CN108546741A - 一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分nasba-elisa快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分nasba-elisa快速检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物检测技术领域，是一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特点是，由根据抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列设计的特异性引物、捕获探针、检测探针，优化的NASBA扩增体系和优化的NASBA产物检测体系组成。能对玉米中抗草丁膦抗性基因成分进行简单快速的检测，具有高效的特异性和容易推广的优越性，也有助于转基因玉米中的抗草丁膦抗性基因成分bar的早期诊断；其检测方法是设计并人工合成抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列的特异性引物、捕获探针和检测探针，确定NASBA扩增反应程序和NASBA产物检测体系等步骤，检测方法避开了对特殊设备和专业人员的需求，结果灵敏度高且重复性好。

Description

一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试 剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，是一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术
随着转基因玉米的扩大种植，其安全性也受到国际社会和广大民众的广泛关注，世界各国都制订了相应安全性评价制度和转基因成分标识制度等，要求对转基因产品进行标识，转基因成分的检测也越来越受到重视。因此，急需一种快速检测方法满足玉米产品在种植及贸易中的监控需要。
从吸水链霉菌中分离得到的bialaphos resistance(bar)基因被证明具有良好的抗草丁膦(PPT)除草剂效果，由于其非选择性、广谱、无残留的优点被广泛用于植物转基因的选择标记，bar基因也常被作为检测转基因的靶标元件。现有检测方法中，检测外源基因的表达产物常因加工过程中产品丧失抗原性导致无法检测。核酸法因其准确快速日益受关注，如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、实时荧光定量PCR和基因芯片等；但因需要昂贵的PCR仪及专业化的操作人员未能得到普及；基因芯片技术成本高、数据分析复杂。因此，找到一种简单快速高效的诊断方法势在必行。一种特异性等温扩增RNA的核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术已有成功应用的报道，它是由一对特异性引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在41℃恒温下进行，可在2h内将模板RNA扩增约1012倍，且无需PCR仪等仪器，避免了PCR扩增结果重复性差的问题，也容易普及应用。
本发明根据玉米转基因成分bar的mRNA基因序列设计了特异引物和探针，将高效的NASBA和简便的酶联检测法完美结合，研发出高效的NASBA检测转基因成分bar的快速检测试剂盒，短时间内对转基因成分bar进行高灵敏度筛查，灵敏度达到5fg，其操作简单、对设备要求低等优点适合在基层部门和采样现场普及应用。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，效果佳，应用价值高的玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，并提供其检测方法。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的：
一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，它包括如下体系：
1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：
(a)bar基因的一对特异性引物
bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；
bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；
(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl2为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；
(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 0.2U，20U RNA酶抑制剂；
2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：
(a)bar基因的探针
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’，
检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；
(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％ BSA混合液；
(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/L Tris-HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；
(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；
(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：
杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％ Tween-20；
显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O，加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；
终止液：0.5mol Na2CO3溶液。
一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测方法，它包含下述步骤：
1)设计并人工合成玉米转基因成分bar的特异引物和探针，检测时扩增混合物中的序列将分别被特异性的捕获探识别并固定于不同检测孔中，通过酶标法进行检测，人工合成的引物和探针如下：
(a)bar基因的一对特异性引物
bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；
bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’；
检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；
2)NASBA扩增模板转基因玉米总RNA的制备
液氮研磨120mg玉米叶片，加入1mLTrizol涡旋1min，室温放置15min；加500μL氯仿，颠倒混匀，室温放置5min，4℃，12000r/min离心15min；上清加入等体积异丙醇，冰浴20min，4℃，10000r/min离心10min，去上清；用75％乙醇洗涤沉淀两次，4℃，10000r/min离心5min，干燥后加50μL TE回溶；
3)NASBA扩增反应体系及程序：
(a)NASBA扩增反应液制备：20μL扩增反应液包2mmol/L dNTP，20mmol/L NTP，80mmol/L Tris-HCl pH8.5，20mmol/L MgCl2，240mmol/L KCl，10mmol/L DTT，200g/LDMSO，上、下游引物各0.4μmol/L；
