CN110129446A - 用于人体her2基因扩增状态检测的组合套装 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测人体HER2基因扩增状态的组合套装，所述套装包含DNA提取样本和检测单元。所述DNA提取样本包括用于分离和提取人体HER2基因和参照基因DNA及其片段的组合物。所述检测单元包括用于定量检测人体HER2基因和参照基因DNA及其片段的拷贝数量和比值的核酸。本发明所述组合套装实现了快速、准确的HER2基因扩增状态的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人体HER2基因DNA及其片段扩增状态的组合套装。
背景技术
人体表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2)基因又称HER2基因，定位于染色体17q12-21.32。HER2基因是一种原癌基因，具有抑制凋亡、促进增殖、增加肿瘤细胞侵袭力、促进肿瘤血管新生和淋巴管新生的功能。HER2蛋白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。研究表明30％以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过表达，如：乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等；其中20％～30％的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过表达。HER2基因扩增/过表达不仅与肿瘤的发生发展相关，还是一个重要的临床治疗监测及预后指标，并且是肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点。
发明内容
目前常用的HER2基因扩增/过表达检测方法主要为免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)。由于受FFPE样本处理、HER2抗体选择、判读者经验和习惯等多种因素的影响，使用IHC检测HER2基因扩增/过表达的结果重复性和准确性不佳。而使用FISH检测HER2基因扩增/过表达，则面临操作过程复杂、检测流程时间长、检测试剂成本高、涉及的实验和检测仪器设备昂贵等实际问题。因此，现有HER2基因扩增/过表达的检测方法尚不能很好地满足检测需求。
针对以上技术现状，本发明提供了一种用于检测人体HER2基因扩增/过表达的组合物套装，本发明通过组合套装可以利用数字PCR对人体HER2基因和参照基因DNA及其片段进行定量检测，从而实现HER2基因扩增/过表达的快速、便捷、灵敏、准确的检测。
具体来说，本发明涉及如下内容：
1.一组核酸，其为用于分别定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量的一组核酸，其中，所述参照基因为人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)。
2.根据项1所述的核酸，其中，
所述一组核酸为用于DNA聚合酶链式反应(PCR)以分别扩增所述人体HER2基因及其片段和所述参照基因DNA及其片段的正向和反向引物，
所述正向和反向引物对人体HER2基因DNA及其片段进行PCR扩增的区间位于HER2蛋白编码区(protein coding region)。
3.根据项2所述的核酸，其中，
所述正向和反向引物对人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段进行PCR扩增得到的产物的长度在60个碱基以下；
优选地，其对HER2基因和参照基因进行PCR扩增的产物的长度为40-50个碱基。
4.根据项2或3所述的核酸，其中，
在所述正向或反向引物中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA；
优选地，所述非人源的DNA与现已发现的所有生物DNA序列既不相同，也不互补。
5.根据项4所述的核酸，其中，
所述非人源的DNA的长度为10-30个碱基；
优选地，所述非人源的DNA的长度为15-20个碱基。
6.根据项5所述的核酸，其中，
所述非人源的DNA的序列互补于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的序列，其中，
HER2探针：SEQ ID NO：13
CCTGAACCGCTCTTCGA
CEP17探针：SEQ ID NO：14
CGAAGACGTCGTGTAGG。
7.根据项1～6中任一项所述的核酸，其中，
所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-12序列中至少10个核苷酸长度的核酸，
HER2正向引物-1：SEQ ID NO：1
GGTCACCTACAACACAGACA
HER2反向引物-1：SEQ ID NO：2
TCGAAGAGCGGTTCAGGGATTGGGCATGGACTCAAAC
HER2正向引物-2：SEQ ID NO：3
CCCTCAACCTGCACTATTGA
HER2反向引物-2：SEQ ID NO：4
TCGAAGAGCGGTTCAGGACTAACTCCTGCACAACACA
HER2正向引物-3：SEQ ID NO：5
TGACTGTGTTAGGGAGAGGA
HER2反向引物-3：SEQ ID NO：6
TCGAAGAGCGGTTCAGGCCAAATGGTCTGGCTCTACA
