JP4418303B2

JP4418303B2 - ダイズの検査方法

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Publication number: JP4418303B2
Application number: JP2004164928A
Authority: JP
Inventors: 宏人山川; 万由飯田; 江里子中川
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 2003-06-02
Filing date: 2004-06-02
Publication date: 2010-02-17
Anticipated expiration: 2024-06-02
Also published as: JP2005013226A

Description

本発明は、ダイズの検査方法に関する。詳細には、食品等の被検試料中のダイズを定性的または定量的に測定しうるダイズの検査方法に関する。

近年、アレルゲンを含む食品に起因する健康危害を防止するために、表示による情報提供の要望が高まっている。このため、平成１３年４月に食品衛生法関連法令が改正され、特定原材料５品目（卵、乳、小麦、そば、落花生）については、食品の全ての流通段階において適切な表示を行うことが義務化された。

ダイズは、平成８年度の厚生労働省の食物アレルギー調査研究班の調査では、症例として５番目に多いアレルゲンであると報告されており、主要な食品アレルギーの原料の一つである。このため、ダイズは特定原材料に準じる原材料として前述法令において定められ、その使用の有無、混入等について食品に表示することが推奨されている。ダイズアレルギーの症状は、他の即時型食物アレルギーと同様に、嘔吐、腹痛、下痢等の消化器疾患症状や呼吸困難等を呈する。また、食物として摂取されるだけでなく、ダイズ粉塵の吸入により喘息を生じた症例もある。

ダイズは食用油やタンパク質の主要な摂取源であり非常に多くの食品に利用されている。例えば、ダイズタンパク質を含む食品として、豆乳、豆腐、味噌、醤油、納豆、ハム、ソーセージ、水産練り製品、パン、スープ、シリアル等の各種加工食品等が挙げられる。

自らダイズを用いていれば加工食品に表示できることは当然であるが、外部で製造された中間原料を用いる場合、中間原料にダイズが含まれているか否かについて、特に意図しない混入を確認することが、アレルギーによる健康危害を未然に防止する上で重要である。

一方、食品アレルギーの検査において、アレルゲンそのものを検出・定量するための特定タンパク質を分離し検出する方法（タンパク質検出方法）として、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）やウェスタンブロッティング法、免疫化学的手法（例えば、ＥＬＩＳＡ法等）が実施されている。これらの方法は原料中の既知の主要アレルゲンの検出には有効であるが、未知のアレルゲンの検出や加熱工程によってアレルゲンである特定のタンパク質が変性している可能性がある加工素材・食品においては必ずしも有効ではない。

このような状況において、被検体からＤＮＡを抽出し、ダイズの多コピーＤＮＡ配列（ＳＢ９２配列）を標的としてＰＣＲを行い、増幅された標的ＤＮＡの有無を指標としてダイズを検出する方法が提案されている（特許文献１参照。）。しかし、該方法は、ダイズ以外の食品原料との交叉反応の問題があり、食品へのダイズ混入等の正確な情報が得られないという問題がある。

したがって、食品メーカーでは、多種多様の食品について、ダイズのごく微量の存在、または製造工程におけるダイズの混入を、特異的に検出することができる正確な検査方法の提供が望まれている。

特開２００１−３０９７８６号公報

本発明の課題は、食品等の被検試料中のダイズを特異的にかつ正確に測定しうる方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題の解決を目的として鋭意検討した結果、ダイズ特異的な特定のプライマーを構築し、これを用いてＰＣＲを行うことにより、原材料や加工食品中のダイズを高精度に検出することができることを見出した。

すなわち本発明は、（１）下記（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群から選択される、ダイズを特異的に検出しうるプライマーのセットを用いてＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う、試料中のダイズを定性的または定量的に測定する方法を提供する。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｉｉ）配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｉｉｉ）配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｉｖ）配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｖ）配列番号１３に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１４に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、および
（ｖｉ）配列番号１５に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１６に記載の塩基配列からなるプライマーのセット。
また、上記の（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群から選択され、ダイズを特異的に検出しうるＰＣＲ用プライマーセット、およびこれらのプライマーのセットの少なくとも１つを含有する、試料中のダイズを定性的または定量的に測定するためのキットを提供する。

