CN113774164A - 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用 - Google Patents

一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113774164A
CN113774164A CN202110989147.8A CN202110989147A CN113774164A CN 113774164 A CN113774164 A CN 113774164A CN 202110989147 A CN202110989147 A CN 202110989147A CN 113774164 A CN113774164 A CN 113774164A
Authority
CN
China
Prior art keywords
melon
virus
endogenous
detected
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110989147.8A
Other languages
English (en)
Inventor
赵立群
邱艳红
徐秀兰
田文
张海军
张晓飞
刘慧�
温常龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Original Assignee
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences filed Critical Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority to CN202110989147.8A priority Critical patent/CN113774164A/zh
Publication of CN113774164A publication Critical patent/CN113774164A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于扩增甜瓜内源病毒基因组片段的引物对，包括第一引物和第二引物；第一引物的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；第二引物的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了包括前述引物对的试剂与试剂盒及其应用。本发明还公开了使用前述引物对检测待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法以及检测待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法。前述引物对检测甜瓜内源病毒的敏感性高，特异性好。

Description

一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用
技术领域
本发明属于植物病毒技术领域，涉及生物检测技术，具体涉及基于一步法RT-PCR技术检测甜瓜内源病毒的引物对、RT-PCR试剂、RT-PCR试剂盒及其应用和方法。
背景技术
甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus，CmEV)是甜瓜上新发生的病毒病害。
近年来，甜瓜内源病毒在英国、美国、厄瓜多尔、韩国和巴西均有报道。2020年，甜瓜内源病毒在我国上海被首次报道，病毒序列与韩国发现的甜瓜内源病毒SJ1株系序列相似度高达98.31％。而且，我国发现的甜瓜内源病毒被证实可以通过种子进行传播。有研究表明内源RNA病毒可以在植株中存在上百世代。另外，甜瓜内源病毒可在甜瓜、丝瓜等多个葫芦科作物中被检出，表明该病毒寄主非常广泛。因而有必要建立该病毒的灵敏、快速精准的检测技术,以检测重要瓜类种子、种苗是否带毒，以防控该病毒随种子、种苗远距离传播扩散。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何检测甜瓜内源病毒、或如何检测待测植物样本是否感染甜瓜内源病毒。为了解决上述技术问题，本发明依据病毒编码区设计特异性引物，可快速、精准、灵敏检测该病毒。
本发明第一方面提供了一种用于扩增甜瓜内源病毒基因组片段的引物对，所述引物对包括第一引物和第二引物。
本发明第二方面提供了一种用于扩增甜瓜内源病毒基因组片段的试剂，所述试剂包括本发明第一方面所述的引物对。
在一些实施方式中，所述第一引物与所述第二引物的摩尔比为1:1。
在一些实施方式中，所述试剂还包括反转录酶和/或DNA聚合酶。
在一些实施方式中，所述试剂还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品可以为感染甜瓜内源病毒的植物叶片，也可以为甜瓜内源病毒本身，还可以是人工合成的如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。
本发明第三方面提供了一种用于扩增甜瓜内源病毒基因组片段的试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的试剂。
本发明第四方面提供了本发明第一方面所述的引物对、本发明第二方面所述的试剂或本发明第三方面所述的试剂盒在如下a1或a2中的应用：
a1、检测甜瓜内源病毒；
a2、制备检测甜瓜内源病毒的制剂；
在一些实施方式中，a1是指：
检测待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒；或
检测待测病毒是否为甜瓜内源病毒；
在一些实施方式中，a2是指：
制备检测待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的制剂；或
制备检测待测病毒是否为甜瓜内源病毒的制剂。
本发明第五方面提供了一种检测待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法，所述方法包括：
