KR101154775B1

KR101154775B1 - 소맥 내재성 ｄｎａ 서열의 검출 및 정량 방법

Info

Publication number: KR101154775B1
Application number: KR1020117031343A
Authority: KR
Inventors: 아끼히로 히노; 다까시 고다마; 마유 이이다; 히로히또 야마까와; 사또미 노자끼; 가쯔유끼 하야가와
Original assignee: 도꾸리쯔 교세이호징 노우교 ? 쇼쿠힝 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨 기꼬우; 가부시키가이샤 닛신 세이분 구루프 혼샤
Priority date: 2004-04-09
Filing date: 2005-04-06
Publication date: 2012-06-18
Also published as: US8030463B2; US8343724B2; US20130115614A1; EP1736543B1; KR101154761B1; JPWO2005097989A1; ES2374293T3; ATE533847T1; KR20120005058A; US8652783B2; US20120009586A1; EP2180051A3; US20120009584A1; EP2180051B1; ATE530646T1; EP1736543A4; KR101154759B1; KR20120005059A; KR20120005057A; EP2180051A2

Abstract

본 발명은 싱글 카피이며 PCR에서 다른 식물과의 교차성이 없는 소맥을 특이적으로 검출할 수 있는 소맥 DNA(게놈)의 부분 영역을 특정하여 이 부분 영역을 증폭하기 위한 프라이머와, 이들을 이용하는 내재성 DNA의 바람직한 검출 및 정량 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 피검 시료 중의 소맥 내재성 DNA 서열을 중합 효소 연쇄 반응에 의해 검출 또는 정량하는 방법이며, 상기 피검 시료 중의 핵산 또는 상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하고, 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％를 포함하는 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 영역의 핵산을 증폭하는 공정, 및 상기 증폭된 핵산을 검출 또는 정량하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

소맥 내재성 ＤＮＡ 서열의 검출 및 정량 방법 {METHOD OF DETECTING AND QUANTIFYING WHEAT ENDOGENOUS DNA SEQUENCE}

본 발명은 피검 시료 중의 소맥 내재성 DNA 서열을 검출 또는 정량하는 방법에 관한 것이며, 특히 식품 소재 및 가공 식품에 포함되는 유전자 재조합 소맥의 혼입률을 결정할 때 이용하는 소맥 내재성 DNA의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.

일본에서는, 현재까지 옥수수, 대두 및 감자 등에 대하여 50종 이상의 유전자 재조합 농작물(이하 "GMO"라고 함)이 안전성 심사를 거쳐 수입 또는 판매가 인정되고 있다. 이에 따라, GMO 함유 식품은 "유전자 재조합에 따른 표시에 대한 가공 식품 품질 표시 기준 제7조 제1항 및 생선 식품 품질 표시 기준 제7조 제1항의 규정에 기초하는 농림 수산 대신이 정한 기준"(2000년 3월 31일 농림 수산성 고시 제517호), 및 "식품 위생법 시행 규칙 및 우유 및 유제품의 성분 규격 등에 따른 시행령의 일부를 개정하는 시행령 등의 시행에 대하여"(2001년 3월 15일 후생 노동성 식품 안전부 발표 제79호)에 기초하여, 그의 표시가 의무화되어 있다.

그러나, 해외에서는 한 번 안전성 평가가 종료되면 GMO와 비GMO가 혼재된 형태로 재배되는 경우도 있기 때문에, 수확 후의 유통의 과정에서도 혼입의 가능성을 부정할 수 없다. 또한, 식품 메이커 등은 가공 식품의 제조를 제조 업자에 위탁하는 경우도 많으며, 만일 비GMO를 사용하도록 지정하여 위탁하여도, 제조 업자의 공장에서 GMO를 사용하고 있는 경우에는, 이 GMO가 가공 식품에 미량 혼입되는 경우가 있다. 따라서, 표시 의무를 준수하기 위해서는, 식품 메이커 등은 완성된 가공 식품 중에도 GMO의 혼입 여부를 검사 분석하여 확인하는 것이 요구된다.

가공 식품 및 그의 원료 등의 피검 시료 중의 GMO의 검출 방법으로서는, 중합 효소 연쇄 반응(이하 "PCR"이라고 함)에 의해 재조합 DNA를 검출하는 방법, 엘리사법에 의해 재조합 단백질을 검출하는 방법이 있지만, 가공 식품의 경우, 가열 또는 가압에 의해 단백질이 변성되는 경우가 많으며, 엘리사법으로는 정확한 검출을 할 수 없는 경우가 많기 때문에, PCR법에 의해 검출이 행해진다.

검사 분석하는 방법으로서, JAS 분석 시험 핸드북 유전자 재조합 식품 검사ㆍ분석 메뉴얼 개정 제2판(비특허 문헌 1)에 기재되어 있는 방법이나, 『재조합 DNA 기술 응용 식품의 검사 방법에 대하여(일부 개정)』(2003년 6월 18일 후생 노동성 식품 안전부 발표 제0618002호)에 기재되어 있는 방법이 있다. 이들에 따르면 GMO의 검사 분석에서는, 피검 시료로부터 추출한 DNA로 PCR 증폭을 행할 수 있는지를 확인하기 위해, 각 농산물의 내재성 DNA를 검지(檢知)하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR법을 행하고, 예상되는 길이의 PCR 산물이 얻어지는 것을 확인할 필요가 있다고 기재되어 있다. 또한, 피검 시료 중에 포함되는 GMO를 정량하는 경우에는, 그의 농산물이 반드시 가지고 있는 내재성 DNA에 대한 재조합 DNA의 존재 비율로부터, 재조합체의 혼입률을 상대적으로 측정하는 방법이 이용된다.

예를 들면 옥수수는, 5계통의 승인 GMO 품종 각각에 대하여 특이적인 검지 프라이머쌍 이외에, 옥수수의 내재성 DNA로서 SSIIB 유전자의 영역을 검지하는 프라이머쌍이 개발되어 있다(비특허 문헌 1). 이 프라이머쌍은, 재조합 DNA의 검출 및 정량에서 내재성 DNA량의 기준이 되기 때문에, 증폭되는 내재성 DNA의 영역은 게놈에서 싱글 카피로 되어 있다.

『재조합 DNA 기술 응용 식품의 검사 방법에 대하여(일부 개정)』(2003년 11월 13일 식품 안전부 발표 제1113001호)에서는 정량 PCR법을 행할 때, 옥수수 또는 대두의 내재성 DNA 및 재조합 DNA를 표적으로 한 특이적 프라이머쌍에 의해 증폭된 증폭 산물을 플라스미드 상에 연결한 것을 표준 물질로서 사용하고 있다. 이러한 표준 물질을 사용하여 정량 PCR법을 행함으로써, 피검 시료에 대하여 일정 시간 정량 PCR을 행한 경우 재조합 DNA의 카피수와 내재성 DNA의 카피수의 비를 정확하게 구할 수 있다.

옥수수와 같이 복수 계통의 GMO 품종이 존재하는 경우에는, 각 계통에 특이적인 DNA와 내재성 DNA를 하나의 환상 DNA에 조합한 표준 물질을 사용하면, 각 계통의 혼입률의 측정에서 공통된 표준 물질을 사용할 수 있기 때문에 특히 유용하다.

또한, 일반적으로 각 계통에 특이적인 유전자는 입수가 곤란하지만, 한 번 이들을 조합하여 환상 DNA를 제조하면 환상 DNA 자체를 복제함으로써, 계통이 특이적인 DNA를 안정적으로 공급하는 것도 가능해진다.