CEP17正向引物-1：SEQ ID NO：7
CACTTTGGAGGTTGGTTAGC
CEP17反向引物-1：SEQ ID NO：8
CCTACACGACGTCTTCGCCCCAGTTGGCTTAGATCCT
CEP17正向引物-2：SEQ ID NO：9
GAGGTTGGTTAGCAGGATCT
CEP17反向引物-2：SEQ ID NO：10
CCTACACGACGTCTTCGAGATGCCACCATGTTTTGG
CEP17正向引物-3：SEQ ID NO：11
AAACAAAGGCACAGCCACTT
CEP17反向引物-3：SEQ ID NO：12
CCTACACGACGTCTTCGCAGTTGGCTTAGATCCTGCTA；
进一步，优选所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-2和7-8序列中至少10个核苷酸长度的核酸。
8.一种用于检测人体HER2基因扩增状态的组合套装，其包括：
一组核酸，其为用于分别定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量的一组核酸，
其中，所述参照基因为人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)及其片段。
9.根据项8所述的组合套装，其还包括：
用于分离和提取人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的检测样本。
10.根据项8或9所述的组合套装，其中，
所述一组核酸为用于DNA聚合酶链式反应(PCR)以扩增人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的正向和反向引物，所述正向和反向引物对人体HER2基因DNA及其片段进行PCR扩增的区间位于HER2蛋白编码区(protein coding region)。
11.根据项8或9所述的组合套装，其中，
所述正向和反向引物对人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段进行PCR扩增得到的产物的长度在60个碱基以下；优选地，其对HER2基因和参照基因进行PCR扩增的产物的长度为40-50个碱基。
12.根据项8或9所述的组合套装，其中，
在所述正向或反向引物中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA；
优选地，所述非人源的DNA与现已发现的所有生物DNA序列既不相同，也不互补。
13.根据项12所述的组合套装，其中，
所述非人源的DNA的长度为10-30个碱基；
优选地，所述非人源的DNA的长度为15-20个碱基。
14.根据项13所述的组合套装，其中，
所述非人源的DNA的序列互补于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的序列，其中，
HER2探针：SEQ ID NO：13
CCTGAACCGCTCTTCGA
CEP17探针：SEQ ID NO：14
CGAAGACGTCGTGTAGG。
15.根据项8或9所述的组合套装，其还包括：
用于检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的PCR扩增产物的荧光探针；
优选所述荧光探针为Taqman探针。
16.根据项15所述的组合套装，其中，
所述的Taqman探针与所述非人源的DNA部分互补；
优选所述的Taqman探针与所述非人源的DNA全部互补。
17.根据项16所述的组合套装，其中，
所述Taqman探针的序列中包括1-3个锁核酸(locked nucleic acid)；
优选所述Taqman探针的序列中包括1个锁核酸。
18.根据项8～17中任一项所述的组合套装，其中，
所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-12序列中至少10个核苷酸长度的核酸，
HER2正向引物-1：SEQ ID NO：1
GGTCACCTACAACACAGACA
HER2反向引物-1：SEQ ID NO：2
TCGAAGAGCGGTTCAGGGATTGGGCATGGACTCAAAC
HER2正向引物-2：SEQ ID NO：3
CCCTCAACCTGCACTATTGA
HER2反向引物-2：SEQ ID NO：4
TCGAAGAGCGGTTCAGGACTAACTCCTGCACAACACA
HER2正向引物-3：SEQ ID NO：5
TGACTGTGTTAGGGAGAGGA
HER2反向引物-3：SEQ ID NO：6
TCGAAGAGCGGTTCAGGCCAAATGGTCTGGCTCTACA
CEP17正向引物-1：SEQ ID NO：7
CACTTTGGAGGTTGGTTAGC
CEP17反向引物-1：SEQ ID NO：8
CCTACACGACGTCTTCGCCCCAGTTGGCTTAGATCCT
CEP17正向引物-2：SEQ ID NO：9
GAGGTTGGTTAGCAGGATCT
CEP17反向引物-2：SEQ ID NO：10
CCTACACGACGTCTTCGAGATGCCACCATGTTTTGG
CEP17正向引物-3：SEQ ID NO：11
AAACAAAGGCACAGCCACTT
CEP17反向引物-3：SEQ ID NO：12
CCTACACGACGTCTTCGCAGTTGGCTTAGATCCTGCTA
进一步，优选所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-2和7-8序列中至少10个核苷酸长度的核酸。
