CN111718978B - 基因扩增参考品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因扩增参考品及其应用。该方法包括：将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；分别测定初始扩增阳性参考品和野生型基因组DNA中，靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，扩增倍数指靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；将相同DNA质量体积浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得扩增倍数为Z的基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T＝S×(X‑Z)/[(1+S)×(Z‑Y)]。该方法具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。

Description

基因扩增参考品及其应用

技术领域

本发明涉及参考品领域，具体而言，涉及一种基因扩增参考品及其应用。

背景技术

在癌症治疗领域，多个基因在其发生基因扩增(gene amplification，指基因拷贝数异常增多)时与癌症靶向治疗药物的疗效密切相关，例如乳腺癌中HER2基因扩增与曲妥珠单抗(一种抗体靶向药物)、肺癌中MET基因扩增与克唑替尼(一种小分子靶向药物)的疗效密切相关。因此基因扩增检测具有重要的临床意义，基因扩增检测技术业已在临床得到应用。

在基于核酸水平的基因扩增检测技术和产品的开发及验证过程中，需要对开发的技术和产品的多项分析性能指标进行评估。对于定性检测试剂，评估指标一般包括：精密度、阳性符合率、阴性符合率、分析特异性、最低检测限等，而在评估过程中均需要使用含有靶基因扩增的参考品。这类参考品的特征是：(1)参考品的基因构成特征应尽可能模拟临床样本；(2)靶基因相对于参照基因(参照基因是基因组中未发生基因扩增/缺失的基因)拷贝数具有已知的不同水平的扩增倍数(扩增倍数指的是靶基因相对于参照基因拷贝数的倍数)。具体来说，在精密度评估中，需要同时使用靶基因扩增倍数为低水平、中或高水平的参考品分别进行批内、批间、日内、日间，由不同人、在不同地点、使用不同批次试剂进行反复测试，从而评估检测试剂的精密度(包括重复性、重现性)；在阳性符合率评估中，需要同时使用靶基因扩增倍数为高水平、中水平、低水平的参考品进行测试；在最低检测限评估中，需要同时使用靶基因扩增倍数从高到低的一系列参考品进行测试，将阳性检出率至少为95％的最低扩增倍数作为检测试剂的最低检测限。注：参考品中靶基因扩增倍数处于低、中、高水平，一般情况下分别指的是靶基因扩增倍数为2～6、6～10、10以上。

由此可见，基因扩增参考品是基因扩增检测技术和产品开发及分析性能评估过程中最为重要的实验材料和测试工具，旨在确保基因扩增检测技术和产品开发的有效性；基于基因扩增参考品制成的基因扩增标准品或标准物质，也是基因扩增检测结果溯源性的重要保障。

目前，获取基因扩增参考品的方式包括外购和自制。外购参考品所面临的困难是：目前国内外鲜有基因扩增参考品/标准品的制造商，且这类参考品/标准品涵盖的基因种类很少、价格非常昂贵，对于一项完善的基因扩增检测技术和产品的分析性能评估而言，需要用到大量的参考品，如果外购参考品完成实验则需要耗费巨资。自制参考品尽管可以涵盖更多的基因种类，且制备成本也比外购大大降低，但依然面临困难：受限于实验者的技术水平和质量意识，有的制备流程过于简单缺乏定量过程，有的制备流程过于复杂导致验证用试剂成本高、周期长，可以说是乱象丛生。

在自制基因扩增参考品的过程中，需要设置由高到低的一系列靶基因扩增倍数水平，从而获得一套完整的基因扩增参考品，用于完成不同的分析性能评估项目。

由于来自临床样本或细胞系的、靶基因发生扩增的样本可用的量非常有限，难以提供来源稳定、满足源源不断需求的量的参考品，且采用临床样本或细胞系的、靶基因发生扩增的样本配制出的基因扩增参考品中靶基因的扩增倍数，无法超过初始临床样本或细胞系中靶基因的扩增倍数，也给参考品中靶基因扩增倍数的设置带来了局限性。因此，常使用通过分子克隆构建的靶基因质粒、PCR产物、核酸合成基因等方式来获取靶基因DNA，进而配出靶基因扩增参考品。另外，由于参考品应尽可能模拟实际样本的基因构成，而质粒、PCR产物等阳性DNA中虽含有靶基因部分序列但无法涵盖整个基因组，因此常常通过混合阳性DNA与基因组DNA的方式来制备基因扩增参考品。

