CN108977504A - 一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法 - Google Patents

一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，包括以下步骤：(1)预处理：制作并固定待测菌株的DNA；(2)杂交：将待测菌株的DNA与标记单链DNA探针进行杂交作用；(3)筛选：通过特异性检测待测菌株是否产生鳍藻毒素。本发明通过菌落原位斑点分子杂交，标记单链DNA探针可特异性检测待测菌株DNA样品中是否产生鳍藻毒素；成本低、快速、准确性及灵敏度高的特性；分析成本低，周期短，所用试剂绿色环保，对人体无害，具有较高的市场前景与经济价值。

Description

一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法。
背景技术
鳍藻毒素(dinophysistoxins，DTXs)是腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfishpoisoning，DSP)的一种，属高毒性、脂溶性、热稳定聚醚类海洋生物毒素。DTXs是细胞特异性蛋白磷酸酶PP1和PP2A强抑制剂，具有长期致畸性，是一种强肿瘤促进剂或原始致癌剂。其长期毒性效应对海洋生态环境、贝类水产品养殖及其出口贸易、人体生命健康构成严重威胁，是世界性研究热点。
目前，鳍藻毒素可通过涡鞭毛藻(如蛎甲藻)的规模培养及产物提取制备获得，但该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。海洋细菌是产DTXs的另一个来源，且与甲藻相比，海洋细菌具有易培养、代谢调控相对简单等特性，因此，利用产毒海洋细菌发酵制备鳍藻毒素，是一种经济、高效的替代方法。
利用产毒海洋细菌发酵制备鳍藻毒素的关键技术是产毒菌株的快速筛选，现有的筛选方法为通过代谢产物的化学分析来实现，不仅工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。目前尚无产鳍藻毒素菌株的快速筛选技术。
发明内容
本发明为了克服传统产毒菌株筛选方法工作量大、周期长、成本高的问题，提供了一种利用DNA探针-菌落原位杂交快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，该方法具有成本低、快速、准确性及灵敏度高的特性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：制作并固定待测菌株的DNA；
(2)杂交：将待测菌株的DNA与标记单链DNA探针进行杂交作用；
(3)筛选：通过特异性检测待测菌株是否产生鳍藻毒素；
其中，步骤(2)中，所述标记单链DNA探针为利用经地高辛标记的含有182个碱基的序列1所述的单链DNA探针，所述序列1为：
TGACCCTGTGACACCGACCGACCTCCGACCGACCCTCGACCCTTAGCCTGGTCCTCTTGACTGGACTAGGCCGACCGAACCTCGTCACTCGACCTAGCCCTCCTGGACTGTTCCTACGAATATCTGACCGATGGCGACCTCCTACGCCGCTTCGCGACTCCTCTGGCGCCGACCCCGACTCC(如SEQ ID No.1所示)。
作为优选，所述标记单链DNA探针由特定的正向引物pks I-a和反向引物pks I-b，经聚合酶链式反应扩增后，经地高辛标记后获得。
作为优选，所述正向引物pks I-a的序列为序列2：GGATACGCAGAGTTGTAGAG(如SEQID No.2所示)；所述反向引物pks I-b的序列为序列3：AGCTCGATCACTTGTATGC(如SEQ IDNo.3所示)。
作为优选，步骤(1)中预处理工艺为：取待测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.45～0.52M NaOH溶液8～12分钟，于78～80℃条件下烘1～2个小时固定DNA；在TE缓冲液中加入溶菌酶，放入DNA膜，于35～38℃温浴20分钟后，用TE缓冲液冲漂洗。
作为优选，步骤(1)中：所述溶菌酶的添加量为每毫升TE缓冲液加入4～6mg/mL溶菌酶；pH为7.5～8.0。
作为优选，步骤(2)中杂交工艺为：将经过步骤(1)预处理过的DNA膜置于8～10mL杂交缓冲液中，40～42℃温育40～45分钟；将标记单链DNA探针置于沸水8～12分钟后，置于冰浴中，取4～6mL标记单链DNA探针加入1～2mL杂交缓冲液中；将DNA膜取出置于塑料薄膜上，加入含标记单链DNA探针的杂交缓冲液中，于40～45℃下作用45～50分钟后，放置盛有2x SSC溶液的平皿内，洗涤1～2次.每次4～5分钟。
作为优选，步骤(3)中筛选工艺为：将经过步骤(2)处理过的DNA膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1分钟；弃去洗涤液，加入25mL 1％封闭液，室温放置60分钟；弃去封闭液，加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，37℃温育25分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤3次，每次35mL；在显色缓冲液中平衡2分钟后，倾倒显色液；将DNA膜置于塑料袋内.加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应；有斑点出现表示结果阳性，无斑点，即表示结果阴性。
作为优选，步骤(2)中，所述杂交缓冲液为：2×SSC溶液，48～50mM磷酸缓冲液，0.8～1mM EDTA，8～12％硫酸葡聚糖，48～50％去离子甲酰胺；pH为7.0～7.1。
作为优选，步骤(3)中，所述缓冲液为：0.1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl；pH为7.0～7.5。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)通过菌落原位斑点分子杂交，标记单链DNA探针可特异性检测待测菌株DNA样品中是否产生鳍藻毒素；
(2)具有成本低、快速、准确性及灵敏度高的特性；
(3)分析成本低，周期短，所用试剂绿色环保，对人体无害，具有较高的市场前景与经济价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1敏感性检验
(1)预处理：挑取糖螺菌(Saccharospirillaceae sp.)LZ-5菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其DNA样品，将其稀释5倍；取2uL稀释样品点于硝酸纤维素滤膜，浸于0.5M NaOH溶液10分钟后，自然干燥置于烘箱80℃烘1.5个小时固定DNA；在TE缓冲液中加入溶菌酶，溶菌酶的添加量为每毫升TE缓冲液加入5mg/mL溶菌酶；pH为7.5～8.0；放入DNA膜，于37℃温浴20分钟后，用TE缓冲液冲漂洗，去除DNA膜表面的细菌细胞残留物；
(2)将经过步骤(1)预处理过的DNA膜置于8～10mL杂交缓冲液中，杂交缓冲液为：2×SSC溶液，50mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，10％硫酸葡聚糖，50％去离子甲酰胺；pH为7.0；42℃温育45分钟；将标记单链DNA探针置于沸水8～12分钟后，置于冰浴中，取5mL标记单链DNA探针加入1.5mL杂交缓冲液中；将DNA膜取出置于塑料薄膜上，加入含标记单链DNA探针的杂交缓冲液中，于42℃下作用50分钟后，放置盛有2x SSC溶液的平皿内，洗涤2次.每次5分钟；
