CN101845499A

CN101845499A - 一种追踪荆州黑麦染色体6rl抗白粉病基因的分子标记方法

Info

Publication number: CN101845499A
Application number: CN201010163311A
Authority: CN
Inventors: 亓增军; 庄丽芳; 王丹; 孙玲; 冯祎高; 刘振乾
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-05-05
Filing date: 2010-05-05
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2030-05-05
Also published as: CN101845499B

Abstract

本发明公开了一种追踪荆州黑麦染色体6RL抗白粉病基因的分子标记方法，属于植物生物技术领域。本发明提供的引物对是3对EST-STS引物中的任何一对，包括引物对CINAU145、CINAU450和CINAU895，其特征在于：这些标记可在荆州黑麦中扩增出与小麦不同的条带，并通过辉县红-荆州黑麦6R附加系和端体附加系中的扩增分析定位于6R染色体长臂，有助于在小麦背景中快速鉴定6RL上携有的抗白粉病基因，并用于标记辅助选择。

Description

一种追踪荆州黑麦染色体6RL抗白粉病基因的分子标记方法

一、技术领域

本专利公开了一种追踪荆州黑麦染色体6RL抗白粉病基因的分子标记方法，属于植物生物技术领域。

二、背景技术

由白粉病菌(Blumeria graminis DC.)引起的小麦白粉病是威胁小麦生产的重要病害之一。小麦对白粉病抗性一般由单基因控制，符合基因对基因假说。国际上现已正式定名的抗白粉病基因有43个，包括近60个位点(见参考文献：McIntosh RA，Yamazak Y，Dubcovsky J，Rogers J，Morris C，SomersDJ，Appels R，Devos KM(2008)Catalogue of gene symbols for wheat.Proc 11th Inter Wheat Genet Symp，August 24-29，Brisbane，Qld Australia；Hua W，Liu ZJ，Zhu J，Xie CJ，Yang TM，Zhou YL，Duan XY，SunQX，Liu ZY(2009)Identification and genetic mapping of Pm42，a new recessive wheat powdery mildewresistance gene derived from wild emmer(Triticum turgidum var.dicoccoides).Theor Appl Genet 119：223-230；He RL，Chang ZJ，Yang ZJ，Yuan ZY，Zhan HX，Zhang XJ，Liu JX(2009)Inheritance andmapping of powdery mildew resistance gene Pm43 introgressed from Thinopyrum intermedium into wheat.Theor Appl Genet 118：1173-1180)，分别定位于16条不同的染色体，其中13个来自普通小麦，其它30个基因源自一粒小麦、二粒小麦、波斯小麦、提莫菲维小麦、硬粒小麦等小麦属或小麦近缘种属山羊草、黑麦、簇毛麦等。随着研究的深入，一些与白粉病成株期抗性有关的QTLs也分别定位于除6D和7A外的19条小麦染色体上，其中比较稳定的在不同群体中均可检测到的位点涉及小麦1A、1B、2A、2B、5D、6A和7B染色体(见参考文献：Keller M，Keller B，Schachermayr G.，Winzeler M，Schmid J E，Stamp P，Messmer M M(1999)Quantitative trait loci for resistance against powdery mildew ina segregating wheat×spelt population.Theor Appl Genet，98：903-912；Liu，S X，Griffey C A，SaghaiMaroof M A(2001)Identification of molecular markers associated with adult plant resistance to powderymildew in common wheat cultivar Massey.Crop Sci，41：1268-1275；Chantret N，Sourdille P，

