CN112813189A - 利用四重实时荧光pcr快速鉴定转基因玉米品系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，包括以下步骤：选择MIR162、Mon89034、Bt11三个转基因玉米品系和玉米内源基因zSSIIb作为内参照基因；设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针；待测玉米样品中基因组DNA的提取；四重实时荧光PCR扩增体系设置；判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分。本发明可实现一个反应管中同时检测MIR162、Bt11、Mon89034三个玉米品系的特异性基因序列和一个玉米内源基因，降低试剂成本，缩短检测时间。

Description

利用四重实时荧光PCR快速鉴定转基因玉米品系的方法
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，具体是一种适用于三种转基因玉米品系的多重实时荧光PCR快速鉴定方法，属于食品安全转基因检测领域。
背景技术
随着转基因作物商业化的不断推进，转基因作物的种植面积也逐渐增加；转基因玉米在转基因作物中占有非常重要的地位，种植面积逐年稳步上升。20世纪80年代以来，玉米转基因技术迅猛发展。截至2018年，全球转基因玉米的种植面积近5900万hm2，占转基因作物总面积的30.33％，占世界玉米总面积的30.72％左右，当前已经培育出了抗旱、抗虫、抗除草剂、抗病等多种转基因玉米。目前国外主要种植的转基因玉米品系有Monsanto孟山都公司的Mon802品系，Mon809品系，Mon810品系，Mon832品系，Mon863品系，Mon87460品系，Mon8770品系，Mon88017品系，Mon89034品系、Pioneer先锋公司的3751IR品系，DP4114品系、Syngenta先正达公司的EXP1910IT品系，SYN-EV176-9品系，SYN-BTO11-1品系，SYN-IR604-5品系，SYN-IR162-4品系，MIR162品系等。截至2019年8月，我国批准进口的转基因玉米转化体共计20个。其中，2004年我国政府首次批准发放转基因玉米进口用作加工原料安全证书，包括先正达公司开发的Bt11和Bt176、杜邦公司和陶氏益农公司合作开发的TC1507以及拜耳作物科学公司开发的T25。
目前，还没有粮食作物获得过国务院农业行政主管部门颁发的种子生产许可证，均不能进行商业性种植。批准进口的转基因玉米主要是用作饲料或加工原料。随着我国农业转基因技术研究和农产品贸易的快速发展，研究、试验、生产、加工、经营和进口环节的农业转基因生物种类不断增多，需强化研究试验源头、田间种植和进口加工环节监管，加强标识管理和科普宣传，切实履行《种子法》、《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物标签的标识》，保障农业转基因生物研究与应用健康发展，保障公众知情权和选择权。
转基因在给人类带来更加丰富的食品供应和巨大的经济效益同时，也可能存在潜在的安全问题，如破坏生态环境，引起抗生素耐性，造成基因漂移，引发食物过敏，隐含对人及动物的潜在毒性等问题。国外已批准种植和正在研发的转基因品系越来越多，但只有部分品系被批准用于加工原料，我国还未颁发转基因玉米种子生产许可证，所有转基因玉米品系均不可在我国进行商业化种植，因此有必要对转基因玉米品系进行筛查，控制未批准的转基因玉米品系在市场上的流通及商业化种植。
转基因检测方法种类繁多，包括主要的基因水平检测方法(如PCR检测、基因芯片、环介导等温扩增技术)和蛋白质水平检测方法(如蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法)。基因芯片技术对于转基因食用农产品的检测，从实验成本考虑，价格过于昂贵，不适宜普遍推广应用；环介导等温扩增技术成本低廉，适合大规模筛查，但其对靶序列存在一定的限制，假阳性问题较为严重，易受到实验室气溶胶的污染容易产生非特异性扩增；蛋白质免疫印迹法实验过程复杂，耗时较长(通常在5小时以上)，检测通量小，使用试剂复杂；酶联免疫吸附法灵敏度较PCR方法低，当外源基因表达的蛋白质含量极低时，难以检测出来；胶体金免疫层析法虽操作简便、耗时短，但检测灵敏度偏低，经过加工的转基因食品中靶蛋白质结构改变，不能被抗体识别。为提高转基因检测的准确性和时效性，急需开发建立能同时多基因检测且能避免常规PCR法缺陷的新方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用四重实时荧光PCR检测转基因玉米品系的方法，本发明属于多重实时荧光PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，实现对待测玉米样品进行品系快速、高效和精确鉴定。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定所用的引物和探针：
内源基因的扩增引物和探针分别为：
zSSIIb-F：CCTCCCAATCCTTTGACATCTG
zSSIIb-R：TCGTTCCGTTTTGCATTGC
zSSIIb-P：VIC-CCGAAGCAAAGTCA-MGB；
转基因玉米品系MIR162的扩增引物和探针分别为：
