CN117535387A - 一套基于液相芯片和kasp技术开发的水稻核心snp标记组合及其应用 - Google Patents

一套基于液相芯片和kasp技术开发的水稻核心snp标记组合及其应用 Download PDF

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CN117535387A CN202311571199.9A CN202311571199A CN117535387A CN 117535387 A CN117535387 A CN 117535387A CN 202311571199 A CN202311571199 A CN 202311571199A CN 117535387 A CN117535387 A CN 117535387A
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Abstract

本发明公开了一套基于液相芯片和KASP技术开发的水稻核心SNP标记组合及其应用。本发明提供了水稻基因组中60个SNP位点的如下应用：制备水稻SNP位点检测试剂盒；对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型；构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库；对水稻种质资源进行遗传多样性分析。本发明所提供的60个SNP位点组合，可应用于水稻分子指纹数据库构建、品种鉴定以及种质资源遗传多样性分析；而且这60核心位点组合的应用相比较目前广泛使用的生化检测方法以及SSR方法可极大提高检测准确度、缩短检测时间、提高检测水平。这将为分子检测提供更有效、可靠的技术手段；并将为水稻品种鉴定提供重要的技术支撑。

Description

一套基于液相芯片和KASP技术开发的水稻核心SNP标记组合 及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一套基于液相芯片和KASP技术开发的水稻核心SNP标记组合及其应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，水稻新品种的选育和推广对水稻生产具有重要意义。据统计全国每年审定的水稻新品种有上千个，品种间的同质化问题也越来越严重。育种技术的不断改进使得品种间的差异变得更加细微，传统的品种鉴定方法显得捉襟见肘。分子标记能从本质上反映生物个体差异，具有高度个体特异性和稳定可靠性，能够准确、快速的对新品种及现存品种进行鉴定。随着分子生物学、生物技术的快速发展，各种DNA指纹技术相继问世，这些技术各具特色，使得分子标记在品种鉴定方面发挥着重要作用。
用于品种区分的分子标记有多种类型，如限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、扩增片段长度多态性(AmplifiedFragment Length Polymorphism，AFLP)、简单重复序列标记(Simple Sequence Repeats，SSR)、单核苷酸多样性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)等，不同类型的分子标记都可以用于区分品种间的多态性。RFLP、AFLP标记，由于标记开发的复杂性、检测的稳定性、检测方法不便捷及数据整合等问题未广泛应用。目前应用最广泛的是SSR标记，然而，SSR标记也具有一定的局限性：(1)设计SSR引物需要知道目标序列信息(2)具有种属限制，只有极少数SSR引物可在亲缘关系较近的不同物种中应用。(3)操作繁琐，效率低，显色过程容易存在背景干扰；数据读取不易实现自动化。由于SSR本身的局限性，使得这一技术已不能满足当前的种业发展需求。
SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量多，多态性丰富，是基因组上多态性最高的遗传变异之一。SNP标记由于在基因组中分布具有高密度、检测方法高通量和易于自动化分析等特点而被广泛用于分子标记的开发和应用。随着高通量测序技术的飞速发展，越来越多的农作物的基因组重测序使得SNP标记日益丰富。基于这些丰富的SNP数据，以SNP芯片阵列和重测序SNP分型技术为主的基因分型平台得到了快速发展。2021年6月20日，全国农技中心在北京组织召开农业行业标准审定会，《水稻品种真实性鉴定SNP标记法》《玉米品种真实性鉴SNP标记法》《小麦品种真实性鉴定SNP标记法》3项标准通过审定。标志着SNP标记法在生物检测领域有着广阔的发展前景，为维护农作物品种创新、市场流通秩序等提供了强有力的技术支撑及依据。
竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-specific PCR，KASP)技术是近些年来发展起来的一种主要基于SNP的高通量基因分型技术。相较于传统的分子标记有其独特的优势，它是一种简单的无凝胶荧光聚合酶链式反应，能够在普通实验室操作的基础上满足低、中、高通量基因分型的要求，具有一定的灵活性，适用于目标位点和样本数量变化很大的实验设计，在未来作物品种鉴定中具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一套用于水稻种质鉴定的SNP位点组合。
第一方面，本发明要求保护水稻基因组中60个SNP位点在如下任一中的应用：
(1)制备水稻SNP位点检测试剂盒；
(2)对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型；
(3)构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库；
(4)对水稻种质资源进行遗传多样性分析。
所述60个SNP位点的物理位置是基于水稻品种日本晴的全基因组序列对比确定的，所述水稻品种日本晴的全基因组序列的版本号为MSU7.0；所述60个SNP位点是OsK01-OsK60；
Osk1位于1号染色体上第1228512位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk2位于1号染色体上第4645481位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk3位于1号染色体上第6644387位，其脱氧核苷酸为C或A；
Osk4位于1号染色体上第9305876位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk5位于1号染色体上第12854426位，其脱氧核苷酸为C或G；
Osk6位于1号染色体上第24749480位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk7位于1号染色体上第30545662位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk8位于2号染色体上第5785532位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk9位于2号染色体上第21772969位，其脱氧核苷酸为G或C；
Osk10位于2号染色体上第34474061位，其脱氧核苷酸为C或A；
Osk11位于2号染色体上第35882696位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk12位于3号染色体上第7956017位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk13位于3号染色体上第13775121位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk14位于3号染色体上第16579520位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk15位于3号染色体上第25181277位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk16位于4号染色体上第15846017位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk17位于4号染色体上第19209543位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk18位于4号染色体上第21469290位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk19位于4号染色体上第22842238位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk20位于4号染色体上第31997187位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk21位于5号染色体上第7384864位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk22位于5号染色体上第17035145位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk23位于5号染色体上第23305515位，其脱氧核苷酸为G或C；
Osk24位于6号染色体上第1529649位，其脱氧核苷酸为G或T；
Osk25位于6号染色体上第3166267位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk26位于6号染色体上第8454606位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk27位于6号染色体上第10345230位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk28位于6号染色体上第25220061位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk29位于7号染色体上第2865195位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk30位于7号染色体上第4660773位，其脱氧核苷酸为T或A；
Osk31位于7号染色体上第8809828位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk32位于7号染色体上第10756612位，其脱氧核苷酸为A或T；
Osk33位于7号染色体上第12924029位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk34位于7号染色体上第21324970位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk35位于7号染色体上第24622118位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk36位于8号染色体上第1530355位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk37位于8号染色体上第2275008位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk38位于8号染色体上第7890733位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk39位于8号染色体上第19466177位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk40位于8号染色体上第24070735位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk41位于9号染色体上第39319位，其脱氧核苷酸为A或T；