19.根据项15所述的组合套装，其中，
所述的Taqman探针等同于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14序列中至少10个核苷酸长度的核酸，
HER2探针：SEQ ID NO：13
CCTGAACCGCTCTTCGA
CEP17探针：SEQ ID NO：14
CGAAGACGTCGTGTAGG。
20.根据项15所述的组合套装，其中，
所述正向引物和反向引物中的每一个的浓度分别为400-900nM；
所述探针中的每一个的浓度分别为250-400nM；
所述组合套装还包括：
0.1-1U DNA聚合酶、
50-400μM的各个dNTP、以及
1-10mM的镁离子。
21、根据项9所述的组合套装，其中，
所述检测样本选自人体新鲜组织、冰冻组织、福尔马林固定适量包埋(FFPE)组织或者人体细胞系中的任一种；优选所述检测样本为FFPE组织样本。
22、根据项8所述的组合套装，其中，
利用人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量来计算HER2基因及其片段的拷贝数量除以参照基因DNA及其片段的拷贝数量的比值，以及，
当所述比值≥1.5时，定义为“阳性”，即为HER2基因扩增/过表达；
当所述比值≤1.2时，定义为“阴性”，即为正常；
当1.2<所述比值<1.5时，定义为无效检测。
23.一种检测人体HER2基因DNA及其片段扩增状态的方法，其包括：
准备检测样本，分离和提取检测样本的人体HER2基因和参照基因及其片段DNA；
对上一步提取的DNA进行检测，即通过PCR选择性扩增人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段，定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量，
计算HER2基因的拷贝数量和参照基因拷贝数量之间的比值，并基于下述标准确定所述检测样本中HER2基因扩增/过表达的最终分析结果：
≥1.5时定义为“阳性”，即为HER2基因扩增/过表达；
≤1.2是定义为“阴性”，即为正常；
介于1.2和1.5之间定义为无效检测。
24.根据项23所述的方法，其中，对DNA进行检测是利用项8-22中任一项所述的组合套装完成的。
发明效果
不同于CN201810658404.8中HER2的两对正向和反向引物均定位于人体HER2基因蛋白编码区之外的5’端的上游，本发明中用于扩增人体HER2基因DNA及其片段的正向和反向引物位于人体HER2基因的蛋白编码区，这样能够更好地保证HER2基因扩增与HER2基因过表达的一致性。
不同于CN201611065900.X、CN201711138769.X、CN201810658404.8中HER2的正向和反向引物所扩增的HER2基因片段都长于60bp，本发明中正向和反向引物所扩增的HER2基因和参考基因片段的长度小于60碱基；优选地，所扩增的HER2基因和参考基因片段的长度为40-50碱基。更小的扩增子(amplicon)更适合FFPE样本中DNA严重断裂、降解的特点，保证更灵敏、更可靠的DNA定量检测。
附图说明
图1.本发明中引物和探针的设计和PCR体系扩增示意图。通过在HER2基因蛋白编码区内选择适当的正向和反向引物，以保证HER2基因的扩增子长度小于50bp。为了能够使用Taqman探针检测扩增产物，在正向或反向引物的5’端外侧添加了一段非人源DNA序列，作为扩增产物中Taqman探针检测的位点。
具体实施方式
本发明涉及一组用于分别定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量的核酸。在本发明中，所述参照基因为人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)。在本发明中，利用上述核酸检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量，并计算人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量之间的比值，即人体HER2基因及其片段的拷贝数量/参照基因DNA及其片段的拷贝数量。
在本发明的一个具体的方式中，该一组核酸是用于DNA聚合酶链式反应(PCR)以分别扩增所述人体HER2基因及其片段和所述参照基因DNA及其片段的正向和反向引物，正向和反向引物对人体HER2基因DNA及其片段进行PCR扩增的区间位于HER2蛋白编码区(protein coding region)。因此，该一组核酸优选包括用于扩增人体HER2基因及其片段的一对引物，即正向引物1和反向引物1，以及一组核酸优选还包括用于扩增人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)及其片段的一对引物，即正向引物2和反向引物2。
在一个具体的实施方式中，正向引物1和反向引物1对人体HER2基因及其片段进行PCR扩增得到的产物的长度在60个碱基以下，优选正向引物1和反向引物1对人体HER2基因进行PCR扩增的产物的长度为40-50个碱基。
在一个具体的实施方式中，正向引物2和反向引物2对人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)及其片段进行PCR扩增得到的产物的长度在60个碱基以下，优选正向引物2和反向引物2对人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)及其片段进行PCR扩增得到的产物的长度为40-50个碱基。
