CN110951917A - 一种快速检测瓜类病毒的rna-rp rt-pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测瓜类病毒的RNA‑RP RT‑PCR方法，将感染病毒的瓜类植物叶片采用PBST+2%PVP溶液或0.5%Triton X‑405 PBS溶液匀浆，提取样品病毒RNA于上清液中，以此上清液用于一步RT‑PCR扩增病毒目标片段，从而检测瓜类病毒。本发明仅需微量样品即可获得足量的RNA模板，用于对瓜类植物中的西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦及模式植物本生烟进行黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）和南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）等6种病毒的检测，方法灵敏度高、结果准确，操作简单和快速，提供了瓜类病毒新的检测方法。

Description

一种快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法
技术领域
本发明属于植物检疫技术领域，具体涉及一种快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法。
背景技术
葫芦科(Cucurbitaceae)植物包括118属825种，我国有32属154种35变种。我国气候条件适宜葫芦科作物的种植，是世界种植大国，以西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦等最为常见。葫芦科作物病毒病普遍发生，严重影响产量和品质。病毒主要有黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）和南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）等。病毒感染导致植株叶片出现花叶、厥叶，植株生长减缓、矮化，种子、蚜虫、农事操作、土壤或灌溉水传播病毒，条件适宜时，病毒病大面积发生，为害极其严重。
由于病毒病危害较大，通过早期检测可以早期预防，这对葫芦科作物生产特别重要。目前，人们可采用电镜法、酶联免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR、qRT-PCR、IC-RT-PCR、环介导等温扩增(LAMP) 和芯片检测等方法进行病毒病的检测。ELISA和RT-PCR最为常用。RT-PCR方法的使用主要依赖于SDS法、CTAB法、TrizoL法和商品化纯化试剂盒等方法获得RNA模板，涉及苯酚、氯仿、β-巯基乙醇等有毒有害试剂的使用，操作繁琐，且污染环境，对实验者存在安全隐患。目前已有商品化产品用于植物基因组DNA的直接释放和扩增。对于植物RNA的直接释放和扩增，虽无商品化产品开发出来，但已有报道显示一些表面活性剂（例如Triton系列）在植物RNA释放方面有一定的潜力。考虑到不同植物组织因细胞壁性质、多糖和活性次级代谢物的存在情况等不同导致病毒核酸释放的难易程度及是否存在抑制因子方面各不相同，且这与病毒本身的侵染特性也有关系。因此，有必要对不同瓜类植物的不同病毒的RNA释放效率进行检测，从而筛选出一种较为有效的可用于瓜类植物病毒病RT-PCR检测的RNA释放方法（RNA release procedure, RNA-RP）。此外，ELISA方法中所用试剂含非离子表面活性剂Tween-20，它可能有助于RNA的释放，也用聚乙烯吡咯烷酮（PVP），它可以以氢键方式与多酚、萜烯或单宁类物质结合, 防止样品氧化，减缓或消除这些物质带来的褐化干扰, 并阻止这些物质与RNA发生作用，保证释放的RNA更为稳定，这说明ELISA方法中所用试剂在RNA释放方面有巨大的应用潜力。因此，本发明对Triton系列试剂及ELISA实验中所用试剂在瓜类植物病毒RNA释放效率、RT-PCR检测灵敏度及针对不同作物、不同病毒的适用性方面进行了分析，为快速检测瓜类病毒和病毒学研究提供新的方法。
发明内容
本发明提供了一种快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，为检测瓜类病毒和辅助病毒学研究提供了新的方法，解决了上述问题。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种快速检测瓜类病毒的RNA- RP RT -PCR方法，包括以下步骤：
（1）取待检测植株叶片于液氮中研磨，加入提取缓冲液进行剧烈震荡、混匀，离心，吸取上清备用；
（2）设计与检测植株叶片相对应的特异性检测引物对，所述的特异性检测引物对包括以下六种：
黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）特异性引物序列如下：
CG-3467F：5＇-TGTTTGCTACYACTGTGCCTAC-3＇，SEQ ID NO .1；
CG-5294R：5＇-GCATCCTTGTGTCAACCARAG-3＇， SEQ ID NO .2；
黄瓜花叶病毒（CMV）特异性引物序列如下：
CMV-R1-1F：5＇-GTTTTATTTACAAGAGCGTACG-3＇，SEQ ID NO .3；
CMV-R1-1627R：5＇-GCRGATGATATCACGTCCCA-3＇，SEQ ID NO .4；
小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）特异性引物序列如下：
Z-7124F：5＇-ACGCAGAAGCGAGCGCTTA-3＇，SEQ ID NO .5；
