CN106591438A - 一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用。所述核酸组合包括两对Her2基因引物和两对内参引物。本发明通过使用两对引物和两对内参使用数字PCR方法对Her2基因进行检测，能够对Her2基因进行绝对定量，借助软件完全自动化的进行结果判读，分析速度快。使用两对引物有利于提高检测结果的准确性，特别是对于血液这种本身DNA含量较低的样品。同时使用两对内参引物，减少了假阴性和假阳性的可能。

Description

一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，特别是涉及一种用于检测HER2基因的核酸组合、试剂盒及应用。
背景技术
人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor recepctor-2，Her2)基因，定位于染色体17q21，编码相对分子质量为185KD的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。该受体蛋白与Her2家族成员及其配体之间相互作用，通过细胞间的信号转导，调节细胞生长、分化和增殖。研究发现，大约25％-30％的浸润性乳腺癌和80％的胃癌患者均有Her2基因扩增或蛋白过表达。此外乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌等均有Her2过表达的发生。赫赛汀(Herceptin)是1998年首次获批的一种免疫治疗药物，能特异性的抑制具有Her2扩增的癌细胞的生长，使病人预后大大改善。因此，准确的检测Her2状态是有效治疗癌症的前提。
目前美国食品及药物管理局(FDA)批准用于Her2检测的方法有两种：检测Her2蛋白的免疫组织化学(IHC)法和检测Her2基因的荧光原位杂交(FISH)法。IHC是一种半定量方法，因其具有成本低、技术简单、便于操作等特点，成为目前病理学实验室检测Her2状态的首选方法。但IHC就容易受到组织影响、缺乏标准化，结果判断存在主观差异，造成不同实验室之间的检测结果可能存在差异。FISH检测具有较高的准确性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间一致性较高，是目前Her2检测的金标准。但FISH检测耗时长、探针成本较为昂贵且需要经过专业培训的技术人员进行较为繁琐的操作，此外，有研究结果表明，17号染色体多体性可导致FISH结果假阴性。
目前的检测一般需要通过有创性组织活检，不易重复获取。研究表明，血液、唾液等样本中混有肿瘤细胞DNA，若要从这些低含量样本中检测肿瘤细胞DNA，需要一种灵敏度高、特异性强、简便易行、结果容易判读的方法，用于肿瘤患者的靶向指导用药及预后判断。数字PCR(digital PCR，dPCR)是近年来新出现的一种PCR技术。在原有PCR技术的基础上，该技术进行了大幅革新。该技术将传统PCR中的每一份反应体系均分到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布，然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增，扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。
与经典的荧光定量PCR相比，dPCR可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析，具有无可比拟的精确性，不再需要标准曲线。dPCR提供了独立互不干扰的极微小的反应微孔，能够使得模板分子真正成为以单一分子为模板开始，进行PCR扩增的过程，能够区分混样模板中的极低含量靶核酸分子。dPCR已经被用于癌症分子标志物的发现、传染病研究、基因组结构变异分析、基因表达分析等领域。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了一种基于数字PCR的用于检测Her2基因的引物组合。
一种用于检测Her2基因的核酸组合，包括两对Her2基因引物和两对内参引物，其中，Her2基因引物序列：
Her2-1-F：5’-ACAACCAAGTGAGGCAGGTC-3’，
Her2-1-R：5’-GTATTGTTCAGCGGGTCTCC-3’；
Her2-2-F：5’-TCTTCCTCTCCCTACATCGG-3’，
Her2-2-R：5’-GTCCAAGTGAACCAGGGAA-3’，
内参引物序列：
RPPH1-F：5’-GTCAGACTGGGCAGGAGATG-3’，
RPPH1-R：5’-TGGCCGTGAGTCTGTTCC-3’；
CEP17-F：5’-CGCTCCTGCACTGTAACACGT-3’，
CEP17-R：5’-TCATTCCTGCAGCCCTTGA-3’。
两对Her2基因引物识别的靶序列在人Her2基因序列上分隔至少1kb以上，两对内参引物其中一对识别位于人17号染色体的靶序列，另一对识别位于非17号染色体的靶序列。
