CN114214417A - 一种用于检测人her-2基因扩增的试剂盒及其应用和工作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测人HER‑2基因扩增的试剂盒及其应用和工作方法，所述试剂盒包括用于检测HER‑2基因的引物对和荧光探针，检测内参基因EIF2C1的引物对和荧光探针，2*ddPCR预混液，阴性质控品，阳性质控品，所述用于检测HER‑2基因的引物对和荧光探针，其正向引物核苷酸序列为5’‑TACGTGCTCATCGCTCACA‑3’，其反向引物核苷酸序列为5’‑GGTGCCTCGCACAATCC‑3’，其荧光探针核苷酸序列为5’‑AGTGAGGCAGGTCCCACTGC‑3’，本发明公布试剂盒基于数字PCR技术，能对人HER‑2基因拷贝数进行检测，具有绝对定量、操作简便、准确度高、特异性好、成本低等优点，可以作为免疫组织化学和荧光原位杂交法检测的可靠补充，检测结果可以辅助判断乳腺癌患者是否对曲妥珠单抗敏感，同时还适用于临床乳腺癌HER‑2扩增阳性患者的治疗监测以及复发监控。

Description

一种用于检测人HER-2基因扩增的试剂盒及其应用和工作 方法

技术领域

本发明是关于人HER-2基因扩增测试领域，特别是关于一种用于检测人HER-2基因扩增的试剂盒及其应用和工作方法。

背景技术

乳腺癌是世界范围内女性最常见的癌症，也是威胁我国女性健康的重大杀手。据2020年年底，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的全球最新癌症负担数据，全球乳腺癌新发病例高达226万例，首次正式取代肺癌(220万)成为全球第一大癌症，占所有新增癌症患者的11.7％。

HER2也称为ERBB2，负责编码跨膜受体蛋白HER2，该蛋白具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinases)活性。ERBB家族成员包括EGFR/ERBB1、HER2/ERBB2/NEU、HER3/ERBB3及HER4/ERBB4。HER2不具有结合配体的结构域，因此它无法与生长因子结合。然而，它可与其他ERBB家族成员(如EGFR)结合并形成异二聚体，以此来稳定其他受体与配体的结合，并增强激酶对下游信号通路的激活。

研究表明，HER2在20-30％的原发性乳腺浸润性导管癌中存在基因的扩增和蛋白的过度表达。HER2阳性的乳腺癌对常规的化疗和内分泌治疗反应差，肿瘤浸润性强，无病生存期端，预后差。为此，多种阻断HER2的抗癌药物相继问世，其中，目前经FDA批准最为常用的此类药物是曲妥珠单抗，它是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性的作用于HER2的细胞外部分，适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2蛋白过度表达和基因扩增的乳腺癌患者接受曲妥珠单抗治疗才有效，因此准确评价HER2基因和蛋白水平对治疗至关重要。

目前，临床上一般采用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测HER2蛋白过度表达，应用荧光原位杂交法(fluorescence in situhybridization，FISH)检测HER2基因扩增的水平。然而不同的检测方法、计算的准确性和试剂的选择都会影响HER2检测的结果。一项调查结果显示，有25％的乳腺癌患者是因检测结果不准确而接受了不恰当的治疗，IHC检测HER2蛋白过度表达的错误率平均为18％，FISH检测HER2基因扩增的错误率在13％。在《乳腺癌临床实践指南(中国版)》2007年第一版中的HER2检测原则中指出IHC方法或FISH技术都可用于肿瘤HER2基因扩增状态的首次评估，IHC检测结果呈交界性的样本(如IHC++)应通过已接受过验证的其他方法(如FISH)进行再次检测。

IHC是基于抗体在蛋白水平上检测HER-2的状态，该方法易于开展，已被广泛使用，但技术本身受组织固定、抗原修复、一抗的灵敏度和特异度、染色结果评定等多种变量的影响，使得结果不够准确和稳定，尤其对HER-2轻、中度表达的样本易产生假阴性。FISH是基于探针直接在基因水平上检测HER-2的状态，该法灵敏、准确、可靠，结果具有高度的可重复性。但FISH检测存在着试剂价格昂贵、操作难度大、检测周期长，且人员专业性要求高等限制。

