CN102115783A - 转基因玉米的基因芯片检测方法 - Google Patents

Abstract

一种转基因玉米的基因芯片检测方法，主要步骤包括确定引物和探针、芯片制备、PCR扩增、PCR产物标记、芯片杂交、芯片扫描及数据处理。该检测方法可一次性对转基因玉米中常用的启动子、终止子、抗虫基因、抗草甘膦基因等7种主要的外源DNA序列进行检测分析，是一种高通量、微型化、自动化、快速高效、灵敏度高的转基因玉米的检测方法，可广泛应用于进出口检验检疫等相关领域。

Description

转基因玉米的基因芯片检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体说是利用基因芯片对转基因玉米产品进行检测的方法。

背景技术

随着基因工程技术的快速发展，转基因作物已进入大规模商品化生产阶段，转基因作物品种达100多个，主要有大豆、玉米、棉花、油菜等，由转基因作物加工生产的转基因食品和食品成分达4000余种。然而转基因作物在带来巨大经济效益的同时也存在许多潜在问题。由于目前尚缺乏科学依据证明转基因产品对人类健康和环境的安全性，转基因产品对健康和环境潜在的风险引起世界各国政府和公众的极大关注和广泛忧虑。农作物中转基因成分的安全性问题已由科学问题上升为社会问题。为了保护消费者的知情权与选择权，世界很多国家都加强了对转基因作物及产品的检测及监管，并要求对含有转基因成分的食品进行明确标示。

玉米是世界上重要的农作物，国内外对于应用基因工程技术改良玉米，特别是改良玉米的抗虫性和品质都非常重视。通过多年努力已经取得很大成绩，转基因玉米研究与产业化进入了快速发展阶段。中国是世界第二大玉米生产国，常年种植2400万hm2，我国转基因玉米研究进展较快，转基因玉米在我国即将进入生产阶段，转基因抗虫、除草剂玉米的产业化蓄势待发，转基因玉米的安全性检测与监督迫在眉睫。

转基因玉米的检测，目前用的比较多的是PCR技术与ELISA技术(酶联免疫法)。

PCR检测技术的基本原理是根据产品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对产品中是否含有靶标基因序列成分进行判定。应用PCR技术的关键是所设计的DNA引物的序列必须和转基因产品中所待扩增的DNA序列互补，因此为了设计有效引物，检验者必须对转基因产品中所含有的外源基因DNA序列有一定的了解。转基因生物中被导入的外源基因序列一般包括标记基因、目的基因、及各自的启动子、终止子等调控序列。

PCR定性筛选检测方法：1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因产品的可能性。检测的一般程序①提取待检品中的DNA：②设计与待测特异DNA片断相适的引物：③对待测DNA片断进行PCR扩增：④用琼脂糖凝胶电泳分离扩增的DNA，EB染色后，分析鉴定转基因成分。

定量PCR检测方法：定性筛选PCR本身具有局限性，所采取的PCR法因其高敏感性常伴有假阳性现象，而操作上的误差，加上一些反应抑制因素亦可带来假阴性现象，其最大的不足是无法对转基因成分进行定量分析。为此，研究者们在定性筛选PCR方法的基础上，发展了不同的定量PCR检测方法。目前，国外较为成熟的方法主要有定量竞争PCR(Quantitative competitive，QC-PCR)和Real-time PCR法。

定量竞争PCR法：先构建含有修饰过的内部标准DNA片断(竞争DNA)，与待测DNA进行共扩增，因竞争DNA片断和待测DNA的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，并可进行定量分析。①样品DNA的提取和定量。按常规方法提取DNA。DNA含量可用紫外分光光度计测定。②竞争DNA的构建。常规分子生物学的方法，用基因重组技术构建竞争DNA片段作为内部标准DNA，此片段除含有转基因成分外(如35S启动子、NOS终止子)，还插入数+bp的DNA序列(或缺失数+bp的DNA序列)。③标准工作曲线的建立。取定量模板DNA，所含GMO量分别为0～100％的系列参考样，分别与一定量的竞争DNA在同一反应体系进行PCR扩增。特异转基因DNA与竞争DNA竞争反应体系中的相同底物、引物，PCR反应获得相差数+bp的两条凝胶电泳带，两条带浓度随转基因成分含量的不同而有差异。当两条带浓度相等，则说明此参考样GMO浓度与竞争DNA浓度相等。通常实验时竞争DNA浓度调整到与含1％转基因成分的参考样相当。通过凝胶成像分析系统对琼脂糖凝胶电泳的结果进行分析，得到每条带的相对浓度，以此数据作〔目标DNA浓度〕——〔目标DNA浓度〕/〔竞争DNA浓度〕的对数图，线性回归分析后得出工作曲线。④待测样品的测定，将500ng待测DNA与经过定量的竞争DNA共扩增，凝胶电泳后经扫描分析得到两条带得到〔目标DNA〕/〔竞争DNA〕的比值，依此数据在工作曲线图上求得待测样品的GMO含量。