비특허 문헌 1: JAS 분석 시험 핸드북 유전자 재조합 식품 검사ㆍ분석 메뉴얼 개정 제2판(독립 행정 법인 농림 수산 소비 기술 센터)

한편, 빵소맥(이하 "소맥"이라고 하는 경우가 있음)에 대하여 현재 시점에서 안전성 심사를 거친 유전자 재조합 제품은 없지만, 가까운 장래에 시판이 예상된다. 이 때문에, 소맥의 GMO가 유통된 경우에 대비하여, 소맥의 내재성 DNA를 검출 및 정량하는 방법 및 이것에 이용하는 PCR용 프라이머쌍의 개발이 요구되고 있다. 그러나 소맥의 경우에는, 동일한 곡물 중에 게놈 구조 또는 코딩되는 유전자의 염기 서열에 대하여 상동성이 높은 보리류, 예를 들면 대맥, 호밀 및 귀리 등이 있다. 또한, 일반적인 소맥(빵소맥) 이외에, 듀럼밀이 존재한다. 특히 듀럼밀은, 빵소맥이 갖는 게놈 (AA, BB, DD) 중의 게놈 (AA, BB)를 갖기 때문에, 빵소맥과의 상동성이 매우 높고, 오검출될 가능성이 높다. 이 때문에, 듀럼밀 또는 기타 보리류를 비롯한 다른 작물로부터 유래된 DNA를 오검출하지 않고, 빵소맥의 내재성 DNA만을 특이적으로 검출할 수 있는, 즉 다른 작물과 교차성이 없는 방법이 요구되고 있다.

또한, PCR법에 의해 증폭되는 내재성 DNA 영역이 멀티 카피이면, 피검 시료 중의 소맥을 정확하게 정량할 수 없으며, 피검 시료 중의 GMO 소맥의 혼입률을 정확하게 정량하기 위해서는 증폭되는 내재성 DNA의 영역이 게놈에서 싱글 카피인 것이 바람직하다.

또한, 정량 PCR법에 의해 GMO 혼입률을 구하는 경우에는, 소맥에 대해서도 내재성 유전자 DNA 및 재조합 DNA를 표적으로 한 특이적 프라이머쌍에 의해 증폭 가능한 영역을 환상 DNA 상에 연결한 표준 물질도 유용하다.

따라서, 본 발명은 싱글 카피이며 PCR에서 다른 식물과의 교차성이 없는 소맥을 특이적으로 검출할 수 있는 소맥 DNA(게놈)의 부분 영역을 특정하여 이 부분 영역을 증폭하기 위한 프라이머와, 이들을 이용하는 내재성 DNA의 바람직한 검출 및 정량 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 소맥 내재성 DNA 및 재조합 DNA를 표적으로 한 특이적 프라이머쌍에 의해 증폭 가능한 영역을 환상 DNA 상에 연결한 표준 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 소맥의 게놈 DNA에서 WaxyD 유전자의 비전사 영역, 수크로오스 트랜스포터를 코딩하는 TaSUT1D 유전자의 영역, 카르복시펩티다아제III을 코딩하는 CbpIII 유전자의 영역, GSS(Genome Survey Sequence) 서열 및 Lr1 유전자(좀녹병(Leaf rust) 내성 유전자) 영역은 싱글 카피이며, PCR 반응에서 다른 식물과의 교차성이 없고, 그것을 증폭함으로써 소맥 내재성 DNA 서열을 특이적으로 검출 또는 정량할 수 있는 부분 영역이 존재하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.

[도 1] 프라이머쌍 Wx011-5'/3'의 소맥 특이성의 결과를 나타낸다. 각 레인은 각각 M: 100 bp 래더 마커, 1: 소맥 브랜드(1 CW), 2: 소맥 브랜드(WW), 3: 소맥 브랜드(N61), 4: 밀가루, 5: 쌀, 6: 대맥, 7: 옥수수, 8: 대두, 9: 감자, 10: 토마토, 11: 가지, 12: 호밀, 13: 미노리보리, 14: 귀리, 15: 조, 16: 수수, 17: 메밀, 18: 유채씨, 19: 주형 대조군 없음(물)을 나타낸다.
[도 2] 프라이머쌍 WxO12-5'/3'의 소맥 특이성의 결과를 나타낸다. 각 레인은 각각 M: 100 bp 래더 마커, 1: 소맥 브랜드(1 CW), 2: 소맥 브랜드(WW), 3: 소맥 브랜드(N61), 4: 밀가루, 5: 쌀, 6: 대맥, 7: 옥수수, 8: 대두, 9: 감자, 10: 토마토, 11: 가지, 12: 호밀, 13: 미노리보리, 14: 귀리, 15: 조, 16: 수수, 17: 메밀, 18: 유채씨, 19: 주형 대조군 없음(물)을 나타낸다.
[도 3] Wx012의 카피수 추정을 위한 서던 혼성화에서의 프로브 WxS01의 설계를 도시한 도면이다. A는 비전사 영역을, B는 프로브를 나타낸다.
[도 4] 프로브 WxS01의 제한 효소의 절단 부위를 나타낸다.
[도 5] 소맥의 WxSO1을 프로브로 사용한 서던 혼성화의 결과를 나타낸다. 각 레인은 각각 1: WW의 품종 △△를 MboI로 절단, 2: WW의 품종 △△를 MvaI로 절단, 3: WW의 품종을 △△를 EcoT14I로 절단, 4: HRS의 품종 □□를 MboI로 절단, 5: HRS의 품종 □□를 MvaI로 절단, 6: HRS의 품종 □□를 EcoT14I, P: 양성 대조군 (WxS01: 300 g)로 절단한 결과를 나타낸다.
[도 6] 듀럼밀의 서던 혼성화의 결과를 나타낸다. 각 레인은 각각 1: 듀럼밀 품종 ▽▽를 MboI로 절단, 2: 듀럼밀 품종 ▽▽를 MvaI로 절단, 3: 듀럼밀 품종 ▽▽를 EcoT14I로 절단한 결과를 나타낸다.
[도 7] 프라이머쌍 Cbp014-5'/3'의 소맥 특이성의 확인 실험 결과를 나타낸다. 각 레인은 각각 M: 100 bp 래더 마커, 1: 소맥 브랜드(1 CW), 2: 소맥 브랜드(WW), 3: 소맥 브랜드(N61), 4: 밀가루, 5: 쌀, 6: 대맥, 7: 옥수수, 8: 대두, 9: 감자, 10: 토마토, 11: 가지, 12: 호밀, 13: 미노리보리, 14: 귀리, 15: 조, 16: 수수, 17: 메밀, 18: 유채씨, 19: 주형 대조군 없음(물)을 나타낸다.
[도 8] 각종 농도의 소맥 DNA를 주형으로서, 정량 PCR을 행한 결과로부터 작성한 검량선이다.

즉, 본 발명은

[1] 피검 시료 중의 소맥 내재성 DNA를 PCR에 의해 검출 또는 정량하는 방법이며, 상기 피검 시료 중의 핵산 또는 상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하고, 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％ 이상의 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 영역의 핵산을 증폭하는 공정, 및 상기 증폭된 핵산을 검출 또는 정량하는 공정을 포함하는 방법;

[2] 상기 [1]에 있어서, 상기 프라이머쌍이 (i) 서열 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 9에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (ii) 서열 10에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 11에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iii) 서열 12에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 13에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iv) 서열 14 또는 16에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 15 또는 17에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (v) 서열 18에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 19에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vi) 서열 20에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 21에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및 (vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 프라이머쌍의 각각에서 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍을 포함하는 프라이머쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머쌍인 방법;

[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 프라이머쌍에 포함되는 프라이머가 염기 15개 내지 40개 길이의 핵산인 방법;

[4] 피검 시료 중의 소맥을 PCR에 의해 검출 또는 정량하기 위한 프라이머쌍이며, 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％를 포함하는 영역을 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머쌍;

[5] 상기 [4]에 있어서, (i) 서열 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 9에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (ii) 서열 10에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 11에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iii) 서열 12에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 13에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iv) 서열 14 또는 16에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 15 또는 17에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (v) 서열 18에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 19에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vi) 서열 20에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 21에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및 (vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 프라이머쌍 각각에서 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍을 포함하는 프라이머쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머쌍;

[6] 상기 [4] 또는 [5]에 기재된 프라이머쌍을 포함하는, 피검 시료로부터 PCR에 의해 소맥 내재성 DNA 서열을 검출 또는 정량하기 위한 키트;

[7] 유전자 재조합 소맥 및 비유전자 재조합 소맥이 공통으로 갖는 내재성 DNA와, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA를 포함하는 환상 DNA;

[8] 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열과 적어도 80 ％의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 환상 DNA;

[9] 상기 [4] 또는 [5]에 기재된 프라이머쌍을 이용하여 PCR에 의해 증폭 가능한 영역을 포함하는 환상 DNA;