b1、采用本发明第一方面所述的引物对对所述待测植物材料的核酸进行PCR扩增；
b2、根据所述扩增的产物确定所述待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒。
在一些实施方式中，所述待测植物材料为甜瓜叶片或甜瓜种子。
在一些实施方式中，所述待测植物材料的核酸为所述待测植物材料的总RNA。
在一些实施方式中，所述PCR扩增为RT-PCR扩增。
在一些实施方式中，所述确定的步骤为：表征所述PCR扩增产物中的DNA片段，当所述PCR扩增产物中没有755bp的DNA片段时，判定所述待测植物材料中没有感染所述甜瓜内源病毒；当所述PCR扩增产物中含有755bp的DNA片段时，判定所述待测植物材料中感染了所述甜瓜内源病毒。
在一些实施方式中，所述表征是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的。
在一些实施方式中，所述PCR扩增采用的温度程序为：
(1)50℃反应30min；
(2)94℃反应2min；
(3)循环反应；
(4)72℃反应10min；
所述循环反应步骤为：94℃反应30s；56-58℃反应30s；72℃反应35s，循环30次。
本发明第六方面提供了一种检测待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法，所述方法包括：
c1、采用本发明第一方面所述的引物对对所述待测病毒样本的核酸进行PCR扩增；
c2、根据所述扩增的产物判断所述待测病毒是否为甜瓜内源病毒。
在一些实施方式中，所述待测病毒样本的核酸为所述待测病毒样本的总RNA。
在一些实施方式中，所述PCR扩增为RT-PCR扩增。
在一些实施方式中，所述确定的步骤为：表征所述扩增产物中的DNA片段，当所述扩增产物中没有755bp的DNA片段时，判定所述待测病毒样本不是所述甜瓜内源病毒；当所述扩增产物中含有755bp的DNA片段时，判定所述待测病毒样本是所述甜瓜内源病毒。
在一些实施方式中，所述表征是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的。
在一些实施方式中，所述PCR扩增采用的温度程序为：
(1)50℃反应30min；
(2)94℃反应2min；
(3)循环反应；
(4)72℃反应10min；
所述循环反应步骤为：94℃反应30s；55-56℃反应30s；72℃反应35s，循环30次。
本发明提供的用于检测甜瓜内源病毒的引物对，该引物对由引物CmEV-755-F(即第一引物)和引物CmEV-755-R(即第二引物)组成。该引物对能够特异性扩增CmEV，扩增片段长度为755bp，而不能扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、西瓜潜隐病毒(citrullus lanatuscryptic virus，CiLCV)、辣椒内源病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus，SqMV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)。以上任一所述待测植物材料具体可为甜瓜材料，更具体可为叶片、种子。由此可鉴定出甜瓜种子、种苗或植株上是否携带该病毒病害，具有广阔的应用前景。本发明提供的引物对具有特异性好、准确度和灵敏度高的优点，而本发明的检测方法具有操作简单方便和检测效率高等优点，能满足种子、种苗生产者和使用者，育苗场以及甜瓜田间检测的基本需求。
附图说明
图1示出了实施例3实验组的特异性试验的结果，泳道1对应检测含有甜瓜内源病毒的阳性对照甜瓜样品的扩增产物；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有辣椒内源病毒的辣椒样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道9对应检测健康的甜瓜样品的扩增产物；泳道M为DNA DL2000Marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。
图2示出了实施例3对照组1的特异性试验的结果，泳道1对应检测含有甜瓜内源病毒的阳性对照甜瓜样品的扩增产物；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有辣椒内源病毒的辣椒样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道9对应检测健康的甜瓜样品的扩增产物；泳道M为DNA DL2000Marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。
图3示出了实施例3对照组2的特异性试验的结果，泳道1对应检测含有甜瓜内源病毒的阳性对照甜瓜样品的扩增产物；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有辣椒内源病毒的辣椒样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道9对应检测健康的甜瓜样品的扩增产物；泳道M为DNA DL2000Marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。
图4示出了实施例3对照组3的特异性试验的结果，泳道1对应检测含有甜瓜内源病毒的阳性对照甜瓜样品的扩增产物；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有辣椒内源病毒的辣椒样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道9对应检测健康的甜瓜样品的扩增产物；泳道M为DNA DL2000Marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。