Z-8302R：5＇-TCGCAGCGCAAATAGCCTC-3＇，SEQ ID NO .6；
西瓜花叶病毒（WMV）特异性引物序列如下：
W-8674F：5＇-ATGCACCGCACTGAGGCAA-3＇，SEQ ID NO .7；
W-10047R：5＇-AGGACAACAAACATTACCGTA-3＇，SEQ ID NO .8；
番木瓜环斑花叶病毒（PRSV）特异性引物序列如下：
P-5461-F：5＇-GTATGGYYTGCCTGTBATG-3＇，SEQ ID NO .9；
P-6987-R：5＇-CAAACCACRGAAGCTATRCC-3＇，SEQ ID NO .10；
南瓜花叶病毒（SqMV）特异性引物序列如下：
S-RNA2-921F：5＇-GGTGGTATGTTGCTGGTTG-3＇，SEQ ID NO .11；
S-RNA2-2362R：5＇-GTTGCCTTTATGTAAGGAGAACTC-3＇，SEQ ID NO .12；
（3）以（1）中制备的上清液为模板，选取对应的特异性引物进行一步RT-PCR体系的配制和目标片段的扩增：2×1 Step Buffer（Dye PLus） 10 μL，PrimeScript 1 Step EnzymeMix 0.8 μL，上游引物（10 μM） 1 μL，下游引物（10 μM） 1 μL，上清液 0.5 μL，补水6.7 μL，总体系共计20 μL；50℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 30 sec，57℃ 30 sec，72℃ 1 Kb/min，运行35个循环，72℃总延伸2 min；
（4）取PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳检测；
（5）电泳检测结果的分析方法为：出现目标条带的样品为阳性，不出现目标条带的样品为阴性。
优选地：所述步骤(1)中的植株叶片包含瓜类植物中的西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦及本生烟。
优选地：所述步骤(1)中的提取缓冲液为PBST+2%PVP溶液或0.5% Triton X-405PBS溶液。
优选地：所述步骤(2)中CGMMV、CMV、ZYMV、WMV、PRSV和SqMV特异性引物对所对应的目标片段长度分别为1828 bp、1627 bp、1179 bp、1374 bp、1527 bp、1442 bp。
优选地：所述步骤(1) 所述的离心为7000-9000 rpm，3-8 min。
优选地：所述步骤(1) 所述的待检测植株叶片的重量与提取缓冲液的比例0.03-0.06g/1ml。
本发明的有益效果：
（1）本发明制备RNA模板过程中不涉及苯酚、β-巯基乙醇、氯仿、异丙醇等有毒有害试剂的使用，对环境无污染，对实验操作者来说更安全；
（2）本发明仅需微量样品即可快速获得足量的实验模板，操作简单、节约成本和时间；
（3）本发明所制备的样品上清液可直接用于RT-PCR检测，也可直接用于ELISA相关实验；
（4）本发明所提供的方法适用于瓜类植物中的西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦等及模式植物本生烟等。
（5）本发明所提供的方法适用于黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、西瓜花叶病毒（WMV）、番木瓜环斑花叶病毒（PRSV）和南瓜花叶病毒（SqMV）等6种瓜类病毒的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 CGMMV在不同溶液中的提取效率比较；
图2 两种溶液的灵敏度检测结果；
图3 DAS-ELISA灵敏度检测结果；
图4 CGMMV在本生烟和和黄瓜中的检测结果；
图5 CMV在本生烟和和甜瓜中的检测结果；
图6 ZYMV和WMV在甜瓜和西瓜中的检测结果；
图7 PRSV和SqMV在甜瓜、黄瓜和西葫芦中的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1植物总RNA的快速释放中所用溶液的筛选
称取8份0.05 g的CGMMV甜瓜发病叶片，分别装于2 mL离心管中，利用组织破碎仪经液氮低温破碎，分别往各管样品中加入1 mL的RNase-free ddH2O、1×PBS、PBST、PBST+2%PVP、0.5% Triton X-100水溶液、0.5% Triton X-100 PBS 溶液、0.5% Triton X-405水溶液和0.5% Triton X-405 PBS溶液，剧烈震荡、混匀，8000 rpm离心5 min，吸取上清备用；
利用CGMMV特异性引物序列CG-3467F/CG-5294R对制备的上清液进行病毒检测，其中2×1 Step Buffer（Dye PLus）10 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix0.8 μL，CG-3467F（10 μM）1μL，CG-5294R（10 μM）1μL，上清液0.5μL，补水6.7μL，总PCR体系共计20μL；50℃ 30min，94℃ 2 min，94℃ 30 sec，57℃ 30 sec，72℃ 2 min，运行35个循环，72℃总延伸2min；
取2 μL的PCR产物利用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测，如图1所示，说明1×PBS、PBST、PBST+2%PVP、0.5% Triton X-405水溶液和0.5% Triton X-405 PBS溶液五种溶液均能用于释放植物总RNA，以PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405 PBS溶液效率较优。
