CN109943627B

CN109943627B - 利用双重数字pcr定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法

Info

Publication number: CN109943627B
Application number: CN201910375468.1A
Authority: CN
Inventors: 刘津; 高东微; 董旭婉; 李志勇; 董洁; 关丽军
Original assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Current assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN109943627A

Abstract

本发明提供了一种利用双重数字PCR定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将花生物种特异性基因序列和芝麻物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述花生物种特异性基因序列和所述芝麻物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到花生占芝麻和花生的DNA拷贝数百分比，换算得到花生成分占芝麻和花生成分的质量百分比。本方法可准确、快速地为检测出芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的质量百分比含量，为芝麻酱和芝麻蓉馅料真实性鉴别提供准确可靠的技术数据。

Description

利用双重数字PCR定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用双重数字PCR定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法。

背景技术

根据《LS/T 3220-2017芝麻酱》中的规定，芝麻酱是以芝麻为原料，经除杂、清洗和焙炒后，采用研磨等工序制成的产品。芝麻酱的唯一原料应为芝麻或去皮后的芝麻仁。芝麻蓉俗称麻蓉，是以芝麻、猪油和糖为原料制作的馅料。由于芝麻酱和芝麻蓉制作工艺简单，市场准入门槛较低，生产企业良莠不齐，部分生产企业为了降低成本，获得更高的利润，向芝麻酱和芝麻蓉中进行掺假。最常见的掺假方法是在纯芝麻酱中勾兑花生酱和在芝麻蓉中掺入花生蓉，有的甚至使用芝麻香精制作没有芝麻的芝麻酱和芝麻蓉。这种行为严重妨碍公平贸易，损害消费者的利益，影响食品安全。

《LS/T 3220-2017芝麻酱》中规定芝麻酱的检验包括感官检验、酸值和脂肪含量等质量指标的检测，不能有效鉴别芝麻酱的真伪。《SN/T 1961.12-2013出口食品过敏原成分检测第12部分：实时荧光PCR方法检测芝麻成分》、《SN/T 4419.14-2016出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法第14部分：芝麻》、《SN/T 1961.2-2007食品中过敏原成反检测方法第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分》和《SN/T 4419.12-2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第12部分：花生》采用实时荧光PCR和等温扩增技术对芝麻和花生进行定性检测，仅能解决芝麻酱和芝麻蓉中是否含有花生成分的问题，对芝麻酱和芝麻蓉生产加工过程中由于共用容器、设备和生产线等造成的“无意污染”和以掺假为目的的“有意添加”不能进行有效区分，存在明显的技术局限性，不能满足芝麻酱和芝麻蓉打假的需求。

为保障食品安全，维护公平合法贸易，建立芝麻酱和芝麻蓉中花生成分双重数字PCR定量检测方法，可对芝麻酱和芝麻蓉中掺入的花生成分进行精准检测，对芝麻酱和芝麻蓉的真伪鉴别提供准确可靠的技术依据。

发明内容

本发明的目的在于针对以上要解决的缺点与不足，提供一种利用双重数字PCR准确、有效地定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用双重数字PCR定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将花生物种特异性基因序列和芝麻物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述花生物种特异性基因序列和所述芝麻物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到花生占芝麻和花生的DNA拷贝数百分比，换算得到花生成分占芝麻和花生成分的质量百分比。

优选地，本发明的方法包括以下步骤：

步骤1.提取芝麻酱或芝麻蓉样品DNA；

步骤2.设计并合成所述芝麻物种特异性基因序列的引物和探针序列以及所述花生物种特异性基因序列的引物和探针序列；

步骤3.进行双重数字PCR反应；

步骤4.采用FAM和VIC双通道荧光检测读取并分析荧光信号；

步骤5.根据荧光信号检测结果计算所述花生占芝麻和花生的DNA拷贝数百分比，换算得到花生成分占芝麻和花生成分的质量百分比；

其中，所述花生占芝麻和花生的DNA拷贝数百分比

其中a为花生特异性基因拷贝数浓度，b为芝麻特异性基因拷贝数浓度。

其中，所述花生成分占芝麻和花生成分的质量百分比，通过建立其对拷贝数百分比的关系式，利用拷贝数百分比求得。

优选地，所述步骤1包括将所述芝麻酱或芝麻蓉样品，采用试剂盒法提取样品DNA。

优选地，所述步骤2中，所述芝麻物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

芝麻特异性基因-F：CCAGAGGGCTAGGGACCTTC(SEQ ID NO.1)；

芝麻特异性基因-R：CTCGGAATTGGCATTGCTG(SEQ ID NO.2)；

芝麻特异性基因-P：FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述步骤2中，所述花生物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

