CN114507749A - 一种准确检测玉米转基因成分的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种准确检测玉米转基因成分的引物组、试剂盒及方法；所述引物组包括36对检测引物对，36对检测引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.72所示；2对扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示；所述试剂盒包括引物组；所述方法包括：分别得到核苷酸序列；根据核苷酸序列，分别设计出引物组；提取待检样品的基因组DNA，得到待测玉米转基因成分的基因组DNA；以基因组DNA为模板，以引物组为扩增体系进行扩增反应，得到扩增产物；将扩增产物进行高通量测序，得到高通量测序数据；将高通量进行基因分析，确定待测玉米样品中是否含有转基因成分；通过设计出的引物组，能够实现在同一PCR反应中实现多个靶标分子的同时检测。

Description

一种准确检测玉米转基因成分的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种准确检测玉米转基因成分的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
玉米是当今世界重要的粮食作物之一，是我国三大粮食作物之首。玉米产业健康发展对保障国家粮食安全和农产品有效供给具有重要意义。玉米同时又是饲料工业和畜牧业的重要原料之一，其作为饲料在粮食总需求量中所占的比重逐渐增加。从播种到收获，玉米多会受到多种虫害的影响，严重影响其产量和品质。通过基因工程途径改良作物重要性状可以有效解决这些问题，但是转基因玉米被直接或间接地制成食品以及国际社会对转基因产品安全性问题的日益关注，农产品中的转基因成分检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目并逐渐得到加强。因此，开发高效、便捷的转基因食品检测技术显得至关重要。
目前应用较广泛是的普通多重PCR，但是由于普通多重PCR的限制，若超过8重检测引物，将会导致扩增引物之间的交叉影响，从而影响检测的准确性，并且也将影响检测的特异性，增加检测工作的难度。
因此如何基于普通多重PCR进行多种玉米转基因成分的准确检测，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种准确检测玉米转基因成分的引物组、试剂盒及方法，以解决现有技术中普通多重PCR检测方法在检测多种玉米转基因成分时，检测通量低的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种准确检测玉米转基因成分的引物组，所述引物组包括36对检测引物对和2对扩增引物对，36对所述检测引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.72所示；
2对所述扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示。
可选的，所述检测引物对用于检测玉米中常见的36种转基因元件，36种所述转基因元件包括p35S、t35S、pNOS、tNOS、tPINII、pRBCS4、tE9、Bar、PAT、HPT、GUS、Cry1Ab-Ac、Cry1A.105、Cry9C、Vip3Aa、Cry2Ab、G10evo-EPSPS、amy797E、AAD-1、eCry3.1Ab、tORF25、Cry34Ab1、Cry35Ab1、pRice_actin、pFMV35S、crylF、CTP2、tahsp17、zmhsp、Adh1、GOX、Cry2Ab、2mepsps、cry3Bb1、cry3A和pmi。
可选的，所述扩增引物对用于对玉米内参基因进行扩增，所述玉米内参基因包括Zein。
可选的，36对所述检测引物对和2对所述扩增引物对中各引物的长度都为18bp～30bp。
第二方面，本申请提供了一种准确检测玉米转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组。
可选的，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
第三方面，本申请提供了一种准确检测玉米转基因成分的试剂盒的应用，所述应用包括：将第二方面所述的试剂盒用于检测转基因玉米及玉米衍生产品中。
第四方面，本申请提供了一种准确检测玉米转基因成分的方法，所述方法包括：
分别得到玉米转基因成分和玉米内参基因的核苷酸序列；
根据所述玉米转基因成分和所述玉米内参基因的核苷酸序列，分别设计出第一方面所述的引物组；
提取待测样品的基因组DNA，得到待测玉米样品的基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，以所述引物组为扩增体系进行扩增反应，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量测序数据；
将所述高通量进行基因分析，确定待测玉米样品是否含有转基因成分。
可选的，所述将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量测序数据，具体包括：
将所述扩增产物进行高通量测序文库的构建，得到高通量测序文库；
得到所述高通量文库的实际浓度；
根据高通量测序文库的所述实际浓度和高通量测序文库说明书上标准浓度的大小，判断所述高通量测序文库是否合格；
若所述实际浓度＞所述标准浓度的最低浓度，则将所述高通量测序文库进行测序出。
可选的，所述高通量文库的所述标准浓度≥2ng/uL。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种准确检测玉米转基因成分的引物组，根据常见的玉米转基因成分和内参基因的分析，设计出36对检测引物对和2对扩增引物对，利用内参基因扩增引物对将内参基因扩增，再通过36对靶标转基因成分检测引物对将待测样品的靶标转基因成分进行扩增，再根据内参基因与转基因靶标的核苷酸序列，对高通量测序出来的序列进行靶标转基因序列及内参基因序列的区分，进而实现通过多重PCR对样品中转基因成分进行准确的定性与定量检测。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的方法的详细流程示意图；
