JPH04500316A

JPH04500316A - 淋菌を検出するための核酸プローブ

Info

Publication number: JPH04500316A
Application number: JP2510082A
Authority: JP
Inventors: バーンズ，スーザン・エム; ホルバート，ドナルド・エヌ; レーン，デビッド・ジェイ
Original assignee: ジーン―トラック・システムス
Priority date: 1989-05-24
Filing date: 1990-05-22
Publication date: 1992-01-23
Also published as: EP0426843B1; AU5966990A; DE69022362D1; CA2031490A1; ATE127856T1; WO1990014442A1; EP0426843A1; DE69022362T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】淋菌を検出するための核酸プローブ発明の分野本発明はナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する細菌を検出することに関するものであり、より詳細には淋菌（Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を特異的に検出するための核酸プローブおよび組成物ならびにそれらの使用法を提供するものである。

発明の背景ここで用いる〃淋菌〃という語はＢｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（クリーブ（Ｎ、Ｒ，Ｋｒ　ｉ　ｅｇ）［６＠］、１９８４．ｐｐ、４９８−５０６．ウィリアムス・アンド・ウィルキンス）にそのように分類されている細菌を意味する。淋菌の検出は種々の医学的および公衆保健の関係において重要である。淋菌は性的に伝搬される流行性疾患の生な病原体であり、米国で１９８３年に約１００万の症例が報告されている。

この病原体に感染すると臨床的に多様に発現し、尿道炎、子宮頸管炎および直腸肛門炎が最も一般的である。しかし感染はしばしば入院を要する疾患、たとえば子宮内膜炎、卵管炎および骨盤炎症性疾患を引き起こす。

従って本発明の観点は淋菌を迅速に検出することができ、かつあらゆる種類の臨床試料に一般的に適用しうるハイブリダイゼーションアッセイ系に用いる核酸プローブを提供することである。

この微生物により起こる疾患の範囲および重篤性のため、臨床試料からの検出法が各種開発されたが、現在疾病コントロールセンター、公衆保健協会または米国微生物学会によりこの微生物を男女の検体から検出するために推奨されている唯一の方法は主として培養に依存する。

生存しうる微生物を培養により最大限に回収するためには、採取したばかりの検体を適宜な選択培地（たとえばテイヤーーマーチン培地）上に直ちに平板接種し、低酸素雰囲気（３−１０％Ｃｏ、）で３５℃において増殖させる。直ちに接種することができない場合、試料が６時間以内保持されるならば非栄養性の輸送用系を使用しつる。試料を６時間以内に接種できない場合は、増殖培地およびＣ０２源を含む栄養性の輸送用系を用いることができる。選択培地への接種ののち、培養物を３４−３６℃で３−１０％ＣＯ２環境において２８−４８時間インキュベートする。ナイセリア属である疑いのあるコロニーをダラム染色し、オキシダーゼ活性を調べる。オキシダーゼ陽性、グラム陰性の双球菌はナイセリア属菌種を指示するものであり、ついで淋菌であることを確認しなければならない。培養部位は種々の非病原性ナイセリア属菌を含むからである。確認は多様な方法で実施しつるが、炭水化物の利用、ラテックスの凝集またはイムノフルオレッセンス試験によりおこなうのが最も一般的である。しかしこれらの確認試験は労力を要し、時間がかかり、しばしば追加のインキュベーションおよび／または増殖期間を必要とする。

本発明の他の観点は、伝統的な培養法に付随する欠点を避けることである。

淋菌を臨床試料から直接に確認するための酵素イムノアッセイ法は数年前に得られた（ゴノザイム（Ｇｏｎｏｚｙｍｅ、商標）、アボット・ラボラトリーズ、イリノイ州シカゴ）が、各種の臨床研究により、この試験法は感度および特異性を欠くことが示された。このアッセイ法は実施するのに３−４時間を必要とし、特殊なシグナル検出装置が必要である。

本発明の他の観点は、酵素イムノアッセイに付随する欠点を避けること、および核酸プローブを用いて淋菌を検出することである。

さらに他の観点は、臨床試料中の淋菌を特異的に検出しつる核酸プローブおよびハイブリダイゼーション法を提供することである。

ここで用いるプローブとは、特定の予め定められたストリンジエンシーにおいてターゲット核酸配列に特異的に（すなわち優先的に、後記のハイブリダイゼーションの項を参照されたい）ハイブリダイズしつる特異的ヌクレオチド配列を設計または選択により含む、合成によりまたは生物学的に形成された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。

ハイブリダイゼーションとは、予め定められた反応条件下で２本の部分的または完全に相補的な核酸ストランドが逆平行に合わさって、特異的かつ安定な水素結合を形成する過程であると伝統的に理解されている。

トラテン（Ｔｏｔｔｅｎ）ら（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔ１ｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９８３．１４８：４６２−４７１）は、臨床検体中の淋菌をこの細菌に一般に付随するいわゆる潜在（ｃｒｙｐｔｉｃ）プラスミドに対するＤＮＡプローブにより検出することにつき記載している。しかし淋菌分離物におけるこのプラスミドの存在は地域性が高いことは周知であり（米国の異なる地方で７８％から９８％の分離物中に見られる）、被験試料中のその存在に基づ（アッセイの変動性が高Ｃ・ことが予想される。

本発明のさらに他の観点は、淋菌のすべての菌株に共通な核酸配列にハイブリダイズするが、被験試料中に存在する共食性の非−淋菌または他のフローラにはハイブリダイズしないプローブを提供することにより、この変動源を排除することである。