图5示出了实施例4的灵敏度试验的结果，泳道1对应检测RNA溶液1的扩增产物；泳道2对应检测RNA溶液2的扩增产物；泳道3对应检测RNA溶液3的扩增产物；泳道4对应检测RNA溶液4的扩增产物；泳道5对应检测RNA溶液5的扩增产物；泳道6对应检测RNA溶液6的扩增产物；泳道7对应检测RNA溶液7的扩增产物；泳道8对应检测RNA溶液8的扩增产物；泳道9对应空白对照，泳道M对应DNA DL2000Marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。
图6为实施例5的准确性试验的结果，其中泳道1-6用本发明引物对对待测样品中的甜瓜内源病毒进行检测。其中，泳道1、2对应检测含有甜瓜内源病毒的阳性对照山东甜瓜样品的扩增产物；泳道3、4对应检测含有甜瓜内源病毒的海南甜瓜待检测样品的扩增产物；泳道5和6对应检测不含有甜瓜内源病毒的甜瓜待检测样品的扩增产物；泳道M对应DNADL2000Marker，从上至下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进或应用的基础，并不以任何方式构成对本发明的具体限制。
下述实施例中的实验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
下述实施例中的黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、西瓜潜隐病毒(citrullus lanatuscryptic virus，CiLCV)、辣椒内源病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus，SqMV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)均为本领域常规生物材料。
实施例1：引物的设计与合成
基于GenBank登录号为KT727022的甜瓜内源病毒基因组，经过大量序列分析、序列设计、人工筛选优化、效果验证，针对病毒编码区域，获得了用于鉴定甜瓜内源病毒polyprotein gene的特异引物对。特异引物对由CMEV-755-F和CMEV-755-R组成，扩增polyprotein gene的623位-1377位。引物序列如下：
CmEV-755-F：5'-CGTGGAAATTGCACTTCCGAGAT-3'(SEQ ID NO.1)；
CmEV-755-R：5'-CTAGCAACTTGTTTGCTGGCACACG-3'(SEQ ID NO.2)；
其中，CmEV-755-F为正向引物，CmEV-755-R为反向引物。
上述特异引物对的理论扩增产物大小为755bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所示，对应的RNA序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
5'-CGTGGAAATTGCACTTCCGAGATGTTAGAGGTTTTAAACAAACTTGTGGCTAAATTTGGAGAATATGAGGCTTATTATAACGTTTATTTAGAAACTCAACATAGACATTTCGGATACCTACAGAAAGAAGACAATGGGAAGTACTCCTTCATCAATGCAAAATTCAATCCACTCAAGAAGTGCTCAGTGTGTAAGTACATGAACCATTATGAGGAGATGATAAGGGGTCTTAGGATGGTCCATTACAGTTTAAAACATTACAGACCAAAATCGAAGGTAGTGACTGATGAATTCTTAACCACATATAATGTGGGAGATGTAATAGAGGATGTCCCTTGGCGTTGTGGATACTGTTTTTCAGATTTAAATTTGCAAGTGTTTATGCGAGAGGATAGATTACAAGAATTAATCCAGATTGTCACTCAGCATTTGTTTGTGCTTATGGGAGACATAGAGCAACTTCTAAAGATGGGTTATGGAGACCTATATGATGATATGGACGTGGCTAGCAAAGAAAAATTAAAATCAGCTGATCAAGTGATCGTTAACGAGTATTTTTACCATTTGCAACGCAAAATAATACCAGTGGGGCGCGATTTTGATGCTGCACAGAGTAAGACTATTACAGAAGTATTGGGTGGTTGTTTCTTTAAGCCACAAAGCAAATTAAATAGTGTGAAACCCGAATTTATAGCTGAACTATCAACTTTAACTGAACTAATTGAAAAATCGTGTGCCAGCAAACAAGTTGCTAG-3'(SEQ ID NO.3)。
5'-CGUGGAAAUUGCACUUCCGAGAUGUUAGAGGUUUUAAACAAACUUGUGGCUAAAUUUGGAGAAUAUGAGGCUUAUUAUAACGUUUAUUUAGAAACUCAACAUAGACAUUUCGGAUACCUACAGAAAGAAGACAAUGGGAAGUACUCCUUCAUCAAUGCAAAAUUCAAUCCACUCAAGAAGUGCUCAGUGUGUAAGUACAUGAACCAUUAUGAGGAGAUGAUAAGGGGUCUUAGGAUGGUCCAUUACAGUUUAAAACAUUACAGACCAAAAUCGAAGGUAGUGACUGAUGAAUUCUUAACCACAUAUAAUGUGGGAGAUGUAAUAGAGGAUGUCCCUUGGCGUUGUGGAUACUGUUUUUCAGAUUUAAAUUUGCAAGUGUUUAUGCGAGAGGAUAGAUUACAAGAAUUAAUCCAGAUUGUCACUCAGCAUUUGUUUGUGCUUAUGGGAGACAUAGAGCAACUUCUAAAGAUGGGUUAUGGAGACCUAUAUGAUGAUAUGGACGUGGCUAGCAAAGAAAAAUUAAAAUCAGCUGAUCAAGUGAUCGUUAACGAGUAUUUUUACCAUUUGCAACGCAAAAUAAUACCAGUGGGGCGCGAUUUUGAUGCUGCACAGAGUAAGACUAUUACAGAAGUAUUGGGUGGUUGUUUCUUUAAGCCACAAAGCAAAUUAAAUAGUGUGAAACCCGAAUUUAUAGCUGAACUAUCAACUUUAACUGAACUAAUUGAAAAAUCGUGUGCCAGCAAACAAGUUGCUAG-3'(SEQ ID NO.4)。