花生特异性基因-F：GAGGCAACAGGAGCAACAGTTCAAG(SEQ ID NO.4)；

花生特异性基因-R：CAACGCTGTGGTGCCCTAAGG(SEQ ID NO.5)；

花生特异性基因-P：VIC-GAGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-BHQ1(SEQ ID NO.6)。

优选地，所述双重数字PCR反应包括微滴数字PCR反应(droplet digital PCR,ddPCR)和芯片数字PCR(chip digital PCR,cdPCR)反应。

更优选地，所述ddPCR反应条件为：95℃，5分钟，1℃/秒；94℃，15s，1℃/秒，60℃，1分钟，1℃/秒，共49个循环；12℃保存反应产物。

更优选地，所述ddPCR反应体系为20μL，各组分如下：2×ddPCR^TM预混液10μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.8μL，浓度为10pmol/μL的探针各0.4μL，DNA模板2μL，补水至20μL。

更优选地，所述cdPCR反应条件为：96℃，10分钟；60℃，2分钟，98℃，30秒，49个循环；60℃，2分钟；10℃保存反应产物。

更优选地，所述cdPCR反应体系为15μL，各组分如下：2×

预混液7.5μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.6μL、浓度为10pmol/μL的探针各0.3μL，DNA模板1.5μL，补水至15μL。

数字PCR是一种基于单分子扩增的核酸检测技术，以泊松分布原理为理论基础，对样品中特定基因片段进行拷贝数浓度定量测定，可以避免复杂的食品配料组成、加工工艺和食品状态等因素引起的结果偏差。以往利用数字PCR技术测定食品中物种成分含量的发明，主要集中在动物源性成分方面。本方法首次开展了食品中植物源性成分的数字PCR定量测定发明，建立了花生占芝麻和花生DNA拷贝数百分比与芝麻酱或芝麻蓉中花生占芝麻和花生成分质量百分比的关系式，利用数字PCR技术测定芝麻酱或芝麻蓉中两个物种DNA拷贝数浓度，计算花生占芝麻和花生DNA拷贝数百分比，根据关系式换算得到芝麻酱或芝麻蓉中花生成分的质量百分比含量。

芝麻(Sesamum indicum L.)属于胡麻科胡麻属植物的果实或种子。根据本发明设计的芝麻特异性引物探针能够对芝麻进行特异性检测。花生(Arachis hypogaea Linn.)属于豆科落花生属植物的果实或种子，根据本发明设计的花生特异性引物探针能够对花生进行特异性检测。与针对动物的引物探针相比，本发明在设计针对植物物种的引物探针时需要面对更多的困难，本发明采用的芝麻特异性引物和探针以及花生特异性引物和探针充分地考虑了芝麻和花生这两种植物的基因序列特性，选取了最合适的特异性引物和探针，确保检测结果的准确性。

本方法对花生和芝麻DNA拷贝数浓度进行定量测定，拷贝数浓度绝对定量限为6拷贝/微升，花生占芝麻和花生DNA拷贝数百分比定量限为1％；芝麻酱和芝麻蓉中花生占芝麻和花生成分的质量百分比定量限为5％。本方法可准确、快速地检测出芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的质量百分比含量，为芝麻酱和芝麻蓉真实性鉴别提供准确可靠的技术数据。

附图说明

图1是拷贝数百分比定量限验证实验数据分析图(ddPCR)。

图2是拷贝数百分比定量限验证实验结果2D图(cdPCR)。

图3是质量百分比-拷贝数百分比关系式(ddPCR)。

图4是质量百分比-拷贝数百分比关系式(cdPCR)。

图5是质量百分比定量限验证实验结果1D图(ddPCR)。

图6是质量百分比定量限验证实验结果2D图(cdPCR)。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明利用双重数字PCR定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法如下：