(b)酶反应液制备：5μL酶反应液包含40U SupeScript II反转录酶，80U T7RNA聚合酶，0.2U核糖核酸酶H和20U RNA酶抑制剂；
(c)扩增反应及程序采用20μL体系：10μL扩增反应液中加入0.5μL玉米总RNA和3.5μL ddH2O，65℃加热2min去除RNA二级结构，41℃冷却2min，加入5μL酶反应液，41℃反应90min，冰浴2min终止反应后-20℃贮存，同时以无菌水做阴性对照；
4)酶标板的制备：
(a)酶标板包被液制备：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度；
(b)酶标板封闭液制备：0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％ BSA混合液；
(c)酶标板制备：96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板35次，4℃避光保存备用；
5)NASBA扩增产物ELISA检测：
(a)杂交反应：每孔中各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μL NASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃反应30min，并用PBST洗板3～5次，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1∶5000稀释，室温反应至少30min，PBST洗板3～5次；
(d)显色反应：每孔加入100μL pNPP进行显色，室温避光显色10min，立即加入100μL碳酸钠终止显色反应，酶标仪测定OD405数值，OD≥0.27为阳性，OD＜0.27为阴性。
本发明的一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法，根据抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列设计了一对特异性引物进行快速诊断。与现有核酸等技术相比，本发明的优势在于：
1.简单快速、易于推广，无需昂贵的核酸扩增反应装置，恒温水浴锅42℃反应1h左右即可，且操作方法容易掌握；
2.精确度高，特异性强，其避开了常规PCR的高温变性步骤，相对于RT-PCR和LAMP错配率较低；
3.灵敏度高，重复性好，效果佳，应用价值高，是RT-PCR灵敏度的10倍，优化后引物和探针检测玉米转抗草丁膦抗性基因成分灵敏度显著提高且重复性更好。
附图说明
图1Bar-NASBA试剂盒检测特异性。
图2Bar-NASBA试剂盒的检测灵敏性。
图3Bar-NASBA试剂盒的样本检测。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
本发明的一种玉米转bar基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，包括如下体系：
1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：
(a)bar基因的一对特异性引物
bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；
bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；
(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl2为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；
(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 0.2U，20U RNA酶抑制剂；
2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：
(a)bar基因的探针
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’，
检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；
(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％ BSA混合液；
(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/L Tris-HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；
(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；
(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：
杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％ Tween-20；
显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O，加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；
终止液：0.5mol Na2CO3溶液。
本发明还提供了一种玉米转bar基因NASBA-ELISA快速检测方法，按如下步骤进行：
实例1：玉米转抗草丁膦抗性bar基因NASBA-ELISA试剂盒特异性检测：
分别提取转bar基因玉米、转Badh抗旱基因玉米，转Cry抗虫基因玉米、非转基因玉米的RNA，各取0.5μL RNA分别和10μL NASBA扩增反应液65℃加热2min，然后41℃冷却2min；立即加入5μL酶混合液轻弹混匀，ddH2O补足20μL反应体积，41℃反应90min，冰浴终止反应，用NASBA产物检测试剂进行ELISA检测。
结果显示只有转bar基因玉米叶片的总RNA扩增产物出现预期大小519bp的目的条带，其余转基因玉米和非转基因玉米未出现扩增信号，阴性对照没信号，表明该试剂盒对bar的RNA的检测具有特异性，见图1-Bar-NASBA试剂盒检测特异性：M.DL-2000Marker；1.转bar基因玉米叶片；2.转Badh基因玉米；3.转Cry基因玉米；4.非转基因玉米；5.阴性对照。
实例2：bar-NASBA试剂盒灵敏性检测：
提取转bar基因玉米总RNA，对初始浓度为500ng/μL bar的RNA做连续浓度稀释，每个梯度取0.5μL模板RNA和10μL NASBA扩增液65℃加热2min，41℃冷却2min；加入5μL酶混合液混匀，ddH2O补足20μL体积，41℃反应90min，冰浴终止反应，ELISA检测NASBA产物，结果表明RNA稀释至10-8时仍有阳性扩增产物，灵敏度为5fg，阴性对照无检出信号，说明试剂盒灵敏性可达到5fg，具有较高灵敏性，见表1。
表1 Bar-NASBA试剂盒灵敏度试验
电泳结果也表明检测浓度可达到1×10-8的浓度，浓度为1×10-9时无检出信号(结果未给出)，灵敏性可达5fg，具有较高的灵敏性，阴性对照无检出信号，见图2-Bar-NASBA试剂盒的检测灵敏性：M.DL-2000Marker；1.1×10-1；2.1×10-2；3.1×10-3；4.1×10-4；5.1×10-5；6.1×10-6；7.1×10-7；8.1×10-8；9.阴性对照。
实例3：玉米抗草丁膦抗性基因bar-NASBA试剂盒样本检测
(1)样品RNA的制备
(a)分别取非转基因和转bar基因玉米叶片、玉米茎和玉米根各120mg，液氮研磨后加入1mL Trizol涡旋1min，室温放置15min。
(b)加500μL氯仿，颠倒混匀几次，室温放置5min，4℃，12000r/min离心15min。
(c)上清加等体积异丙醇，冰浴20min，4℃，10 000r/min离心10min，去上清。
(d)沉淀用适量75％乙醇洗涤两次，4℃，10 000r/min离心5min。
(e)自然干燥后加50μL DEPC处理的TE回溶，紫外分光光度测定和电泳鉴定。
(2)NASBA扩增反应程序