针对甜瓜内源病毒polyprotein gene设计对照引物对CmEV-C1-F和CmEV-C1-R，预期扩增产物长度为413bp，具体序列如下：
CmEV-C1-F：5'-GGTGGAATATGGGTTGATGCTAG-3'(SEQ ID NO.5)
CmEV-C1-R：5'-CGTCGTGATGGACATCAACTCTAC-3'(SEQ ID NO.6)
针对甜瓜内源病毒polyprotein gene设计对照引物对CmEV-C2-F和CmEV-C2-R，预期扩增产物长度为710bp，具体序列如下：
CmEV-C2-F：5'-GAGGTGAACACAGCACTTGTTG-3'(SEQ ID NO.7)
CmEV-C2-R：5'-CCAGAGAATAATGGACAGCCAC-3'(SEQ ID NO.8)
针对甜瓜内源病毒polyprotein gene设计对照引物对CmEV-C3-F和CmEV-C3-R，预期扩增产物长度为381bp，具体序列如下：
CmEV-C3-F：5'-AAGSGAGAATWATHGTRTGGCA-3'(SEQ ID NO.9)
CmEV-C3-R：5'-CTAGWGCKGTBGTAGCTTGWCC-3'(SEQ ID NO.10)
其中，S代表：g或c，，W代表：a或t/u，H代表：a或c或t/u，R代表：g或a，K代表：g或t/u，B代表：g或c或t/u。
实施例2：鉴定方法的建立
一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法
1、用TRIZOL法或其他可用于提取病毒RNA的试剂盒按照说明提取待测样品的总RNA。
2、以步骤1中提取的总RNA为模板，采用实施例1设计的引物对利用一步法RT-PCR进行扩增。
反应体系如下(25μl)：引物CmEV-755-F 0.5μl(10μmol/L)、引物CmEV-755-R 0.5μl(10μmol/L)、PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl、2x 1step Buffer(Dye Plus)12.5μl、模板1μL(即步骤1提取的总RNA,浓度100ng-200ng/μL)、余量用无RNase的水补足25μl。其中，PrimeScript 1Step Enzyme Mix和2x 1step Buffer(Dye Plus)来源于Takara公司的PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)，货号RR057A。
反应条件如下：
1.50℃反应30min；
2.94℃反应2min；
3.94℃反应30s；
4.55℃反应30s；
5.72℃反应35s；
6.72℃反应5min
其中从步骤3-5反应30个循环。
3、取步骤2的产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。并以甜瓜内源病毒作为阳性对照样品。
若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有755bp的DNA片段，则结果为阳性，待测病毒样品中含有甜瓜内源病毒。
若阳性对照样品的扩增产物含有755bp的DNA片段，而检测样品的扩增产物不含有755bp的DNA片段，则结果为阴性，待测病毒样品中不含甜瓜内源病毒。
若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。
二、鉴定待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法
1、用TRIZOL法或其他可用于提取植物RNA的试剂盒按照说明提取待测植物的总RNA，样品可为叶片或种子等待测的植物组织。
2、同“一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法”的步骤2。
3、同“一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法”的步骤3。
若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有755bp的DNA片段，则结果为阳性，待测植物材料已感染甜瓜内源病毒。
若阳性对照样品的扩增产物含有755bp的DNA片段，而检测样品的扩增产物不含有755bp的DNA片段，则结果为阴性，待测植物材料未感染甜瓜内源病毒。
若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。
实施例3：特异性实验
待测病毒如下：
甜瓜内源病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒、西瓜潜隐病毒、辣椒内源病毒、南瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒。
实验组：已经确定分别感染了上述病毒的植物的检测样品，按照实施例2的“二、鉴定待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法”进行检测。
结果见图1。图1中，泳道1对应检测含有甜瓜内源病毒的阳性对照甜瓜样品的扩增产物；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有辣椒内源病毒的辣椒样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道9对应检测健康的甜瓜样品的扩增产物；泳道M对应DNA DL2000 Marker。除泳道1对应的甜瓜内源病毒的阳性对照样品的扩增产物含有755bp的DNA片段外，其它待检测样品均无特异性扩增条带，表明本发明建立的甜瓜内源病毒RT-PCR检测方法具有良好的特异性。
对照组1：与实验组的差别在于，将引物替换成CmEV-C1-F和CmEV-C1-R，结果见图2。图2中显示了一些非特异性扩增条带，说明这对引物的特异性不好。
