CN1620514A

CN1620514A - 小麦的检验方法

Info

Publication number: CN1620514A
Application number: CN02828074.1A
Authority: CN
Inventors: 山川宏人; 铃木江里子; 宫武圣子; 早川克志
Original assignee: NISSHIN POWDER MILLS Ltd
Current assignee: NISSHIN POWDER MILLS Ltd
Priority date: 2002-02-15
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: AU2002332326B2; JPWO2003068989A1; AU2002332326A1; WO2003068989A1; CA2476581C; ATE432363T1; KR20040083428A; JP3903044B2; CN1322144C; EP1482058B1; KR100938415B1; CA2476581A1; US7629118B2; EP1482058A4; EP1482058A1; US20050272033A1; DE60232466D1

Abstract

用基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR，用来测定食品中有无小麦的方法，在检出食品中所含的微量成分和识别有害的特定物质过敏源方面是优异的。

Description

小麦的检验方法

技术领域

本发明涉及小麦的检验方法，特别涉及为了标示在食品中是否含有过敏性物质，而在整个食品流通阶段检测所含微量小麦的检出方法。

背景技术

近年来，为了防止起因于含有过敏物质的食品造成的对健康的危害，对通过标示提供信息的希望日益高涨，伴随着平成13年4月食品卫生法关连法令的修订，对含有过敏物质的标示就成了义务。特别是对于病历数比较多的蛋、奶、小麦和症状比较重的荞麦和花生等5个品种(特定原材料)，在食品的整个流通阶段进行适当的标示已经义务化。

由于作为过敏物质的食品是否认为是过敏源，因个体的差异而有所不同，如果把在食品中所含的极其微量特定物质作出适当的标示，自己就可以知道从食品中摄取的是否含有过敏源。但是，当对食品进行加热等加工来检查有没有极其微量的特定物质时，用历来公知的食品分析方法是很困难的。

如果是生产者在本公司使用的特定物质，当然能够在加工的食品中进行标示，可是在使用特定物质作为终端制品的中间原料的情况下，特别是有时不能确认在购入的中间原料中是否含有微量的特定物质。实际上有时是无意混入的。

在食品制造商那里，正确的把握加工助剂或夹带物等食品添加物的极微量残留或者在制造线之间的相互污染的实态，做出适当的对策的同时，给消费者提供基于法律是正确的信息是很重要的，因此就希望提供过敏物质的正确分析技术。

特别是，小麦经常作为各式各样食品的一部分原材料使用，只是看到成为最终制品的食品，几乎不能判别使用了小麦。由小麦引起的过敏症很重，而且伴随着饮食生活的欧美化，患者人数有增加的倾向，在即时型的过敏物质中，成为重要的一员。

为此，在标示含有食品卫生法规定的过敏物质时，小麦被规定为特定的原材料之一，在食品中有时混入的情况下，对其的标示被义务化。

但是，对于小麦，没有适当的测定方法，因此希望有微量成份的确实测量方法。

发明内容

本发明的目的是开发能够正确地分析在食品中有无小麦混入的方法，通过构筑小麦特异性的引物并确认其分析系统的检出限，以及试图用在加工食品中，开发出测定食品中有无小麦的方法。

为达到上述目的本发明采用以下技术方案：

[1]本发明基于由一部分小麦的基因得到的信息，设计引物进行多聚酶链式反应(PCR)，从而提供测定食品中有小麦的方法。

[2]为了标示在食品中有无微量成份，提供一种在食品中的标示方法，基于由小麦的一部分基因得到的信息设计引物进行PCR，测定有没有小麦。

[3]为了识别含有对食品摄取者有害的小麦过敏源的食品，可以提供基于小麦的一部分基因得到的信息，设计引物并进行PCR，从而测定在食品中有无特定物质的方法、提供在食品中是否含有对过敏患者或其疑似患者有害过敏源的小麦的信息的方法，或者在食品中标示这其中的任何一种的方法。

[4，5]在此，上述食品可以是经过加工处理的食品，也可以是食品原料。食品包括人类的食品，也包括动物的食品(饲料)。

[6～8]在此，优选上述基因和上述引物是如下的方法：

①上述基因是在序列表的序列号13表示的小麦基因，上述引物是从第661a至第1320a的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选出的正义引物或反义引物；

②上述基因是在序列表的序列号14中表示的小麦基因，上述引物是从第181a至540t的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选出的正义引物或反义引物。

③上述基因是在序列表的序列号15中表示的用于淀粉合成的普通小麦(Triticum aestivum)基因(GBSSI)(Wx-D1)完全cds.(发病#AB019624，全长2886bp)基因，上述引物是从第2401g至2886a的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选出的正义引物或反义引物。

引物是靶基因的互补链，靶基因的N-末端的序列部分和C-末端的序列部分进行成对选择，对偶的长度可以相同，也可以不同。

[9]特别优选在①～③中以及在下面表3中表示的Wtr01(序列号1)/Wtr10(序列号2)、Wgs05(序列号5)/Wgs10(序列号6)、Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)的引物对，特别优选Wtr01(序列号1)/Wtr10(序列号2)、Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)的引物对。

在PCR中使用的引物，如果作为模板DNA(如以小麦举例的情况下，可以举出序列号13～15的序列)的该区域是同样的区域，那么引物的各个序列的5’-上游侧、3’-下游侧的碱基的位置在对应的同一个模板上，或者即使剪切几个碱基到十几个碱基也具有同样的机能，已知得到同样的结果(PCR产物)。

从而，优选的引物对，并不限于如上表3中的，实际上能够在PCR时达到与上述表3的引物对同样功能的，也包括在优选的引物对中。

关于上述引物，是各个引物中缺失、置换、添加和/或插入一个或几个碱基的引物，在成为模板DNA的该区域中杂交的引物，实质上与上述引物是同样的。具体说，比如，关于序列号1～12的各引物，是在与对应的模型DNA相对的5’-上游侧/下游侧和/或3’-上游/下游侧剪切1个或几个乃至十几个碱基的引物，在序列号1～12的序列中，包括连续的至少80％，更优选90％以上，特别优选95％以上序列的引物等，包括在本发明优选的引物中。