M，Tavaud M，Bernard M，Doussinault G(2000)Location and mapping of the powdery mildew resistancegene MlRE and detection of a resistance QTL by bulked segregate analysis(BSA)with microsatellites inwheat，Theor Appl Genet，100：1217-1224；Mingeot D，Chantret N，Baret P V，Dekeyser A，Boukhatem N，Sourdille P，Doussinault G，Jacquemin J M(2002)Mapping QTL involved in adult plant resistance topowdery mildew in the winter wheat line RE714 in two susceptible genetic backgrounds，Plant Breed，121：133-140；Tucker D M，Griffey C A，Liu S，Brown-Guedira G，Marshal D S，Saghai Maroof M A(2007)Confirmation of three quantitative trait loci conferring adult plant resistance to powdery mildew in twowinter wheat populations，Euphytica，155：1-13)。在我国，在生产上得到应用的抗白粉病主效基因包括Pm4a、Pm6、Pm8、Pm21等(见参考文献：齐莉莉，陈佩度，刘大钧，周波，张守忠，盛宝钦，向齐君，段霞渝，周益林(1995)小麦白粉病新抗源-基因Pm21，作物学报，21(3)：257-262)，其中来自黑麦的Pm8应用最为广泛，在生产中发挥了很大作用。但由于白粉病菌生理小种的演变，包括黑麦Pm8基因在内的许多基因的抗性相继丧失(见参考文献：Bennett F G A(1984)Resistance to powderymildew in wheat：a review of its use in agriculture and breeding programmes，Plant Pathology，33：279-300)，严重威胁小麦生产。发掘和利用新的抗白粉病基因，并与代表水平抗性和持久抗性的成株期抗性相结合，对于小麦高产稳产具有很重要的意义。

栽培黑麦(Secale cerale L.)是最早也是最成功用于小麦改良的物种，由于具有较大的遗传多样性，迄今已发掘出20多个不同的抗病基因(见参考文献：McIntosh RA，Yamazak Y，Dubcovsky J，RogersJ，Morris C，Somers DJ，Appels R，Devos KM(2008)Catalogue of gene symbols for wheat.Proc 11th InterWheat Genet Symp，August 24-29，Brisbane，Qld Australia)，其中抗白粉病基因4个，分别为Pm7、Pm8、Pm17和Pm20，分别源于Rosen、Petkus、Insave FA和Prolific 4个品种。荆州黑麦是发现于我国湖北省荆州地区襄河两岸沙丘及滩地的一种栽培黑麦类型，不仅抗多种麦类病害、耐瘠薄，而且易于与普通小麦杂交，并已有培育成功小麦品种(系)的报道(见参考文献：吴琴生，王耀南(1983)湖北省荆州地区农科所小麦抗病育种经验简介，江苏农业科学，9：9-10；蔡习文(1994)荆州黑麦的染色体分析与C-显带研究，华中农业大学学报，13(1)：90-92；史建荣，王裕中，陈怀谷，沈素文(2000)小麦纹枯病品种抗性鉴定技术及抗病资源的筛选与分析，植物保护学报，107：107-112；Wang XE，Zhang QP，Wang YN，Chen PD，Chu CG，Qi ZJ，Zhuang LF，Liu DJ(2003)Identification and geneticanalysis of new germplasms with wheat spindle streak mosaic bymovirus(WSSMV)resistance.In：PognaNE，Romano M，Pogna EA，Galterio G(eds)Proc 10th Int Wheat Genet Symp，Instituto Sperimentale perla Cerealcoltura，Rome，Italy.vol 3，pp1284-1286；陈桥生，张道荣，陈善杰，汤清益，张晓波(2006)多基因聚合在鄂麦19多抗性选育中的应用，麦类作物学报，26(6)：35-37)。

经多年鉴定，本研究室发现荆州黑麦及本研究所创造的辉县红-荆州黑麦双二倍体荆辉1号高抗小麦白粉病、梭条花叶病等多种病害(见参考文献：亓增军，庄丽芳，刘大钧，陈佩度(2000)将荆州黑麦种质导入栽培小麦的研究(I)，南京农业大学学报，23(4)：1-4)，并已成功培育出辉县红-荆州黑麦二体或多重附加系11个，但并未涉及到6R染色体(见参考文献：李爱霞，亓增军，裴自友，庄丽芳，冯祎高，王秀娥，普通小麦辉县红-荆州黑麦异染色体系的选育及其梭条花叶病抗性鉴定，作物学报，2007，33(4)：637-643)。本申请利用已经发表的172个黑麦EST标记，筛选出18个荆州黑麦多态性标记，其中3个在现有附加系中没有定位可作为追踪荆州黑麦6R染色体的候选标记。利用这套标记对辉县红-荆州黑麦双二倍体荆辉1号(见参考文献：亓增军，庄丽芳，刘大钧，陈佩度(2000)将荆州黑麦种质导入栽培小麦的研究(I)，南京农业大学学报，23(4)：1-4)与辉县红杂交、回交BC₂F₁\F₂\F₃进行分析，发现单株100-2-2和16-3仅包含3个6R染色体的候选标记，进一步从其自交后代中综合利用分子标记和染色体荧光原位杂交鉴定出单体异附加系H-J MA6R、二体异附加系H-J DA6R、单端体异附加系H-J MtA6RS和H-J MtA6RL、端二体异附加系H-J DtA6RL，其中添加6R染色体的单体异附加系H-J MA6R、二体异附加系H-J DA6R和添加6R染色体长臂的端二体异附加系H-J DtA6RL在全生育期均高抗白粉病，而添加6R染色体短臂的单端体异附加系H-J MtA6RS则表现为感病，说明荆州黑麦6RL携有高抗白粉病基因，是小麦抗病育种的重要基因资源。