对照组2：与实验组的差别在于，将引物替换成CmEV-C2-F和CmEV-C2-R，结果见图3。图3中显示了一些不同程度的非特异性扩增条带，说明这对引物的特异性不好。针对黄瓜花叶病毒的西瓜样品也有可见扩增条带。
对照组3：与实验组的差别在于，将引物替换成CmEV-C3-F和CmEV-C3-R，结果见图4。图4中显示了一些不同程度的非特异性扩增条带，说明这对引物的特异性不好。针对健康的甜瓜样品之外的其他样品有不同程度的扩增条带，而针对含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品有三条肉眼可见条带，特异性较差。
实施例4：灵敏度试验
待测病毒如下：甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus，CmEV)。
1、利用TRIZOL法提取确定含有甜瓜内源病毒的甜瓜叶片总RNA。
2、取步骤1得到的总RNA，用无菌水进行十倍梯度稀释，分别得到如下RNA溶液：RNA浓度为200ng/μl的RNA溶液1，RNA浓度为20ng/μl的RNA溶液2，RNA浓度为2ng/μl的RNA溶液3，RNA浓度为2×10-1ng/μl的RNA溶液4，RNA浓度为2×10-2ng/μl的RNA溶液5，RNA浓度为2×10-3ng/μl的RNA溶液6，RNA浓度为2×10-4ng/μl的RNA溶液7，RNA浓度为2×10-5ng/μl的RNA溶液8。
3、以步骤2得到的RNA溶液为模板，每个反应体系中上述RNA溶液的用量均为1μl，采用实施例1设计的引物对进行一步法RT-PCR扩增。
反应体系和反应条件参考实施例2的“一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法”的步骤2，以无菌水作为空白对照。
4、取步骤3的扩增产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
结果见图5。图5中，泳道1对应RNA溶液1、泳道2对应RNA溶液2，泳道3对应RNA溶液3，泳道4对应RNA溶液4，泳道5对应RNA溶液5，泳道6对应RNA溶液6，泳道7对应RNA溶液7，泳道8对应RNA溶液8，泳道9对应空白对照(无菌水)，泳道M对应DNA DL2000Marker。结果表明，模板中病毒RNA浓度为2ng/μl或更高(泳道3)时检测结果均为阳性。表明本发明建立的甜瓜内源病毒PCR检测方法具有良好的灵敏性。
实施例5：检测待测植物样本
1、甜瓜样本
取若干具有甜瓜内源病毒病发病症状的甜瓜叶片和不含有甜瓜内源病毒的甜瓜叶片，作为待测植物材料。各个待测植物材料取自不同甜瓜植株。
取待测植物材料，利用TRIZOL法提取待测甜瓜叶片总RNA，然后按照实施例2的“二、鉴定待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法”进行检测。
结果见图6。图6中，泳道1、2、3和4示出了采用本发明引物检测待测植物甜瓜中是否感染甜瓜内源病毒的检测结果；泳道5和6示出了不含有甜瓜内源病毒的对照样品检测结果；泳道M对应DNA DL2000Marker；另将泳道1、2、3和4对应的四份样品的扩增产物分别用Sanger法测序，其核苷酸序列均与前述SEQ ID No.3完全相同，且Blast分析后为甜瓜内源病毒。结果表明本发明建立的甜瓜内源病毒RT-PCR检测方法能够有效地从甜瓜样品中鉴定出甜瓜内源病毒。
以上结果表明，各个含有甜瓜内源病毒的待测植物材料均检测出含有甜瓜内源病毒，本发明提供的方法的准确性为100％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用
<130> C1CNCN210094
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtggaaatt gcacttccga gat 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagcaactt gtttgctggc acacg 25
<210> 3
<211> 755
<212> DNA
<213> 甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus)
<400> 3
cgtggaaatt gcacttccga gatgttagag gttttaaaca aacttgtggc taaatttgga 60
gaatatgagg cttattataa cgtttattta gaaactcaac atagacattt cggataccta 120
cagaaagaag acaatgggaa gtactccttc atcaatgcaa aattcaatcc actcaagaag 180
tgctcagtgt gtaagtacat gaaccattat gaggagatga taaggggtct taggatggtc 240
cattacagtt taaaacatta cagaccaaaa tcgaaggtag tgactgatga attcttaacc 300
acatataatg tgggagatgt aatagaggat gtcccttggc gttgtggata ctgtttttca 360
gatttaaatt tgcaagtgtt tatgcgagag gatagattac aagaattaat ccagattgtc 420
actcagcatt tgtttgtgct tatgggagac atagagcaac ttctaaagat gggttatgga 480
gacctatatg atgatatgga cgtggctagc aaagaaaaat taaaatcagc tgatcaagtg 540
atcgttaacg agtattttta ccatttgcaa cgcaaaataa taccagtggg gcgcgatttt 600
gatgctgcac agagtaagac tattacagaa gtattgggtg gttgtttctt taagccacaa 660