[10]本发明提供一种方法，使用上述引物进行PCR，在包括选自如下所述的小麦群中一种以上的小麦的被检测体中，在电泳图像中辨认出明确的扩增带，而在包括裸麦、小麦以外的动植物(源于食品原料)的被检物质中则不能辨认出。

小麦群：强力小麦、中力(准强力)小麦、弱力小麦、硬质小麦(通心粉小麦)和其他食用单粒系小麦等。

作为小麦，具体可以举出Western White(美国)、加拿大1#春小麦(加拿大)、澳大利亚标准小麦(澳大利亚)、农林一号(日本)、加拿大琥珀硬质小麦(加拿大)等。

[11]提供一种基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的PCR用的引物，和含有这些引物，用来测定在食品中有小麦和/或其浓度的试剂盒。

附图说明

图1是表示小麦检出引物的小麦特异性结果的电泳图象。

图1a是表示小麦的检出引物，Wtr01/10的小麦特异性结果的电泳图象。

图1b是表示小麦检出引物Wgs11/12特异性的电泳图象。

图1c是表示小麦检出引物Wtr05/06的小麦特异性的电泳图象。

图1d是表示小麦检出引物Wgs07/08的小麦特异性的电泳图象。

图1e是表示小麦检出引物Wgs05/10的小麦特异性的电泳图象。

图2是表示通过PCR进行检出的小麦检出系统检出限的电泳图象。

图2a是DNA水平的模拟混入试样的测定结果的电泳图象。、

图2b是表示粉末水平的模拟混入试样测定结果的电泳图象。

图3是表示由PCR从加工食品中进行小麦检出结果的电泳图象。

图3a、图3b是分别测定的加工食品每个泳道是不同的。

图4是表示由PCR进行的小麦检出系统结果的电泳图象。

图5是表示小麦检出引物Wss01/Wss02的小麦特异性结果的电泳图象。

具体实施方式

下面详细地说明本发明。

本发明是进行基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR来测定食品中有无小麦的方法。

作为检测体而被测定的食品，可以是原材料，也可以是在任何加工阶段的食品，还可以是加工以后的食品。本发明的方法用来检出在食品中有无比如微量小麦存在，检出量是在DNA水平的体积比或者相对于全部食品中特定物质的质量比，优选在0.1％以下，1000ppm以下，特别是500ppm以下，更特别在100ppm以下，在食品中含有小麦基因的情况下，也能够检出并非生产者有意放入，而是作为调味品或添加剂的一部分微量存在的小麦。基因与蛋白质等来自生物的其他物质相比，对于加热等食品加工是比较稳定的，能够检出经过加热、调理等加工的食品中微量的存在。

小麦的基因序列，在未知的情况下也可以由公知的基因检出法来检出，但当前能够使用很多的已知基因信息。比如，由国立遗传学研究所(DDBJ)等数据库能够得到小麦基因全序列的信息，由一部分序列信息就能够选择适合于PCR反应的正义引物和反义引物的对。

引物的设计，在考虑本发明的检测方法时要注意以下的事项。首先，(i)引物的气相色谱含量为40～60％；(ii)引物的熔点(下面记做Tm值)为55～70℃；(iii)两个引物对的Tm值相近；(iv)在两个引物的3’-末端之间不保有互补的序列；(v)引物本身不形成发夹式的高次结构；(vi)引物的全长取15～35mer；(vii)引物的3’-末端的气相色谱含量低；(viii)在引物内要回避同一核苷酸多数连续的序列；(ix)没有必要与引物扩增的模板DNA片侧一根链的序列完全一致，但在3’-末端的互补性要高；(x)在使用的DNA试样中，没有另外与引物同样的序列等。

本发明的引物，必须不仅能够用于原材料的小麦，而且还要能够用于在加工阶段的食品经过加热和调理等加工以后的食品。因此，使用的小麦模板DNA不是完整的，可以认为是切断成非常小的NDA碎片；(xi)由两个引物扩增的一部分基因优选是比较短的区域。特别是在各种小麦共同具有的一个基因的区域中，设计完全满足(i)～(xi)条件的引物是必要的。但是，在仅仅由A、C、G、T等4个核苷酸组成的DNA序列中，要制造出完全满足这些条件的引物是非常困难的，因此，引物的设计在进行PCR时是一个非常困难的问题。既便是假如能够设计出完全满足这样多数条件的引物，这只是在进行PCR的一个必要条件，实际上还不知道能否按照意图成功地进行PCR。

PCR法没有特别的限制，包括公知的各种改良的方法，但如果举一个例子的话，除了引物对和模板(被检验)DNA以外，取Tris-HCl、KCl、MgCl₂、各dNTP、TaqDNA聚合酶等混和类试剂作为PCR的反应液。PCR的第一循环由热变性、引物的缓冷、由DNA聚合酶合成DNA的反应3个步骤组成。各个步骤是分别不同的，由于在不同的情况下选取相同的反应温度和反应时间是必要的，要将DNA区域的碱基序列及其长度选取适当的范围使其扩增。为进行这样的操作的热循环器是市售的。由气相色谱含量和序列的长度得到的如下公式作为缓冷温度的指标。

Tm(℃)＝4×(G+C)+2×(A+T)

PCR的扩增产物在50～500bp，更优选在100～150bp的程度。这是由于如果在此范围内，即使是在加工食品中断裂的DNA也能够被检出。

在本发明中，上述基因和上述引物优选如下所示。

③上述基因是在序列表的序列号15中表示的小麦基因，上述引物是从第2401g至2886a的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选出的正义引物或反义引物。

如上所述，特别优选在①～③的正义引物或反义引物对中的以及在下面表3中表示的Wtr01(序列号1)/Wtr10(序列号2)、Wgs05(序列号5)/Wgs10(序列号6)、Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)的引物对，特别优选Wtr01(序列号1)/Wtr10(序列号2)、Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)的引物对。

