CN107739760A - 一种用于her‑2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于her‑2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor‑2，HER‑2)的核酸序列及试剂盒，属于分子诊断技术领域。本发明提供的检测HER‑2的引物及探针能特异地扩增并检测HER‑2基因的扩增。本发明还公开了一种基于微滴式数字PCR系统的检测HER‑2基因的检测试剂盒，能实现快速、灵敏、准确的检测HER‑2基因的扩增。本发明具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，可用于临床HER‑2基因扩增的快速检测，为临床人表皮生长因子受体2的诊断和治疗提供参考依据。

Description

一种用于HER-2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种用于HER-2基因拷贝数扩增检测的核苷酸序列、试剂盒及其应用。
背景技术
人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因位于染色体17q12-q21，其编码产物为185kD的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720-987位属于酪氨酸激酶区。HER-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体(EGFR)家族成员，与EGFR高度同源。研究证实，HER-2介导的信号传导与多种肿瘤的形成、增殖、转移、侵袭及放化疗耐药有关。以往其相关研究多集中于乳腺癌和卵巢癌。近年的研究显示，HER-2在胃癌中也存在高表达，有望成为一个新的基因治疗靶点。
原瘤基因HER-2/neu的研究是当前研究的热点之一。目前女性乳腺癌中,有25％～30％的病人有这种基因扩增。文献报道15％～20％的浸润性乳腺癌和多达60％的导管原位癌有HER-2/neu基因和蛋白的表达。大规模研究证实HER-2阳性的肿瘤不仅其预后较差，而且复发的风险显著增加，主要表现在基因扩增与乳腺癌的复发、转移有关。近年来，随着医疗技术的进步，以HER-2为靶点的靶向治疗药物——曲妥珠单抗(罗氏制药，中文商品名：赫赛汀)。该药物通过抑制细胞活化信号的传递,用于治疗HER-2高表达的乳腺癌患者，不仅显著减少了肿瘤的转移和复发率，也提高了患者的生存质量。随机对照临床研究已证实，抗HER-2单克隆抗体曲妥珠单抗联合化疗在HER-2过表达晚期胃癌中的疗效显著优于单纯化疗。赫赛汀以HER-2为治疗靶点，若要筛选可受益于赫赛汀治疗的患者，必须进行HER-2基因检测。对于乳腺癌的治疗和预后均具有重要意义。
目前，临床上检测HER-2状态的常用方法有免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)和荧光原位杂交法(fluorescence in situhybridization，FISH)。IHC是基于抗体在蛋白(基因产物)水平上检测HER-2的状态，该法易于开展，已被广泛使用，但技术本身受组织固定、抗原修复、一抗的灵敏度和特异度、染色结果评定等多种变量的影响，使得结果不够准确和稳定，尤其对HER-2轻、中度表达的样本易产生假阴性。FISH是基于探针直接在DNA(基因)水平上检测HER-2的状态，该法灵敏、准确、可靠，结果具有高度的可重复性。但FISH依赖于制作的探针质量和样本前期制片质量，同时还受17号染色体多倍体干扰，且检测流程长，操作复杂，结果分析困难，技术难度和成本均较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种操作简便、结果准确、成本低廉和高通量的新型HER-2基因扩增检测试剂盒，满足临床HER-2诊疗需求。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于特异检测HER-2基因扩增的引物和探针，具体包括如下：
(1)扩增HER-2基因扩增的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；
(2)扩增HER-2基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(3)扩增21-TFF3-S基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示；
(4)扩增21-TFF3基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
(5)扩增21-TFF3-L基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示；
其中，HER-2探针SEQ ID NO：3序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，21-TFF3基因探针SEQ ID NO：6序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。上述8条核酸序列在一次2孔检测中使用。
本发明还公开一种用于检测HER-2基因扩增的试剂盒，包括如下试剂组分：
(1)2*supermix：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等；
(2)引物探针预混合液：将SEQ ID NO：1～8所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；1～3各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；4～6各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；6～8各核酸序列的母液以25:9:9的比例混合，最终形成引物/探针在反应体系中的浓度为900/250nM。