Osk42位于9号染色体上第10515653位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk43位于9号染色体上第12725653位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk44位于9号染色体上第13665180位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk45位于9号染色体上第17753206位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk46位于10号染色体上第369133位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk47位于10号染色体上第2335637位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk48位于10号染色体上第3787248位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk49位于10号染色体上第10724291位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk50位于10号染色体上第19029893位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk51位于11号染色体上第4374875位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk52位于11号染色体上第18935157位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk53位于11号染色体上第20525980位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk54位于11号染色体上第26085857位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk55位于11号染色体上第28010037位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk56位于12号染色体上第215397位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk57位于12号染色体上第1794727位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk58位于12号染色体上第2738115位，其脱氧核苷酸为A或T；
Osk59位于12号染色体上第13784750位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk60位于12号染色体上第24090217位，其脱氧核苷酸为T或C。
第二方面，本发明要求保护一种成套KASP引物。
本发明所要求保护的成套KASP引物为用于检测前文第一方面中所述60个SNP位点的KASP引物。
每个待测SNP位点对应的KASP引物均分别包括两条正向引物和一条反向引物；其中两条正向引物分别记作正向引物1和正向引物2；所述正向引物1为在特异性引物1的5'末端连接一种荧光标签序列后所得，所述正向引物2为在特异性引物2的5'末端连接另一种荧光标签序列后所得；所述反向引物为通用引物。
用于检测Osk01的所述特异性引物1由SEQ ID No.1的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.61的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.121所示核苷酸组成；
用于检测Osk02的所述特异性引物1由SEQ ID No.2的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.62的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.122所示核苷酸组成；
用于检测Osk03的所述特异性引物1由SEQ ID No.3的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.63的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.123所示核苷酸组成；
用于检测Osk04的所述特异性引物1由SEQ ID No.4的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.64的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.124所示核苷酸组成；
用于检测Osk05的所述特异性引物1由SEQ ID No.5的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.65的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.125所示核苷酸组成；
用于检测Osk06的所述特异性引物1由SEQ ID No.6的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.66的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.126所示核苷酸组成；
用于检测Osk07的所述特异性引物1由SEQ ID No.7的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.67的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.127所示核苷酸组成；
用于检测Osk08的所述特异性引物1由SEQ ID No.8的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.68的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.128所示核苷酸组成；
用于检测Osk09的所述特异性引物1由SEQ ID No.9的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.69的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.129所示核苷酸组成；
用于检测Osk10的所述特异性引物1由SEQ ID No.10的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.70的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.130所示核苷酸组成；
用于检测Osk11的所述特异性引物1由SEQ ID No.11的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.71的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.131所示核苷酸组成；
用于检测Osk12的所述特异性引物1由SEQ ID No.12的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.72的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.132所示核苷酸组成；
用于检测Osk13的所述特异性引物1由SEQ ID No.13的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.73的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.133所示核苷酸组成；
用于检测Osk14的所述特异性引物1由SEQ ID No.14的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.74的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.134所示核苷酸组成；
用于检测Osk15的所述特异性引物1由SEQ ID No.15的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.75的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.135所示核苷酸组成；
用于检测Osk16的所述特异性引物1由SEQ ID No.16的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.76的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.136所示核苷酸组成；
用于检测Osk17的所述特异性引物1由SEQ ID No.17的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.77的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.137所示核苷酸组成；
用于检测Osk18的所述特异性引物1由SEQ ID No.18的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.78的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.138所示核苷酸组成；
用于检测Osk19的所述特异性引物1由SEQ ID No.19的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.79的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.139所示核苷酸组成；
用于检测Osk20的所述特异性引物1由SEQ ID No.20的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.80的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.140所示核苷酸组成；
用于检测Osk21的所述特异性引物1由SEQ ID No.21的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.81的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.141所示核苷酸组成；
用于检测Osk22的所述特异性引物1由SEQ ID No.22的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.82的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.142所示核苷酸组成；
用于检测Osk23的所述特异性引物1由SEQ ID No.23的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.83的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.143所示核苷酸组成；
用于检测Osk24的所述特异性引物1由SEQ ID No.24的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.84的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.144所示核苷酸组成；
用于检测Osk25的所述特异性引物1由SEQ ID No.25的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.85的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.145所示核苷酸组成；
用于检测Osk26的所述特异性引物1由SEQ ID No.26的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.86的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.146所示核苷酸组成；
用于检测Osk27的所述特异性引物1由SEQ ID No.27的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.87的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.147所示核苷酸组成；
用于检测Osk28的所述特异性引物1由SEQ ID No.28的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.88的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.148所示核苷酸组成；
用于检测Osk29的所述特异性引物1由SEQ ID No.29的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.89的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.149所示核苷酸组成；
用于检测Osk30的所述特异性引物1由SEQ ID No.30的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.90的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.150所示核苷酸组成；
用于检测Osk31的所述特异性引物1由SEQ ID No.31的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.91的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.151所示核苷酸组成；
用于检测Osk32的所述特异性引物1由SEQ ID No.32的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.92的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.152所示核苷酸组成；