引物是靶基因的互补链，靶基因的N-末端的序列部分和C-末端的序列部分在对中选择。对的长度可以是相同的，也可以是不同的。

如在下面的“特异性的确认”中所说明的，即使使用具有相同Tm值的引物对(Wtr05(序列号3)/Wtr06(序列号4)、Wgs07(序列号7)/Wgs08(序列号8))进行检出，也会有不适当的情况，因此引物对的选择是很重要的。

如果对TaqDNA聚合酶、MgCl₂的浓度或反应循环数等适当的PCR条件进行研究，或者使用网状PCR，都有可能更提高检出的感度。

PCR的反应物可以使用免疫反应进行鉴定，也可以用其他方式鉴定，但如果使用电泳，在必要的情况下，如果在使用阳性对照组或阴性对照组进行的电泳图象上确认出明确的带，就能够确认在检验体中有被检物质存在。

本发明的方法，在被检物质(食品)中含有的检出物是小麦的情况下是有效的。

在此，所谓“小麦”指的是强力小麦、中力(准强力)小麦、弱力小麦、硬质小麦(通心粉小麦)和其他食用单粒系小麦等。

作为小麦，具体可以举出Western White(西部白)(美国)、加拿大1#春小麦(加拿大)、澳大利亚标准小麦(澳大利亚)、农林一号(日本)、加拿大琥珀硬质小麦(加拿大)等。

本发明的检出方法，如果使用含有基于由小麦的一部分基因得到的信息而设计的引物作为试剂的试剂盒，就能够很容易地实施。试剂盒可含有在PCR中普遍使用的公知的试剂，也可以附属于电泳装置等另外的装置。具体说，可以举出dNTP、MgCl₂、Taq聚合酶、Tris-HCl、甘油、DMSO、阳性对照组用DNA、阴性对照组用DNA、蒸馏水等作为试剂。这些试剂在试剂盒中可以分别以独立包装的形式提供，也可以以两种以上混和的形式提供。试剂盒中各个试剂的浓度没有特别的限制，只要在能够实施本发明的PCR的范围内即可。在试剂盒中可以附加适当的PCR条件等信息，也可以只是引物试剂。

由于DNA是热稳定的，在加工食品中，即使有微量也能够检出，所以得到的结果用来标示食品的话，除了能够作为食品的过敏信息而加以利用外，通过检出在食品中有无小麦，就能够检出残留的极微量加工助剂或夹带物等食品添加物或者在制造线之间有没有生产者无意带来的相互污染。

下面具体说明本发明，但本发明并不限于此。

(1)构筑用来检出小麦的引物

在构筑用于检出源于小麦DNA的引物时，首先在国立遗传学研究所(DDBJ)的数据库中进行寻址，对小麦(Triticum aestivum)基因进行检索，从得到的有关小麦的基因信息中选择作为储存蛋白的Triticum aestivum triticin precursor，mRNA，partial cds.(Accession#S62630全长1567bp)(序列号13)；Triticum aestivum glutathoneS-transferase(GST)gene，complete cds(Accesion #AF109417，全长2947bp)(序列导14)；Triticum aestivum gene for starch synthase(GBSSI)(Wx-D1)，complete cds.(Accession#AB019624，全长2886bp)。

然后通过DDBJ的BLAST检索，确认在小麦以外的植物中没有所选择的小麦基因序列和类似的序列。

为了设计引物，本发明人使用了有关小麦的特定基因序列的软件“GENETYX MAC”，对成为候补引物的序列进行检索。GENETYXMAC，用来设定在上述设计引物的各个条件中难以用手算解析的各种条件，比如(i)气相色谱含量和(ii)Tm值的范围等。结果，能够鉴别出126对成为候补的序列。通过本发明人独自检索，选择出完全满足上述(i)～(xi)的引物设计条件，能够在本发明的检测方法中使用的12对引物序列。对于设计本发明检验方法的引物，鉴于是从DNA进行断片化的加工食品中进行检测的，认为通过PCR扩增的产物在100～150bp的程度。这样就制造出被选择的引物的12对寡核苷酸DNA引物((巴依噢楼极卡有限公司)バイオロジカ(株)合成的)。

(2)DNA抽出

对小麦和其他植物的种子，用1％的TritonX(和光纯药)洗涤表面，然后用蒸馏水漂洗，用很好干燥后的多球破碎机(安井机械)进行微粉碎。然后将1～1.5g试样，用Dneasy Plant Maxi kit(Qiagen)抽提DNA。对于小麦粉等粉末试样，也在与上述种子同样微粉碎以后，用Dneasy Plant Maxi kit(Qiagen)抽提DNA。而对于含水量高的加工食品，在冷冻干燥24h以后，使用1g试样，含水量低的就原封不动地使用1g，用Genomic Tip 20/G(Qiagen)抽出DNA。抽出的DNA通过吸光度测定求出浓度以后，用纯水稀释到10ng/μL，用其作为PCR模板(被检)DNA的试样液。

(3)通过PCR和电泳图像检出小麦

按照如下方式调节PCR的反应液。即在含有PCR缓冲液(PCRbuffer II，(阿来意的白噢西司体母司)アプライドバイオシステムス社)，200μmol/L、dNTP，1.5mmol/L、MgCl₂，0.5μmol/L、5’-和3’-引物，以及0.625单位TaqDNA聚合酶(AmpliTaq Gold，(阿来意的白噢西司体母司)アプライドバイオシステムス社)的液体中加入2.5μL的DNA试样液调节到10ng/μL，使总量为25μL。表4中没有记载模板DNA量的是在此情况下的浓度。但是，在抽出的DNA浓度在10ng/μL以下的情况下，或者在添加物比较多的加工食品等当中，得到的DNA的吸光度OD₂₆₀/OD₂₈₀的值在1.7以下和杂质比较多、DNA的纯度很低的情况下，要将抽出的DNA原液或10ng/μL的稀释液添加到2.5μL～17.8μL的PCR反应液中，根据其量的不同，用纯水调节到总量25μL。在表4中模板DNA上附加的就是此时的浓度。