[10] 상기 [9] 또는 [10]에 있어서, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA를 포함하는 환상 DNA;

[11] 피검 시료에서의 유전자 재조합 소맥의 혼입률을 결정하는 방법이며, 상기 [7] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 환상 DNA와 피검 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로서 정량 PCR을 행하고, 환상 DNA에 대한 상기 정량 PCR의 결과를 이용하여 주형 DNA의 분자수를 구하기 위한 검량선을 작성하고, 피검 시료에 대한 상기 정량 PCR의 결과와 상기 검량선을 이용하여 상기 피검 시료 중에 포함되는 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수와, 1종 이상의 유전자 재조합 소맥에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 구하고, 상기 유전자 재조합 소맥에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 상기 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 A를 구하는 것을 포함하는 방법;

[12] 상기 [11]에 있어서, 상기 비 A와, 유전자 재조합 소맥의 표준 종자로부터 추출한 DNA를 주형으로서 정량 PCR을 행하여 구해지는, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 B를 이용하여 수학식 100×A/B를 계산함으로써 피검 시료 중의 유전자 재조합 소맥의 혼입률을 결정하는 공정을 추가로 포함하는 방법;

[13] 상기 [11] 또는 [12]에 있어서, 상기 정량 PCR에서 상기 [4] 또는 [5]에 기재된 프라이머쌍으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머쌍을 이용하는 방법

에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 식품 소재 및 가공 식품 등의 피검 시료 중의 소맥의 존재 및 그의 양에 대한 정확한 정보를 제공하며, 따라서 본 발명의 방법에 이용되는 PCR용 프라이머쌍은 소맥을 특이적으로 검출하고, 소맥 이외의 작물, 예를 들면 쌀, 대맥, 호밀, 귀리, 미노리보리, 옥수수, 대두, 감자, 토마토, 가지, 조, 수수, 메밀 및 유채씨 등과 교차 반응하지 않는 것이 필요하다. 또한, 본 발명의 프라이머쌍에 의해 증폭하기 위한 내재성 DNA의 영역은 싱글 카피인 것이 바람직하다.

여기서, 검사법에서 PCR용 프라이머쌍이 소맥 이외의 작물과 교차 반응하면, 소맥 검출의 위양성의 가능성이 생길 뿐만 아니라, 피검 시료 중의 소맥 내재성 DNA의 정확한 정량이 곤란하다. 또한, 상기 내재성 DNA 영역이 멀티 카피이면, 마찬가지로 소맥 내재성 DNA를 정확하게 정량할 수 없다. 따라서, 이와 같은 방법 및 프라이머쌍은 GMO 소맥의 정확한 혼입률을 결정할 수 없다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하에, 본 명세서에서 사용하는 용어의 의미 등을 나타내어, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 명세서에서, 용어 "소맥"은 특별히 언급하지 않는 한 빵소맥을 의미한다.

본 발명의 방법은 소맥의 내재성 DNA 서열로서, 소맥의 게놈 상의 WaxyD 유전자의 비전사 영역과 그의 3' 상류 영역(서열 16), TaSUT1D 유전자(Accession NO. AF408845), CbpIII 유전자(Accession NO. J02817), Lr1 유전자(Accession NO. S79983) 및 GSS 서열(Accession N0. AJ440705)의 영역의 특정 부분을 검출한다.

Waxy 유전자는 소맥의 4A, 7A, 7D 염색체 각각에 1 세트씩, 합계 3 세트가 존재한다고 알려져 있다(일본 특허 공개 제2003-284598, Ainsworth, C. et al.: Plant Mol. Biol. 1993 Apr; 22(1): 67 내지 82). 가공 식품 중의 소맥 게놈으로부터 WaxyD 유전자의 전체 길이를 검출하는 것은 곤란하며, 무작위로 짧은 부분 서열을 선택하면 그의 영역은 멀티 카피일 가능성이 있다.

본 발명자들은 WaxyD 유전자의 비전사 영역의 염기 서열(서열 22)을 결정하고, 그의 영역 중에 게놈 D에만 존재하는 싱글 카피인 영역이 있는 것을 발견하여, 그 중의 101 bp 부분을 Wx011 영역으로 하였다(서열 2). 또한, 102 bp 부분을 Wx012 영역으로 하였다(서열 1). 본 발명에 따른 방법에서는, Wx011 영역 또는 Wx012 영역의 적어도 80 ％를 포함하는 영역을 PCR로 증폭함으로써 WaxyD 유전자를 검출 및 정량한다.

TaSUT 유전자는 수크로오스 트랜스포터 유전자로서 알려져 있으며, 소맥 A, B 및 D 염색체 각각에 염기 서열의 상동성이 매우 높은 TaSUT 유전자가 1 카피씩 존재한다는 보고가 있다(Aoki, N. et al.: Plant Molecular Biology 50:453 내지 462, 2002). 그러나, 본 발명에서는 게놈 D의 TaSUT1D 유전자 영역 중 sut01 영역(서열 3) 및 sut02 영역(서열 4)이 D 염색체에만 존재하는 싱글 카피 영역일 가능성이 발견되었다. 따라서, 본 발명은 sutO1 영역(서열 3) 및/또는 sut02 영역(서열 4)의 적어도 80 ％를 포함하는 영역을 PCR로 증폭함으로써 TaSUT1D 유전자를 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 게놈의 CbpIII 유전자 영역 중 100 bp의 CbpIII014 영역(서열 5)은 싱글 카피일 가능성이 높으며, 정성(定性) PCR에서 다른 식물 품종과 교차성이 거의 없는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명은 CbpIII014 영역(서열 5)의 적어도 80 ％를 포함하는 영역을 PCR로 증폭함으로써 CbpIII 유전자를 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다.

소맥의 GSS 영역이란, 게놈 해석의 프로모터와 같은 역할을 행하는 DNA를 말한다. 본 발명에서, GSS 영역 중 111 bp의 gss01 영역(서열 6)은 싱글 카피일 가능성이 높으며, 정성 PCR에서 다른 식물 품종과 교차성이 거의 없는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명은 gss01(서열 6) 영역의 적어도 80 ％를 포함하는 영역을 PCR로 증폭함으로써 gss01 영역을 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 소맥 게놈의 Lr1 유전자 영역 중 111 bp의 Lr101 영역(서열 7)은 싱글 카피일 가능성이 높으며, 정성 PCR에서 다른 식물 품종과 교차성이 거의 없는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명은 Lr101(서열 7) 영역의 적어도 80 ％를 포함하는 영역을 PCR로 증폭함으로써 Lr1 유전자를 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다.

이와 같이, 상기 Wx011 영역, Wx012 영역, sut01 영역, sut02 영역, CbpIIl014 영역, gss01 영역 및 Lr101 영역은 각각 약 100 내지 130 bp로 짧기 때문에, DNA가 단편화될 가능성이 있는 가공 식품 등의 시료로부터도 소맥 내재성 DNA의 검출 및 정량이 가능하다.

또한, 본원 명세서에서 "서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％를 포함하는 영역"이란, 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 것보다 짧은 영역, 또는 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열과, 또한 게놈 상에서의 5'측 및/또는 3'측의 염기 서열을 포함하며, 전체 길이의 적어도 80 ％가 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열이 차지하는 것보다 긴 영역을 의미한다. 이러한 영역은 싱글 카피 영역을 적어도 80 ％ 포함하기 때문에, 서열 1 내지 7에 기재된 염기 서열보다 짧은 영역 또는 긴 영역이어도, 적절한 프라이머쌍을 선택함으로써 예측된 길이의 PCR 산물이 얻어지고, 이에 따라 소맥 내재성 DNA를 검출 및/또는 정량할 수 있다.

본 발명에서 PCR법에 이용하는 프라이머쌍은, Wx011 영역, Wx012 영역, sutO1, sut02 영역, CbpIII014 영역, gss01 영역 및 Lr101 영역 중 어느 하나의 영역의 적어도 80 ％ 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍이면 특별히 한정되지 않으며, 증폭하고자 하는 영역의 염기 서열을 기초로 프라이머 제조상의 기본 규칙을 준수하여 설계할 수 있다. 이때, 각 프라이머의 Tm값이 통일되도록 하는 것에 유의한다. 또한, 각 프라이머의 길이는 통상적으로 15 내지 40 bp, 바람직하게는 15 내지 30 bp로 한다.

