CN114369677A - 一种检测小麦转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

一种检测小麦转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测小麦转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用。所述的检测小麦常用的转基因元件及转基因品系的引物对组合包括以扩增9种常用小麦转基因元件、3种转基因品系Ta_B73‑6‑1、Ta_B72‑8‑1、Ta_B102‑1‑2特异性序列以及2种小麦内参基因Ta_Waxy‑D10和Ta_GAG56D的引物组。本发明还涉及检测小麦转基因元件和品系的试剂盒与检测方法。本发明技术方案操作简单，检测效率高，检验对象全面，具有较高的检测特异性、准确度和灵敏性等特点；可用于转基因小麦及其制品的大规模检测，具有较好的应用前景。

Description

一种检测小麦转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、 检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测小麦转基因成分和转基因品 系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
小麦(Triticun aestivum L.)属于禾本科小麦属。在世界范围内是种植 面积最大，总产量最高的粮食作物，是重要的植物蛋白来源之一的粮食作物。 恶劣的气候以及病虫害都会严重制约小麦的生产。为了创制新品种，导入外源 基因改良小麦性状。自1992年第一株转基因的小麦诞生以来，小麦的遗传改 良得到了巨大的发展。然而转基因技术对粮食安全问题意义重大。因此，开发 高效、便捷的转基因食品检测技术显得至关重要。
转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测 方法。目前基于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、最准确的转基因检测技 术，其主要包括普通定性PCR、巢式PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、荧光 定量PCR多重PCR等方法。相对于普通定性PCR方法，巢式PCR高了检测的灵 敏度，容易造成假阳性。LAMP操作简单、特异性强，然而引物设计较为复杂， 容易造成DNA污染，影响后续的实验。荧光定量PCR方法具有重复性好、灵 敏度高、核酸交叉污染少的优点，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。普通 的多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但一般不超过6重，否 则引物之间干扰较大，影响检测效果。基因芯片和数字PCR技术也是常用的转 基因产品检测技术，它们均具有高通量、灵敏度高、特异性强等优点，且可平 行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因作物；然而其成本高 昂，需要专门的仪器设备，要求操作人员具有较高的专业素质，这些因素限制 了该技术在检测中的广泛应用。
因此研发一种高效、灵敏和通量高的转基因产品检测方法，成为亟待解决 的关键问题。
发明内容
本发提供了一种面检测小麦转基因元件和品系的引物对组合、试剂盒及检 测方法，以解决基于定量PCR技术通量低、基因芯片和数字PCR技术的转基因 检测成本高的技术问题。
本发提供的一种全面检测小麦转基因元件和品系的技术方案，以9种检测 常用的小麦转基因元件Ubi、pRice_actin、Hsp、tNOS、aad、GUS、bar、PAT、 cp4epsps和3个转基因品系Ta_B73-6-1、Ta_B72-8-1、Ta_B102-1-2的特异性 核苷酸序列即本发明所筛选的靶标分子，以及内参基因Ta_Waxy-D10和 Ta_GAG56D作为检测目标，设计多重PCR扩增引物对的核苷酸序列；开发了14 对引物，所述引物互相间不影响，可以通过多重PCR进行高效的扩增。所述多 重PCR引物组合可以用于开发小麦转基因元件和品系检测试剂盒。
具体的技术方案为，第一方面，本申请提供了一种检测小麦转基因元件和 品系引物对组合，即包括编号为TaGMO1、TaGMO2、TaGMO3、TaGMO4、TaGMO5、 TaGMO6、TaGMO7、TaGMO8、TaGMO9、TaGMO10、TaGMO11、TaGMO12的12对引 物，每对引物由正向引物和反向引物组成，具体的引物对组合核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示。
还提供了包括用于扩增小麦内参基因Ta_Waxy-D10和Ta_GAG56D的编号为TaGMO13、TaGMO14两对引物对组合，每对引物由正向引物和反向引物组成，其 核苷酸序列如SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.28所示。
上述这些引物分别用于扩增下列小麦转基因元件Ubi、pRice_actin、Hsp、 tNOS、aad、GUS、bar、PAT、cp4epsps和小麦转基因品系Ta_B73-6-1、Ta_B72-8-1、 Ta_B102-1-2的特异性核苷酸序列即本发明所筛选的靶标分子。上述引物与其 扩增的上述小麦转基因元件和品系的特异性核苷酸序列、相应引物对的编号及 引物对的核苷酸序列如表1所示。
表1本发明所筛选的靶标分子及其引物序列
Figure BDA0003454417800000021
Figure BDA0003454417800000031
在引物设计时，为了增强所述引物的适用性和灵敏性，所设引物长度介于 在18-30bp之间，引物间互不干扰，且所有引物可以组合成引物池进行多重PCR 扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增，经使用证实，灵 敏度高和适用性强。