因此，开发一种绝对定量、操作简便、准确度高、特异性好、成本较低的HER2基因扩增检测试剂盒是急需解决的问题。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测人HER-2基因扩增的试剂盒及其应用和工作方法，其能够提供一种绝对定量、操作简便、准确度高、特异性好、成本较低的HER2基因扩增检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测HER-2基因的引物对和荧光探针，检测内参基因EIF2C1的引物对和荧光探针，2*ddPCR预混液，阴性质控品，阳性质控品，所述试剂盒包括用于检测HER-2基因的引物对和荧光探针，其正向引物核苷酸序列为5’-TACGTGCTCATCGCTCACA-3’，其反向引物核苷酸序列为5’-GGTGCCTCGCACAATCC-3’，其荧光探针核苷酸序列为5’-AGTGAGGCAGGTCCCACTGC-3’。

作为优选的，所述试剂盒包括用于检测内参基因EIF2C1基因的引物对和荧光探针，其正向引物核苷酸序列为5’-TTCGGCTTTCACCAGTCTGT-3’，其反向引物核苷酸序列为5’-TCTCCCCACTCACCATCAAT-3’，其荧光探针核苷酸序列为5’-CCTGCCATGTGGAAGATGATGC-3’。

作为优选的，所述试剂盒包括2*ddPCR预混液，所述2*ddPCR预混液包括DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Mg2+、和PCR反应缓冲液。

作为优选的，所述阴性质控品为人工合成，其中HER-2基因拷贝数/EIF2C1基因拷贝数＝0.75～1.25。

作为优选的，所述阳性质控品为人工合成，其中HER-2基因拷贝数/EIF2C1基因拷贝数＝2.5～3.5。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，所述一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于辅助判断IHC/FISH判定为疑似阳性的乳腺癌患者HER-2基因扩增状态。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，所述一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于辅助判断乳腺癌患者是对赫赛汀治疗敏感性。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，所述一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于临床HER-2扩增阳性乳腺癌患者的治疗监测及复发监控。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、提取肿瘤组织标本或外周血游离的DNA；

S2、采用所述的引物对和荧光探针，引物对的用量为10-15uM，荧光探针的用量为5-10uM，对S1中提取到的DNA进行数字PCR扩增，并同时进行阴性质控品和阳性质控品的检测；

S3、将扩增完毕的芯片放入生物芯片阅读仪，检测荧光信号并使用软件对扩增产物进行拷贝数统计，分别计算HER-2基因拷贝数(FAM荧光通道)/EIF2C1基因拷贝数(HEX荧光通道)的比值；

S4、判读数值结果，数值结果的判读方法为：若HER-2/EIF2C1的比值≥1.5，则判定HER2基因扩增阳性；若1.25≤HER-2/EIF2C1＜1.5，则判定HER2基因扩增临界阳性；若HER-2/EIF2C1＜1.25，则判定HER2基因扩增阴性。

作为优选的，所述数字PCR的扩增条件如下表所示：

与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)荧光探针的5’端修饰有FAM荧光集团，3’端修饰有MGB淬灭基团，引物对和荧光探针的目标区域设定在HER2蛋白的受体结合区，该区域是生长因子-配体结合物、赫赛汀等靶向药物的作用位点之一，可以避免因HER2基因融合；

(2)基于数字PCR技术，通过微滴化处理，对HER2基因扩增状态进行检测，具有绝对定量、操作简便、准确度高、特异性好、成本低等优点，可以作为免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)和荧光原位杂交法(fluorescence in situhybridization，FISH)检测的可靠补充；

(3)可以辅助判断乳腺癌患者是否对曲妥珠单抗敏感，同时还适用于临床乳腺癌HER-2扩增阳性患者的治疗监测以及复发监控，提供从乳腺癌患者初诊到晚期治疗监测的整体解决方案。