PCR용 프라이머쌍이 소맥 이외의 작물과 교차 반응하면, 소맥 검출의 위양성의 가능성이 생길 뿐만 아니라, 피검 시료 중의 소맥 내재성 DNA 서열의 정확한 정량이 곤란하다. 또한, 상기 내재성 DNA 서열이 멀티 카피이면, 마찬가지로 소맥 내재성 DNA 서열을 정확하게 정량할 수 없다. 따라서, 이와 같은 방법 및 프라이머쌍은 GMO 소맥의 정확한 혼입률을 결정할 수 없다.

본 발명의 방법은 식품 소재 및 가공 식품 등의 피검 시료 중의 소맥의 존재 및 그의 양에 대한 정확한 정보를 제공하며, 따라서 본 발명의 방법에 이용되는 PCR용 프라이머쌍은 소맥을 특이적으로 검출하고, 소맥 이외의 작물, 예를 들면 쌀, 듀럼밀, 대맥, 호밀, 귀리, 미노리보리, 옥수수, 대두, 감자, 토마토, 가지, 조, 수수, 메밀 및 유채씨 등과 교차 반응하지 않는 것이 필요하다.

이러한 프라이머쌍으로서는, 예를 들면 (i) 서열 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 9에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (ii) 서열 10에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 11에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iii) 서열 12에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 13에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iv) 서열 14 또는 16에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 15 또는 17에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (v) 서열 18에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 19에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (j) 서열 20에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 21에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및 (vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 프라이머쌍 각각에서 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍을 포함하는 프라이머쌍 등을 들 수 있다. 이들 프라이머쌍은 WxO11 영역, Wx012 영역, sutO1, sut02 영역, CbpIII014 영역, gss01 영역 및 Lr101 영역 중 어느 하나의 영역을 다른 작물과 교차성이 없을 뿐만 아니라 특이적으로 증폭할 수 있다.

또한, "각 프라이머의 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 프라이머"는, 서열 8 내지 21에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하며, 경우에 따라 게놈의 염기 서열에서 5'측 및/또는 3'측으로 이동된, 전체 길이가 짧거나, 길거나 또는 동일한 프라이머를 의미한다. 이 때문에, 상기 (vii)의 프라이머쌍에서는, 서열 8 내지 21에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산 프라이머 중 전방 프라이머, 후방 프라이머 또는 두 프라이머 모두를 상술한 조건에 따라 변화시킬 수 있다. 단, 이들 프라이머는 서열 8 내지 21의 염기 서열을 적어도 80 ％ 포함하기 때문에, (i) 내지 (vi)의 프라이머쌍과 마찬가지로 WxO11 영역, Wx012 영역, sutO1, sutO2 영역, CbpIII014 영역, gss01 영역 및 Lr101 영역 중 어느 하나의 영역을 다른 작물과 교차성이 없을 뿐만 아니라 특이적으로 증폭할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 피검 시료는 소맥을 포함하거나 포함할 가능성이 있는 식품 소재 및 가공 식품이며, 예를 들면 소맥을 가공하지 않은 종자, 건조 종자, 밀가루 또는 혼합 분말 등의 식품 원료 또는 그의 가공 중간 원료, 빵류 또는 국수류 등의 가공 식품이 포함된다. 또한, 식품 소재 또는 식품은 인간의 식품 뿐만 아니라, 애완 동물 먹이 또는 사료를 포함한다. 또한, 소맥 이외의 작물은 식품 소재 및 식품 원료로서 사용되는 모든 작물을 의미하며, 예를 들면 상술한 작물이다.

이러한 시료는, 예를 들면 그 상태로 또는 분쇄하여 핵산 추출에 제공할 수 있으며, 세정하여 건조시키고 나서 파쇄하여 핵산 추출에 제공할 수도 있다. 피검 시료로부터 추출하여 분석에 이용하는 핵산은 통상적으로 DNA이다. DNA는 공지된 임의의 방법에 의해 추출할 수도 있지만, 현재는 다수의 DNA 추출 키트가 시판되어 있기 때문에 이들을 이용하여 추출할 수 있다. 예를 들면 DNeasy Plant Maxi 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여, JAS 분석 시험 핸드북 유전자 재조합 식품 검사ㆍ 분석 메뉴얼 개정 제2판(독립 행정 법인 농림 수산 소비 기술 센터)에 기재된 방법에 따라 피검 시료로부터 DNA를 추출한다. 추출한 DNA는 흡광도 측정 등에 의해 농도를 구하고, PCR에 바람직한 농도까지 희석하여 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, PCR은 이용되는 프라이머 또는 DNA 중합 효소를 고려하여 통상법에 따라 행할 수 있다. 이때, PCR 완충액, dNTP 및 MgCl₂ 등의 시약은 제조할 수도 있으며, 시판되는 PCR 키트를 이용할 수도 있다. PCR에는 상기 프라이머쌍을 1군 또는 2군 이상 이용할 수 있다. 또한, PCR 조건은 예를 들면 95 ℃에서 30초, 63 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초를 1 사이클로서 40 사이클 행하며, 마지막으로 종료 반응으로서 72 ℃에서 7분의 조건을 들 수 있지만, 이용되는 프라이머의 Tm 또는 증폭하기 위한 영역의 길이 및 주형 DNA의 농도 등을 고려하여 적절하게 변경할 수 있다.

증폭된 핵산(PCR 산물)의 검출은 특정한 DNA 단편을 동정(同定)할 수 있는 임의의 방법, 구체적으로는 아가로스 겔 전기 영동, 아크릴아미드 겔 전기 영동, 모세관 전기 영동, 혼성화, 면역학적 방법 등을 이용하여 실시할 수 있다. 일반적으로는, PCR 산물을 전기 영동하고, 그의 영동 패턴에 의해 확인하는데, 예를 들면 에티듐브로마이드를 포함하는 0.8 ％의 아가로스 겔에 의한 전기 영동을 행하여 밴드를 확인함으로써 검출할 수 있다.

본 발명은 상술한 검출 또는 정량 방법에서 이용하는 프라이머쌍 및 이들의 프라이머쌍을 포함하는 키트를 포함한다. 프라이머는 통상법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 키트는 프라이머쌍 이외의 다른 시약, 예를 들면 dNTP, MgCl₂ 및 TaqDNA 중합 효소 등의 중합 효소, 완충액(예를 들면 Tris-HCl), 글리세롤, DMSO, 양성 대조군용 DNA, 음성 대조군용 DNA 및 증류수 등을 포함할 수 있다. 이들 시약은 키트 중에서, 각각 독립적으로 포함되어 제공될 수도 있으며, 2종 이상의 시약이 혼합된 형태로 제공될 수도 있다. 키트 중의 각각의 시약의 농도에 특별히 제한은 없으며, 본 발명의 PCR을 실시하는 것에 대하여 가능한 범위일 수 있다. 또한, 키트에는 바람직한 PCR 조건 등의 정보가 추가로 첨부될 수도 있으며, 프라이머 시약만일 수도 있다.

또한, 본 발명은 GMO 소맥의 혼입률을 정량 PCR법에 의해 측정할 때 유용한 표준 물질을 제공한다. 이 표준 물질은 비-GMO 소맥과 GMO 소맥이 공통으로 갖는 내재성 DNA와, 하나 이상의 GMO 소맥 특이적 DNA를 1개의 환상 DNA 상에 연결한 것이다.

본 발명에 따른 표준 물질은 예를 들면, 내재성 DNA로서 서열 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 염기 서열과 적어도 80 ％의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 DNA를 포함하는 환상 DNA일 수도 있다.

또한, 예를 들면 (i) 서열 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 9에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (ii) 서열 10에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 11에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iii) 서열 12에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 13에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iv) 서열 14 또는 16에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 15 또는 17에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (v) 서열 18에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 19에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vi) 서열 20에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 21에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및 (vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 프라이머쌍 각각에서 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍을 포함하는 프라이머쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머쌍에 의해 증폭될 수 있는 영역을, 내재성 DNA로서 포함하는 환상 DNA일 수도 있다.

