CN112176034B - 一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法 - Google Patents

一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋生物技术领域，针对产海葵毒素微生物的快速筛选方法的技术空白的问题，公开了一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，包括如下步骤：（1）获取菌株DNA；（2）获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中后再置于冰浴中，取DNA探针溶液加入到杂交液中；（3）杂交：将DNA膜置于DNA探针杂交液中，温育杂交；将杂交后的DNA膜放置于盛有2 x SSC溶液容器内洗涤；（4）显色；（5）结果判定。将DNA探针‑菌落原位杂交方法用于产海葵毒素微生物菌株的快速筛选，通过特异性扩增的DNA探针及简单有序的操作步骤来精准的筛选出能够产海葵毒素的菌株，此方法简单高效，筛选周期短，准确度高。

Description

一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，尤其是涉及一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法。
背景技术
海葵毒素(Palytoxins，PLTXs)是已知毒性最强的非蛋白类藻毒素之一，被列为最大的非聚合天然产物之一；属高毒性、脂溶性、热稳定聚醚类海洋生物毒素；是分布最广，发病率最高的海洋毒素之一。可对肠道、肝脏、神经、胎盘等多种器官与组织造成不可逆损伤，且中毒后无特效药救治，海葵毒素严重危害海洋生态系统安全及人类健康，成为世界性研究热点。海葵毒素属神经毒素，在有害赤潮检测、神经生理学、医学诊断、药物开发、生化战剂等研究中均有重要应用。目前，海葵毒素可通过产毒甲藻的规模培养及产物提取制备获得，该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。而与甲藻相比，海洋微生物具有易培养、代谢调控相对简单等特性，因此，利用海洋微生物发酵产生及制备海葵毒素，是一种经济、高效的替代方法。海洋微生物是产海葵毒素的另一个重要来源。其具有易培养、代谢调控相对简单等特性，因此，利用产毒海洋微生物发酵制备，是一条行之有效的方法。其关键技术是产毒菌株的快速筛选，目前主要可通过代谢产物化学分析来实现，该方法不仅工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。而目前尚无产海葵毒素菌株的快速筛选技术，所以探寻有效的产海葵毒素微生物的快速筛选方法具有重要的意义。
发明内容
本发明是为了克服产海葵毒素微生物的快速筛选方法的技术空白的问题，提供一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，将DNA探针-菌落原位杂交方法用于产海葵毒素微生物菌株的快速筛选，通过特异性扩增的DNA探针及简单有序的操作步骤来精准的筛选出能够产海葵毒素的菌株，此方法简单高效，筛选周期短，准确度高。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，包括如下步骤：
(1)获取菌株DNA：取被试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于NaOH溶液中，自然干燥后置于烘箱烘干；置于溶菌酶溶液中，去除硝酸纤维素膜表面被试菌株细胞残留物；
(2)获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中后再置于冰浴中，取DNA探针溶液加入到杂交液中；
(3)杂交：将步骤(1)获取的DNA膜置于步骤(2)的DNA探针杂交液中，温育杂交；将杂交后的DNA膜放置于盛有2x SSC溶液容器内洗涤；
(4)显色：将步骤(3)中洗涤后的DNA膜依次分别放置于缓冲液、封闭液、碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液、冲洗液及显色缓冲液后，将DNA膜置于容器内.加入显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，观察反应结果；
(5)结果判定：有斑点出现，表示结果阳性；无斑点，即表示结果阴性。
本发买那个依次通过将被试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜上，制备形成DNA膜并将被试菌株DNA稳定在硝酸纤维素膜，在将其与地高辛标记的DNA探针进行杂交，杂交结束后利用显色液进行显色反应，再观察结果，有斑点出现的表示结果阳性，即能够产生产海葵毒素，无斑点为阴性，此鉴定方法快速高效，可操作性强。
作为优选，步骤(1)的具体过程为：取被试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.4-0.44M NaOH溶液6-8min，自然干燥后置于60-65℃烘1-1.2h，烘烤完毕后置于5-5.2mg/mL、pH 8-8.4的溶菌酶溶液中，在36-38℃下温浴14-18min，再用TE缓冲液冲去DNA膜表面微生物细胞残留物。
在烘箱中进行烘烤的目的是为了将DNA稳定的固定在硝酸纤维素膜上，防止DNA从膜上脱落，进而影响后续的杂交结果及最终的判定结果。