PCR管中加入10μL扩增反应液，分别加入0.5μL非转基因、转bar基因玉米叶片、玉米茎和玉米根总RNA，65℃加热2min以去除RNA的二级结构，41℃冷却2min，立即加入5μL酶反应液，轻弹混匀，41℃反应90min，冰浴2min终止反应。
(3)NASBA扩增产物的ELISA检测
96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板3～5次，4℃避光保存备用。
每孔各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μL NASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃反应30min，并用PBST洗板3～5次。
每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1∶5000稀释)，室温反应至少30min，PBST洗板3～5次。
每孔加入100μL pNPP室温显色10min，加入100μL碳酸钠终止反应，酶标仪检测。
(4)ELISA检测结果判定
Bar-NASBA试剂盒对非转基因和转bar基因玉米叶片、玉米茎和玉米根总RNA检测结果表明试剂盒应用于转bar基因的玉米各组织检测，且具有较高灵敏度和特异性，见图3-Bar-NASBA试剂盒的样本检测：M.DL-2000 Marker；1.转bar基因玉米叶片；2.转bar基因玉米茎；3.转bar基因玉米根；4.非转基因玉米叶片；5.非转基因玉米茎；6.非转基因玉米根；7.阴性对照。
结论：本发明首次将NASBA联合ELISA方法应用于玉米中bar基因的检测，通过优化引物和探针使其灵敏度可达到5fg，较常规PCR法更适合于检测转bar基因的转基因玉米样品。NASBA玉米转bar基因诊断试剂盒，因其高特异性、所需设备简单和操作快速的优点，可以广泛应用到检验部门等，易于推广和使用；尤其适合基层部门和采样现场对bar转基因成分的早期鉴定。

Claims (2)

1.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，它包括如下体系：
1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：
(a)bar基因的一对特异性引物
bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；
bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；
(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl2为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；
(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H0.2U，20U RNA酶抑制剂；
2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：
(a)bar基因的探针
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’，
检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；
(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；
(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/LTris-HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；
(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；
(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：
杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％Tween-20；
显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O，加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；
终止液：0.5mol Na2CO3溶液。
2.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测方法，其特征在于，它包含下述步骤：
1)设计并人工合成玉米转基因成分bar的特异引物和探针，检测时扩增混合物中的序列将分别被特异性的捕获探识别并固定于不同检测孔中，通过酶标法进行检测，人工合成的引物和探针如下：
(a)bar基因的一对特异性引物
bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；
bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；
特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’；
检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；
2)NASBA扩增模板转基因玉米总RNA的制备
液氮研磨120mg玉米叶片，加入1mLTrizol涡旋1min，室温放置15min；加500μL氯仿，颠倒混匀，室温放置5min，4℃，12000r/min离心15min；上清加入等体积异丙醇，冰浴20min，4℃，10000r/min离心10min，去上清；用75％乙醇洗涤沉淀两次，4℃，10000r/min离心5min，干燥后加50μL TE回溶；
3)NASBA扩增反应体系及程序：
(a)NASBA扩增反应液制备：20μL扩增反应液包2mmol/L dNTP，20mmol/L NTP，80mmol/LTris-HCl pH值为8.5，20mmol/L MgCl2，240mmol/L KCl，10mmol/L DTT，200g/L DMSO，上、下游引物各0.4μmol/L；
(b)酶反应液制备：5μL酶反应液包含40U SupeScript II反转录酶，80U T7 RNA聚合酶，0.2U核糖核酸酶H和20U RNA酶抑制剂；
(c)扩增反应及程序采用20μL体系：10μL扩增反应液中加入0.5μL玉米总RNA和3.5μLddH2O，65℃加热2min去除RNA二级结构，41℃冷却2min，加入5μL酶反应液，41℃反应90min，冰浴2min终止反应后-20℃贮存，同时以无菌水做阴性对照；
(4)酶标板的制备：
(a)酶标板包被液制备：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度；
(b)酶标板封闭液制备：0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；
(c)酶标板制备：96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板35次，4℃避光保存备用；
(5)NASBA扩增产物ELISA检测：
(a)杂交反应：每孔中各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μL NASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃反应30min，并用PBST洗板3～5次，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1∶5000稀释，室温反应至少30min，PBST洗板3～5次；
(d)显色反应：每孔加入100μL pNPP进行显色，室温避光显色10min，立即加入100μL碳酸钠终止显色反应，酶标仪测定OD405数值，OD≥0.27为阳性，OD＜0.27为阴性。
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