표준 물질로서 이용되는 환상 DNA는, 내재성 DNA 및 GMO 소맥의 계통 특이적 DNA를 삽입할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 pBR계 벡터(예; pBR322 및 pBR328 등), pUC계 벡터(pUC19 및 pUC18 등), λ파지계 벡터(λgt10 및 λgt11 등) 및 이들에 변화를 가한 시판되는 벡터 등을 이용할 수 있다.

GMO 소맥을 검출하는 경우에는, 유전자 재조합에 의해 보통 소맥 게놈에 삽입된 외래 DNA 서열만을 증폭하여 검출하지 않고, 외래 DNA 서열의 상류 및 하류의 내재성 서열을 포함하는 영역을 증폭할 필요가 있다. 다른 작물에도 동일한 외래 DNA 서열을 삽입하여 GMO 작물을 제조하는 경우가 있으므로, 외래 DNA 서열만을 검출하면 GMO 소맥으로부터 유래된 것인지, 다른 작물의 유전자 재조합체인지 판별할 수 없기 때문이다. 따라서, GMO 계통 특이적 서열을 검출하기 위한 프라이머는, 각 계통의 GMO 소맥에 삽입된 외래 DNA 서열과 그의 상류 및 하류의 내재성 서열을 포함하는 영역을 증폭할 수 있는 프라이머일 필요가 있다. 이러한 프라이머는, 예를 들면 대두에 대하여 보고된 문헌(Wurz, A. et al.; 2^nd Status report. BgVV, BgVV-Heft, 1/199797, 118 또는 Kopell, E. et al.; Mitt. Gebiete Levensm, Hyg., 88, 164 등을 참조)에 기재된 방법 또는 그에 준한 방법에 따라 제조된다. 상기 표준 물질에 삽입되는 GMO 소맥의 각 계통에 특이적인 서열은, 이러한 프라이머로 증폭할 수 있는 DNA 서열이 선택된다.

표준 물질에 삽입하는 소맥 내재성 DNA와 GMO 소맥 특이적 DNA가 결정되면, 보통 소맥 게놈 또는 GMO 소맥 게놈을 주형으로 한 PCR을 행하여 내재성 DNA 및 GMO 소맥 특이적 DNA를 클로닝하고, 클로닝한 DNA 단편과 상기 환상 DNA의 클로닝 부위를 동일한 제한 효소로 절단함으로써, 상기 DNA 단편을 상기 환상 DNA가 절단된 부위에 연결할 수 있다. 제한 효소는 공지된 것을 적절하게 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들면 EcoRI, SpeI, EcoRV, SmaI, SacI, NotI, HindIII 및 XhoI 등이 사용된다.

이렇게 하여 제조된 표준 물질을 포함하는 용액에 대하여, 2종 이상의 희석 계열을 형성하여 각각에 대하여 정량적 PCR을 행하면, 소맥 내재성 DNA 서열, GMO 특이적 DNA 서열의 부분 영역 각각에 대하여 검량선을 구할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 표준 물질은 정성 PCR에서의 소맥 내재성 DNA 서열 또는 GMO 특이적 DNA 서열의 양성 대조군으로서도 이용할 수 있다.

본 발명은 상술한 표준 물질을 사용한 PCR에 의해, 피검 시료 중에서의 GMO 소맥의 혼입률을 결정하는 방법을 포함한다.

상기 방법은 우선, 상술한 표준 물질과 피검 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로서 정량 PCR을 행하고, 표준 물질에 대한 정량적 PCR의 결과를 이용하여, 주형 DNA의 분자수를 구하기 위한 검량선을 작성한다.

정량적 PCR에서는 데이터로서 Ct값이 얻어진다. Ct값이란, 정량 PCR의 증폭 산물량의 변화를 시간 경과에 따라 취한 경우, 증폭이 지수 함수적으로 발생하는 부분에서 일정한 증폭 산물량이 되는 사이클수(threshold Cycle)이다. 이 Ct값을 피검 시료 중 PCR을 행하기 전에 포함되어 있었던 DNA의 초기 분자수(주형 DNA의 분자수)로 변환하기 위해, 상기 검량선을 이용할 수 있다.

검량선은 예를 들면 Ct값을 종축으로 하고 희석 계열에 포함되는 표준 물질의 분자수의 대수를 횡축으로 하여 공지된 방법 또는 그에 준하는 방법에 따라 작성할 수 있다. 예를 들면, 상기 표준 물질을 다양한 농도로 포함하는 희석 계열을 제조하고, 일정 시간 동안 정량적 PCR을 행한 후의 각각의 Ct값을 구하여 제조하는 것이 가능하다.

한편, 상기 피검 시료 중에 포함된 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 초기 분자수 및 유전자 재조합 소맥에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수는, 피검 시료에 대하여 행한 정량적 PCR의 결과, 즉 Ct값으로부터 상술한 검량선을 이용하여 구할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 유전자 재조합 소맥에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 A를 구하고, 유전자 재조합 소맥의 표준 종자를 사용한 정량적 PCR을 행하여 구해지는, GMO 소맥의 각 계통에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 B를 이용하여 수학식 100×A/B를 계산함으로써 피검 시료 중의 유전자 재조합 소맥의 혼입률을 결정할 수 있다. 상기 비 B는, 비특허 문헌 1에서 "내표비"로 불리는 것이며, 순수한 GM 계통마다 종자로부터 추출한 DNA 중의 (재조합 유전자)/(내재성 유전자)의 비율이다. 내표비는, 각 재조합 계통 종자 중에서 일정한 비율을 나타낸다.

본 발명에 따른 GMO 소맥 혼입률의 결정 방법에서 행해지는 각 PCR 공정은 동시에 실시할 수도 있고, 각각 실시할 수도 있다. 각각 PCR 공정을 행하는 경우에는, 검량선을 구하기 위해 행한 PCR과 핵산의 증폭 효율이 대략 동일해지는 조건으로 행하는 것이 바람직하다. 이러한 조건으로서는, 예를 들면 검량선을 작성하기 위해 행한 PCR의 온도 및 사이클을 동일하게 하는 조건을 들 수 있다.

실시예

실시예 1

WaxyD 유전자의 검출

WaxyD 유전자의 비전사 영역인 101 bp의 Wx011 영역(서열 2), 102 bp의 Wx012 영역(서열 1)을 증폭함으로써 검출하였다.

[1] 프라이머의 설계

프라이머는 프라이머 설계 소프트 프라이머 익스프레스(어플라이드 바이오 시스템즈사)에 의해 설계하였다. 프라이머의 디자인에는, 프라이머 제조상의 기본 규칙을 준수하여, 각 프라이머의 Tm값이 통일되도록 할 뿐만 아니라, DNA가 단편화되어 있는 가공 식품으로부터의 검지를 감안하여 PCR에 의한 증폭 산물이 100 내지 150 bp 정도가 되도록, 또는 프라이머의 염기수가 18 내지 25 bp가 되도록 하였다. 그 결과, 5'프라이머 Wx011-5'(서열 8)와 3'프라이머 Wx011-3'(서열 9) 및 5'프라이머 Wx012-5'(서열 10)와 3'프라이머 Wx012-3'(서열 11)을 얻었다.

[2] DNA의 추출

PCR의 주형 DNA 샘플로서는, 소맥 샘플로서 소맥 2 브랜드(1CW, WW) 4 품종(N61을 포함함) 및 시판된 밀가루(닛신 세이훈사 제조『카메리야』)로부터 추출한 DNA를 이용하고, 비교예로서 쌀, 옥수수, 조, 수수, 메밀, 대맥 2 품종, 호밀, 귀리, 대두, 유채씨, 토마토, 가지, 듀럼밀 4 품종(이하 "듀럼밀 품종 A 내지 D"라고 함), 1 브랜드(CAD)로부터 추출한 DNA를 이용하였다.