1、样品的制备与基因组DNA模板的提取：取样品(芝麻、花生、芝麻酱、芝麻蓉馅料等)10g，使用研磨仪进行粉碎和均质，条件为1800转/分、3分钟。

称取样品30mg于1.5mL离心管内，采用试剂盒法提取样品DNA，试剂盒可选用：Kurabo QuickGene DNA提取试剂盒DT-S、Wizard Genomic DNA purification kit(Promega，A1120)、PSS核酸自动提取仪等DNA提取方法。本领域技术人员熟知这些DNA提取方法，从而分别提取相应样品的DNA。

2、设计并合成所述芝麻物种特异性基因序列的引物和探针序列以及所述花生物种特异性基因序列的引物和探针序列，所述的引物和探针的核苷酸序列如下：

3、进行双重数字PCR反应

(1)仪器

QX200^TM Droplet Digital PCR系统：包括热循环仪(C1000Touch^TM thermalcycler)、微滴生成仪(droplet generator)、微滴分析仪(droplet reader)和封膜仪(PCRplate sealer)4个部分，购自美国Bio-rad公司。

QuantStudio^TM 3D Digital PCR系统：包括PCR系统(Dual Flat Block

PCR System9700)、芯片装载仪(Digital Chip Loader)和芯片分析仪(Digital PCRInstrument)3个部分，购自美国Applied Biosystems by Life Technologies公司。

E4-200XLS+单通道电动移液枪购自美国瑞宁公司。

(2)试剂

ddPCR：ddPCR^TM预混液(Super Mix for Probes,no dUTP)、微滴生成油(DropletGeneration Oil)、微滴分析油(Droplet Reader Oil)、微滴生成卡槽(Droplet GeneratorDG8Cartridge)、微滴生成卡槽胶垫(Droplet Generator DG8Gasket)和96孔板，购自美国Bio-Rad公司。

cdPCR：

预混液(3D Digital PCR Master Mix v2)、芯片试剂盒(3DDigital PCR 20K Chip Kit v2，包含芯片、芯片盖、刷头、封油注射器)，购自美国AppliedBiosystems by Life Technologies公司。

QuickGene基因提取试剂盒(Cat.#DT-S)

引物和探针均由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。

(3)供试样本

每种方法除供试样本不同之外，其操作步骤、试剂用量及反应条件等均相同。具体的供试样本及得到的实验数据以下面实施例中详述。

(4)反应体系的配制和分散

ddPCR反应体系为20μL，各组分如下：2×ddPCR^TM预混液(MasterMix)10μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.8μL，浓度为10pmol/μL的探针各0.4μL，DNA模板2μL，补水至20μL。分别将20μL的反应体系和70μL微滴生成油加入微滴生成卡槽中，盖上胶垫后放入微滴生成仪中进行微滴生成，待微滴生成结束后用单通道电动移液枪将生成的微滴(大约40μL)全部转移至96孔板中，用封膜仪进行封膜后置于热循环仪中进行PCR反应。

cdPCR反应体系为15μL，各组分如下：2×

预混液(MasterMix)7.5μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.6μL、浓度为10pmol/μL的探针各0.3μL，DNA模板1.5μL，补水至15μL。将配制好的15μL反应体系通过芯片装载仪自动加载到芯片上的微孔中，体系加载完成后立即使用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封。密封后的芯片放置于PCR系统上进行扩增。

(5)反应程序

ddPCR反应条件：95℃，5分钟(1℃/s)；94℃15秒(1℃/秒)，60℃1分钟(1℃/秒)，共49个循环；12℃保存反应产物。

cdPCR反应条件：96℃10分钟；60℃2分钟，98℃30秒，49个循环；60℃2分钟；10℃保存反应产物。

4、荧光信号读取和分析

本标准中荧光读取采用FAM和VIC双通道荧光检测。

荧光收集结束后，根据反应热点图确定荧光阈值，进行阴性点与阳性点的区分。

ddPCR数据读取：扩增结束后将96孔板置于微滴分析仪中读取荧光信号，并用QuantaSoft V1.3.2软件分析实验数据。

cdPCR数据读取：扩增结束后，待芯片恢复至室温，将芯片置于芯片分析仪中读取并初步分析芯片结果，再经由QuantStudio^TM 3D AnalysisSuiteTM Cloud Software二次分析实验数据。

