CN108830046B - 一种生物技术产品dna含量估计方法 - Google Patents

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开了一种生物技术产品DNA含量估计方法，可得到DNA的相对百分含量。所述估计方法从实时荧光定量PCR或数字PCR的样品中获得DNA的百分含量需要两次测试。一次用来检测外源插入基因的DNA拷贝数，称之为X，另一测用来检测内源基因DNA拷贝数，称之为Y。两次测试必须是独立进行的，通过本发明所述估计方法能得到DNA的相对百分含量。本发明的估计方法具有广泛适用性，能够准确计算并客观反应生物技术产品的DNA含量，该计算方法对于生物技术产品的基因含量提供了一种准确的数学模型，对我国生物技术产品定量分析及相关产品监管、检测具有十分重要指导意义。

Description

一种生物技术产品DNA含量估计方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物技术产品DNA含量估计方法。
背景技术
随着生物技术产品，如转基因作物及相关产品，在全世界范围内的迅速发展，其环境安全和食用安全问题一直受到各国政府和广大消费者及相关机构人员的重视。对生物技术产品核酸进行定量检测，保证检测结果的准确、可靠和有效性至关重要。
由于生物技术产品的含量分析是通过外源基因(转入基因)拷贝数比上内源基因拷贝数获得的，并且外源基因拷贝数和内源基因拷贝数是分别(独立)测量的。每次会获得一系列的外源基因拷贝数结果与内源基因拷贝数结果，计算比值时存在人为的主观选择过程，常常使得计算结果的标准偏差SD和相对标准偏差CV因人而异。
因此，建立一种摆脱人为干扰的新型生物技术产品含量计算方法，对于生物技术产品核酸含量检测提供了一种更准确的计算手段，对我国核酸检测方法标准化及标准物质研制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种生物技术产品核酸含量的计算方法。
一种生物技术产品DNA含量估计方法，其特征在于，从应用实时荧光定量PCR或数字PCR的样品中获得DNA的百分含量需要两次测试。一个用来检测目的基因的DNA的拷贝数，称之为X，另一个用来检测内源DNA拷贝数，称之为Y。两个实验必须是独立进行的(例如，在不同的孔中进行反应)。
一种生物技术产品DNA含量估计方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)实时荧光定量PCR或数字PCR的样品中DNA样品相对百分含量通以下公式得到：
Figure BDA0001653517810000021
(2)X和Y为随机变量，根据以下展开公式计算两变量比值的平均值及误差。
Figure BDA0001653517810000022
Figure BDA0001653517810000023
(4)μx和μY分别用目的DNA拷贝数和内源DNA拷贝数重复平均数的估算值来评价，Var[X]和Var[Y]也用重复数据的误差来评价。假定X和Y间的互作误差忽略不计(互作误差没有包括在2及3的公式中)。单次检测的相对误差通过下面公式计算：
Figure BDA0001653517810000024
(4)多次重复实验，这里用n表示重复的次数(如n＝2，表示2次重复检测)。则n次重复均值的近似均数和误差为：
Figure BDA0001653517810000033
Figure BDA0001653517810000031
N个重复样品的相对标准偏差(CV)则可以用(5)和(6)来计算：
Figure BDA0001653517810000032
本发明的有益效果：本发明的估计方法具有广泛适用性，能够准确计算并客观反应生物技术产品的DNA含量，该计算方法对于生物技术产品的基因含量提供了一种准确的数学模型，对我国生物技术产品定量分析及相关产品监管、检测具有十分重要指导意义。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
1、实验方案
本方案针对2个转基因大豆样品，分别标为转基因大豆样品1、转基因大豆样品2。
定值仪器为微滴数字PCR仪。
1.1 DNA模板稀释
转基因大豆样品1和转基因大豆样品2，需经提取DNA再进行测试。提取后，浓度稀释至10ng/μL待用。
1.2引物/探针
本次定值配置的PCR反应体系，外源基因和内标基因在不同管中进行反应。大豆内标基因探针标记与玉米内标基因探针标记为VIC-TAMRA，转化体探针标记FAM-BHQ1。
1.3数字PCR反应体系配置
配置反应体系所加试剂如下所示：(1)DNA溶液，1μL；(2)引物F、R各1μL；(3)探针0.5μL；(4)2×ddPCR Mix，10μL；(5)ddH2O，6.5μL。
每管DNA做8个平行，配置10×PCR反应体系。配置体系如表1所示：
表1数字PCR反应体系
Figure BDA0001653517810000041
1.4 PCR扩增条件
本次定值每管DNA样品做8个平行。PCR反应扩增条件如表2所示。
表2数字PCR反应参数
Figure BDA0001653517810000042
Figure BDA0001653517810000051
实施例2
数字PCR法分别测试两种转基因大豆样品中内源基因DNA与外源基因DNA的拷贝数，并采用两种计算方式对数字PCR拷贝数结果进行计算。一种采用本发明中含量计算方法(表示为A)，另一种常规的采用人为的定值方式即外源拷贝数与内源拷贝数的直接比值(表示为B)，具体结果如表3、表4所示。
表3数字PCR拷贝数原始结果
Figure BDA0001653517810000052
表4两种方法计算结果
Figure BDA0001653517810000053
由表4可知，两种计算方式得到的均值相近，但标准偏差(SD)以及相对标准偏差(CV)的结果中本专利发明的方法比常规方法低一个数量级，表明本专利发明的计算方法得到的结果更精密、更准确。
实施例3
1、实验方案
本方案针对2个转基因水稻样品，分别标为转基因水稻样品1、转基因水稻样品2。
定值仪器为实时荧光定量PCR仪。
1.1 DNA模板稀释
转基因水稻样品1和转基因水稻样品2，需经提取DNA再进行测试。提取后，浓度稀释至25ng/μL待用。
1.2引物/探针
本次定值配置的PCR反应体系，外源基因和内标基因在不同管中进行反应。将引物、探针用灭菌的双蒸水溶解，并稀释至10μmol/L，-20℃保存，探针需避光保存。
1.3转基因水稻标准曲线制备
转基因水稻样品稀释梯度：标准曲线设置的浓度梯度是100ng、10ng、1ng、0.1ng和0.01ng；通过梯度稀释制备，方法如下：取15μl 100ng/μL标准溶液，加15μl的ddH2O(或0.1xTE)混匀，稀释成50ng/μL溶液；取10μl 50ng/μL标准溶液，加90μl的ddH2O(或0.1xTE)混匀，稀释成5ng/μL溶液；取10μl5ng/μL标准溶液，加90μl的ddH2O(或0.1xTE)混匀，稀释成0.5ng/μL溶液；取10μl 0.5ng/μL标准溶液，加90μl的ddH2O(或0.1xTE)混匀，稀释成0.05ng/μL；取10μl 0.05ng/μL标准溶液，加90μl的ddH2O(或0.1xTE)混匀，稀释成0.005ng/μL溶液。每个反应加2μL DNA模板。
1.4实时定量PCR反应体系配置
每个样品进行3次提取，测量3次。即制备3条标准曲线，测定3个样品，且每次组内进行3个重复
实时定量PCR反应配置体系如表5所示：
表5实时定量PCR反应配置体系
Figure BDA0001653517810000071
1.5实时定量PCR反应扩增条件
表6 PCR反应扩增条件
Figure BDA0001653517810000072
实施例4
实时定量PCR法分别测试两种转基因水稻样品中内源基因DNA与外源基因DNA的拷贝数，并采用两种计算方式对实时定量PCR拷贝数结果进行计算。一种采用本发明中新的转基因含量计算方法(表示为A)，另一种常规的采用人为的定值方式即外源拷贝数与内源拷贝数的直接比值(表示为B)，具体结果如表7、表8所示。
表7数字PCR拷贝数原始结果
Figure BDA0001653517810000081
表8两种方法计算结果
Figure BDA0001653517810000082
由表8可知，两种计算方式得到的均值相近，但标准偏差(SD)以及相对标准偏差(CV)的结果中本专利发明的方法比常规方法低一个数量级以上，表明本专利发明的计算方法得到的结果更精密、更准确。