本発明はまた、ダイズのみを特異的に検出し、穀類、種実類、ダイズ以外の豆類、その他の作物とは交叉反応しない、試料中のダイズを定性的または定量的に測定する方法を提供する。

本発明の方法は、食品素材または食品中のダイズの有無を食品に表示するための検査方法である。

本発明はさらに上記の方法を実施して、ダイズに対してアレルギーがあるまたはその疑いがある食品摂取者のためにダイズ含有食品であるかを識別するため、または食品にダイズが含まれるか否かの情報を提供するために、ダイズの有無を食品またはその包装に表示する方法を提供する。
なお、食品素材または食品は、食品原料、その加工中間原料、加工食品が含まれる。また、食品素材または食品はヒトの食品のみならず、ペットフードや飼料を含む。

本発明によれば、ダイズに対して特異性が高く、精度および感度が高いダイズ検査方法が提供される。一般的にアレルゲンの検出法は、加工食品中の特定の原材料のタンパク質を数μｇ／ｍＬまたは数μｇ／ｇの程度で検出可能であれば十分であるとされている。本発明の方法はＤＮＡレベルで１０ｐｐｍ以上のダイズを検出可能であり、これはタンパク質量として数ｐｐｍに相当する。このため、本発明のダイズの検査方法は、食品、特に加工食品におけるアレルゲンの分析手段として極めて有用である。

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ダイズの遺伝情報に基づきＰＣＲ用プライマーを設計してＰＣＲを行い、食品中のダイズの有無を測定する方法（以下、「本発明の方法」という場合がある。）である。

検体として検査される食品は、原材料であっても、加工段階のいずれであっても、加工後の食品であってもよい。本発明の方法は、食品中の例えば、全食品に対するダイズの質量比、またはＤＮＡレベルでのダイズ由来ＤＮＡの質量もしくは体積比で、１％以下、好ましくは１００ｐｐｍ以下、さらには５０ｐｐｍ以下、特に１０ｐｐｍ程度の微量のダイズの存在の有無を検出することができる。このため、意図しないダイズの混入、調味料や添加物の一部として微量存在しても検出することができる。さらに核酸（ＤＮＡ）は、タンパク質等の他の生体物質に比べて、加熱等の食品加工に対して比較的安定であり、加熱、調理等、加工された食品中の微量の存在を検出できる。

また、本発明の方法は、食品へのダイズ混入等の正確な情報を与え、検査における偽陰性、偽陽性の心配がない、食品等の被検試料中のダイズを特異的にかつ正確に検出または測定できることが必要とされる。すなわち、本発明の方法に用いるＰＣＲ用プライマーは、ダイズを特異的に検出し、ダイズ以外の作物または食品原料、例えばライムギ、コメ、トウモロコシ、ナタネ、オーツムギ、コムギ、ソバ、モチキビ、オオムギ、ピーナッツ、カシューナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、アーモンド、キントキマメ、シロハナマメ、ムラサキハナマメ、ウズラマメ、エンドウマメ、レンズマメ、インゲンマメ、ガルバンゾーおよびアズキとは交叉反応しないように設計されるのが好ましい。そのようなプライマーはダイズの遺伝情報に基づいて設計される。

ダイズの遺伝情報としては、サテライトＤＮＡＳＴＲ１２０−Ａ. １（Ａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎＮｏ．Ｕ２６６９７）またはＳＩＲＥ１（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０６３２６）のダイズＤＮＡの塩基配列、特に配列番号１または２に記載される塩基配列を挙げることができる。

プライマーの設計は、本発明の方法を考慮して以下の条件等に留意する。
条件として、（ｉ）プライマーのＧＣ含量が４０〜６０％、（ｉｉ）プライマーのＴｍ値が５５〜７０℃、（ｉｉｉ）センス、アンチセンスプライマーのＴｍ値が近い、（ｉｖ）プライマーの３′末端側で相補的配列を有していない、（ｖ）プライマーが高次構造を形成しない、（ｖｉ）プライマーの全長は５〜５０ｍｅｒ、好ましくは１５〜３５ｍｅｒ
、（ｖｉｉ）プライマーの３′末端側のＧＣ含量を低くする、（ｖｉｉｉ）プライマー内で同一ヌクレオチドが多数連続する配列は回避する、（ｉｘ）プライマーは増幅すべき鋳型ＤＮＡの片側１本鎖の配列と完全に一致している必要はないが、３′末端側の相補性を高くする、（ｘ）使用する鋳型ＤＮＡにおいて、プライマー部位の他に同様の配列がない等である。