(3)将经过步骤(2)处理过的DNA膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1分钟；缓冲液为：0.1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl；pH为7.5；弃去洗涤液，加入25mL 1％封闭液，室温放置60分钟；弃去封闭液(0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，0.1M MgCl2，pH 8.0.)，加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，37℃温育25分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液(0.1M Tris-HCl，0.15MNaCl，pH 7.5)洗涤3次，每次35mL；在显色缓冲液(0.1M Tris，0.1M NaCl，50mM MgCl2，pH9.5)中平衡2分钟后，倾倒显色液；将DNA膜置于塑料袋内.加入BCIP/NBT显色液(0.3mg/mLNBT，0.16mg/mL BCIP，pH 9.0)中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，观察有无斑点出现。结果显示，所有DNA样品稀释液样品均呈杂交阳性。
本发明利用特定序列2和序列3所述引物，通过PCR合成了经地高辛标记的探针序列1，通过菌落原位杂交，这些探针可用于对产毒微生物菌株的快速筛选。
实施例2特异性检验
(1)预处理：1株产毒菌(硝酸盐还原菌)，9株非产毒菌(包括大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、哈维氏弧菌、杀鲑弧菌、腔隙莫拉氏菌、类志贺邻单胞菌)，分别挑取上述样品菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其DNA样品，将其稀释10倍；
取2uL稀释样品点于硝酸纤维素滤膜，浸于0.5M NaOH溶液10分钟后，自然干燥置于烘箱80℃烘1.5个小时固定DNA；在TE缓冲液中加入溶菌酶，溶菌酶的添加量为每毫升TE缓冲液加入6mg/mL溶菌酶；pH为8.0；放入DNA膜，于38℃温浴20分钟后，用TE缓冲液冲漂洗，去除DNA膜表面的细菌细胞残留物；
(2)将经过步骤(1)预处理过的DNA膜置于10mL杂交缓冲液中，杂交缓冲液为：2×SSC溶液，48mM磷酸缓冲液，0.8mM EDTA，12％硫酸葡聚糖，48％去离子甲酰胺；pH为7.0；40℃温育45分钟；将标记单链DNA探针置于沸水8分钟后，置于冰浴中，取4mL标记单链DNA探针加入2mL杂交缓冲液中；将DNA膜取出置于塑料薄膜上，加入含标记单链DNA探针的杂交缓冲液中，于40℃下作用45分钟后，放置盛有2x SSC溶液的平皿内，洗涤2次.每次5分钟；
(3)将经过步骤(2)处理过的DNA膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1分钟；缓冲液为：0.1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl；pH为7.0；弃去洗涤液，加入25mL 1％封闭液，室温放置60分钟；弃去封闭液(0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，0.1M MgCl2，pH 8.0)，加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，37℃温育25分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液(0.1M Tris-HCl，0.15MNaCl，pH 7.5)洗涤3次，每次35mL；在显色缓冲液(0.1M Tris，0.1M NaCl，50mM MgCl2，pH9.5)中平衡2分钟后，倾倒显色液；将DNA膜置于塑料袋内.加入BCIP/NBT显色液(0.3mg/mLNBT，0.16mg/mL BCIP，pH 9.0)中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，观察有无斑点出现；结果显示，1株产毒菌株均有斑点反应，其它9株菌均无斑点出现(表1)。
以上经过斑点检测显示为阳性的菌株，均可通过其发酵代谢产物的化学检测确认其产DTXs毒素；而经斑点检测为阴性的菌株，通过其发酵代谢产物的化学检测确认其不产DTXs毒素。表明本方法特异性强，检测结果准确可靠。
表1.检测结果
菌株Bacterial species 编号Strain No. 杂交结果
糖螺菌Saccharospirillaceae sp.LZ-5 CCTCC AB 2017232 +
大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 25922 —
宋氏志贺氏菌(Shigella sonnet) ATCC 29930 —
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538 —
腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata) ATCC 17952 —
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC 23857 —
杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida) ATCC 43839 —
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853 —
类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides) ATCC 14029 —
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ATCC BB120 —
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 182
<212> DNA
<213> 聚酮合成酶(type I polyketide synthase)
<400> 1
tgaccctgtg acaccgaccg acctccgacc gaccctcgac ccttagcctg gtcctcttga 60
ctggactagg ccgaccgaac ctcgtcactc gacctagccc tcctggactg ttcctacgaa 120
tatctgaccg atggcgacct cctacgccgc ttcgcgactc ctctggcgcc gaccccgact 180
cc 182
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 聚酮合成酶DNA探针的正向引物(type I polyketide synthase)
<400> 2
ggatacgcag agttgtagag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 聚酮合成酶DNA探针的反向引物(type I polyketide synthase)
<400> 3
agctcgatca cttgtatgc 19