将利用PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405 PBS溶液所制备的上清液依次进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释，再次进行一步RT-PCR扩增和电泳检测，如图2所示，说明利用PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405 PBS溶液进行RNA制备并结合一步RT-PCR方法的灵敏度为10-4，其灵敏度比DAS-ELISA方法高出100倍（图3）。
实验例2 CGMMV在本生烟和黄瓜中的RNA-RP RT-PCR检测
称取0.05 g的CGMMV本生烟和黄瓜发病叶片各两份，分别装于2 mL离心管中，利用组织破碎仪经液氮低温破碎，分别往各管样品中加入1 mL的PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405PBS溶液，剧烈震荡、混匀，8000 rpm离心5 min，吸取上清，利用CGMMV特异性引物序列CG-3467F/CG-5294R对制备的上清液进行病毒检测，其中2×1 Step Buffer（Dye PLus）10 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.8 μL，CG-3467F（10 μM）1 μL，CG-5294R（10 μM）1μL，上清液 0.5 μL，补水6.7 μL，总PCR体系共计20 μL；50℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 30sec，57℃ 30 sec，72℃ 2 min，运行35个循环，72℃总延伸2 min；
取4 μL的PCR产物进行电泳检测，结果如4所示，说明PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405PBS溶液均能有效释放本生烟和黄瓜叶片中的总RNA用于CGMMV的检测。
实验例3 CMV在本生烟和和甜瓜中的RNA-RP RT-PCR检测
称取0.05 g的CMV本生烟和甜瓜发病叶片各两份，分别装于2mL离心管中，利用组织破碎仪经液氮低温破碎，分别往各管样品中加入1 mL的PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405PBS溶液，剧烈震荡、混匀，7000 rpm离心8min，吸取上清，利用特异性引物CMV-R1-1F/CMV-R1-1627R结合一步RT-PCR方法对CMV进行检测，具体步骤与实施例1一样，不在重复，
取3 μL的PCR产物进行电泳检测，结果如5所示，说明PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405PBS溶液均能有效释放本生烟和甜瓜叶片中的总RNA用于CMV的检测。
实验例4 ZYMV和WMV在甜瓜和西瓜中的RNA-RP RT-PCR检测
称取0.03g的ZYMV甜瓜和西瓜发病叶片各两份及WMV甜瓜和西瓜发病叶片各两份，分别装于2 mL离心管中，利用组织破碎仪经液氮低温破碎，分别往各管样品中加入1 mL的PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405 PBS溶液，剧烈震荡、混匀，8000 rpm离心5 min，吸取上清，分别利用特异性引物Z-7124F/Z-8302R、W-8674F/W-10047R结合一步RT-PCR方法对ZYMV和WMV进行检测，具体步骤与实施例1一样，不在重复，
取3 μL的PCR产物进行电泳检测，结果如6所示，说明PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405PBS溶液均能有效释放甜瓜和西瓜叶片中的总RNA用于ZYMV和WMV的检测。
实验例5 PRSV和SqMV在甜瓜、黄瓜和西葫芦中的RNA-RP RT-PCR检测
称取0.06g的PRSV甜瓜、黄瓜和西葫芦发病叶片各两份及SqMV甜瓜、黄瓜和西葫芦发病叶片各两份，分别装于2mL离心管中，利用组织破碎仪经液氮低温破碎，分别往各管样品中加入1 mL的PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405 PBS溶液，剧烈震荡、混匀，9000 rpm离心3min，吸取上清，分别利用特异性引物P-5461-F/P-6987-R、S-RNA2-921F/S-RNA2-2362R结合一步RT-PCR方法对PRSV和SqMV进行检测，具体步骤与实施例1一样，不在重复，
取3 μL的PCR产物进行电泳检测，结果如7所示，说明PBST+2%PVP和0.5% Triton X-405PBS溶液均能有效释放甜瓜、黄瓜和西葫芦叶片中的总RNA用于PRSV和SqMV的检测。