作为优选，步骤(2)的具体过程为：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中5-7min后，放置于冰浴中，取DNA探针溶液以体积比1:1-1.2加入到杂交液中。
作为优选，步骤(3)的具体过程为：将DNA膜置于DNA探针杂交液中，40-42℃温育25-30min进行杂交，将杂交后的DNA膜放置于盛有2x SSC溶液中洗涤2-3次，每次4-5min。
作为优选，步骤(4)的具体过程为：将DNA膜放至盛有缓冲液的容器中洗1-2min，弃去洗涤液，DNA膜加入质量分数1-2％的封闭液，室温放置30-35min，弃去封闭液，加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36-38℃温育20-25min，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤2-3次，DNA膜在显色缓冲液中平衡2-3min后，倾倒显色液，将DNA膜置于容器中，加入BCIP/NBT显色液，置于暗处，待显色后，加入TE溶液终止反应。
此处NBT代表氯化硝基四氮唑兰，BCIP代表甲苯胺蓝。
作为优选，所述杂交液成分为：2×SSC溶液，40-42mM磷酸缓冲液，0.54-0.6mMEDTA，质量浓度8-10％硫酸葡聚糖，质量浓度40-42％去离子甲酰胺，pH 7.2-7.4。
作为优选，步骤(2)中DNA膜与DNA探针溶液的比例为6*6cm2：8-10ml；步骤(4)中DNA膜与缓冲液的比值为6*6cm2：18-22ml，封闭液、冲洗液、显色缓冲液、显色液与缓冲液的体积相当。
DNA探针溶液的体积只需要在DNA膜平铺的时候能够将其覆盖就可以，加入过多的量会造成浪费，加入的量过少则使DNA之间杂交不充分。
作为优选，缓冲液为：0.14-0.16M顺丁烯二酸，0.12-0.14M NaCl，pH7.2-7.4；封闭液为:0.14-0.16M Tris-HCl、0.08-0.12M NaCl、0.1-0.12M MgCl2、pH 7-7.4；冲洗液为：0.1-0.12M Tris-HCl、0.14-0.16M NaCl、pH 7.2-7.3；显色缓冲液为：0.14-0.16M Tris、0.14-0.16M NaCl、30-32mM MgCl2、pH 8.4-8.6；显色液为：0.20-0.22mg/mL NBT、0.1-0.12mg/mL BCIP、pH9-9.2。
此处缓冲液、封闭液、冲洗液、显色缓冲液、显色液与缓冲液，之间的处理循序不能有更改，只有依次进行处理才能尽可能除去杂质，使得最终的显色效果达到最佳。这里各液体的浓度范围也是取决于所筛选的菌株种类，不具有普适性，只有在这些范围内的的溶液才能使最终的判定结果准确，减小筛选方法的筛选误差。
作为优选，所述地高辛标记的DNA探针是利用特定引物序列2和序列3合成的单链DNA探针序列1，序列1如SEQ ID NO.1为：GCCTGCTCCGGCACCCGCCCTGCCGACGCCCTTGCAGCCTGACCGCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGGCCAGCCGCCTCCGCCGTCGCACTCGACCTAGCGGCGCCCCTCCTGGACTGTTCCTACGAATATCGGCATCCGAGGCGCCGACGCGGCCCCTCCTACGCCGCGCTTCGCCGACTCCTGCCTCCTGCGGGCCGCCCGACCGCGACTCCTGACGTGACTCTCAACGCACGCTCCTCCGCCTCCTCTGGCAAGGCGCGCTAC。
作为优选，所述序列2是正向引物PKS-a如SEQ ID NO.2：TTGTTTAAGTTAGTGCGTAGGTGTAAGTGAG；
所述序列3是反向引物PKS-b如SEQ ID NO.3：TCTGCTGTCTGACTCGGCTTTTGTC。
地高辛标记的DNA探针的利用特定的引物序列扩增出来的，专门进一步与被试菌株杂交，再对杂交的结果进行针对性筛选的，此处的基因序列是第一无二的。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)提供一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，将DNA探针-菌落原位杂交方法用于产海葵毒素微生物菌株的快速筛选，通过特异性扩增的DNA探针及简单有序的操作步骤来精准的筛选出能够产海葵毒素的菌株，此方法简单高效，筛选周期短，准确度高；
(2)从DNA膜的制备到DNA的引物序列，再后后续所采用的溶液浓度范围都是针对本发明的产海葵毒素微生物所特定的，其特异性决定了最终筛选的准确度，本发明具有较高的特异性。
附图说明
图1是样品检测的DNA杂交示意图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，包括如下步骤：
(1)获取菌株DNA：取被试菌株单菌落点于6*6cm2硝酸纤维素膜，浸于0.4-0.44MNaOH溶液6-8min，自然干燥后置于60-65℃烘1-1.2h，烘烤完毕后置于5-5.2mg/mL、pH 8-8.4的溶菌酶溶液中，在36-38℃下温浴14-18min，再用TE缓冲液冲去DNA膜表面微生物细胞残留物；