为更好地转移和利用该抗病基因，本研究根据已有的小麦EST(公知公用，来源于www.ncbi.nlm.nih.gov)设计STS引物，首先在辉县红、荆州黑麦和荆辉1号中进行扩增筛选出多态性引物，然后在涉及荆州黑麦所有染色体的一套异染色体系中进行了扩增分析，定位于6R染色体的引物在单端体异附加系H-J MtA6RS和端二体异附加系H-J DtA6RL中进行扩增，筛选出3个特异追踪6R染色体长臂及其所携抗白粉病基因的分子标记，并应用于抗白粉病小麦的辅助选择。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于公开辅助筛选小麦近缘物种荆州黑麦(Secale cereals L.cvJingzhouheimai)所携抗白粉病基因的方法用其专用引物。

技术方案

本发明所提供的辅助筛选抗白粉病小麦材料的专用引物对是引物对CINAU145、CINAU450和/或CINAU895中的任何一对；

引物对CINAU145的脱氧核糖核苷酸序列如列表中序列SEQ ID NO.1和序列SEQ ID NO.2所示；

引物对CINAU450的脱氧核糖核苷酸序列如列表中序列SEQ ID NO.3和序列SEQ ID NO.4所示；

引物对ClNAU895的脱氧核糖核苷酸序列如列表中序列SEQ ID NO.5和序列SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供辅助筛选抗白粉病小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦材料的DNA作为模板，用上述引物对中的至少一对引物进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有1500bp、400bp和/或850bp条带的待测小麦材料为候选的抗白粉病小麦。

所述PCR扩增中，每10μL的PCR反应体系如下：包含20ng的模板DNA，10×PCR buffer 1μL(含10nmol L^-1 Tris-HCl和50nmol L^-1KCl)，1.25mmol μL^-1 dNTP 0.8μL，25mmol μL^-1 MgCl₂ 0.8μL，Taq酶0.1U，100μmol L^-1引物各0.2μL，加ddH₂O补充反应体系至10μL。所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50或55℃退火45s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min；所述检测PCR产物是对扩增产物进行8％非变性连续聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝39∶1)电泳，然后银染显色。

所述引物对CINAU145、CINAU450和/或CINAU895在制备辅助筛选抗白粉病小麦的试剂盒中的应用。所述引物对、方法及试剂盒均可在小麦育种中得到应用。

有益效果

本发明公开的6RL上的3个分子标记(Xcinau145、Xcinau450和Xcinau895)可有效追踪导入小麦背景中的荆州黑麦6R染色体长臂所携抗白粉病基因，用于分子标记辅助选择，加快该基因向栽培品种的转移与利用。

四、附图说明

图1 EST-STS标记Xcinau145在辉县红-荆州黑麦异染色体系中的扩增，M：DL2000；1：辉县红；2：黑麦；3：荆辉1号；4：H-J DA6R；5：H-J MtA6RS；6：H-J DtA6RL；箭示6RL特异带.

图2 EST-STS标记Xcinau895在辉县红-荆州黑麦6R端体异附加系中的扩增，M：DL2000；1：辉县红；2：黑麦；3：荆辉1号；4：H-J DA6R；5：H-J MtA6RS；6：H-J DtA6RL；箭示6RL特异带.

图3 EST-STS标记Xcinau145在辉县红-荆州黑麦MA6R自交后代中的扩增，M：DL2000；1：辉县红；2：黑麦；3：荆辉1号；4：100-2-26；5：100-2-42；6：100-2-67；7：100-2-60；8：100-2-72；9：100-2-85；10：100-2-87；11：100-2-13；12：100-2-35；13：100-2-79；14：100-2-14；15：100-2-27；16：100-2-43.箭示6RL特异带.R：抗病；S：感病.

