CN105331743A - 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法，它涉及一种快速检测甜瓜病毒病的试剂盒及其快速检测方法。它解决了现有甜瓜病毒病多重RT-PCR检测技术可同时检测的甜瓜病毒病种类少的问题。一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物。快速检测方法：一、提取被感染病毒叶片的总RNA；二、反转录成cDNA；三、用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR。本发明通过一次PCR可以同时检测出多达7种的甜瓜病毒病，可在田间采集、鉴定甜瓜病毒病种类，具有鉴定过程简单、步骤少、设备要求低、费用少、时间短和精确性高等优点。

Description

一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测甜瓜病毒病的试剂盒及其快速检测方法。
背景技术
甜瓜病毒病一直是限制甜瓜生产的主要因素，目前国内外没有一种有效的方法可以防治甜瓜病毒病。病毒病在瓜产区复合感病的情况比较普遍。目前检测甜瓜病毒病病毒种类的方法有双抗体夹心法(DAS-ELISA)和硝酸纤维素膜法(NCM-ELISA)法、血清抗原检测等方法；但这些方法操作复杂、费用高、需要时间较长。
多重RT-PCR技术可同时检测几种致病菌，大大缩短了检验时间和流程，节省了供试材料，尤其适合一些难分离，难获取的种质材料或病源分离物的快速检测。但是，由于多重RT-PCR体系中存在多对引物，因此各引物对必须保持高度的特异性(以避免非特异性的扩增)；而且各对引物所扩增出的目的片段的大小差异性要大，可以通过电泳或其他方法区分(避免条带重叠或误判)；还要避免所用引物间的相互作用；各引物对须保持相对一致的扩增效率等要求。并且，不同长度的模板核酸片段、不同引物对所要求的退火温度也不一样。加之其他限制因素，多重RT-PCR技术难以在甜瓜病毒病的实际检测中有优异的表现，可同时检测的甜瓜病毒病种类极少。引物对越多扩增难度就越大，因此，目前所知植物病毒多重RT-PCR检测技术最多只能一次同时检测5种。
发明内容
本发明是为了解决现有甜瓜病毒病多重RT-PCR检测技术可同时检测的甜瓜病毒病种类少的问题，而提供的一种一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法。
一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物；
用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1F的核苷酸序列为5’-GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3’，下游引物WMV1R的核苷酸序列为5’-GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3’；
用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核苷酸序列为5’-GACAGTTGGGAATCGGA-3’，下游引物CMV1R的核苷酸序列为5’-AACAGGGAGCAAGAGGA-3’；
用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5’-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3’，下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5’-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3’；
用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5’-GGATGCCTTTGGCTATTGG-3’，下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5’-GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3’；
用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核苷酸序列为5’-TTTTGGAGGAATGAGTTT-3’，下游引物TMV-R的核苷酸序列为5’-AGGGAAAAACACTATGC-3’；
用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5’-CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3’，下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5’-TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3’；
用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核苷酸序列为5’-TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3’，下游引物MYSVR的核苷酸序列为5’-GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3’。
用上述一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒快速检测的方法：
一、提取被感染病毒叶片的总RNA；
二、反转录成cDNA；
三、用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR，即可确定叶片是否感染了西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒，以及病毒类型；
步骤三中7对RT-PCR引物为用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1F的核苷酸序列为5’-GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3’，下游引物WMV1R的核苷酸序列为5’-GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3’；
用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核苷酸序列为5’-GACAGTTGGGAATCGGA-3’，下游引物CMV1R的核苷酸序列为5’-AACAGGGAGCAAGAGGA-3’；
用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5’-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3’，下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5’-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3’；
用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5’-GGATGCCTTTGGCTATTGG-3’，下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5’-GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3’；
用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核苷酸序列为5’-TTTTGGAGGAATGAGTTT-3’，下游引物TMV-R的核苷酸序列为5’-AGGGAAAAACACTATGC-3’；
用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5’-CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3’，下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5’-TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3’；
用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核苷酸序列为5’-TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3’，下游引物MYSVR的核苷酸序列为5’-GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3’；
步骤三多重RT-PCR扩增体系为25μL，包括2μL的模板cDNA、2μL的引物对、浓度为1.0mmol/L的dNTPs、酶活为1U的TaqDNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+；
