CN103409498A

CN103409498A - 转基因大豆mon89788转化事件的检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN103409498A
Application number: CN2013100806352A
Authority: CN
Inventors: 于常海; 杨滨; 张明; 李飞武; 刘乐庭
Original assignee: Haikang Life Beijing Corp ltd; Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Haikang Life Beijing Corp ltd; Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明公开了一种快速检测转基因大豆MON89788转化事件的方法和试剂盒。该方法先将样品DNA进行高温变性后，使用识别MON89788特异性区域的引物在RNA聚合酶的作用下转录生成RNA；再以所得RNA为模板，使用上述引物进行NASBA扩增；最后对扩增产物进行检测。该方法无需购买大型仪器，从而降低了检测成本；检测产物易于降解，从而减少了样品间相互污染的问题。

Description

转基因大豆MON89788转化事件的检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，特别涉及用于检测生物样品中是否存在转基因大豆MON89788转化事件的方法和试剂盒。

背景技术

在农业或工业上通过遗传操作成功地向植物中引入在商业上感兴趣的性状是一个依赖不同因素的复杂过程。根据国际农业生物工程应用技术采集管理局(ISAAA)统计，自转基因产品商品化以来，转基因农作物的种植面积已经超过了10亿公顷。而中国成为第六大转基因作物增长国。随着各国对转基因产品的管理和人们对转基因产品安全性的关注，世界各国纷纷出台相关法规政策，要求对转基因产品进行标识。

转基因大豆MON89788品系经过改造后，是可以抗Roundup除草剂中的活性成分-草甘膦的一种转基因品系。抗草甘膦的大豆是通过在其基因组内插入草甘膦抗性的元件——烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因而起到抗除草剂的性状，此酶是从土壤农杆菌菌株CP4中分离出来的，简称CP4EPSPS。EPSPS是草莽酸途径中的一个重要的酶，这个途径参与了植物芳香类物质以及芳香族氨基酸的合成。草甘膦通过抑制EPSPS活性阻断芳香族氨基酸的合成，最终导致受试植株的死亡。从土壤农杆菌菌株CP4中分离出来的CP4-EPSPS，具有抗草甘膦的特性。而在哺乳动物体内没有合成芳香族氨基酸的途径，所以这种酶对人体无害。

MON89788型转基因大豆是由美国孟山都公司开发成功的。MON89788大豆已大面积种植并在市面上流通。但由于生物安全性的考虑，以及各国法律的相关规定，要求对含这种转基因大豆成分的产品在标签中予以注明，以具有可追溯性。

马尔文等发表了关于大豆事件MON89788和检测它的方法(中华人民共和国知识产权局.公开号：CN101252831A.公开时间：2008年8月27日)。所述方法基于PCR检测技术，通过测定MON89788外源DNA区与5’或3’侧翼区的连接区域(转化体特异性检测)的存在来确认转基因事件MON89788的存在。上述检测方法需要依赖昂贵的仪器，并且，由于其扩增产物为DNA，为了防止DNA造成的实验结果相互污染的问题，在设计实验室场地时，常需要将样品提取、样品扩增和样品检测分布到不同的房间，并且需要严密谨慎小心的操作，这就增加了试验的复杂性。因此，需要开发一种高效、准确、灵敏且简便的检测方法。这对于国家的进出口贸易、转基因安全性以及对于海关、商检、出入境检验检疫部门、食品加工部门来说都是至关紧要需要解决的一个问题。

发明内容

本发明提供了一种检测转基因大豆MON89788转化事件的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将样品DNA95℃变性后立即冰置，使用特异性识别MON89788外源DNA区的特异引物对，在RNA聚合酶的作用下转录生成RNA；所述引物之一包含所述RNA聚合酶的识别序列；

(b)使用上述特异引物对，对上述所得RNA进行NASBA扩增，得RNA扩增产物；

(c)分别设计捕获探针和检测探针，对上述RNA扩增产物进行检测。

所述“外源DNA区”是相对于受体植物内源性DNA区的概念，包括MON89788的植物基因组中侧翼于TDNA(包含转基因的转化DNA)插入的5’末端的基因组DNA的一部分。所述MON89788外源DNA区具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