为了得到目标所需的较低扩增倍数的参考品，常规方法是：将靶基因扩增倍数较高的参考品与野生型基因组DNA分别按照不同比例进行混合，再将制备得到的一系列候选参考品一同进行扩增倍数的定量，最后找到扩增倍数符合需求的参考品投入使用。这种常规制备方法面临的困境是：

(1)如果在基因扩增参考品的制备过程中缺乏定量过程，那么基因扩增参考品中的靶基因实际扩增倍数可能大大偏离预期，所制备出的参考品无法保证其准确性，从而造成使用这些参考品得到的实验结果失真、实验结果的有效性也就无从谈起。

(2)目前对于基因扩增参考品中的靶基因相对于参照基因拷贝数倍数的精确定量，常用数字PCR、高通量测序(NGS)等技术方法实现，每个测定反应的实验周期较长、测试试剂费用较高，因此，在制备基因扩增参考品时，如果按照常规方法先配制出多个梯度作为候选参考品，然后再逐一测定这些候选参考品中的靶基因扩增倍数，则导致参考品配制过程复杂、靶基因扩增倍数定量的样品较多也导致验证过程长、验证费用高，从而大大制约了基因扩增参考品的制备效率。

鉴于此，目前亟需提供一种快速、简便、准确的制备基因扩增参考品的方法。特提出本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基因扩增参考品及其应用，以提供一种快速、简便、准确的制备基因扩增参考品的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种制备基因扩增参考品的方法，该方法包括：将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；分别测定初始扩增阳性参考品和野生型基因组DNA中，靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，其中，扩增倍数指靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；将相同DNA质量体积浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得扩增倍数为Z的基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T＝S×(X-Z)/[(1+S)×(Z-Y)]。

进一步地，基因扩增阳性DNA通过以下任一方式获得：(1)通过分子克隆技术构建含有靶基因扩增序列的质粒，并提取质粒DNA；(2)通过PCR获得含有靶基因扩增序列的PCR产物，并纯化PCR产物DNA；(3)通过核酸合成的方式获得含有靶基因扩增序列的双链DNA，并纯化DNA。

进一步地，将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品包括：根据预期的初始扩增阳性参考品中靶基因的目标扩增倍数，估算基因扩增阳性DNA的质量体积浓度，并配制估算所得质量体积浓度的基因扩增阳性DNA；将估算配制所得的基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品。

进一步地，1：S的体积比为1：1～1：10；优选地，若初始扩增阳性参考品中靶基因的扩增倍数X低于目标扩增倍数，方法还包括：调整1：S的体积比以加大基因扩增阳性DNA的比例，并重复测定初始扩增阳性参考品中靶基因的扩增倍数X。

进一步地，野生型基因组DNA从细胞系或临床样本中提取得到。

进一步地，野生型基因组DNA是组织DNA或细胞游离DNA。

进一步地，通过数字PCR或高通量测序的方法分别测定初始扩增阳性参考品和野生型基因组DNA中靶基因的扩增倍数。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种基因扩增参考品，该基因扩增参考品通过上述任一种方法制备得到。

根据本发明的第三个方面，提供了一种基因扩增检测试剂，该试剂包括基因扩增参考品，基因扩增参考品通过上述任一种方法制备得到。

根据本发明的第四个方面，提供了一种基因扩增检测试剂盒，该试剂盒包括基因扩增参考品，基因扩增参考品通过通过上述任一种方法制备得到。

应用本发明的技术方案，通过先将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按1：S的任意比例混合得到高扩增倍数参考品，以此作为初始扩增阳性参考品，根据目标所需扩增倍数，只需按照本申请的计算公式进行一步操作即可稀释至目标所需的低扩增倍数参考品，无需对稀释得到的参考品再进行扩增倍数验证，相对于常规方法，也无需先稀释出多个扩增倍数梯度然后再逐一验证，具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

基因扩增：本申请中专指基因拷贝数异常增多的情况。

质量浓度：本申请中的质量浓度或质量体积浓度，均是指质量体积浓度，单位为g/μL或ng/μL。

如背景技术中提到的，现有技术中在制备基因扩增参考品时，通常需要先获得高扩增倍数参考品，然后再与野生型基因组DNA按梯度混合，然后再经过数字PCR(既包括微滴式的数字PCR，也包括非微滴式数字PCR(例如芯片式的))或高通量测序验证等一系列过程来获得目标扩增倍数的参考品，不仅制备过程繁琐、耗时长且成本高，为了改善这一状况，本申请提出了一种快速制备基因扩增参考品的方法，该方法包括：将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；分别测定初始扩增阳性参考品和野生型基因组DNA中靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，其中，扩增倍数指靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；将相同DNA质量浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得扩增倍数为Z的基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T＝S×(X-Z)/[(1+S)×(Z-Y)]。