(3)阳性对照：FISH检测为HER-2基因簇状扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)；
(4)阴性对照：FISH检测为HER-2基因不扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)。
本发明的另一技术方案为：将HER-2基因扩增检测试剂盒，用于临床FFPE样本HER-2基因扩增检测，主要步骤如下：
1)抽提FFPE中的DNA；
2)用上述设计的试剂盒进行HER-2基因扩增检测。
3)将扩增完毕的PCR板放入微滴读取仪，对每一扩增完的样本进行微滴读取仪的荧光分析，在阴阳性对照结果正常的前提下，分别计算样本反应孔中HER-2基因拷贝数(FAM通道，蓝色荧光)/21-TFF3-S基因拷贝数(VIC通道，绿色荧光)和HER-2基因拷贝数(FAM通道，蓝色荧光)/21-TFF3-L基因拷贝数(VIC通道，绿色荧光)，最终得出样本中HER-2基因的准确扩增状态。
作为优选，所述扩增体系如下：2*supermix 10μl，引物探针预混合液2μl，标本抽提模板DNA 8μl，总体系20μl；所述PCR扩增条件为：95℃10min；40个循环(94℃15s，55℃60s)，98℃10min；4℃，hold。
本试剂盒的有益效果：
1)本发明中采用一种基于微滴式数字PCR系统的检测体系，将每一样本的20μl反应液通过乳化分成20000个独立的微滴，对浓度较低的样本来说，每个微滴中包含的HER-2或21-TFF3拷贝数为1或0，通过专用软件自动检测每个微滴的荧光信号，再计数总的阳性微滴数，就能得到准确的HER-2拷贝数，浓度较高的样本只需进行一定比例的稀释，也能得到准确的结果。
2)目前临床上乳腺癌标本应用IHC+FISH相结合的检测方法，其中IHC 2+为HER-2不确定病例，需进一步应用FISH的方法进行HER-2基因扩增状态检测，其中占比约30～40％的样本，而本发明中设计引物和探针时，设计了三对引物和探针序列，采用两条不同长度的引物(21-TFF3-S、21-TFF3-L)分别与HER-2基因组合双孔双通道检测，可以将不确定的比率降低至10％左右，很大程度上减少了FISH检测的成本；同时对于数字PCR方法检测出的阳性和阴性结果的样本，可以直接发布结果，最大程度的提高了发布报告的时间，为临床医生提供快速、准确的辅助用药指导。
3)本发明所述的试剂盒及微滴式的数字PCR检测系统配制简单，整个流程自动化程度高，效果好，操作非常简便易上手，适宜临床应用及推广。
附图说明
图1为阳性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测HER-2拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的蓝色荧光点即为HER-2阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因人21-TFF3基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为21-TFF3基因阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度。
图2为阴性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测HER-2拷贝数，无阳性微滴，荧光信号均低于2000；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因人21-TFF3基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为21-TFF3基因阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度。
图3为1例HER-2患者检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测HER-2拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的蓝色荧光点即为HER-2阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因人21-TFF3基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为21-TFF3基因阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度。该患者FFPE中RS比值为2.6：RL比值为：3.7。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明。
实施例1：检测HER-2和人基因21-TFF3的引物和探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列如下，：
扩增HER-2的引物：
F1(SEQ ID NO：1)：5′-tcactcatatcctcctctttctgc-3′；
R1(SEQ ID NO：2)：5′-aattttcacattctccccatcag-3′；
检测HER-2的探针：
P HER-2(SEQ ID NO：3)：5′-cagggcatctggatc-3′；
其中，HER-2探针P HER-2(SEQ ID NO：3)序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。
扩增人21-TFF3-S基因的引物：
F3(SEQ ID NO：4)：5′-gcctggatcttgcctggag-3′；
R3(SEQ ID NO：5)：5′-aaatcctaatgcttggggcac-3′；
检测人21-TFF3基因的探针：
P21-TF F3(SEQ ID NO：6)：5′-ccagttacatcagggca-3′；
