CN113528696A - 玉米糯性基因的kasp分子标记的开发方法及应用 - Google Patents

玉米糯性基因的kasp分子标记的开发方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法及应用，属于生物技术领域。它包括KASP通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测SNP位点和InDel位点。与SSR、RFLP、InDel等分子标记相比，KASP标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发低成本、适合于高通量分子检测平台的玉米糯性基因KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国糯玉米的育种效率和育种水平具有重要意义。

Description

玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法及应用
技术领域
本发明涉及玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
糯玉米是我国重要的粮食作物，我国是糯玉米的主要发源地之一(王义发,汪黎明,沈雪芳,等.糯玉米的起源、分类、品种改良及产业发展[C].中国作物学会2007年全国作物遗传育种学术研讨会论文集.2007.)。玉米糯性由淀粉含量决定，支链淀粉含量高，玉米糯性增加。糯玉米由于支链淀粉含量高、易于消化、风味独特，是改善人民生活水平的重要粮食；同时，糯玉米也是重要的饲料植物，糯玉米饲养奶牛可提高产奶量；糯玉米还是重要的酿酒原料，支链淀粉也被广泛应用于食品、纺织、铸造、粘合剂等工业。因此，研究玉米糯性基因，提高糯玉米育种效率成为我国重要的玉米研究方向之一。
目前，已挖掘多个玉米糯性基因，如sbe2a、ae、wx、SSIIa(陈亭亭.玉米籽粒淀粉合成关键基因sbeⅠ,waxy的研究[D].山东农业大学,2013；陈枫.玉米ae基因的分子标记及辅助选择研究[D].安徽农业大学,2008；杨泽峰,张恩盈,杜灿灿,等.玉米淀粉合成相关基因ZmSSIIa的序列变异分析[J].科技导报,2014,32(36):52-58；孙粲然,张雪海,马指挥,etal.玉米籽粒淀粉粒密度基因tw1的精细定位[J].中国农业科学,2018,v.51(07):16-26)。大多数基因也已开发出相应的分子标记，通过分子标记辅助选择技术(Marker-assistedSelection，MAS)进行糯玉米改良育种。分子标记可以在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择(Tanksley等，RFLP mapping in plant breeding:New tools for anold science.1989,Biotechnology,7:257-263)，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，成为解决品种选育难这一问题的有效途径。
然而，上述很多玉米淀粉相关基因的连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但多为RFLP标记、SSR标记、InDel标记或酶切标记，检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，并不适用于高通量的分子检测平台(程备久,陈枫,朱苏文,等.玉米ae基因的分子标记及其获得方法和应用,CN101619362B[P].2011；雷武生.特异性PCR在检测玉米ae基因中的应用[D].甘肃农业大学,2005)。因此，开发低成本、可高通量检测的分子标记是促进玉米糯性基因鉴定、增加糯性育种准确度与提高育种效率的迫切需求。
发明内容
本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：
玉米糯性基因的KASP分子标记开发方法，包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米糯性；所述待测玉米的基因型为玉米基因组中KASP_zmwx位点的基因型；所述KASP_zmwx位点是玉米基因组中的一个InDel位点，位于玉米9号染色体25128934-25128963位，为SEQ ID No.4的第51-80位核苷酸，其核苷酸种类为GCGTTGTTCAGTTCAGAGAAGGCAACCTTT(下文均用“+”表示)或缺失(下文均用“-”表示)。
KASP_zmwx位点的基因型为++基因型或+-基因型，待测玉米的糯性低于或者候选低于KASP_zmwx位点的基因型为--基因型的待测玉米；KASP_zmwx位点的基因型为+-基因型的待测玉米与KASP_zmwx位点的基因型为++基因型的待测玉米在糯性上无显著差异；其中，++基因型表示玉米基因组中所述KASP_zmwx位点的核苷酸种类为+的纯合型；--基因型表示玉米基因组中KASP_zmwx位点的核苷酸种类为-的纯合型；+-基因型表示玉米基因组中KASP_zmwx位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而提出的应用，所述应用包括以下几个方面：
S1、KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米糯性中的应用；
S2、KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助制备鉴定玉米糯性产品中的应用；
S3、KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质在玉米辅助育种或制备玉米辅助育种产品中的应用。
玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而提出玉米育种的方法，包括以下步骤：
选择所述KASP_zmwx位点的基因型为--的玉米作为亲本进行育种，--基因型表示玉米基因组中KASP_zmwx位点的核苷酸种类为-的纯合型；玉米育种为培育高糯性玉米。
4、玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而生产出的产品，主要包括以下几种产品：
s1、检测与玉米糯性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
s2、鉴定或辅助鉴定玉米糯性的产品；
s3、用于玉米辅助育种的产品。
作为优选实例，检测权利要求1中KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述检测权利要求1中KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_zmwx位点在内的玉米基因组DNA片段的PCR引物；
D2)所述检测权利要求1中KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
作为优选实例，所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-39位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-37位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组。
作为优选实例，所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA的引物组。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种玉米糯性基因waxy紧密连锁的KASP标记开发与应用，所述分子标记是与玉米糯性基因waxy紧密连锁的KASP标记KASP_zmwx，该标记基于KASP技术开发，可高通量检测玉米基因组9号染色体的第25128934-25128963位碱基，本发明应用KASP技术对玉米糯性基因waxy进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测玉米糯性基因waxy，对促进玉米糯性育种具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1利用分子标记KASP_zmwx检测8份测试玉米品种材料的分型图，其中，FAM表示基因型为--，VIC表示基因型为++，H表示基因型为+-。