图3为本申请实施例提供的转基因成分3272的结构示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本发明的创造性思维为：现有的转基因产品检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法；目前基于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，其主要包括普通定性PCR、巢式PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、荧光定量PCR和多重PCR等方法，但是各有缺点：
(1)相对于普通定性PCR方法，巢式PCR高了检测的灵敏度，容易造成假阳性；
(2)LAMP操作简单、特异性强，然而引物设计较为复杂，容易造成DNA污染，影响后续的实验；
(3)荧光定量PCR方法具有重复性好、灵敏度高、核酸交叉污染少的优点，但其成本高，并且需要特殊检测仪器；
(4)普通的多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但一般不超过六重，否则引物之间干扰较大，影响检测效果；
(5)基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术，它们均具有高通量、灵敏度高、特异性强等优点，且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因作物，然而其成本高昂，需要专门的仪器设备，要求操作人员具有较高的专业素质，因此限制了该技术在检测中的广泛应用。
由于普通多重PCR的限制，若超过8重检测引物，将会导致扩增引物之间的交叉影响，例如扩增产物的结构和浓度之间若存在重叠，在检测阶段，重叠的扩增引物将导致检测结果呈现错乱，或者表现出假阳性，从而影响检测的准确性，并且也将影响检测的特异性，增加检测工作的难度，本发明开发的方法一次检测多个靶标分子，每个靶标分子检测多个位点，每个位点被测序大于1000次，因此本发明不但大大提高了检测的效率和准确性，同时兼顾了检测成本与通量的大小、具有较好的应用前景。
在本申请一个实施例中，提供一种准确检测玉米转基因成分的引物组，所述引物组包括36对检测引物对和2对扩增引物对，36对所述检测引物对的核苷酸序列分别如SEQID NO.1～SEQ ID NO.72所示；
2对所述扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示。
在一些可选的实施方式中，所述检测引物对用于检测36种玉米转基因成分的转基因元件，36种所述转基因元件包括p35S、t35S、pNOS、tNOS、tPINII、pRBCS4、tE9、Bar、PAT、HPT、GUS、Cry1Ab-Ac、Cry1A.105、Cry9C、Vip3Aa、Cry2Ab、G10evo-EPSPS、amy797E、AAD-1、eCry3.1Ab、tORF25、Cry34Ab1、Cry35Ab1、pRice_actin、pFMV35S、crylF、CTP2、tahsp17、zmhsp、Adh1、GOX、Cry2Ab、2mepsps、cry3Bb1、cry3A和pmi。
在一些可选的实施方式中，所述扩增引物对用于对玉米内参基因进行扩增，所述玉米内参基因包括Zein。
本申请实施例中，通过对玉米内参基因Zein设计，从而得到特异性识别的扩增引物，进而利用设计出的扩增引物，在相互之间不冲突且不影响的基础上，能够保证所用检测引物能够对靶标分子进行有效扩增，多靶标分子的扩增不仅能够加快检测的速度，并且能被有效区分，因此间接的提高多重PCR扩增的检测效率与准确性。
在一些可选的实施方式中，36对所述检测引物对和2对所述扩增引物对中各引物的长度都为18bp～30bp。
2对在本申请一个实施例中，提供一种准确检测玉米转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。
在一些可选的实施方式中，所述试剂盒还包括多重PCR预混液；
具体的，所述多重PCR预混液的组分包括所述引物组每条引物按照1∶1的比例进行预混，根据不同的实验目的进行各引物的混合，实际操作时，每条引物浓度是2nM。
本申请实施例中，通过限定试剂盒中含有多重PCR预混液，从而能保证检测引物可以组成引物池进行多重PCR检测并且相互之间不影响，实现普通的多重PCR的准确检测。
在本申请一个实施例中，提供一种准确检测玉米转基因成分的试剂盒的应用，所述应用包括：将所述试剂盒用于检测转基因玉米及玉米衍生产品中。
在本申请一个实施例中，如图1所示，提供一种检测玉米转基因成分的方法，所述方法包括：
S1.分别得到玉米转基因成分和玉米内参基因的核苷酸序列；
S2.根据所述玉米转基因成分和所述玉米内参基因的核苷酸序列，分别设计出所述引物组；
S3.提取待测样品的基因组DNA，得到待测玉米样品的基因组DNA；
S4.以所述基因组DNA为模板，以所述引物组为扩增体系进行扩增反应，得到扩增产物；
S5.将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量测序数据；
S6.将所述高通量进行基因分析，确定待测玉米样品是否含有转基因成分；
其中，所述高通量测序可以是二代测序，也可以是三代测序；
所述设计可以是Primer3Plus软件设计。
本申请实施例中，通过上述方法，以引物组为扩增体系，再以待测玉米的DNA片段为模板，可以有效的构建出关于待测玉米样品的高通量文库，从而能够保证后续通过高通量文库进行基因序列分析，进而能够准确得到转基因成分，提高多重PCR的检测准确性。
在一些可选的实施方式中，如图2所示，所述将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库，具体包括：
S501.将所述扩增产物进行高通量测序文库的构建，得到高通量测序文库；