利用上述本发明的一组核酸能够得到更小的扩增子，而更小的扩增子(amplicon)更适合FFPE样本中DNA严重断裂、降解的特点，保证更灵敏、更可靠的DNA定量检测。
在本发明一个具体的实施方式中，在本发明的正向或反向引物中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA。具体来说，例如在上述正向引物1或反向引物1中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA，或者在所述正向引物2或反向引物2中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA。或者在上述正向引物1或反向引物1中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA，以及在所述正向引物2或反向引物2中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA。
在本发明一个具体的实施方式中，非人源的DNA与现已发现的所有生物DNA序列既不相同，也不互补。该非人源的DNA的长度为10-30个碱基，优选地，非人源的DNA的长度为15-20个碱基。
在本发明涉及的一组核酸中引入非人源DNA是为了适应本发明中小扩增子的设计，用于PCR产物检测的Taqman探针位点是通过引物的外加序列而引入的，即：在正向和反向引物中的至少一个引物的核酸序列的5’端包含了一段非人源的DNA；优选地，所述非人源的DNA与现已发现的所有生物DNA序列不相同、不互补。
本领域技术人员可以根据需要来设计非人源DNA的序列，例如非人源的DNA的序列互补于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的序列。
通过上述方式设计的引物，进行PCR反应，其扩增产生的扩增子在所扩增的人体HER2基因和参考基因DNA及其片段外侧增添了一段非人源DNA序列，其结构示意图如图1所示。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明的一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-12序列中至少10个核苷酸长度的核酸。
HER2正向引物-1：SEQ ID NO：1
GGTCACCTACAACACAGACA
HER2反向引物-1：SEQ ID NO：2
TCGAAGAGCGGTTCAGGGATTGGGCATGGACTCAAAC
HER2正向引物-2：SEQ ID NO：3
CCCTCAACCTGCACTATTGA
HER2反向引物-2：SEQ ID NO：4
TCGAAGAGCGGTTCAGGACTAACTCCTGCACAACACA
HER2正向引物-3：SEQ ID NO：5
TGACTGTGTTAGGGAGAGGA
HER2反向引物-3：SEQ ID NO：6
TCGAAGAGCGGTTCAGGCCAAATGGTCTGGCTCTACA
CEP17正向引物-1：SEQ ID NO：7
CACTTTGGAGGTTGGTTAGC
CEP17反向引物-1：SEQ ID NO：8
CCTACACGACGTCTTCGCCCCAGTTGGCTTAGATCCT
CEP17正向引物-2：SEQ ID NO：9
GAGGTTGGTTAGCAGGATCT
CEP17反向引物-2：SEQ ID NO：10
CCTACACGACGTCTTCGAGATGCCACCATGTTTTGG
CEP17正向引物-3：SEQ ID NO：11
AAACAAAGGCACAGCCACTT
CEP17反向引物-3：SEQ ID NO：12
CCTACACGACGTCTTCGCAGTTGGCTTAGATCCTGCTA；
在本发明的一个具体实施方式中，本发明的一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-2和7-8序列中至少10个核苷酸长度的核酸。
其中，在SEQ ID NO：1-12序列中，上述用下划线表示的一段序列是在正向引物1或反向引物1，以及正向引物2或反向引物2中的非人源的DNA部分。非人源的DNA与下述本发明中用于检测PCR产物的探针序列部分互补；优选全部互补。
本发明还涉及一种用于检测人体HER2基因扩增状态的组合套装，其包括：上述本发明的一组用于分别定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量的核酸。
一组用于分别定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量的核酸如上文所述。
在一个具体的实施方式中，本发明的组合套装还包括：用于分离和提取人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的检测样本。在本发明中该检测样本选自人体新鲜组织、冰冻组织、福尔马林固定适量包埋(FFPE)组织或者人体细胞系中的任一种；优选所述检测样本为FFPE组织样本。
在一个具体的实施方式中，本领域技术人员可以根据其已掌握的知识来提供人体新鲜组织以及冰冻组织等。
在一个具体的实施方式中，FFPE组织样本通过如下方法制备。首先对FFPE切片样本进行脱蜡处理。脱蜡处理可从多种脱蜡试剂中选择，如：二甲苯、庚烷和柠檬烯等，并通过加热、孵育完成。完成脱蜡的切片样本转移至裂解缓冲液，在蛋白酶K的消化作用下，完成核酸的释放。在蛋白酶K处理后，利用硅胶膜离心柱对DNA进行纯化：在硅胶模上分离DNA，洗涤以去除污染，之后以20-100μl的小体积洗脱。
