CN112126709A - 利用四重实时荧光pcr检测玉米转基因成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，以及所用的引物和探针。本发明的方法包括：设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针；待测玉米中基因组DNA的提取；四重实时荧光PCR扩增；根据PCR扩增结果，判定待测玉米是否为转基因玉米。本发明为玉米及其深加工产品是否为转基因玉米的快速检测提供了有效方法。

Description

利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法
技术领域
本发明涉及转基因玉米及其深加工产品，具体是一种适用于玉米及其深加工产品中是否含有转基因成分(即，是非为转基因玉米)的四重实时荧光PCR检测方法，属于食品安全转基因检测领域。
背景技术
玉米是世界上第二大规模的商业化食用经济作物，全球种植面积约6060万公顷，占全球转基因种植面积的45.1％，转基因渗透率已达到33％，是种植面积第二大的作物。目前全球转基因玉米共146个品系，主要有耐除草剂、抗虫、改善品质、耐旱及抗虫+耐除草剂、品质和耐除草剂等转基因性状。玉米作为主要的粮食作物，重要的饲料和工业原料，种植面积占比在逐年上升。2019年，全球范围内共有43项关于转基因作物的批准，涉及40个品种，有9个新的转基因作物品种获得批准，包括油菜(1种)，棉花(4种)，豇豆(1种)，大豆(1种)和甘蔗(2种)。我国农业农村部也公示了192个拟颁发的“农业转基因生物安全证书”植物品种，其中包括抗虫抗除草剂玉米“DBN9936”和抗虫抗除草剂玉米“双抗12-5”2个玉米品种。根据《农业转基因生物安全管理条例》及相应配套制度，中国转基因种子审批需经历转基因作物安全评价以及品种审定。目前，还没有粮食作物获得过国务院农业行政主管部门颁发的种子生产许可证，均不能进行商业性种植。
转基因作物给人们带来了优良的性状，解决了粮食短缺问题，但也存在潜在的安全性，如可能产生急性毒性、慢性毒性、过敏性、营养性、致畸性等食用安全问题，转基因性状影响到其他物种的环境生态安全问题，以及外源基因的基因漂移和基因逃逸等问题。因此有必要对转基因产品的进行外源基因检测，控制未批准的转基因产品的流通。
为提高检测准确性和时效性，主要以核酸检测技术为主，包括定性PCR、荧光PCR、巢式PCR、数字PCR、依赖核酸序列扩增技术和环介导等温扩增技术等。以上检测方法大多仅能对一个或几个基因进行检测。随着转基因技术的发展应用，转基因元件数量和种类的不断增多，常规的PCR方法在检测容量上已逐渐难以满足检测需要。多重实时荧光PCR技术在一个反应管中加入标记有不同波长荧光基团的序列特异性荧光探针，可同时检测转基因技术中通用的报告基因、启动子和终止子等特异性片段，快速地判断待测样品是否为转基因产品。目前，在导入农产品的外源基因种类和批准转基因生产应用的作物越来越多的情况下，单一项目的检测已不能满足转基因食品监管的需要，迫切需要开发高通量的快速转基因检测技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法及所用的引物和探针，本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，实现对待测玉米样品是否为转基因玉米的快速、高效的检测。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法中所用的引物和探针：
内源基因的扩增引物对为：
zSSIIb-F：GATTGGCATACCGCACTTCTG
zSSIIb-R：ATCAAACCATTGTCCCGGTAAT；
外源基因的扩增引物对为：
35s-F:GACATTGCGATAAAGGAAAGGC
35s-R:GGGTCCATCTTTGGGACCA；
nos-F：TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTC
nos-R：ACATGCTTAACGTAATTCAACAG；
EPSPS-F：CTACAAATGCCATCATTGCGATA
EPSPS-R：ACTGTCGGCAGAGGCATCTT；
内源基因探针为：
zSSIIb-P：VIC-CTGTCTATCTAAAGGCC–MGB；
外源基因探针为：
35s-P：FAM-ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACA-BHQ1
nos-P：Cy5-AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGAT-BHQ3
EPSPS-P：NED-AGGAAAGGCCATCGTT-MGB。
本发明还同时提供了利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，包括以下步骤：
①、设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针：
②、待测玉米样品中基因组DNA的提取；
③、四重实时荧光PCR扩增；
④、根据PCR扩增结果，判定待测玉米是否为转基因玉米。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法的改进：