附图说明

图1为HER2和EIF2C1的二维检测图，其中纵坐标为HER2基因检测出的荧光强度，横坐标为EIF2C1基因检测出的荧光强度，第一象限是HER2基因和EIF2C1基因检测出的共同阳性微滴，第二象限是HER2基因检测出的阳性微滴，第三象限是阴性微滴，第四象限是EIF2C1基因检测出的阳性微滴。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒，试剂盒包括用于检测HER-2基因的引物对和荧光探针，检测内参基因EIF2C1的引物对和荧光探针，2*ddPCR预混液，阴性质控品，阳性质控品，试剂盒包括用于检测HER-2基因的引物对和荧光探针，其正向引物核苷酸序列为5’-TACGTGCTCATCGCTCACA-3’，其反向引物核苷酸序列为5’-GGTGCCTCGCACAATCC-3’，其荧光探针核苷酸序列为5’-AGTGAGGCAGGTCCCACTGC-3’。可见，探针的5’端修饰有FAM荧光集团，3’端修饰有MGB淬灭基团，该荧光探针的目标区域位于HER2蛋白的受体结合区，该区域是生长因子-配体结合物、赫赛汀等靶向药物的作用位点之一，可以避免因HER2基因融合、断裂等导致的假性结果。

试剂盒包括用于检测内参基因EIF2C1基因的引物对和荧光探针，其正向引物核苷酸序列为5’-TTCGGCTTTCACCAGTCTGT-3’，其反向引物核苷酸序列为5’-TCTCCCCACTCACCATCAAT-3’，其荧光探针核苷酸序列为5’-CCTGCCATGTGGAAGATGATGC-3’。检测EIF2C1基因的荧光探针的5’端修饰有HEX荧光集团，3’端修饰有MGB淬灭基团，用于检测内参基因EIF2C1基因的荧光探针的目标区域位于EIF2C1基因的高保守区域，增加了结果的稳定性，同时可以避免如FISH方法检测时由17号染色体多倍体造成的假阴性结果(HER2基因和CEP17基因拷贝数均增加)。

试剂盒包括2*ddPCR预混液，2*ddPCR预混液包括DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Mg2+、和PCR反应缓冲液。

阴性质控品为人工合成，其中HER-2基因拷贝数/EIF2C1基因拷贝数＝0.75～1.25。

阳性质控品为人工合成，其中HER-2基因拷贝数/EIF2C1基因拷贝数＝2.5～3.5。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于辅助判断IHC/FISH判定为疑似阳性的乳腺癌患者HER-2基因扩增状态。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于辅助判断乳腺癌患者是对赫赛汀治疗敏感性。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于临床HER-2扩增阳性乳腺癌患者的治疗监测及复发监控。

一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、提取肿瘤组织标本或外周血游离的DNA；

S2、采用的引物对和荧光探针，引物对的用量为10-15uM，荧光探针的用量为5-10uM，对S1中提取到的DNA进行数字PCR扩增，并同时进行阴性质控品和阳性质控品的检测；

S3、将扩增完毕的芯片放入生物芯片阅读仪，检测荧光信号并使用软件对扩增产物进行拷贝数统计，分别计算HER-2基因拷贝数(FAM荧光通道)/EIF2C1基因拷贝数(HEX荧光通道)的比值；

S4、判读数值结果，数值结果的判读方法为：若HER-2/EIF2C1的比值≥1.5，则判定HER2基因扩增阳性；若1.25≤HER-2/EIF2C1＜1.5，则判定HER2基因扩增临界阳性；若HER-2/EIF2C1＜1.25，则判定HER2基因扩增阴性。

数字PCR的扩增条件如下表所示：

这一用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的使用方法基于数字PCR技术，通过微滴化处理，对HER2基因扩增状态进行检测，具有绝对定量、操作简便、准确度高、特异性好、成本低等优点，可以作为免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)和荧光原位杂交法(fluorescence in situhybridization，FISH)检测的可靠补充；且在实际应用时可以辅助判断乳腺癌患者是否对曲妥珠单抗敏感，同时还适用于临床乳腺癌HER-2扩增阳性患者的治疗监测以及复发监控，提供从乳腺癌患者初诊到晚期治疗监测的整体解决方案。

实施例1：

用于检测人HER2基因扩增的特异性PCR引物和荧光探针制备，包括如下步骤：

1.序列获得：所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)

2.设计方法：根据NCBI数据库公布的HER2、EIF2C1基因序列，选取高保守区域，设计特异性PCR引物，每对引物相应的再设计一条检测探针，其序列如表1所示：

表1 特异性PCR引物和探针序列表

名称	编号	核苷酸序列
			HER2_F	SEQ ID No.1	5’-TACGTGCTCATCGCTCACA-3’
HER2_R	SEQ ID No.2	5’-GGTGCCTCGCACAATCC-3’
			HER2_P	SEQ ID No.3	5’-AGTGAGGCAGGTCCCACTGC-3’
EIF2C1_F	SEQ ID No.4	5’-TTCGGCTTTCACCAGTCTGT-3’
			EIF2C1_R	SEQ ID No.5	5’-TCTCCCCACTCACCATCAAT-3’
EIF2C1_P	SEQ ID No.6	5’-CCTGCCATGTGGAAGATGATGC-3’