本発明の方法は、生の原材料だけでなく、加工段階の食品や加熱、調理等の加工食品にも使用可能であることが必要とされる。このため、使用されるダイズの鋳型ＤＮＡがインタクトだけではなく、細かく切断されたＤＮＡ断片である場合があり、(ｘｉ)ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ領域は、比較的短いことが好ましい。
本発明の方法に用いるプライマーは、該ＤＮＡ領域において（ｉ）〜（ｘｉ）の全ての条件を満たすプライマーとして設計する。しかし、これらの条件を全て満たすプライマーを設計することは難しく、条件を満たすプライマーを設計できたとしてもＰＣＲを行う上での必要条件でしかなく、所望のＰＣＲの結果が得られるかどうかは、実際にＰＣＲを行ってみないと判らない。それ故、プライマーの設計は、ＰＣＲを行う上で非常に困難な問題となっている。

本発明におけるプライマーは、サテライトＤＮＡＳＴＲ１２０−Ａ. １（Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ２６６９７）またはＳＩＲＥ１（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０６３２６）のダイズＤＮＡの８０〜４００ｂｐ、好ましくは１００〜３００ｂｐ程度の連続した領域を特異的に増幅するためのプライマーである。したがって、本発明におけるプライマーは、サテライトＤＮＡＳＴＲ１２０−Ａ. １（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮ
ｏ．Ｕ２６６９７）またはＳＩＲＥ１（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０６３２６）のダイズＤＮＡより選択されるダイズＤＮＡの塩基配列のうち、少なくとも５〜５０ｍｅｒの連続した塩基配列を有するプライマーが好ましい。

本発明のプライマーの好ましい具体例としては、上記（４）の（ｉ）〜（ｖｉ）に記載のプライマー（第１のプライマー群）が例示できるが、しかしながら、本発明のプライマーは、特定の配列および長さのプライマーに限定されず、第１のプライマー群と実質的に同一の機能を有するプライマー（第２のプライマー群）もまた包含する。したがって、本発明のプライマーは、第１および第２のプライマー群に含まれるプライマーの５塩基、より好ましくは３塩基、さらに好ましくは１塩基を欠失、置換、付加および／または挿入したプライマー、第１のプライマー群に含まれるプライマーに対応する鋳型ＤＮＡに対し５′側および／または３′側に１５塩基、より好ましくは８塩基、さらに好ましくは３塩基ずれているプライマー、また、第１および第２のプライマー群に含まれるプライマーとおよそ８０％、より好ましくはおよそ９０％、さらに好ましくはおよそ９５％の配列が一致するプライマーで、第１および第２のプライマー群に含まれるもとのプライマーと同じ鋳型ＤＮＡの領域にハイブリダイズするのであれば、これを包含する。

具体的には、特定の配列および長さのプライマーとして下記に示されるプライマーが例示できる。
ｇｙｍ０１；５’−ＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡ−３’
（配列番号３）
ｇｙｍ０２；５’−ＡＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＣＣＣＴＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴ−３’
（配列番号４）
ｇｙｍ０３；５’−ＧＡＣＴＴＡＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＡＴＡＧＡＴＣＣＡ−３’
（配列番号５）
ｇｙｍ０４；５’−ＴＧＣＣＴＡＡＧＴＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＡＡ−３’
（配列番号６）
ｇｙｍ０５；５’−ＴＴＡＡＣＡＧＣＧＣＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＡ−３’
（配列番号７）
ｇｙｍ０６；５’−ＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＣＴＡＡ−３’
（配列番号８）
ｇｙｍ０７；５’−ＣＡＣＴＴＡＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＣ−３’（配列番号９）
ｇｙｍ０８；５’−ＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡ−３’（配列番号１０）
ｇｙｍ４１；５’−ＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＧ−３’
（配列番号１３）
ｇｙｍ４２；５’−ＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡ−３’
（配列番号１４）
ｇｙｍ８１；５’−ＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＡＧＴＧＡ−３’
（配列番号１５）
ｇｙｍ８２；５’−ＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＡＣ−３’
（配列番号１６）