所述步骤①中：探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’淬灭集团为非荧光标记，所述非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法的进一步改进：步骤①中所用的引物和探针如上所述。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法的进一步改进：所述步骤④判定待测玉米是否为转基因玉米为：根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品中是否含有转基因成分；依次进行以下步骤：
4.1)、获取内源基因zSSIIb Ct值；
当内源基因zSSIIb Ct值小于35，表明待测玉米样品基因组DNA提取有效(即，PCR体系中没有或者较少有抑制剂干扰，扩增反应正常，则进入下述步骤4.2)；反之，则判定检测无效；
4.2)、针对外源基因：
一个外源基因自身的判定规则为：
当外源基因无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米样品的判定结果为阴性(可直接报告未检出转基因)；
当外源基因Ct值＜35时，待测玉米样品的判定结果为阳性；
当35≤外源基因Ct值≤40时，对待测玉米样品重新进行外源基因的检测，当重新进行检测所得的外源基因Ct值＞40时，待测玉米样品的判定结果为阴性，当重新进行检测所得的外源基因Ct值＜35时，待测玉米样品的判定结果为阳性；当重新进行检测所得的结果仍然为35≤外源基因Ct值≤40时，加大模板量重新进行外源基因的检测，直至能进行阴性/阳性的判断；
当35s、nos、EPSPS这3个外源基因中的任意一个的Ct值＜35时，待测玉米样品的判定结果为阳性。即，当35s、nos、EPSPS这3个外源基因中的任意一个的Ct值＜35时，即使别的2个外源基因Ct值处于35～40，也无需进行重新检测了。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法的进一步改进：20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为0.1～0.8μM，10μLTransStart Probe qPCR SuperMix(2×，Trans，货号AQ711)，基因组DNA 1pg～100ng；ddH2O补足至20μL。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法的进一步改进：20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：
Figure BDA0002754842110000041
作为本发明的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法的进一步改进：四重实时荧光PCR扩增条件为：94℃预变性30s；94℃变性5sec，60℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
作为本发明的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法的进一步改进：所述步骤②的待测玉米样品中基因组DNA的提取为：
玉米(即，指未加工过的玉米果实、种子、叶片、玉米粉等)采用CTAB法、SDS法、高盐低pH法或试剂盒法进行提取；试剂盒可采用北京全式金(EE111)、天根(DP305)、北京鼎国(NEP003)、Qiagen(69104)、Koning(F1612)等5种植物DNA提取试剂盒。
玉米制品(即，玉米深加工产品，包括玉米片、玉米酥、爆米花等)采用天根深加工制品提取试剂盒(DP326)、德国Congen SureFood PREP Plant X(S1006)试剂盒进行提取。
在本发明的发明过程中，首先进行检测靶标基因的筛选与确定，而后再进行设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针。
四重实时荧光PCR检测的靶标基因通过国内外数据库和网站的筛选，最终确定花椰菜花叶病毒35S启动子(35S promoter from cauliflower mosaic virus)、胭脂碱合成酶NOS终止子(Terminator of nopaline synthase gene)、新毒素转移酶基因EPSPS(Neomycin transferase gene)三个常见的转基因玉米外源基因和编码玉米淀粉合成酶异构体zSSIIb常见玉米物种内源基因为四重实时荧光PCR的检测靶标。
探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，主要有6-FAM、TET、HEX、VIC、NED、JOE、CY3、CY5、TAMRA、TexasRed；探针的3’淬灭集团为非荧光标记，非荧光标记包括ECLIPSE、BHQ或MGB。
实时荧光PCR反应适用于所有实时荧光PCR反应仪，主要包括ABI实时荧光PCR系统，BioRad实时荧光PCR系统，SmartCyclerII系统等。