步骤三多重RT-PCR反应程序为94℃预变性4min，94℃变性40s、50℃退火复性35s、72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7min。
西瓜花叶病毒病(WMV)、黄瓜花叶病毒病Cucumbermosaicviroid(CMV)、小西葫芦黄花叶病毒病(ZYMV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、烟草花叶病毒病(TMV)、番木瓜环斑病毒(PRSV)和甜瓜黄斑病毒(MYSV)是甜瓜病毒病中常见的种类，而且在我国感染、发病率高。
本发明一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒针对西瓜花叶病毒病(WMV)、黄瓜花叶病毒病Cucumbermosaicviroid(CMV)、小西葫芦黄花叶病毒病(ZYMV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、烟草花叶病毒病(TMV)、番木瓜环斑病毒(PRSV)和甜瓜黄斑病毒(MYSV)设计了7对特异性引物。扩增西瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为1149bp，扩增黄瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为980bp，扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为789bp，扩增南瓜花叶病毒的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为604bp，扩增烟草花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为397bp，扩增番木瓜环斑病毒的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为300bp，扩增甜瓜黄斑病毒的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为250bp。7对特异性引物扩增出的核苷酸片段长度迥异，长度相近片段的最小差异为50bp，在凝胶电泳的过程中可以清楚地区分扩增到的核苷酸条带。
本发明通过一次PCR可以同时检测出多达7种的甜瓜病毒病，可在田间采集、鉴定甜瓜病毒病种类，具有鉴定过程简单、步骤少、设备要求低、费用少、时间短和精确性高等优点。
本发明检测方法在甜瓜产区复合感染病毒的检测中及甜瓜病毒病的发生规律研究中，具有节省时间、降低成本、灵明度高，简便与效率高的优点。
附图说明
图1是实施例1检测结果凝胶电泳图，图中泳道中A标样为健康植株，图中泳道CK中标样为阴性对照，图中泳道1～4中标样均为被7种甜瓜病毒病侵染的植株。
图2是实施例2检测结果凝胶电泳图，图中泳道中A标样为健康植株，图中泳道1～7中标样依次为被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒侵染的植株。
图3是实施例3检测结果凝胶电泳图。
图4是实施例4检测结果凝胶电泳图，图中泳道1～7中标样多重RT-PCR扩增体系中模板cDNA的体积依此为0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL、1.75μL和2μL。
图5是实施例5检测结果凝胶电泳图，图中泳道1～7中标样多重RT-PCR扩增体系中Mg2+的浓度依此为1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L和4.0mmol/L。
图6是实施例6检测结果凝胶电泳图，图中泳道1～7中标样多重RT-PCR扩增体系中dNTP的浓度依此为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L和1.4mmol/L。
图7是实施例7检测结果凝胶电泳图，图中泳道1～7中用于扩增西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对的浓度比依此为1:1:1:1:1:1:1(引物对总体积5μL)、2:2:2:1:1:1:1(引物对总体积5μL)、10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积5μL)、1:1:1:1:1:1:1(引物对总体积2μL)、2:2:2:1:1:1:1(引物对总体积2μL)、10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积2μL)、1:1:1:1:1:1:1；(引物对总体积7μL)。
图8是实施例8检测结果凝胶电泳图，图中泳道1～7中标样多重RT-PCR扩增体系中TaqDNA聚合酶的酶活依此为0.25U、0.5U、0.75U、1.0U、1.25U、1.5U、1.75U。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物；
用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1F的核苷酸序列为5’-GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3’，下游引物WMV1R的核苷酸序列为5’-GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3’；
用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核苷酸序列为5’-GACAGTTGGGAATCGGA-3’，下游引物CMV1R的核苷酸序列为5’-AACAGGGAGCAAGAGGA-3’；
用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5’-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3’，下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5’-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3’；
用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5’-GGATGCCTTTGGCTATTGG-3’，下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5’-GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3’；
用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核苷酸序列为5’-TTTTGGAGGAATGAGTTT-3’，下游引物TMV-R的核苷酸序列为5’-AGGGAAAAACACTATGC-3’；
用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5’-CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3’，下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5’-TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3’；
用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核苷酸序列为5’-TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3’，下游引物MYSVR的核苷酸序列为5’-GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3’。
具体实施方式二：本实施方式一步快速检测甜瓜多种病毒按以下步骤进行：
一、提取被感染病毒叶片的总RNA；
二、反转录成cDNA；
三、用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR，即可确定叶片是否感染了西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒，以及病毒类型；
步骤三中7对RT-PCR引物为用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1F的核苷酸序列为5’-GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3’，下游引物WMV1R的核苷酸序列为5’-GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3’；
用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核苷酸序列为5’-GACAGTTGGGAATCGGA-3’，下游引物CMV1R的核苷酸序列为5’-AACAGGGAGCAAGAGGA-3’；