5、拷贝数百分比的计算

根据荧光信号检测结果计算所述花生占芝麻和花生DNA拷贝数百分比。

花生占芝麻和花生DNA拷贝数百分比

a——花生特异性基因拷贝数浓度(拷贝/微升)

b——芝麻特异性基因拷贝数浓度(拷贝/微升)。

6、质量百分比-拷贝数百分比关系式的建立

制备以芝麻为基质，掺入不同质量百分比的花生，得到不少于5个质量百分比的系列花生/芝麻混合样品。例如，制备花生成分质量百分比为1％、5％、10％、40％、50％和100％的花生/芝麻粉末混合样品。每个样品称取3个平行，每个平行30mg，分别进行DNA提取，每个称样平行DNA稀释10倍后，分别进行1个平行的ddPCR和cdPCR。利用数据分析软件建立质量百分比-拷贝数百分比关系式。

7、质量百分比的换算

将步骤5中计算得到的待测样品拷贝数百分比代入步骤6中所述质量百分比-拷贝数百分比关系式，换算得到待测样品中花生成分占芝麻和花生成分质量百分比含量。

8、质量控制

(1)样品检测的质量控制

a.样品平行间的相对标准偏差计算

样品数字PCR反应应设置3个平行，在保证检测结果拷贝数浓度大于绝对定量限的情况下，并且阳性反应数量低于总反应数量80％的前提下，3个平行样品拷贝数浓度的相对标准偏差(RSD)需满足RSD≤25％，其3个平行样品所测得的平均值作为该样品的花生/芝麻和花生基因含量进行后续分析。

b.有效微反应数的控制

数字PCR体系分割过程中产生的有效微反应的总数量不得低于平台理论数的60％(即12000个)；阳性体系的数量不得超过总体系数量的80％。

c.空白对照的质量控制

数字PCR空白对照理论检测结果应为零。但在实际检测中，允许有极少量阳性体系数出现。空白对照中阳性微反应体系数应小于实际有效体系数的0.03％。

以上质控条件中有一项不符合者，实验结果应放弃，并重新进行数字PCR实验。

(2)性能指标的确证

a.拷贝数浓度绝对定量限

以RSD≤25％作为有效定量数据的判断依据，拷贝数浓度绝对定量限为检测结果RSD≤25％时的最低拷贝数浓度。对系列稀释浓度的芝麻和花生DNA进行数字PCR定量检测，每个浓度设置3个平行，计算各浓度平行检测结果的RSD值。本方法对花生和芝麻DNA的拷贝数浓度绝对定量限为6拷贝/微升。

b.拷贝数百分比定量限和回收率

以RSD≤25％和回收率80％～120％作为有效定量数据的判断依据，拷贝数百分比定量限为检测结果RSD≤25％和回收率80％～120％时的最低拷贝数百分比。对系列掺比拷贝数百分比的芝麻和花生DNA进行数字PCR定量检测，每个拷贝数百分比设置3个平行，计算各拷贝数百分比平行检测结果的RSD值和回收率。本方法对花生占芝麻和花生DNA的拷贝数百分比定量限为1％。

c.质量百分比定量限和回收率

以RSD≤25％和回收率80％～120％作为有效定量数据的判断依据，质量百分比定量限为检测结果RSD≤25％和回收率80％～120％时的最低质量百分比。对系列掺比质量百分比的芝麻酱或芝麻蓉进行DNA提取和数字PCR定量检测，每个质量百分比设置3个平行，计算各质量百分比平行检测结果的RSD值和回收率。本方法对花生占芝麻和花生成分的质量百分比定量限为5％。