Claims (9)

1.一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：制作并固定待测菌株的DNA；
(2)杂交：将待测菌株的DNA与标记单链DNA探针进行杂交作用；
(3)筛选：通过特异性检测待测菌株是否产生鳍藻毒素；
其中，步骤(2)中，所述标记单链DNA探针为利用经地高辛标记的含有182个碱基的序列1所述的单链DNA探针，所述序列1为：
TGACCCTGTGACACCGACCGACCTCCGACCGACCCTCGACCCTTAGCCTGGTCCTCTTGACTGGACTAGGCCGACCGAACCTCGTCACTCGACCTAGCCCTCCTGGACTGTTCCTACGAATATCTGACCGATGGCGACCTCCTACGCCGCTTCGCGACTCCTCTGGCGCCGACCCCGACTCC。
2.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述标记单链DNA探针由特定的正向引物pks I-a和反向引物pks I-b，经聚合酶链式反应扩增后，经地高辛标记后获得。
3.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述正向引物pks I-a的序列为：GGATACGCAGAGTTGTAGAG；所述反向引物pks I-b的序列为：AGCTCGATCACTTGTATGC。
4.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤(1)中预处理工艺为：取待测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.45～0.52M NaOH溶液8～12分钟，于78～80℃条件下烘1～2个小时固定DNA；在TE缓冲液中加入溶菌酶，放入DNA膜，于35～38℃温浴20分钟后，用TE缓冲液冲漂洗。
5.根据权利要求4所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤(1)中：所述溶菌酶的添加量为每毫升TE缓冲液加入4～6mg/mL溶菌酶；pH为7.5～8.0。
6.根据权利要求4或5所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤(2)中杂交工艺为：将经过步骤(1)预处理过的DNA膜置于8～10mL杂交缓冲液中，40～42℃温育40～45分钟；将标记单链DNA探针置于沸水8～12分钟后，置于冰浴中，取4～6mL标记单链DNA探针加入1～2mL杂交缓冲液中；将DNA膜取出置于塑料薄膜上，加入含标记单链DNA探针的杂交缓冲液中，于40～45℃下作用45～50分钟后，放置盛有2x SSC溶液的平皿内，洗涤1～2次.每次4～5分钟。
7.根据权利要求6所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤(3)中筛选工艺为：将经过步骤(2)处理过的DNA膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1分钟；弃去洗涤液，加入25mL 1％封闭液，室温放置60分钟；弃去封闭液，加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，37℃温育25分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤3次，每次35mL；在显色缓冲液中平衡2分钟后，倾倒显色液；将DNA膜置于塑料袋内.加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应；有斑点出现表示结果阳性，无斑点，即表示结果阴性。
8.根据权利要求6所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述杂交缓冲液为：2×SSC溶液，48～50mM磷酸缓冲液，0.8～1mM EDTA，8～12％硫酸葡聚糖，48～50％去离子甲酰胺；pH为7.0～7.1。
9.根据权利要求7所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲液为：0.1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl；pH为7.0～7.5。
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