CN111235293B

CN111235293B - 一种黑麦6rl染色体臂特异kasp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111235293B
Application number: CN202010107963.7A
Authority: CN
Inventors: 马朋涛; 宋建成; 杜文晓; 贾梦淑; 王文瑞; 张旭; 梁萧; 武莉茹
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: CN111235293A

Abstract

本发明公开了一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记及其应用，所述KASP分子标记为YTU6RL，其KASP分子标记YTU6RL的引物包括黑麦等位型上游引物YTU6RL‑F、小麦等位型上游引物YTU6RL‑H和共用下游引物YTU6RL‑C；所述黑麦等位型上游引物YTU6RL‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述小麦等位型上游引物YTU6RL‑H的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述共用下游引物YTU6RL‑C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明提供了一个能够精准鉴定黑麦的6RL染色体的KASP分子标记，可高通量检测和追踪小麦背景下是否携带黑麦6RL染色体，加快黑麦6RL染色体上优异基因的育种利用，该标记遗传稳定性好、分辨率高，可有效应用于小麦‑黑麦种质资源创新和分子标记辅助选择育种。

Description

一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和遗传育种领域，具体地说是一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记及其应用。

背景技术

普通小麦（Triticum aestivum L.，2n = 42，AABBDD）是世界上最重要的粮食作物之一，可为人类提供约20%的能量，小麦的高产、稳产对国家粮食安全和人们生活水平提高至关重要。然而，小麦育种在过去发展过程中，往往通过种间杂交创造新的变异进行遗传改良，随着品种间广泛的相互杂交，主要品种的遗传背景趋向一致，严重限制了小麦产量、品质和抗逆抗病性的提升，致使突破性小麦品种的选育更加困难。小麦近缘种属植物往往蕴藏着丰富的遗传变异，携带大量与高产、优质、抗病和抗逆等优良性状相关的优异基因，可通过与普通小麦进行远缘杂交转移到小麦背景中，应用于小麦遗传改良，可大大推动突破性小麦新品种的选育。

黑麦（Secale cereale L.，2n = 2x = 14，RR）为小麦重要的近缘属植物之一，是小麦遗传改良重要的基因源之一，在小麦遗传育种中具有重要应用价值。在过去几十年中，育种家通过远缘杂交已创制了丰富的小麦-黑麦附加系、代换系和易位系材料，将黑麦携带的大量优异基因转移到了小麦背景中，是小麦遗传育种中利用最成功的近缘植物之一。

在黑麦7条染色体中，第6号染色体的长臂6RL携带了众多可应用于小麦遗传改良的优异基因，尤其是抵抗各种小麦病害的优良基因，目前已被成功以6RL染色体臂易位的形式转移到了普通小麦背景中，有效改善了普通小麦抗病性状。例如，Friebe等（1996）和Wanget al. （2010）分别报道了黑麦6RL染色体臂携带了小麦抗白粉病基因（Friebe et al.Characterization of wheat-alien translocations conferring resistance todiseases and pests: current status. Euphytica, 1996, 91: 59–87; Wang et al.Allocation of a powdery mildew resistance locus to the chromosome arm 6RL ofSecale cereale L. cv.‘Jingzhouheimai’. Euphytica, 2010, 176: 157-166）；Wehling（等）报道了黑麦6RL染色体臂携带叶锈病抗性基因（Wehling et al. Leaf-rustresistance in rye (Secale cereale L.). 1. Genetic analysis and mapping ofresistance genes Pr1 and Pr2. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107:432–438）。Mukai等（1993）报道了黑麦6RL染色体携带小麦抗瘿蚊基因（ Mukai et al.Molecular cytogenetic analysis of radiation-induced wheat-rye terminal andintercalary chromosomal translocations and the detection of rye chromatinspecifying resistance to Hessian fly. Chromosoma, 1993, 102: 88–95）;Gallego（等）报道了黑麦6RL染色体臂携带了小麦抗铝胁迫相关的基因（Gallego et al. Geneticcontrol of aluminium tolerance in rye (Secale cereale L.). Theoretical andApplied Genetics, 1997, 95: 393–399）；Taylor等（1998）报道了黑麦6RL染色体臂携带了小麦抗包囊线虫相关的基因（Taylor et al. A molecular genetic map of the longarm of chromosome 6R of rye incorporating the cereal cyst nematode resistancegene, CreR. Theoretical and Applied Genetics, 1998, 97: 1000–1012）。因此，黑麦6RL染色体臂上优异基因的发掘与利用，对丰富小麦遗传变异、促进小麦遗传改良具有重要意义。