ローおよびヤングら（欧州特許出願第８７１０１２１５．９号明細書）は、淋菌の染色体遺伝子に対する核酸プローブの分離につき記載している。これらのプローブは淋菌の６ｍ株を特異的に認識し、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｊｎｇｉ　ｔ　１ｄｉｓ）の６菌株には交叉ハイブリダイズしないことを目的とする。ヴエルヘル（Ｗｅｌｃｈｅｒ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１９８６゜１．４　：１００２７−１００４４）も染色体をターゲットとするＤＮＡプローブの分離を記載している。これらのプローブはそれらが選択された菌株および淋菌の６臨床分離物を特異的に認識し、他の淋菌７菌株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、共食細菌ブランハメラ・カタラリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａＩｉｓ）にはハイブリダイズしないことを目的とする。しかし広範な生物に対する上記プローブの試験は報告されなかった。また、それらの染色体ターゲット配列は各細胞において低いコピー数で提示されているので、報告されたアッセイ法は必ずしもきわめて高感度ではなく、従って臨床用途におけるそれらの有用性は著しく限定される。

本発明の他の観点は、淋菌に対する高い特異性と、ターゲット細菌中に多量に存在するリポソームＲＮＡ分子にハイブリダイズするプローブの使用による高い感度を兼ね備えた核酸プローブを提供することである。

リポソームは遺伝情報を細胞蛋白質、すなわち生命の生な構造要素および触媒要素を二翻訳する既知の唯一の手段として作用するので、すべての生物にとって極めて重要である。この重要性の明らかな証拠は、すべての細胞がリポソームを含むことである。

リポソームは３種類の別個のＲＮＡ分子を含み、これらは少なくとも大腸菌においては５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡと呼ばれる。これらの名称は歴史的に、それらの沈降速度で測定したＲＮＡ分子の大きさに関係する。しかし実際には、’）　＋４＋ノ一ムＲＮ人分子の大きさは生物間で若干具なる。それにもかかわらず５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡがいずれの細菌においても相同ＲＮＡ分子に対する総称として慣用され、ここでもこの慣例に従う。

コーン（Ｋｏｈｎｅ）ら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ、８：１１０４−１１１８．１９６８）はｒＲＮＡ配列に対するプローブの製法について論じているが、淋菌特異性プローブの調製に必要な教示を行っていない。

ベース（ｐ　ａ　ｃ　ｅ）およびキャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌ　１ＨＪｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１０７：５４３−５４７．１９７１）は、多数の細菌種からのリポソームリポ核酸の相同性、およびこの相同性を定量するためのハイブリダイゼーション法について論じている。同様にソージン（Ｓｏｇｉｎ）、ソージンおよびベーゼ（Ｗｏｅｓｅ）（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、１：１７３−１８４．１９７２）は異なるリポソームＲＮＡ分子の一次構造解析を系統発生関係の評価に利用することの理論的および実際的観点につき論じている。フォックス（Ｆａｘ）、ペヒマン（Ｐｅｃｈｍａｎ）およびベーゼ（Ｗｏｅｓｅ）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２７：４４−５７．１９７７）は、原核細胞系統学の研究法としての１６８リポソームＲＮＡの比較カタログ作成について論じている。しかしこれらの参考文献は淋菌に関するコーンの教示の欠陥を解決し得ておらず、特に臨床試料中の淋菌を検出するアッセイ法に有用な淋菌特異性プローブを提供しない。

ホーガンら（欧州特許出願公開８８１０３９５７号明細書）は、淋菌ｒ　ＲＮＡに特異的であると主張する多数のプローブを記載している。しかしホーガンらは彼らのプローブが彼らの意図するプローブにハイブリダイズしたことを証明したにすぎない。これは過去の、はとんど新規性のない結論である。いずれのプローブも他の菌株の淋菌にハイブリダイズすることを示唆するデータは示されていない。またプローブの特異性は関連するナイセリア属数菌種（８）のうちわずか単一菌株に対するハイブリダイゼーションの欠如により判定されている。いずれのプローブが主張される特異性をもつのか、すなわちそれらがすべてまたは大部分の淋菌に包括的であることを示すデータはない。

本発明の他の観点は、ナイセリア属および非ナイセリア属細菌に対するそれらのハイブリダイゼーション挙動に関して十分に解明された核酸プローブを提供することである。

リポソームＲＮＡは高度の構造性分子である。この構造はブローブーターゲット相互作用を支配するものとおなし型の相互作用に大幅に依存する。従って、必ずしもすべての潜在的に有用なハイブリダイゼーションターゲット配列が、考慮されるあらゆるアッセイ条件下で等しくプローブに到達しつるわけではない。

本発明のさらに他の観点は、普通のアッセイ条件下でプローブに到達しつる状態にされたｒＲＮＡターゲット領域にハイブリダイズしうるプローブおよびプローブセットを提供することである。

特定の１組のハイブリダイゼーション条件のストリンジエンシーは、ブローブーターゲットデュプレックスの長さおよび塩基配列により、ならびに２核酸間の対合誤りの程度および形状により定まる。

ストリンジエンシーはハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度および種類、存在する変性剤の種類および濃度などの反応パラメーターによっても支配される。一般に安定なハイブリッドを形成したい場合は、ハイブリダイゼーション条件がよりストリンジェントになるのに伴ってより長いプローブが好ましい。当然、ハイブリダイゼーションが起こる条件のストリンジエンシー（実施すべきアッセイの種類による）が、使用すべき好ましいプローブの特定の特性を指示するであろう。これらの関係は十分に理解されており、当業者が容易に操作しつる。

一般にプローブの長さに応じて、ストリンジェント条件は約０．９モル濃度の塩溶液中、約３５−６５℃を意味すると当業者は解する。

本発明の種々の原理および観点によれば、特定の条件下で淋菌のリポソームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）またはｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）にハイブリダイズするが、同じ条件下で試料中に存在する可能性のある他の関連細菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにはハイブリダイズしない、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列からなる核酸プローブが提供される。従って本発明のプローブは、臨床または環境試料中の淋菌を特異的に検出するための価値ある核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法を開発する基礎を与える。