S502.得到所述高通量文库的实际浓度；
S503.根据高通量测序文库的所述实际浓度和高通量测序文库说明书上标准浓度的大小，判断所述高通量测序文库是否合格；
若所述实际浓度＞所述标准浓度的最低浓度，则将所述高通量测序文库进行测序；
若所述实际浓度＜所述标准浓度的最低浓度，则重新进行引物设计。
本申请实施例中，通过以高通量文库的标准浓度为参考，对构建出的关于待测玉米的高通量文库的实际浓度进行判断，从而能筛选出合格的高通量文库，进而进一步提高检测的准确性。
在一些可选的实施方式中，所述高通量文库的所述标准浓度≥2ng/uL。
本申请实施例中，通过限定高通量文库的标准浓度≥2ng/uL，可以有效的保证高通量文库具有足够的浓度进行分析，从而提高多重PCR检测的准确性；当浓度的取值小于该范围的端点值，将导致高通量文库的浓度不足，进而影响PCR检测的准确性。
在一些可选的实施方式中，所述扩增体系包括：先94℃预变性15min，后进行第一扩增反应和第二扩增反应，其中，所述第一扩增反应包括10个降落循环，所述降落循环的目标温度为0.8℃。
本申请实施例中，限定具体的扩增体系，通过采用两次扩增反应，并且在第一次扩增反应中设置降落循环，能得到充足的扩增引物，从而能构建出合适的高通量文库，进而能搞检测的准确性，并且间接的保证检测引物之间的检测过程不相互影响。
在一些可选的实施方式中，所述第一扩增反应包括：94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个降落循环；
所述第二扩增反应包括：94℃变性20s，57℃退火并延伸60s。
本申请实施例中，限定第一扩增反应和第二扩增反应的具体程序，从而能保证得到充足的扩增引物，进而构建出合适的高通量文库。
在一些可选的实施方式中，所述扩增反应的总体系包括：总体系：30μL，引物组：2μL、2×buffer：15μL，多重扩增酶：0.5μL；剩余的用水补充。
实施例1
一种准确检测玉米转基因成分的引物组，引物组包括36对检测引物对和2对扩增引物对，36对检测引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.72所示；
2对扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示。
检测引物对用于检测玉米中常见的36种转基因元件，36种转基因元件包括p35S、t35S、pNOS、tNOS、tPINII、pRBCS4、tE9、Bar、PAT、HPT、GUS、Cry1Ab-Ac、Cry1A.105、Cry9C、Vip3Aa、Cry2Ab、G10evo-EPSPS、amy797E、AAD-1、eCry3.1Ab、tORF25、Cry34Ab1、Cry35Ab1、pRice_actin、pFMV35S、cry1F、CTP2、tahsp17、zmhsp、Adh1、GOX、Cry2Ab、2mepsps、cry3Bb1、cry3A和pmi，其中，检测引物对和玉米转基因成分的对应关系如表1所示。
表1检测引物对和玉米转基因成分的对应关系情况表
Figure BDA0003525120310000071
Figure BDA0003525120310000081
Figure BDA0003525120310000091
扩增引物对用于对玉米内参基因进行扩增，玉米内参基因包括Zein。
36对检测引物对和2对扩增引物对中各引物的长度都为18bp～30bp。
引物组还包括2对扩增引物对，2对扩增引物对包括ZmGMO30、ZmGMO31、ZmGMO32和ZmGMO33，2对扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59～SEQ ID NO.66所示，用于扩增玉米内参基因Zein，其中，扩增内参基因和扩增引物对的对应关系如表2所示。
表2扩增引物对和玉米转基因成分的对应关系情况表
Figure BDA0003525120310000092
一种准确检测玉米转基因成分的试剂盒，试剂盒包括引物组。
试剂盒还包括多重PCR预混液。
一种所检测玉米转基因成分的试剂盒的应用，包括：将试剂盒用于检测转基因玉米及玉米衍生产品中。
如图2所示，一种检测玉米转基因成分的方法，包括：
S1.分别得到玉米转基因成分和玉米内参基因的核苷酸序列；
S2.根据玉米转基因成分和玉米内参基因的核苷酸序列，分别设计出引物组；
S3.提取待测样品的基因组DNA，得到待测玉米样品的基因组DNA；
S4.以基因组DNA为模板，以引物组为扩增体系，将DNA片段进行扩增反应，得到扩增产物；
S501.将所述扩增产物进行高通量测序文库的构建，得到高通量测序文库；
S502.得到高通量测序文库的实际浓度；
S503.根据高通量测序文库的所述实际浓度和高通量测序文库说明书上标准浓度的大小，判断所述高通量测序文库是否合格；
若实际浓度＞标准浓度的最低浓度，则将所述高通量测序文库进行测序；
若实际浓度＜标准浓度的最低浓度，则重新进行引物设计；
S6.将高通量进行基因分析，确定待测玉米样品是否含有转基因成分。
高通量文库的标准浓度≥2ng/uL。
扩增体系包括：先94℃预变性15min，后进行第一扩增反应和第二扩增反应，其中，第一扩增反应包括10个降落循环，降落循环的目标温度为0.8℃。
第一扩增反应包括：94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个降落循环；
第二扩增反应包括：94℃变性20s，57℃退火并延伸60s。
扩增反应的总体系包括：总体系：30μL，引物组：2μL、2×buffer：15μL，多重扩增酶：0.5μL；剩余的用水补充。
实施例2
将实施例2和实施例1相对比，实施例2和实施例1的区别在于：
玉米转基因成分的筛选和多重PCR扩增的检测引物对的设计过程如下：
一、靶标转基因成分的筛选：
靶标转基因成分即主要是指玉米中的常用转基因元件，以及所有的内参基因，需要从转基因数据库、国家标准、行业标准或者现有文献中进行全面收集，以保证检测的特异性和准确性，其筛选出的靶标基因如表2和表1所示。
二、多重PCR扩增的检测引物对的设计：