Real-time定量PCR法：此方法须设计一个内部探针，该探针包含5’端荧光报告因子和3’端猝灭因子。PCR反应前，由于猝灭因子与荧光报告因子的位置相近，使荧光受到抑制而检测不到荧光信号。随着PCR反应从上游的PCR引物开始，引物和标记探针与目标DNA分子中对应的互补序列复性，聚合酶与探针相遇，利用其5’核酸外切酶活性使报告因子释放，产生的荧光可被内设的激光器记录，记录到的荧光强度可反映PCR的产物量，从而实现实时定量分析。

PCR检测技术灵敏度高，检测迅速。但现今的筛选方法，只是对特定启动子、终止子和标记基因进行PCR检测，而PCR方法因其高敏感性常伴有假阳性现象。另一方面，随着转基因技术的发展，越来越多的转基因生物采用全新的启动子、终止子和标记基因，使得现在常用的筛选因子的覆盖面减小，失去筛选的意义。

ELISA技术是建立在抗体抗原免疫学反应的基础上的。抗原抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应，即在通常情况下，抗原只和它自己(或具有相同抗原决定簇)诱导产生的抗体发生反应，因此具有高度特异性，抗体抗原反应虽然产生肉眼可见的凝集反应，但灵敏度太低而且需要大量的抗体和抗原。

ELISA分析法特异性高，获得的结果很快，仪器简单，仪器操作，对人员要求不高；免去了对样品进行核酸提取的麻烦，同时可降低检测的成本；由于酶具有很高的催化效率，可极大的放大反应效果，从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性。但是也有其局限性：(1)检测范围窄，需要转基因食品中含有待检测范围，如EPSPS基因的耐除草剂大豆，转Bt基因的抗虫玉米等，因此只能在商业化GMF品种较少的情况下使用。目前商品化ELISA试剂盒只能检测少数几种GMF，且一种试剂盒只针对某一特定转基因产物，无法高通量、快速的检测具有多种混合成分的食品样品；(2)易出现假阴性结果，一方面转基因产品中“新蛋白”含量通常很低，难以检出，另一方面蛋白质在食品加工过程中易变性，已加工食品中的蛋白质很可能失去抗体所针对的抗原表位，从而造成ELISA检测结果假阴性。此外，蛋白质在受体生物基因组内表达前后如进行新的修饰，也可导致检测敏感性降低及假阴性结果。

就目前转基因产品检测中常用的ELISA和PCR技术而言，最大的缺点是检测范围窄，效率低，无法高通量大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所知的情况下，对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的。因此，对转基因产品的检测，需要有更有效、快速、特别是高通量的检测方法。

发明内容

本发明旨在提供一种高通量、微型化、自动化、快速高效、灵敏度高的转基因玉米的基因芯片检测方法，涵盖的转基因玉米产品检测面很广，可一次性同时对目前我国批准的转基因玉米中常用的启动子、终止子、抗虫基因、抗草甘膦基因等7种主要的外源DNA序列进行检测分析的方法。

本发明实现的步骤如下：

1)确定引物和探针：

2)采用多聚赖氨酸处理芯片载体，浸泡烘干。

3)芯片制备

探针与TE buffer充分混匀，采用芯片点样仪点样于处理过的芯片载体上，芯片经过烘干，UV交联，化学封闭以及变性后，置于干燥箱中室温保存。

4)PCR扩增

反应体系含有反应缓冲液，dNTP，引物，TITANUIM扩增酶，DNA模板，MgCl2，灭菌超纯水。

5)PCR产物标记

反应体系含有反应缓冲液，Cy3-dNTP，Thermo sequence DNAPolymerase，SBE引物，多重PCR产物，灭菌超纯水。

6)芯片杂交

标记的PCR产物变性取出放置于冰上，加入杂交液，然后将杂交混合液滴于制备的芯片上，杂交炉中杂交2h，杂交后的芯片经洗涤，离心，晾干。

7)芯片扫描及数据处理

利用芯片扫描仪对杂交反应后的芯片进行扫描，输出数据进行分析处理。

本发明选择了最佳的的杂交条件和扩增、杂交引物，能使多基因PCR产物与芯片上的杂交探针处于最佳的反应状态，大大提高了外源DNA的检出率，结果表明，灵敏度达0.01％。