根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米样品中是否含有转基因成分；主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值，每个反应的Ct值是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。
在本发明中，设置三个复孔的重复和非模板空白对照(设置三个重复确保数据可靠准确，设置非模板对照避免出现假阴性结果)。实验结果应用QuantStudioTM Design&Analysissoftware进行分析处理。
在本发明中，DNA浓度及纯度通过NanoDrop核酸蛋白分析仪检测。
本发明属于四重实时荧光PCR转基因成分筛查技术，本发明针对玉米内源基因zSSIIb和三个常用的外源基因设计4组扩增引物和4条不同标记的荧光探针。
本发明在设计过程中，通过转基因生物DNA序列数据库https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/jrcgmoamplicons/，国际环境风险评估中心转基因数据库http://cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，加拿大转基因产品库http://www.agbios.com/dbase.php，国际农业生物技术应用服务组织转基因数据库http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp信息，收集得到目前已公开报道的商品化生产的转基因玉米信息。比较分析发现，这些转基因玉米品种均采用35S启动子(35s)和NOS终止子(nos)，内源基因主要以zSSIIb为主，标记基因主要以EPSPS为主。根据以上序列信息，以外源基因35s、nos和EPSPS，玉米内源基因zSSIIb为目标基因，使用引物探针设计软件Primer Express 3.0(Primer Express Software for Real-time PCR,Version 3.0)设计相应的引物和探针，并委托invitrogen公司合成。
需要着重说明的是：在本发明中，由于本发明是多重荧光定量，首先探针标记的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑四对引物和四条探针之间都不能相互干扰。
在本发明中，所述的探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，第一条检测通道检测35s,其荧光染料的发射波长约为522nM；第二条检测通道检测EPSPS，其荧光染料的发射波长约为553nM；第三条检测通道检测zSSIIb，其荧光染料的发射波长约为582nM；第四条检测通道检测nos，其荧光染料的发射波长约为666nM。以ABIQuantStudio Q5实时荧光PCR仪(Applied biosystem)为例，第一到第四条检检测通过分别以FAM、VIC、NED和Cy5标记。探针的3’淬灭集团可以选择ECLIPSE或BHQ，VIC和NED荧光探针以MGB作为3’淬灭集团。
综上所述，本发明属于多重荧光定量PCR检测技术，利用该技术的高通量检测特性，分别检测玉米样本的内源基因和三个外源调控元件，建立了一整套合适的引物和探针、核酸提取及多重扩增和分析方法，对转基因玉米(包括深加工食品)进行多重快速检测。与现有技术相比，本发明的优点在于：可以实现一管多检的实际需要，降低试剂成本，缩短检测时间；多重扩增体系中设置了内源基因的检测，可以判断核酸提取和扩增反应的有效性，避免出现假阴性反应结果；寻找并验证了适用于深加工样品核酸提取的试剂盒。本发明为玉米及其深加工产品转基因成分(是否为转基因玉米)的快速检测提供了有效方法，为促进农产品和食品出口提供技术保障。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为“Bt11”转基因玉米四重实时荧光PCR体系同时扩增zSSIIb，35s，nos和EPSPS所得的扩增曲线图谱。
图2为“ZY1711”非转基因玉米四重实时荧光PCR体系同时扩增zSSIIb，35s，nos和EPSPS所得的扩增曲线图谱。
图3为使用10倍梯度稀释的标准品在四重实时荧光PCR体系中同时扩增zSSIIb，35s，nos和EPSPS所得的标准曲线图谱。
具体实施方式
1材料和方法
1.1样品采集
玉米阳性样本主要为“MON810”、“MON863”、“NK603”、“MON88017”、“Bt176”、“Bt11”“FAPAS GeMSU 56A”、“FAPAS GeMSU 56B”、“ACAS-T067-J273”。玉米阴性样本为“ZY1711”、“美玉7号”、“彩糯一号”、“京粘一号”和“甜糯182号”。玉米深加工产品为本实验室2019年市场上购买的流通产品，共50个批次。
1.2基因组DNA提取
将玉米种子和果实等未加工样本采用Koning(F1612)植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。提取的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.8(表明核酸纯度较高，蛋白质残留较少)，OD260/230大于1.5(表明有机试剂和多糖的污染较低，提取的核酸较纯)，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。