优选的，所述的核酸组合，还包括对应的探针，两对Her2基因引物对应的探针为：
Her2-1-P：5’-R1-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-Q1-3’，
Her2-2-P：5’-R2-ACAGCCATGCCCACAGCCAG-Q2-3’，
两对内参引物对应的探针为：
RPPH1-P：5’-R3-TGCCTCCTTTGCCGGAGCTT-Q3-3’，
CEP17-P：5’-R4-AGCAGGTCCAGCCCA-Q4-3’，
其中，R1、R2、R3、R4为荧光报告基团，Q1、Q2、Q3、Q4为荧光淬灭基团，并且R1、R2和R3、R4之间选择不同颜色的荧光报告基团。检测结果分析时，以R1+R2的数量与R3+R4的数量整体进行比较。
Her2基因位于17号染色体长臂上，CEP17基因位于17号染色体着丝粒区。在发生Her2基因过表达的乳腺癌样本中，通常不涉及17号染色体多体的情况。此种情况下，同时检测样本中的Her2基因拷贝数和CEP17基因的拷贝数并进行比较，可以分析出Her2基因相对于CEP17基因的拷贝数变化。由于正常细胞样本中Her2基因与CEP17基因的拷贝数应一致，即1∶1的关系，在上述的大多数乳腺癌Her2基因过表达样本中，Her2基因拷贝数/CEP17基因拷贝数明显偏离1∶1的关系，因此Her2基因过表达的样本可与Her2基因不过表达的样本区分。但临床上亦有少部分Her2过表达的乳腺癌由17号染色体多体引起，此种情况下，分析单条染色体上Her2基因与CEP17基因拷贝数的关系，可以表现为与Her2基因非过表达的样本一致，而实际上由于单个肿瘤细胞内含有多条17号染色体，实质上Her2基因拷贝数亦超过了Her2基因未过表达的细胞中的Her2基因拷贝数。正如Her2基因过表达临床检测的金标准-荧光原位杂交(FISH)相关的《2014年NCCN乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌HER2检测指南2014版》所指出Her2扩增判读标准：
A.若HER2/CSP17<2.0，且平均HER2拷贝数/细胞<4.0，HER2阴性；
B.若HER2/CSP17<2.0，且平均HER2拷贝数/细胞<6.0，但≥4.0时，HER2结果不确定；
C.若HER2/CSP17≥2.0，或HER2/CSP17<2.0而HER2拷贝数/细胞≥6.0，HER2阳性。
(CSP17拷贝数即CEP17基因拷贝数)
即使HER2/CSP17<2.0时，如HER2拷贝数/细胞≥6.0时，依然判别为阳性，这种情况就是防止单纯考虑Her2基因和CEP17基因拷贝数时，因出现17号染色体多体的情况而未能正确判读Her2基因过表达为阳性。
为了在出现17号染色体多体的情况时我们依旧可以正确评估Her2基因过表达情况，我们在CEP17这个内参基因之外加入了14号染色体上RPPH1这个内参基因，同时对Her2基因也增加一组检测引物和对应探针。一方面是在模板量极少的情况下，得出的拷贝数会更多，增加结果的稳定性，另一方面，在17号染色体多体，Her2基因和CEP17内参基因拷贝均都增加的情况下，单纯比较Her2/CEP17的比值，会造成假阴性，此时加入14号染色体上的内参基因RPPH1，会有效降低假阴性的产生。理论计算结果可见表1。
表1
通过比较Her2/CEP17和2×Her2/(CEP17+RPPH1)可发现，当单个细胞内Her2拷贝数大于等于6时(即出现17号染色体多体且FISH技术评判为阳性时)，Her2/CEP1与2×Her2/(CEP17+RPPH1)有明显差异。因此评估2×Her2/(CEP17+RPPH1)比值可一定程度上消除17号染色体多体带来的影响。同时当17号染色体为二倍体时，不会对Her2扩增评估带来影响，理论计算结果见表2。
表2
并且，当用血液样本提取游离DNA时，由于DNA含量低，若用单组引物探针做的话，得出的拷贝数可能会比较低，但用两组引物探针，同样的模板量得出的拷贝数会显著增加，稳定性会提高。此外，加两组引物探针的另外一个好处在于：对内参来说，RPPH1基因位于14号染色体，CEP17基因位于17号染色体，Her2基因也位于17号染色体，若只是用CEP17这个内参的话，当17号染色体多体时，容易造成假阴性，因此再加入一个14号染色体的内参，降低这种错误的发生。
优选的，荧光报告基团选自FAM、HEX、Cy5、Cy3或VIC；荧光淬灭基团选自TAMARA、BHQ1、BHQ2或MGB。
本发明又提供了包含所述核酸组合的试剂盒。
本发明还提供了所述的试剂盒在检测Her2基因中的应用。
本发明还提供了一种检测HER2基因的方法，使用所述核酸组合对待检测的样本进行数字PCR检测。
优选的，所述的方法，各条引物的用量分别为300-950nM，各探针的用量分别为100-300nM。
优选的，所述的方法，所述数字PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共进行40个循环。