在具体实施例中，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶，所述T7RNA聚合酶的识别序列为SEQ ID No.2所示的T7promoter序列。

本发明所述引物对优选引物长度为18-28bp，GC含量为30％-40％，扩增长度为120-450bp，Tm值在57-62摄氏度的引物对。

优选地，所述引物对分别包含SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，特异性识别MON89788外源DNA区内的5’末端基因组序列。

在具体实施例中，所述引物对分别为如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。SEQ ID No.5所示序列的5’端含有与捕获探针序列具有至少90％相似性的核苷酸序列；SEQ ID No.6所示序列的5’端包含T7RNA聚合酶的识别序列。

上述方法中，所述捕获探针或检测探针可特异性与上述RNA扩增产物杂交。当采用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物对时，所述捕获探针包含SEQ ID No.7所示核苷酸序列，可特异性与RNA扩增产物的5’端杂交；所述检测探针包含SEQ ID No.8所示核苷酸序列，可特异性与RNA扩增产物的中间段杂交。

上述捕获探针的5’端带有Binding标记，可通过与Streptavidin相互作用而结合到磁珠上，从而达到捕获RNA扩增产物的目的；所述检测探针的5’端带有地高辛标记(DIG)或Ru标记，分别用于酶联检测或电化学发光检测。

本发明的另一个目的是提供一种检测转基因大豆MON89788转化事件的NASBA检测试剂盒，所述试剂盒包括阳性质粒对照，可特异性识别上述MON89788外源DNA区的引物对，RNA聚合酶，以及可特异性与上述引物对介导的NASBA扩增产物杂交的捕获探针和检测探针，所述引物之一包含所述RNA聚合酶的识别序列。

所述试剂盒，还包含用于NASBA检测的RNA聚合酶、逆转录酶和RNase H。

优选地，所述引物对分别包含SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列。

更优选地，所述引物对序列分别如SEQ IDNo.5和SEQ IDNo.6所示。

当采用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示核苷酸序列组成的引物对时，所述捕获探针包含SEQ ID No.7所示序列，所述检测探针包含SEQ ID No.8所示序列。

所述试剂盒，还包含用于NASBA检测的阳性对照质粒。构建质粒时优选地，所述引物对分别包含SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示核苷酸序列。

本发明所述检测方法具有以下优势：

(1)为等温扩增技术，无需购买大型仪器，从而降低了检测成本；

(2)检测产物为RNA，易于降解，从而大大减少了样品间相互污染的问题；

(3)简便快捷，易于操作，可应用到田间检测；

(4)检测灵敏度高。

图1质粒载体图谱

图2质粒电泳图

其中，M：DL100Marker；1为：阴性对照；2：扩增的目的片段，大小为430bp

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1转基因大豆MON89788NASBA检测方法的建立

1.MON89788质粒标准分子的构建及检测引物探针设计

主要试剂：

A.目的基因的获得：

基因组DNA的提取：使用转基因植物及深加工产品提取试剂盒提取待检大豆基因组。通过对目的基因片段设计特异性引物对SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，优化体系和扩增程序对大豆品系MON89788基因组进行PCR扩增。(扩增条件：95℃，10min；94℃30s，58℃30s，72℃30s(35cycles)；72℃7min；6℃1min)。

PCR扩增，25μlPCR反应体系如下：在200μl的小离心管中依次加入下列成分

PCR产物，加入2μl loading buffer，电泳。

扩增完成后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化。

B.PCR产物的电泳回收(按照中科瑞泰胶回收试剂盒说明书操作)

(1)切取含有DNA片断的琼脂糖，加入4倍凝胶体积的binding bufferA，加热，让凝胶溶化完全。

(2)取一个回收DNA的专用管放在离心管架上。

(3)加入750μl binding bufferB，10000rpm离心，1min。

(4)加入300μl binding bufferB，10000rpm离心1min。

(5)加入DNA washing buffer750μl，浸泡2min，10000rpm离心1min。

(6)重复步骤5。

(7)空管10000rpm离心1min。

(8)换管，加入30μl elution buffer或者ddH2O，将离心柱移入1.5ml的离心管中，稍后离心。

(9)检验。

C.连接T载体(按照全式金T载体连接试剂盒操作)