小麦与黑麦远缘杂交之后，如何快速、准确和简便地追踪和鉴定导入小麦背景中的黑麦遗传物质，对加速种质创新、提高选择的准确性十分关键。虽然细胞学水平的检测技术，如基因组原位杂交（Genomic in situ hybridization，GISH）和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术，可以直观准确的鉴定小麦背景中外缘物质，但是成本和技术上的要求使得该技术在一定程度上受到限制。随着分子标记的发展，利用分子标记检测小麦遗传背景中的外缘物质大大提高了种质创新和分子标记辅助选择的效率，尤其是以SNP（Single nucleotide polymorphism）为基础的第三代分子标记的出现，大大提升了基因分型的效率。

KASP（Kompetitive allele specific PCR）技术是一种基于PCR过程中引物末端碱基特异性匹配来实现SNP/InDel（Insertion-deletion）分型的方法，能够精确地进行双等位基因分型。而且KASP标记可避免实验室凝胶电泳，实现自动化、平台化操作，具有高通量、低成本、遗传稳定性好等特点。鉴于此特点，KASP标记目前已经在小麦基因定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种中发挥了重要作用。得益于近年来小麦近缘种属植物基因测序信息的不断完善，小麦背景下追踪外缘物质也不断有成功的报道。例如，Tiwari等（2014）开发了可用于检测小麦-卵穗山羊草后代材料中 5M^g外缘成分的KASP标记（Tiwari et al.SNP Ddiscovery for mapping alien introgressions in wheat. BMC genomics, 2014,15, 273）；Ma等（2019）开发了一系列检测冰草染色体的KASP标记，用于小麦基因组中冰草遗传物质的追踪和选择（Ma et al. Development of P genome-specific SNPs andtheir application in tracing Agropyron cristatum introgressions in commonwheat. Crop Journal, 2019, 37,151–162.）。这些KASP标记成功应用于了小麦背景中外缘遗传物质的检测，为加速外缘染色体片段中优异基因的追踪与应用提供了有力支撑。然而，黑麦作为小麦远缘杂交最成功和应用最为广泛的外缘种属，却鲜有特异染色体臂KASP标记的报道，具有重要育种应用价值的6RL染色体的特异KASP标记也尚未有特异KASP标记报道。因此，利用黑麦基因组信息，寻找6RL染色体臂上与小麦基因组特异的SNP位点，开发黑麦6RL染色体臂特异的KASP标记，能够快速、准确、低成本、高通量地实现小麦-黑麦后代材料中6RL染色体的检测，加速6RL上优异基因向小麦的转移，高效应用于小麦-黑麦种质资源创新和分子标记辅助选择育种。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记及其应用，为高通量检测和追踪小麦背景下黑麦6RL染色体、加快黑麦6RL染色体上优异基因向小麦背景的转移和利用提供了有力工具，可有效应用于小麦-黑麦种质资源创新和分子标记辅助选择育种。

本发明是通过以下方法实现的：一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记，所述KASP分子标记为YTU6RL，其KASP分子标记YTU6RL的引物包括黑麦等位型上游引物YTU6RL-F、小麦等位型上游引物YTU6RL-H和共用下游引物YTU6RL-C；

所述黑麦等位型上游引物YTU6RL-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述小麦等位型上游引物YTU6RL-H的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述共用下游引物YTU6RL-C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所述的黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记在小麦-黑麦种质资源创新和分子标记辅助选择育种中的应用。

所述的黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记在鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的应用。

本发明还提供了一种鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的DNA，作为模板；

（2）利用所述KASP分子标记YTU6RL的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

所述KASP分子标记YTU6RL的引物包括黑麦等位型上游引物YTU6RL-F、小麦等位型上游引物YTU6RL-H和共用下游引物YTU6RL-C；所述黑麦等位型上游引物YTU6RL-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述小麦等位型上游引物YTU6RL-H的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述共用下游引物YTU6RL-C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

（3）采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物基因型；37℃测量荧光信号，Bio-Rad CFX Manager 3.1读取分型结果；分型结果中若等位型为Allele1/Allele1则为黑麦的基因型，若等位型为Allele1/Allele2则为小麦中携带黑麦6RL染色体臂的基因型，若等位型为Allele2/Allele2则为不含黑麦6RL染色体臂的小麦的基因型。

所述的鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的方法，所述PCR扩增的反应体系为：10-30ng/μL DNA 3.0μL，2×KASP Maseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH₂O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中所述黑麦等位型上游引物YTU6RL-F和小麦等位型上游引物YTU6RL-H的浓度均为12μM；共用下游引物YTU6RL-C的浓度为30 μM。

所述的鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的方法，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，然后58℃退火并延伸60秒，38个循环。