在PCR扩增装置中使用了GeneAmp PCR System 9600((阿来意的白噢西司体母司)アプライドバイオシステムス社)，将反应条件设定如下。首先，在95℃下开始反应并保持10min，然后在95℃下反应30sec、在60℃下反应30sec、在72℃下反应30sec作为一个循环，进行40循环的PCR扩增。最后，在72℃下作为最终反应保持7min，然后保持在4℃下，得到的反应液作为PCR扩增反应液。

PCR扩增反应液，通过含有2％溴化エチジウム的琼脂糖凝胶(2％E-Gel，Invitrogen)供给电泳，在通过阳性对照组(由小麦种子抽出的DNA)和阴性对照组(没有模板DNA的空白反应液)有无扩增带来判断PCR的妥当性的同时，通过确认由各种引物得到的最合适尺寸的DNA扩增带来判断在试样中有没有混入小麦。

(4)实验1.检知小麦引物特异性的确认

以选拔特异性地检出小麦的引物为目的，使用由小麦和其他植物种子得到的DNA进行PCR。作为小麦试样，使用了5种小麦的牌号或品种[Western White(西部白)(美国)、加拿大1#春小麦(加拿大)、澳大利亚标准小麦(澳大利亚)、农林一号(日本)、加拿大琥珀硬质小麦(加拿大)]。使用了裸麦(加拿大)、大麦((米讷理目给)ミノリムギ)、燕麦(赛马用饲料)、稻米((口西皮卡理)コシヒカリ)、玉米(饲料用非GMO)、大豆((木拉有它卡)ムラユタカ)、小米(熊本)、油菜籽((卡农拉)Canola)等作为其他植物。

进行PCR后电泳，选拔出只在小麦试样中辨认出最适当尺寸的明确的扩增带，而在其他植物中没有辨认出扩增带的引物作为能够特异性地检出小麦的引物。

表示检出小麦用的引物，即Wtr01(序列号1)/Wtr10(序列号2)、Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)、Wtr05(序列号3)/Wtr06(序列号4)、Wgs07(序列号7)/Wgs08(序列号8)、Wgs05(序列号5)/Wgs10(序列号6)和Wss01(序列号11)/Wss02(序列号12)的特异性检出结果的电泳图象分别显示在图1a、图1b、图1c、图1d、图1e和图5中。

在图1和图5中，M：表示100bp的指针标记，NC：表示无模板DNA对照组(没有模板DNA的空白)水。图1的泳道序号(试样名)及其结果显示在下面的表1中。图5的泳道序号(试样名)及其结果显示在下面的表2中。

表1

图1泳道序号	种类	牌号或品种	由PCR检测的结果
			由PCR检测的结果					Wtr01/10	Wgs11/12	Wgs05/10	Wtr05/06	Wgs07/08
			12345	小麦小麦小麦小麦(硬)小麦	西部白(WesternWhite)加拿大1#春小麦澳大利亚标准小麦农林一号加拿大琥珀硬质小麦	+++++	+++++	Wtr01/10	Wgs11/12	Wgs05/10	Wtr05/06	Wgs07/08	+++++	+++++	+++++
6789101112131415，NC	裸麦大麦燕麦大米玉米大豆小米油菜籽荞麦无模板对照水	加拿大赛马用饲料口西皮卡理(コシヒカリ)非GMO木拉有它卡(ムラユタカ)熊本产卡农拉(Canola)	12345	小麦小麦小麦小麦(硬)小麦	西部白(WesternWhite)加拿大1#春小麦澳大利亚标准小麦农林一号加拿大琥珀硬质小麦	+++++	+++++	----------	----------	----------	+--++++++-	+---------	+++++	+++++	+++++

表2

图1泳道序号	种类	牌号或品种	由PCR检测的结果
			由PCR检测的结果	Wss01/02
			12345	Wss01/02	小麦小麦小麦小麦(硬)小麦	西部白(WesternWhite)加拿大1#春小麦澳大利亚标准小麦农林一号加拿大琥珀硬质小麦	+++++
6789101112131415，NC	裸麦大麦燕麦大米玉米大豆小米油菜籽荞麦无模板对照水	加拿大赛马用饲料口西皮卡理(コシヒカリ)非GMO木拉有它卡(ムラユタカ)熊本产卡农拉(Canola)	12345	----------	小麦小麦小麦小麦(硬)小麦	西部白(WesternWhite)加拿大1#春小麦澳大利亚标准小麦农林一号加拿大琥珀硬质小麦	+++++

实验1的结果，从10对候补的引物中选拔出3对引物组，即Wtr01(序列号1)/Wtr10(序列号2)、Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)和Wgs05(序列号5)/Wgs10(序列号6)作为用于特异性检出小麦的小麦检出引物。由于其PCR的扩增带是最为明显的，特别选拔出Wtr01(序列号1)/Wtr10(序列号2)和Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)等两对引物组作为优选的小麦检出引物。

而Wtr05(序列号3)/Wtr06(序列号4)的引物对辨认出与小麦以外的多种谷类的交叉反应，Wgs07(序列号7)/Wgs08(序列号8)的引物对辨认出与裸麦的加成反应，认为作为检出小麦用引物是不适当的。

而其他多个引物对，辨认出与在食品卫生法中规定作为特定的原材料的小麦范畴以外的裸麦具有加成反应。

在表3中显示出上述引物对。

第3表

名称	序列号	序列	Tm	气相色谱％	引物设定部位
					引物设定部位		开始	结束
					正义Wtr01反义Wtr10正义Wtr05反义Wtr06	1234	开始	结束	5′CAT CAC AAT CAA CTT ATG GTG G 3′5′TTT GGG AGT TGA GAC GGG TTA 3′5′GGT GGT TGG AAT GGT TTA GAG G 3′5′TTG GGA GTT GAG ACG GGT TAT C 3′	62626666	41475050	1171131111881310	1192129112091289
正义Wgs05反义Wgs10正义Wgs07反义Wgs08正义Wgs11反义Wgs12	5678910	5′CTG TGT ATT TTC TTG GTC CCG A 3′5′AGG CTA CAC AAA CAA TAC AGC C 3′5′TGC TCT CAC CCT ACA ACT CAG 3′5′GCT GAA GGT GCA TCT GGC TG 3′5′GCT GTG TAT TTT CTT GGT CCC G 3′5′GGC TAC ACA AAC AAT ACA GCC C 3′	646464646666	454552605050	正义Wtr01反义Wtr10正义Wtr05反义Wtr06	1234	28243924212574281438	30341824412555302417		62626666	41475050	1171131111881310	1192129112091289
正义Wgs05反义Wgs10正义Wgs07反义Wgs08正义Wgs11反义Wgs12	5678910		646464646666	454552605050	正义Wss01反义Wss02	1112	28243924212574281438	30341824412555302417	5′CCG ACG TGA AGA AGG TGG TG 3′5′GCA TCC TAA ACC AGA CCA GAG 3′	6464	6052	25322672	25512652