(2)获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中5-7min后，放置于冰浴中，取DNA探针溶液以体积比1:1-1.2加入到杂交液中；杂交液成分为：2×SSC溶液，40-42mM磷酸缓冲液，0.54-0.6mM EDTA，质量浓度8-10％硫酸葡聚糖，质量浓度40-42％去离子甲酰胺，pH 7.2-7.4；
所述地高辛标记的DNA探针是利用特定引物序列2和序列3合成的单链DNA探针序列1，序列1为：GCCTGCTCCGGCACCCGCCCTGCCGACGCCCTTGCAGCCTGACCGCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGGCCAGCCGCCTCCGCCGTCGCACTCGACCTAGCGGCGCCCCTCCTGGACTGTTCCTACGAATATCGGCATCCGAGGCGCCGACGCGGCCCCTCCTACGCCGCGCTTCGCCGACTCCTGCCTCCTGCGGGCCGCCCGACCGCGACTCCTGACGTGACTCTCAACGCACGCTCCTCCGCCTCCTCTGGCAAGGCGCGCTAC。
所述序列2是正向引物PKS-a：TTGTTTAAGTTAGTGCGTAGGTGTAAGTGAG；所述序列3是反向引物PKS-b：TCTGCTGTCTGACTCGGCTTTTGTC。
(3)杂交：将步骤(1)获取的DNA膜置于8-10ml步骤(2)的DNA探针杂交液中，40-42℃温育25-30min进行杂交，将杂交后的DNA膜放置于盛有2x SSC溶液中洗涤2-3次，每次4-5min；
(4)显色：将DNA膜放至盛有18-22ml缓冲液的容器中洗1-2min，弃去洗涤液，DNA膜加入质量分数1-2％的18-22ml封闭液，室温放置30-35min，弃去封闭液，加入18-22ml碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36-38℃温育20-25min，弃去抗体结合物，用18-22ml冲洗液洗涤2-3次，DNA膜在18-22ml显色缓冲液中平衡2-3min后，倾倒显色液，将DNA膜置于容器中，加入18-22ml BCIP/NBT显色液，置于暗处，待显色后，加入TE溶液终止反应；
缓冲液为：0.14-0.16M顺丁烯二酸，0.12-0.14M NaCl，pH7.2-7.4；封闭液为:0.14-0.16M Tris-HCl、0.08-0.12M NaCl、0.1-0.12M MgCl2、pH 7-7.4；冲洗液为：0.1-0.12M Tris-HCl、0.14-0.16M NaCl、pH 7.2-7.3；显色缓冲液为：0.14-0.16M Tris、0.14-0.16M NaCl、30-32mM MgCl2、pH 8.4-8.6；显色液为：0.20-0.22mg/mL NBT、0.1-0.12mg/mLBCIP、pH 9-9.2。
(5)结果判定：有斑点出现，表示结果阳性；无斑点，即表示结果阴性。
实施例1(本发明的敏感性检验)
(1)样品：海洋细菌Nioella sp.LZ7-4(CCTCC AB 2017231)购买自中国典型培养物保藏中心，其代谢产物化学分析确认产毒素。
(2)样品处理：挑取LZ7-4菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其基因组DNA样品，将其稀释8倍后备用。
(3)获取菌株DNA：取1μL及2μL上述细菌DNA样品点于6*6cm2硝酸纤维素滤膜，浸于0.42M NaOH溶液内，作用6min，取出膜放入烘箱60℃烘1个小时以固定细菌DNA。然后置于溶菌酶(5mg/mL，pH 8.2)溶液中，37℃下温浴15min。用TE缓冲液冲去膜表面的细菌细胞残留物。
(4)获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中5min后，放置于冰浴中，取5mLDNA探针溶液加入到5.0mL杂交液中。
(5)杂交：将获取的DNA膜置于10mL含有DNA探针的杂交液中，40℃温育30min进行杂交。将杂交后的硝酸纤维素膜放置于盛有2x SSC溶液平皿内，洗涤2次.每次4min。
(6)显色：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1min。弃去洗涤液，加入20mL 1％封闭液，室温放置30min。弃去封闭液，加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，37℃温育20min，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤2次，每次20mL。在显色缓冲液中平衡2min后，倾倒显色液。将膜置于玻璃平皿中，加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应。观察有无斑点出现。
(7)结果显示，所有DNA样品稀释液样品均呈杂交阳性。本发明利用特定序列2和序列3所述引物，通过PCR合成了经地高辛标记的探针序列1，通过菌落原位杂交，这些探针可用于对产毒微生物菌株的快速筛选。
实施例2(本发明的敏感性检验)
(1)样品：海洋细菌Nioella sp.LZ7-4(CCTCC AB 2017231)购买自中国典型培养物保藏中心，其代谢产物化学分析确认产毒素。
(2)样品处理：挑取LZ7-4菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其基因组DNA样品，将其稀释5倍后备用。