MIR162-F：TCACTTTTACTCGTCTCAATCAGACA
MIR162-R：CAACCGACCTGACAAGTGACA
MIR162-P：FAM-TCACCGTCCACCAACGAACGCC-BHQ1；
转基因玉米品系Mon89034的扩增引物和探针分别为：
Mon89034-F：GCCTCGTGCGGAGCTTT
Mon89034-R:CGTTGATGTTTGGGTTGTTGTC
Mon89034-P：NED-AGGTAGAAGTGATCAACC-MGB；
转基因玉米品系Bt11的扩增引物和探针分别为：
Bt11-F：GATACAACAACTCGCGGTTGAC
Bt11-R：CGAGGGAACACGGGAGTCT
Bt11-P：Cy5-TGCGCCTTCTTGGCGGCTTATC-BHQ3。
本发明还同时提供了一种利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，包括以下步骤：
①、检测靶标基因的筛选与确定：
选择MIR162、Mon89034、Bt11三个转基因玉米品系(为转基因食品安全监管关注的品系)和玉米内源基因zSSIIb作为内参照基因；
②、设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针；
③、待测玉米样品中基因组DNA的提取；
④、四重实时荧光PCR扩增体系设置；
⑤、判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法的改进：
所述步骤②中：探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法的进一步改进：
所述步骤②的四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针如上文所述。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法的进一步改进：
步骤④中，20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为0.1～0.8μM，10μL TransStart Probe qPCR SuperMix(2×，Trans，货号AQ711)，0.4μLPassiveRefereence Dye(50×，Trans，货号AQ711)，基因组DNA 1pg～100ng；ddH2O补足至20μL。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法的进一步改进：
20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：
Figure BDA0002973339190000031
Figure BDA0002973339190000041
作为本发明的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法的进一步改进：
四重实时荧光PCR扩增条件为：94℃预变性30s；94℃变性5sec，58℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的58℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法的进一步改进：
所述步骤⑤判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分：根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品品系或是否含有某品系转化体成分；依次进行以下步骤：
5.1)、获取内源基因zSSIIb Ct值；
当内源基因zSSIIb Ct值小于35，表明样品基因组DNA提取有效(即，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常，则进入下述步骤5.2)；反之，则判定检测无效；
5.2)、针对品系特异性基因：
一、当MIR162、Mon89034和Bt11三个靶标序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品的判定结果为非MIR162、Mon89034和Bt11转基因玉米品系或不含有这三种品系的转化体成分；
当MIR162特异性基因序列Ct值＜35时，且Mon89034和Bt11特异性基因序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米MIR162品系或含有该品系的转化体成分；
当Mon89034特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR162和Bt11特异性基因序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米Mon89034品系或含有该品系的转化体成分；
当Bt11特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR162和Mon89034特异性基因序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米Bt11品系或含有该品系的转化体成分；