本发明通过使用两对引物和两对内参使用数字PCR方法对Her2基因进行检测，能够对Her2基因进行绝对定量，借助软件完全自动化的进行结果判读，分析速度快。使用两对引物有利于提高检测结果的准确性，特别是对于血液这种本身DNA含量较低的样品。同时使用两对内参引物，减少了假阴性的产生。
具体实施方式
实施例1
针对人的Her2基因序列进行引物及探针的设计，共设计合成了3对引物，每对引物再相应地设计一条探针，其序列如表3所示。
表3
Her2-1引物对扩增片段大小为155bp，扩增片段序列为：ACAACCAAGTGAGGCAGGTCGTATTGTTCAGCGGGTCTCCACAACCAAGTGAGGCAGGTCccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatGGAGACCCGCTGAACAATAC。
Her2-2引物对扩增片段大小为125bp，扩增片段序列为：TCTTCCTCTCCCTACATCGGGTCCAAGTGAACCAGGGAATCTTCCTCTCCCTACATCGGccccacctgtccccacccctccagcccacagccatgcccacagccagTTCCCTGGTTCACTTGGAC。
Her2-3引物对扩增片段大小为111bp，扩增片段序列为：GGGCTCTTTGCAGGTCTCTCCCAGCAAGAGTCCCCATCCTAGGGGCTCTTTGCAGGTCTCTCCggagcaaacccctatgtccacaaggggCTAGGATGGGGACTCTTGCTG。
Her2基因位于17号染色体上，研究发现部分乳腺癌存在17号染色体非整体性，即17号染色体不是正常的二体，而是单体或多体，此时，可能会存在假阳性或假阴性的结果存在，如果17号染色体单体，仅扩增Her2基因可能会造成假阴性；如果17号染色体多体，仅扩增Her2基因可能会造成假阳性。
所以加入内参基因的检测可以排除这种假阳性或假阴性的产生。所以又设计了多对内参引物和相应探针。如表4所示。
表4
RPPH1基因位于人14号染色体上，RPPH1引物对扩增片段大小为132bp，扩增片段序列为：
GTCAGACTGGGCAGGAGATGTGGCCGTGAGTCTGTTCCGTCAGACTGGGCAGGAGATGccgtggaccccgcccttcggggaggggcccggcggatgcctcctttgccggagcttGGAACAGACTCACGGCCA。
CEP17基因位于人17号染色体上，CEP17引物对扩增片段大小为105bp，扩增片段序列为：
CGCTCCTGCACTGTAACACGTTCATTCCTGCAGCCCTTGACGCTCCTGCACTGTAACACGTacctggggcagcaggtccagcccagTCAAGGGCTGCAGGAATGA。
CEP17-new引物对扩增片段大小为123bp，扩增片段序列为：
GCTGATGATCATAAAGCCACAGGTATGGTGCTCAGGCAGTGCGCTGATGATCATAAAGCCACAGGTAagaagtaggcaaccgcctattgcagcacgtggcacatggGCACTGCCTGAGCACCA。
EFTUD2基因位于人17号染色体上，EFTUD2-1引物对扩增片段大小为127bp，扩增片段序列为：
GCAGGGATGCCACAGTTTACAGAACAAGAGCAAAGGCAAGCAGGGATGCCACAGTTTAactgccgggtctctaagagcacacatctttctggggagcatttatgtctTTGCCTTTGCTCTTGTTCTG。
EFTUD2-2引物对扩增片段大小为114bp，扩增片段序列为：
ATGCCGACACCTTTGGTAAGAGGAAAGGCACACAGGACTCATGCCGACACCTTTGGTAAGcgctggctggcagtctgtctcaccagcttcccctGAGTCCTGTGTGCCTTTCCT。
实施例2
数字PCR检测的步骤如下：
(1)准备样品：样品DNA来源可以是血液或中性福尔马林固定石蜡包埋的组织样本切片。可将DNA样品进行适当的稀释，保证样本信号拷贝数在200拷贝/μL-2000拷贝/μL之间。
(2)按照以下配比配制PCR反应液：2×PCR预混液(使用Life Technologies公司的3D Digital PCR Master Mix V2，货号：A26358)、引物、探针及样品DNA，用蒸馏水补足至终体积为15μL，配制成数字PCR混合液。其中每条引物含量分别是900nM，每条探针分别为250nM。
(3)将配制好的15μL数字PCR混合液刷到芯片上。
(4)将芯片放入PCR仪中，按照以下条件进行扩增：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共进行40个循环。
(5)PCR扩增完成后将芯片放置于信号读取仪中进行信号收集，检测荧光信号。用QuantStudio 3D AnalysisSuite Cloud进行数据分析。
实施例3
引物和探针的筛选。