(5-1)实验2-1.确认由PCR检出小麦的检出限

在实验2-1中，以研究中使用Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)引物通过PCR检出小麦的检出限为目的，制造DNA水平和粉末水平的模拟混入小麦的试样，确认其使用DNA试样液进行PCR的小麦检出限。

将由小麦种子抽出的DNA稀释到10ng/μL，以在鲑鱼精子NDA中小麦DNA的混入率为0.1、10、50、100、1,000ppm和1vol％的体积比混和，制造DNA水平的模拟混入试样。而以在玉米粉中小麦粉的混入率为0.1、10、50、100、1,000ppm和1％的质量比混和，制造粉末水平模拟混入试样，将各个混入试样进行微粉碎后，进行DNA抽出。

在图2a和图2b中显示出检出结果的电泳图象。上部的数字表示小麦的混入率，M表示100bp的指针，NC表示无模板对照组(没有模板DNA的空白)水。在此，图2a以用鲑鱼精子DNA稀释小麦DNA的DNA水平模拟混入试样作为被检体，图2b是以用玉米粉稀释小麦粉的粉末水平模拟混入试样作为被检体。

在实验2-1中，通过使用Wgs11(序列号9)/Wgs12(序列号10)的PCR确认小麦检出限的结果，在DNA水平和粉末水平两种模拟混入试样中，检出限是小麦混入率50ppm(图2)。但是在进行多次实验当中，有几次检出限是100ppm，这意味着在此PCR反应系统中，稳定的检出限是100ppm。因为小麦粉中的蛋白质含量大约为10wt％(食品成份表修订第5版)，所以本PCR反应系统的检出限100ppm换算为小麦蛋白质的混入率为10ppm。

这就是说，在此处表示的由PCR检出小麦的检出法，达到了前所未有高的检出限，而且由于特异性高，可认为是微量成份的确实的测定(分析)方法。

(5-2)实验2-2.确认由PCR检出小麦的检出限

在实验2-2中，与上述实验2-1同样，以研究中使用Wss01(序列号11)/Wss02(序列号12)引物通过PCR检出小麦的检出限为目的，制造DNA水平和粉末水平的模拟混入小麦的试样，确认其使用DNA试样液进行PCR的小麦检出限。

在图4中显示出检出结果的电泳图象。上部的数字表示小麦的混入率，M表示100bp的指针，NC表示无模板对照组(没有模板DNA的空白)水。在此，图4以用鲑鱼精子DNA稀释小麦DNA的DNA水平模拟混入试样作为被检体。

(6)实验3.通过PCR检出加工食品中的小麦

使用Wgs11(序列号9)/12(序列号10)作为小麦检出引物，从含有作为原料小麦的加工食品中进行小麦的检出。使用的试样是热灭菌罐头、蛋糕粉、通心粉、谷物、7种点心(饼干、薄脆、(普雷求录)プレチエル、蒸食、蛋糕、小吃点心、巧克力)，将它们分别粉碎以后，用Dneasy Plant Maxi kit或Genomic Tip 20/G(Qiagen)抽出DNA供给PCR。对于热灭菌罐头，得到的DNA的p纯度低，每根PCR反应管添加50～120ng(由吸光度计算)的DNA。

下面的部4中显示出图3a和图3b的泳道序号(试样名)。

表4

泳道序号		试样名
泳道序号		试样名	图3a	1224NCPCM	热灭菌罐头(模型DNA量50ng/管)热灭菌罐头(模型DNA量120ng/管)蛋糕粉通心粉水小麦100bp指针
图3b	12345678PCNCM	谷物饼干薄脆普雷求录(プレチエル)蒸食蛋糕小吃点心巧克力小麦水100bp指针	图3a	1224NCPCM	热灭菌罐头(模型DNA量50ng/管)热灭菌罐头(模型DNA量120ng/管)蛋糕粉通心粉水小麦100bp指针

用Wgs11(序列号9)/12(序列号10)由加工食品进行PCR检出小麦的结果(实验3)，除了热灭菌罐头以外的试样中都检出了小麦(图3)。即使将热灭菌罐头的模型DNA添加量增加到50ng或120ng也未能检出小麦(图3a)。将热灭菌罐头在120℃下进行30min的加热灭菌，由于在此加热的工序中DNA断裂为片段，据推测用PCR也不能检出。

现在，在检查食品过敏的临床现场，实施诱发实验或针刺-划痕实验、PAST方法等，但是这些方法是以过敏患者的自身或者血液作为对象进行的检查，难以适用于食品的分析。另外，使用了电泳法(SDS-PAGE)或蛋白质印迹杂交法、免疫化学的方法(ELISA法)作为用于检出或定量过敏源本身的特定蛋白质分离检出法，但是这些对于检出已知的主要抗原是有效的，而对于未知抗原的检出，或者用于加热的工序有可能使蛋白质变性的某些加工食品中就未必适当。

产业上利用的可能性

由于DNA耐受加热的性能比蛋白质要高，即使在加工食品中经常会有残留。为此，在本发明中出示的，通过以DNA为指标的PCR法检出特定物质的方法，特别在加工食品中，作为食品中过敏源物质的间接分析手段，弥补了过去蛋白质检出法的不足，被认为是极其有用的。

序列表

<110>H.YAMAKAWA et.al.