本発明において、ＰＣＲ法は特に限定されず、公知である種々の改良方法を含むが、１例を挙げれば、プライマーのセット、鋳型（被検）ＤＮＡの他にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲ反
応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の３つのステップからなる。各ステップはそれぞれ異なる、場合により同一の反応温度と反応時間を必要とし、これらは増幅すべきＤＮＡ領域の塩基配列、長さ等により適宜決定される。このような操作のためのｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒが市販されている。

本発明の方法においては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ₂の濃度や反応サイクル数等
好適なＰＣＲ条件の検討、またはｎｅｓｔｅｄＰＣＲを用いれば、さらに検出感度が向上する可能性がある。

ＰＣＲの結果（ＰＣＲ産物）は、特定のＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリダイゼーション、免疫学的方法等を用いて同定することができる。一般的には、ＰＣＲ産物を電気泳動し、その泳動パターンにより確認する。この場合、所望のサイズの明瞭なバンドが認められれば、被検試料中にダイズの存在を検出することできる。また、種々の量の鋳型ＤＮＡを用いることにより、ダイズのみを定量的に測定することができる。さらに、定量的ＰＣＲを行うことにより、より正確にダイズのＤＮＡを定量することができる。定量的ＰＣＲは、例えばＪＡＳ分析試験ハンドブック遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版（独立行政法人農林水産消費技術センター）に記載される方法および装置を用いて行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲ装置を用いると、より迅速にダイズＤＮＡを検出・定量することができる。

本発明の方法は、ダイズのみを特異的に検出しうるが、ダイズの特定の品種のみに限定されるものではない。例えば、主なダイズ１４品種（とよこまち（北海道産）、とよむすめ（北海道産）、りゅうほう（秋田産）、たちながは（栃木産）、えんれい（富山産）、ふくゆたか（三重産）、むらゆたか（三重産）、丹波黒豆、青大豆（山形産）、ＶＩＮＴＯＮ（米国産）、納豆用（米国産）、単品種（米国産）、ＳＯＹ（ブラジル産）および中国産ダイズ）の全てを検出することができたことから、本発明の方法は任意のダイズ品種に適用することができる。

本発明は、上記ＰＣＲ用プライマーを含む本発明の方法を実施するためのキットを包含する。該キットは、本発明のＰＣＲ用プライマーの他に、ＰＣＲに広く用いられる公知の試薬を含有していても、電気泳動装置等の他の装置が付属していてもよい。
試薬としては、例えば、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ₂、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のポリメ
ラーゼ、緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等が挙げられる。これらの試薬はキットの中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。キット中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、本発明のＰＣＲを実施するについて可能な範囲であればよい。また、キットには、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。

ＤＮＡは熱に安定であり加工食品中でも微量で検出できるので得られた結果は食品に表示したり、食品のアレルギー情報として利用したりできるほか、食品中のダイズの有無を検出することにより加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存、あるいは製造ライン間の相互汚染の有無等の生産者の意図していない工程を検出することができる。