对基因组DNA来说，一个基因组大小约为3×109bp，对应的分子质量是3pg，则1ng基因组DNA的拷贝数大约是333。做数字PCR时，取1ng正常人血DNA，配成15μL的反应液，刷涂到芯片中，理论上得到的目的基因(Her2)和内参基因拷贝数都应该是333，但是数字PCR最终显示的FAM(Her2基因)和VIC(内参基因)是以拷贝/μL来表示，333拷贝/15μL≈22拷贝/μL。正常人的Her2基因并没有过度表达，因此Her2与内参的拷贝数之比(FAM/VIC)理论上是1∶1。
筛选过程：
按实施例2中的检测方法进行检测。
模板：1ng正常人血提取的DNA
引物探针：以下15种组合方式(分别是Her2-1/RPPH1，Her2-1/CEP17，Her2-1/CEP17-1，Her2-1/EFTUD2-1，Her2-1/EFTUD2-2，Her2-2/RPPH1，Her2-2/CEP17，Her2-2/CEP17-1，Her2-2/EFTUD2-1，Her2-2/EFTUD2-2，Her2-3/RPPH1，Her2-3/CEP17，Her2-3/CEP17-1，Her2-3/EFTUD2-1，Her2-3/EFTUD2-2)，
使用Life Technologies公司的3D Digital PCR Master Mix V2(货号：A26358)。
结果如表5所示。
表5
Her2-1 Her2-2 Her2-3
RPPH1 19.789/19.567 16.482/19.453 18.284/22.623
CEP17 16.432/22.379 20.631/21.314 16.871/22.815
CEP17-1 16.402/20.304 15.147/12.812 13.854/2.178
EFTUD2-1 15.565/16.563 18.066/19.261 16.028/19.517
EFTUD2-2 16.478/20.294 21.295/18.672 14.163/17.634
注：表格中的数值表示FAM/VIC。
从表格中的拷贝数来看，只有Her2-1/RPPH1，Her2-2/CEP17符合要求。
实施例4
按实施例2中的检测方法进行检测。
模板：1ng(样本1、样本2、样本3、样本4、样本5)
引物探针：单组(Her2-1/RPPH1、Her2-2/CEP17)，两组(Her2-1/RPPH1+Her2-2/CEP17)
使用Life Technologies公司的3D Digital PCR Master Mix V2(货号：A26358)。
结果如表6所示，可以看出，单组引物探针做数字PCR得出的FAM和VIC拷贝数明显低于两组引物探针的组合，因此，当用血液样本提取游离DNA时，由于DNA含量低，若用单组引物探针做的话，得出的拷贝数可能会比较低(Life technologies的数字PCR系统最优检测范围是200-2000拷贝/μL，实验中发现当拷贝数低于20时，结果的准确性会大大降低)，但用两组引物探针的话，同样的模板量得出的拷贝数会显著增加，相应的准确性会提高。此外，加两组引物探针的另外一个好处在于：对内参来说，RPPH1基因位于14号染色体，CEP17基因位于17号染色体，Her2基因也位于17号染色体，若只是用CEP17这个内参的话，当17号染色体多体时，造成VIC拷贝数增多，会造成结果假阴性，因此再加入一个14号染色体的内参，降低这种错误的发生。
所以本发明最终选择Her2-1/RPPH1+Her2-2/CEP17两对Her2基因引物和两对内参引物对Her2基因进行检测。
表6
实施例5
使用Her2-1/RPPH1+Her2-2/CEP17两对Her2基因引物和两对内参引物，以及他们对应的探针进行实际样品的验证。按实施例2中的检测方法进行检测。5例乳腺癌石蜡包埋切片Her2阳性样本dPCR实验结果如表7所示，对5例乳腺癌患者石蜡包埋切片进行检测，结果均为Her2阳性，与FISH结果一致。
表7
实施例6
使用Her2-1/RPPH1+Her2-2/CEP17两对Her2基因引物和两对内参引物，以及他们对应的探针进行实际样品的验证。按实施例2中的检测方法进行检测。
实验中共包含42例石蜡切片(31片为Her2阳性，11片为Her2阴性，均为IHC3+或FISH检测为Her2阳性)，对结果进行分析，灰区划为1.1-1.2，即FAM拷贝数/VIC拷贝数＜1.1，即为Her2阴性，FAM拷贝数/VIC拷贝数＞1.2，即为Her2阳性，结果：31例阳性样本中有一例落入灰区，11例阴性样本中有一例落入灰区。
灰区范围较小，对于落在灰区的样本可重新取样检测或采用其他方式检测进行确认。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东医药（杭州）基因科技有限公司
<120> 一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用