(3)获取菌株DNA：取1μL及2μL上述细菌DNA样品点于6*6cm2硝酸纤维素滤膜，浸于0.4M NaOH溶液内，作用7min，取出膜放入烘箱62℃烘1.1小时以固定细菌DNA。然后置于溶菌酶(5.1mg/mL，pH 8.3)溶液中，36℃下温浴14min。用TE缓冲液冲去膜表面的细菌细胞残留物。
(4)获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中6min后，放置于冰浴中，取5mLDNA探针溶液加入到5.0mL杂交液中。
(5)杂交：将获取的DNA膜置于8mL含有DNA探针的杂交液中，41℃温育30min进行杂交。将杂交后的硝酸纤维素膜放置于盛有2x SSC溶液平皿内，洗涤2次.每次4min。
(6)显色：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1min。弃去洗涤液，加入20mL 1％封闭液，室温放置30min。弃去封闭液，加入21mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36℃温育22min，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤2次，每次20mL。在显色缓冲液中平衡2min后，倾倒显色液。将膜置于玻璃平皿中，加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应。观察有无斑点出现。
(7)结果显示，所有DNA样品稀释液样品均呈杂交阳性。本发明利用特定序列2和序列3所述引物，通过PCR合成了经地高辛标记的探针序列1，通过菌落原位杂交，这些探针可用于对产毒微生物菌株的快速筛选。
实施例3(本发明的敏感性检验)
(1)样品：海洋细菌Nioella sp.LZ7-4(CCTCC AB 2017231)购买自中国典型培养物保藏中心，其代谢产物化学分析确认产毒素。
(2)样品处理：挑取LZ7-4菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其基因组DNA样品，将其稀释10倍后备用。
(3)获取菌株DNA：取1μL及2μL上述细菌DNA样品点于6*6cm2硝酸纤维素滤膜，浸于0.44M NaOH溶液内，作用8min，取出膜放入烘箱65℃烘1.2小时以固定细菌DNA。然后置于溶菌酶(5.2mg/mL，pH 8.4)溶液中，38℃下温浴18min。用TE缓冲液冲去膜表面的细菌细胞残留物。
(4)获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中7min后，放置于冰浴中，取5mLDNA探针溶液加入到6mL杂交液中。
(5)杂交：将获取的DNA膜置于9mL含有DNA探针的杂交液中，42℃温育28min进行杂交。将杂交后的硝酸纤维素膜放置于盛有2x SSC溶液平皿内，洗涤3次.每次4.5min。
(6)显色：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗2min。弃去洗涤液，加入22mL 1％封闭液，室温放置32min。弃去封闭液，加入22mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，38℃温育25min，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤2次，每次18mL。在显色缓冲液中平衡2min后，倾倒显色液。将膜置于玻璃平皿中，加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应。观察有无斑点出现。
(7)结果显示，所有DNA样品稀释液样品均呈杂交阳性。本发明利用特定序列2和序列3所述引物，通过PCR合成了经地高辛标记的探针序列1，通过菌落原位杂交，这些探针可用于对产毒微生物菌株的快速筛选。
实施例4(本发明的特异性检验)
(1)样品：1株产毒菌(Nioella sp.LZ7-4)购买自中国典型培养物保藏中心。9株非产毒菌(包括大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、哈维氏弧菌、杀鲑弧菌、腔隙莫拉氏菌、类志贺邻单胞菌)，均购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，菌株编号见表1。
(2)获取菌株DNA：取12μL稀释样品点于6*6cm2硝酸纤维素滤膜，浸于0.42M NaOH溶液内，作用6分钟，取出膜放入烘箱60℃烘1个小时以固定细菌DNA。然后置于溶菌酶(5mg/mL，pH 8.2)溶液中，37℃下温浴15分钟。用TE缓冲液冲去膜表面的细菌细胞残留物。
(3)获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中5分钟后，放置于冰浴中，取5mLDNA探针溶液加入到5.0mL杂交液中。
(4)杂交：将获取的DNA膜置于10mL含有DNA探针的杂交液中，40℃温育30分钟进行杂交。将杂交后的硝酸纤维素膜放置于盛有2x SSC溶液平皿内，洗涤2次.每次4分钟。