在一个具体的实施方式中，本发明的组合套装还包括：用于检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的PCR扩增产物的荧光探针。优选所述荧光探针为Taqman探针。其中，Taqman探针与所述非人源的DNA部分互补；优选Taqman探针与所述非人源的DNA全部互补。
在本发明的一个具体的实施方式中，为了缩短探针长度，本发明的探针序列中包括1-3个锁核酸(locked nucleic acid)；优选地，其序列中包括1个锁核酸。通过利用锁核酸提高退火温度的特性，可以在保证探针结合特异性的前提下减少探针长度。
锁核酸(locked nucleic acid)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构。锁核酸包括A、C、G、T、U、mC六种碱基。锁核酸是一种经过修饰的RNA，LNA中一部分核糖上的2'与4'碳连结在一起，一般可见于A-DNA或RNA。
在本发明的一个具体的实施方式中，本发明的Taqman探针等同于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14序列中至少10个核苷酸长度的核酸。
在本发明的一个具体的实施方式中，在上述本发明的组合套装中，所述正向引物和反向引物中的每一个的浓度分别为400-900nM；所述探针中的每一个的浓度分别为250-400nM；此外，所述组合套装还包括：0.1-1U DNA聚合酶、50-400μM的各个dNTP、以及1-10mM的镁离子。
在本发明的一个具体的实施方式中，在上述本发明的组合套装中，正向引物1、反向引物1、正向引物2、以及反向引物2的浓度均为400-900nM；优选地，正向引物1、反向引物1、正向引物2、以及反向引物2的浓度均为600nM。在上述本发明的组合套装中，探针中的每一个的浓度分别为250-400nM；优选地，探针中的每一个的浓度为300nM。
利用上述本发明的一组核酸或本发明的组合套装，通过使用数字PCR检测人体HER2基因和参照基因DNA及其片段的数量、并计算其比值，能够方便、准确地实现HER2基因扩增/过表达的检测。
具体来说，利用人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量来计算HER2基因及其片段的拷贝数量除以参照基因DNA及其片段的拷贝数量的比值，以及，当所述比值≥1.5时，定义为“阳性”，即为HER2基因扩增/过表达；当所述比值≤1.2时，定义为“阴性”，即为正常；当1.2<所述比值<1.5时，定义为无效检测。
本发明还涉及一种检测人体HER2基因DNA及其片段扩增状态的方法，其包括：准备检测样本，分离和提取检测样本的人体HER2基因和参照基因及其片段DNA；对上一步提取的DNA进行检测，即通过PCR选择性扩增人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段，定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量，计算HER2基因的拷贝数量和参照基因拷贝数量之间的比值，并基于下述标准确定所述检测样本中HER2基因扩增/过表达的最终分析结果：
≥1.5时定义为“阳性”，即为HER2基因扩增/过表达；
≤1.2是定义为“阴性”，即为正常；
介于1.2和1.5之间定义为无效检测。
在本发明的上述方法中，在PCR扩增过程中利用的是利用本发明的一组核酸作为引物来进行扩增的。PCR扩增过程是通过本发明所述的组合套装来实现的。
具体来说，上述方法具体包括如下步骤：
第一步，准备检测样本，对其进行分离，并从中提取人体HER2基因和参照基因及其片段DNA；
典型地，首先对FFPE切片样本进行脱蜡处理。脱蜡处理可从多种脱蜡试剂中选择，如：二甲苯、庚烷和柠檬烯等，并通过加热、孵育完成。完成脱蜡的切片样本转移至裂解缓冲液，在蛋白酶K的消化作用下，完成核酸的释放。在蛋白酶K处理后，利用硅胶膜离心柱对DNA进行纯化：在硅胶模上分离DNA，洗涤以去除污染，之后以20-100μl的小体积洗脱。
第二步，使用上述本发明的组合套装对第一步提取的DNA进行检测：
典型地，通过PCR选择性扩增人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段，用探针检测扩增产物是否存在。用基于PCR的方式来测定人体HER2基因和参照基因DNA及其片段的数量，如：数字PCR、荧光实时定量PCR；其中，数字PCR测定为高灵敏度和高精密度的定量测定技术，是本发明的优选检测方法。
第三步，通过计算HER2基因和参照基因片段数量的比值，确定所述样本中HER2基因扩增/过表达的最终分析结果。
≥1.5时定义为“阳性”，即为HER2基因扩增/过表达；
≤1.2是定义为“阴性”，即为正常；
介于1.2和1.5之间定义为无效检测。
综上所述，本发明通过以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，通过联合利用用于检测HER2基因和参照基因DNA及其片段的核酸序列和数字PCR，实现了HER2基因扩增/过表达的检测。
实施例
尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，不以任何方式限制本发明的保护范围。
(一)样品
将21例女性乳腺癌肿瘤组织FFPE样本切成5-10μM厚的切片，将3-4片/样本放入1.5mL离心管中。所述21例乳腺癌肿瘤组织的HER2基因扩增/过表达的状态已经由FISH检测确定；其中13例为阴性，8例为阳性。