当出现两个及以上玉米品系的靶标序列Ct值均<35时，则判定待测样品为多个玉米品系的混合样品或含有多个品系的转化体成分；
二、当35≤MIR162、Mon89034和Bt11转基因玉米品系靶标序列Ct值≤40时，对待测玉米样品重新进行检测，判定方式按照上述一。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法的进一步改进：
所述步骤③的待测玉米样品中基因组DNA的提取为：
玉米(即指未加工过的玉米果实、种子、叶片、玉米粉等)采用CTAB法、SDS法、高盐低pH法或试剂盒法进行提取；试剂盒可采用北京全式金(EE111)、天根(DP305)、百迈(NEP023)、北京鼎国(NEP003)、Qiagen(69104)、Koning(F1612)等6种植物DNA提取试剂盒；
玉米制品(即玉米深加工产品，包括玉米酥、爆米花等)采用天根深加工制品提取试剂盒(DP326)、德国Congen SureFood PREP Plant X(S1006)试剂盒进行提取。
在本发明中：
四重实时荧光PCR鉴定的靶标是通过国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站筛选出的全球较为常见的三种转基因玉米品系的特异性基因序列和一个玉米内源性基因序列，其中三种转基因玉米品系分别为我国玉米进口贸易中重点监测的转基因玉米MIR162、Mon89034和Bt11，一个内源基因为编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2(zSSIIb)基因。
探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，主要有6-FAM、TET、HEX、VIC、NED、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red探针的3’淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。
实时荧光PCR反应适用于多通道的实时荧光PCR反应仪，主要包括ABI实时荧光PCR系统，BioRad实时荧光PCR系统，SmartCyclerII系统等。
根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品是否为转基因玉米MIR162、Mon89034和Bt11，主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值，每个反应的Ct值是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。首先需确保所有的玉米样品中内源基因zSSIIb的Ct值必须小于35，表明样品基因组DNA提取有效，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常；否则检测无效(必须重做检测)；在此基础上查看MIR162、Mon89034和Bt11三个靶标序列的扩增情况。
设置DNA提取质控，确保核算样本制备环节有效，对下游试验无干扰；还设置三个复孔的重复和非模板空白对照(设置三个重复确保数据可靠准确，设置非模板对照避免出现假阴性结果)。实验结果应用QuantStudioTM Design&Analysis software进行分析处理。
DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测。
本发明属于四重实时荧光PCR转基因玉米品系快速鉴定技术，本发明针对玉米内源基因zSSIIb和三个国家重点监测的转基因玉米品系设计4组扩增引物和4条不同标记的荧光探针。
本发明在设计过程中，通过国际农业生物技术应用服务组织转基因数据库http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp信息，收集得到目前已公开报道的商品化生产的转基因玉米品系以及我国批准进口用于生产原料的转基因玉米品系信息。比较分析发现，MIR162、Mon89034和Bt11为我国批准进口仅能用于生产原料，不能商业化种植的转基因玉米品系，是国家重点监控的转基因流通产品。故本发明以转基因玉米MIR162、Mon89034和Bt11特异性靶标序列以及玉米内源基因zSSIIb为目标基因，使用引物探针设计软件Primer Express 3.0(Primer Express Software for Real-time PCR,Version 3.0)设计相应的引物和探针，并委托invitrogen公司合成。
需要着重说明的是：在本发明中，由于本发明是多重荧光定量，首先探针标记的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑四对引物和四条探针之间都不能相互干扰。
在本发明中，所述的探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，第一条检测通道检测MIR62,其荧光染料的发射波长约为522nM；第二条检测通道检测Mon89034，其荧光染料的发射波长约为553nM；第三条检测通道检测zSSIIb，其荧光染料的发射波长约为582nM；第四条检测通道检测Bt11，其荧光染料的发射波长约为666nM。以ABIQuantStudio Q5实时荧光PCR仪(Applied biosystem)为例，第一到第四条检检测通过分别以FAM、VIC、NED和Cy5标记。探针的3’淬灭集团可以选择ECLIPSE或BHQ，VIC和NED荧光探针以MGB作为3’淬灭集团。