用于检测Osk33的所述特异性引物1由SEQ ID No.33的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.93的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.153所示核苷酸组成；
用于检测Osk34的所述特异性引物1由SEQ ID No.34的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.94的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.154所示核苷酸组成；
用于检测Osk35的所述特异性引物1由SEQ ID No.35的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.95的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.155所示核苷酸组成；
用于检测Osk36的所述特异性引物1由SEQ ID No.36的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.96的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.156所示核苷酸组成；
用于检测Osk37的所述特异性引物1由SEQ ID No.37的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.97的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.157所示核苷酸组成；
用于检测Osk38的所述特异性引物1由SEQ ID No.38的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.98的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.158所示核苷酸组成；
用于检测Osk39的所述特异性引物1由SEQ ID No.39的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.99的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.159所示核苷酸组成；
用于检测Osk40的所述特异性引物1由SEQ ID No.40的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.100的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.160所示核苷酸组成；
用于检测Osk41的所述特异性引物1由SEQ ID No.41的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.101的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.161所示核苷酸组成；
用于检测Osk42的所述特异性引物1由SEQ ID No.42的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.102的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.162所示核苷酸组成；
用于检测Osk43的所述特异性引物1由SEQ ID No.43的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.103的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.163所示核苷酸组成；
用于检测Osk44的所述特异性引物1由SEQ ID No.44的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.104的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.164所示核苷酸组成；
用于检测Osk45的所述特异性引物1由SEQ ID No.45的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.105的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.165所示核苷酸组成；
用于检测Osk46的所述特异性引物1由SEQ ID No.46的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.106的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.166所示核苷酸组成；
用于检测Osk47的所述特异性引物1由SEQ ID No.47的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.107的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.167所示核苷酸组成；
用于检测Osk48的所述特异性引物1由SEQ ID No.48的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.108的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.168所示核苷酸组成；
用于检测Osk49的所述特异性引物1由SEQ ID No.49的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.109的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.169所示核苷酸组成；
用于检测Osk50的所述特异性引物1由SEQ ID No.50的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.110的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.170所示核苷酸组成；
用于检测Osk51的所述特异性引物1由SEQ ID No.51的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.111的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.171所示核苷酸组成；
用于检测Osk52的所述特异性引物1由SEQ ID No.52的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.112的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.172所示核苷酸组成；
用于检测Osk53的所述特异性引物1由SEQ ID No.53的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.113的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.173所示核苷酸组成；
用于检测Osk54的所述特异性引物1由SEQ ID No.54的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.114的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.174所示核苷酸组成；
用于检测Osk55的所述特异性引物1由SEQ ID No.55的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.115的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.175所示核苷酸组成；
用于检测Osk56的所述特异性引物1由SEQ ID No.56的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.116的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.176所示核苷酸组成；
用于检测Osk57的所述特异性引物1由SEQ ID No.57的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.117的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.177所示核苷酸组成；
用于检测Osk58的所述特异性引物1由SEQ ID No.58的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.118的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.178所示核苷酸组成；
用于检测Osk59的所述特异性引物1由SEQ ID No.59的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.119的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.179所示核苷酸组成；
用于检测Osk60的所述特异性引物1由SEQ ID No.60的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.120的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQIDNo.180所示核苷酸组成。
在本发明的具体实施方式中，在所述正向引物1中，5'末端连接的荧光标签序列可为FAM荧光标签序列；在所述正向引物2中，5'端连接的荧光标签序列为HEX荧光标签序列。
具体地，所述FAM荧光标签序列如SEQ ID No.1的第1-21位所示；所述HEX荧光标签序列如SEQ ID No.2的第1-21位所示。
更进一步地，用于检测各SNP位点的KASP引物具体如下：
用于检测Osk01的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.61所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.121所示；
用于检测Osk02的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.62所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.122所示；
用于检测Osk03的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.63所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.123所示；
用于检测Osk04的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.64所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.124所示；
用于检测Osk05的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.65所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.125所示；
用于检测Osk06的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.66所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.126所示；
用于检测Osk07的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.67所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.127所示；
用于检测Osk08的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.68所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.128所示；
用于检测Osk09的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.69所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.129所示；
用于检测Osk10的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.70所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.130所示；