具体实施方式
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例一
与玉米糯性相关基因waxy紧密连锁KASP标记开发
1.引物的设计：根据KASP_zmwx位点提取左右各100bp的侧翼序列，优选利用Primer5.0软件设计3组KASP引物，利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1套多态性良好的KASP引物用于后续验证，用于检测KASP_zmwx的KASP引物具体如下：
Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattCTACAGGGACGCAAAGGT-3’(SEQ ID No.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；
Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctATCTACAGGGACGCCG-3’(SEQ ID No.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；
Primer R：5’-TATACGAGCATGGAGAACGAA-3’(SEQ ID No.3)；
2.DNA提取：采用常规CTAB法从玉米叶片中提取基因组DNA；
3.KASP反应测试
KASP标记扩增及反应体系：
(1)荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：
5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L-1各12μL，反向引物Primer R100pmol·L-1 30μL，ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL；按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
(2)选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测
1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L-1各12μL，反向引物Primer R 100pmol·L-1 30μL,ddH2O46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL；根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg2+等组成；荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。
扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测玉米基因组中KASP_zmwx位点的基因型(即检测玉米基因组9号染色体的第25128934-25128963位碱基是+还是-)，若所述待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测玉米基因组中KASP_zmwx位点的基因型为++纯合型(即玉米基因组9号染色体的第25128934-25128963位碱基为++纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测玉米基因组中KASP_zmwx位点的基因型为--纯合型(即玉米基因组9号染色体的第25128934-25128963位碱基为--纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测玉米基因组中KASP_zmwx位点的基因型为+-杂合型(即玉米基因组第9号染色体的第25128934-25128963位碱基为+-杂合型)；左下角显示为黑色的样本为空白对照。
5.标记分型数据分析
为了验证KASP_zmwx标记的可靠性，对8份玉米品种材料进行糯性表型调查；材料基因型采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行检测，检测方法、反应体系以及扩增程序按照上述优选方案实行。
扩增结果表明，KASP_zmwx标记在8份材料中能够获得稳定的PCR产物，并且能够检测到+和-两个等位位点(图1)；三份糯玉米基因型均为++基因型，五份普通玉米均为--基因型；由此，可看出KASP_zmwx标记可用于玉米糯性选育工作。
因此，本发明所述的KASP_zmwx标记可用于玉米糯性相关基因waxy的分子标记辅助育种。
表1.8份测试玉米品种的糯性与基因型信息
Figure BDA0003130249240000081
实施例二
与玉米糯性相关基因waxy紧密连锁的KASP标记在分子标记辅助选择玉米高糯性植株中的应用
为检测本发明KASP_zmwx标记的实用性，将表1所述的玉米品种昌7-2(作为母本)与苏玉糯11(作为父本)杂交配制F2分离群体，对F2分离群体进行KASP标记检测和糯性表型记录(检测结果见表2)，标记检测实施方法参考实施例一；通过对测试品种的糯性表型进行统计，在48份分离群体单株中，仅2份单株基因型与糯性表型不匹配，糯性表型与基因型的一致性结果为P＝95.8％(P＝一致的群体单株数量/总群体数量)；上述结果表明标记KASP_zmwx在玉米高糯性植株筛选中具有较高的实用性。
表2.玉米分离群体的表型与基因型信息
Figure BDA0003130249240000082
Figure BDA0003130249240000091
注：‘*’表示无检测信号。
需要说明的是，本发明通过文献挖掘到一个与玉米糯性相关的InDel位点(袁文娅,赵晓雷,周旭梅,等.waxy基因功能标记开发及在糯玉米育种中的应用[J].作物杂志,2020(4).)，该位点锚定在玉米9号染色体的第25128934-25128963位
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_902167145.1/，基因组版本Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0)，将该InDel位点命名为KASP_zmwx，其侧翼序列如SEQ ID No.4所示，KASP_zmwx位于SEQ ID No.4的第51-80位，该处的核苷酸序列为+或-。
下述++基因型表示KASP_zmwx的核苷酸序列为+的纯合型；--基因型表示KASP_zmwx的核苷酸序列为-的纯合型；+-基因型表示KASP_zmwx的核苷酸种类为+和-的杂合型。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 1
agagaagcac caccaccaga cgaggtatac gagcatggag aacgaagacg gcgttgttca 60
gttcagagaa ggcaaccttt gcgtccctgt agatgccgtg ggactggtag ttgctcttga 120
ggtagcacga gagagggccg 140
<210> 2
<211> 110
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 2
agagaagcac caccaccaga cgaggtatac gagcatggag aacgaagacg gcgtccctgt 60
agatgccgtg ggactggtag ttgctcttga ggtagcacga gagagggccg 110