ダイズの遺伝情報としてサテライトＤＮＡＳＴＲ１２０−Ａ. １（Ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎＮｏ．Ｕ２６６９７）またはＳＩＲＥ１（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０６３２６）を例にして、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）ダイズ検出のためのプライマーの構築
ダイズ由来ＤＮＡを検出するためのプライマーを構築するにあたって、国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）のデータベースにアクセスし、ダイズの既知遺伝子配列の検索を行った。キーワードは、ダイズの学術名「ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ」および繰り返し配列を示す「サテライト［ｓａｔｅｌｌｉｔｅ］」とした。
その結果、サテライトＤＮＡＳＴＲ１２０−Ａ. １〜Ａ. ４、Ｂ. １（Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ．２６６９７〜Ｕ．２６７０１）がヒットした。このうち、最も配列の長いＳＴＲ１２０−Ａ. １をＢＬＡＳＴ検索にかけた所、ＳＴＲ１２０−Ａ. ２〜Ａ. ４、Ｂ. １以外には、殆ど相同性が見られず、ダイズ特異性が高いことが見込まれた。そこで、このＳＴＲ１２０−Ａ. １（全長３７２ｂｐ）の塩基配列（配列番号１）
をもとにプライマーを設計した。設計したプライマーは、第１表に示した。
また、ＤＤＢＪデータベースに登録されたダイズの既知遺伝子からＢＬＡＳＴ検索により他の生物との相同性が低い遺伝子として、ＳＩＲＥ１配列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０６３２６）（配列番号２）を選択し、このＳＩＲＥ１配列（全長７７６ｂｐ）の塩基配列（配列番号２）をもとにプライマーを設計した。設計したプライマーは、第２表に示した。

本発明者は、プライマーを設計するために、ダイズの特定の遺伝子配列についてソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸＭＡＣ」を使用して、プライマーの候補となる配列の検索を行った。「ＧＥＮＥＴＹＸＭＡＣ」は、プライマー設計の上記条件のうち、手計算では解析困難な条件（ｉ）ＧＣ含量、（ｉｉ）Ｔｍ値の範囲設定を行えることから使用した。その結果、候補として１００以上のプライマーのセット（センスプライマーおよびアンチセンスプライマー）の中からピックアップした。次いで、その中で上記（ｉ）〜（ｘｉ）のプライマー設計のための条件を全て満たすプライマーとして、本発明者が独自に検索することにより、２２セットのＰＣＲ用プライマーを設計して作製した（ＱＩＡＧＥＮにて合成）。

（２）ＤＮＡの抽出
ダイズ、その他の豆類、穀物、種実類は、それぞれ表面を１％ＴｒｉｔｏｎＸ（和光純薬（株）製）により洗浄した後蒸留水ですすぎ、よく乾燥させた。その後マルチビーズショッカー（安井機械（株）製）により微粉砕した。
得られた穀物類の粉砕サンプル１ｇを厚生労働省医薬局食品保健部長通知食発第１１０６００１号（平成１４年１１月６日付け）「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（以下、単に「通知法」という。）に記載されたプロトコールに従って、ＤｎｅａｓｙＰｌａｎｔＭａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。ダイズ、その他の豆類および種実類については、得られた粉砕サンプル２ｇを、該通知法に従いＧｅｎｏｍｉｃＴｉｐ２０／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。
抽出された各ＤＮＡは吸光度の測定により濃度を求めた後、純水を用いて２０ｎｇ／μＬに希釈し、これをＰＣＲの鋳型（被検）ＤＮＡ試料液として用いた。

（３）ＰＣＲと電気泳動像によるダイズの検出
ＰＣＲ反応液は以下のようにして調製した。
すなわちＰＣＲ緩衝液（ＰＣＲｂｕｆｆｅｒＩＩ、アプライドバイオシステムズ社製）、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、１.５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ₂、０.５μｍｏｌ／
Ｌ各プライマーおよび０.６２５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ
Ｇｏｌｄ、アプライトバイオシステムズ社製）を含む液に、２０ｎｇ／μＬに調整したＤＮＡ試料液２.５μＬを加え、全量を２５μＬとした。

ＰＣＲ増幅装置にはＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。
まず９５℃に１０分間保ち反応を開始させ、次に９５℃で３０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲの増幅を行った。最後に終了反応として７２℃に７分間保った後４℃で保存し、得られた反応液をＰＣＲ増幅反応液とした。
ＰＣＲ増幅反応液はエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲル（２％Ｅ−Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて電気泳動し、陰性コントロール（鋳型ＤＮＡを含まない
ＰＣＲ反応液）および陽性コントロール（ダイズより抽出したＤＮＡ）のバントの有無およびサイズによってＰＣＲの妥当性を判断すると共に、各プライマーによるＰＣＲ産物のバンドとそのサイズを確認することによって試料中のダイズの混入の有無を判定した。
また同時に、植物ＤＮＡ検出プライマー、ｃｐ０３−５’／−３’（通知法）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ試料液にＰＣＲ反応に至適なＤＮＡが確実に含まれていることを確認した。