用于检测Osk11的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.71所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.131所示；
用于检测Osk12的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.72所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.132所示；
用于检测Osk13的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.73所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.133所示；
用于检测Osk14的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.74所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.134所示；
用于检测Osk15的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.75所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.135所示；
用于检测Osk16的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.76所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.136所示；
用于检测Osk17的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.77所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.137所示；
用于检测Osk18的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.78所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.138所示；
用于检测Osk19的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.79所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.139所示；
用于检测Osk20的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.80所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.140所示；
用于检测Osk21的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.81所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.141所示；
用于检测Osk22的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.82所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.142所示；
用于检测Osk23的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.83所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.143所示；
用于检测Osk24的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.84所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.144所示；
用于检测Osk25的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.85所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.145所示；
用于检测Osk26的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.86所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.146所示；
用于检测Osk27的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.87所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.147所示；
用于检测Osk28的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.88所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.148所示；
用于检测Osk29的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.89所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.149所示；
用于检测Osk30的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.90所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.150所示；
用于检测Osk31的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.91所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.151所示；
用于检测Osk32的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.92所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.152所示；
用于检测Osk33的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.93所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.153所示；
用于检测Osk34的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.94所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.154所示；
用于检测Osk35的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.95所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.155所示；
用于检测Osk36的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.96所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.156所示；
用于检测Osk37的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.97所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.157所示；
用于检测Osk38的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.98所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.158所示；
用于检测Osk39的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.99所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.159所示；
用于检测Osk40的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.40所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.100所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.160所示；
用于检测Osk41的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.41所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.101所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.161所示；
用于检测Osk42的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.42所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.102所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.162所示；
用于检测Osk43的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.43所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.103所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.163所示；
用于检测Osk44的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.44所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.104所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.164所示；
用于检测Osk45的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.105所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.165所示；
用于检测Osk46的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.46所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.106所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.166所示；
用于检测Osk47的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.107所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.167所示；
用于检测Osk48的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.108所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.168所示；
用于检测Osk49的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.49所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.109所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.169所示；
用于检测Osk50的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.50所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.110所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.170所示；
用于检测Osk51的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.51所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.111所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.171所示；