实施例1：拷贝数绝对定量限的验证

供试样本：为验证本方法的拷贝数绝对定量限，分别提取芝麻和花生基因组DNA并进行系列稀释，得到500、100、20、10、5、1拷贝/微升的系列稀释浓度的芝麻和花生DNA。分别进行3个平行的ddPCR和cdPCR实验，所得实验结果见表1。

表1花生和芝麻DNA拷贝数绝对定量限的验证(ddPCR和cdPCR)

由表1所示的结果可见，在ddPCR平台上，当花生DNA拷贝数浓度为3.77拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值均大于25％，当花生DNA拷贝数浓度大于等于5.93拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，花生DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.93拷贝/微升；当芝麻DNA拷贝数浓度为1.21拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值大于25％，当芝麻DNA拷贝数浓度大于等于5.18拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，芝麻DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.18拷贝/微升。在cdPCR平台上，当花生DNA拷贝数浓度为2.53拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值均大于25％，当花生DNA拷贝数浓度大于等于5.75拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，花生DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.75拷贝/微升；当芝麻DNA拷贝数浓度为1.27拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值大于25％，当芝麻DNA拷贝数浓度大于等于5.31拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，芝麻DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.31拷贝/微升。为了本方法的应用，本方法对花生和芝麻DNA拷贝数浓度绝对定量限取整数为6拷贝/微升。

实施例2：拷贝数百分比定量限的验证

供试样本：为验证本方法的拷贝数百分比定量限，以已知拷贝数浓度的芝麻DNA为基质，掺入已知拷贝数浓度的花生DNA，得到系列掺比拷贝数百分比分别为0.1％、1％、10％和50％的芝麻和花生DNA混合样品。分别进行3个平行的ddPCR和cdPCR实验，所得实验结果见图1和图2。

由图1和图2所示的结果可见，对于拷贝数百分比分别为0.1％、1％、10％和50％的芝麻和花生DNA混合样品，在ddPCR平台上的检测结果分别为0.099％、1.033％、10.023％和49.400％，三个平行之间的RSD值在0.58％～3.11％之间，回收率在98.80％～103.33％之间；在cdPCR平台上的检测结果分别为0.098％、0.958％、9.971％和50.82％，三个平行之间的RSD值在1.316％～3.927％之间，回收率在95.80％～101.64％之间。对于拷贝数百分比为0.1％的样品，测得的拷贝数浓度低于绝对定量限6拷贝/微升，检测结果不是有效定量数据。因此，本方法的拷贝数百分比定量限为1％。

实施例3：质量百分比-拷贝数百分比关系式的建立

供试样本：为建立质量百分比-拷贝数百分比关系式，以芝麻为基质，掺入不同质量百分比的花生，得到质量百分比为1％、5％、10％、20％、40％、50％和100％的花生和芝麻粉末混合样品。每个样品称取3个平行，每个平行30mg，分别进行DNA提取，每个称样平行DNA稀释10倍后，分别进行1个平行的ddPCR和cdPCR。利用数据分析软件建立质量百分比-拷贝数百分比关系式，所得关系式见图3和图4。对于质量百分比为1％的样品，拷贝数百分比的回收率不满足有效定量数据的判断依据，检测结果不是有效定量数据。因此，关系式的建立采用质量百分比为5％、10％、40％和50％的检测结果。

在ddPCR平台建立的质量百分比-拷贝数百分比关系式如图3所示，关系式为：100y＝(100x-0.5362)/1.021，其中，x为拷贝数百分比，y为质量百分比。R²为0.9998。

在cdPCR平台建立的质量百分比-拷贝数百分比关系式如图4所示，关系式为：100y＝(100x+0.1165)/1.053，其中，x为拷贝数百分比，y为质量百分比。R²为0.996。

实施例4：质量百分比定量限的验证

供试样本：为验证本方法的质量百分比定量限，以芝麻为基质，掺入不同质量的花生并制成芝麻酱，得到系列花生质量掺比分别为1％、5％、10％、40％和50％的芝麻酱样品。每个样品称取3个平行，每个平行30mg，分别进行DNA提取，每个称样平行DNA稀释10倍后，分别进行1个平行的ddPCR和cdPCR，所得实验结果见图5和图6。