其中，人21-TFF3基因探针P21-TFF3(SEQ ID NO：6)序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。
扩增人21-TFF3-L基因的引物：
F3(SEQ ID NO：7)：5′-ccagcagtgagtgacaaagca-3′；
R3(SEQ ID NO：8)：5′-tgcagcccattagaatcacct-3′；
实施例2：HER-2基因扩增剂盒的制备方法。
(1)PCR反应液：2*supermix(购于美国Bio-rad公司，货号186-3026)，为2*PCR反应预混液，其中含有DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等组分，-20℃保存；
(2)引物探针预混合液：将SEQ ID NO：1～8所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；1～3各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；4～6各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；6～8各核酸序列的母液以25:9:9的比例混合，最终形成引物/探针在反应体系中的浓度为900/250nM。-20℃保存；
(3)阳性对照：FISH检测为HER-2基因簇状扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE),4℃保存；
(4)阴性对照：FISH检测为HER-2基因不扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)，4℃保存。
实施例3：检测方法。
仪器：Eppendorf Mastercycler pro S定性PCR仪，Bio-rad QX200微滴式数字PCR系统(包括微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪)，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器(太仓华利达)，低速板式离心机(安徽中佳)。
1.HER-2样本、阳性对照、阴性对照DNA模板的制备：采用QIAGEN公司QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(货号157017130)，按照试剂盒说明书操作。
2.以步骤(1)得到的核酸为模板，利用3对特异性引物和2条特异荧光探针进行HER-2和21-TFF3基因的扩增检测，具体包括如下步骤；
(1)PCR反应液配制：从-20℃冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液Xμl*2孔：
X1＝(10μlPCR反应液+2μl引物探针预混合液)×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。
X2＝(10μlPCR反应液+2μl引物探针预混合液)×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。
振荡混匀后，10000rpm瞬时离心10s，按每人份12μl分装到八联PCR反应管中，传至样本制备区备用。
(2)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入HER-2样本、阳性对照、阴性对照DNA模板8μl(若模板保存在-20℃，使用前置室温解冻，以10000rpm离心10s)，空白对照孔加入8μl双蒸水。盖上八联管盖，涡旋震荡，板式离心机2000rpm离心1min。
(3)微滴生成：将八联PCR管中的20μl PCR反应液转移至QX200微滴生成仪专用卡夹(共有三行，每行8孔，依次为微滴行、样本行和生成油行)的样品行的8孔中，生成油行对应的8孔加入配套的微滴生成油70μL(Bio-rad公司，货号1863005)，放入微滴生成仪中，自动生成微滴于上方微滴行；
(4)PCR扩增：将生成的40μL微滴转移至96孔PCR反应板，封膜仪封铝膜，放入定性PCR仪中，反应条件如下：95℃10min；40个循环(94℃15s，55℃60s)，98℃10min；4℃，hold。扩增完成降至4℃时即可取出。
3微滴读取仪进行结果分析，具体包括如下步骤：
(1)简单设置每个反应孔样本信息，开始运行，仪器会自动对每个孔的约20000个微滴进行荧光读取和分析，并自动计算浓度结果，也可手动微调：
检测合格标准：
阳性对照，RS≥1.8，RL≥2.5；阴性对照RS＜1.8，RL＜2.5；
样本结果：样本中HER-2/21-TFF3基因的准确扩增比值计算公式如下：
样本中HER-2/21-TFF3基因的准确扩增比值＝测试孔HER-2浓度结果(拷贝/μl)/测试孔21-TFF3浓度结果(拷贝/μl)
(2)如果样本中HER-2或者21-TFF3浓度过高，导致测试孔中浓度结果超过5000拷贝/μl，则对应原始样本中超过2*105拷贝/μl，为了达到最佳准确性，需对样本进行稀释10倍，再进行检测。
实施例4：部分临床样本检测
将本发明所述的检测试剂盒用于FISH方法检测确认过的患者样本的检测，方法参照实施例3，结果与市场上现有性能最佳的HER-2基因检测试剂盒(荧光原位杂交法)，美国雅培的HER-2/neu基因检测试剂盒(荧光原位杂交法)进行比对，检测结果如表1：
表1样品检测结果对照表
在对70例临床样本进行的比对实验显示，两种方法学一致性较好，准确率＞90％；目前临床上乳腺癌标本应用IHC+FISH相结合的检测方法，IHC3+为HER-2阳性，IHC 0和1+为HER-2阴性,IHC 2+为HER-2不确定病例，需进一步应用FISH的方法进行HER-2基因扩增状态检测，其中占比约30～40％的样本，而本方法学通过双孔不同大小片段的检测，可以将比率降低至10％左右，即结果中为RS≥1.8，RL＜2.5或者RS＜1.8，RL≥2.5为不确定样本，需进一步进行FISH方法检测，很大程度上减少了FISH检测的成本；同时对于数字PCR方法检测出的阳性和阴性结果的样本，可以直接发布结果，最大程度的提高了发布报告的时间，为临床医生提供快速、准确的辅助用药指导；这样的检测具有操作简便快捷，灵敏、准确度高，成本低、结果判读客观方便，能有利于医师进行快速诊断，及时修正治疗方案。本发明的试剂盒技术门槛低，易于推广，具有很好的应用前景。