agcaaattaa atagtgtgaa acccgaattt atagctgaac tatcaacttt aactgaacta 720
attgaaaaat cgtgtgccag caaacaagtt gctag 755
<210> 4
<211> 755
<212> RNA
<213> 甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus)
<400> 4
cguggaaauu gcacuuccga gauguuagag guuuuaaaca aacuuguggc uaaauuugga 60
gaauaugagg cuuauuauaa cguuuauuua gaaacucaac auagacauuu cggauaccua 120
cagaaagaag acaaugggaa guacuccuuc aucaaugcaa aauucaaucc acucaagaag 180
ugcucagugu guaaguacau gaaccauuau gaggagauga uaaggggucu uaggaugguc 240
cauuacaguu uaaaacauua cagaccaaaa ucgaagguag ugacugauga auucuuaacc 300
acauauaaug ugggagaugu aauagaggau gucccuuggc guuguggaua cuguuuuuca 360
gauuuaaauu ugcaaguguu uaugcgagag gauagauuac aagaauuaau ccagauuguc 420
acucagcauu uguuugugcu uaugggagac auagagcaac uucuaaagau ggguuaugga 480
gaccuauaug augauaugga cguggcuagc aaagaaaaau uaaaaucagc ugaucaagug 540
aucguuaacg aguauuuuua ccauuugcaa cgcaaaauaa uaccaguggg gcgcgauuuu 600
gaugcugcac agaguaagac uauuacagaa guauugggug guuguuucuu uaagccacaa 660
agcaaauuaa auagugugaa acccgaauuu auagcugaac uaucaacuuu aacugaacua 720
auugaaaaau cgugugccag caaacaaguu gcuag 755
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggaatat gggttgatgc tag 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtcgtgatg gacatcaact ctac 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggtgaaca cagcacttgt tg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccagagaata atggacagcc ac 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagsgagaat wathgtrtgg ca 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctagwgckgt bgtagcttgw cc 22

Claims (10)

1.一种用于扩增甜瓜内源病毒基因组片段的引物对，所述引物对包括第一引物和第二引物；
所述第一引物的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二引物的核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种用于扩增甜瓜内源病毒基因组片段的试剂，所述试剂包括权利要求1所述的引物对。
3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述第一引物与所述第二引物的摩尔比为1:1；
优选地，所述试剂还包括反转录酶和/或DNA聚合酶；
优选地，所述试剂还包括阳性对照样品。
4.一种用于扩增甜瓜内源病毒基因组片段的试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂。
5.权利要求1所述的引物对、权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在如下a1或a2中的应用：
a1、检测甜瓜内源病毒；
a2、制备检测甜瓜内源病毒的制剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，a1是指：
检测待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒；或
检测待测病毒是否为甜瓜内源病毒；
优选地，a2是指：
制备检测待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的制剂；或
制备检测待测病毒是否为甜瓜内源病毒的制剂。
7.一种检测待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法，所述方法包括：
b1、采用权利要求1所述的引物对对所述待测植物材料的核酸进行PCR扩增；
b2、根据所述扩增的产物确定所述待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测植物材料为甜瓜叶片或甜瓜种子；
优选地，所述待测植物材料的核酸为所述待测植物材料的总RNA；
优选地，所述PCR扩增为RT-PCR扩增；
优选地，所述确定的步骤为：表征所述PCR扩增产物中的DNA片段，当所述PCR扩增产物中没有755bp的DNA片段时，判定所述待测植物材料中没有感染所述甜瓜内源病毒；当所述PCR扩增产物中含有755bp的DNA片段时，判定所述待测植物材料中感染了所述甜瓜内源病毒；