该方法，通过先将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按1：S的任意比例混合得到高扩增倍数参考品，以此作为初始扩增阳性参考品，根据目标所需扩增倍数，只需按照上述计算公式进行一步操作即可稀释至目标所需的低扩增倍数参考品，无需对稀释得到的参考品再进行扩增倍数验证，相对于常规方法，也无需先稀释出多个扩增倍数梯度然后再逐一验证，具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。

上述得到初始扩增阳性参考品是，1：S的体积比可以是任意比例，比如1:1～1:10之间的任意一个比例。可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等等，也可以是1:1.5、1:2.5、1:3.5、1:4.5。具体比例可以根据计算方便、基因扩增阳性DNA的质量体积浓度、混合操作的习惯等进行确定。

为方便理解配制初始扩增阳性参考品的步骤，结合以下案例进行示例性说明：

1.将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA，按照1:S的体积比混合得到初始扩增阳性参考品。

2.根据拷贝数估算，配制出所需DNA质量浓度的、所含靶基因扩增倍数较高的基因扩增参考品，即初始扩增阳性参考品。根据实际需要设定初始扩增阳性参考品中的靶基因扩增倍数，一般情况下为10～20，这样便于后续用其继续配制得到靶基因扩增倍数为中或低水平的参考品。拷贝数估算所用的参数包括：

(1)在野生型基因组DNA中，野生型靶基因或参照基因的含量约为330拷贝/ng。

(2)基因扩增阳性DNA(质粒、PCR产物或核酸合成DNA)中的靶基因拷贝浓度(拷贝/μL)＝靶基因DNA质量浓度/分子量×阿伏伽德罗常数。其中DNA质量浓度由上述流程测定，单位为g/μL；分子量可由质粒、PCR产物或核酸合成DNA的碱基序列精确计算得到，单位为g/mol。

详细示例如下：如果需要配制出10ng/μL靶基因扩增倍数为10的初始扩增阳性参考品(根据自身实验所需确定需要配制的初始扩增阳性参考品的靶基因扩增倍数。一般需要从高到低设计一组梯度，例如在做检测限评估实验时)，则可将野生型基因组DNA稀释至20ng/μL，然后与一定浓度的基因扩增阳性DNA按1:1(此时S＝1)的体积比混合；所需基因扩增阳性DNA浓度的计算过程为：由于靶基因扩增倍数为10，所以靶基因拷贝浓度≈10×基因组DNA中参照基因拷贝浓度＝10×10ng/μL×330拷贝/ng＝33000拷贝/μL＝靶基因DNA质量浓度/分子量×阿伏伽德罗常数/2，再根据已知的分子量即可计算出配制所需的靶基因DNA的质量浓度，例如当靶基因DNA的分子量为3300000g/mol时，按前述公式计算出靶基因DNA质量浓度约为3.6×10^-4ng/μL。

上述示例中，S值和预期的初始阳性参考品中的扩增倍数这两个参数确定下来后，阳性DNA的质量浓度也就能通过估算基本确定下来了。此处有两层含义：(1)借助估算过程来配制初始阳性参考品，是为了避免配出的初始阳性参考品中的扩增倍数过于偏离预期。(2)由于DNA质量浓度的测定可能存在误差，所以随后还需要用数字PCR或NGS对靶基因扩增倍数进行精确定量。另外，S值理论上的确可以任意取值，实践中主要根据计算方便和习惯进行确定。

上述测定初始扩增阳性参考品、野生型基因组DNA中靶基因的实际扩增倍数的步骤中，可以通过数字PCR或高通量测序等技术方法准确测定。由于初始扩增阳性参考品是根据理论估算的参数配制的，为了确保参考品扩增倍数的准确，使用数字PCR或高通量测序等技术方法测定初始扩增阳性参考品中靶基因相对于参照基因的倍数，即实际的扩增倍数，分别为X、Y。如果X低于预期，可加大基因扩增阳性DNA的用量重新配制初始扩增阳性参考品，并测定实际扩增倍数。

上述将相同DNA质量浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1:T的体积比混合，即可仅通过一步制备出所需扩增倍数为Z的基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，并且T＝S×(X-Z)/[(1+S)×(Z-Y)]。该方法可以配制出不超过初始扩增阳性参考品扩增倍数的任意目标所需扩增倍数的靶基因扩增参考品。