(1)加样

(2)短暂离心5s

(3)连接4℃，24h

D.T载体连接产物的转化

(1)将100μl DH5α感受态细胞置于冰上，完全解冻后，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30min。

(2)42℃，水浴90s(或PCR里加热)，冰上放置2min。

(3)加入400μl Soc/LB培养基里，37℃，200-250rpm振荡培养1h。

(4)室温下，4000rpm离心5min。

(5)将细菌涂抹在平板上(预先用20μl100mmol/L IPIG和100μl的20mg/ml x-gal涂抹在氨苄青霉素平板上)。

(6)平板37℃正向放置1h，以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜12-16h。

E.菌落鉴定测序

利用菌落PCR对重组的菌株进行鉴定，然后将阳性克隆的菌液送去测序，对比与原序列一致。获得序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列作为阳性对照。构建的质粒载体图和凝胶电泳结果见说明书附件。

检测方法设计检测转基因大豆MON89788的引物探针，如权利要求所述SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ IDNo.7，SEQ IDNo.8序列。

2.NASBA扩增条件的优化

以下操作所用试剂均由海康生命科技有限公司的NASBA-MP试剂盒提供(引物、探针除外)。

(1)基因组DNA的提取：使用转基因植物及深加工产品提取试剂盒提取待检大豆基因组。

(2)试剂预备：按照NASBA-MP试剂盒说明书准备。

A、扩增试剂的预备

试剂球中加入80μl试剂球稀释剂、16μl KCl和14μl NASBA水，振荡混匀。

B、酶溶液的预备

酶球中加入55μl酶稀释液，室温放置至少20min；用手指轻轻叩击试管，让酶球充分溶解，使用前轻轻离心试管。

C、检测溶液的预备

MON89788检测探针(26μM)及捕获探针(26μM)解冻至室温；

检测浓缩液按1∶500在检测缓冲液中稀释。

根据本公司(海康生物科技(北京)有限公司)以往NASBA扩增RNA成熟的技术经验，对扩增条件进行优化，通过改变变性温度和优化扩增程序等，选取下列扩增条件来扩增MON89788基因组DNA以及构建的质粒DNA，其中已构建的MON89788阳性质粒(60ng/ul)

(1)取扩增试剂9.2ul，加0.8ul引物，5ul模板

(2)65℃/95℃5min

(3)冰上放置3min

(4)41℃温浴5min，加5ul NASBA酶。

(5)41℃90min

(6)扩增体系(20ul)

通过65℃和95℃变性温度扩增样本结果比较，95℃变性温度下阴性对照(Negtive control)，阴性大豆基因组，MON89788阳性基因组，MON89788阳性质粒，三次重复试验数据稳定，扩增效率高。65℃变性温度下得到的数值较低，扩增效率低，所以我们选择95℃做为NASBA的扩增温度。

3.NASBA扩增引物浓度的优化

在优化扩增程序的基础上，将引物浓度进行筛选，设置引物浓度梯度，上下引物总共分别为0.8ul，0.4ul，0.2ul，其他条件和程序不变，模板分别为已构建的MON89788阳性质粒(500copies)，转基因阴性大豆(50ng/uL)，MON89788纯阳性基因组(吉林农科院提供)。

检测结果显示选择引物为0.8ul最佳。引物浓度在0.2ul和0.4ul时扩增，设置每次两个平行，三次重复。检测数据得值偏低并且不稳定，引物浓度0.8ul试验数据稳定，重复性好，结果可信。

最终建立了NASBA的检测方法为：

(1)阳性对照质粒：SEQ ID No.1所示核苷酸序列是位于MON89788外源DNA区内的待扩增序列；

(2)阴性对照：以非转基因大豆基因组为阴性对照；

(3)空白对照：以NASBA水为模板；

(4)转基因大豆MON89788基因组(吉林农科院提供)。

试剂：转基因植物及深加工产品提取试剂盒(海康生命科技有限公司)、NASBA-MP试剂盒(海康生命科技有限公司)、阳性转基因大豆MON89788基因组(吉林农科院提供)。