本发明通过一次性检测启动子、终止子、抗虫基因、抗除草剂基因等常见的7种外源基因来判定待检样品是不是转基因玉米，是不是我国已批准的转基因玉米种类。

本发明可广泛应用于进出口检验检疫。

实施方式

实施例1

针对转基因玉米中常用的7个外源基因以及对照基因(18SrRNA、Invertase内源基因)的序列，通过引物设计软件primer5.0和oligo6.0来设计引物和探针，并在ncbi进行核苷酸序列的比对，从中选出符合要求的引物和探针，所选用的引物和探针信息详见表1和表2。

表1

引物编号	引物序列	目标DNA
			1	TAA TAG AGC AAT GAA CAG TCG G	18SrRNA
2	CTT TCA ACA ACG GAT CTC TTG G
			3	GGC CGG ATC GTC ATG CTC TAC A	Invertase内源基因
4	TTG GCG TCC GAC TTG ACC CAC T
			5	GAT TCC ATT GCC CAG CTA TCT G	CaMV35S启动子
6	TAG AGG AAG GGT CTT GCG AAG G
			7	GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG	T-nos终止子
8	CGA TT CCC GAT CTA GTAAC
			9	CGT CTT GAA GGT CGT GGTA	修饰型CP4-EPSPS
10	GCA ACA GCG AGA ATT GGA TA
			11	TCG ACA TCA GCC TGA GCC TG	杀虫毒蛋白CryIAb基因
12	TGG TTG ATC AGC TGC TCG ATC
			13	CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC T	耐除草剂Ivr1基因
14	GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C
			15	GCT TGC ATT GTT CGC TCT C	抗虫Zein基因
16	CGA TGG CAT GTC AAC TCA TTA
			17	CGG TGG ATG CTA AGG CTG ATG	抗虫zSSIIb基因
18	AAA GGG CCA GGT TCA TTA TCC TC

表2

探针编号	探针序列	目标DNA
			P1	TTC AGA CCT CCA CCC TTG AAT	18SrRNA

P2	CGA GCA GAC CGC CGT GTA CTT CTA CC	Invertase内源基因
			P3	GGC CAT CGT TGA AGA TGC CTC TGC C	CaMV35S启动子
P4	AAT GTA TAA TTG CGG GAC TCT AAT C	T-nos终止子
			P5	TGG CTG ACT TGC GTG TTC GTT CTT CTA CTT TG	修饰型CP4-EPSPS
P6	ATG GTG CTC CGC GAT GTC TCC	杀虫毒蛋白CryIAb基因
			P7	ACT TTA ATA GCA TAC GTT ATT CCA	耐除草剂Ivr1基因
P8	GGT ATG AAC CCA GCA GGA ATT GGA	抗虫Zein基因
			P9	CGT GTA CTT CTA CC GTG TTC TTG	抗虫zSSIIb基因

多重PCR扩增反应按照一定的反应体系进行扩增，体系如下：10×PCRbuffer 5ul，2.5mM dNTP 8ul，20uM primer各2ul，TITANUIM扩增酶1ul，DNA模板50-100ng，灭菌水补充体系至50ul，PCR反应程序为94℃5min；94℃30sec，55℃1min，72℃1min，40个循环；72℃7min。

扩增混合物用Exo.I和SAP进行酶切反应，去除反应体系中多余的primer和dNTP，然后多基因产物用荧光染料cy3进行标记，并使用PCR纯化试剂盒进行纯化提取。

在芯片杂交时，将被荧光标记的多基因PCR产物95℃进行变性，迅速取出后立即置于冰上5min，加入等体积的杂交液，制成杂交混合液，滴于预处理过的芯片上，小心盖上盖玻片，置于48℃杂交炉中反应2h，杂交反应完毕后依次用2×SSC、1×SSC、0.6×SSC进行洗涤，每次五分钟，以除去未杂交残留物，玻片离心甩干后待测。

将杂交反应并处理过的芯片插入芯片扫描仪的检测孔内，进行结果扫描和分析处理(扫描power 600，分辨率为10um)