実験例１：ダイズ検出プライマーの選択
ダイズおよび豆類３種（インゲンマメ、ガルバンゾーおよびアズキ）のＤＮＡを鋳型として、ｇｙｍ０１／０２〜ｇｙｍ０７／０８のプライマーを用いＰＣＲを行った。その結果を下記の第３表に示す。

その結果、４セットのプライマーは全てダイズに対してのみ増幅バンドが認められ、その他の豆類とは交叉反応が認められなかった。次いで、ダイズの増幅バンドを検討したところ、４セットのプライマー全てについて予想されたサイズの増幅バンドが認められた。また、ｇｙｍ０１／０２、ｇｙｍ０５／０６では、特にバンドが強く認められた。

次に、ｇｙｍ４１／４２〜ｇｙｍ５７／５８及び、ｇｙｍ７７／７８〜ｇｙｍ８９／９０について、以下の選抜試験を行った。
まず、選抜試験１として、とよこまち（北海道）、とよむすめ（北海道）、りゅうほう（秋田）、たちながは（栃木）、えんれい（富山）、ふくゆたか（三重）及び、むらゆたか（三重）のＤＮＡを混合したダイズ７種混合ＤＮＡと、ＨｙｐｅｒＰｒｏｔｅｉｎ、ＰｒｉｍｅＨａｒｄ、ＷｅｓｔｅｒｎＷｈｉｔｅ、ＤａｒｋＮｏｒｔｈｅｒｎＳｐｒｉｎｇ（以上アメリカ産）、ＣａｎａｄｉａｎＡｍｂｅｒＤｕｒｕｍ、ＣａｎａｄｉａｎＷｈｅａｔＮｏ．１（以上カナダ産）、ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＳｔａｎｄａｒｄＷｈｅａｔ（オーストラリア産）、農林６１号、チクゴイズミ及び、ホクシン（以上日本産）のＤＮＡを混合したコムギ１０種混合ＤＮＡと、マンカン(アメリカ産)、マンカン（カナダ産）、マンカン（中国産）、内蒙古（中国産）、楡林（中国産）、キタワセ（日本産）及び、会津在来（日本産）のＤＮＡを混合したソバ７種混合ＤＮＡと、ピーナッツ及びトラマメ、エンドウマメ、レンズマメのＤＮＡを混合した、ダイズ以外の豆類４種混合ＤＮＡと、マカダミアナッツのＤＮＡと、ナタネ、アワ及び、コメのＤＮＡを混合した油脂・穀類３種混合ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。
次に、選抜試験２として、選抜試験１で用いたダイズ７種混合ＤＮＡを、混入率が０、１０、５０、１００ｐｐｍとなるように、２０ｎｇ／μＬのサケ精子由来ＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ）に混合して作製した擬似混入ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。選抜試験１及び選抜試験２で用いた各種混合ＤＮＡは、各作物から別々にＤＮＡを採取し、それぞれ精製水で２０ｎｇ／μＬに希釈した後、等量づつ混合して作製した。

選抜試験１の結果、ｇｙｍ４１／４２〜ｇｙｍ５７／５８及び、ｇｙｍ７７／７８〜ｇ
ｙｍ８９／９０の１８セットのプライマーは全てダイズに対してのみ増幅バンドが認められ、ダイズ以外の豆類、種実類、油脂・穀類とは交叉反応が認められなかった。一方で、選抜試験２においてｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２を用いた場合のみ、ダイズＤＮＡの混入率が１０ｐｐｍの擬似混入ＤＮＡまで増幅が認められた。

次に、ｇｙｍ０１／０２、ｇｙｍ０５／０６、ｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２の４つのプライマーセットについてさらに検討を行った。