3.所得序列委托美国Integrated DNA Technologies公司(简称IDT)合成。

实施例2

应用一种用于检测人HER-2基因扩增的试剂盒检测石蜡组织切片样本中的HER-2基因扩增状态，试剂盒中用于检测HER2基因扩增的特异性PCR引物和荧光探针为实施例1中制备。

1.材料：20例已经经过IHC或者FISH检测鉴定的乳腺癌患者石蜡切片样本；

2.方法：使用DropDx-2044HT数字PCR系统(锐讯)进行数字PCR检测

A.使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(德国QIAGEN公司，Cat No.56404)对石蜡切片样本进行核酸提取，提取步骤按照产品说明书进行，得到50ul DNA溶液，直接进行检测或-20℃暂存；同时进行阴性质控品和阳性质控品的检测。

B.按照表2配置HER2引物探针pool，涡旋混匀，瞬时离心；

表2 HER2引物探针pool配置表

C.按照表3配置EIF2C1引物探针pool，涡旋混匀，瞬时离心；

表3 EIF2C1引物探针pool配置表

D.按照表4配置数字PCR反应液，涡旋混匀，瞬时离心；

表4 数字PCR反应液配置表

2×DDPCR预混液	12.5μl
		HER2引物探针pool	1μl
EIF2C1引物探针pool	1μl
		DNA模板	8μl
PCR级水	2.5μl
		总计	25μl

E.按照DropX-2044HT标准作业流程，完成芯片加样，包括液滴生成油、数字PCR预混液、封闭液。将加好的芯片及托盘水平转移至数字PCR扩增仪的已贴膜的导热板上，按照表5运行扩增程序:

表5 数字PCR扩增条件

F.信息采集：将扩增完毕的芯片放入生物芯片阅读仪，检测荧光信号并使用软件对扩增产物进行拷贝数统计，分别计算HER-2基因拷贝数(FAM荧光通道)/EIF2C1基因拷贝数(HEX荧光通道)的比值；

G.结果分析：若HER-2/EIF2C1的比值≥1.5，则判定HER2基因扩增阳性；若1.25≤HER-2/EIF2C1＜1.5，则判定HER2基因扩增临界阳性；若HER-2/EIF2C1＜1.25，则判定HER2基因扩增阴性。检测结果见表5所示。

表5：20例石蜡切片样本HER2/EIF2C1的比值结果表

3.实验结果分析：本次实验中20例石蜡切片样本的检测结果与已有临床IHC/FISH的检测结果相比，其中18例样本与IHC或者FISH的检测结果相符，有2例(编号为39和41的样本)HER2的IHC检测结果为(++)，即检测结果无法确定的情况下，补充FISH检测结果为HER2阴性，而本发明试剂盒检测比值及判定结果为HER-2阳性。本实施例的检测方法及拷贝数比值结果均说明本发明，即一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒及应用在检测HER2基因扩增水平时是可行的，与FISH检测方法相比，本试剂盒具有绝对定量、操作简便、准确度高、特异性好、成本低等优点，可以作为免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)和荧光原位杂交法(fluorescence in situhybridization，FISH)检测的可靠补充。

实施例3

应用一种用于检测人HER-2基因扩增的试剂盒检测外周血游离DNA中的HER-2基因扩增状态，试剂盒中用于检测HER2基因扩增的特异性PCR引物和荧光探针为实施例1中制备。

1.材料：随即选取实施例2中20例乳腺癌患者中17例患者的血液样本

2.方法：使用DropDx-2044HT数字PCR系统(锐讯)进行数字PCR检测

A.样本采集：使用Streck BCT管采集上述患者空腹晨血10ml，采血后缓慢垂直90°混匀十次，常温(6-26℃)保存运输，72小时内送达实验室。

B.血浆分离：将采血管置于离心机中，保持配平，盖紧离心机转子内盖和外盖，在4℃下离心1600xg 15min；准备全血的1.5ml离心管，并做好标记，使用移液器小心转移上清血浆于对应的1.5ml离心管中；将1.5m离心管置于离心机中，保持配平，盖紧离心机转子内盖和外盖，在4℃下离心12000xg10min；准备全新的1.5ml离心管，并做好标记，使用移液器小心将上清血浆分装到新的1.5ml离心管中(Note：1.5ml离心管底部可以才留一些血浆(约30ul左右)，以免吸到离心管下层的残留白细胞。)