本発明者らの経験により、これらの核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法は被験試料中の細菌を検出するだめの現在用いられている大部分の微生物学的方法に関して性能の向上をもたらすことが見出された。これには一般に下記のものが含まれる：ａ）感度の向上：すなわち特定の試料中の上記少数細菌を検出しうる：ｂ）安価な試薬の使用および労働の削減によりアッセイ経費を著しく低減しうる：Ｃ）生化学的に稀な菌株のターゲット細菌ですら正確に同定される；ｄ）本発明の試験は試験前にターゲット細菌を試料から単離する必要がないため、より速やかに結果が得られる。

たとえばシグナル保有プローブ（検出プローブ）として作用することおよび／または淋菌特異性プローブのターゲット部位への到達しやすさを高めることによる。

淋菌に対する著しい包括性および排他性を備えた本発明のプローブが得られるという知見は予知および予想不可能であった。

本発明のプローブはそれらのハイブリダイゼーション特性のほかに、個々のアッセイ条件下でのそれらの適正なまたは最適な機能性を改良する特定の構成要素をも含みうる。たとえばプローブを、ヌクレアーゼ分解に対するそれらの抵抗を改良すべく（たとえ末端キャッピングによる）、検出リガンドを保有すべく（たとえばフルオレセイン、３２−Ｐ、ビオチンなど）、または固体状支持体へのそれらの捕獲を容易にすべく（たとえばポリデオキシアデノシン／／テイル／／）修飾しつる。これらの修飾はプローブの基本的機能、すなわちそれがハイブリダイゼージョンアッセイにおいてターゲット生物と非ターゲット生物を有用な程度に区別する能力を配慮したものである。

表の簡単な説明表を参照することにより、本発明の原理および観点がさらに理解されるであろう。

表１一本発剪の好ましい１６Ｓ　ｒＲＮＡ−ターゲット化プローブのヌクレオチド配列と多数のナイセリア属菌株のターゲットヌクレオチド配列との詳細な対応を示す。多数の近縁−非淋菌からの１６８　ｒＲＮＡの対応部分をも比較のため示す。ターゲットＲＮＡ配列は５−から３′へ記載され、プローブ配列はＤＮＡであり、３゛から５′へ記載される。プローブはそれらの包括性および排他性挙動の基礎となる変動の〃コア〃領域と共に示される。プローブ１１１６および１１１７において小文字のＣ（ｃ）は修飾されたシトシン残基を示し、検出リガンドは用いるアッセイ形式に応じてこれに結合し、または結合しない（後記を参照されたい）。

表２一本発明の好ましい２３Ｓ　ｒＲＮＡ−ターゲット化プローブのヌクレオチド配列と淋菌のターゲットヌクレオチド配列との詳細な対応を示す。大腸菌および髄膜炎菌からの２３８　ｒＲＮＡの対応部分をも比較のため示す。ＲＮＡ　（ターゲット）配列は５゛から３′へ記載され、プローブ配列はＤＮＡであり、３ ′から５′へ記載される。プローブはそれらの包括性および排他性挙動の基礎となる変動の〃コアＩ・領域と共に示される。

表３−ドツトプロットハイブリダイゼーションアッセイにおける代表的な淋菌菌株試料に対する好ましいプローブの包括性を例示する。

表４−ドツトプロットハイブリダイゼーションアッセイにおける非−淋菌の代表的試料に対する好ましいプローブの排他性挙動を例示する。

本発明のプローブの開発に際してとられた第１工程は、淋菌特異性核酸プローブに対するターゲット部位として作用すると思われる１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡの領域を同定するものであった。実際には被験試料中にいずれの非−淋菌生物が存在するかを先験的に予測するのは困難である。

その可能性のある非−淋菌細菌は多数であるため、特定のプローブ配列についての排他性を証明するのは予測不可能なばかりでなく、極めて困難かつ労力を要するものであった。最終的にはプローブを用いてスクリーンされるすべての被験試料中に存在すると思われる非−淋菌細菌が何であるかを知る必要性を排除する、より厳密を判疋万ａか堰用された。

これには淋菌間および淋菌と他の属の細菌との系統発生学的関係についての知識を必要とした。

詳細には、淋菌と既知のものでは進化上それに最も近縁である髄膜炎菌とにおいて異なるｒＲＮＡヌクレオチド配列の領域が見出された場合、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてこれら２者を区別するプローブを構成しつるという、通用しているがこれまで証明されていない仮説が適用された。系統発生の原理に基づいて、実際の識別は必ずしもなされていないが、より離れた関係をもつ生物のｒＲＮＡ配列は特定領域の配列において、上記の系統発生的に淋菌の近縁体のものと同程度またはより以上に異なるであろうと推定された。しかしそれらの領域が存在するか否か、または存在したとしてもそれらの領域がｒＲＮＡ内のどこに位置するかを先験的に予測することは不可能であった。

核酸ハイブリダイゼーションプローブに対する有用なターゲット部位として作用する可能性のある淋菌ｒＲＮＡの領域を同定する第１工程として、淋菌の菌株ＡＴＧＣ１９４２４（型の菌株）およびＡＴＣＣ９７９３（普通の臨床分離物）、髄膜炎菌グループＢＳＣおよびＤ　（ＡＴＣＣ１３０９０，１３１０２，１３１１３）ならびにナイセリア・ラクタミカ（Ｎ、ｌａｃｔａｍｉｃａ）菌株ＡＴＣＣ２３９７０からの１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡのヌクレオチド配列の関連部分を調べた。