(5)显色：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1分钟。弃去洗涤液，加入20mL 1％封闭液，室温放置30分钟。弃去封闭液，加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，37℃温育20分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤2次，每次20mL。在显色缓冲液中平衡2分钟后，倾倒显色液。将膜置于玻璃平皿中，加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应。观察有无斑点出现。
(6)结果，1株产毒菌株有阳性斑点出现，其它9株菌无斑点出现(结果如表1及图1所示)。
(7)以上经过斑点检测显示为阳性的菌株，均可通过其发酵代谢产物的化学检测确认其产毒素；而经斑点检测为阴性的菌株，通过其发酵代谢产物的化学检测确认其不产毒素。表明本方法特异性强，检测结果准确可靠。
表1特异性检验结果
编号 菌株Bacterial species 菌株号Strain No. 结果
1 Nioella sp.LZ7-4 CCTCC AB 2017231 +
2 大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 25922 —
3 宋氏志贺氏菌(Shigella sonnet) ATCC 29930 —
4 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538 —
5 腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata) ATCC 17952 —
6 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC 23857 —
7 杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida) ATCC 43839 —
8 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853 —
9 类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides) ATCC 14029 —
图1中，纵坐标a为样品DNA量1μL；b为样品DNA量2μL；横坐标1代表Nioellasp.LZ7-4；2代表大肠杆菌(Escherichia coli)；3代表宋氏志贺氏菌(Shigella sonnet)；4代表金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；5代表腔隙莫拉氏菌(Moraxellalacunata)；6代表枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；7代表杀鲑弧菌(Vibriosalmonicida)；8代表铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；9代表类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)；10代表哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。说明本实验快速筛选的特异性强，准确度高。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 舟山海关综合技术服务中心
<120> 一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctgctccg gcacccgccc tgccgacgcc cttgcagcct gaccgcctgg tccctccttg 60
gactagggcc agccgcctcc gccgtcgcac tcgacctagc ggcgcccctc ctggactgtt 120
cctacgaata tcggcatccg aggcgccgac gcggcccctc ctacgccgcg cttcgccgac 180
tcctgcctcc tgcgggccgc ccgaccgcga ctcctgacgt gactctcaac gcacgctcct 240
ccgcctcctc tggcaaggcg cgctac 266
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtttaagt tagtgcgtag gtgtaagtga g 31
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgctgtct gactcggctt ttgtc 25

Claims (8)

1.一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，包括如下步骤：
（1）获取菌株DNA：取被试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于NaOH溶液中，自然干燥后置于烘箱烘干；置于溶菌酶溶液中，去除硝酸纤维素膜表面被试菌株细胞残留物；
（2）获得DNA探针杂交液：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中后再置于冰浴中，取DNA探针溶液加入到杂交液中；