另一方面，本申请提供了一种检测小麦转基因元件和品系的试剂盒，其特 征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测小麦转基因元件和品系的引物 对组合和权利要求2所述的用于扩增小麦内参基因Ta_Waxy-D10、Ta_GAG56D 的引物对组合。
优选地，所述检测试剂盒还包括多重PCR预混液。
本发明还提供了权利要求1或2所述的引物对组合、权利要求3或4的述 的检测试剂盒在检测转基因小麦及相关产品中的应用。
本发明还提供了一种检测小麦转基因元件和品系的方法，其特征在于，所 述方法包括以下步骤：
1)以小麦转基因元件和品系以及小麦内参基因进行参考，得到多重PCR 引物；
2)得到待测小麦的DNA；以所述DNA为模板，将所述多重PCR引物加入反 应体系中，进行扩增反应，得到扩增产物；将所述扩增产物进行高通量测序， 得到高通量文库；将所述高通量文库中的基因序列进行分析，以实现检测小麦 转基因元件和品系。
优选地，所述的方法的扩增反应的环境/程序包括：94℃预变性15分钟； 第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃ 变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
再优选地，所述的方法的反应体系包括：总体系30μl，引物对：2μl、2×buffer：15ul，多重扩增酶：0.5μl；剩余的用水补充；所述高通量文库 的浓度大于2ng/ul为合格。
为了实现对样品中小麦转基因元件和品系的检测目的，在选用了上述小麦 转基因元件和品系时，加入对小麦内参基因的检测引物，以实现转基因成分含 量的定量检测。
在引物设计时，为了增强所述引物的适用性和灵敏性，所设引物长度介于 在18-30bp之间，引物间互不干扰，且所有引物可以组合成引物池进行多重PCR 扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增，经使用证实，灵 敏度高和适用性强。
具体的，多重PCR预混液的组分包括所述扩增转基因小麦元件和品系以及 内参基因的各引物组时，每条引物按照1:1的比例进行预混，根据不同的实验 目的进行各引物的混合，具体实施实例中，每条引物浓度是2nM。
在一些实施方式中，所述引物对数范围为：1-14对之间根据具体检测样品 的情况适当调整。后期可根据新收集的转基因元件进行定期增加，我们的引物 组合尝试过3000对，扩增效果依然很好。所述多重PCR引物的对数范围为： 1-14对，相比常规的8对特异性的多重PCR，具有检测通量和灵敏度高的优势。
具体地，高通量测序可以是二代测序，也可以是三代测序，得到的高通量 文库可以从多个维度分析小麦样品中的转基因成分，包括但不限于我们实施案 例中的小麦转基因元件和品系。
在一些实施例中，使用上述方法，可一次性对多样本的所有靶标转基因元 件和品系进行检测，具有高通量、高灵敏、准确和快速等优势，可应用于转基 因小麦元件和品系及其制品的转基因成分定性与定量检测。
本发明所提供的试剂盒能灵敏的检测样品中含量为0.05％的小麦转基因 成分。
本发明的重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间检测结果重 现率r＝100％，准确率a＝100％。
本发明的所述试剂盒在复杂模板中检测多种小麦转基因元件和品系，具有 高度特异性。
本发明的有益效果是：
1)操作简单，经过一次样品前处理，单管PCR扩增，文库构建与测序就 可以同步检测多样品或一个样品中多种转基因成分，具有平行分析和多重判断 的特点，大大提升了转基因产品的检测效率；
2)检验对象全，包含了小麦当前常见和转基因元件和品系，并且可以很 方便的加入新的检测序列，避免单个靶标扩增失败，提高的了检测的特异性、 准确度和灵敏性；
3)试剂盒融合二代测序平台进行扩增产物的测序，提高了系统的检测通 量和可重复性，并且检测结果可以直接数字化，适用于转基因小麦及其制品的 大规模检测。
因此，本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的小麦转基因 品系检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果重复性好，多样 本多靶标序列检测成本低廉，对种子站、农科院所及海关进出口岸的转基因制 品检测具有重要应用。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的技术方案进行详细说明。
附图说明
图1；转基因品系Ta_B73-6-1的结构示意图
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细 的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同 的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例 的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语 与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书 中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设 备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1靶标转基因元件和品系的筛选以及多重PCR扩增引物的设计
S1、靶标转基因元件和品系的筛选
本申请实施例中，靶标转基因元件和品系以及内参基因主要收集于常用的 转基因数据库、国家标准、行业标准或者现有的文献中，尽量收集完整，以保 证我们检测的特异性和准确性。其中筛选的转基因元件和品系以及内参基因的 名称如表1所示。
S2、多重PCR扩增引物的设计
本申请实施例中，利用Primer3Plus设计多重PCR引物，所设引物长度介于在 18-30bp之间，引物间互不干扰，这个主要评估引物之间的二聚体，或者引物 内部的发夹结构，以及非靶标序列的非特异扩增，评估后的所有引物可以组合 成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常 扩增。具体的引物序列包括：SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.28所示。