将玉米酥、玉米片、爆米花的等深加工制品采用德国Congen SureFood PREPPlant X试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。提取得到的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.5，OD260/230大于1.0，提取效果均良好，可用于实时荧光PCR检测。
1.3引物和探针设计
在NCBI网站中检索玉米内源基因zSSIIb和外源基因35s、nos和EPSPS相应序列，在保守区域使用Primer Express 3.0(ABI)软件设计多重引物和荧光探针，并在NCBI Blast中验证。并采用了本发明特定的设计规则；探针分别使用荧光基团FAM、VIC、NED和Cy5作为发光基团，使用BHQ和MGB作为非荧光淬灭基团。引物探针可委托英俊公司合成。本发明所用引物和探针的序列信息见表1：
表1、用于荧光定量PCR反应的引物和探针信息
Figure BDA0002754842110000071
1.4四重荧光PCR反应
使用上述引物和探针对提取的玉米基因组DNA进行单重和多重实时荧光PCR扩增，以玉米内源基因zSSIIb扩增情况监控反应的有效性。
反应体系为20μL,在多重荧光定量PCR反应体系加入4组检测引物和探针，TransStartProbe qPCR SuperMix，Passsive Reference Dye II和基因组DNA等成分(具体见表2)，荧光定量PCR反应参数为：94℃预变性30s；94℃变性5sec，60℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。设置三个复孔的重复和非模板空白对照。扩增反应在ABI QuantStudio Q5实时荧光PCR仪中进行，实验结果应用QuantStudioTM Design&Analysis software进行数据分析和处理。
说明：单重扩增时，体系中仅有该对引物和探针组合，Nuclease-free ddH2O补足至20μL。
表2、多重荧光定量PCR的反应混合液组成
Figure BDA0002754842110000081
1.5特异性检测
提取转基因玉米Bt11和非转基因玉米ZY1711样本基因组DNA，使用上述多重荧光定量PCR体系进行转基因成分检测，验证方法的特异性。图1和图2分别为转基因玉米Bt11和非转基因玉米ZY1711多重反应的结果，内源基因zSSIIb均产生了明显的S型扩增曲线，Ct值小于35。外源基因35S、nos和EPSPS在转基因玉米Bt11中检出，且扩增曲线呈现明显的S型，35S、nos和EPSPS对应的Ct值分别为29,28和28。而非转基因玉米ZY1711中不检出，即，35S、nos和EPSPS无荧光信号，未出现明显的扩增曲线。空白对照无信号，检测基因之间无信号干扰，外源基因的反应结果与期望结果一致，表明引物探针的设计及反应体系的设置具有特异性，可用于玉米转基因成分的筛查检测。
备注说明：本发明设计的玉米内源基因zSSIIb的引物和探针以及反应用量，可以在玉米物种中检测到较好的信号(即Ct值小于35，S型扩增曲线)，所以这个基因的检测具有玉米物种特异性；外源基因35s，nos和EPSPS在转基因玉米中检出，而非转基因玉米中不检出，且扩增曲线呈现明显的S型，空白对照无信号，检测基因之间无信号干扰，故说明设计的引物和探针及PCR体系的设置使基因的检测具有特异性。
1.6灵敏性检测
提取“Bt11”玉米阳性样本基因组DNA，按照10倍浓度稀释5个梯度，稀释介质为Nuclease-free ddH2O。根据玉米的单倍体基因组分子重量约为2.6pg。稀释后标准品每个反应分别为13 000、1 300、130、13、1.3拷贝。以5个梯度的标准品分别为模版，进行四重实时荧光定量反应，每个浓度设置3个重复，验证方法的灵敏性和检测范围。以拷贝数的自然对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制内源基因zSSIIb和外源基因35s、nos和EPSPS的标准曲线，求得线性方程，相关系数和扩增效率。
转基因玉米Bt11梯度稀释后DNA四重实时荧光PCR扩增的Ct值见下表所示，四个基因相关系数R2为0.992～0.996。同一基因同一稀释梯度范围内Ct值的变异系数较小，重复性较好。zSSIIb基因Ct值变化范围在19.26～34.39之间，标准偏差在0.048～0.837，R2为0.993，扩增效率为96.1％；外源基因35S的Ct值变化范围在22.70～37.68，标准偏差在0.082～0.605，R2为0.992，扩增效率为104％；外源基因nos的Ct值变化范围在24.01～37.83，标准偏差在0.160～0.876，R2为0.996，扩增效率为97.2％，外源基因EPSPS的Ct值变化范围22.84～37.45，标准偏差在0.054～0.704，R2为0.996，扩增效率为91.4％，表明该四重实时荧光PCR扩增体系稳定性较高，重复性较好，最低检测限为每20μL反应1.3个拷贝，最低定量限为每20μL反应13个拷贝。
表3、玉米转基因成分单重和四重实时荧光PCR检测相对灵敏性分析