実験例２：プライマーのダイズ特異性の評価（１）
１）ｇｙｍ０１／０２の評価
穀類９種（ライムギ、コメ、トウモロコシ、ナタネ、オーツムギ、コムギ、ソバ、モチキビ、オオムギ）、種実類５種（ピーナッツ、カシューナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、アーモンド）、豆類１０種（キントキマメ（大正金時）、シロハナマメ、ムラサキハナマメ、ウズラマメ（中長うずら）、エンドウマメ、レンズマメ、インゲンマメ、ガルバンゾー、アズキ、ダイズ）から得られたＤＮＡを試料として、ｇｙｍ０１／０２のプライマーセットによるＰＣＲを行い、プライマーのダイズ特異性を検証した。
その結果、ダイズのみに強いシングルバンドが検出され、ダイズ以外の豆類、穀類、種実類とは交叉反応が認められなかった（図１および図２）。ただし、インゲンマメについては、植物ＤＮＡ検出プライマーｃｐ０３−５’／−３’による増幅も認められなかったことから、ＤＮＡ試料液がＰＣＲ反応に不適当なものであったと考えられる。

図１の電気泳動像において、レーン１はライムギ、レーン２はコメ、レーン３はトウモロコシ、レーン４はダイズ、レーン５はナタネ、レーン６はオーツムギ、レーン７はコムギ、レーン８はソバ、レーン９はインゲンマメ、レーン１０はガルバンゾー、レーン１１はアズキ、レーン１２はモチキビ、レーン１３はオオムギ、レーン１４は陰性コントロール（水）、Ｍは１００ｂｐマーカーを示す。
図２の電気泳動像において、レーン１はピーナッツ、レーン２はカシューナッツ、レーン３はマカダミアナッツ、レーン４はピスタチオ、レーン５はアーモンド、レーン６はキントキマメ、レーン７はシロハナマメ、レーン８はムラサキハナマメ、レーン９はウズラマメ、レーン１０はエンドウマメ、レーン１１はレンズマメ、レーン１２はガルバンゾー、レーン１３はアズキ、レーン１４はダイズ、レーン１５は陰性コントロール（水）、Ｍは１００ｂｐマーカーを示す。

２）ｇｙｍ０５／０６、ｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２の評価
穀類６種（ライムギ、コメ、トウモロコシ、コムギ、ソバ、オオムギ）、種実類１種（マカダミアナッツ）、油脂類１種（ナタネ）、豆類６種（トラマメ、エンドウマメ、レンズマメ、アズキ、ピーナッツ、ダイズ）から得られたＤＮＡを試料として、ｇｙｍ８１／８２、ｇｙｍ０５／０６及び、ｇｙｍ４１／４２のプライマーセットによるＰＣＲを行い、プライマーのダイズ特異性を検証した。その結果を下記の第４表に示す。

その結果、全てのプライマーのセットにおいて、ダイズ以外の豆類、穀類、種実類、ナタネとは交叉反応が認められなかった。

実験例３：プライマーのダイズ特異性の評価（２）
１）ｇｙｍ０１／０２の評価
ダイズ１４品種（とよこまち（北海道産）、とよむすめ（北海道産）、りゅうほう（秋田産）、たちながは（栃木産）、えんれい（富山産）、ふくゆたか（三重産）、むらゆたか（三重産）、丹波黒豆、青大豆（山形産）、ＶＩＮＴＯＮ（米国産）、納豆用（米国産）、単品種（米国産）、ＳＯＹ（ブラジル産）および中国産ダイズ）から得られたＤＮＡを試料として、ＰＣＲを行った。

その結果、試験したダイズ１４品種全てに対して所望のサイズ（１０８ｂｐ）のバンドが明瞭に認められ、プライマーｇｙｍ０１／０２はダイズを特異的に、かつ多岐にわたる品種のダイズを検出することができることが示された（図３）。
図３の電気泳動像において、レーン１はとよこまち（北海道産）、レーン２はとよむすめ（北海道産）、レーン３はりゅうほう（秋田産）、レーン４はたちながは（栃木産）、レーン５はえんれい（富山産）、レーン６はふくゆたか（三重産）、レーン７はむらゆたか（三重産）、レーン８は丹波黒豆、レーン９は青大豆（山形産）、レーン１０はＶＩＮＴＯＮ（米国産）、レーン１１は納豆用（米国産）、レーン１２は単品種（米国産）、レーン１３はＳＯＹ（ブラジル産）、レーン１４は中国産ダイズ、レーン１５は陰性コントロール（水）、Ｍは１００ｂｐマーカーを示す。