소맥 및 기타 식물 시료에 대하여, 1 ％ SDS(와코 쥰야꾸)에 의해 세정하고, 증류수에 의해 세정한 후 각각 건조시키며, 이어서 멀티 비즈 쇼커(야스이 기까이)를 사용하여 미분쇄하였다. 분쇄 샘플 1 g을 DNeasy Plant Maxi 키트(퀴아젠)에 넣고, 상기 비특허 문헌 1에 기재된 옥수수 DNA 추출의 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. 또한, 듀럼밀은 각 품종 4알씩을 무작위로 선택하고, 상기 키트를 이용하여 이 키트의 프로토콜에 따라 곡립(穀粒) 1알씩으로부터 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 흡광도로부터 농도를 측정한 후, 그의 일부를 순수로 10 ng/㎕로 희석하여, 이것을 PCR 반응의 주형 DNA 시료액으로서 이용하였다.

[3] PCR 반응과 전기 영동

PCR 반응액은 이하와 같이 제조하였다. 즉 PCR 완충액(PCR 버퍼II, 어플라이드 바이오 시스템즈사), 200 μmol/ℓ dNTP, 1.5 mmol/ℓ MgCl₂, 0.5 μmol/ℓ 5' 및 3'프라이머, 및 0.625 단위 Taq DNA 중합 효소(Ampli Taq Gold, 어플라이드 바이오 시스템즈사)를 포함하는 액에 10 ng/㎕로 조정한 DNA 시료액 2.5 ㎕를 첨가하여 전체량을 25 ㎕로 하였다.

PCR 증폭 장치로서 GeneAmp PCR System 9600(어플라이드 바이오 시스템즈사)을 사용하여, 반응 조건을 다음과 같이 설정하였다. 우선 95 ℃로 10분간 유지하여 반응을 개시하고, 이어서 95 ℃에서 30초, 63 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초를 1 사이클로서, 40 사이클의 PCR 증폭을 행하였다. 마지막으로 종료 반응으로서 72 ℃에서 7분간 유지한 후 4 ℃로 보존하여, 얻어진 반응액을 PCR 증폭 반응액으로 하였다.

PCR 증폭 반응액은 에티듐브로마이드를 포함하는 0.8 ％ 아가로스 겔 전기 영동에 넣었다. 소맥과 다른 작물의 검지 시험에 대하여, Wx011-5'/Wx011-3'의 결과를 도 1에 도시하고, Wx012-5'/Wx012-3'의 결과를 도 2에 도시한다.

프라이머쌍 Wx011-5'/Wx011-3', Wx012-5'/Wx012-3' 모두, 소맥 샘플(레인 1 내지 4)에서는 예상된 크기의 싱글 밴드를 검출하였으며, 소맥 이외의 레인에서는 밴드가 관찰되지 않았다. 이로부터, 프라이머쌍 Wx011-5'/Wx011-3' 또는 Wx012-5'/Wx012-3'를 이용하면, 다른 작물과 교차성 없이 소맥 내재성 DNA로서 Wx011 영역 또는 Wx012 영역을 검출할 수 있다는 것이 확인되었다.

또한, 프라이머쌍 Wx012-5'/Wx012-3'를 이용한 경우의 소맥과 듀럼밀에 대한 결과를 하기의 표 1에 나타낸다. 프라이머쌍 Wx012-5'/Wx012-3'를 이용하면, 소맥과 듀럼밀도 교차성 없이 검출할 수 있다는 것이 확인되었다.

실시예 2

Wx012 영역의 카피수의 확인

Wx012 영역의 카피수를 확인하기 위해, 서던(southern) 혼성화를 이하의 조건으로 행하였다.

소맥 2 품종으로부터 추출한 DNA를 샘플로 하였다. DNA 추출은 실시예 1과 동일하게 행하였다.

혼성화 및 검출에는, Gene Images Alkphos Direct Labeling and Detection System(아머샴 바이오 사이엔스사)을 이용하였다. 시약 및 완충액 등은 모두 키트의 프로토콜과 동일한 것을 사용하였다.

〔1〕 프로브의 설계

상기 키트를 이용한 서던 혼성화에서, 양호한 감도가 얻어지는 프로브의 크기는 300 bp 이상으로 되어 있다. 그러나, Wx012는 102 bp로서 서던 혼성화의 프로브로서는 작다. 또한, 소맥의 게놈 크기는 1.7×10¹⁰ bp로 커서 검출 감도를 충분히 높일 필요성이 있기 때문에, Wx012 영역을 포함하는 444 bp의 프로브 WxS01을 설계하고, 5'프라이머 WxS01-5'(서열 23)와 3'프라이머 Wx012-3'(서열 11)를 이용하여 PCR에 의해 제조하여, 프로브로서 사용하였다. WxS01을 얻기 위한 프라이머의 설계는 Genetyx Win.을 사용하고, 프라이머 제조상의 기본 규칙을 준수하여 각 프라이머의 Tm값이 통일되도록 하였다. 프로브 설계의 개략을 도 3에 도시한다.

〔2〕 제한 효소의 선택

제한 효소는 목적 영역을 절단하지 않고, 메틸화의 영향을 받지 않는 효소이며, 표적을 포함하는 절단 부위의 위치를 알고 있는 것을 조건으로서 선택하였다. 그 결과, 단일 효소 반응으로 목적으로 하는 영역의 양측을 절단할 수 있는 MboI, MvaI 및 EcoT14I를 선택하였다. 각각의 제한 효소 절단 부위 및 절단편 크기를 도 4에 도시한다. 또한, 도 3에서의 제한 효소 부위는 서열 22에 기재된 염기 서열에서의 위치이다.

〔3〕 소맥의 서던 혼성화

DNA에 상술한 각 제한 효소를 37 ℃에서 15 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 페놀ㆍ클로로포름 처리 및 에탄올 침전 처리를 행하고, 이어서 TE 용액에 용해하였다. 얻어진 DNA 용액을, 1.6 ％ 아가로스 겔(LO3, 다까라 바이오사)을 사용하고 영동액으로서 TAE 용액을 사용한 전기 영동에 넣었다. 이어서, 20×SSC 용액을 사용하여, 하룻밤에 걸쳐서 겔 중의 DNA를 막(HyperBondN⁺, 아머샴 파마시아사)에 전사시켰다.

혼성화는 55 ℃에서, 키트의 혼성화 완충 용액을 사용하여 행하였다. 프로브 WxS01의 농도는 20 ng/㎖가 되도록 하여, 하룻밤 동안 반응시켰다. 세정은 1차 세정액을 사용하여 55 ℃에서 20분간, 2차 세정액을 사용하여 상온에서 10분간 행하였다. 세정 후, 검출 효소 반응을 개시시킨 막을 3분간 방치한 후, 검출 용액을 떨어뜨려 사란랩으로 쌌다. 암실에서 감광 필름(하이퍼 필름, 아머샴 파마시아사)에 1 시간 동안 감광시켜 현상하여, 밴드의 유무를 확인하였다.

그 결과, MboI로 절단한 경우에는 2개, MvaI로 절단한 경우에는 3개, EcoT14I로 절단한 경우에는 3개 또는 6개의 밴드가 검출되었다(도 5). Waxy 유전자는 게놈 A에 2 카피, 게놈 D에 1 카피가 있다고 보고되어 있기 때문에(Ainswor th, C. et al.: Plant mol. Biol. 1993 Apr; 22(1):67 내지 82), 프로브 WxSO1이 혼성화되는 영역이 게놈 A에 2 카피, 게놈 D에 1 카피 존재한다는 것이 확인되었다.

〔4〕 듀럼밀의 서던 혼성화

게놈 D가 존재하지 않는 듀럼밀 게놈을 주형으로서, 상기 [3]과 마찬가지로 서던 혼성화를 행하였다.

그 결과, MboI로 절단한 경우에는 1개, MvaI로 절단한 경우에는 2개, EcoT14I로 절단한 경우에는 3개의 밴드가 검출되었다. 그러나, EcoT14I에 의한 3개의 밴드는 그 중 1개가 다른 2개보다 굵고, 밴드 2개가 중합된 것이기 때문에, 본 실험에서는 듀럼밀로부터 검출되는 밴드는 최대 4개라고 판단하였다(도 6). 이 결과는, WxS01이 게놈 A에 2 카피 존재한다는 상기〔3〕과 일치한다. 또한, 실시예 1에서 내재성 DNA의 Wx012 영역이 게놈 D에만 존재하는 것이 확인되었다. 이들 결과로부터, Wx012 영역은 소맥 게놈 중에 1 카피만 존재한다는 것이 확인되었다.

