子７種類（ビスケット、せんべい、プレチェル、ふがし、カステラ、スナック菓子、チョコレート）で、それぞれ微粉砕後、Ｄｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔまたはＧｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ２０／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲに供した。レトルト缶詰については、得られたＤＮＡのｐ純度が低く、ＰＣＲ反応チューブ当たり５０〜１２０ｎｇ（吸光度からの計算値）のＤＮＡを添加した。
図３ａ、図３ｂのレーン番号（サンプル名）を以下の第４表に示す。
現在食品アレルギーの検査として臨床現場では、誘発試験やプリック・スクラッチ試験、ＲＡＳＴ法等が実施されているが、これらの方法はアレルギー患者自身あるいは血液を対象として実施する検査であり、食品分析への適用は困難である。一方、アレルゲンそのものを検出、定量するための特定タンパク質の分離検出法として、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）やウェスタンブロッティング法、免疫化学的手法（ＥＬＩＳＡ法）が使われているが、これらは既知の主要アレルゲンの検出のためには有効であるが、未知のアレルゲンの検出あるいは加熱工程によってタンパクが変性している可能性のある加工食品においては必ずしも適当ではない。
産業上の利用可能性
ＤＮＡはタンパク質よりも加熱耐性が高いため加工食品中でも残存している場合が多い。このため本発明で示した遺伝子を指標としたＰＣＲによるコムギの検知法は、特に加工食品において従来からのタンパク質の検出法を補う間接的な食品中のアレルギー物質の分析手段として極めて有用であると考えられる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、コムギ検出プライマーのコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像である。図１ａはコムギ検出プライマーＷｔｒ０１／１０のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｂはコムギ検出プライマーＷｇｓ１１／１２のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｃはコムギ検出プライマーＷｔｒ０５／０６のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｄはコムギ検出プライマーＷｇｓ０７／０８のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像であり、図１ｅはコムギ検出プライマーＷｇｓ０５／１０のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像である。
図２は、ＰＣＲによるコムギ検出系の検出限界を示す電気泳動像である。図２ａは、ＤＮＡレベルの擬似混入サンプルの測定結果であり、図２ｂは、粉体レベルの擬似混入サンプルの測定結果を示す電気泳動像である。
図３は、ＰＣＲによる加工食品からのコムギの検出結果を示す電気泳動像である。図３ａ、図３ｂはそれぞれ測定した加工食品がレーン毎に異なっている。
図４は、ＰＣＲによるコムギ検出系の結果を示す電気泳動像である。
図５は、コムギ検出プライマーＷｓｓ０１／Ｗｓｓ０２のコムギ特異性の結果を表示する電気泳動像である。
Claims (7)
- 食品からＤＮＡを抽出し、プライマーの対（センスプライマーおよびアンチセンスプライマー）を用いて、ＰＣＲを行って、前記プライマーの増幅産物を測定する方法において、
前記プライマーの対が、
Ｗｔｒ０１（配列番号１）およびＷｔｒ１０（配列番号２）のプライマー、であり、
前記測定が、下記コムギ群から選択される1種以上のコムギが測定され、ライムギが測定されない食品中のコムギの有無を測定する方法。
コムギ群：強力コムギ、中力（準強力）コムギ、薄力コムギ、デュラム（マカロニ）コムギ、その他食用の単粒系コムギ - 前記プライマーの増幅産物がアニーリング温度６０℃のＰＣＲで得られる増幅産物を、電気泳動により、測定する方法において、明瞭なバンドとして認められる請求項１に記載の食品中のコムギの有無を測定する方法。
- 食品中の微量成分を食品に表示するために、請求項１または２に記載の方法を用いて、コムギの有無を測定し、食品に表示する請求項１または２に記載の食品中のコムギの有無を測定する方法。
- 食品摂取者にとって有害なコムギのアレルゲンを含む食品を識別するために、請求項１または２に記載の方法を用いて、食品中のコムギの有無を測定する方法。
- 前記食品が、加工処理された食品または食品原料である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 食品中のコムギの有無および／または濃度を測定するための請求項１に記載のＰＣＲ用プライマー。
- 請求項１に記載のプライマーを含有する、食品中のコムギの有無/または濃度を測定するためのキット。
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