实施例2

利用全自动芯片点样仪，设计成6×9阵列，包含了18条检测目标探针，两条阴性对照，每对探针重复4个点，每一行检测一种基因，芯片上安徽那个设置与检测探针没有同源性的人类基因作为阴性对照，以排除杂交过程中非特异杂交的干扰。

实施例3

应用建立的转基因玉米的基因检测芯片对20份标准样进行反复检测验证，结果显示，无转化基因的标准样本只出现了对应的内参照基因(18SrRNA、invertase内源基因)杂交检测信号，0.1％的玉米不仅得到了内参照基因的杂交检测信号，同时得到了特异的外源基因杂交检测信号，验证结果说明设计的芯片具有非常高的灵敏度，而且实验结果准确度很高，选用的引物、探针和反应条件都为最佳。

应用建立的转基因玉米的基因检测芯片对10份未知玉米样品进行检测，结果显示，六份样品检出了18SrRNA、invertase、抗虫zSSIIb基因、杀虫毒蛋白CryIAb基因、CaMV 35S启动子、T-nos终止子、耐除草剂Ivr1基因，结果呈阳性，而其他四分样本只检出了内参照基因杂交信号(18SrRNA、invertase内源基因)，说明这四份样本为非转基因玉米。

Claims (3)

1.一种转基因玉米的基因芯片检测方法，检测步骤如下：

1)确定引物和探针：

2)采用多聚赖氨酸处理芯片载体，浸泡烘干。

3)芯片制备

探针与TE buffer充分混匀，采用芯片点样仪点样于处理过的芯片载体上，芯片经过烘干，UV交联，化学封闭以及变性后，置于干燥箱中室温保存。

4)PCR扩增

反应体系含有反应缓冲液，dNTP，引物，TITANUIM扩增酶，DNA模板，MgCl2，灭菌超纯水。

5)PCR产物标记

反应体系含有反应缓冲液，Cy3-dNTP，Thermo sequence DNAPolymerase，SBE引物，多重PCR产物，灭菌超纯水。

6)芯片杂交

标记的PCR产物变性取出放置于冰上，加入杂交液，然后将杂交混合液滴于制备的芯片上，杂交炉中杂交2h，杂交后的芯片经洗涤，离心，晾干。

7)芯片扫描及数据处理

利用芯片扫描仪对杂交反应后的芯片进行扫描，输出数据进行分析处理。

2.如权利要求1所述的转基因玉米的基因芯片检测方法，其特征是步骤1所选用引物如下： 

1)18SrRNA.

TAA TAG AGC AAT GAA CAG TCG G

CTT TCA ACA ACG GAT CTC TTG G

2)intervase内源基因

GGC CGG ATC GTC ATG CTC TAC A

TTG GCG TCC GAC TTG ACC CAC T

3)CaMV 35S启动子

GAT TCC ATT GCC CAG CTA TCT G

TAG AGG AAG GGT CTT GCG AAG G

4)T-nos终止子

GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG

CGA ATT CCC GAT CTA GTA AC

5)修饰型CP4-EPSPS

CGT CTT GAA GGT CGT GGT A

GCA ACA GCG AGA ATT GGA TA

6)杀虫毒蛋白CryIAb基因

TCG ACA TCA GCC TGA GCC TG

TGG TTG ATC AGC TGC TCG ATC

7)耐除草剂Ivr1基因

CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC T

GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C 

8)抗虫Zein基因

GCT TGC ATT GTT CGC TCT C

CGA TGG CAT GTC AAC TCA TTA

9)抗虫zSSIIb基因

CGG TGG ATG CTA AGG CTG ATG

AAA GGG CCA GGT TCA TTA TCC TC。

3.如权利要求1所述的转基因玉米的基因芯片检测方法，其特征是步骤1所选用探针如下：

TTC AGA CCT CCA CCC TTG AAT

CGA GCA GAC CGC CGT GTA CTT CTA CC

GGC CAT CGT TGA AGA TGC CTC TGC C

AAT GTA TAA TTG CGG GAC TCT AAT C

TGG CTG ACT TGC GTG TTC GTT CTT CTA CTT TG

ATG GTG CTC CGC GAT GTC TCC

ACT TTA ATA GCA TAC GTT ATT CCA

GGT ATG AAC CCA GCA GGA ATT GGA

CGT GTA CTT CTA CC GTG TTC TTG。