用于检测Osk52的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.52所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.112所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.172所示；
用于检测Osk53的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.53所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.113所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.173所示；
用于检测Osk54的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.54所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.114所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.174所示；
用于检测Osk55的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.55所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.115所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.175所示；
用于检测Osk56的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.56所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.116所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.176所示；
用于检测Osk57的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.57所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.117所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.177所示；
用于检测Osk58的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.58所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.118所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.178所示；
用于检测Osk59的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.59所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.119所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.179所示；
用于检测Osk60的所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.60所示，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.120所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.180所示。
第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述成套KASP引物的试剂盒。
进一步地，所述试剂或试剂盒中还可含有KASP 2×Mastermix，MgCl2和ddH2O。
所述试剂或试剂盒中KASP 2×Mastermix(英国LGC公司,KBS-1016002)含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg2+等组成。
所述荧光探针A的核苷酸序列：5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’与所述正向引物1的5'端连接的荧光标签序列的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。
所述荧光探针B的核苷酸序列：5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’与所述正向引物2的5'端连接的荧光标签序列的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。
在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX；所述淬灭基团为BHQ。
第四方面，本发明要求保护前文第二方面中所述的成套KASP引物或前文第三方面中所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(1)制备水稻SNP位点检测试剂盒；
(2)对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型；
(3)构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库；
(4)对水稻种质资源进行遗传多样性分析。
第五方面，本发明要求保护一种对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型的方法。
本发明要求保护的对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型的方法，可包括如下步骤：
(a1)分别提取供试水稻种质资源或遗传群体中所有水稻样品的基因组DNA；
(a2)对(a1)所得供试水稻样品DNA，按照前文第一方面中所述60个SNP位点，依次配制PCR反应体系，采用前文第二方面中所述的成套KASP引物中的相应引物分别进行PCR扩增；
(a3)对扩增产物进行荧光扫描，读取和分析荧光信号，从而获得所述供试水稻样品DNA在所述60个SNP位点的基因分型结果。
第六方面，本发明要求保护一种构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库的方法。
本发明要求保护的构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库的方法，可包括如下步骤：提取用于构建水稻DNA分子指纹数据库的水稻种质资源或品种的基因组DNA，检测前文第一方面中所述60个SNP位点的基因型，获得的所检水稻种质资源或品种在所述60个SNP位点的基因型数据即构成水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库。
在本发明的具体实施方式中，在检测完所述60个SNP位点的基因型后还包括如下步骤：对每个水稻种质资源或品种在每个SNP位点的基因型数据均整理成0、1、2的格式，并按照SNP位点的编号顺序组合排列，其中与参考基因组一致的基因型记为0，与所述参考基因组不一致的基因型记为1，杂合基因型记为2，缺失记为N。所述参考基因组为水稻品种日本晴版本号为MSU7.0的全基因组序列，每个水稻种质资源或品种均得到一个由0、1、2组成的数字串，所述数字串也可为水稻种质资源或品种DNA指纹数据库。
第七方面，本发明要求保护一种对水稻种质资源进行遗传多样性分析的方法。
本发明要求保护的对水稻种质资源进行遗传多样性分析的方法，可包括如下步骤：提取用于进行遗传多样性分析的水稻种质资源的基因组DNA，检测前文第一方面中所述60个SNP位点的基因型，然后基于各水稻种质资源间的遗传距离，采用邻接法构建水稻资源的亲缘关系进化树。
进一步地，在第六方面和第七方面中，检测所述60个SNP位点的基因型可通过前文第五方面所述方法实现。
在本发明的具体实施方式中，所述水稻具体选自实施例中表5和表6中所示水稻。
本发明所提供的用于区分水稻品种的KASP分子标记组合能够高效，稳定，准确的对水稻品种及种质资源进行鉴定区分，能够实现水稻品种高通量，高区分度以及低成本的大规模鉴定，适于大规模推广应用。
本发明所提供的60个SNP位点组合，可应用于水稻分子指纹数据库构建、品种鉴定以及种质资源遗传多样性分析；而且这60核心位点组合的应用相比较目前广泛使用的生化检测方法以及SSR方法可极大提高检测准确度、缩短检测时间、提高检测水平。这将为分子检测提供更有效、可靠的技术手段；并将为水稻品种鉴定提供重要的技术支撑。
附图说明
图1为4类主要的KASP标记基因分型聚类图。(a)为KASP标记K4的基因分型图；(b)为KASP标记K82的分型分析；(c)为KASP标记K49的基因分型；(d)为KASP标记K138的基因分型。
图2为60个KASP标记的多态性分析。(A)为60个SNP位点在染色体上的物理位置,右边数字是60个KASP标记的编号,左边数字是60个KASP标记在染色体上物理位置,单位为Mb；(B)为60个SNP位点的最小等位基因频率分布(MAF)和多态信息含量分布(PIC)。
图3为80份水稻的DNA分子指纹数据库。
图4为122份水稻资源的聚类分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、水稻种质资源60个核心SNP位点组合的获得
一、基因型数据过滤分析
利用博瑞迪开发的水稻10k液相芯片(GenoBaits Rice 10K Panel)对江苏省农作物种质资源库中314份水稻种质资源进行全基因组扫描，获得314份水稻资源的全基因组SNP基因分型的原始数据。
使用软件fastp(version 0.20.0，参数：-n 10-q 20-u 40)对测序原始数据进行过滤，筛选获得了Clean Reads，根据Clean Reads在参考基因组的比对结果，使用软件GATK(version v3.5-0-g36282e4)的UnifiedGenotyper模块进行变异检测。将变异结果使用自编的Perl脚本对SNP位点的基因型分型信息进行提取，当样品在某个SNP位点的覆盖深度<5X说明该样品在该位点测序深度不足，为保证基因型分型结果准确，该位点按缺失处理，在表格中以NA表示；当样品在某个SNP位点基因型有突变，则需要根据该位点突变频率进行判断，若突变频率≥0.8或者≤0.2则该位点为纯合，若突变频率在0.2-0.8之间，杂合基因型中每个等位基因至少要有4个reads支持，则该SNP位点为杂合突变，否则该位点按缺失处理，以NA表示；最终汇总成样品在全部SNP位点的基因型结果，共得到22428个二态性SNP位点标记。进一步对获得的SNP数据进行过滤。利用plink将vcf文件转化成ped/map文件，然后用plink进行数据过滤，筛选标准基于测序深度大于10、最小等位基因频率大于0.05、基因型缺失率小于0.1，哈迪温伯格平衡显著性阀值P<0.001过滤后获20260个高质量的SNP位点。
二、SNP位点筛选
进一步以多态信息含量PIC>0.4以及二态性为条件进行筛选得到1192个候选SNP位点，从所述候选SNP位点中筛选出前后各100bp没有其它变异位点的待选SNP位点，再从所述待选SNP位点中选择在不同所述水稻品种之间具有保守性的靶标SNP，最终筛选出170个SNP位点用于开发KASP标记。
三、KASP分子标记的开发
根据170个靶标SNP位点和侧翼序列由网站http://www.snpway.com/设计用于PCR扩增的KASP引物组合，用以开发KASP分子标记。每个KASP引物组合设计两条SNP特异性引物(F1和F2)和一条通用引物(R)，F1尾部添加能够与FAM荧光结合的特异性序列，F2尾部添加能够与HEX荧光结合的特异性序列。
四、样品DNA提取与质检
对46份水稻7天的幼苗进行取样，采用CTAB法进行植物基因组DNA提取。使用BioDrop uLite核酸微量测定仪对待测样品进行DNA浓度测量和质量检测，并根据检测结果将所有待测样品统一稀释至适宜的上机浓度(10-20ng/μl左右)。
五、PCR扩增过程
1.将DNA样品分装到96孔PCR板上
将稀释好的DNA转到96孔PCR样品板上，每板加2个ddH2O(NTC)作为对照。
2.配制KASP基因分型混合液
参照表1，分别配制反应所需的混合液。
表1、KASP基因分型混合液
96孔array tape
湿DNA 0.8μl/孔
2×KASP Master mix+Assay 0.8μl/孔
总反应体积 1.6μl/孔
注：所有试剂使用前均应短暂地涡旋振荡，配制时需要加上损失的体积，保证配制足够的基因分型混合液。
将KASP基因分型混合液加到已含DNA模板的array tape膜上。利用IntelliQube的SNP基因检测平台编制程序，并依次将96Array tape、DNA样品板、KASP基因分型混合液放置进机器，操作机器执行程序，分别自动进行DNA样品稀释液和KASP基因分型混合液向96孔的array tape分装、封膜的过程。
3.PCR循环反应
PCR反应可在IntelliQube机器内以SNP genotyping inline(单张膜时)模式进行，亦可在Hydrocycler内以SNP genotyping outline(多张膜时)模式进行水浴PCR。