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<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gggctctttg caggtctctc c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cagcaagagt ccccatccta g 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agcaaacccc tatgtccac 19
<210> 10
<211> 155
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 10
acaaccaagt gaggcaggtc gtattgttca gcgggtctcc acaaccaagt gaggcaggtc 60
ccactgcaga ggctgcggat tgtgcgaggc acccagctct ttgaggacaa ctatgccctg 120
gccgtgctag acaatggaga cccgctgaac aatac 155
<210> 11
<211> 125
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 11
tcttcctctc cctacatcgg gtccaagtga accagggaat cttcctctcc ctacatcggc 60
cccacctgtc cccacccctc cagcccacag ccatgcccac agccagttcc ctggttcact 120
tggac 125
<210> 12
<211> 111
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 12
gggctctttg caggtctctc ccagcaagag tccccatcct aggggctctt tgcaggtctc 60
tccggagcaa acccctatgt ccacaagggg ctaggatggg gactcttgct g 111
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtcagactgg gcaggagatg 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tggccgtgag tctgttcc 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgcctccttt gccggagctt 20
<210> 16
<211> 132
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 16
gtcagactgg gcaggagatg tggccgtgag tctgttccgt cagactgggc aggagatgcc 60
gtggaccccg cccttcgggg aggggcccgg cggatgcctc ctttgccgga gcttggaaca 120
gactcacggc ca 132
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgctcctgca ctgtaacacg t 21
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcattcctgc agcccttga 19
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agcaggtcca gccca 15
<210> 20
<211> 105
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 20
cgctcctgca ctgtaacacg ttcattcctg cagcccttga cgctcctgca ctgtaacacg 60
tacctggggc agcaggtcca gcccagtcaa gggctgcagg aatga 105
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctgatgatc ataaagccac aggta 25
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tggtgctcag gcagtgc 17
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgctgcaata ggcgg 15
<210> 24
<211> 123
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 24
gctgatgatc ataaagccac aggtatggtg ctcaggcagt gcgctgatga tcataaagcc 60
acaggtaaga agtaggcaac cgcctattgc agcacgtggc acatgggcac tgcctgagca 120