根据筛选出的靶标基因，利用Primer3Plus设计多重PCR引物，具体序列如表2中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.72所示和如表1中SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示。
实施例3
将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：
三、检测过程的具体步骤包括：
1.实验材料：选取玉米转基因品系3272为研究材料，其转入了t35S、amy797E、pmi和tNOS四种转基因元件，其转基因含量为10％。
2.DNA模板的准备：采用CTAB或天根生化科技(北京)有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP350)，其中，为了检测的准确性，采用DP350进行待测样品的检测，每个样品做三个生物重复。
3.PCR扩增、高通量文库的构建和高通量测序：
(1)采用36对检测引物对和2对扩增对进行DNA模板的扩增，得到DNA样本的扩增产物；
(2)将每个DNA样本的扩增产物连接测序接头和特异样本DNA条形码后进行混合，构建出高通量文库；
(2)采用高通量测序平台检测高通量文库，并对得到的高通量测序数据进行质量控制，质量控制的标准根据检测的准确性和灵敏性要求，同时质量控制后的结果可以作为PCR扩增的循环数和高通量测序深度的关键数据进行调整的依据。
4.结果判断：
1)据测试样品中的转基因成分的信号指数S和空白对照中转基因成分的信号指数P判定污染是否可接受，其中，空白对照的噪音指数：
P＝nc/Nc，
式中，nc为空白对照中转基因成分的测序片段的数量；
Nc为空白对照中转基因成分的总测序片段数量
测试样品的信号指数：
S＝nt/Nt，
式中，nt为测试样品中转基因成分的测序片段的数量；
Nt为测试样品中转基因成分总测序片段数量；
因此根据信噪比＝测试样品的信号指数/空白对照的噪音指数，可以计算出对应的信噪比，再根据信噪比判定污染是否可以接受。
2)转基因结果的判断
利用待测样本DNA条形码和同源比对，将每个测序片断分配到每个目标物种的每个靶标位置上，而靶标包括玉米转基因成分和内参基因。
再根据每个靶标位置上的测序序列数目，以实现转基因成分的绝对定量，具体步骤为：
当比对内参基因和转基因成分上的测序序列超过指定阈值时，定性判定样品中含有转基因成分；
当样品中含有转基因成分时，根据转基因成分与内参基因的测序序列的比值，定量判定样品中的外源基因的含量。
本实施例中转基因含量的计算公式如(A)所示：
Figure BDA0003525120310000121
式中，CtestDNA为测试样品的转基因含量；
tTi为测试样品中的每种转基因成分的测序序列数目；
tRi为测试样品中检出的每种内参基因片段的测序序列数目；
m为测试样品中检出的内参基因片段的总数；
n为标准品中检出的转基因成分片段的总数。
实施例4
将实施例4和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于：
在实施例3提供的检测步骤的基础上，本申请实际检测6个样品，包括5个转基因品系以及一个阴性样品，每个样品包括三个生物重复，具体结果如表3所示。
表3实际检测结果情况表
Figure BDA0003525120310000122
Figure BDA0003525120310000131
在测序阶段，由于要将测序reads数目小于5条的序列过滤掉，并且当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可接受的，因此当实际检测中转基因成分的信噪比大于10，能够判定样本检测出的转基因成分就是准确的样品中实际含有的转基因成分，而不是被污染的，由表2可知，在三个重复实验中选取的5个样品的靶标分子均能被有效的检测出，并且测定的含量接近实际含量，因此本申请提供的玉米转基因试剂盒都可以用来检测转基因产品。
实施例5
将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于：
四、检测方法的准确性、特异性和灵敏度的评估：
将玉米转基因品系3272和T25的转基因标准品制备成不同质量百分比的转基因样本，从而评估检测方法的准确度和灵敏度，具体情况如下：
将各样本的转基因样本按照质量百分比进行稀释：将3272和T25用阴性玉米样本分别稀释成10％，1％，0.1％，0.05％，0.025％和0.01％的样本，分别对应于转基因品系3272的稀释样本编号A1、A2、A3、A4、A5和A6和转基因品系T25的稀释样本编号B1、B2、B3、B4、B5和B6。
定性检测的准确度指真阳性与真阴性所占的比例，定量准确度是指多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。
特异性又称真阴性率，多次检测检出的真阴性占所有阴性的百分比。
灵敏度指在95％置信度下，能够检出的转基因成分的最低含量，即检测下限。
按照实施例3的方法进行检测，每个样本三个生物重复，结果如表4所示。
表4准确性、特异性和灵敏度的评估情况表
Figure BDA0003525120310000141
Figure BDA0003525120310000151
注：+代表检出，-代表未检出，A1和B1代表转基因含量为10％，A2和B2代表转基因含量为1％，A3和B3代表转基因含量为0.1％，A4和B4代表转基因含量为0.05％，A5和B5代表转基因含量为0.025％，A6和B6代表转基因含量为0.01％。
由表4中可得出：本申请提供的试剂盒能在转基因含量为0.05％的样本中稳定地检出各转基因元件，而在阴性的样本中未检出任何转基因成分，说明其特异性强，也说明本申请提供的试剂盒能够明显区分转基因含量为0.05％的样本和阴性样本，因此本申请的试剂盒具有技术稳定性和转基因含量为0.05％的检测灵敏度。
实施例6
将实施例6和实施例5相对比，实施例6和实施例5的区别在于：
五、批量转基因待测样品的检测准确性：