图4 EST-STS标记Xcinau450在辉县红-荆州黑麦MA6RL自交后代中的扩增，M：DL2000；1：辉县红；2：黑麦；3：荆辉1号；4：16-3-3-69；5：16-3-3-73；6：16-3-3-74；7：16-3-3-56；8：16-3-3-57；9：16-3-3-59；10：16-3-3-61；11：16-3-3-62；12：16-3-3-68；13：16-3-3-70；14：16-3-3-72；15：16-3-3-77；16：16-3-3-80；17：16-3-3-85.箭示6RL特异带.R：抗病；S：感病.

五、具体实施方式

以下的实施方式为便于更好地理解本发明，但并不限定于本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

所有引物合成均由英骏生物技术有限公司(上海)完成。以下实施例中所有用到的小麦材料均为公知公用。

(一)EST标记的开发及其荆州黑麦染色体上的定位

通过从Graingenes(http://www.graingenes.org)和GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载定位于小麦第6群染色体上的EST(见参考文献：Randhawa HS，Dilbirligi M，Sidhu D，et al.(2004)Deletion mapping of homoeologous group 6-specific wheat expressed sequence tags.Genetics，168：677-686)，用Primer Premier 5.0程序设计引物，原则为引物长度18-24bp；退火温度Tm值40.4-65.4℃，且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；(G+C)含量30-70％，PCR扩增产物长度100-300bp，尽量避免引物二级结构的出现。

本研究共设计了312对EST-STS引物对普通小麦品种辉县红(公知公用)、栽培黑麦品种荆州黑麦(公知公用)、辉县红-荆州黑麦双二倍体(公知公用，见参考文献：亓增军，庄丽芳，刘大钧，陈佩度(2000)将荆州黑麦种质导入栽培小麦的研究(I)，南京农业大学学报，23(4)：1-4)进行多态性引物筛选，接着在一套辉县红-荆州黑麦异染色体系(包括H-J DA1R、H-J DA2R、H-J MA3R、H-JDA2RDS1R(1D)、H-J DA4RDS1R(1B)DS2R(2B)、H-J DA5R、H-J DA6R和H-J DA7R)(见参考文献：李爱霞，亓增军，裴自友，庄丽芳，冯祎高，王秀娥，普通小麦辉县红-荆州黑麦异染色体系的选育及其梭条花叶病抗性鉴定，作物学报，2007，33(4)：637-643)中进行了扩增分析，定位于6R染色体上的分子标记用选育出的H-J MtA6RS(2n＝43)和H-J DtA6RL(2n＝44)进行分析，筛选出3个定位于6R染色体长臂的分子标记，可以特异追踪该抗白粉病基因：

1、荆州黑麦6R染色体抗白粉病基因的分子标记Xcinau145

该标记来源于小麦EST(Genbank号：BE490610)，其引物对CINAU145，脱氧核糖核苷酸序列如列表中序列1和序列2所示，该引物采用以下扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min，在辉县红中扩增出约1600bp的条带，荆州黑麦扩增出1500bp的条带，H-J MA6R、H-J DA6R和H-J DtA6RL能扩增出这两条带，而H-J MtA6RS只能扩增辉县红的条带(图1)，1500bp的特异条带能有效追踪导入小麦辉县红背景中的荆州黑麦6R染色体长臂；

2、荆州黑麦6R染色体抗白粉病基因的分子标记Xcinau450

该标记来源于小麦EST(Genbank号：BE443156)，其引物CINAU450，脱氧核糖核苷酸序列如列表中序列5和序列6所示，该引物采用以下扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min，在辉县红中扩增出约270bp和420bp的条带，荆州黑麦扩增出400bp的条带，H-JMA6R、H-J DA6R和H-J DtA6RL能扩增出这3条带，而H-J MtA6RS只能扩增辉县红的条带(图2)，400bp的特异条带能有效追踪导入小麦辉县红背景中的荆州黑麦6R染色体长臂；