用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5’-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3’，下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5’-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3’；
用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5’-GGATGCCTTTGGCTATTGG-3’，下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5’-GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3’；
用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核苷酸序列为5’-TTTTGGAGGAATGAGTTT-3’，下游引物TMV-R的核苷酸序列为5’-AGGGAAAAACACTATGC-3’；
用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5’-CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3’，下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5’-TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3’；
用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核苷酸序列为5’-TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3’，下游引物MYSVR的核苷酸序列为5’-GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3’；
步骤三多重RT-PCR扩增体系为25μL，包括2μL浓度为1000ng/μL的模板cDNA、2μL的引物对、浓度为1.0mmol/L的dNTPs、酶活为1U的TaqDNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+；
步骤三多重RT-PCR反应程序为94℃预变性4min，94℃变性40s、50℃退火复性35s、72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7min。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤二中采用随机引物与反转录酶进行反转录。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三的不同点是：步骤三多重RT-PCR扩增体系中引物对由扩增西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液按10:9:8:8:5:5:3体积比组成。其它步骤及参数与实施方式二或三相同。
扩增西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液中引物的浓度都是10μM。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一的不同点是：步骤三中PCR反应在BiometraPCR仪上进行。其它步骤及参数与实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一的不同点是：步骤三中PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后，使用Bio-Rad凝胶成像系统观察。其它步骤及参数与实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一的不同点是：步骤二在PCR管中加入3μg总RNA，采用0.4μLoligo(dT)18引物和0.6μL随机六聚体引物反转录cDNA。其它步骤及参数与实施方式二至六之一相同。
实施例1
采用本发明试剂盒和方法对同时被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株，以及健康植株和阴性对照进行检测。
检测结果如图1所示，健康植株和阴性对照中均未有条带出现，泳道1～4中都有7条明亮、清晰的条带，且条带大小与西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒一一对应。
实施例2
采用本发明试剂盒和方法对分别被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒侵染的甜瓜植株，以及健康植株进行检测。
检测结果如图2所示，健康植株未有条带出现，泳道1～7中分别在不同位置个出现1条明亮、清晰的条带，且条带大小与西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒一一对应。
实施例3
采用本发明试剂盒和方法对新疆不同地区瓜产区采集样品的甜瓜病毒病种类进行鉴定，并采用已知西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒特异性引物分别对采集样品进行PCR检测。
本发明试剂盒和方法的检测结果如图3所示，其结果与用已知西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒特异性引物分别进行PCR检测的结果一致。说明本发明方法检测结果准确、可靠。
实施例4
对同时被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行检测。
本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中模板cDNA的体积分别为0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL、1.75μL和2μL。
检测结果如图4所示，只有RT-PCR扩增体系中模板cDNA的体积为2μL的泳道中同时出现了7条明亮、清晰的条带。
实施例5
对同时被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行检测。
本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中Mg2+的浓度分别为1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L和4.0mmol/L。
检测结果如图5所示，只有RT-PCR扩增体系中Mg2+的浓度为2.0mmol/L的泳道中同时出现了7条清晰的条带。
实施例6
对同时被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行检测。
本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中dNTP的浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L和1.4mmol/L。
检测结果如图6所示，只有RT-PCR扩增体系中dNTP的浓度为1.0mmol/L的泳道中同时出现了7条清晰的条带。
实施例7
对同时被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行检测。
本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中引物对由扩增西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液分别按1:1:1:1:1:1:1(引物对总体积5μL)、2:2:2:1:1:1:1(引物对总体积5μL)、10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积5μL)、1:1:1:1:1:1:1(引物对总体积2μL)、2:2:2:1:1:1:1(引物对总体积2μL)、10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积2μL)、1:1:1:1:1:1:1；(引物对总体积7μL)的体积比组成。
检测结果如图7所示，RT-PCR扩增体系中引物对的体积比为10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积2μL)的6号泳道中同时出现了7条最为明亮、清晰的条带。
实施例8
对同时被西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行检测。