(二)具体的组合套装结构和操作
1)对提取样品DNA的提取
首先在1.5mL试管中加入300μL除蜡液，并在80℃孵育30min进行脱蜡处理。脱蜡处理可从多种脱蜡试剂中选择，如：二甲苯、庚烷和柠檬烯等；本实施例采用的是石蜡油。然后加入30μL的蛋白酶K，涡旋混匀，56℃孵育60min至无明显组织块；蛋白酶K裂解缓冲液的组分为：10mMTris-HCl、25mM EDTA、100mM NaCl以及0.5％SDS。蛋白酶K消化处理后，在90℃、孵育60min。热处理后，13,000rpm离心1min，用枪头小心刺穿液面表层蜡层，取下层清液并转移至硅胶膜离心柱，进行DNA纯化和回收：首先13,000rpm离心1min，弃滤出液；使用500μL80％的乙醇进行洗涤，13,000rpm离心1min，弃滤出液；重复洗涤一次；最后在硅胶膜离心柱中加入20～50μL洗脱液，13,000rpm离心1min，收集滤出液，并在-20℃保存。
2)检测单元对DNA样本的检测
采用检测单元，本实验例中采取的PCR反应体系为：DNA模板10ng、400nM引物、250nM探针、1UTaq聚合酶、400μM的各个dNTP、10mM的MgCl2和1×PCR缓冲液。
本实施例中使用的引物和探针是由通用生物系统(安徽)有限公司合成的，其序列为：
HER2正向引物-1：SEQ ID NO：1
GGTCACCTACAACACAGACA
HER2反向引物-1：SEQ ID NO：2
TCGAAGAGCGGTTCAGGGATTGGGCATGGACTCAAAC
CEP17正向引物-1：SEQ ID NO：7
CACTTTGGAGGTTGGTTAGC
CEP17反向引物-1：SEQ ID NO：8
CCTACACGACGTCTTCGCCCCAGTTGGCTTAGATCCT
HER2探针：SEQ ID NO：13
CCTGAACCGCTCTTCGA
CEP17探针：SEQ ID NO：14
CGAAGACGTCGTGTAGG
其中，SEQ ID NO：13-14中，加粗标记的碱基为锁核酸。
最后，通过数字PCR对样本中的HER2基因和参照基因片段的数量进行检测。在本实施例中，数字PCR检测是在北京达微生物科技有限公司的GO1型液滴数字PCR仪上完成的。PCR反应条件为：在94℃持续10分钟；紧接着进行40个循环的1)在57℃退火和延伸20秒，和2)94℃下变性15秒。
数字PCR对FFPE样本中HER2基因和CEP17拷贝数的定量检测如下。
表1
(三)结论
上述实验结果显示：数字PCR检测得到的HER2基因扩增/过表达状态与FISH检测得到的结果一致。因此，使用上述组合套装能够通过数字PCR准确地检测人体HER2基因扩增/过表达状态的检测。
尽管以上对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
序列表
<110> 北京达微生物科技有限公司
<120> 用于人体HER2基因扩增状态检测的组合套装
<130> TPC00550
<141> 2019-05-28
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggtcacctac aacacagaca 20
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tcgaagagcg gttcagggat tgggcatgga ctcaaac 37
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccctcaacct gcactattga 20
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcgaagagcg gttcaggact aactcctgca caacaca 37
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tgactgtgtt agggagagga 20
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tcgaagagcg gttcaggcca aatggtctgg ctctaca 37
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cactttggag gttggttagc 20
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cctacacgac gtcttcgccc cagttggctt agatcct 37
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gaggttggtt agcaggatct 20
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cctacacgac gtcttcgaga tgccaccatg ttttgg 36
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aaacaaaggc acagccactt 20
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cctacacgac gtcttcgcag ttggcttaga tcctgcta 38
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