실시예 3

정량적 PCR에 의한 Wx012의 적정 확인

이어서, 정량적 PCR에 의한 검지에서도, Wx012가 검지용 내재성 서열로서의 필요 사항을 만족하는 것을 확인하였다.

〔1〕 TaqMan 프로브의 설계

프라이머 및 프로브의 설계 소프트웨어인 프라이머 익스프레스(어플라이드 바이오 시스템즈 재팬사 제조)를 이용하여 설계하였다. 소프트웨어의 프로토콜에 기재된 프로브 설정시의 확인 사항을 확인하여, 적당한 프로브를 선택하였다. 선택한 프로브의 염기 서열을 서열 42에 기재한다.

〔2〕 공시(供試) 샘플

PCR의 주형 DNA 샘플로서는, 소맥 이외의 12 종류의 식물(쌀, 옥수수, 조, 수수, 메밀, 대맥, 호밀, 귀리, 대두, 유채씨, 병아리콩 및 편두), 듀럼밀 대표적 4 품종 및 강력, 중력, 박력밀의 대표적 19 품종으로부터 추출한 DNA를 이용하였다.

〔3〕 DNA의 추출

소맥 및 기타 식물 시료에 대하여, 1 ％ SDS(와코 쥰야꾸)에 의해 세정하고, 증류수에 의해 세정한 후 각각 건조시키며, 이어서 멀티 쇼커(야스이 기까이)를 사용하여 미분쇄하였다. 얻어진 곡류의 분쇄 샘플 1 g을 DNeasy Plant Maxi 키트(퀴아젠)에 넣고, 공정법에 기재된 옥수수의 DNA 추출 프로토콜에 따라 DNA를 추출하였다. 또한, 듀럼밀은 각 품종 4알씩을 무작위로 선택하고, DNeasy Plant Mini 키트(퀴아젠)를 키트의 프로토콜 상태로 사용하여 곡립 1알씩의 DNA 추출을 행하였다. 또한, 소맥 4 품종에 대해서는, 공정법에 기재되어 있는 프로토콜에 따라 Genomic-tip20/G(퀴아젠) 및 CTAB법에 의한 추출을 행하며, Dneasy Plant Mini 키트(퀴아젠)에 의한 추출도 키트에 부록되어 있는 프로토콜에 따라 행하였다. 추출된 DNA는 흡광도의 측정에 의해 농도를 구한 후, 그의 일부를 순수에 의해 20 ng/㎕로 희석하여, 이것을 PCR 반응의 주형 DNA 시료액으로서 사용하였다.

〔4〕 정량적 PCR 반응

정량적 PCR은 ABI7700(어플라이드 바이오 시스템즈사 제조)을 사용하여 행하였다.

분석은 각 자료에 대하여 2 가지 또는 3 가지 병행하여 행하였다. 1개의 웰당 25 ㎕의 계에서 반응을 행하였다.

PCR의 반응액은 다음과 같이 조정하였다. 우선 TaqMan 프로브, 5'-프라이머 및 3'프라이머의 용액을 각각 2 μM, 5 μM, 5 μM로 순수로 희석하고, 이들과 순수를 1:1:1:1의 비율로 혼합한 용액을 프라이머ㆍ프로브 믹스 용액으로 하였다.

마스터 믹스는 TaqMan 유니버설 마스터 믹스(어플라이드 바이오 시스템즈사)와, 프라이머ㆍ프로브 믹스 용액을 1.25:1의 비율로 혼합하여 필요량 조정하였다. 마스터 믹스를 주형 DNA의 수만큼 72 ㎕씩 분주(分注)하고, 각각에 20 ng/㎖로 조정한 주형 DNA를 8 ㎕씩 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액을 구멍이 96개인 플레이트의 지정 웰에 25 ㎕씩, 1 샘플당 3 웰로 분주하였다.

반응 조건은 다음과 같이 설정하였다. 50 ℃에서 2분간 유지한 후 95 ℃에서 10분간 유지하여 반응을 개시시키며, 95 ℃에서 30초, 59 ℃에서 1분을 1 사이클로서 40 사이클의 증폭 반응을 행하고, 그 후 50 ℃에서 4분간 유지하였다.

〔5〕 소맥 특이성의 확인

19 품종의 소맥 및 다른 12 종류 식물의 DNA, 4 품종의 듀럼밀로부터 추출한 DNA 및 소맥 이외의 12 종류 식물로부터 추출한 DNA를 주형으로서, 1 샘플에 대하여 3 웰로 적용하여 정량 PCR을 행하였다.

Wx012-5'/3'프라이머 및 TaqMan 프로브 Wx012-T에 의한 정량 PCR의 결과, NTC에 대해서는 증폭 곡선이 검출되지 않았으며, 19 품종의 소맥 DNA에 대해서는 양호한 증폭 곡선이 검출되었다. 소맥 이외의 12종의 식물 DNA 및 4 품종의 듀럼밀 DNA에 대해서는 증폭이 검출되지 않았다.

〔6〕 검량선의 직선성의 확인

소맥의 DNA를 300 ng/㎕, 150 ng/㎕, 75 ㎕, 30 ㎕, 10 ng/㎕, 4 ng/㎕, 1 ng/㎕, 0.1 ng/㎕로 조정하고, 이들을 표준 주형으로서 정량 PCR을 행하였다. 얻어진 결과로부터, JAS 분석법 핸드북에 따라 검량선을 구하여, 상관 계수를 확인하였다.

얻어진 검량선을 도 8에 도시한다. 1 내지 300 ng/㎕ 및 0.1 내지 75 ng/㎕로 조정한 소맥 DNA를 표준 주형 DNA로서 적용한 결과, 직선성이 높은 검량선을 표시할 수 있었으며, 정량 시험에 이용 가능한 것으로 나타났다.

실시예 4

TaSUT1D 유전자의 검출

TaSUT1D 유전자 중의 sut01 영역(서열 3)에 기재된 염기 서열을 포함하는 sut02 영역(서열 4)을 PCR에 의해 증폭하였다.

프라이머쌍은 상기 WaxyD의 경우와 마찬가지로 설계하여, 5'프라이머인 sut01-5'(서열 12)와 3'프라이머인 sut01-3'(서열 13) 및 5'프라이머인 sut02-5'(서열 14)와 3'프라이머 sut02-3'(서열 15)를 PCR 실험에 이용하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

어떠한 프라이머쌍을 이용한 경우에도, 소맥에 대해서는 예측된 크기의 싱글 밴드(각각 131 bp 및 101 bp)가 검출되었으며, 다른 곡류 및 듀럼밀(게놈 구성 AaBb)에 대해서는 밴드가 검출되지 않았다. 또한, 소맥에 대해서는 복수의 품종에 대하여 동일한 시험을 행하였더니, 모두 예측된 크기의 싱글 밴드가 검출되었다.

또한, 이들의 프라이머쌍을 설계한 영역(Accession NO. AF408845, 3924 내지 4397; 474 bp)이 게놈 A, B 및 D에 각각 1 카피가 있는 것으로 이미 나타났다. 또한, sut01-5'/3' 및 sut02-5'/3'의 증폭 영역 sut01 및 sut02는 정성 PCR의 경우 소맥(게놈 구성 AaBbDd)에 특이적이고 듀럼밀(게놈 구성 AaBb)로부터 검출되지 않았기 때문에, sut01 영역 및 sut02 영역은 게놈 D에만 1 카피 존재할 가능성이 높다는 것이 확인되었다. 이로부터, 프라이머쌍 sut01-5'/3' 또는 sut02-5'/3'를 이용하면, 다른 작물과 교차하지 않고 소맥 내재성 DNA(TaSUT1D 유전자)를 검출할 수 있다는 것이 확인되었다.

실시예 5

CbpIII 유전자의 검출

CbpIII 유전자 중의 CbpIII014 영역(서열 5)을 PCR에 의해 증폭하였다.