上述基因扩增阳性DNA，指仅含有靶基因发生基因扩增的DNA，也即，不含有参照基因的DNA。本申请中的参照基因是指在基因组中既未发生基因扩增，也未发生基因缺失的基因。具体的参照基因可以根据研究目的和实际需要的不同，进行合理选择。比如某些看家基因，如GAPDH。基因扩增阳性DNA的具体获得方式不限，只要是仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA即可。在本申请中，其可以通过以下任一方式获得：

(1)通过分子克隆技术构建含有靶基因扩增序列的质粒，并提取质粒DNA；具体地，质粒中的插入片段序列和长度应满足后续测定参考品扩增倍数的数字PCR或高通量测序技术所需；

(2)通过PCR获得含有靶基因扩增序列的PCR产物，并纯化PCR产物DNA；具体地，PCR产物的序列和长度应满足后续测定参考品扩增倍数的数字PCR或高通量测序技术所需；

(3)通过核酸合成的方式获得含有靶基因扩增序列的双链DNA，并纯化DNA；具体地，合成DNA的序列和长度应满足后续测定参考品扩增倍数的数字PCR或高通量测序技术所需。

上述野生型基因组DNA可以从细胞系或临床样本中提取得到。具体地，可通过商品化试剂盒提取体外培养的细胞系或临床样本中的野生型基因组DNA，并通过适当的方法(例如微量分光光度计、荧光染料法等)测定DNA的质量浓度。

野生型基因组DNA的具体形式可以是gDNA，也可以是细胞游离DNA(cfDNA)，此处的细胞游离DNA可以是gDNA打断成短片段模拟的cfDNA。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种基因扩增参考品，该基因扩增参考品通过上述任一种方法制备得到。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种基因扩增检测试剂，该试剂包括基因扩增参考品，基因扩增参考品通过上述任一种方法制备得到。

在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种基因扩增检测试剂盒，试剂盒包括基因扩增参考品，基因扩增参考品通过上述任一种方法制备得到。

本申请的方法得到的基因扩增参考品，扩增倍数准确性好，配制后无需再次通过数字PCR等方法确认结果，相对于常规方法大大节省了验证所需的步骤和费用，且多批次独立配制参考品结果的重现性强，非常适合实际应用(例如配制量不足时可再次按T值配制，配出后也无需通过数字PCR再次验证扩增倍数)。将其单独做出参考品、甚至标准品或设计成试剂盒，能够更方便使用。

下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1

HER2基因扩增参考品的制备和验证

1.采用本发明所述的方法，提取FISH(荧光原位杂交)方法检测HER2基因扩增为阴性的乳腺癌临床组织样本的基因组DNA(gDNA)，也可将基因组DNA通过超声仪(Covaris)制备成cfDNA。将DNA统一稀释至10ng/μL。

2.根据数字PCR反应体系中HER2特异性引物探针序列，采用常规分子克隆技术，构建含有HER2扩增序列(且不含参照基因扩增序列)的质粒，提取质粒DNA，采用分光光度计测定质粒的质量体积浓度为120ng/μL，根据预期初始阳性参考品中HER2的扩增倍数为10，混合比例按1:1进行估算，在混合前需要将质粒的质量体积浓度稀释为1.8×10^-4ng/μL(由于提取出的质粒DNA测出的质量浓度一般在20～500ng/μL范围内。估算后，质粒的使用浓度很低，如前文示例中，一般在10^-4ng/μL左右，因此说，混合前会将质粒稀释到一个特定浓度)。

3.采用本发明所述的方法，将上述质粒DNA与野生型基因组DNA或野生型cfDNA，按照1:1(即S＝1)的体积比混合得到初始扩增阳性参考品，其DNA质量体积浓度为5ng/μL(由于用于混合的质粒DNA的质量浓度很低，一般在10^-4ng/μL左右，在初始扩增阳性参考品中质粒DNA的质量浓度远远低于其中野生型基因组DNA的质量浓度，因此，初始扩增阳性参考品中的DNA质量浓度，可以基本等同于其中野生型基因组DNA的质量浓度，也就是说，质粒DNA对于参考品的DNA质量浓度来说可以忽略不计)。

4.通过数字PCR方法测定初始扩增阳性参考品、野生型基因组DNA中HER2基因相对于参照基因(ACTB)的扩增倍数(见下表)。

表1：

样本	野生型DNA类型	初始扩增倍数
			初始扩增阳性样本	gDNA	15.8
野生型样本	gDNA	1.1
			初始扩增阳性样本	cfDNA	14.7
野生型样本	cfDNA	1.1