选取某公司231份未知基因型的玉米叶片样品进行检测，按照实施例3的方法进行检测，并把检测结果与该公司的保存类型进行比较，及统计结果的一致性，分析结果表面在294份测试样品中，只有3份样品的结果不一致，检测结果的一致性高达98.9％。
本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
(1)本申请实施例提供的引物组，根据常见的玉米转基因成分和内参基因的分析，设计出36对检测引物对和2对扩增引物对，利用扩增引物对和检测引物对的结合，能保证扩增产物之间的清晰分辨，进而保证通过多重PCR对转基因成分的准确检测。
(2)本申请实施例提供的试剂盒，融合了二代测序平台进行扩增产物的测序，提高了系统的检测通量和可重复性，并且检测结果可以直接数字化，适用于转基因玉米及其制品的大规模检测。
(3)本申请实施例提供的方法，操作简单，经过一次样品前处理，单管PCR扩增，文库构建与测序就可以同步检测多样品或一个样品中多种转基因成分，具有平行分析和多重判断的特点，大大提升了转基因产品的检测效率。
(4)本申请实施例提供的方法，检测对象全面，包含了玉米当前常见的转基因元件序列和转基因成分，并且可以很方便的加入新的检测序列，避免单个靶标分子出现扩增失败，提高的了检测的特异性、准确度和灵敏性。
(5)本申请实施例提供的方法，克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的玉米转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果重复性好，多样本多靶标序列检测成本低廉，对种子站、农科院所及海关进出口岸的转基因制品检测具有重要应用。
(6)本申请实施例提供的方法，相比常规的8对特异性的多重PCR，具有检测通量和灵敏度高的优势，同时在重现性实验中，每个样品不同文库间、不同建库批次间检测结果重现率r＝100％，准确率a＝100％。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种检测玉米转基因品系的引物组、试剂盒及检测方法
<160> 76
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcgtcaaca tggtggagca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagccacct tccttttcca 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagagctct agatctgttc tgcac 25
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actgacagaa ccgcaacgat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggaacgtca gtggagcatt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agggtttcgc tcatgtgttg a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctcggtacc cctggatttt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtgggcatc aaagttgtgt g 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agacacgtga cattcattta gga 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccactccacc atcacacaat 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgttgagac ccttatcggc t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttcattgcg cacacaccag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agaggccacg atttgacaca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagtcgaccg tgtacgtctc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgaagtcca gctgccagaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tacagcagct gatatggccg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtggtgttt gtggctctgt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acagcggtca ttgactggag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atttgtgtac gcccgacagt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