本发明通过靶标基因筛选，转基因阳性样品采集，核酸样本制备，多重引物和荧光探针组合筛选，反应体系优化以及样品适用性检测等过程开发建立了四重重荧光定量PCR检测技术。
综上所述，本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，同时检测转基因玉米MIR162、Mon89034和Bt11特异性靶标序列和玉米内源基因zSSIIb，建立了一整套合适的引物和探针、核酸提取及多重扩增和分析方法，对转基因玉米品(包括深加工食品)进行多重快速鉴定。与现有技术相比，本发明的优点在于：可以实现一管多检的实际需要，即，该技术的使用可实现一个反应管中同时检测MIR162、Bt11、Mon89034三个玉米品系的特异性基因序列和一个玉米内源基因，降低试剂成本，缩短检测时间；多重扩增体系中设置了内源基因的检测，可以判断核酸提取和扩增反应的有效性，避免出现假阴性反应结果；寻找并验证了适用于深加工样品核酸提取的试剂盒。本发明为玉米及其深加工产品转基因品系的快速鉴定提供了有效方法，为转基因玉米品系的快速鉴定和筛查提供了参考，为有效规范转基因产品的市场流通和促进进出口贸易提供技术保障。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系转基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合样本进行鉴定的扩增曲线图谱。
图2为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对“MIR162”转基因玉米进行鉴定的扩增曲线图谱。
图3使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对“Mon89034”转基因玉米进行鉴定的扩增曲线图谱。
图4为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对“Bt11”转基因玉米进行鉴定的扩增曲线图谱。
图5为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对Mon863/NK603/T25/Bt176转基因玉米进行鉴定的扩增曲线图谱。
图6为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对“ZY1711”非转基因玉米进行鉴定的扩增曲线图谱。
图7为使用四重实时荧光PCR转基因玉米快速鉴定体系对转基因大豆、棉花、番茄进行鉴定的扩增曲线图谱。
图8为使用10倍梯度稀释的标准品在四重实时荧光PCR体系中同时扩增MIR162、Mon89034和Bt11特异性靶标序列和玉米内源基因zSSIIb所得的标准曲线图谱。
具体实施方式
实施例1、
1.1样品采集
玉米阳性样本主要为“MIR162”、“Mon89034”、“Mon810”、“Mon863”、“NK603”、“Bt11”、“FAPAS GeMSU 56A”、“FAPAS GeMSU 56B”、“ACAS-T067-J273”。玉米阴性样本为“晶甜3号”、“中农甜488”，“金甜玉808”，“泰甜8号”，“华珍”，“珍甜6号”，“金甜60”，“珍早18”，“甜糯3号”，“加甜糯11号”。玉米深加工产品为本发明人的实验室2020年市场上购买的流通产品，共41个批次。
1.2基因组DNA提取
将玉米种子和果实等未加工样本采用Koning(F1612)植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。提取的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.5(表明核酸纯度较高，蛋白质残留较少)，OD260/230大于1.0(表明有机试剂和多糖的污染较低，提取的核酸较纯)，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。
将玉米酥、玉米片、爆米花的等深加工制品采用德国Congen SureFood PREPPlant X试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。提取得到的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.5，OD260/230大于1.0，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。
1.3引物和探针设计
在NCBI网站中检索并下载玉米内源基因zSSIIb和转基因玉米MIR162、Mon89034和Bt11转化体相应序列，分别根据三个转基因玉米转化体特异性序列，在其外源插入片段3′端与玉米基因组的连接区序列上使用Primer Express 3.0(ABI)软件设计设计特异性引物和探针，并在NCBI Blast中进行产物特异性验证。采用本发明特定的设计规则，探针分别使用荧光基团FAM、VIC、NED和Cy5作为发光基团，使用BHQ和MGB作为非荧光淬灭基团。引物探针可委托上海捷瑞公司合成。本发明所用引物和探针的序列信息见表1：
表1、用于荧光定量PCR反应的引物和探针信息
Figure BDA0002973339190000081