<120>Method of wheal analysis

<130>PCT-179

<160>15

<210>SEQ ID No：1

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wtr01，disigned sense primer based on SEQ ID No：13 between 1171 and 11

92

<400>1

catcacaatc aacttatggt gg 22

<210>SEQ ID No：2

<211>21

<212>DNA

<400>3

ggtggttgga atggtttaga gg 22

<210>SEQ ID No：4

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wtr06，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：13 between 1310 and 1289

<400>4

ttgggagttg agacgggtta tc 22

<210>SEQ ID No：5

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wgs05，disigned sense primer based on SEQ ID No：14 between 282 and 303

<400>5

ctgtgtattt tcttggtccc ga 22

<210>SEQ ID No：6

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wgs10，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：14 between 439 an

d 418

<400>6

aggctacaca aacaatacag cc 22

<210>SEQ ID No：7

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wgs07，disigned sense primer based on SEQ ID No：14 between 2421 and 24

41

<400>7

tgctctcacc ctacaactca g 21

<210>SEQ ID No：8

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wgs08，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：14 between 2574 a

nd 2555

<400>8

gctgaaggtg catctggctg 20

<210>SEQ ID No：9

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wgs11，disigned sense primer based on SEQ ID No：14 between 281 and 302

<400>9

gctgtgtatt ttcttggtcc cg 22

<210>SEQ ID No：10

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wgs12，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：14 between 438 an

d 417

<400>10

ggctacacaa acaatacagc cc 22

<210>SEQ ID No：11

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wss01，disigned sense primer based on SEQ ID No：15 between 2532 and 25

51

<400>11

ccgacgtgaa gaaggtggtg 20

<210>SEQ ID No：12

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Wss02，disigned anti-sense primer based on SEQ ID No：15 between 2672 a

nd 2652

<400>12

gcatcctaaa ccagaccaga g 21

<210>SEQ ID No：13

<211>1567

<212>DNA

<213>Triticum aestivum

<220>

<221>CDS

<222>(60)..>(1567)

<223>triticin precursor，mRNA，partial cds.

<400>13

tccttttttt atgaaacaca atggaccttt gttgatatct ctctcctcct caaacagtta 60

tggcagctac tagtttcgct tcgctctctt tttacttctg cattttgctc ttgtgccata 120

gctccatggc acaactgttt ggcatgagct ttaacccatg gcaaagctct caccaagggg 180

gtttcagaga gtgtacattc aataggctac aagcatctac accacttcgt caagtgaggt 240

cacaagcagg cctgaccgag tattttgatg aggaaaatga acaatttcgt tgtactggtg 300

tatttgccat ccgtcgtgta atcgaacctc gtggttattt gttaccgcga taccacaaca 360

ctcatggatt agtctacatc atccaaggaa gtggtttcgc cggactgtct tttcctggat 420

gcccagagac attccagaaa cagtttcaaa aatatgggca atcacaatcc gtacagggtc 480

aaagccaaag ccaaaagttt aaagatgagc accaaaaagt tcaccgtttc agacaaggag 540

atgtcattgc attaccggca ggaattgtac attggttcta caatgacggt gatgcgccaa 600

ttgtggctat ctatgttttc gacgtaaaca actatgctaa tcaacttgag cctaggcata 660

aggaattttt gttcgctggc aactatagga gttcgcaact tcactctagt caaaacatat 720

tcagtggttt cgatgttcga ttgcttgctg aggccttggg tacaagtgga aaaatagcgc 780

aaaggcttca aagtcaaaat gatgacataa ttcatgtgaa tcataccctt aaatttctga 840

agcctgtttt tacacaacag cgagacgcag aatcccgcac actcaatatg aggaagggca 900

atctcaggca aaacactctc aggaagagca acctcaaatg gggcagtcac aggaagagca 960

acctcaaatg gggcagtcac agggagagca gcctcaaatg gggcagtctc aggcaaagca 1020

ctcagggaga gcaacctcaa atggggtggt ctcaggcaaa gcactctcag ggagaccagc 1080

ctgaagaagg gcagggaggg caatctcaac aagaacaatc tcaggcaggg ccatatccgg 1140

gatgtcaacc tcatgcaggg cgatctcatg catcacaatc aacttatggt ggttggaatg 1200

gtttagagga gaacttttgt gatcataagc taagtgtgaa catcgacgat cccagtcgtg 1260

ctgacatata caatccgcgt gccggtacga taacccgtct caactcccaa acgttcccca 1320

tccttaacat cgtgcaaatg agtgctacaa gagtacatct ctaccagaac gccattattt 1380

caccattatg gaacattaat gcccatagtg tgatgtacat gatccaagga catatctggg 1440

ttcaggttgt caatgaccat ggtcgaaatg tgttcaatga ccttattagt ccggggcaac 1500

tattaatcat accacagaac tatgttgttc tgaagaaggc acaacgtgat ggaagcaagt 1560

acattga 1567

<210>SEQ ID No：14

<211>2947

<212>DNA

<213>Triticum aestivum

<220>

<221>CDS

<222>join(17..98，603..647，1111..1196，1298..1369，1558..1611，1719..1794，2036.

.2097，2314..2373，2477..2581)

<223>glutathione S-transferase(GST)gene，complete cds.