cctgaaccgc tcttcga 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cgaagacgtc gtgtagg 17
Claims (24)
1.一组核酸，其为用于分别定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量的一组核酸，其中，所述参照基因为人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中，
所述一组核酸为用于DNA聚合酶链式反应(PCR)以分别扩增所述人体HER2基因及其片段和所述参照基因DNA及其片段的正向和反向引物，
所述正向和反向引物对人体HER2基因DNA及其片段进行PCR扩增的区间位于HER2蛋白编码区(protein coding region)。
3.根据权利要求2所述的核酸，其中，
所述正向和反向引物对人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段进行PCR扩增得到的产物的长度在60个碱基以下；
优选地，其对HER2基因和参照基因进行PCR扩增的产物的长度为探针40-50个碱基。
4.根据权利要求2或3所述的核酸，其中，
在所述正向或反向引物中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA；
优选地，所述非人源的DNA与现已发现的所有生物DNA序列既不相同，也不互补。
5.根据权利要求4所述的核酸，其中，
所述非人源的DNA的长度为10-30个碱基；
优选地，所述非人源的DNA的长度为15-20个碱基。
6.根据权利要求5所述的核酸，其中，
所述非人源的DNA的序列互补于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的序列，其中，
HER2探针：SEQ ID NO：13
CCTGAACCGCTCTTCGA
CEP17探针：SEQ ID NO：14
CGAAGACGTCGTGTAGG。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的核酸，其中，
所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-12序列中至少10个核苷酸长度的核酸，
HER2正向引物-1：SEQ ID NO：1
GGTCACCTACAACACAGACA
HER2反向引物-1：SEQ ID NO：2
TCGAAGAGCGGTTCAGGGATTGGGCATGGACTCAAAC
HER2正向引物-2：SEQ ID NO：3
CCCTCAACCTGCACTATTGA
HER2反向引物-2：SEQ ID NO：4
TCGAAGAGCGGTTCAGGACTAACTCCTGCACAACACA
HER2正向引物-3：SEQ ID NO：5
TGACTGTGTTAGGGAGAGGA
HER2反向引物-3：SEQ ID NO：6
TCGAAGAGCGGTTCAGGCCAAATGGTCTGGCTCTACA
CEP17正向引物-1：SEQ ID NO：7
CACTTTGGAGGTTGGTTAGC
CEP17反向引物-1：SEQ ID NO：8
CCTACACGACGTCTTCGCCCCAGTTGGCTTAGATCCT
CEP17正向引物-2：SEQ ID NO：9
GAGGTTGGTTAGCAGGATCT
CEP17反向引物-2：SEQ ID NO：10
CCTACACGACGTCTTCGAGATGCCACCATGTTTTGG
CEP17正向引物-3：SEQ ID NO：11
AAACAAAGGCACAGCCACTT
CEP17反向引物-3：SEQ ID NO：12
CCTACACGACGTCTTCGCAGTTGGCTTAGATCCTGCTA；
进一步，优选所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-2和7-8序列中至少10个核苷酸长度的核酸。
8.一种用于检测人体HER2基因扩增状态的组合套装，其包括：
一组核酸，其为用于分别定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量的一组核酸，
其中，所述参照基因为人体17号染色体着丝粒序列(CEP17)及其片段。
9.根据权利要求8所述的组合套装，其还包括：
用于分离和提取人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的检测样本。
10.根据权利要求8或9所述的组合套装，其中，
所述一组核酸为用于DNA聚合酶链式反应(PCR)以扩增人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的正向和反向引物，所述正向和反向引物对人体HER2基因DNA及其片段进行PCR扩增的区间位于HER2蛋白编码区(protein coding region)。
11.根据权利要求8或9所述的组合套装，其中，
所述正向和反向引物对人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段进行PCR扩增得到的产物的长度在60个碱基以下；优选地，其对HER2基因和参照基因进行PCR扩增的产物的长度为40-50个碱基。
12.根据权利要求8或9所述的组合套装，其中，
在所述正向或反向引物中至少一个引物的核酸序列的5’端包含一段非人源的DNA；
优选地，所述非人源的DNA与现已发现的所有生物DNA序列既不相同，也不互补。