Claims (7)

1.玉米糯性基因的KASP分子标记开发方法，其特征在于：包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米糯性；所述待测玉米的基因型为玉米基因组中KASP_zmwx位点的基因型；所述KASP_zmwx位点是玉米基因组中的一个InDel位点，位于玉米9号染色体25128934-25128963位，为SEQ ID No.4的第51-80位核苷酸，其核苷酸种类为GCGTTGTTCAGTTCAGAGAAGGCAACCTTT（下文均用“+”表示）或缺失（下文均用“-”表示）；
KASP_zmwx位点的基因型为++基因型或+-基因型，待测玉米的糯性低于或者候选低于KASP_zmwx位点的基因型为--基因型的待测玉米；KASP_zmwx位点的基因型为+-基因型的待测玉米与KASP_zmwx位点的基因型为++基因型的待测玉米在糯性上无显著差异；其中，++基因型表示玉米基因组中所述KASP_zmwx位点的核苷酸种类为+的纯合型；--基因型表示玉米基因组中KASP_zmwx位点的核苷酸种类为-的纯合型；+-基因型表示玉米基因组中KASP_zmwx位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
2.根据权利要求1所述的玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而提出的应用，其特征在于，所述应用包括以下几个方面：
S1、KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米糯性中的应用；
S2、KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助制备鉴定玉米糯性产品中的应用；
S3、KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质在玉米辅助育种或制备玉米辅助育种产品中的应用。
3.根据权利要求1所述的玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而提出玉米育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
选择所述KASP_zmwx位点的基因型为--的玉米作为亲本进行育种，--基因型表示玉米基因组中KASP_zmwx位点的核苷酸种类为-的纯合型；玉米育种为培育高糯性玉米。
4.根据权利要求1所述的玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而生产出的产品，其特征在于，主要包括以下几种产品：
s1、检测与玉米糯性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
s2、鉴定或辅助鉴定玉米糯性的产品；
s3、用于玉米辅助育种的产品。
5.根据权利要求2任一一项所述玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而提出的应用或权利要求7所述玉米糯性基因的KASP分子标记的开发方法而生产出的产品，其特征在于：检测权利要求1中KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质为如下D1）、D2）或D3）：
D1）所述检测权利要求1中KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_zmwx位点在内的玉米基因组DNA片段的PCR引物；
D2）所述检测权利要求1中KASP_zmwx位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3）含有D1）所述PCR引物或D2）所述PCR试剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的应用或产品，其特征在于：所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-39位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-37位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组。
7.根据权利要求5或6任意一种所述的应用或产品，其特征在于：所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQID No.3所示的单链DNA的引物组。
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