ヌクレオチド配列は標準的実験室プロトコールにより、ｒＲＮＡを特定する遺伝子のクローニング（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２．　Ｍｏ　Ｉ　ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、：）−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、ニューヨーク、ｐｐ５４５）および配列決定によって、および／または逆転写酵素を用いてｒＲＮＡ自身を直接配列決定することによって（レーン（Ｌａｎｅ）ら、１９８５．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ８２　：　６９５５−６９５９）決定された。

決定されたナイセリア属ｒＲＮＡヌクレオチド配列を相互に、および得られた他のヌクレオチド配列と比較した。配列データの初期系統発生分析は、ナイセリア属が従来報告されている真正細菌目の紅色細菌量ベータ豆量と呼ばれる細菌分類に属することを示した（ベーゼ（Ｗｏｅｓｅ）、１９８７．Ｍｉｃｒｏｂｉ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、５１：２２１−２７１）。

淋菌およびそのごく近縁の髄膜炎菌の配列の比較は特に有用であることが分かった。１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列および２３Ｓ　ｒＲＮＡ配列の多数の領域が、ナイセリア属のこれら２種において、および淋菌と非−淋菌との間で異なると思われた。

最終的に必要な特異性および到達性を備え、かつ本発明のプローブのターゲット部位である領域の位置を表１および２に示す。種々のナイセリア属および非ナイセリア属におけるこれらのターゲット領域のより詳細な比較をも示す。観察されたこれらのヌクレオチド配列の相異に基づくプローブの有用性は、表３および４に示されるデータにより例示される広範なドツトプロットハイブリダイゼーションにより確認された。最後に液体ハイブリダイゼーションアッセイ形式におけるマルチプローブセットの使用例を記載する（表５に示すデータ）。

プローブの物理的記載以上のプローブ選択計画により、試料中の淋菌を同定するのに有用な多数のプローブが得られた。下記の好ましいオリゴヌクレオチドプローブをここに開示する。

プローブセット１　プローブ９１９．１１１６および１１１７は１６Ｓ　ｒＲＮＡの隣接する３領域をターゲットとする（表１）。プローブ９１９はヌクレオチド４５３−４８０位にほぼ対応する淋菌１６Ｓ　ｒＲＮＡの領域をターゲットとする（大腸菌ナンバリング方式）。プローブ９１９の他の多数の型（すなわち長さの変異体）も表１に示す。プローブ１１１６は、はぼ４９３−５３７位をターゲットとする。プローブ１１１７はほぼ４０３−４４２位をターゲットとする。

表１に示すように、プローブ９１９は淋菌とそれにご（近縁の髄膜炎菌を識別するのに極めて有用なコア変異位置付近に〃形成〃される。淋菌１６Ｓ　ｒＲＮＡのコア配列、ｃｇｕｕｇｃｃａａｕａｕｃＧｇｃｇｇｃｃ、は髄膜炎菌の相同領域に対して４カ所の配列の相異を含む（表１、コア配列内の大文字により示される）。これら４カ所の相異のうち２カ所は淋菌菌株９７９３と１９４２４の間にも見られる（すなわち４５８および４７７位のＵ）。しかしこれらの相異はプローブ９１９および淋菌（菌株１９４２４）ｉ６ｓ　ｒＲＮＡ間ではこれらの位置においてＧ：Ｕ非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎ　ｉ　ｃａ　］）対においてのみ生じる。

これらＧ：Ｕ対にもかかわらずプローブ９１９は淋菌１９４２４株に極めて効果的にハイブリダイズする。

これに対し９１９ターゲツト領域により領域１９４２４配列に相補的なプローブは、淋菌９７９３にほとんどハイブリダイズせず、かつ他の非−淋菌、特に髄膜炎菌に対し受容し得ない程度に交叉ハイブリダイズする。

表１にはプローブ９１９よりわずかに長い２形態（プローブ１１１４および１１１５）をも示す。これらはプローブ９１９とおなしコア変異を利用し、プローブ９１９と同様な包括性および排他性を示すが、それらの余分な長さはより高いストリンジエンシーにおいて安定なプローブターゲットハイブリダイゼーションを促進する。

プローブ１１１６および１１１７は淋菌と髄膜炎菌を識別しない−これはこれら２種の細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡにおいてこれらのプローブに対する配列が等しいことから予想された（表１）。従ってプローブ１１１６および１１１７はそれ自体では淋菌特異性プローブとして有用ではない。これら２種の細菌の識別は−般に、これらのプローブを用いる可能性が極めて高いアッセイ用途にとって重要であると考えられるからである。しカルプローブ１１１６および１１１７はプローブ９１９と併用した場合、それらを有用にする重要かつ新規な特性を備えている（後記参照）。

プローブセット２．　１６５　ｒＲＮＡターゲット化プローブ１２ｏ８および！２０９’＝”　７！−ｔなＴ　ＣＺ、１ｂ）　。ブ０　２１２０９＋ｔヌ’）　レオ＋　ド９８３−１０１０位に対応する淋菌１６ｓ　ｒＲＮＡの領域をターゲットとする。プローブ１２０８は１０２４−１０５１位をターゲットとする。

このセットのうちプローブ１２ｏ９は淋菌特異性であり、プローブ１２ｏ８はヘルパー／検出プローブとして設計される。プローブ１２ｏ９は表１に示す淋菌および髄膜炎１６Ｓ配列間に存在することが認められたントシン（Ｃ）およびアデノシン（Ａ）相異点付近に形成される。プローブ１２ｏ９の特異性の基礎となるコア変異には淋菌配列ＵｕｕｇａｃａｕｇｕＧの領域が含まれる。プローブ１２０８は淋菌と髄膜炎菌を識別しないが、種々の二重プローブアッセイ方式においてプローブ１２０９と併用した場合、有用である。