Figure BDA0002973339190000091
1.4四重荧光PCR反应
使用上述表1所述的引物和探针对提取的玉米基因组DNA进行单重和多重实时荧光PCR扩增，以玉米内源基因zSSIIb扩增情况监控反应的有效性。
反应体系为20μL,在多重荧光定量PCR反应体系加入4组检测引物和探针，TransStart Probe qPCR SuperMix，Passsive Reference Dye II和基因组DNA等成分(具体见表2)，荧光定量PCR反应参数为：94℃预变性30s；94℃变性5sec，58℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的58℃退火并延伸阶段收集荧光信号。设置三个复孔的重复和非模板空白对照。扩增反应在ABI QuantStudio Q5实时荧光PCR仪中进行，实验结果应用QuantStudioTM Design&Analysis software进行数据分析和处理。
表2快速鉴定转基因玉米品系的四重实时荧光PCR反应混合液组成
Figure BDA0002973339190000092
Figure BDA0002973339190000101
实施例2、特异性检测
提取转基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11、NK603、T25、Bt176、Mon863、Mon810以及非转基因玉米ZY1711样本基因组DNA，使用实施例1所述的多重荧光定量PCR体系进行转基因品系鉴定，验证方法的特异性。
图1至图7分别为转基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合样本、转基因玉米MIR162、转基因玉米Mon89034、转基因玉米Bt11、转基因玉米Mon863/NK603/T25/Bt176混合样本以及非转基因玉米ZY1711多重实时荧光PCR扩增反应结果。内源基因zSSIIb均产生了明显的S型扩增曲线，Ct值小于35，表明DNA提取过程和实时荧光PCR扩增有效。
在图1中，转基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合样本为模板的反应管中玉米内源基因zSSIIb转基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11三个品系的转化体特异性基因序列均检出，内源基因zSSIIb序列Ct值为22.41，MIR162特异性基因序列Ct值为23.92，Mon89034特异性基因序列Ct值为24.01，Bt11特异性基因序列Ct值为26.78，表明样品中含有这三种玉米品系的转化体成分；
在图2中，转基因玉米MIR162为模板的反应管中仅有转基因玉米MIR162转化体的特异性基因序列检出，MIR162特异性基因序列Ct值为27.13，其他两个转化体均未检出，表明样品中含有MIR162转化体成分；
在图3中，转基因玉米Mon89034为模板的反应管中仅有转基因玉米Mon89034转化体的特异性基因序列检出，其他两个转化体均未检出，Mon89034特异性基因序列Ct值为26.91，表明样品中含有Mon89034转化体成分；
在图4中，转基因玉米Bt11为模板的反应管中仅有转基因玉米Bt11转化体的特异性基因序列检出，其他两个转化体均未检出，Bt11特异性基因序列Ct值为27.46，表明样品中含有Bt11转化体成分；
在图5～图6中，Mon863/NK603/T25/Bt176混合样本和非转基因玉米ZY1711为模板的反应管中都仅有玉米内源基因zSSIIb检出，三种玉米品系的转化体特异性基因均未检出，表明这些样品中不含有这三种玉米品系的转化体成分；
在图7中，转基因大豆GTS 40-3-2、转基因棉花281-24-236×3006-210-23、转基因番茄Huafan no.1为模板的反应管中四个靶标基因均未检出，但tRNALeu基因(植物内参照基因，可作为提取有效性对照)有检出，表明这些样品不是玉米物种，且不含有MIR162、Mon89034、Bt11三种玉米品系的转化体成分。
以上反应中，以灭菌蒸馏水为模板的空白对照管中无荧光信号，表明检测基因之间无信号干扰，多重实时荧光PCR的反应结果与期望结果一致，表明引物探针的设计及反应体系的设置具有特异性，可用于玉米转基因品系的快速鉴定。
实施例3、灵敏性检测
提取转基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11样本基因组DNA，等比例混合作为DNA模板溶液，将其按照10倍浓度稀释5个梯度，稀释介质为Nuclease-free ddH2O。根据玉米的单倍体基因组DNA长度为2504bp。稀释后混合玉米样品每个反应分别为18 000、1 800、180、18、1.8拷贝。以5个梯度的标准品分别为模版，按照实施例1所述方法进行四重实时荧光定量反应，每个浓度设置3个重复，验证方法的灵敏性和检测范围。以拷贝数的自然对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制内源基因zSSIIb和转基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11三个品系的转化体特异性基因的标准曲线，求得线性方程，相关系数和扩增效率。