5.采用本发明所述的方法，分别计算配制到HER2基因扩增倍数为10、5、2.5、1.5的gDNA或cfDNA参考品所对应的T值(见下表)。

表2：

6.按照上表计算出的T值，分3个批次，分别独立制备出扩增倍数为10、5、2.5、1.5的参考品，再次用数字PCR方法验证配出的参考品中HER2基因的实测扩增倍数是否符合预期，结果见下表。

表3：

以上结果显示配制得到的HER2基因扩增参考品实测扩增倍数均在目标扩增倍数的±10％以内，表明了采用本申请的方法制备得到的基因扩增参考品的扩增倍数准确性好，配制后无需再次通过数字PCR等方法确认结果，相对于常规方法大大节省了验证所需的步骤和费用(节省时间约1周、节省试剂成本3万元)，且多批次独立配制参考品检测扩增倍数的批间CV％均低于5％，表明本发明所述方法的重现性强，非常适合实际应用(例如配制量不足时可再次按T值配制，配出后也无需通过数字PCR再次验证扩增倍数)。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

(1)本发明针对质粒、PCR产物、核酸合成DNA均适用，因此可根据需要，构建出含有任意靶基因的DNA，进而配制出含有所需靶基因任意扩增倍数的基因扩增参考品。

(2)本发明制备的基因扩增参考品含有基因组DNA成分，可最大程度模拟实际临床DNA样本的特征，避免了参考品与实际临床样本之间在序列构成等性质方面的差异。

(3)本发明采用了数字PCR或高通量测序等技术精确测定参考品中的靶基因相对于参照基因拷贝数的倍数，相对于仅进行理论估算的配制方式而言，本发明对参考品中靶基因实际扩增倍数的确定更加准确、客观。

(4)采用本发明，仅需针对最少两例初始参考品进行靶基因扩增倍数的测定，随后仅需采用一步，即可配制得到不超过初始靶基因扩增倍数的、任意较低扩增倍数的参考品，配制过程非常快速、简单，配制时间短。

(5)本发明所述的基因扩增参考品配制方法，无需针对配制后得到的较低扩增倍数的参考品再次进行扩增倍数的实际测定，相对于常规方法，省去了先制备出多个含有不同扩增倍数梯度的参考品然后再逐一对其扩增倍数进行测定的繁杂过程，具有快速、简单、验证费用低、重现性强的优点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种制备基因扩增参考品的方法，其特征在于，所述方法包括：

将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品；所述基因扩增阳性DNA指仅含有发生基因扩增的靶基因的DNA；

分别测定所述初始扩增阳性参考品和所述野生型基因组DNA中，所述靶基因的扩增倍数，并分别记为X和Y，其中，所述扩增倍数指所述靶基因的拷贝数与参照基因的拷贝数的比值；

将相同DNA质量体积浓度的初始扩增阳性参考品与野生型基因组DNA按1：T的体积比混合，获得所述扩增倍数为Z的所述基因扩增参考品，其中Z为满足0<Y<Z<X的任意数值，且T=S×(X-Z)/[(1+S)×(Z-Y)]。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因扩增阳性DNA通过以下任一方式获得：

（1）通过分子克隆技术构建含有靶基因扩增序列的质粒，并提取质粒DNA；

（2）通过PCR获得含有靶基因扩增序列的PCR产物，并纯化PCR产物DNA；

（3）通过核酸合成的方式获得含有靶基因扩增序列的双链DNA，并纯化DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将基因扩增阳性DNA与野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品包括：

根据预期的所述初始扩增阳性参考品中所述靶基因的目标扩增倍数，估算所述基因扩增阳性DNA的质量体积浓度，并配制估算所得质量体积浓度的所述基因扩增阳性DNA；

将估算配制所得的所述基因扩增阳性DNA与所述野生型基因组DNA按照1：S的体积比混合，得到初始扩增阳性参考品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述1：S的体积比为1：1~1：10。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，若所述初始扩增阳性参考品中所述靶基因的扩增倍数X低于所述目标扩增倍数，所述方法还包括：调整所述1：S的体积比以加大所述基因扩增阳性DNA的比例，并重复测定所述初始扩增阳性参考品中所述靶基因的扩增倍数X。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述野生型基因组DNA从细胞系或临床样本中提取得到。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述野生型基因组DNA是组织DNA或细胞游离DNA。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，通过数字PCR或高通量测序的方法分别测定所述初始扩增阳性参考品和所述野生型基因组DNA中所述靶基因的扩增倍数。