プローブセット３　プローブＩＧ７００およびそのヘルパープローブＩＧ７０６は他のセントを形成するが、淋菌の２３８　ｒＲＮＡをターゲットとする。この対のうちプローブＩＧ７００は淋菌特異性である。ＩＧ７０６はヘルパー／検出プローブとして設計される。プローブＩＧ７００は淋菌の２３３　ｒＲＮＡ８９ −１１６位をターゲットとしく大腸菌２３Ｓ　ｒＲＮＡナンバ１ルグを採用）、表２ａに示すＡおよびＣの相異に依存する。プローブＩＧ７００の特異性が依存するコア変異にはこれらの位置が含まれ、淋菌配列ＵａｕｇａｕＵと定められる（表２ａ）。

プローブセット４　プローブｌ０７０５およびそのヘルパープローブ１７５゜は本発明に記載する他のセントを形成する。他の上記プローブセントと同様にこれら２者は淋菌ｒＲＮＡの隣接領域をターゲットとする。この対のうちプローブ１０７０５は淋菌特異性であり、１７５ｏはヘルパー／検出プローブとして設計される。プローブＩＧ７０５は淋菌（７）２３Ｓ　ｒＲＮ、Ａ］５６−１８２位ヲターギソトとし、特異性に関して淋菌と髄膜炎菌の間の単一位置の相異に依存する（アデノシン＝Ａ、表２ａ）。従ってプローブ＋Ｇ７０５は上記の淋菌特異性プローブ９１９．１２０９と同様にほぼこの位置付近に中心をもち、ＩＧ７００はそれら個々のコア変異領域付近に中心をもつ。このプローブセットのコンパニオンヘルパー／検出プローブであるプローブ１７５０は淋菌の２３Ｓ　ｒＲＮＡ１２６−１５４位をターゲットとする。

上記グローブおよびプローブセットの特異性挙動はそれらが用し・られるアノ七イ形式に著しく依存する。逆にアッセイ形式は個々のプローブの最適設計性をある程度支配する。本発明のプローブの／・本質・・はたとえば９１９および１１１６および１１１７と命名されるプローブ中の特異的ヌクレオチドストリングに限定されると解すべきではない。これら個々のオリゴヌクレオチドの長さは下記ドツトプロットアッセイ法（および他の特定の予想されるアッセイ法）に使用するために最適なものとされた。当業者に周知のように、プローブの最適長さは選ばれたハイブリダイゼーション条件のストリンジエンシーの関数であり、従って本発明のプローブの長さはそれに応じて変更しつる。同様に２以上のプローブからなるセットを考慮すると、すべてのプローブは両者が用いられる個々の形式において匹敵する様式で挙動することが望ましい。従って個々のプローブの厳密な長さはある程度その特定の意図する用途を反映する。

ここに記載するプローブのＩ・本質ノ・は上記ならびに表Ｊおよび２に示す淋菌特異性配列（コア変異）の知見および利用にある。

同様に留意すべき点は、淋菌２ＳＳ　ｒＲＮＡ上のターゲット部位が近接するためプローブＴＧ７００およびＩＧ７０５　（それらの個々のヘルパープローブを用いた場合または用いない場合）も有用なプローブセットを形成するということである。両プローブとも単独で淋菌に特異的であるので（ナイセリア・フラバ（Ｎ。

ｆｌａｖａ）に対するプローブｌ０７０５を除＜）、一方をキャプチャープローブとし、他方を検出プローブとして用いる二重プローブアッセイ形式は特異的／非特異的キャプチャー／検出プローブ対より著しく　ｒｒ強力／／であろう。

プローブ挙動のハイブリダイゼーション分析表１および２の配列データはプローブ９１９．１２０９、ＩＧ７００およびＩＧ７０５　（またはそれらの変異体）が淋菌の検出にハイブリダイゼーションプローブとして有用であることを示唆する。しかし配列分析により検査しなかった池の淋菌菌株中にはるかに広範な配列変異が存在する可能性がある。これらの変異は若干または多数の未試験淋菌菌株に対し可能性のあるプローブによるハイブリダイゼーションを低下させまたは排除するかも知れない。

プローブの包括性挙動と同様に重要なものはそれらの排他性挙動、すなわち非− 淋菌細菌に対するそれらの反応性である。表１および２に示す淋菌と髄膜炎菌のｒＲＮＡ間の数箇所の小範囲の配列変異の知見は予想外であった。しかし前記のようにこれらの配列変異パターンは髄膜炎菌の他の菌株、他のナイセリア属菌種の株、または他の非ナイセリア属細菌には保有されない。

従って代表的な淋菌および非−淋菌細菌に対するプローブの挙動をハイブリダイゼーション分析により測定した。

実施例１・　プローブハイブリダイゼーション挙動のドツトプロット分析周知の方法によるドツトプロット分析は下記による。核酸または一群の核酸をフィルター、たとえばニトロセルロース、ナイロンその他の誘導体化されたメンブレンに固定化する。これらは特にこのために市販されている。ＤＮＡまたはＲＮＡはこれらのフィルターに容易に固定化され、次いで各種条件下で（すなわちストリンジエンシー）目的のヌクレオチド配列またはプローブとのＩｓイブリダイゼーションにつき検査または試験される。目的の核酸をまず精製する必要なしに粗製（未精製）細胞溶解物中に存在するＤ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡを固定化しつる方法もある（たとえばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）、フリッシュ（Ｆｒｉｔ　ｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、　）およびサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、）、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａり。この方法は、個々の生物の核酸中に存在する特定のヌクレオチド配列をスクリーニングするのに要する努力の量を著り、＜減少させ、さらに多数の生物の大量スクリーニングに有利に利用しうることが認められた。プローブは標準法により放射性Ｐ３２で末端標識された。前記のようにハイブリダイゼーションおよび洗浄したのち、ハイブリダイゼーションフィルターをＸ線フィルムに露光し、既知量のターゲット物質（細胞またはＲＮＡ）の対照スポットに対してシグナル強度を視覚的に・・採点した・・。