转基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11混合DNA溶液梯度稀释后四重实时荧光PCR扩增的Ct值见表3所示，四个基因相关系数R2为0.995～0.998。同一基因同一稀释梯度范围内Ct值的变异系数较小，重复性较好。zSSIIb基因Ct值变化范围在22.366～35.324之间，标准偏差在0.037～0.305，R2为0.996，扩增效率为107％；MIR162转化体特异性基因的Ct值变化范围在23.763～37.680，标准偏差在0.084～0.647，R2为0.998，扩增效率为101％；Mon89034转化体特异性基因的Ct值变化范围在24.701～38.912，标准偏差在0.160～0.876，R2为0.996，扩增效率为94.6％；Bt11转化体特异性基因的Ct值变化范围25.844～38.990，标准偏差在0.054～0.366，R2为0.997，扩增效率为102％，表明该四重实时荧光PCR扩增体系稳定性较高，重复性较好，最低检测限为每20μL反应1.8个拷贝，最低定量限为每20μL反应18个拷贝。
表3、玉米转基因四重实时荧光PCR灵敏性检测的扩增数据
Figure BDA0002973339190000111
Figure BDA0002973339190000121
对比实验1：改变多重实时荧光PCR反应的退火温度
将上述实施例1实时荧光PCR反应参数的退火温度增高，即由原来的从58℃增至62℃，其余参照实施例2，最终得到的结果为：所有实验组在四重实时荧光PCR的反应管里，由于退火温度过高，Bt11的探针长度较短，没有MGB标记，TM值较低，无法得到有效扩增，因此体现的结果：在转基因玉米“Bt11”和转基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合样本中无法检测到Bt11基因片段，该片段未检出与实际检测结果不符。
对比实验2：改变四重反应中Mon89034的探针浓度：
将上述实施例1的四重荧光PCR反应中Mon89034的探针终浓度减半，即由原来的0.4μmol/L降至0.2μmol/L，其余参照实施例2，最终得到的结果为：在转基因玉米“Mon89034”和转基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合样本DNA中均扩增不到Mon89034基因片段，该片段未检出与实际检测结果不符。
将上述实施例1的四重荧光PCR反应中Mon89034的探针终浓度加倍，即由原来的0.4μmol/L增至0.8μmol/L，其余参照实施例2，最终得到的结果为：在Mon89034基因的空白对照管中产生了扩增信号，Ct值为34。表明Mon89034探针过量导致非特异性扩增，空白对照中出现了引物二聚体扩增的信号，此外过量的NED荧光染料干扰了以VIC标记的zSSIIb基因的扩增。
对比实验3：改变Bt11转化体特异性基因序列的引物和探针序列
将上述实施例1中的引物和探针设计中Bt11基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:TGAT GTGATATCTCCACTGACGT，R-P:CTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCT，probe:cy5-GCACAATCCCACTATCCTTCGC-BHQ3，扩增产物长度为80bp，其余参照实施例2，所有实验组最终反应在四重PCR反应管中获取不到Bt11基因片段的扩增信号，Ct值大于40。表明设计的Bt11基因片段的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到Bt11基因片段。
对比实验4、改变MIR162转化体特异性基因序列的引物和探针序列
将上述实施例1中的引物和探针设计中MIR162基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:CAGGTCACTTTTACTCGTCTCAATCA，R-P:CAACCGACCTGACAAGTGACA，probe:FAM—ACCGTCCACCAACGAACGCCAAC-BHQ1，扩增产物长度为79bp，其余参照实施例2，所有实验组最终反应在四重PCR反应管中获取不到MIR162基因片段的扩增信号，Ct值大于40。表明设计的MIR162基因片段的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到MIR162基因片段。
对比实验5、改变Mon89034转化体特异性基因序列的引物和探针序列
将上述实施例1中的引物和探针设计中Mon89034基因片段的引物和探针序列设计为：F-P:GCCTCGTGCGGAGCTTT，R-P:CGTTGATGTTTGGGTTGTTGTC，probe:NED--AGGTAGAAGTGATCAACC-MGB，扩增产物长度为65bp，其余参照实施例2，所有实验组最终反应在四重PCR反应管中获取不到Mon89034基因片段的扩增信号，Ct值大于40。表明设计的Mon89034基因片段的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到Mon89034基因片段。
实施例4、日常样本适用性检测