cca 123
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcagggatgc cacagttta 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cagaacaaga gcaaaggcaa 20
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgccgggtct ctaagagcac aca 23
<210> 28
<211> 127
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 28
gcagggatgc cacagtttac agaacaagag caaaggcaag cagggatgcc acagtttaac 60
tgccgggtct ctaagagcac acatctttct ggggagcatt tatgtctttg cctttgctct 120
tgttctg 127
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
atgccgacac ctttggtaag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aggaaaggca cacaggactc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cgctggctgg cagtctgtct c 21
<210> 32
<211> 114
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 32
atgccgacac ctttggtaag aggaaaggca cacaggactc atgccgacac ctttggtaag 60
cgctggctgg cagtctgtct caccagcttc ccctgagtcc tgtgtgcctt tcct 114

Claims (8)

1.一种用于检测Her2基因的核酸组合，其特征在于，包括两对Her2基因引物和两对内参引物，
其中，Her2基因引物序列：
Her2-1-F：5’-ACAACCAAGTGAGGCAGGTC-3’，
Her2-1-R：5’-GTATTGTTCAGCGGGTCTCC-3’；
Her2-2-F：5’-TCTTCCTCTCCCTACATCGG-3’，
Her2-2-R：5’-GTCCAAGTGAACCAGGGAA-3’，
内参引物序列：
RPPH1-F：5’-GTCAGACTGGGCAGGAGATG-3’，
RPPH1-R：5’-TGGCCGTGAGTCTGTTCC-3’；
CEP17-F：5’-CGCTCCTGCACTGTAACACGT-3’，
CEP17-R：5’-TCATTCCTGCAGCCCTTGA-3’。
2.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，还包括对应的探针，两对Her2基因引物对应的探针为：
Her2-1-P：5’-R1-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-Q1-3’，
Her2-2-P：5’-R2-ACAGCCATGCCCACAGCCAG-Q2-3’，
两对内参引物对应的探针为：
RPPH1-P：5’-R3-TGCCTCCTTTGCCGGAGCTT-Q3-3’，
CEP17-P：5’-R4-AGCAGGTCCAGCCCA-Q4-3’，
其中，R1、R2、R3、R4为荧光报告基团，Q1、Q2、Q3、Q4为荧光淬灭基团，并且R1、R2和R3、R4之间选择不同颜色的荧光报告基团。
3.如权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，荧光报告基团选自FAM、HEX、Cy5、Cy3或VIC；荧光淬灭基团选自TAMARA、BHQ1、BHQ2或MGB。
4.包含如权利要求1～3任一所述核酸组合的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒在检测Her2基因中的应用。
6.一种检测HER2基因的方法，其特征在于，使用如权利要求1～3任一所述核酸组合对待检测的样本进行数字PCR检测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，各条引物的用量分别为300-950nM，各探针的用量分别为100-300nM。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述数字PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共进行40个循环。
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