实施例2检测小麦样品是否含有转基因元件和品系
1.实验材料：转基因品系Ta_B73-6-1，示意图如图1所示。实验材料转 入了Ubi、GUS、bar、tNOS，其转基因含量为10％，用其作为我们的研究材料。
2.DNA模板的准备：植物基因组的提取采用的是CTAB或天根生化科技(北 京)有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP350)。本实施例是用天根 DNA提取试剂盒提取的待测样品DNA，每个样品做了三个生物重复。
3.PCR扩增、文库构建与测序
利用14对多重PCR扩增引物扩增样本的基因组DNA；将每个样本的扩增产 物连接测序接头和特异样本DNA条形码后混合，成为高通量测序文库；利用高 通量测序平台检测高通量测序文库并对高通量测序数据进行质量控制。本步骤 需要根据检测的准确性、灵敏性等要求，研究调整扩增循环数、测序深度等关 键参数；本步骤也可连接三代测序，以实现二代测序与三代测序间优势互补。
4.结果的判定
1)据测试样品中的转基因元件和品系的信号指数S和空白对照中转基因 元件和品系的信号指数P判定污染是否可接受，其中：
空白对照噪音指数P＝nc/Nc，其中nc和Nc分别代表空白对照中，转基因 元件和品系的测序片段的数量和总测序片段数量。
测试样品的信号指数S＝nt/Nt，其中，和Nt分别代表测试样品中，转基因 元件和品系的测序片段的数量和总测序片段数量。
信噪比＝S/P
2)转基因结果的判断
利用待测样本DNA条形码和同源比对，将每个测序片断分配到每个目标物 种的每个靶标位置上，所述的靶标包括转基因元件和内参基因。根据每个靶标 位置上的测序序列数目，以实现转基因品系的绝对定量。当比对内参基因和转 基因元件上的测序序列超过指定阈值时，定性判定样品中含有转基因品系；当 样品中含有转基因品系时，根据转基因元件与内参基因的测序序列的比值，定 量判定样品中的外源基因的含量。本实施例中转基因含量的计算公式如(A) 所示：
Figure BDA0003454417800000071
CtestDNA ——测试样品的转基因含量
tTi ——测试样品中的每种转基因元件和品系的测序序列数 目
tRi ——测试样品中检出的每种内参基因片段的测序序列目
m ——测试样品中检出的内参基因片段的总数
n ——标准品中检出的转基因元件和品系片段的总数
根据本实例，我们共检测了2个样品，1个转基因品系和一个阴性样品， 每个样品做了三个生物重复，结果如表2和图1所示：常见的转基因元件也在 阴性样品会检测出几个序列，本实例中我们要求测序reads数目小于5条的序 列过滤掉。本发明规定当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可 接受的。当样品中转基因品系的信噪比大于10，判定样本中检出转基因品系的 核酸。具体地，阳性样品中的各对应的转基因品系在三个重复实验中国均被 有效检出，而且含量接近于其含量；从该表说明我们发明的这个小麦转基因试 剂盒可以用来检测转基因产品。
表2本实施例2待测样品的转基因检测结果
Figure BDA0003454417800000072
Figure BDA0003454417800000081
实施例3准确性、特异性与灵敏度评估
转基因小麦品系Ta_B73-6-1和Ta_B102-1-2制备不同质量百分比的转基 因样本来评估所开发技术的准确度和灵敏度。具体地，各样本的转基因含量采 用质量百分进行稀释，具体地把转基因小麦品系Ta_B73-6-1和Ta_B102-1-2 用阴性小麦分别稀释成10％，1％，0.1％，0.05％，0.025％和0.01％的样本，分别 对应于转基因品系Ta_B73-6-1的稀释样本编号(A1，A2，A3，A4，A5，A6) 和转基因品系Ta_B102-1-2的稀释样本编号(B1，B2，B3，B4，B5，B6)。定 性检测的准确度指真阳性与真阴性所占的比例，定量准确度是指多次测定的平 均值与真值相符合的程度，以误差来表示。特异性又称真阴性率，多次检测检 出的真阴性占所有阴性的百分比。灵敏度指在95％置信度下，能够检出的转基 因品系的最低含量，即检测下限。按照实施例2的方法进行检测，每个样本三 个生物重复，结果如表3所示：所述试剂盒能在转基因含量为0.05％的样本中 稳定地检出各转基因元件，而在阴性的样本中检出均未检出转基因品系，说明 特异性强，所述试剂盒能够明显区分转基因含量为0.05％的样本和阴性样本， 具有技术稳定性和转基因含量为0.05％的检测灵敏度。
表3本发明方法的准确性与灵敏度评估
Figure BDA0003454417800000082
Figure BDA0003454417800000091
注：+代表检出，－代表未检出，A1和B1代表转基因含量为10％，A2和B2代表转基因含 量为1％，A3和B3代表转基因含量为0.1％，A4和B4代表转基因含量为0.05％，A5和B5 代表转基因含量为0.025％，A6和B6代表转基因含量为0.01％。
实施例4我们发明的方法在实际检测样品中的应用
为了验证本发明的准确性及批量样品转基因检测中的作用，实验室选取了 某公司316份未知基因型的小麦叶片样本进行检测，采用实施例2的检测方法， 检测结果并与该公司的保存类型进行比较，并统计结果的一致性。分析结果表 明在316份测试样品中，只有1份样品的结果不一致，检测结果的一致性为 99.6％，因此较好的证明了我们所发明方法的准确性。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅 仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者 暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包 括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一 系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明 确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要 素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排 除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他 实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要 符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种检测小麦转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用