本发明提供了一个能够精准、高通量鉴定黑麦的6RL染色体的KASP分子标记，利用黑麦基因组与小麦基因比对，基于黑麦与小麦基因组间的差异SNP位点开发，发掘6RL染色体臂上特异的SNP位点，开发黑麦6RL染色体臂特异的KASP分子标记，设计了特异KASP分子标记引物，可高通量检测和追踪小麦背景下是否携带黑麦6RL染色体，加快黑麦6RL染色体上优异基因的育种利用，该标记遗传稳定性好、分辨率高，可有效应用于小麦-黑麦种质资源创新和分子标记辅助选择育种。

具体来讲，本发明较现有技术的优点在于：

1）本发明开发的黑麦6RL染色体臂特异分子标记YTU6RL的类型是KASP标记，相比于传统的基于PCR扩增的黑麦6RL染色体臂特异分子标记，KASP标记YTU6RL遗传稳定性好、操作简单，可以摆脱实验室凝胶电泳的限制，快速、高通量、平台化的应用于检测和追踪小麦-黑麦后代中的6RL染色体，提高小麦-黑麦种质创新和分子标记辅助选择育种的精度和效率。

2）本发明开发的KASP标记基于SNP位点，遗传稳定性好，分辨率高，含有该SNP位点的黑麦染色体片段都可以检测出来，对于携带该SNP位点的6RL小片段易位系的检测和追踪十分重要。

3）本发明开发的KASP标记是共显性分子标记，在普通小麦、黑麦及小麦-黑麦6RL导入系分别呈现不同的等位型，既可以追踪小麦背景中的黑麦遗传物质，也可以用于小麦和黑麦染色体变化的分析。

附图说明

图1为利用黑麦6RL染色体臂特异的KASP标记YTU6RL检测小麦、黑麦及整套小麦-黑麦附加系和端体附加系的分型结果图。

图2利用黑麦6RL染色体臂特异的KASP标记YTU6RL对小麦-黑麦后代材料中6RL易位系进行选择的育种利用图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 黑麦通用6RL染色体特异共显性KASP分子标记YTU6RL的获得

1、基因组DNA的提取

利用CTAB法分别提取帝国黑麦、King II黑麦、荆州黑麦、中国春小麦、一套整套小麦-黑麦二体附加系和端体附加系的基因组DNA，具体操作步骤如下：

（1）取一叶期的新鲜叶片于研钵中，液氮冷冻研磨，每个样品取0.5g研磨的粉末于2mL离心管中；

（2）向离心管中加入65℃预热的CTAB提取液600μL，65℃水浴45min，每隔15min摇晃混匀一次；

（3）取出离心管冷却至室温，加入与CTAB提取液等量的氯仿-异戊醇(24:1)，置于摇床15min使其充分混匀，然后12000rpm、4℃离心15min，吸取上清液移至1.5mL离心管；

（4）加入3倍体积的-20℃预冷的无水乙醇于上清液离心管中，混匀至絮状DNA出现，放入-20℃冰箱30min；

（5）用移液枪头挑出絮状沉淀至新的1.5mL离心管中，用70%乙醇冲洗DNA 2次后干燥DNA；

（6）加入60μL 1×TE缓冲液溶解DNA；

（7）待DNA充分溶解后，检测浓度与纯度，配置10-30ng/μL工作液，用做PCR扩增模板。

2、黑麦6RL染色体臂特异KASP标记的开发

利用黑麦参考基因组序列（NCBI: Rye_Lo7_WGS_contigs GenBank assembly）与小麦参考基因序列（IWGSC Reference Sequence v1.0）进行序列比对分析，获得与小麦A、B和D三套亚组均特异的黑麦序列，寻找到一个黑麦6RL染色体上特异的SNP位点，根据该位点开发了一个KASP标记YTU6RL，其引物包括：

标有FAM的黑麦等位型上游引物YTU6RL-F的核苷酸序列：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctTGGAAGGAGGATGAATGAGCT-3’，如SEQ ID NO:1所示；

标有HEX的小麦等位型上游引物YTU6RL-H的核苷酸序列：

5’-gaaggtcggagtcaacggattTGGAAGGAGGATGAATGAGCA-3’，如SEQ ID NO:2所示；

共用下游引物YTU6RL-C的核苷酸序列：

5’-GATGTGCCTGCCCGTG-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

PCR扩增体系为：10-30ng/μL DNA 3.0μL，2×KASP Maseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH₂O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中的黑麦等位型及小麦等位型上游引物工作液浓度均为12μM；共用下游引物工作浓度为30 μM；

PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，然后每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，58℃退火并延伸60秒，38个循环。