引物及探针：

上游引物(SEQ ID No.5)：

斜体部分为与捕获探针序列具有90％相似性的序列；下划线部分为可特异性识别MON89788外源DNA区的序列，即SEQ ID No.3所示序列。

下游引物(SEQ ID No.6)：

斜体部分为T7RNA聚合酶的识别序列，即SEQ ID No.2所示序列；下划线部分为可特异性识别MON89788外源DNA区的序列，即SEQ IDNo.4所示序列。

捕获探针(Binding-SEQ ID No.7)：

BINDING-GATGCAAGGTCGCATATGGC

检测探针(DIG-SEQ ID No.8)：

DIG-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG

核酸扩增

1)取5μl基因组样品(100-200ng DNA)或NASBA水(空白对照)，加入9.2μl扩增试剂、0.8μl primermix(5μM each)，95℃变性5min后立即冰上放置3min，41℃孵育5min；

2)向上述体系中加入5μl NASBA酶溶液，混匀，41℃，孵育90min；

扩增产物检测

1)在支持板框中安放1条微孔板板条；

2)在微孔板孔中加入NASBA扩增产物5μl，上述检测探针及捕获探针各1μl，杂交缓冲液43μl，混匀，41℃温育1小时。

3)倾去溶液，以250μl1×TBS(PH7.4)洗三次

4)每孔加100μl检测液，室温下温育30min

5)倾去溶液，以250μl1×TBS(PH7.4)洗三次

6)微孔加100μl连接液，避光温育5min

7)微孔加100μl终止液终止显色反应

8)测定405nm波长处的吸光度。

实施例2NASBA技术对MON89788大豆基因组临界值判定

根据实施例1中建立起的MON89788大豆基因组NASBA方法，通过测定20个阴性样品，阴性大豆(50ng/ul)，其他试剂、扩增条件及扩增程序不变，获得NASBA检测转基因大豆MON89788的临界判值0.32(Mean(阴性样品)+10SD)。

实施例3NASBA技术对MON89788基因组特异性和灵敏性的判定

1.NASBA技术对MON89788大豆基因组特异性的判定

为测试研究建立的MON89788大豆NASBA检测方法的特异性，选择目前已经允许商业化应用的主要转基因作物。这些转基因样本基本包括了全部获批准作为加工原料进入中国市场的转基因大豆、玉米、油菜、棉花的转化事件，用来验证此检测方法只针对MON89788这一种特异的转基因品系。已构建的MON89788阳性质粒、MON89788阳性基因组、非转基因阴性对照、含MON89788的转基因大豆混合样品(MON89788、GTS40-3-2、A5547-127、A2704-12)、不含MON89788的转基因大豆混合样品(GTS40-3-2、A5547-127、A2704-12)、转基因玉米混合样品(MON810、MON863、Bt11、Bt176、NK603、GA21、TC1507、T25)、转基因棉花混合物(MON1445、MON531、LLCOTTON25、MON15985、MON88913)、转基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2)、非转基因作物混合物(玉米、大豆、油菜、棉花)。我们设置三次重复试验，利用检测权利要求书所述引物探针序列对上述样本进行检测，根据实施例1中建立起的MON89788基因组NASBA方法和实施例2得到的NASBA方法对MON89788基因组判定的临界值，对我们得到的检测结果进行分析，含有目的基因的阳性质粒对照，100％转基因大豆MON89788和含MON89788转基因成分的大豆均能检测出，而本身不含目的基因的转基因作物均未检出。符合试验预期，证明我们引物及探针对MON89788大豆基因组是特异性的。

2.NASBA技术对MON89788基因组灵敏性的判定

在NASBA扩增前用紫外分光光度计测浓度，计算拷贝数。

拷贝数的计算：质粒拷贝数(cp/μL)＝质粒模板浓度(g/μL)*NA

[bp/mol]/(M[g/mol]*2*plasmid size[bp/cp])

大豆的基因组大小为1115Mb

MON89788质粒大小为3670bp

质粒MON89788稀释成500个拷贝，做为阳性对照。MON89788的基因组稀释成1000，500，100，50拷贝四个梯度，做三次重复实验每次三个平行。获得NASBA检测转基因大豆MON89788的检测下限值为100copies。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表