13.根据权利要求12所述的组合套装，其中，
所述非人源的DNA的长度为10-30个碱基；
优选地，所述非人源的DNA的长度为15-20个碱基。
14.根据权利要求13所述的组合套装，其中，
所述非人源的DNA的序列互补于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的序列，其中，
HER2探针：SEQ ID NO：13
CCTGAACCGCTCTTCGA
CEP17探针：SEQ ID NO：14
CGAAGACGTCGTGTAGG。
15.根据权利要求8或9所述的组合套装，其还包括：
用于检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的PCR扩增产物的荧光探针；
优选所述荧光探针为Taqman探针。
16.根据权利要求15所述的组合套装，其中，
所述的Taqman探针与所述非人源的DNA部分互补；
优选所述的Taqman探针与所述非人源的DNA全部互补。
17.根据权利要求16所述的组合套装，其中，
所述Taqman探针的序列中包括1-3个锁核酸(locked nucleic acid)；
优选所述Taqman探针的序列中包括1个锁核酸。
18.根据权利要求8～17中任一项所述的组合套装，其中，
所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-12序列中至少10个核苷酸长度的核酸，
HER2正向引物-1：SEQ ID NO：1
GGTCACCTACAACACAGACA
HER2反向引物-1：SEQ ID NO：2
TCGAAGAGCGGTTCAGGGATTGGGCATGGACTCAAAC
HER2正向引物-2：SEQ ID NO：3
CCCTCAACCTGCACTATTGA
HER2反向引物-2：SEQ ID NO：4
TCGAAGAGCGGTTCAGGACTAACTCCTGCACAACACA
HER2正向引物-3：SEQ ID NO：5
TGACTGTGTTAGGGAGAGGA
HER2反向引物-3：SEQ ID NO：6
TCGAAGAGCGGTTCAGGCCAAATGGTCTGGCTCTACA
CEP17正向引物-1：SEQ ID NO：7
CACTTTGGAGGTTGGTTAGC
CEP17反向引物-1：SEQ ID NO：8
CCTACACGACGTCTTCGCCCCAGTTGGCTTAGATCCT
CEP17正向引物-2：SEQ ID NO：9
GAGGTTGGTTAGCAGGATCT
CEP17反向引物-2：SEQ ID NO：10
CCTACACGACGTCTTCGAGATGCCACCATGTTTTGG
CEP17正向引物-3：SEQ ID NO：11
AAACAAAGGCACAGCCACTT
CEP17反向引物-3：SEQ ID NO：12
CCTACACGACGTCTTCGCAGTTGGCTTAGATCCTGCTA
进一步，优选所述一组核酸等同或互补于SEQ ID NO：1-2和7-8序列中至少10个核苷酸长度的核酸。
19.根据权利要求15所述的组合套装，其中，
所述的Taqman探针等同于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14序列中至少10个核苷酸长度的核酸，
HER2探针：SEQ ID NO：13
CCTGAACCGCTCTTCGA
CEP17探针：SEQ ID NO：14
CGAAGACGTCGTGTAGG。
20.根据权利要求15所述的组合套装，其中，
所述正向引物和反向引物中的每一个的浓度分别为400-900nM；
所述探针中的每一个的浓度分别为250-400nM；
所述组合套装还包括：
0.1-1 U DNA聚合酶、
50-400μM的各个dNTP、以及
1-10mM的镁离子。
21.根据权利要求9所述的组合套装，其中，
所述检测样本选自人体新鲜组织、冰冻组织、福尔马林固定适量包埋(FFPE)组织或者人体细胞系中的任一种；优选所述检测样本为FFPE组织样本。
22.根据权利要求8所述的组合套装，其中，
利用人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量来计算HER2基因及其片段的拷贝数量除以参照基因DNA及其片段的拷贝数量的比值，以及，
当所述比值≥1.5时，定义为“阳性”，即为HER2基因扩增/过表达；
当所述比值≤1.2时，定义为“阴性”，即为正常；
当1.2<所述比值<1.5时，定义为无效检测。
23.一种检测人体HER2基因DNA及其片段扩增状态的方法，其包括：
准备检测样本，分离和提取检测样本的人体HER2基因和参照基因及其片段DNA；
对上一步提取的DNA进行检测，即通过PCR选择性扩增人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段，定量检测人体HER2基因及其片段和参照基因DNA及其片段的拷贝数量，
计算HER2基因的拷贝数量和参照基因拷贝数量之间的比值，并基于下述标准确定所述检测样本中HER2基因扩增/过表达的最终分析结果：
≥1.5时定义为“阳性”，即为HER2基因扩增/过表达；
≤1.2是定义为“阴性”，即为正常；
介于1.2和1.5之间定义为无效检测。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，对DNA进行检测是利用权利要求8-22中任一项所述的组合套装完成的。
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