ストリンジェント条件下では、そのヌクレオチド配列がターゲット配列に対して大きな相補性をもつプローブはど、低い相補性をもつプローブより高い水準のハイブリダイゼーションを示す。ここに記載するオリゴヌクレオチドについては、６０℃で１４−１６時間の、ｒＲＮＡへのハイブリダイゼーション（０，９ＭＮａＣ１，０，１２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，６ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．ＩＭ　ＫＰＯｌ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロホスフェート、０．００２％ファイコル、０．０２％ＢＳＡおよび０．００２％ポリビニルピロリドンを含有するハイブリダイゼーション溶液中で）、次いで非結合プローブを除去すめだめの６０ ℃で３回、１５分間のハイブリダイゼーション後洗浄（０，０３Ｍ　ＮａＣｌ。

０．００４Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳ中）が表１および２に詳述する水準を得るのに十分な程度にストリンジェントであろう。

表３および４は同じ淋菌の２８菌株／分離物のドツトプロットハイブリダイゼーション試験の代表的結果を示す。異なる臨床源から分離された、少量ではあるが典型的な菌株試料がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より得られた。残りは表３および４に示すように種々の培養コレクションおよび患者集団より得られた分離物である。本発明の淋菌特異性プローブを用いた結果のみを示す。種々のヘルパープローブは表１および２に示す配列比較により判断されるように淋菌特異性ではない。

プローブ９１９．１２０９、ＩＧ７００およびＩＧ７０５の包括性挙動は下記のとおり要約される：すべでのプローブが試験したすべての淋菌にハイブリダイズする（すなわち完全に包括性である）。

種々の上記ヘルパープローブは、表３および４に示すハイブリダイゼーション実験において試験しなかった。それらは淋菌特異性プローブの包括性および排他性挙動を試験するために設計されたものである。ヘルパー／検出プローブは淋菌特異性ではない。有効１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡ配列の分析によりそれらはすべての淋菌（および他の大多数）にハイブリダイズするであろうということが確実に予想される。これらのヘルパープローブはハイブリダイゼーション反応の力学および熱力学に影響を及ぼし、生成物の分布を目的の分子間プローブ／ターゲントコンプレックス形成という好ましい方向に移行させる。

表３に示すデータは淋菌菌株に対するプローブの包括性挙動が卓越していることを示す。試験した淋菌菌株（表３）はその種の幅広い代表として選ばれたので、他の淋菌菌株により関するプローブの包括性挙動は極めて良好であると予想しうる。

排泄性（すなわち非−淋菌に対するへ１′ブリダ１′ゼー／ヨ／）に関しＣも、プローブは極めて類似の挙動を示す。プローブＩＧ７０５　（表４のナイセリア・フラバの１被験菌株に弱くハイブリダイズした）というわずかな例外はあるが、プローブはいずれも試験した非−淋菌にハイブリダイズしなかった。表４において明らかなように、髄膜炎菌に対するプローブのハイブリダイゼーションの欠如については極めて慎重に試験した（１９菌株）。髄膜炎菌は知られているうちで遺伝的に最も淋菌に近縁のものである（ＤＮＡハイブリダイゼーション試験による）。

髄膜炎菌は淋菌につき一般に検査される試料中にしばしば存在することも知られている。これら２つの理由から、プローブが淋菌と髄膜炎菌を識別する能力は極めて重要であると考えられる。

上記を除いてプローブはいずれも、試験した他のいずれのナイセリア属菌種または非ナイセリア属細菌にもハイブリダイズしない。

淋菌に対して本発明のプローブがもつような著しい包括性および排他性を備えたプローブが得られることは予想および期待されなかった。

プローブセットの説明および有用性上記の淋菌特異性プローブ９１９．１２０９、ＩＧ７００およびＩＧ７０５のほかに、これらのプローブと他のヘルパープローブを含む多数のプローブセットを記載する。最も簡単な場合、ヘルパープローブは前記の淋菌特異性プローブのハイブリダイゼーション効率を、これらのプローブがそれらのターゲット配列に到達するのを補助することにより高める以上のことはしない。ハイブリダイゼーションを改良する特性をもつこのプローブセットは下記のものであるニブローブセット　淋菌特異性プローブ　ヘルパープローブ１　９１９　１１１６、１１１７３　１Ｇ７００　１Ｇ７０６４　１Ｇ７０５　１７５０構造解放機能のほかにこれらの・Ｉヘルパー・・プローブは他の機能をも含む場合がある。たとえばある１類のサンドインチ型アッセイ形式においてに陽性のシグナルを発生するために２プローブを必要とする。通常はターゲット生物特異性である一方のプローブはターゲット分子にハイブリダイズするだけでなく、同時にまたは次いで試料マトリックスから固体支持体表面へ捕獲されるべく修飾される。