<400>14

ggggtagcag tcagccatgg cgacggccaa gcccatcctg tacggcgcct ggatcagctc 60

ttgctctcac cgtgtccgga tcgctctcaa cctcaaaggt gagtagtact tgttgaggtt 120

ttggagcttc aatcgcttcg gttcggttct tcttgattat gttaaccccc agattagttt 180

atactcagct tctccatccc tatggtccta gacctagagt tgattatgtt tatgctaggt 240

tcataacact cttcagttgg gaacatttca gatgccacca gctgtgtatt ttcttggtcc 300

cgaacatgta tatgactatc ataattaaga atattgttgt tcttttagct tttgccttgt 360

ttcttttctt cagttcttct ctgttttcgt ttttggtttt ccctttgttt tagtttgggc 420

tgtattgttt gtgtagcctc ggcaccttgt tgtagtacaa aatgacgcac acttaggtgc 480

gtgttcaaga aaaatgatta atgcagcaaa ttagatgtat taagaatttc ggtgcacaat 540

taaacgatat aagttttagg gtcttgttca ggaaactaat taatttatta tatgtgatgt 600

aggtgtggac tatgagtata aggcagtcaa tcctcggaca gatccaggta ctcaaattta 660

ccagataaca tgcccgtata ctaattataa agccatctga tccccgtttt tttaaacaaa 720

acatctcatt tccggtttgc aattgatgag agctcaaaat ggcaactgtc agagttgatg 780

tgatgaatga aatatgatcg tgttcagttt acatgtaaaa tgtgatagat gttgcctcat 840

gatgcctact tatgccttat tactaggcta gtagccgcct aatttgcagg gaactgcgca 900

tagactattc cttccctgga cattagctta gtctgctata acaactttgt gcaccatctt 960

tgatgatgaa aatcttggct tgatcaatga tacaattgca atgcatattg tacccatcta 1020

ttcccaatgc tgaaatctac ggaatgttga aaaacgcata atttgtattc tgttttagga 1080

gaattcaccg ttatggattt cttattgcag actatgaaaa aataaacccg atcaaataca 1140

taccagcatt ggtagatggg gactttgttc tatctgattc tctcgctatc atgttggtga 1200

gtcacaattc ttgcttcagt ggattaagaa tgtgtttttt cagcattcct gtccctctgt 1260

tattagttaa caagtgtttt ttttttgcac tgagcagtat ctggaggata agtatcctca 1320

gcatcctctc gtacctaaag atatcaaaac gaaaggtctt gatcttcagg tatatgtccg 1380

gctcaagatt ttctttagtt attttttcta gaaaaatctc ttctatagtt ctatttctgt 1440

atcttgttaa tcacatgaac catagttgtt cagcactctt ttccgaacca tagttattca 1500

gcacacttat cggtaactcc atatggacta gctaattaca ttatttgctt gttgcagatt 1560

gcgaacatag tttgctcaag catccaacct ctccaaggct acggcgtaat tgtgggtttt 1620

tccgggagtt agctaccgct gacaagattt cgtcttctca atgatcatac gagtacgagt 1680

ttgatagcgt gtgtgtgcaa tatttgttta ctttgcaggg tttacatgag ggtaggttga 1740

gccccgatga gagccttgag gtggttcaac gttatattga caagggcttc agaggtgcga 1800

tatttcgcaa catactgtct gcacagttac atacctgcat atttgagaga aggggaattc 1860

agaatctctt ttttgtcttc tagactttcc ttttctcaga cattcttcca tcatatgcga 1920

cagagatatg ttcagttgtg ctgtcctgag ttctgacccc catcaaccat gcttattatt 1980

tgttcagttg accaaaacaa tcttactctt ggtctgctct tattatctgt tgcagcaatc 2040

gaaaagcttt tggatggatg tgacagcaaa tattgcgttg gagatgaagt ccatttggtt 2100

tgtgtttctg aacctacaca cttcttcact gatacatgtt tgatgctttg ccttgatcag 2160

tcaccttgaa atgaacttcc aattcaacat gatcaaattg attccggact cccaatttcc 2220

ttaattagca tgtcactatt attactaaat gtgctagtac ttactaatct tgagctatat 2280

attgtgatac atgtacattc gtggccttgg cagggagatg tgtgtctagc cccacagatc 2340

catgccgcca tcaatcgctt ccagattgat atggtactca ctttctctct gatattctct 2400

gtgcaaatta agatttctgc tgctctcacc ctacaactca gaaatccaat agcaacaagc 2460

tttccttttc ttacagacga agtacccaat attgtcgcga cttcacgacg catacatgaa 2520

aattccggca tttcaagctg cactgcccca gaatcagcca gatgcacctt cagcaaaata 2580

atcaagaaat caagccagtt acaactacat gcgtgtaatt tacgcaataa tgaggaatgt 2640

agtagtctgc aattgaagaa cctctcataa gtcataactt gttccctccg tccaggtgca 2700

tagggcatct aatgaaaatt tagtattcca aatatataag tcaccatgcg tggaagaagc 2760

ccctctacat gccatgccga gctgccggcc gggctccggc accatgtaaa ttaatattta 2820

tcgattcacc accagtgaga ttcagcagaa aaaaaaggtg atttgacgaa ttgacctgta 2880

tctataaccg attttctctc ttggatttgt atttactgct ggatattttt tgcgggggat 2940

ttattgg 2847

<210>SEQ ID No：15

<211>2886

<212>DNA

<213>Triticum aestivum

<220>

<221>CDS

<222>join(13..333，424..504，600..698，803..956，1109..1209，1351..1704，1790..19

69，2052..2243，2328..2414，2513..2641，2758..2874)

<223>starch synthase(GBSSI)，complete cds.