Figure BDA0002754842110000091
Figure BDA0002754842110000101
表4、玉米转基因四重实时荧光PCR灵敏性检测的扩增数据
Figure BDA0002754842110000102
1.7对比实验：
1.7.1改变四重反应中EPSPS的探针浓度：
将上述步骤1.4中的四重荧光PCR反应中EPSPS的探针终浓度减半，即由原来的0.4μmol/L降至0.2μmol/L，其余同本发明，最终得到的结果为：在转基因阳性的玉米“Bt11”和“MON863”中均扩增不到EPSPS基因，该基因未检出与实际检测结果不符。
将上述步骤1.4中的四重荧光PCR反应中EPSPS的探针终浓度加倍，即由原来的0.4μmol/L增至0.8μmol/L，其余同本发明，最终得到的结果为：在EPSPS基因的空白对照管中产生了扩增信号，Ct值为33，且扩增zSSIIb基因的反应管中Ct值降低。表明EPSPS探针过量导致非特异性扩增，空白对照中出现了引物二聚体扩增的信号，此外过量的NED荧光染料干扰了以VIC标记的zSSIIb基因的扩增。
1.7.2改变四重反应中zSSIIb引物和探针浓度：
将上述步骤1.4中的四重荧光PCR反应中的zSSIIb引物和探针的量加倍，即终浓度由原来的0.1μmol/L至0.2μmol/L，其余同本发明，最终得到的结果为：在zSSIIb基因的空白对照管中产生了扩增信号，Ct值为32，且扩增EPSPS基因的反应管中Ct值降低。表明zSSIIb引物和探针过量导致非特异性扩增，空白对照中出现了引物二聚体扩增的信号，此外过量的VIC荧光染料干扰了以NED标记的EPSPS基因的扩增。
1.7.3改变EPSPS基因的引物和探针序列
将上述步骤1.3引物和探针设计中EPSPS基因的引物和探针序列设计为：F-P:TGCAGACTTGCGTGTGAGATC，R-P:AGCTCTATCTTCAGGCACGGTAA，probe:VIC-AGCACACTCAAAGGA-MGB，扩增产物长度为61bp，其余同本发明，最终反应在四重PCR反应管中获取不到EPSPS基因的扩增信号，Ct值大于40。表明设计的EPSPS基因的引物和探针达不到扩增的效果，不能检测到EPSPS基因。
1.7.4改变四重实时荧光PCR反应的退火温度
将上述步骤1.4实时荧光PCR反应参数的退火温度增高，即由原来的从60℃增至65℃，其余同本发明，最终得到的结果为：在四重实时荧光PCR的反应管里，只有不完整的35s和nos的扩增曲线，无EPSPS和zSSIIb的扩增曲线。EPSPS和zSSIIb的探针序列较短，TM值较低，退火温度较高达不到扩增效果。
1.8日常样本检测
对市售的ZY1711、美玉7号、彩糯一号、京粘一号、甜糯182号；松仁玉米、甜糯玉米、玉米酥和爆米花等31种玉米及其深加工制品等样品以及转基因玉米标准品和能力验证样品进行四重实时荧光PCR检测，同时按照《SN/T 1204-2016植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检测方法》中所述的引物和探针、检测步骤和反应程序对上述样品进行检测，结果见表5。经SN/T 1204-2016标准反应体系验收和盲样测试的10个转基因标准品和能力验证样品四重实时荧光PCR反应均为阳性，31个市场抽样的玉米制品分别经四重实时荧光PCR检测和标准方法检测，均为阴性。表明本实验研究开发的四重实时荧光PCR反应体系适用于玉米转基因成分的筛查检测，尤其是大量样本的快速检测。
表5、四重荧光定量PCR反应对转基因玉米和CNAS/FAPAS能力验证样品的筛查检测结果
Figure BDA0002754842110000111
Figure BDA0002754842110000121
Figure BDA0002754842110000131
备注说明：MON810、MON863、Bt11、Bt176、GA21、NK603、MON88017为不同品系的转基因玉米。FAPAS GeMSU 56A、FAPAS GeMSU 56B和ACAS-T067-J273代表能力验证样品经检验和评定为转基因阳性玉米。ZY1711、美玉7号、彩糯一号、京粘一号和甜糯182号代表市售的经检测确认为非转基因玉米。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江经贸职业技术学院
<120> 利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gattggcata ccgcacttct g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcaaaccat tgtcccggta at 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacattgcga taaaggaaag gc 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggtccatct ttgggacca 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaaacattt ggcaataaag tttc 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acatgcttaa cgtaattcaa cag 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctacaaatgc catcattgcg ata 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actgtcggca gaggcatctt 20