セットの他方のプローブもターゲットにハイブリダイズしなければならず、そしてさらに検出可能なりガントを含むべく修飾されている。

たとえばプローブ１１１６および１１１７はプローブ９１９に対するコンパニオンプローブとして種々の二重プローブサンドイッチアッセイ形式のいずれかに用いるために極めて価値がある（たとえば米国特許出願第２７７．５７９：１６９．６４６または２３３６８３号明細書に記載のホモポリマーキャプチャー二重プローブ液体ハイブリダイゼーション形式）。このような用途の場合、プローブ９１９またはその誘導体はその３′末端において長さ約２０−２００残基のデオキシアデノシン（ｄ　Ａ）残基の範囲を含むべく修飾されている。これはターゲットｒＲＮＡを被験試料から、この目的のためにポリデオキシチミジン（ｄＴ）で適宜誘導体化された固体支持体（たとえばビーズ、プラスチック表面、フィルターなど）上に／ｌ捕獲〃する（液体ハイブリダイゼーションにより）ために用いられる。プローブ１１１６および／または１１１７　（またはその誘導体）は検出プローブとして用いられ、検出可能なリガンド（たとえば３２−Ｐ、フルオレセイン、ビオチンなど）により誘導体化されている。表１に示す修飾シトシン残基はこれらのリガンドを結合させる好都合な手段である。次いで被験試料中のターゲット核酸の存在の検出は、検出リガンドが下記の一連のハイブリダイゼーシジン相互作用により固体表面上に　捕獲されることにより示される：支持体　１　１１１１１１　１１１１１１１１１１１１１　１１１１１１１１１１１１１１１ｎＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（キ“プ５−＋　−’　（検出〕ｏ−フ）検出プローブは被験試料中にターゲット核酸が存在した場合にのみ、固体支持体に結合しうる。

キャプチャーおよび検出プローブのターゲット部位の物理的近接は、ある種類の被験試料中に存在するりボヌクレアーゼがこれらターゲット部位間のターゲットｒＲＮＡ分子を分断することにより試験結果にマイナスの影響を与える機会を最小限に抑える。またプローブ１１１６および１１１７はプローブ９１９のハイブリダイゼーションを二次構造−後者のターゲット領域を含む−の解放により高めるべく設計される。

同様に他の上記〃ヘルパー／／プローブはそれら個々のセットの淋菌特異性プローブの挙動を高める。

本発明の他の有用なプローブセットが上記プローブセットに基づいて定められる。これはプローブセット３と４の組み合わせであり、プローブセット５と表示二重プローブ、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ形式において、プローブセット５を幾つかの様式で有利に用いることができる。たとえば淋菌２３Ｓ　ｒＲＮＡターゲット分子へのハイブリダイゼーション効率を高めるために］Ｇ７００およびＩＧ７０５双方を特異的キャプチャープローブとして用いることができる。この場合、ヘルパープローブはなお非特異的検出プローブとして、かつターゲット構造を解放するヘルパーとしても用いられる。これは原理的に、単一キャプチャープローブを用いて捕獲する場合より多量の２３３タ一ゲツト分子を捕獲することによって、アッセイにより得られるシグナルを増大させるであろう。

アッセイに／／強度〃を付加する他の可能性はＩＧ７００をキャプチャープローブとし、ＩＧ７０５を検出プローブとして（またはその逆）用いるものである。

３その場合、修飾されていないヘルパープローブは主としてそれらの構造解放能において作用する。しかしこの形式ではキャプチャープローブおよび検出プローブ双方がターゲット核酸に特異的であることが有利である。これによって、たとえばターゲット核酸への非特異的検出プローブのハイブリダイゼーション水準が低いことにより、縦隔性ハイブリダイゼーションシグナルが発生しにくくなる。

く、しばしばハイブリダイゼーション効率およびアッセイ特異性を向上させるために有利に用いられる。

ｒＲＮＡの検出に関して本発明の説明を行ったが、ここに記載するプローブおよびここに記載するプローブに対し相補的なプローブはｒＲＮＡを特定する遺伝子（ＤＮＡ）（すなわち／／　ｒＤＮ　Ａ　ｔｔ　）に検出にも有用であることは容易に理解され、従ってこれらのプローブはここに記載するプローブと均等物であり、本発明および請求の範囲の精神および範囲に包含されると解すべきである。

表ＩＪＩ！１ｌ１６ｓ　ｒＲＮ八　コアおよびプローブ配列情報ブ。−フ１】＋　７　ＴｃＧＣＡＣＡＧＡＣＴ’ｌＮ？ＩＴＣＣ印ＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＴＴ ’ＣＣＴＣ；ＡＡＡＡＣ入Ｃ−５−Ｊｌｌ　１９１　處Ｉコ＋　ｒ＋　Ｑ　ｒＤ）ＪＡ　ｖ’ＧＩｈ＊ｔｌｌｌにＩＩ亀屹７１１％困ｉ＋１ｈｒＫｒぜΔロピタク慣シｉ表；１．　包括性ドットプロット／１イブリダイゼーンｊンデータ表４・　排他性ドットブロットハイブリダイセー／シンデータ表４＝　排他性データ　（続）アルカリギネス・フェーカリス　λ１ｃ農１ｆσイＢ―＠　ｆｍｍｍｍ１４ｍ国際調査報告１、、ｌ−２ｂ−−ｉａユ、−＋、−ｈ−ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２８４１国際調査報告丁ｈ＋＋ａ＊＋ｖｚＪｉ１１１＋Ｍｌｌｌｆｆｌｌ＋ｍ＋＋ｙ閉（ｍｂａｎｍａｌｌｓ）＋６１ｔ’ｌｌｕ＋ｅ＋＋ｍａｅｗｍｅ＋＋ｕ＋ｉ{ｅｍ１１１１ＭＩ −詐！−Ｍ＋＋６１費−＋Ｒ１１””ＩＮＭＩＩＩ＃Ｊｌｔｌｌ。１．、（丁− １１１１ｆｆｉｌｅｒｌＩｎ＃寥＋ｌ１１１１ＪＩＡｅｌＩｆ’＋１ＮＩＩｓ＜ｏｓ＋ａり鐘ｍｏｕ１−−ｉｏｐｈ＋−−−０２１０８^９０ｔｈｅＬｕｉＯ噌−−ｍｐｍ＋ａｒ＋ｅイｈｅｍ＋ｔ＋ａｍ＋ｌｌＦｌｌａｍａ１ｍｌ噂曹１Ｌ−ａｔｕ＋ｈｎ＋ｌｌ＋Ｃ１１−イｖ…引ｒ浴{ｖｅ１ｗ電−− 鴫５ｃＮＨｎＭｎＪｅｎａａｂ嘲−−１゜