<400>15

cctgcgcgcg ccatggcggc tctggtcacg tcccagctcg ccacctccgg caccgtcctc 60

ggcatcaccg acaggttccg gcgtgcaggt ttccagggcg tgaggccccg gagcccggcg 120

gatgcggctc tcggcatgag gaccgtcgga gctagcgccg ccccaacgca aagccggaaa 180

gcgcaccgcg ggacccggcg gtgcctctcc atggtggtgc gcgccaccgg cagcggcggc 240

atgaacctcg tgttcgtcgg cgccgagatg gcgccctgga gcaagaccgg cggcctcggc 300

gacgtcctcg ggggcctccc cccagccatg gccgtaagct agacagcacc actgtcttct 360

cataatgttc atcttgcagt tgcagccatg cctgccgtta caacgggtgg tgtgtccgtg 420

caggccaacg gccaccgggt catggtcatc tccccgcgct acgaccagta caaggacgcc 480

tgggacacca gcgtcgtctc cgaggtactt gaaccctacc cgcaacttta acgatcaaaa 540

ttcgcatgct cctgcacatt tctgcaggat cctactgact gactaactgg atctcgcaga 600

tcaaggtcgt tgacaagtac gagagggtga ggtacttcca ctgctacaag cgcggggtgg 660

accgcgtgtt cgtcgaccac ccgtgcttcc tggagaaggt gaccgatcgt cgtcgtggac 720

cgatcaagct agctcttcgt cgtctcaacc ttgataggca tggtgattga tttcagttgt 780

ttctgctggt tgcaatttcc aggtccgggg caagaccaag gagaagatct acgggcccga 840

cgccggcacg gactacgagg acaaccagca gcgcttcagc cttctctgcc aggcggcgct 900

ggaagtgccg aggatcctga acctcgacaa taacccctac ttttctgggc cctacggtaa 960

gatcaagatc aagcacgcct actagttcaa gctagagtgt gtgtaatctg aactctgaag 1020

aacttgatat tttcttgaga gagctggatg atcaccattt ttttttgtat ctgggtgccg 1080

tcgtcgtccc ttgttgcgcg ccgcgcaggg gaggacgtgg tgttcgtgtg caatgactgg 1140

cacacgggcc ttctggcctg ctacctcaag agcaactacc agtccaatgg catctacagg 1200

gccgcaaagg ttttgcatct tcttctcaaa ctatatatcc tctctgcatt catatgcatg 1260

catatcttgc tcttcattct gaaacaggca tatcaatttt gcggttcatt ctggcctgaa 1320

ttttacattg caacttcatt tcatggccag gtggcattct gcatccacaa catctcgtac 1380

cagggccgct tctccttcga cgacttcgcg cagctcaacc tgcccgacag gttcaagtcg 1440

tccttcgact tcatcgacgg ctacgacaag ccggtggagg ggcgcaagat caactggatg 1500

aaggccggga tcctgcaggc cgacaaggtg ctgacggtga gcccctacta cgcggaggag 1560

ctcatctctg gcgaagccag gggctgcgag ctcgacaaca tcatgcgcct cactgggatc 1620

accggcatcg tcaacggcat ggatgttagc gagtgggacc ccaccaagga caagttcctc 1680

gccgtcaact acgacatcac caccgtgagc aaccacacaa agatttcttc ctcttcttcc 1740

ggtgatcgct ggttctgggt gggttctcac gaacgaggca aagtgacagg cgttggaggg 1800

gaaggcgctg aacaaggagg cgctgcaggc cgaggtgggg ctgccggtgg accggaaggt 1860

gcccctggtg gcgttcatcg gcaggctgga ggagcagaag ggccccgacg tgatgatcgc 1920

cgccatcccg gagatcctga aggaggagga cgtccagatc gttctcctgg tacatcatcg 1980

agcccgcaac ccgaccgcca ttgctgaaac ttcgatcaag cagacctaag gaatgatcga 2040

atgcattgca gggcaccggg aagaagaagt tcgagcggct actcaagagc attgaggaga 2100

aattcccgag caaggtgagg gccgtggtca ggttcaacgc gccgctggct caccagatga 2160

tggccggcgc cgacgtgctc gccgtcacca gccgcttcga gccctgcggc ctcatccagc 2220

tccaggggat gcgctacgga acggtaaact tttccttctt gccaagtcct tacttcctga 2280

gcaatcatga gccatgccca tgaccgaagt ttcttccaaa ttttcagccg tgcgcgtgcg 2340

cgtccaccgg cgggcttgtc gacacgatcg tggagggcaa gaccgggttc cacatgggcc 2400

ggctcagtgt cgatgtaagt tcatcaatct cttcaataaa ttcttcatct tgttcatcct 2460

gggagctcag gcagatcatc aaacgggttt cctttttcct cttggtggcc agtgcaacgt 2520

ggtggagccg gccgacgtga agaaggtggt gaccaccctg aagcgcgccg tcaaggtcgt 2580

cggcacgccg gcataccatg agatggtcaa gaactgcatg atacaggatc tctcctggaa 2640

ggtaagtcag tctctggtct ggtttaggat gcattttcca gaacaactaa gagttaagac 2700

tacaatggtg ctcttgttcg atgtatccat taatggtggc ttgcgcatat ggtgcagggg 2760

ccagccaaga actgggagga cgtgcttctg gaactgggtg tcgaggggag cgagccgggg 2820

gtcatcggcg aggagattgc gccgctcgcc atggagaacg tcgccgctcc ctgaagagag 2880

aaagaa 2886

Claims

1.一种测定食品中有无小麦的方法，其特征在于：用基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR的测定方法。

2.一种标示食品中有无微量成份的方法，其特征在于：用基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR反应，来测定在食品中有无小麦，从而对食品进行标示的方法。

3.一种识别在食品中含有对食品摄取者有害的特定物质过敏源的方法，其特征在于：使用基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR反应，来测定在食品中有无小麦的方法。

4.如权利要求1～3中任何一项的方法，其特征在于：其中上述食品是经过加工处理的食品。

5.如权利要求1～3中任何一项的方法，其特征在于：其中上述食品是食品原料。

6.如权利要求1～5中任何一项的方法，其特征在于：其中上述基因是序列表的序列号13表示的基因，上述引物是从第661a至1230a的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选择的正义引物和反义引物。

7.如权利要求1～5中任何一项的方法，其特征在于：其中上述基因是序列表的序列号14表示的基因，上述引物是从第181a至1540t的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选择的正义引物和反义引物。

8.如权利要求1～5中任何一项的方法，其中上述基因是序列表的序列号15表示的基因，上述引物是从第2401g至2886a的序列中选择的至少5～35个连续的DNA片段的信息中选择的正义引物和反义引物。

9.如权利要求1～8中任何一项的方法，其特征在于：其中使用上述引物进行PCR，在电泳图象中，在含有从下面的小麦群中选择的一种以上的小麦的被检物质中能够辨认出明确的扩增带，而在含有裸麦的被检体中，则不能辨认出，所述的小麦群为强力小麦、中力小麦、弱力小麦、硬质小麦和其它食用单粒系小麦。

10.一种测定食品中有无小麦和/或测量其浓度的PCR用引物，其特征在于：用基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的引物。

11.一种用来测定在食品中有无小麦和/或测量其浓度用的试剂盒，其特征在于：它含有用基于由小麦的一部分基因得到的信息设计的PCR用引物。