程序设置如表2所示。
表2、PCR循环反应程序
六、SNP基因分型
将PCR扩增产物利用可检测FAM和HEX波长荧光的荧光定量PCR仪或酶标仪等仪器进行读板，并根据荧光量比值进行SNP分型。
基因分型结果按如下标准判定：基因分型图中聚合在接近X轴的显示红色的样本基因型为结合FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示蓝色的样本基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示紫色的样本基因型为两种等位基因的杂合型，显示黑色的为阴性对照，显示灰色的样本分群不明显，作缺失处理。
数据记录为XX或XY，其中X、Y为该位点的单核苷酸，如A、T、C、G，按此顺序排列。无效数据记录为NA。一个样品的无效数据所占比例如高于10％，不予采用。经检测最终获得了122对高质量的KASP分子标记引物,这些标记位点可以准确清楚地将相同基因型的品种聚类(聚类形式如图1)，同时阴性对照NTC(No Template Control)始终聚集在一起，且不产生信号，成功率达到72％(图1中(a)和(b))。其他引物被淘汰的主要原因：(1)不能将不同的基因型进行聚类，即使相同基因型的聚类也比较分散(图1中(c))，(2)引物在群体中的扩增效率不高(图1中(d))。
七、核心KASP分子标记的筛选
为了进一步筛选出具有代表性的标记，对鉴定出的122个标记进行过滤。根据基因型分型结果以及所述KASP引物组合在水稻染色体上的分布情况(主要依据能够将HEX型和FAM型的基因型精确分型且MAF>0.40、PIC>0.3，以及在染色体上的位置分布均匀等信息)，最终筛选出60个位点(60个SNP位点的基因组位置信息、变异碱基见表3，对应的引物序列及其编号见表4)，形成用于区分水稻品种及种质资源的KASP分子标记组合。这些位点覆盖在水稻基因组的12条染色体上，平均间隔为6.2Mb(图2中(A))。利用遗传多样性分析软件PowerMarker3.25对这些位点的等位基因频率等方面进行总体评价，60个SNP位点PIC变化范围为0.34-0.50，平均值为0.46，MAF变化范围为0.50-0.78，平均值为0.604(图2中(B))，表明60个SNP位点具有高特异性和高稳定性。
表3、60个SNP位点的基因组位置信息、变异碱基
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注：表中的SNP位点位置信息均是以水稻品种日本晴版本号为MSU7.0的全基因组序列为参考基因组计的。
表4、60个KASP标记的引物序列信息(5’-3’)
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注：所有“正向引物1”的5’端均为FAM荧光标签序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'(如SEQ ID No.1中下划线部分)；所有“正向引物2”的5’端均为HEX荧光标签序列5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'(如SEQ ID No.61中下划线部分)。
实施例2、60个核心SNP位点组合在构建水稻DNA分子指纹数据库中的应用
选取80份江苏地区1970-2020年间大面积推广的育成品种为实验材料，品种名称如表5所示。
表5、80份江苏地区1970-2020年间大面积推广的育成品种
南粳23 南粳52 武香粳19 武连粳1号 苏香粳100 宁粳1号 盐粳5号 连粳6号
南粳34 南粳0212 武运粳8号 武陵粳1号 苏粳2号 宁粳3号 盐粳6号 连粳7号
南粳35 南粳9108 武运粳7号 武粳4号 扬粳186 宁粳4号 盐粳9号 连粳9号
南粳39 南粳5055 武运粳11号 武粳13号 扬辐粳8号 宁粳6号 盐粳10号 连粳11号
南粳41 武香粳1号 武运粳23号 武粳15号 扬育粳2号 宁粳7号 盐粳16号 连嘉粳1号
南粳44 武育粳2号 武运粳24号 常农粳4号 扬粳4038 宁粳8号 盐稻10号 徐稻3号
南粳45 武育粳3号 武运粳21号 常农粳5号 淮稻5号 镇稻4号 盐稻8号 徐稻4号
南粳46 武育粳5号 武运粳27 常农粳8号 淮稻6号 镇稻11号 盐稻9号 徐稻5号
南粳49 武香粳9号 武运粳31号 苏香粳1号 淮稻11号 镇稻12号 连粳3号 徐稻9号
南粳51 武香粳14号 武育粳20 苏香粳2号 淮稻13号 镇稻88 连粳4号 徐稻10号
水稻DNA提取及检测，PCR扩增以及数据采集基因分析同实施例1进行。将PCR扩增产物利用可检测FAM和HEX波长荧光的荧光定量PCR仪或酶标仪等仪器进行读板，并根据荧光量比值进行SNP分型。数据记录为XX或XY，其中X、Y为该位点的单核苷酸，如A、T、C、G，按此顺序排列。无效数据记录为NA。一个样品的无效数据所占比例如高于10％，不予采用。将基因型数据进行整理成0、1、2的格式；与参考基因组(水稻品种日本晴版本号为MSU7.0的全基因组序列)一致的基因型(纯合)为0；不一致的(纯合)为1，杂合型为2，无效数据为N。两个品种间存在一个SNP位点的差异即为不同的品种，80份水稻品种的DNA分子指纹图谱数据如图3所示。可见，利用本发明这60个核心SNP标记组合能够有效的将供试的80份水稻品种区分开来。其中武运粳7号和武运粳8号仅存在一个位点的差异，系谱分析发现这两个品种具有相同的亲本来源，说明本发明的60个核心SNP标记组合能够有效的区分江苏地区主要育成品种。
实施例3、60个核心SNP位点组合在水稻遗传多样性分析中的应用
为了进一步检测该分子标记组合在水稻种质资源遗传多样性中的应用，利用本发明开发的60个核心KASP标记组合对江苏省农作物种质资源中期库保存的122份种质资源(表6)包括94份育成品种和28份地方品种进行基因分型(具体操作参见实施例1)，然后基于各品种间的遗传距离,采用邻接法(Neighbor-joining)构建122份水稻资源的亲缘关系进化树，结果显示不同来源的水稻能够根据系谱来源和地理分布进行聚类，反映出不同水稻品种间的亲缘关系。122份水稻资源的聚类分析结果如图4所示。
表6、122份水稻种质资源品种名称
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.水稻基因组中60个SNP位点在如下任一中的应用：
(1)制备水稻SNP位点检测试剂盒；
(2)对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型；
(3)构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库；
(4)对水稻种质资源进行遗传多样性分析；
所述60个SNP位点的物理位置是基于水稻品种日本晴的全基因组序列对比确定的，所述水稻品种日本晴的全基因组序列的版本号为MSU7.0；所述60个SNP位点是OsK01-OsK60；
Osk1位于1号染色体上第1228512位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk2位于1号染色体上第4645481位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk3位于1号染色体上第6644387位，其脱氧核苷酸为C或A；
Osk4位于1号染色体上第9305876位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk5位于1号染色体上第12854426位，其脱氧核苷酸为C或G；
Osk6位于1号染色体上第24749480位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk7位于1号染色体上第30545662位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk8位于2号染色体上第5785532位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk9位于2号染色体上第21772969位，其脱氧核苷酸为G或C；
Osk10位于2号染色体上第34474061位，其脱氧核苷酸为C或A；
Osk11位于2号染色体上第35882696位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk12位于3号染色体上第7956017位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk13位于3号染色体上第13775121位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk14位于3号染色体上第16579520位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk15位于3号染色体上第25181277位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk16位于4号染色体上第15846017位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk17位于4号染色体上第19209543位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk18位于4号染色体上第21469290位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk19位于4号染色体上第22842238位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk20位于4号染色体上第31997187位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk21位于5号染色体上第7384864位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk22位于5号染色体上第17035145位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk23位于5号染色体上第23305515位，其脱氧核苷酸为G或C；
Osk24位于6号染色体上第1529649位，其脱氧核苷酸为G或T；
Osk25位于6号染色体上第3166267位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk26位于6号染色体上第8454606位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk27位于6号染色体上第10345230位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk28位于6号染色体上第25220061位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk29位于7号染色体上第2865195位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk30位于7号染色体上第4660773位，其脱氧核苷酸为T或A；
Osk31位于7号染色体上第8809828位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk32位于7号染色体上第10756612位，其脱氧核苷酸为A或T；
Osk33位于7号染色体上第12924029位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk34位于7号染色体上第21324970位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk35位于7号染色体上第24622118位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk36位于8号染色体上第1530355位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk37位于8号染色体上第2275008位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk38位于8号染色体上第7890733位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk39位于8号染色体上第19466177位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk40位于8号染色体上第24070735位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk41位于9号染色体上第39319位，其脱氧核苷酸为A或T；