3、荆州黑麦6R染色体抗白粉病基因的分子标记Xcinau895

该标记来源于小麦EST(Genbank号：EB515929)，其引物CINAU895，脱氧核糖核苷酸序列如列表中序列7和序列8所示，该引物采用以下扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min，在辉县红中扩增出约1100bp的条带，荆州黑麦扩增出850bp的条带，H-J MA6R、H-J DA6R和H-J DtA6RL能扩增出这两条带(图2)，而H-J MtA6RS只能扩增辉县红的条带，850bp的特异条带能有效追踪导入小麦辉县红背景中的荆州黑麦6R染色体长臂；

这3个小麦EST-STS引物所扩增出的黑麦特异条带可有效追踪导入小麦背景中的荆州黑麦6R染色体、6RL端体及其所携有的抗白粉病基因。

(二)3个荆州黑麦染色体6RL特异标记在辅助选择抗白粉病小麦中的应用

应用本专利开发的3个6RL特异标记和前人定位的6RS特异标记Xscm304(见参考文献：Saal Band G Wricke(1999)Development of simple sequence repeat markers in rye(Secale cereale L.).Genome，42：964-972)在辉县红-荆州黑麦MA6R和MtA6RL的自交后代中进行扩增分析，结合白粉病抗性鉴定(表1)，结果表明，在鉴定的111个单株中，31个单株包含全部4个6R标记(Xscm304-6RS、Xcinau145-6RL、Xcinau450-6RL和Xcinau895-6RL)，均高抗白粉病(图3)，仅包含6RL标记(Xcinau145、Xcinau450和Xcinau895)的3个单株(图4)也高抗白粉病，而仅包含6RS标记Xscm304-6RS的5个单株及未检测到任何荆州黑麦特异位点的其余72个单株均高感白粉病，进一步确证荆州黑麦染色体6RL携有抗白粉病基因，定位于6RL的3个标记(Xcinau145、Xcinau450和Xcinau895)可应用于该抗性基因的分子标记辅助选择，培育抗白粉病小麦。

表1 MA6R和MtA6RL自交后代的染色体组成与白粉病抗性

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种追踪荆州黑麦染色体6RL抗白粉病基因的分子标记方法

<130>说明书

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CINAU145F

<222>(1)..(23)

<223>

<400>1

atcctgttacccagtatctacct 23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CINAU145R

<222>(1)..(20)

<223>

<400>2

atgttccatttctgctccaa 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CINAU450F

<222>(1)..(20)

<223>

<400>3

tcgacacgagcaagattcac 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CINAU450R

<222>(1)..(20)

<223>

<400>4

gtcagcgttgaggagagacc 20

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CINAU895F

<222>(1)..(18)

<223>

<400>5

gctttgcctcagtatgtc 18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CINAU895R

<222>(1)..(18)

<223>

<400>6

gtgatcccgaagtttgtt 18

Claims

1.辅助筛选荆州黑麦6R染色体长臂所携抗白粉病基因的引物对，是引物对CINAU145、引物对CINAU450和/或引物对CINAU895中的任何一对：

引物对CINAU895的脱氧核糖核苷酸序列如列表中序列SEQ ID NO.5和序列SEQ ID NO.6所示。

2.一种辅助筛选荆州黑麦6R染色体长臂抗白粉病基因的方法，包括如下步骤：以待测小麦材料的DNA作为模板，用权利要求1所述引物对中的至少一对引物进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有1500bp、400bp和/或850bp条带的待测材料为候选的抗白粉病小麦材料。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，每10μL的PCR反应体系如下：

包含20ng的模板DNA，10×含10nmol L^-1Tris-HCl和50nmol L^-1KCl的PCR buffer 1μL，1.25mmolμL^-1dNTP 0.8μL，25mmolμL^-1 MgCl₂0.8μL，Taq酶0.1U，100μmol L^-1引物各0.2μL，加ddH₂O补充反应体系至10μL。

所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50或55℃退火45s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min

所述检测PCR产物是对扩增产物进行8％非变性连续聚丙烯酰胺凝胶Acr∶Bis＝39∶1电泳，然后银染显色。

4.权利要求1所述引物对CINAU145、CINAU450和/或CINAU895在制备辅助筛选抗白粉病小麦的试剂盒中的应用。

5.含有权利要求1所述引物对中至少一对的辅助筛选抗白粉病小麦的试剂盒。

6.权利要求1所述引物对在小麦育种中的应用。

7.权利要求2或3所述方法在小麦育种中的应用。

8.权利要求5所述试剂盒在小麦育种中的应用。