<130> 20220102
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 20
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<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
tcagcatcag tggctacagc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
atcgatgatc caggtgtcgc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
ctatgcggca tcagagcaga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
catgtgacat ccagcaacgc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
acagaccagg agagacgtga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
aacttacctt cgcctcctgc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
gcaacaacta gcacaaggcc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggggagatc tggttgtgtg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
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caacggcatg gatgttagcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctttgtgtgg ttgctcacgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
tcctcagcag ctccaatgtg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
ttgagctggt tgttggggtt 20

Claims (8)

1.一种检测小麦转基因元件及转基因品系的引物对组合，其特征在于，所述引物对组合包括编号为TaGMO1、TaGMO2、TaGMO3、TaGMO4、TaGMO5、TaGMO6、TaGMO7、TaGMO8、TaGMO9、TaGMO10、TaGMO11、TaGMO12的12对引物，每对引物由正向引物和反向引物组成，具体的引物对组合核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示。
2.根据权利要求1所述的引物对组合，其特征在于，所述引物对组合还包括用于扩增小麦内参基因Ta_Waxy-D10的编号为TaGMO13和内参基因Ta_GAG56D的编号为TaGMO14两对引物对组合，每对引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25-SEQ IDNO.28所示。
3.一种检测小麦转基因元件和转基因品系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测小麦转基因元件和品系的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增小麦内参基因Ta_Waxy-D10、Ta_GAG56D的引物对组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括多重PCR预混液。
5.权利要求1或2所述的引物对组合、权利要求3或4的述的检测试剂盒在检测转基因小麦及相关产品中的应用。
6.一种检测小麦转基因元件和品系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)以小麦转基因元件和品系的特征核苷酸序列及小麦内参基因为参考，得到多重PCR引物；
2)得到待测小麦样品的DNA；以所述DNA为模板，将所述多重PCR引物加入反应体系中，进行扩增反应，得到扩增产物；将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库；将所述高通量文库中的基因序列进行分析，以实现检测小麦常见转基因元件和品系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的环境/程序包括：94℃预变性5分钟；第一步扩增反应，94℃变性15s，62℃～56℃退火30s，12个Touch Down cycle，(每个循环退火及延伸的温度降低0.5℃)；第二步扩增反应，94℃变性15s，57℃退火30S，22个cycle。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，反应体系包括：总体系40μl，引物预混液2.5μl、2×buffer：20μl，多重PCR扩增酶：0.5μl；其余的用水补充；剩余的用水补充；所述高通量文库的浓度大于2ng/ul为合格。
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