２）ｇｙｍ０５／０６、ｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２の評価
ダイズ９品種（とよこまち（北海道産）、とよむすめ（北海道産）、りゅうほう（秋田産）、たちながは（栃木産）、えんれい（富山産）、ふくゆたか（三重産）、むらゆたか（三重産）、ＶＩＮＴＯＮ（米国産）、ＮＡＶＹ（米国産））から得られたＤＮＡを試料として、ＰＣＲを行った。その結果を下記の第５表に示す。

その結果、試験したダイズ９品種全てに対して所望のサイズのバンドが明瞭に認められ、プライマーｇｙｍ０５／０６、ｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２はダイズを特異的に、かつ多岐にわたる品種のダイズを検出することができることが示された。

実験例４：検出限界の評価
１）ｇｙｍ０１／０２の評価
擬似混入ＤＮＡサンプルを鋳型として、プライマーｇｙｍ０１／０２によるＰＣＲを行い、ダイズの検出限界を確認した。
ＤＮＡレベルの擬似混入ＤＮＡサンプルは、ダイズＤＮＡを２０ｎｇ／μＬに希釈し、それをサケ精子ＤＮＡ中のダイズＤＮＡの混入率が１０、５０、１００、１０００ｐｐｍとなるように混合して作製した。その結果を第６表に示す。

その結果、プライマーｇｙｍ０１／０２を用いたＰＣＲの検出限界は１０ｐｐｍであることが示された。

２）ｇｙｍ０５／０６、ｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２の評価
粉体レベルの擬似混入サンプルから抽出したＤＮＡサンプルを鋳型として、プライマーｇｙｍ０５／０６、ｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２によるＰＣＲを行い、ダイズの検出限界を確認した。
粉体レベルの擬似混入サンプルは、ダイズ混入率が１０、５０、１００および１０００
ｐｐｍとなるように大豆粉を小麦粉に重量比で混合して作製したものより抽出したＤＮＡを用いた。その結果を第７表に示す。

その結果、プライマーｇｙｍ０５／０６、ｇｙｍ４１／４２及び、ｇｙｍ８１／８２を用いたＰＣＲの検出限界は１０ｐｐｍであることが示された。

実験例５：先行技術との比較
先行技術（特許文献１）のダイズ検出方法（以下、単に「従来法」という）と本発明の方法との比較実験を以下のように行った。
実験例２の１）と同じＤＮＡ試料液（穀類９種および豆類４種）を用いて、従来法のプライマー（配列番号１１、１２）、本発明のプライマーｇｙｍ０１／０２によりＰＣＲを行い、ダイズに対する特異性を比較した。その結果を第８表に示す。

その結果、本発明のプライマーｇｙｍ０１／０２では実験例２の１）と同様にダイズのみ検出したが、従来法のプライマーを用いた場合には、トウモロコシ、ナタネ、ソバ、アズキ、モチキビと交叉反応が認められた。この結果により、本発明の方法はダイズ特異性が非常に高く正確に判定できるのに対して、従来法は交叉反応による偽陽性が生じうることが示された。

図１は、プライマーｇｙｍ０１／０２を用いたダイズ特異性の結果を示す電気泳動図（その１）である。図２は、プライマーｇｙｍ０１／０２を用いたダイズ特異性の結果を示す電気泳動図（その２）である。図３は、プライマーｇｙｍ０１／０２を用いたダイズ特異性の結果を示す電気泳動図である。

Claims

下記（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群から選択される、ダイズを特異的に検出しうるプライマーのセットを用いてＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことを特徴とする、試料中のダイズを定性的または定量的に測定する方法；
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｉｉ）配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｉｉｉ）配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｉｖ）配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、
（ｖ）配列番号１３に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１４に記載の塩基配列からなるプライマーのセット、および
（ｖｉ）配列番号１５に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号１６に記載の塩基配列からなるプライマーのセット。
請求項１に記載の（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群から選択されるプライマーセットを含有する、試料中のダイズを定性的または定量的に測定するためのキット。