catgaagatg cggacttgcg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgccatgtt catctgccca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgttagcgtg tttgggcaaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtggtcggt gtagtttcca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttcagcaact cgtccgtgag 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcatagcgga ttcttgcacg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acagctacat caaccccagc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtacacgttg aagctgtcgc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcctgaagaa ccagcagctg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggtactcgat ctgcaggctc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tggacatcaa cgtgaccctg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atcagtacag cggcgagatg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tacaccactc gctacctcct 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaagtggtg ccagaggtga 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agtacctgga gctggaggag 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gcccttctgg tagtactcgc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
actggagtgg acttgaggga 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tctgtgtgcc agtcatcacc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tatgacggcc gacaacaaca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgctcacata gtcctccacg 20
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgactgtcat ttgtatcaaa tcgtgt 26
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgtccccaag aatgaggtgc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cgacgtgaac aacaagaccg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tggccgtcgt atttgttgga 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tacctctccc tcgacgactc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cgttgttcac gttccacacc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aatagctttc ccccgttgca 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggcttgctat ggatcgtgga 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcggaatgct gtgtgaacca 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggccattgca gcagaacaaa 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aggaggcttt ggcaatcctc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agagagtcaa tggtcccgga 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tggtgtgcag aacccatctc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aatccccacg acgacgaaat 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tggttgatgt gtgtgcgagt 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tcatcgccga atctgttggc 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ctgcctttgt tactgccacg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tgctacaaag gacggcaagt 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
attggtgtcg acctgaaccc 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gccagtgcaa ccaaacttcc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gcgaatttgt atctgcgcgt 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atccacgttc ggtatcgagc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