优选地，所述表征是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的；
优选地，所述PCR扩增采用的温度程序为：
(1)50℃反应30min；
(2)94℃反应2min；
(3)循环反应；
(4)72℃反应10min；
所述循环反应步骤为：94℃反应30s；55-56℃反应30s；72℃反应35s，循环30次。
9.一种检测待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法，所述方法包括：
c1、采用权利要求1所述的引物对对所述待测病毒样本的核酸进行PCR扩增；
c2、根据所述扩增的产物判断所述待测病毒是否为甜瓜内源病毒。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测病毒样本的核酸为所述待测病毒样本的总RNA；
优选地，所述PCR扩增为RT-PCR扩增；
优选地，所述确定的步骤为：表征所述扩增产物中的DNA片段，当所述扩增产物中没有755bp的DNA片段时，判定所述待测病毒样本不是所述甜瓜内源病毒；当所述扩增产物中含有755bp的DNA片段时，判定所述待测病毒样本是所述甜瓜内源病毒；
优选地，所述表征是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的；
优选地，所述PCR扩增采用的温度程序为：
(1)50℃反应30min；
(2)94℃反应2min；
(3)循环反应；
(4)72℃反应10min；
所述循环反应步骤为：94℃反应30s；55-56℃反应30s；72℃反应35s，循环30次。
CN202110989147.8A 2021-08-26 2021-08-26 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用 Pending CN113774164A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110989147.8A CN113774164A (zh) 2021-08-26 2021-08-26 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110989147.8A CN113774164A (zh) 2021-08-26 2021-08-26 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113774164A true CN113774164A (zh) 2021-12-10

Family

ID=78839563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110989147.8A Pending CN113774164A (zh) 2021-08-26 2021-08-26 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113774164A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9606906D0 (en) * 1996-04-02 1996-06-05 Zeneca Ltd Ripening-related dna from melon
WO2005097989A1 (ja) * 2004-04-09 2005-10-20 Nisshin Seifun Group Inc. コムギ内在性ｄｎａ配列の検出・定量方法
CN104630215A (zh) * 2015-01-23 2015-05-20 北京市农林科学院 与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁系列分子标记及获取方法
CN105331743A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 新疆农业科学院植物保护研究所 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法
CN113005224A (zh) * 2021-01-19 2021-06-22 北京市农业技术推广站 一种用于扩增西瓜潜隐病毒的引物对及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9606906D0 (en) * 1996-04-02 1996-06-05 Zeneca Ltd Ripening-related dna from melon
WO2005097989A1 (ja) * 2004-04-09 2005-10-20 Nisshin Seifun Group Inc. コムギ内在性ｄｎａ配列の検出・定量方法
CN104630215A (zh) * 2015-01-23 2015-05-20 北京市农林科学院 与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁系列分子标记及获取方法
CN105331743A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 新疆农业科学院植物保护研究所 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法
CN113005224A (zh) * 2021-01-19 2021-06-22 北京市农业技术推广站 一种用于扩增西瓜潜隐病毒的引物对及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTONIO CHARLYS DA COSTA等: "Discovery of Cucumis melo endornavirus by deep sequencing of human stool samples in Brazil", VIRUS GENES, vol. 55, pages 332 - 338, XP036792886, DOI: 10.1007/s11262-019-01648-0 *