Claims

【特許請求の範囲】

１．予め定められたストリンジェンシー条件下で淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズし得るが、非淋菌細菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにはハイブリダイズし得ない核酸フラグメント。
２．該フラグメントが該条件下で下記のもののｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにはハイブリダイズし得ない、請求の範囲第１項に記載の核酸フラグメント：アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎梓菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ　ｋｉｎｇａｅ）、キンゲラ・デニトリフィカンス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ）、モビランカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ　ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、モラクセラ・オスレオンシス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｏｓｌｅｏｎｓｉｓ）、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ　ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・デニトリフィカンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ナイセリア・エロンガータ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｅｌｏｎｇａｔａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｆｌａｖｏｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　１ａｃｔａｍｉｃａ）、髄膜炎菌Ａ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＡ）、髄膜炎菌Ｂ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ）、髄膜炎菌Ｃ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣ）、髄膜炎菌Ｄ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＤ）、ナイセリア・ムコーサ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｕｃｏｓａ）、ナイセリア・サブフラバ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｓｕｂｆｌａｖａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ・アリゾナ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｒｉｚｏｎａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）およびベイロネラ・パルブラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ）。
３．プローブ９１９およびその相補的配列よりなるプローブ群から選ばれるプローブ配列からなる、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
４．フラグメントが表１に示す淋菌の１６ＳｒＲＮＡ配列の領域４５５−４７７内のいずれか１０個の連続ヌクレオチドからなる配列の少なくとも９０％に相同または相補的である、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
５．少なくとも２種類の核酸フラグメントからなり、その一方がプローブ９１９またはその相補的配列であり、他方プローブ１１１６、プローブ１１１７およびその相補的配列よりなるプローブ群から選ばれるプローブセット。
６．プローブ１２０９およびその相補的配列よりなるプローブ群から選ばれるプローブ配列からなる、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
７．フラグメントが表１に示す淋菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列の領域９８３−１０１０内のいずれか１０個の連続ヌクレオチドからなる配列の少なくとも９０％に相同または相補的である、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
８．少なくとも２種類の核酸フラグメントからなり、その一方がプローブ１２０９またはその相補的配列であり、他方プローブ１２０８またはその相補的配列であるプローブセット。
９．プローブＩＧ７００およびその相補的配列よりなるプローブ群から選ばれるプローブ配列からなる、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
１０．フラグメントが表２に示す淋菌の１６ＳｒＲＮＡ配列の領域８９−１１６内のいずれか１０個の連続ヌクレオチドからなる配列の少なくとも９０％に相同または相補的である、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
１１．少なくとも２種類の核酸フラグメントからなり、その一方がプローブＩＧ７００またはその相補的配列であり、他方ＩＧ７０６またはその相補的配列であるプローブセット。
１２．プローブＩＧ７０５およびその相補的配列よりなるプローブ群から選はれるプローブ配列からなる、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
１３．フラグメントが表２に示す淋菌の１６ＳｒＲＮＡ配列の領域１５６−１８２内のいずれか１０個の連続ヌクレオチドからなる配列の少なくとも９０％に相同または相補的である、請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメント。
１４．少なくとも２種類の核酸フラグメントからなり、その一方がプローブＩＧ７０５またはその相補的配列であり、他方プローブ１７５０またはその相補的配列であるプローブセット。
１５．少なくとも２種類の核酸フラグメントからなり、その一方がプローブＩＧ７００またはその相補的配列であり、他方プローブＩＧ７０５またはその相補的配列であるプローブセット。
１６．試料中の淋菌の存在を検出する方法において、ａ）試料を請求の範囲第２項に記載の核酸フラグメントから選ばれる少なくとも一方のプローブと、淋菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡが試料中に存在する場合は該フラグメントがこれらにハイブリダイズしてハイブリッド核酸コンプレックスを形成しうる条件下で接触させ、その際該核酸フラグメントは予め定められたストリンジェンシー条件下で淋菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズし得るが、非淋菌のｒＲＮＡ及びｒＤＮＡにはハイブリダイズし得ず；そしてｂ）該ハイブリッド核酸コンプレックスを試料中に淋菌が存在することを示すものとして検出する、ことからなる方法。
１７．接触工程の核酸フラグメントがプローブ９１９である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
１８．接触工程の核酸フラグメントがプローブ１２０９である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
１９．接触工程の核酸フラグメントがプローブＩＧ７００である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
２０．接触工程の核酸フラグメントがプローブＩＧ７０５である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
２１．接触工程が試料を少なくとも２種類の核酸フラグメントと接触させることよりなり、その一方がプローブ９１９またはその相補的配列であり、他方プローブ１１１６、プローブ１１１７およびそれらの相補的配列よりなるプローブ群から選ばれる、請求の範囲第１６項に記載の方法。
２２．接触工程が試料を少なくとも２種類の核酸フラグメントと接触させることよりなり、その一方がプローブ１２０９またはその相補的配列であり、他方プローブ１２０８またはその相補的配列である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
２３．接触工程が試料を少なくとも２種類の核酸フラグメントと接触させることよりなり、その一方がプローブＩＧ７００またはその相補的配列であり、他方プローブＩＧ７０６またはその相補的配列である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
２４．接触工程が試料を少なくとも２種類の核酸フラグメントと接触させることよりなり、その一方がプローブＩＧ７０５またはその相補的配列であり、他方プローブ１７５０またはその相補的配列である、請求の範囲第１６項に記載の方法。
２５．接触工程が試料を少なくとも２種類の核酸フラグメントと接触させることよりなり、その一方がプローブＩＧ７００またはその相補的配列であり、他方プローブＩＧ７０５またはその相補的配列である、請求の範囲第１６項に記載の方法。