Claims (8)

1.利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法中所用的引物和探针，其特征是:
内源基因的扩增引物对为：
zSSIIb-F：GATTGGCATACCGCACTTCTG
zSSIIb-R：ATCAAACCATTGTCCCGGTAAT；
外源基因的扩增引物对为：
35s-F:GACATTGCGATAAAGGAAAGGC
35s-R:GGGTCCATCTTTGGGACCA；
nos-F：TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTC
nos-R：ACATGCTTAACGTAATTCAACAG；
EPSPS-F：CTACAAATGCCATCATTGCGATA
EPSPS-R：ACTGTCGGCAGAGGCATCTT；
内源基因探针为：
zSSIIb-P：VIC-CTGTCTATCTAAAGGCC-MGB；
外源基因探针为：
35s-P：FAM-ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACA-BHQ1
nos-P：Cy5-AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGAT-BHQ3
EPSPS-P：NED-AGGAAAGGCCATCGTT-MGB。
2.利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，其特征是包括以下步骤：
①、设计四重实时荧光PCR扩增所需的引物和探针：
②、待测玉米中基因组DNA的提取；
③、四重实时荧光PCR扩增；
④、根据PCR扩增结果，判定待测玉米是否为转基因玉米。
3.根据权利要求2所述的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，其特征是：
所述步骤①中：探针5’荧光染料标记根据所采用的实时荧光PCR仪的配置和荧光基团的发射光谱或者吸收光谱而定，探针的3’淬灭集团为非荧光标记。
4.根据权利要求2或3所述的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，其特征是：所述步骤①中所用的引物和探针如权利要求1所述。
5.根据权利要求4所述的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，其特征是：
所述步骤④判定待测玉米是否为转基因玉米为：根据四重实时荧光PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断待测玉米中是否含有转基因成分；依次进行以下步骤：
4.1)、获取内源基因zSSIIb Ct值；
当内源基因zSSIIb Ct值小于35，表明待测玉米基因组DNA提取有效；反之，则判定检测无效；
4.2)、针对外源基因：
一个外源基因自身的判定规则为：
当外源基因无S曲线产生或Ct值＞40时，待测玉米的判定结果为阴性；
当外源基因Ct值＜35时，待测玉米的判定结果为阳性；
当35≤外源基因Ct值≤40时，对待测玉米重新进行外源基因的检测，当重新进行检测所得的外源基因Ct值＞40时，待测玉米的判定结果为阴性，当重新进行检测所得的外源基因Ct值＜35时，待测玉米的判定结果为阳性；当重新进行检测所得的结果仍然为35≤外源基因Ct值≤40时，加大模板量重新进行外源基因的检测，直至能进行阴性/阳性的判断；
当35s、nos、EPSPS这3个外源基因中的任意一个的Ct值＜35时，待测玉米的判定结果为阳性。
6.根据权利要求5所述的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，其特征是：
20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：检测引物和探针浓度分别为0.1～0.8μM，10μLTransStart Probe qPCR SuperMix，基因组DNA 1pg～100ng；ddH2O补足至20μL。
7.根据权利要求6所述的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，其特征是：
20μL的四重实时荧光PCR扩增体系为：
Figure FDA0002754842100000021
Figure FDA0002754842100000031
8.根据权利要求6或7所述的利用四重实时荧光PCR检测玉米转基因成分的方法，其特征是：
四重实时荧光PCR扩增条件为：94℃预变性30s；94℃变性5sec，60℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
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