（3）杂交：将步骤（1）获取的DNA膜置于步骤（2）的DNA探针杂交液中，温育杂交；将杂交后的DNA膜放置于盛有2 x SSC溶液容器内洗涤；
（4）显色：将步骤（3）中洗涤后的DNA膜依次分别放置于缓冲液、封闭液、碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液、冲洗液及显色缓冲液后，将DNA膜置于容器内．加入显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，观察反应结果；
（5）结果判定：有斑点出现，表示结果阳性；无斑点，即表示结果阴性；
所述地高辛标记的DNA探针是利用特定引物序列2和序列3合成的单链DNA探针序列1，序列1如SEQ ID NO.1所示为：GCCTGCTCCGGCACCCGCCCTGCCGACGCCCTTGCAGCCTGACCGCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGGCCAGCCGCCTCCGCCGTCGCACTCGACCTAGCGGCGCCCCTCCTGGACTGTTCCTACGAATATCGGCATCCGAGGCGCCGACGCGGCCCCTCCTACGCCGCGCTTCGCCGACTCCTGCCTCCTGCGGGCCGCCCGACCGCGACTCCTGACGTGACTCTCAACGCACGCTCCTCCGCCTCCTCTGGCAAGGCGCGCTAC；
所述序列2是正向引物PKS-a如SEQ ID NO.2：TTGTTTAAGTTAGTGCGTAGGTGTAAGTGAG；所述序列3是反向引物PKS-b如SEQ ID NO.3：TCTGCTGTCTGACTCGGCTTTTGTC。
2.根据权 利要求1所述的一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，步骤（1）的具体过程为：取被试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.4-0.44M NaOH溶液6-8min，自然干燥后置于60-65℃烘1-1.2h，烘烤完毕后置于5-5.2 mg/mL、pH 8-8.4的溶菌酶溶液中，在36-38℃下温浴14-18min，再用TE缓冲液冲去DNA膜表面微生物细胞残留物。
3.根据权 利要求1所述的一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，步骤（2）的具体过程为：将地高辛标记的DNA探针溶液置于沸水中5-7min后，放置于冰浴中，取DNA探针溶液以体积比1:1-1.2加入到杂交液中。
4.根据权 利要求1所述的一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，步骤（3）的具体过程为：将DNA膜置于DNA探针杂交液中，40-42℃温育25-30min进行杂交，将杂交后的DNA膜放置于盛有2 x SSC溶液中洗涤2-3次，每次4-5min。
5.根据权 利要求1所述的一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，步骤（4）的具体过程为：将DNA膜放至盛有缓冲液的容器中洗1-2min，弃去洗涤液，DNA膜加入质量分数1-2%的封闭液，室温放置30-35min，弃去封闭液，加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36-38℃温育20-25min，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤2-3次，DNA膜在显色缓冲液中平衡2-3min后，倾倒显色液，将DNA膜置于容器中，加入BCIP /NBT显色液，置于暗处，待显色后，加入TE溶液终止反应。
6.根据权 利要求1或3所述的一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，所述杂交液成分为：2 × SSC溶液，40-42 mM 磷酸缓冲液，0.54-0.6mM EDTA，质量浓度8-10%硫酸葡聚糖，质量浓度40-42%去离子甲酰胺，pH 7.2-7.4。
7.根据权 利要求1或4所述的一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，步骤（2）中DNA膜与DNA探针溶液的比例为6*6cm2：8-10ml；步骤（4）中DNA膜与缓冲液的比值为6*6cm2：18-22ml，封闭液、冲洗液、显色缓冲液、显色液与缓冲液的体积相当。
8.根据权 利要求1或5所述的一种产海葵毒素微生物的快速筛选方法，其特征是，缓冲液为：0.14-0.16 M 顺丁烯二酸，0.12-0.14M NaCl，pH7.2-7.4；封闭液为: 0.14-0.16MTris-HCl、0.08-0.12M NaCl、0.1-0.12 M MgCl2、pH 7-7.4；冲洗液为：0.1-0.12 M Tris-HCl、0.14-0.16 M NaCl、pH 7.2-7.3；显色缓冲液为：0.14-0.16 M Tris、0.14-0.16MNaCl、30-32 mM MgCl2、pH 8.4-8.6；显色液为：0.20-0.22 mg/mL NBT、0.1-0.12 mg/mLBCIP、pH 9-9.2。
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