프라이머쌍은 상기 WaxyD의 경우와 마찬가지로 설계하여, 5'프라이머 cbp014-5'(서열 16)와 3'프라이머 cbp014-3'(서열 17)를 PCR 실험에 이용하였다. 결과를 도 7에 도시한다. 소맥 샘플(레인 1 내지 4)에서는 예측된 크기의 싱글 밴드(101 bp)가 검출되었으며, 소맥 이외의 레인에서는 밴드가 검출되지 않았다. 이로부터, 프라이머쌍 cbp014-5'/cbp014-3'를 이용하면, 다른 작물과 교차하지 않고 소맥 내재성 DNA(Cbp 유전자)를 검출할 수 있다는 것이 확인되었다.

실시예 6

GSS 서열의 검출

GSS 서열 중의 gss01 영역(서열 6), gss02 영역(서열 30) 및 gss03 영역(서열 31)을 PCR에 의해 증폭하였다.

프라이머쌍은 상기 WaxyD의 경우와 마찬가지로 설계하여, gss01 영역용 프라이머로서 gSS01-5'(서열 18) 및 gss01-03'(서열 19)에 기재된 쌍을, gss02 영역용 프라이머로서 gss02-5'(서열 34) 및 gss02-3'(서열 35)에 기재된 쌍을, gss03 영역용으로서 gss03-5'(서열 36) 및 gss03-3'(서열 37)에 기재된 쌍을 이용하여 PCR을 행하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

모든 프라이머쌍이 소맥에 대하여 예상된 크기의 싱글 밴드를 검출하였다. gss02용 프라이머 및 gss03용 프라이머는 듀럼밀 및 옥수수와 교차성이 관찰되었지만, gss01용 프라이머는 이들과의 교차성이 관찰되지 않았기 때문에, gss01용 프라이머는 소맥 내재성 유전자의 검출에 이용할 수 있다는 것이 확인되었다.

실시예 7

Lr1 서열 중의 Lr101 영역(서열 7), Lr102 영역(서열 32), Lr103 영역(서열 33)을 PCR에 의해 증폭하였다.

프라이머쌍은 상기 WaxyD의 경우와 마찬가지로 설계하여, Lr101 영역용 프라이머로서 서열 20 및 21에 기재된 쌍을, Lr102 영역용 프라이머로서 서열 38 및 39에 기재된 쌍을, Lr103 영역용으로서 서열 40 및 41에 기재된 쌍을 이용하여 PCR을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.

모든 프라이머쌍이 소맥에 대하여 예상된 크기의 싱글 밴드를 검출하였다. Lr102용 프라이머쌍 및 Lr103용 프라이머쌍은 듀럼밀과의 교차성이 관찰되었지만, Lr101용 프라이머는 이들과의 교차성이 관찰되지 않았기 때문에, Lr1O1용 프라이머는 소맥 내재성 유전자의 검출에 이용할 수 있다는 것이 확인되었다.

비교예

(1) CbpIII 유전자의 염기 서열에 기초하여 설계된 5'프라이머 Cbp013-5'(서열 24)/3'프라이머 Cbp013-3'(서열 25)의 프라이머쌍, (2) TthV 유전자(Castagnaro A. et al.: J. mol. Biol. 1992 Apr 20; 224(4): 1003 내지 1009)의 염기 서열에 기초하여 설계된 5'프라이머 TthV011-5'(서열 26)/3'프라이머 TthV011-3'(서열 27)의 프라이머쌍, 또는 (3) 마찬가지로 TthV 유전자의 염기 서열에 기초하여 설계된 5'프라이머 TthV012-5'(서열 28)/3'프라이머 TthV012-3'(서열 29)의 프라이머쌍을 이용하여, PCR에 의해 소맥 내재성 DNA의 검지 실험을 행하였다.

DNA의 추출, PCR 및 전기 영동 등은 상기 실시예에 따라 행하였다.

상기 (1)의 프라이머쌍을 이용한 결과, 소맥에 대해서는 예측된 크기의 싱글 밴드가 검출되었지만, 쌀, 대맥, 옥수수, 호밀, 대맥(미노리보리), 귀리 및 조에서도 밴드가 검출되었으며, 복수의 작물과의 교차성이 관찰되었다. (2)의 결과, 소맥에 대해서는 예측된 크기의 싱글 밴드가 검출되었지만, 대맥과의 교차성이 관찰되었다. (3)의 결과, 소맥에 대해서는 예상된 크기의 싱글 밴드가 검출되었지만, 호밀과 대맥의 일종인 미노리보리와의 교차성이 관찰되었다. 이들의 결과를 하기의 표 5에 나타낸다.

본 발명에 따르면, 식품 소재 및 가공 식품 등의 피검 시료로부터, 다른 작물과 교차하지 않고 소맥 내재성 DNA를 특이적으로 검출 또는 정량할 수 있는 방법 및 상기 방법에 이용하는 PCR용 프라이머쌍이 제공된다. 상기 방법은 소맥 이외의 곡물과 상동성이 낮으며, 게놈 상에서 싱글 카피인 소맥 내재성 DNA 서열의 특이적인 부분 영역을 PCR에 의해 검출 또는 정량한다.

또한, 본 발명에 의해 제공되는 GMO 소맥 검지를 위한 표준 물질을 사용함으로써, 정량 PCR법으로 피검 시료 중의 GMO 소맥의 혼입률을 GMO 계통별로 양호한 정밀도로 구하는 것이 가능해진다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

피검 시료 중의 소맥 내재성 DNA를 PCR에 의해 검출 또는 정량하는 방법이며, 상기 피검 시료 중의 핵산 또는 상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하고, 서열 7에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％ 이상의 연속된 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 영역의 핵산을 증폭하는 공정, 및 상기 증폭된 핵산을 검출 또는 정량하는 공정을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 프라이머쌍이
(i) 서열 20에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 21에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및
(ii) 상기 (i)의 프라이머쌍에서, 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍을 포함하는 프라이머쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머쌍인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프라이머쌍에 포함되는 프라이머가 염기 15개 내지 40개 길이의 핵산인 방법.
피검 시료 중의 소맥을 PCR에 의해 검출 또는 정량하기 위한 프라이머쌍이며, 서열 7에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％ 이상의 연속된 영역을 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머쌍.
제4항에 있어서,
(i) 서열 20에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열 21에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및
(ii) 상기 (i)의 프라이머쌍에서 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍을 포함하는 프라이머쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머쌍.
제4항 또는 제5항에 기재된 프라이머쌍을 포함하는, 피검 시료로부터 PCR에 의해 소맥 내재성 DNA 서열을 검출 또는 정량하기 위한 키트.
유전자 재조합 소맥 및 비유전자 재조합 소맥이 공통으로 갖는 서열 7에 기재된 염기 서열의 적어도 80% 연속된 염기서열을 포함하는 DNA인 내재성 DNA와, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA를 포함하는 환상 DNA.
서열 7에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％ 연속된 염기 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 환상 DNA.
제4항 또는 제5항에 기재된 프라이머쌍을 이용하여 PCR에 의해 증폭 가능한 영역을 포함하는 환상 DNA.
제8항에 있어서, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA를 추가로 포함하는 환상 DNA.
피검 시료에서의 유전자 재조합 소맥의 혼입률을 결정하는 방법이며,
제7항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 기재된 환상 DNA와 피검 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로서 정량 PCR을 행하고,
환상 DNA에 대한 상기 정량 PCR의 결과를 이용하여 주형 DNA의 분자수를 구하기 위한 검량선을 작성하고,
피검 시료에 대한 상기 정량 PCR의 결과와 상기 검량선을 이용하여 상기 피검 시료 중에 포함되는 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수와 1종 이상의 유전자 재조합 소맥에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 구하고,
상기 유전자 재조합 소맥에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 상기 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 A를 구하는 것을 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 비 A와,
유전자 재조합 소맥의 표준 종자로부터 추출한 DNA를 주형으로서 정량 PCR을 행하여 구해지는, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 DNA 서열 부분 영역의 분자수를 소맥 내재성 DNA 서열 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 B를 이용하여 수학식 100×A/B를 계산함으로써 피검 시료 중의 유전자 재조합 소맥의 혼입률을 결정하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 정량 PCR에서 피검 시료 중의 소맥을 PCR에 의해 검출 또는 정량하기 위한 프라이머쌍이며, 서열 7에 기재된 염기 서열의 적어도 80 ％ 이상의 연속된 영역을 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머쌍으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머쌍을 이용하는 방법.