Osk42位于9号染色体上第10515653位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk43位于9号染色体上第12725653位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk44位于9号染色体上第13665180位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk45位于9号染色体上第17753206位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk46位于10号染色体上第369133位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk47位于10号染色体上第2335637位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk48位于10号染色体上第3787248位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk49位于10号染色体上第10724291位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk50位于10号染色体上第19029893位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk51位于11号染色体上第4374875位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk52位于11号染色体上第18935157位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk53位于11号染色体上第20525980位，其脱氧核苷酸为T或C；
Osk54位于11号染色体上第26085857位，其脱氧核苷酸为G或A；
Osk55位于11号染色体上第28010037位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk56位于12号染色体上第215397位，其脱氧核苷酸为C或T；
Osk57位于12号染色体上第1794727位，其脱氧核苷酸为T或G；
Osk58位于12号染色体上第2738115位，其脱氧核苷酸为A或T；
Osk59位于12号染色体上第13784750位，其脱氧核苷酸为A或G；
Osk60位于12号染色体上第24090217位，其脱氧核苷酸为T或C。
2.成套KASP引物，为用于检测权利要求1中所述60个SNP位点的KASP引物；
每个待测SNP位点对应的KASP引物均分别包括两条正向引物和一条反向引物；其中两条正向引物分别记作正向引物1和正向引物2；所述正向引物1为在特异性引物1的5'末端连接一种荧光标签序列后所得，所述正向引物2为在特异性引物2的5'末端连接另一种荧光标签序列后所得；
用于检测Osk01的所述特异性引物1由SEQ ID No.1的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.61的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.121所示核苷酸组成；
用于检测Osk02的所述特异性引物1由SEQ ID No.2的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.62的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.122所示核苷酸组成；
用于检测Osk03的所述特异性引物1由SEQ ID No.3的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.63的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.123所示核苷酸组成；
用于检测Osk04的所述特异性引物1由SEQ ID No.4的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.64的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.124所示核苷酸组成；
用于检测Osk05的所述特异性引物1由SEQ ID No.5的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.65的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ ID No.125所示核苷酸组成；
用于检测Osk06的所述特异性引物1由SEQ ID No.6的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.66的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.126所示核苷酸组成；
用于检测Osk07的所述特异性引物1由SEQ ID No.7的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.67的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ ID No.127所示核苷酸组成；
用于检测Osk08的所述特异性引物1由SEQ ID No.8的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.68的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ ID No.128所示核苷酸组成；
用于检测Osk09的所述特异性引物1由SEQ ID No.9的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.69的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ ID No.129所示核苷酸组成；
用于检测Osk10的所述特异性引物1由SEQ ID No.10的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.70的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.130所示核苷酸组成；
用于检测Osk11的所述特异性引物1由SEQ ID No.11的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.71的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.131所示核苷酸组成；
用于检测Osk12的所述特异性引物1由SEQ ID No.12的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.72的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.132所示核苷酸组成；
用于检测Osk13的所述特异性引物1由SEQ ID No.13的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.73的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.133所示核苷酸组成；
用于检测Osk14的所述特异性引物1由SEQ ID No.14的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.74的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.134所示核苷酸组成；
用于检测Osk15的所述特异性引物1由SEQ ID No.15的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.75的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.135所示核苷酸组成；
用于检测Osk16的所述特异性引物1由SEQ ID No.16的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.76的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.136所示核苷酸组成；
用于检测Osk17的所述特异性引物1由SEQ ID No.17的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.77的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.137所示核苷酸组成；
用于检测Osk18的所述特异性引物1由SEQ ID No.18的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.78的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.138所示核苷酸组成；
用于检测Osk19的所述特异性引物1由SEQ ID No.19的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.79的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.139所示核苷酸组成；
用于检测Osk20的所述特异性引物1由SEQ ID No.20的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.80的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.140所示核苷酸组成；
用于检测Osk21的所述特异性引物1由SEQ ID No.21的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.81的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.141所示核苷酸组成；
用于检测Osk22的所述特异性引物1由SEQ ID No.22的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.82的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.142所示核苷酸组成；
用于检测Osk23的所述特异性引物1由SEQ ID No.23的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.83的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.143所示核苷酸组成；
用于检测Osk24的所述特异性引物1由SEQ ID No.24的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.84的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.144所示核苷酸组成；
用于检测Osk25的所述特异性引物1由SEQ ID No.25的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.85的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.145所示核苷酸组成；
用于检测Osk26的所述特异性引物1由SEQ ID No.26的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.86的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.146所示核苷酸组成；
用于检测Osk27的所述特异性引物1由SEQ ID No.27的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.87的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.147所示核苷酸组成；
用于检测Osk28的所述特异性引物1由SEQ ID No.28的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.88的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.148所示核苷酸组成；
用于检测Osk29的所述特异性引物1由SEQ ID No.29的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.89的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.149所示核苷酸组成；
用于检测Osk30的所述特异性引物1由SEQ ID No.30的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.90的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.150所示核苷酸组成；