按照如上所述的PCR扩增程序和反应体系进行KASP基因分型，采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物的基因型；37℃测量荧光信号，Bio-Rad CFX Manager 3.1读取分型结果。分型结果如图1所示。图中横轴远端样品群为三个黑麦品种帝国黑麦、King II黑麦、荆州黑麦，等位型为“Allele1/Allele1”，荧光读取呈现橙色圆形点；纵轴远端样品群为中国春小麦和不含6RL染色体的小麦-黑麦材料，等位型为“Allele2/Allele2”，荧光读取呈现蓝色方形点；中间样品群为含有6R附加系和6RL端体系，荧光读取呈现绿色三角形点，等位型为“Allele1/Allele2”；近原点处三个方形黑点代表无模板对照。以上结果说明KASP分子标记YTU6RL在小麦、黑麦及整套小麦-黑麦二体附加系和端体附加系中正确分型，可作为6RL染色体臂的特异分子标记。

实施例2 黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记YTU6RL的应用

黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记YTU6RL检测携带6RL的小麦-黑麦后代材料。

待测材料包括：

3个黑麦品种：帝国黑麦、King II黑麦、荆州黑麦；

10个经基因组原位杂交GISH/FISH鉴定并确认的6RL易位系；

11个不携带6RL染色体臂的普通小麦品种：中国春、山农29、泰农18、烟农19、烟农21、泰农1014、济南17、良星619、济麦20、济麦21、宁麦13.

以上述材料的DNA为模板，利用本发明开发的KASP分子标记YTU6RL的引物：

标有FAM的黑麦等位型上游引物YTU6RL-F的核苷酸序列：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctTGGAAGGAGGATGAATGAGCT-3’，如SEQ ID NO:1所示；

标有HEX的小麦等位型上游引物YTU6RL-H的核苷酸序列：

5’-gaaggtcggagtcaacggattTGGAAGGAGGATGAATGAGCA-3’，如SEQ ID NO:2所示；

共用下游引物YTU6RL-C的核苷酸序列：

5’-GATGTGCCTGCCCGTG-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

PCR扩增体系为：10-30ng/μL DNA 3.0μL，2×KASP Maseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH₂O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中的黑麦等位型及小麦等位型上游引物工作液浓度均为12μM；下游引物工作浓度为30 μM。

PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，然后58℃退火并延伸60秒，38个循环。

按照如上所述的PCR扩增反应体系及优化扩增程序进行KASP分型，采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物的基因型；37℃测量荧光信号，Bio-Rad CFX Manager 3.1读取分型结果。分型结果如图2所示。图中横轴远端样品群为三个黑麦品种帝国黑麦、King II黑麦、荆州黑麦，等位型为“Allele1/Allele1”，荧光读取呈现橙色圆形点；纵轴远端样品群为中国春小麦和不含6RL染色体的小麦-黑麦材料，等位型为“Allele2/Allele2”，荧光读取呈现蓝色方形点；中间样品群为经基因组原位杂交GISH/FISH鉴定并确认的6RL易位系，荧光读取呈现绿色三角形点，等位型为“Allele1/Allele2”；近原点处三个方形黑点代表无模板对照。以上结果说明KASP分子标记YTU6RL可正确追踪和检测小麦背景下的6RL染色体臂。

因此，本发明提供的黑麦6RL染色体臂特异KASP标记YTU6RL，可用于小麦背景下黑麦6RL染色体臂的检测，也可应用于小麦-黑麦种质资源创新和分子标记辅助选择育种。

以上所述用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以做一些修改或改进，使之对本领域技术人员是易于操作的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 烟台大学

<120> 一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 标有FAM的黑麦等位型上游引物YTU6RL-F

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc ttggaaggag gatgaatgag ct 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 标有HEX的小麦等位型上游引物YTU6RL-H

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat ttggaaggag gatgaatgag ca 42

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 共用下游引物YTU6RL-C

<400> 3

gatgtgcctg cccgtg 16

Claims

1.一种黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记的引物，其特征在于，所述KASP分子标记为YTU6RL，其KASP分子标记YTU6RL的引物包括黑麦等位型上游引物YTU6RL-F、小麦等位型上游引物YTU6RL-H和共用下游引物YTU6RL-C；

所述共用下游引物YTU6RL-C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种权利要求1所述的黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记的引物在小麦-黑麦种质资源和分子标记辅助选择育种中的应用。

3.一种权利要求1所述的黑麦6RL染色体臂特异KASP分子标记的引物在鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的应用。

4.一种鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的DNA，作为模板；

（3）采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物基因型；37℃测量荧光信号，Bio-RadCFX Manager 3.1读取分型结果。

5.根据权利要求4所述的鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：10ng/μL~30ng/μL DNA 3.0μL，2×KASPMaseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH₂O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中所述黑麦等位型上游引物YTU6RL-F和小麦等位型上游引物YTU6RL-H的浓度均为12μM；共用下游引物YTU6RL-C的浓度为30μM。

6.根据权利要求4或5所述的鉴定小麦-黑麦后代材料中是否携带黑麦6RL染色体臂的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒， 64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒， 58℃退火并延伸60秒，38个循环。