质量百分比定量限验证实验结果1D图(ddPCR)如图5所示，其中，A09、B09、C09为花生质量百分比5％的芝麻酱样品，A08、B08、C08为花生质量百分比10％的芝麻酱样品，D07、E07、F07为花生质量百分比40％的芝麻酱样品，A07、B07、C07为花生质量百分比50％的芝麻酱样品。

质量百分比定量限验证实验结果2D图(cdPCR)如图6所示。

根据实验结果计算拷贝数百分比，代入实施例3的质量百分比-拷贝数百分比关系式中换算出质量百分比。由图5和图6所示的结果可见，对于花生质量百分比分别为5％、10％、40％和50％的芝麻酱样品，在ddPCR平台上的检测结果分别为5.27％、10.04％、40.31％和49.58％，三个平行之间的RSD值在1.75％～18.59％之间，回收率在94.86％～100.85％之间；在cdPCR平台上的检测结果分别为5.13％、9.37％、41.88％和48.56％，三个平行之间的RSD值在1.41％～8.91％之间，回收率在95.50％～106.70％之间。对于质量百分比为1％的芝麻酱样品，质量百分比的回收率不满足有效定量数据的判断依据，检测结果不是有效定量数据。因此，本方法的质量百分比定量限为5％。

序列表

<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 利用双重数字PCR定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagagggct agggaccttc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcggaattg gcattgctg 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgcaggtgc aacatgcgac c 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggcaacag gagcaacagt tcaag 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caacgctgtg gtgccctaag g 21

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagctcagga acttgcctca acagtgcg 28

Claims

1.一种利用双重数字PCR定量检测芝麻酱和芝麻蓉中花生成分的方法，其特征在于：采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将花生物种特异性基因序列和芝麻物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述花生物种特异性基因序列和所述芝麻物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到花生占芝麻和花生的DNA拷贝数百分比，换算得到花生成分占芝麻和花生成分的质量百分比；

所述方法包括以下步骤：

步骤1.提取芝麻酱或芝麻蓉样品DNA；

步骤3.进行双重数字PCR反应；

步骤4. 采用FAM和VIC双通道荧光检测读取并分析荧光信号；

其中，所述花生占芝麻和花生的DNA拷贝数百分比

，其中a为花生特异性基因拷贝数浓度，b为芝麻特异性基因拷贝数浓度；

其中，所述花生成分占芝麻和花生成分的质量百分比，通过建立其对拷贝数百分比的关系式，利用拷贝数百分比求得；

所述步骤2中，所述芝麻物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

芝麻特异性基因-F：CCAGAGGGCTAGGGACCTTC；

芝麻特异性基因-R：CTCGGAATTGGCATTGCTG；

芝麻特异性基因-P：FAM- TCGCAGGTGCAACATGCGACC -BHQ1；

所述花生物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

花生特异性基因-F：GAGGCAACAGGAGCAACAGTTCAAG；

花生特异性基因-R：CAACGCTGTGGTGCCCTAAGG；

花生特异性基因-P：VIC- GAGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG -BHQ1；

所述双重数字PCR反应包括ddPCR反应和cdPCR反应；

所述ddPCR反应条件为：95℃，5分钟，1℃/秒；94℃，15秒，1℃/秒，60℃，1分钟，1℃/秒，共49个循环；12℃保存反应产物；

所述ddPCR反应体系为20 μL，各组分如下：2×ddPCR^TM预混液 10 μL；浓度为10 pmol/μL的引物各0.8 μL，浓度为10 pmol/μL的探针各0.4 μL，DNA模板2 μL，补水至20 μL；

所述cdPCR反应条件为：96℃，10分钟；60℃，2分钟，98℃，30秒，49个循环；60℃，2分钟；10℃保存反应产物；

所述cdPCR反应体系为15 μL，各组分如下：2×QuantStudio^® 预混液7.5 μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.6 μL、浓度为10 pmol/μL的探针各0.3 μL，DNA模板1.5 μL，补水至15 μL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括将所述芝麻酱或芝麻蓉样品采用试剂盒法提取样品DNA。