用于检测Osk31的所述特异性引物1由SEQ ID No.31的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.91的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.151所示核苷酸组成；
用于检测Osk32的所述特异性引物1由SEQ ID No.32的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.92的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.152所示核苷酸组成；
用于检测Osk33的所述特异性引物1由SEQ ID No.33的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.93的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.153所示核苷酸组成；
用于检测Osk34的所述特异性引物1由SEQ ID No.34的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.94的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.154所示核苷酸组成；
用于检测Osk35的所述特异性引物1由SEQ ID No.35的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.95的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.155所示核苷酸组成；
用于检测Osk36的所述特异性引物1由SEQ ID No.36的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.96的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.156所示核苷酸组成；
用于检测Osk37的所述特异性引物1由SEQ ID No.37的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.97的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.157所示核苷酸组成；
用于检测Osk38的所述特异性引物1由SEQ ID No.38的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.98的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.158所示核苷酸组成；
用于检测Osk39的所述特异性引物1由SEQ ID No.39的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.99的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.159所示核苷酸组成；
用于检测Osk40的所述特异性引物1由SEQ ID No.40的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.100的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.160所示核苷酸组成；
用于检测Osk41的所述特异性引物1由SEQ ID No.41的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.101的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.161所示核苷酸组成；
用于检测Osk42的所述特异性引物1由SEQ ID No.42的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.102的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.162所示核苷酸组成；
用于检测Osk43的所述特异性引物1由SEQ ID No.43的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.103的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.163所示核苷酸组成；
用于检测Osk44的所述特异性引物1由SEQ ID No.44的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.104的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.164所示核苷酸组成；
用于检测Osk45的所述特异性引物1由SEQ ID No.45的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.105的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.165所示核苷酸组成；
用于检测Osk46的所述特异性引物1由SEQ ID No.46的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.106的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.166所示核苷酸组成；
用于检测Osk47的所述特异性引物1由SEQ ID No.47的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.107的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.167所示核苷酸组成；
用于检测Osk48的所述特异性引物1由SEQ ID No.48的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.108的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.168所示核苷酸组成；
用于检测Osk49的所述特异性引物1由SEQ ID No.49的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.109的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.169所示核苷酸组成；
用于检测Osk50的所述特异性引物1由SEQ ID No.50的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.110的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.170所示核苷酸组成；
用于检测Osk51的所述特异性引物1由SEQ ID No.51的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.111的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.171所示核苷酸组成；
用于检测Osk52的所述特异性引物1由SEQ ID No.52的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.112的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.172所示核苷酸组成；
用于检测Osk53的所述特异性引物1由SEQ ID No.53的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.113的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.173所示核苷酸组成；
用于检测Osk54的所述特异性引物1由SEQ ID No.54的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.114的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.174所示核苷酸组成；
用于检测Osk55的所述特异性引物1由SEQ ID No.55的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.115的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.175所示核苷酸组成；
用于检测Osk56的所述特异性引物1由SEQ ID No.56的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.116的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.176所示核苷酸组成；
用于检测Osk57的所述特异性引物1由SEQ ID No.57的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.117的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.177所示核苷酸组成；
用于检测Osk58的所述特异性引物1由SEQ ID No.58的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.118的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.178所示核苷酸组成；
用于检测Osk59的所述特异性引物1由SEQ ID No.59的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.119的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.179所示核苷酸组成；
用于检测Osk60的所述特异性引物1由SEQ ID No.60的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由SEQ ID No.120的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由SEQ IDNo.180所示核苷酸组成。
3.根据权利要求2所述的成套KASP引物，其特征在于：在所述正向引物1中，5'末端连接的荧光标签序列为FAM荧光标签序列；和/或
在所述正向引物2中，5'端连接的荧光标签序列为HEX荧光标签序列。
4.根据权利要求3所述的成套KASP引物，其特征在于：所述FAM荧光标签序列如SEQIDNo.1的第1-21位所示；和/或
所述HEX荧光标签序列如SEQ ID No.2的第1-21位所示。
5.含有权利要求2-4中任一所述的成套KASP引物的试剂盒。
6.权利要求2-4中任一所述的成套KASP引物或权利要求5所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(1)制备水稻SNP位点检测试剂盒；
(2)对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型；
(3)构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库；
(4)对水稻种质资源进行遗传多样性分析。
7.一种对水稻种质资源或遗传群体进行基因分型的方法，包括如下步骤：
(a1)分别提取供试水稻种质资源或遗传群体中所有水稻样品的基因组DNA；
(a2)对(a1)所得供试水稻样品DNA，按照权利要求1中所述60个SNP位点，依次配制PCR反应体系，采用权利要求2-4中任一所述的成套KASP引物中的相应引物分别进行PCR扩增；
(a3)对扩增产物进行荧光扫描，读取和分析荧光信号，从而获得所述供试水稻样品DNA在所述60个SNP位点的基因分型结果。
8.一种构建水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库的方法，包括如下步骤：提取用于构建水稻DNA分子指纹数据库的水稻种质资源或品种的基因组DNA，检测权利要求1中所述60个SNP位点的基因型，获得的所检水稻种质资源或品种在所述60个SNP位点的基因型数据即构成水稻种质资源或品种DNA分子指纹数据库。
9.一种对水稻种质资源进行遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：提取用于进行遗传多样性分析的水稻种质资源的基因组DNA，检测权利要求1中所述60个SNP位点的基因型，然后基于各水稻种质资源间的遗传距离,采用邻接法构建水稻资源的亲缘关系进化树。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于：检测权利要求1中所述60个SNP位点的基因型通过权利要求7所述方法实现。
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