以上实施例说明，利用本发明结合快速释放植株总RNA及相应的瓜类病毒RNA-RPRT-PCR检测方法可对瓜类病毒进行特异性检测，并得到准确结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一种快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtttgctac yactgtgcct ac 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatccttgt gtcaaccara g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttttattta caagagcgta cg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcrgatgata tcacgtccca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgcagaagc gagcgctta 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgcagcgca aatagcctc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcaccgca ctgaggcaa 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggacaacaa acattaccgt a 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtatggyytg cctgtbatg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caaaccacrg aagctatrcc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtggtatgt tgctggttg 19
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttgccttta tgtaaggaga actc 24

Claims (6)

1.一种快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取待检测植株叶片于液氮中研磨，加入提取缓冲液进行剧烈震荡、混匀，离心，吸取上清备用；
（2）设计与检测植株叶片相对应的特异性检测引物对，所述的特异性检测引物对包括以下六种：
黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）特异性引物序列如下：
CG-3467F如SEQ ID NO .1所示；
CG-5294R如SEQ ID NO .2所示；
黄瓜花叶病毒（CMV）特异性引物序列如下：
CMV-R1-1F如SEQ ID NO .3所示；
CMV-R1-1627R如SEQ ID NO .4所示；
小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）特异性引物序列如下：
Z-7124F如SEQ ID NO .5所示；
Z-8302R如SEQ ID NO .6所示；
西瓜花叶病毒（WMV）特异性引物序列如下：
W-8674F如SEQ ID NO .7所示；
W-10047R如SEQ ID NO .8所示；
番木瓜环斑花叶病毒（PRSV）特异性引物序列如下：
P-5461-F如SEQ ID NO .9所示；
P-6987-R如SEQ ID NO .10所示；
南瓜花叶病毒（SqMV）特异性引物序列如下：
S-RNA2-921F如SEQ ID NO .11所示；
S-RNA2-2362R如SEQ ID NO .12所示；
（3）以（1）中制备的上清液为模板，选取对应的特异性引物进行一步RT-PCR体系的配制和目标片段的扩增：2×1 Step Buffer（Dye PLus） 10 μL，PrimeScript 1 Step EnzymeMix 0.8 μL，上游引物（10 μM） 1 μL，下游引物（10 μM） 1 μL，上清液 0.5 μL，补水6.7 μL，总体系共计20 μL；50℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 30 sec，57℃ 30 sec，72℃ 1 Kb/min，运行35个循环，72℃总延伸2 min；
（4）取PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳检测；
（5）电泳检测结果的分析方法为：出现目标条带的样品为阳性，不出现目标条带的样品为阴性。
2.根据权利要求1所述的快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤(1)中的植株叶片包含瓜类植物中的西瓜、甜瓜、黄瓜和西葫芦及本生烟。
3.根据权利要求1所述的快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取缓冲液为PBST+2%PVP溶液或0.5% Triton X-405 PBS溶液。
4.根据权利要求1所述的快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤(2)中CGMMV、CMV、ZYMV、WMV、PRSV和SqMV特异性引物对所对应的目标片段长度分别为1828 bp、1627 bp、1179 bp、1374 bp、1527 bp、1442 bp。
5.根据权利要求1所述的快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤(1) 所述的离心为7000-9000 rpm，3-8 min。
6.根据权利要求1所述的快速检测瓜类病毒的RNA-RP RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤(1) 所述的待检测植株叶片的重量与提取缓冲液的比例0.03-0.06g/1ml。
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