RONG ZENG等: "First report of Cucumis melo endornavirus on Cucumis melo in China", JOURNAL OF PLANT PATHOLOGY, vol. 102, pages 1355 *
SEAD SABANADZOVIC等: "Cucumis melo endornavirus: Genome organization, host range andco-divergence with the host", VIRUS RESEARCH, vol. 214, pages 49 - 58, XP029422991, DOI: 10.1016/j.virusres.2016.01.001 *
赵立群等: "甜瓜内源病毒CmEV的TaqMan RT-qPCR检测方法研究", 园艺学报, vol. 49, pages 2471 - 2478 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Rapid detection of tobacco mosaic virus using the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method
Luigi et al. Development of quantitative real-time RT-PCR for the detection and quantification of Peach latent mosaic viroid
CN108728581B (zh) 同时检测5种甘蔗病毒的多重rt-pcr方法及其引物和试剂盒
CN113005224B (zh) 一种用于扩增西瓜潜隐病毒的引物对及其应用
CN110628944A (zh) 鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒
CN108411041B (zh) 一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及应用
CN107190103B (zh) 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法
CN109234449A (zh) 一种黑麦通用2rl染色体特异共显性kasp分子标记及其应用
CN112626275A (zh) 基于一步法rt-pcr技术检测或辅助检测南方番茄病毒的引物对和方法
CN102888398A (zh) 转基因水稻品系Bar68-1的外源插入片段的旁侧序列及其应用
Kuan et al. Use of Reverse Transcription Loop‐Mediated Isothermal Amplification for the Detection of Z ucchini yellow mosaic virus
CN113774164A (zh) 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用
CN106521028B (zh) 一种用于同步检测4种虫传病毒的多重rt－pcr方法
KR102240776B1 (ko) 신종 및 변종 고구마 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법
CN112760319B (zh) 高大山羊草2Sl染色体特异分子标记的开发及其应用
KR101314168B1 (ko) 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법
Shaffer et al. First report of amazon lily mild mottle virus in peony in the United States
CN108018377B (zh) 一种罗湖病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及方法
CN114214448A (zh) 用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph30的SNP标记及其应用
Kim et al. Development and preliminary application of a reverse-transcription droplet digital PCR assay for detection and quantification of apple stem pitting virus in vitro propagated apple plantlets
Azimi et al. Genetic and Antigenic Evaluation of Foot-and-mouth Disease Virus Type A in the Endemic Area of Iran within 2014-2015
KR101088775B1 (ko) 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
CN108950015A (zh) 鉴别福寿螺杂交型的多重pcr检测试剂盒及其检测方法
Chao et al. Development and application of SCAR markers for discriminating cytoplasmic male sterile lines from their cognate maintainer lines in indica rice
KR101750837B1 (ko) MNSV, SqMV, WMV, 및 CABYV 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211210

RJ01 Rejection of invention patent application after publication