对玉米及其深加工制品进行转基因品系及成分检测分析。其中包括实验室收集的转基因玉米标准品6种(Mon89034、MIR162、Bt11，MON863，MON810，NK603)及其混合DNA样本5种，中国合格评定国家认可委员会(CNAS)组织的能力验证样品(T067-J273)，英国FAPAS分析实验室组织的能力验证样品(GeMSU56A和GeMSU568)；来自不同农作物种子市场和互联网农作物销售商等10个玉米品系种子样本(晶甜3号、中农甜488，金甜玉808，泰甜8号，华珍，珍甜6号，金甜60，珍早18，甜糯3号，加甜糯11号)，作为可种植的农作物活生物体代表。来自于农贸市场和超市的41份玉米食品，即罐装玉米(11批次)、玉米粉(20批次)、爆米花(10批次)。结果表明使用本研究建立的四重实时荧光PCR方法检测实验室收集的转基因标准品和阳性样本，检测结果与样本信息一致。使用四重实时荧光PCR检测10个玉米种子样本和41份玉米及其深加工制品样本结果与单重实时荧光PCR检测结果一致，均为阴性结果。表明本实验研究开发的四重实时荧光PCR快速品系鉴定体系适用于玉米转基因品系及成分的快速鉴定，尤其是大量样本的快速检测。
表4、四重荧光定量PCR适用性检测结果
Figure BDA0002973339190000141
Figure BDA0002973339190000151
备注说明：Mon89034、MIR162、MON810、MON863、Bt11、NK603为不同品系的转基因玉米。FAPAS GeMSU 56A、FAPAS GeMSU 56B和ACAS-T067-J273代表能力验证样品经检验和评定为转基因阳性玉米。晶甜3号、中农甜488，金甜玉808，泰甜8号，华珍，珍甜6号，金甜60，珍早18，甜糯3号，加甜糯11号代表市售的经检测确认为非转基因玉米。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江经贸职业技术学院
<120> 利用四重实时荧光PCR快速鉴定转基因玉米品系的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcccaatc ctttgacatc tg 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgttccgtt ttgcattgc 19
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgaagcaaa gtca 14
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcacttttac tcgtctcaat cagaca 26
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caaccgacct gacaagtgac a 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaccgtcca ccaacgaacg cc 22
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcctcgtgcg gagcttt 17
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgttgatgtt tgggttgttg tc 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggtagaagt gatcaacc 18
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatacaacaa ctcgcggttg ac 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgagggaaca cgggagtct 19
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcgccttct tggcggctta tc 22

Claims (9)

1.利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定所用的引物和探针，其特征是：
内源基因的扩增引物和探针分别为：
zSSIIb-F：CCTCCCAATCCTTTGACATCTG
zSSIIb-R：TCGTTCCGTTTTGCATTGC
zSSIIb-P：VIC-CCGAAGCAAAGTCA-MGB；
转基因玉米品系MIR162的扩增引物和探针分别为：
MIR162-F：TCACTTTTACTCGTCTCAATCAGACA
MIR162-R：CAACCGACCTGACAAGTGACA
MIR162-P：FAM-TCACCGTCCACCAACGAACGCC-BHQ1；
转基因玉米品系Mon89034的扩增引物和探针分别为：
Mon89034-F：GCCTCGTGCGGAGCTTT
Mon89034-R:CGTTGATGTTTGGGTTGTTGTC
Mon89034-P：NED-AGGTAGAAGTGATCAACC-MGB；
转基因玉米品系Bt11的扩增引物和探针分别为：
Bt11-F：GATACAACAACTCGCGGTTGAC
Bt11-R：CGAGGGAACACGGGAGTCT
Bt11-P：Cy5-TGCGCCTTCTTGGCGGCTTATC-BHQ3。
2.利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：