atccacgctg tgcatgagaa 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gtgcgtgtct ggttgttcac 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tgttggctgt ggtggaaagt 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tccaccagca gcagtaacag 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
actccaacat gggcttctcg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggacggggat gaactcgatc 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ccctggtgaa ggcctacaag 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gttctcggtg cactggatga 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ccgccggaga tatcgtttca 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gaatggagag tggctgtgct 20
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gatgtcacca ttgatgatgc cg 22
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tgaacatgaa tggtaactgc tgttg 25
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
atgacgattc cacccatgtt ctta 24
<210> 76
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
aacttgtttt attgttaata ataatgagtc aca 33

Claims (10)

1.一种准确检测玉米转基因成分的引物组，其特征在于，所述引物组包括36对检测引物对和2对扩增引物对，36对所述检测引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.72所示；2对所述扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.76所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述检测引物对用于检测玉米中36种转基因元件，36种所述转基因元件包括p35S、t35S、pNOS、tNOS、tPINII、pRBCS4、tE9、Bar、PAT、HPT、GUS、CrylAb-Ac、Cry1A.105、Cry9C、Vip3Aa、Cry2Ab、G10evo-EPSPS、amy797E、AAD-1、eCry3.1Ab、tORF25、Cry34Ab1、Cry35Ab1、pRice_actin、pFMV35S、cry1F、CTP2、tahsp17、zmhsp、Adh1、GOX、Cry2Ab、2mepsps、cry3Bb1、cry3A和pmi。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述扩增引物对用于对玉米内参基因进行扩增，所述玉米内参基因包括Zein。
4.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，36对所述检测引物对和2对所述扩增引物对中各引物的长度都为18bp～30bp。
5.一种准确检测玉米转基因成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
7.一种准确检测玉米转基因成分的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用包括：将如权利要求5或权利要求6所述的试剂盒用于检测转基因玉米及玉米衍生产品中。
8.一种准确检测玉米转基因成分的方法，其特征在于，所述方法包括：
分别得到玉米转基因成分和玉米内参基因的核苷酸序列；
根据所述玉米转基因成分和所述玉米内参基因的核苷酸序列，分别设计出如权利要求1-4任一项所述的引物组；
提取待测样品的基因组DNA，得到待测玉米样品的基因组DNA；
以所述基因组DNA片段为模板，以所述引物组为扩增体系进行扩增反应，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量测序数据；
将所述高通量进行基因分析，确定待测玉米样品是否含有转基因成分。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库，具体包括：
将所述扩增产物进行高通量测序文库的构建，得到高通量测序文库；
得到所述高通量测序文库的实际浓度；
根据高通量测序文库的所述实际浓度和高通量测序文库说明书上标准浓度的大小，判断所述高通量测序文库是否合格；
若所述实际浓度＞所述标准浓度的最低浓度，则将所述高通量测序文库进行测序。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述高通量文库的所述标准浓度≥2ng/uL。
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