本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中TaqDNA聚合酶的酶活分别为0.25U、0.5U、0.75U、1.0U、1.25U、1.5U、1.75U。
检测结果如图8所示，只有RT-PCR扩增体系中TaqDNA聚合酶的酶活为1U的泳道中同时出现了7条明亮、清晰的条带。

Claims (7)

1.一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒，其特征在于一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物；
用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1F的核苷酸序列为5’-GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3’，下游引物WMV1R的核苷酸序列为5’-GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3’；
用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核苷酸序列为5’-GACAGTTGGGAATCGGA-3’，下游引物CMV1R的核苷酸序列为5’-AACAGGGAGCAAGAGGA-3’；
用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5’-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3’，下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5’-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3’；
用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5’-GGATGCCTTTGGCTATTGG-3’，下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5’-GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3’；
用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核苷酸序列为5’-TTTTGGAGGAATGAGTTT-3’，下游引物TMV-R的核苷酸序列为5’-AGGGAAAAACACTATGC-3’；
用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5’-CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3’，下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5’-TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3’；
用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核苷酸序列为5’-TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3’，下游引物MYSVR的核苷酸序列为5’-GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3’。
2.用权利要求1所述一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒快速检测的方法，其特征在于一步快速检测甜瓜多种病毒按以下步骤进行：
一、提取被感染病毒叶片的总RNA；
二、反转录成cDNA；
三、用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR，即可确定叶片是否感染了西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒，以及病毒类型；
步骤三中7对RT-PCR引物为用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1F的核苷酸序列为5’-GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3’，下游引物WMV1R的核苷酸序列为5’-GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3’；
用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核苷酸序列为5’-GACAGTTGGGAATCGGA-3’，下游引物CMV1R的核苷酸序列为5’-AACAGGGAGCAAGAGGA-3’；
用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5’-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3’，下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5’-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3’；
用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5’-GGATGCCTTTGGCTATTGG-3’，下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5’-GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3’；
用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核苷酸序列为5’-TTTTGGAGGAATGAGTTT-3’，下游引物TMV-R的核苷酸序列为5’-AGGGAAAAACACTATGC-3’；
用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5’-CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3’，下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5’-TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3’；
用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核苷酸序列为5’-TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3’，下游引物MYSVR的核苷酸序列为5’-GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3’；
步骤三多重RT-PCR扩增体系为25μL，包括2μL的模板cDNA,、2μL的引物对、浓度为1.0mmol/L的dNTPs、酶活为1U的TaqDNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+；
步骤三多重RT-PCR反应程序为94℃预变性4min，94℃变性40s、50℃退火复性35s、72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7min。
3.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法，其特征在于步骤二中采用随机引物与反转录酶进行反转录。
4.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法，其特征在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中引物对由扩增西瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液按10:9:8:8:5:5:3体积比组成。
5.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法，其特征在于步骤三中PCR反应在BiometraPCR仪上进行。
6.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法，其特征在于步骤三中PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后，使用Bio-Rad凝胶成像系统观察。
7.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法，其特征在于步骤二在PCR管中加入3μg总RNA，采用0.4μLoligo(dT)18引物和0.6μL随机六聚体引物反转录cDNA。
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