C.核酸提取：使用QIAamp Circulating Acid Kit(Qiagen,Cat No 55114)对上述血浆进行核酸提取，得到25ul DNA溶液，直接进行检测或-20℃暂存；同时进行阴性质控品和阳性质控品的检测。

D.数字PCR检测步骤及结果分析参照实施例2进行，检测结果见6所示。

表6 10例血液样本HER2/EIF2C1的比值结果表

3.实验结果分析：本次实验中使用了17例血液样本进行数字PCR检测并进行比值结果判定，结果显示与石蜡切片样本数字PCR结果对比分析中，有2例不一致，即NT-50和NT-62号标本石蜡切片样本数字PCR结果为HER2阳性，而本实施例的检测及比值结果判定为HER2阴性，这是由于血液样本检测时，是以肿瘤细胞释放到血液中的循环游离DNA为模板，和组织样本的检测结果有差异属于正常现象。但是也可以说明本发明，即即一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒同时还可以使用外周血中循环肿瘤DNA作为检测标本，有效缓解乳腺癌患者面临的采样伤害，排除组织异质性等问题。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测HER-2基因的引物对和荧光探针，检测内参基因EIF2C1的引物对和荧光探针，2*ddPCR预混液，阴性质控品，阳性质控品，所述用于检测HER-2基因的引物对和荧光探针，其正向引物核苷酸序列为5’-TACGTGCTCATCGCTCACA-3’，其反向引物核苷酸序列为5’-GGTGCCTCGCACAATCC-3’，其荧光探针核苷酸序列为5’-AGTGAGGCAGGTCCCACTGC-3’。

2.如权利要求1所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测内参基因EIF2C1基因的引物对和荧光探针，其正向引物核苷酸序列为5’-TTCGGCTTTCACCAGTCTGT-3’，其反向引物核苷酸序列为5’-TCTCCCCACTCACCATCAAT-3’，其荧光探针核苷酸序列为5’-CCTGCCATGTGGAAGATGATGC-3’。

3.如权利要求1所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括2*ddPCR预混液，所述2*ddPCR预混液包括DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、Mg2+、和PCR反应缓冲液。

4.如权利要求书1所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为人工合成，其中HER-2基因拷贝数/EIF2C1基因拷贝数＝0.75～1.25。

5.如权利要求书4所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为人工合成，其中HER-2基因拷贝数/EIF2C1基因拷贝数＝2.5～3.5。

6.如权利要求书1-5中所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，其特征在于，所述一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于辅助判断IHC/FISH判定为疑似阳性的乳腺癌患者HER-2基因扩增状态。

7.如权利要求书1-5中所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，其特征在于，所述一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于辅助判断乳腺癌患者是对赫赛汀治疗敏感性。

8.如权利要求书1-5中所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的应用，其特征在于，所述一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒应用于临床HER-2扩增阳性乳腺癌患者的治疗监测及复发监控。

9.如权利要求书1-5中所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取肿瘤组织标本或外周血游离的DNA；

S2、采用所述的引物对和荧光探针，引物对的用量为10-15uM，荧光探针的用量为5-10uM，对S1中提取到的DNA进行数字PCR扩增，并同时进行阴性质控品和阳性质控品的检测；

S3、将扩增完毕的芯片放入生物芯片阅读仪，检测荧光信号并使用软件对扩增产物进行拷贝数统计，分别计算HER-2基因拷贝数(FAM荧光通道)/EIF2C1基因拷贝数(HEX荧光通道)的比值；

S4、判读数值结果，数值结果的判读方法为：若HER-2/EIF2C1的比值≥1.5，则判定HER2基因扩增阳性；若1.25≤HER-2/EIF2C1＜1.5，则判定HER2基因扩增临界阳性；若HER-2/EIF2C1＜1.25，则判定HER2基因扩增阴性。

10.如权利要求9所述的一种用于检测人HER2基因扩增的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述数字PCR的扩增条件如下表所示：

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