①、检测靶标基因的筛选与确定：
选择MIR162、Mon89034、Bt11三个转基因玉米品系和玉米内源基因zSSIIb作为内参照基因；
②、设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针；
③、待测玉米样品中基因组DNA的提取；
④、四重实时荧光PCR扩增体系设置；
⑤、判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分。
3.根据权利要求2所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
所述步骤②中：探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。
4.根据权利要求3所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
所述步骤②的四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针如权利要求1所述。
5.根据权利要求2～4任一所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
步骤④中，20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为0.1～0.8μM，10μL TransStart Probe qPCR SuperMix，0.4μLPassive Refereence Dye，基因组DNA1pg～100ng；ddH2O补足至20μL。
6.根据权利要求5所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：
Figure FDA0002973339180000021
ddH2O补足至20μL。
7.根据权利要求6所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
四重实时荧光PCR扩增条件为：94℃预变性30s；94℃变性5sec，58℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的58℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
8.根据权利要求2～7任一所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
所述步骤⑤判定待测玉米转基因品系或是否含有某品系转化体成分：根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品品系或是否含有某品系转化体成分；依次进行以下步骤：
5.1)、获取内源基因zSSIIb Ct值；
当内源基因zSSIIb Ct值小于35，表明样品基因组DNA提取有效；反之，则判定检测无效；
5.2)、针对品系特异性基因：
一、当MIR162、Mon89034和Bt11三个靶标序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品的判定结果为非MIR162、Mon89034和Bt11转基因玉米品系或不含有这三种品系的转化体成分；
当MIR162特异性基因序列Ct值＜35时，且Mon89034和Bt11特异性基因序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米MIR162品系或含有该品系的转化体成分；
当Mon89034特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR162和Bt11特异性基因序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米Mon89034品系或含有该品系的转化体成分；
当Bt11特异性基因序列Ct值＜35时，且MIR162和Mon89034特异性基因序列均为无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品判定为转基因玉米Bt11品系或含有该品系的转化体成分；
当出现两个及以上玉米品系的靶标序列Ct值均<35时，则判定待测样品为多个玉米品系的混合样品或含有多个品系的转化体成分；
二、当35≤MIR162、Mon89034和Bt11转基因玉米品系靶标序列Ct值≤40时，对待测玉米样品重新进行检测，判定方式按照上述一。
9.根据权利要求2所述的利用四重实时荧光PCR对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，其特征是：
所述步骤③的待测玉米样品中基因组DNA的提取为：
玉米采用CTAB法、SDS法、高盐低pH法或试剂盒法进行提取；试剂盒可采用北京全式金(EE111)、天根(DP305)、百迈(NEP023)、北京鼎国(NEP003)、Qiagen(69104)、Koning(F1612)等6种植物DNA提取试剂盒；
玉米制品采用天根深加工制品提取试剂盒(DP326)、德国Congen SureFood PREPPlant X(S1006)试剂盒进行提取。
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