Claims (3)

1.一种生物技术产品DNA含量估计方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)实时荧光定量PCR或数字PCR的样品中DNA样品相对百分含量从以下公式得到：
Figure FDA0003038138970000011
所述X为检测外源基因拷贝数；所述Y为检测内标准基因拷贝数；
(2)X和Y为随机变量，根据以下展开公式计算两变量比值的平均值及标准偏差；
Figure FDA0003038138970000012
Figure FDA0003038138970000013
(3)μX和μY分别用外源基因和内标准基因重复平均数的估算值来评价，Var[X]和Var[Y]也用重复数据的误差来评价；假定X和Y间的互作误差忽略不计；单次检测的相对误差通过下面公式计算：
Figure FDA0003038138970000014
(4)多次重复实验，这里用n表示重复的次数；则n次重复均值的近似均数和误差为：
Figure FDA0003038138970000015
Figure FDA0003038138970000016
N个重复样品的相对标准偏差
Figure FDA0003038138970000017
则可以用(5)和(6)来计算：
Figure FDA0003038138970000021
2.根据权利要求1所述的一种生物技术产品DNA含量估计方法，其特征在于，所述估计方法需要的外源基因拷贝数检测与内标准基因拷贝数检测是独立进行。
3.根据权利要求1所述的一种生物技术产品DNA含量估计方法，其特征在于，对于多次重复实验，需计算外源基因拷贝数与内标准基因拷贝数的重复平均数μX和μY以及重复数据的误差来评价Var[X]和Var[Y]，随后进行两个变量比值的均值和误差计算。
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