序列表
<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司
<120> 一种用于HER-2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcactcatat cctcctcttt ctgc 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattttcaca ttctccccat cag 23
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagggcatct ggatc 15
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcctggatct tgcctggag 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatcctaat gcttggggca c 21
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagttacat cagggca 17
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccagcagtga gtgacaaagc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcagcccat tagaatcacc t 21

Claims (6)

1.一种用于检测HER-2基因扩增的的核酸序列，其特征在于，包括如下引物对及探针：
(1)扩增HER-2基因扩增的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；
(2)扩增HER-2基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(3)扩增21-TFF3-S基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示；
(4)扩增21-TFF3基因的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
(5)扩增21-TFF3-L基因的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示；
其中，HER-2探针SEQ ID NO：3序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，21-TFF3基因探针SEQ ID NO：6序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团，上述8条核酸序列在一次2孔检测中使用。
2.一种用于检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：
(1)2*supermix：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等；
(2)引物探针预混合液：将SEQ ID NO：1～8所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；1～3各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；4～6各核酸序列的母液以9:9:25的比例混合；6～8各核酸序列的母液以25:9:9的比例混合，最终形成引物/探针在反应体系中的浓度为900/250nM。
(3)阳性对照：FISH检测为HER-2基因簇状扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)；
(4)阴性对照：FISH检测为HER-2基因不扩增的福尔马林浸泡的石蜡组织样本(FFPE)。
3.根据权利要求2所述用于检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照中，HER-2基因拷贝数/人21-TFF3-S基因拷贝数RS≥1.8，HER-2基因拷贝数/人21-TFF3-L基因拷贝数RL≥2.5。
4.根据权利要求2所述检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照中，HER-2基因拷贝数/人21-TFF3-S基因拷贝数RS＜1.8，HER-2基因拷贝数/人21-TFF3-L基因拷贝数RL＜2.5。
5.一种权利要求2～4所述的检测HER-2基因扩增的试剂盒在检测HER-2基因准确扩增中的应用，其特征在于，包括以下步骤，1)抽提FFPE中的DNA；
2)用上述设计的试剂盒进行HER-2基因扩增检测；
3)将扩增完毕的PCR板放入微滴读取仪，对每一扩增完的样本进行微滴读取仪的荧光分析，在阴阳性对照结果正常的前提下，分别计算样本反应孔中HER-2基因拷贝数(FAM通道，蓝色荧光)/21-TFF3-S基因拷贝数(VIC通道，绿色荧光)和HER-2基因拷贝数(FAM通道，蓝色荧光)/21-TFF3-L基因拷贝数(VIC通道，绿色荧光)，最终得出样本中HER-2基因的准确扩增状态。
6.根据权利要求5所述的一种检测HER-2基因扩增的试剂盒在检测HER-2基因准确扩增中的应用，其特征在于，所述步骤2)中的扩增体系为：2*supermix10μl，引物探针预混合液2μl，标本抽提模板DNA8μl，总体系20μl；所述PCR扩增条件为：95℃10min；40个循环(94℃15s，55℃60s)，98℃10min；4℃，hold。
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